FI72744C - Foerfarande foer framstaellning av 3-oxo- / 1,4-steroider. - Google Patents

Foerfarande foer framstaellning av 3-oxo- / 1,4-steroider. Download PDF

Info

Publication number
FI72744C
FI72744C FI814128A FI814128A FI72744C FI 72744 C FI72744 C FI 72744C FI 814128 A FI814128 A FI 814128A FI 814128 A FI814128 A FI 814128A FI 72744 C FI72744 C FI 72744C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
liters
liter
culture
hours
adjusted
Prior art date
Application number
FI814128A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI814128L (fi
FI72744B (fi
Inventor
Alfred Weber
Mario Kennecke
Original Assignee
Schering Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Schering Ag filed Critical Schering Ag
Publication of FI814128L publication Critical patent/FI814128L/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI72744B publication Critical patent/FI72744B/fi
Publication of FI72744C publication Critical patent/FI72744C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/02—Dehydrogenating; Dehydroxylating
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J1/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, androstane
    • C07J1/0003—Androstane derivatives
    • C07J1/0033—Androstane derivatives substituted in position 17 alfa and 17 beta
    • C07J1/0037—Androstane derivatives substituted in position 17 alfa and 17 beta the substituent in position 17 alfa being a saturated hydrocarbon group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J5/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond
    • C07J5/0046—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond substituted in position 17 alfa
    • C07J5/0053—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond substituted in position 17 alfa not substituted in position 16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J5/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond
    • C07J5/0046—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond substituted in position 17 alfa
    • C07J5/0061—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond substituted in position 17 alfa substituted in position 16
    • C07J5/0069—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond substituted in position 17 alfa substituted in position 16 by a saturated or unsaturated hydrocarbon group
    • C07J5/0076—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond substituted in position 17 alfa substituted in position 16 by a saturated or unsaturated hydrocarbon group by an alkyl group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J5/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond
    • C07J5/0046—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond substituted in position 17 alfa
    • C07J5/0061—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond substituted in position 17 alfa substituted in position 16
    • C07J5/0069—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond substituted in position 17 alfa substituted in position 16 by a saturated or unsaturated hydrocarbon group
    • C07J5/0084—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond substituted in position 17 alfa substituted in position 16 by a saturated or unsaturated hydrocarbon group by an alkylene group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J63/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton has been modified by expansion of only one ring by one or two atoms
    • C07J63/008—Expansion of ring D by one atom, e.g. D homo steroids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J7/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms
    • C07J7/0005—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21
    • C07J7/001—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group
    • C07J7/004—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group substituted in position 17 alfa
    • C07J7/005—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group substituted in position 17 alfa substituted in position 16
    • C07J7/0055—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group substituted in position 17 alfa substituted in position 16 by a saturated or unsaturated hydrocarbon group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J71/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton is condensed with a heterocyclic ring
    • C07J71/0005—Oxygen-containing hetero ring
    • C07J71/001—Oxiranes
    • C07J71/0015—Oxiranes at position 9(11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J71/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton is condensed with a heterocyclic ring
    • C07J71/0005—Oxygen-containing hetero ring
    • C07J71/0026—Oxygen-containing hetero ring cyclic ketals
    • C07J71/0031—Oxygen-containing hetero ring cyclic ketals at positions 16, 17

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Mobile Radio Communication Systems (AREA)
  • Radio Relay Systems (AREA)

Description

72744 Λ7 4
Menetelmä S-okso-A·*-' -steroidien valmistamiseksi . 1 4
Keksintö koskee menetelmää 3-okso-A ' -steroidien valmistamiseksi, joilla on yleinen kaava I
1 i_i (i),
jossa X
X merkitsee vetyatomia, klooriatomia, fluoriatomia tai metyy-liryhmää, 15 ryhmittymä A on
B
/ \ / / ^
0=f , H0H(f tai O
20 CH CY "'JO
/ \ \ jossa Y on vety, fluori tai kloori, ja ryhmittymä on
V
25 f
OH CH0Z CH0Z
f -R, I 2 „ . T 2 ,Cr' X ' C=0 tai C=0
"' I _ -r2 I
,n i JC-' C-----O R.
30 I ^ \ \ \ p / 4 V*2 \ i 5 joissa Z merkitsee vetyatomia, hydroksiryhmää, fluoriatomia tai 35 klooriatomia, merkitsee vetyatomia tai alisyklistä hiilivetytähdettä, jossa on 1 - 4 hiiliatomia, 72744 2 1*2 merkitsee vetyatomia, hydroksiryhmää, mahdollisesti happiatomin tai rikkiatomin katkaisemaa alkyyliryhmää, jossa on 1 - 6 hiiliatomia, alkanoyylioksiryhmää, jossa on 1 - 6 hiiliatomia tai bentsoyylioksiryhmää, 5 merkitsee vetyatomia, hydroksiryhmää tai metyyliryhmää ja. R^ ja Rj- merkitsevät alkyyliryhmää, jossa on 1 - 4 hiili-atomia · 3-okso- Δ4
-steroidien fermentointi tunnettujen steroidi- Δ1 -dehydraajien kuten bakteerien Bacillus lentus ATCC 10 13 805, Bacillus sphaericus ATCC 7054, ATCC 7055 ja ATCC
12 488, Bacillus subtilis NRRL B 558, Arthrobacter simplex sekä Norcardia corallina ATCC 4273 ja 4275 elävillä viljelmillä tapahtuu usein epätyydyttävästä, osittain koska muuttumisnopeus on liian hidas tai substraatin riittävää muuttumis-15 ta ei ole havaittavissa, osittain koska substraatti metabo-lisoituu voimakkaasti.
Nyt on keksitty, että 3-okso-Δ4-steroidien mikrobiologinen Δ^-dehydraus on suoritettavissa erittäin hyvin, jos tämän substraatin dehydraukseen käytetään Arthrobacter simp-20 lex-lajin mikro-organismia ja muuttaminen suoritetaan siten, että läsnä on 0,04-0,12 g koboltti(II)-ioneja viljelmän litraa kohden. Sopivia Arthrobacter simplex-kantoja ovat esimerkiksi kannat IFO (3530), ATCC 13260 ja erityisesti ATCC 6946.
Jo kauan on ollut tunnettua, että Arthrobacter simp-25 lex - josta aikaisemmin on käytetty nimitystä Corynebacterium simplex - pystyy Δ^-dehydraamaan steroideja. Tekniikassa sitä käytetään usein, koska sen etuna muihin edellä mainittuihin steroidi- Δ^-dehydraajiin verrattuna on se, että tätä kantaa käytettäessä muuttuminen tapahtuu oleellisesti nopeam-30 min kuin muita mainittuja mikro-organismeja käytettäessä; toisaalta lajilla Arthrobacter simplex on kuitenkin kaksi varjopuolta: 1. Fermentointiajän ollessa pitkä, sillä on taipumus metabolisoida steroideja, mikä voi aiheuttaa ei niinkään mer-35 kityksettömiä saantohäviöitä halutun menetelmätuotteen osalta, ja 3 72744 2. sillä on usein taipumus pysäyttää reaktio kun viljelmäliemessä on vielä jäljellä 1-3 % lähtösteroidia.
Tämä vaikeuttaa usein huomattavasti menetelmällä saatavien tuotteiden valmistamista niin puhtaina kuin lääkevaikutusta 5 omaavilta aineilta edellytetään.
Nämä varjopuolet ovat vältettävissä keksinnön mukaisella menetelmällä, jolle on tunnusomaista, että 3-okso- Δ4-steroidia, jolla on yleinen kaava II
10 ! | ^ (ID, 15 i jossa X, ^ ja U^ ovat merkitykseltään edellä mainittuja,
20 B V
/ \ I
tai sen ja 1 - 6 hiiliatomisten alkyylikarboksyylihappojen 21-esteriä fermentoidaan Arthrobacter simplex'in elävällä viljelmällä siten, että läsnä on 0,04 g - 0,12 g koboltti-25 (II)-ioneja viljelmän litraa kohden. Vähäisemmällä koboltti-ionikonsentraatiolla ei saavuteta mainittavaa vaikutusta, suurempi koboltti(II)-ionikonsentraatio vaikuttaa inhiboi-vasti. Sopivia koboltti(II)-ioneja tuottavia aineita ovat vesiliukoiset kobolttisuolat kuten esimerkiksi CoC^, CoNO^, 30 CoSo4 tai CoSO^.7H20. Menetelmän suoritettavuuden kannalta näiden suolojen anioneilla ei ole merkitystä, koska koboltti (II) -suolathan dissosioituvat elatusaineessa.
Muuten keksinnön mukainen menetelmä suoritetaan olosuhteissa, joita yleensä käytetään steroidien A^-dehydrauk-35 seen Arthrobacter simplex-lajin mikro-organismeilla.
Tämän mikro-organismin yhteydessä tavallisesti käytettävissä viljelyolosuhteissa viljely tapahtuu sopivassa 72744 4 ravintoalustassa ilmastamalla uposviljelmää. Sitten viljelmiin lisätään substraatti (sopivaan liuottimeen liuotettuna tai lähinnä emulgoituna) ja fermentoidaan kunnes substraatin muutos on saatu mahdollisimman suureksi.
5 Sopivia substraattiliuottimia ovat esimerkiksi meta- noli, etanoli, glykolimonometyylieetteri, dimetyyliform-amidi, dimetyylisulfoksidi, tai heksametyylifosforihappo-triamidi. Substraatin emulgointi voidaan suorittaa esimerkiksi suihkuttamalla tämä hienojakoisessa muodossa tai ve-10 den kanssa sekoittuvaan liuottimeen (kuten metanoliin, etanoliin, asetoniin, glykolimonometyylieetteriin, dimetyyli-formamidiin tai dimetyylisulfoksidiin) liuotettuna voimakkaan pyörrevirtauksen alaisena (lähinnä kalkittomaan) veteen, jossa on tavanomaisia emulgointiapuaineita. Sopivia emulgoin-15 tiapuaineita ovat ionittomat emulgaattorit, kuten esimerkiksi etyleenioksidiadduktit tai polyglykolien rasvahappoeste- rit. Sopivina emulgaattoreina mainittakoon esimerkkeinä kau- (R) (R) (R) pan olevat kostutusaineet Tegin , Tagat , Tween ja (R)
Span . Paras mahdollinen substraattikonsentraatio, subs-20 traatin lisäysaika ja fermentoinnin kesto riippuvat käytettävän mikro-organismin lajista. Nämä muuttujat on, kuten mikrobiologisten steroidimuutosten yhteydessä yleisestikin on välttämätöntä, selvitettävä yksityistapauksessa ammattimiehen tuntemin esikokein.
25 Seuraavien suoritusesimerkkien tarkoituksena on va laista keksinnön mukaista menetelmää.
Seuraavassa suoritusesimerkissä käytetty proteiini-hydrolysaatti valmistettiin Federmehl-jauheesta ohjeen Organic Synthesis, Col. Voi. I, sivu 194 mukaisesti, kuitenkin 30 siten, että hydrolyysin tapahduttua neutraloitiin ammoniakilla ja suodatettiin steriilistä. Saatua suodosta käytettiin enempää puhdistamatta "proteiinihydrolysaattina".
Esimerkki 1 a) 2 litran erlenmeyer-pulloon, jossa on litra ste-35 rilliä ravintoliuosta, joka sisältää 0,5 % maissiliotetta 5 72744 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,1 % hiivauutetta - säädetty pH-arvoon 7,0 ympätään Arthrobacter simplex ATCC 6946:n pestyä kuivaviljel-5 mää ja ravistellaan 30°C:ssa 72 tuntia kierrosnopeuden ollessa 180 kierrosta minuutissa.
b) 50 litran fermentointiastiaan, jossa on 30 litraa steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 0,5 % maissiliotetta 10 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,1 % hiivauutetta 4 ml Silikon SH-valmistetta 4 ml Pluronic-valmistetta - säädetty pH-arvoon 7,0 -, 15 ympätään 1 litra Arthrobacter simplex-viljelmää ja tätä esi-viljelmää inkuboidaan 24 tunnin ajan 30°C:ssa ilmastamalla (2 m tuntia kohden) ja sekoittamalla (220 kierrosta/minuutti).
c) 7,5 g 9 A ll/A-epoksi-17o(-hydroksi-16^-metyyli-4-pregneeni-3,20-dionia liuotetaan 300 mitään etyleeniglykoli- 20 monometyylieetteriä ja sen jälkeen suodatetaan steriilisti.
d) 12 g CoSO^. 7^0^3 ja 12 g (NH^^SO^ta liuotetaan 500 mitään vettä, pH säädetään arvoon 6,5 ja steriloidaan.
e) 50 litran fermentointiastiaan pannaan 30 litraa steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 25 0,5 % maissiliotetta 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,3 % "proteiinihydrolysaattia" 4 ml Silikon SH-valmistetta 4 ml Pluronic-valmistetta 30 - säädetty pH-arvoon 7,0 -, tähän ympätään 3 litraa Arthrobacter simplex-esiviljelmää 3 ja inkuboidaan ilmastamalla (2 m /tunti) ja sekoittamalla (220 kierrosta/minuutti) 6 tunnin ajan 30°C:ssa. Sitten viljelmään lisätään kohdassa c) valmistettu steriili 9/>,ll<4-35 epoksi-17o(-hydroksi-16(3-metyyli-4-pregneeni-3,20-dioniliuos ja kohdassa d) valmistetut lisäaineet. Sen jälkeen fermen- 72744 6 toidaan edelleen 20 tuntia.
Suoritetun fermentoinnin jälkeen 5 litralla etyleeni-kloridia stabiloitu viljelmäliemi uutetaan 3 kertaa 20 litran etyleenikloridierillä ja etyleenikloridiuute konsentroi-5 daan pyörivässä haihduttimessa enintään 50°C:ssa vakuumissa. Tämän jälkeen seuraa puhdistus kromatografoimalla aluminium-oksilla.
Saadaan 5,8 g 9^, lV'-epoksi-^^-hydroksi-l&^-metyyli- 1,4-pregnadieeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste on 212/213-10 214°C.
Esimerkki 2 a) 2 litran erlenmeyer-pulloon, jossa on 1 litra steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 0,5 % maissiliotetta 15 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,1 % hiivauutetta - säädetty pH-arvoon 7,0 -, ympätään Arthrobacter simplex ATCC 6946:n pestyä kuivaviljel-mää ja ravistellaan 30°C:ssa 72 tuntia nopeudella 180 kier-20 rosta/minuutti.
b) 50 litran fermentointiastiaan, jossa on 30 litraa steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 0,5 % maissiliotetta 0,05 % glukoosimonohydraattia 25 0,1 % hiivauutetta 4 ml Silikon SH-valmistetta 4 ml Pluronic-valmistetta - säädetty pH-arvoon 7,0 -, ympätään 1 litra Arthrobacter simplex-viljelmää ja tätä 30 esiviljelmää inkuboidaan 24 tunnin ajan 30°C:ssa ilmastamal- 3 la (2 m /tunti) ja sekoittamalla (220 kierrosta/minuutti).
c) 7,5 g 17oi-hydroksi-16,^-metyyli-4,9 (11) -pregnadi-eeni—3,20-dionia liuotetaan 60°C:ssa 150 mitään etyleeni-glykolimonometyylieetteriä ja sen jälkeen suodatetaan ste- 35 riilisti.
d) 18 g CoS04.7H20:ta ja 18 g (NH4)2S04:a liuotetaan 7 72744 500 ml:aan vettä, pH säädetään arvoon 6,5 ja steriloidaan.
e) 50 litran fermentointiastiaan pannaan 30 litraa steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 0,5 % maissiliotetta 5 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,3 % "proteiinihydrolysaattia" 4 ml Silikon SH-valmistetta 4 ml Pluronic-valmistetta - säädetty pH-arvoon 7,0 -, 10 tähän ympätään 3 litraa Arthrobacter simplex-esiviljelmää ja inkuboidaan 6 tunnin ajan 30°C:ssa ilmastamalla (2 m / tunti) ja sekoittamalla (220 kierrosta/minuutti). Sitten viljelmään lisätään kohdassa c) valmistettu steriili \lot~ hydroksi-16^-metyyli-4,9(11)-pregnadieeni-3,20-dioniliuos 15 ja kohdassa d) valmistetut lisäaineet. Sen jälkeen fermen-toidaan edelleen 24 tuntia.
Tapahtuneen fermentoinnin jälkeen 5 litralla etylee-nikloridia stabiloitu viljelmäliemi uutetaan 3 kertaa 20 litran etyleenikloridierillä ja etyleenikloridiuute konsent-20 roidaan pyörivässä haihduttimessa enintään 50°C:ssa vakuu-missa. Tämän jälkeen seuraa puhdistus kromatografoimalla aluminiumoksidilla.
Saadaan 6,2 g 17o£-hydroksi-16/3-metyyli-l, 4,9 (11) -pregnatrieeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste on 177-178°C. 25 Esimerkki 3 a) 2 litran erlenmeyer-pulloon, jossa on 1 litra steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 0,5 % maissiliotetta 0,05 % glukoosimonohydraattia 30 0,1 % hiivauutetta - säädetty pH-arvoon 7,0 -, ympätään Arthrobacter simplex ATCC 6946:n pestyä kuivavil-jelmää ja ravistellaan 72 tuntia 30°C:ssa kierrosnopeuden ollessa 180 kierrosta/minuutti.
35 b) 30 litran fermentointiastiaan, jossa on 20 litraa steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää e 72744 0,5 % maissiliotetta 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,1 ml hiivauutetta 4 ml Silikon SH-valmistetta 5 4 ml Pluronic-valmistetta - säädetty pH-arvoon 7,0 -, ympätään 1 litra Arthrobacter simplex-viljelmää ja tätä esi-viljelmää inkuboidaan 30°C:ssa 24 tunnin ajan ilmastamalla 3 (2 m /tunti) ja sekoittamalla (220 kierrosta/minuutti).
10 c) 6 g 17'X,21-dihydroksi-16-metyleeni-4-pregneeni- 3,11,20-trionia liuotetaan 300 ml:aan heksametyylifosfori-happotriamidia ja sen jälkeen suodatetaan steriilisti.
d) 9 g CoSO^^Orta ja 9 g (NH^^SO^ra liuotetaan 500 ml:aan vettä, pH säädetään arvoon 6,5 ja steriloidaan.
15 e) 30 litran fermentointiastiaan pannaan 20 litraa steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 0,5 % maissiliotetta 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,3 % "proteiinihydrolysaattia" 20 4 ml Silikon SH-valmistetta 4 ml Pluronic-valmistetta - säädetty pH-arvoon 7,0 -, tähän ympätään 1,5 litraa Arthrobacter simplex-esiviljelmää ja inkuboidaan 6 tunnin ajan 30°C:ssa ilmastamalla (2 m'V 25 tunti) ja sekoittamalla (220 kierrosta/minuutti). Sitten viljelmään lisätään kohdassa c) valmistettu steriili 21-asetoksi-17>X-hydroksi-16-metyleeni-4-pregneeni-3,11,20-trioniliuos ja kohdassa d) valmistetut lisäaineet. Tämän jälkeen fermentoidaan edelleen 16 tuntia.
30 Suoritetun fermentoinnin jälkeen 3 litralla etyleeni- kloridia stabiloitu viljelmäliemi uutetaan 3 kertaa 10 litran etyleenikloridierillä ja etyleenikloridiuute konsentroidaan pyörivässä haihduttimessa enintään 50°C:ssa vakuumissa. Tämän jälkeen seuraa puhdistus kromatografoimalla aluminium-35 oksidilla.
Saadaan 4,5 g llnC, 21-dihydroksi-16-metyleeni-l, 4- 9 72744 pregnadieeni-3,ll,20-trionia, jonka sulamispiste on 218-219°C. Esimerkki 4 a) 2 litran erlenmeyer-pulloon, jossa on 1 litra steriiliä ravintoliuostas, joka sisältää 5 0,5 % maissiliotetta 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,1 % hiivauutetta - säädetty pH-arvoon 7,0 -, ympätään Arthrobacter simplex ATCC 6946:n pestyä kuivaviljel-10 mää ja ravistellaan 72 tuntia 30°C:ssa kierrosnopeudella 180 kierrosta/minuutti.
b) 30 litran fermentointiastiaan, jossa on 20 litraa steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 0,5 % maissiliotetta 15 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,1 % hiivauutetta 4 ml Silikon SH-valmistetta 4 ml Pluronic-valmistetta - säädetty pH-arvoon 7,0 -, 20 ympätään 1 litra Arthrobacter simplex-viljelmää ja tätä esi-viljelmää inkuboidaan 24 tunnin ajan 30°C:ssa ilmastamalla 3 (2 m /tunti) ja sekoittamalla (220 kierrosta/minuutti).
c) 6,0 g 11/3,17aQG, 21-trihydroksi-D-homo-4-pregneeni- 3,20-dionia liuotetaan 150 ml:aan heksametyylifosforihappo- 25 triamidia ja tämän jälkeen suodatetaan steriilisti.
d) 9 g CoSO^. 7^0: ta ja 9 g (NH^) 2^4 :a liuotetaan 400 ml:aan vettä, pH säädetään arvoon 6,5 ja steriloidaan.
e) 30 litran fermentointiastiaan pannaan 20 litraa steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 30 0,5 % maissiliotetta 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,3 % "proteiinihydrolysaattia" 4 ml Silikon SH-valmistetta 4 ml Pluronic-valmistetta 35 - säädetty pH-arvoon 7,0 -, tähän ympätään 1,5 litraa Arthrobacter simplex-esiviljelmää ja inkuboidaan 6 tuntia 30°C:ssa ilmastamalla (2 m^/tunti) 10 72744 ja sekoittamalla (220 kierrosta/minuutti). Sitten viljelmään lisätään kohdassa c) valmistettu steriili 1^, 17ao<j, 21-tri-hydroksi-D-homo-4-pregneeni-3,20-dioniliuos ja kohdassa d) valmistetut lisäaineet. Tämän jälkeen fermentoidaan edelleen 5 18 tunnin ajan.
Suoritetun fermentoinnin jälkeen 3 litralla etyleeni-kloridia stabiloitu viljelmäliemi uutetaan kolme kertaa 15 litran etyleenikloridierillä ja etyleenikloridiuute konsentroidaan pyörivässä haihduttimessa enintään 50°C:ssa vakuu-10 missä. Tämän jälkeen seuraa puhdistus kromatografoimalla aluminiumoksidilla.
Saadaan 5,0 g 11 fi, 17acx, 21-trihydroksi-D-homo-l, 4-pregnadieeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste on 248-249°C. Esimerkki 5 15 a) 2 litran erlenmeyer-pulloon, jossa on 1 litra ste riiliä ravintoliuosta, joka sisältää 0,5 % maissiliotetta 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,1 % hiivauutetta 20 - säädetty pH-arvoon 7,0 -, ympätään Arthrobacter simplex ATCC 6946:n pestyä kuivaviljel-mää ja ravistellaan 72 tuntia 30°C:ssa kierrosnopeuden ollessa 180 kierrosta/minuutti.
b) 50 litran fermentointiastiaan, jossa on 30 litraa 25 steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 0,5 % maissiliotetta 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,1 % hiivauutetta 4 ml Silikon SH-valmistetta 30 4 ml Pluronic-valmistetta - säädetty pH-arvoon 7,0 -, ympätään 1 litra Arthrobacter simplex-viljelmää ja tätä esi-viljelmää inkuboidaan 30°C:ssa 24 tunnin ajan ilmastamalla 3 (2 m /tunti) ja sekoittamalla (220 kierrosta/minuutti).
35 c) 15 g 6c£— fluori—11^, 21—dihydroksi — 16g£—metyyli—4 — pregneeni—3,20-dionia liuotetaan 300 ml:aan heksametyyli- X1 727 4 4 fosforihappotriamidia ja sen jälkeen suodatetaan steriilisti.
d) 12 g CoSO^. 71^0: ta ja 12 g (NH^)2S0^:a liuotetaan 500 ml:aan vettä, pH säädetään arvoon 6,5 ja steriloidaan.
e) 50 litran fermentointiastiaan pannaan 30 litraa 5 steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 0,5 % maissiliotetta 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,3 % "proteiinihydrolysaattia” 4 ml Silikon SH-valmistetta 10 4 ml Pluronic-valmistetta - säädetään pH-arvoon 7,0 -, tähän ympätään 3 litraa Arthrobacter simplex-esiviljelmää ja inkuboidaan 6 tunnin ajan 30°C:ssa ilmastamalla (2 m3/ tunti) ja sekoittamalla (220 kierosta/minuutti). Sitten vil-15 jelmään lisätään kohdassa c) valmistettu steriili 6.^-fluori-11$, 21-dihydroksi-16ö(,-metyyli-4-pregneeni-3,20-dioniliuos ja kohdassa d) valmistetut lisäaineet. Sen jälkeen fermen-toidaan edelleen 22 tunnin ajan.
Suoritetun fermentoinnin jälkeen 5 litralla etyleeni-20 kloridia stabiloitu viljelmäliemi uutetaan 3 kertaa 20 litran etyleenikloridierillä ja etyleenikloridiuute konsentroidaan enintään 50°C:ssa vakuumissa. Tämän jälkeen seuraa puhdistus kromatografisella aluminiumoksidilla.
Saadaan 13,1 g 60(-fluori-11$, 21-dihydroksi-16^-metyy-25 li-1,4-pregnadieeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste on 180/181°-182°C.
Esimerkki 6 a) 2 litran erlenmeyer-pulloon, jossa on 1 litra steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 30 0,5 % maissiliotetta 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,1 % hiivauutetta - säädetty pH-arvoon 7,0 ympätään Arthrobacter simplex ARCC 6946:n pestyä kuivaviljel-35 mää ja ravistellaan 72 tuntia 30°C:ssa kierrosnopeuden ollessa 180 kierrosta/minuutti.
12 7274 4 b) 50 litran fermentointiastiaan, jossa on 30 litraa steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 0,5 % maissiliotetta 0,05 % glukoosimonohydraattia 5 0,1 % hiivauutetta 4 ml Silikon SH-valmistetta 4 ml Pluronic-valmistetta - säädetty pH-arvoon 7,0 -, ympätään 1 litra Arthrobacter simplex-viljelmää ja tätä 10 esiviljelmää inkuboidaan 30°C:ssa 24 tunnin ajan ilmastamal- 3 la (2 m /tunti) ja sekoittamalla (220 kierrosta/minuutti).
c) 15 g 11/0, 21-dihydroksi-16oi, 17oC-isopropylideeni-dioksi-4-pregneeni-3,20-dionia liuotetaan 300 ml:aan etylee-niglykolimonometyylieetteriä ja sen jälkeen suodatetaan ste- 15 riilisti.
d) 12 g CoSO^. 7H 20: ta ja 12 g (NH4)2SC>4:a liuotetaan 500 ml:aan vettä, pH säädetään arvoon 6,5 ja steriloidaan.
e) 50 litran fermentointiastiaan pannaan 30 litraa steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 20 0,5 % maissiliotetta 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,3 % "proteiinihydrolysaattia" 4 ml Silikon SH-valmistetta 4 ml Pluronic-valmistetta 25 - säädetty pH-arvoon 7,0 -, tähän ympätään 3 litraa Arthrobacter simplex-esiviljelmää ja inkuboidaan 6 tunnin ajan 30°C:ssa ilmastamalla (2 m/ tunti) ja sekoittamalla (220 kierrosta/minuutti). Sitten viljelmään lisätään kohdassa c) valmistettu steriili 11/3, 30 21-dihydroksi-16iy, 17ö(-isopropylideenidioksi-4-pregneeni- 3,20-dioniliuos ja kohdassa d) valmistetut lisäaineet. Sen jälkeen fermentoidaan edelleen 20 tunnin ajan.
Suoritetun fermentoinnin jälkeen 5 litralla etyleeni-kloridia stabiloitu viljelmäliemi uutetaan 3 kertaa 20 lit-35 ran etyleenikloridierillä ja etyleenikloridiuute konsentroidaan pyörivässä haihduttimessa enintään 50°C:ssa vakuumissa.
13 72 7 4 4 Tämän jälkeen seuraa puhdistus kromatografoimalla aluminium-oksidilla.
Saadaan 13,6 g 11/^, 21-dihydroksi-16c*, 17*C-isopropyyli-deenidioksi-l,4-pregnadieeni-3,20-dionia, jonka sulamispis-5 te on 241-242,5°C.
Esimerkki 7 a) 2 litran erlenmeyer-pulloon, jossa on 1 litra steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 0,5 % maissiliotetta 10 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,1 % hiivauutetta - säädetty pH-arvoon 7,0 -, ympätään Arthrobacter simplex ATCC 6946:n pestyä kuivavil-jelmää ja ravistellaan 72 tuntia 30°C:ssa kierrosnopeuden 15 ollessa 180 kierrosta minuutissa.
b) 50 litran fermentointiastiaan, jossa on 30 litraa steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 0,5 % maissiliotetta 0,05 % glukoosimonohydraattia 20 0,1 % hiivauutetta 4 ml Silikon SH-valmistetta 4 ml Pluronic-valmistetta - säädetty pH-arvoon 7,0 -, ympätään 1 litra Arthrobacter simplex-viljelmää ja tätä esi-25 viljelmää inkuboidaan 30°C:ssa 24 tuntia ilmastamalla (2 m / tunti) ja sekoittamalla (220 kierrosta/minuutti).
c) 21 g 11/3,17x, 21-trihydroksi-6o(-metyyli-4-pregneeni- 3,20-dionia liuotetaan 300 ml:aan etyleeniglykolimonometyy-lieetteriä ja sen jälkeen suodatetaan steriilisti.
30 d) 12 g CoSO^. 7H20rta ja 12 g (NH^^SO^ia liuotetaan 500 mitään vettä, pH säädetään arvoon 6,5 ja steriloidaan.
e) 50 litran fermentointiastiaan pannaan 30 litraa steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 0,5 % maissiliuotetta 35 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,3 % "proteiinihydrolysaattia" 14 72744 4 ml Silikon SH-valmistetta 4 ml Pluronic-valmistetta - säädetty pH-arvoon 7,0 -, tähän ympätään 3 litraa Arthrobacter simplex-esiviljelmää 5 ja inkuboidaan 9 tunnin ajan 30°C:ssa ilmastamalla (2 in / tunti) ja sekoittamalla (220 kierrosta/minuutti). Sitten viljelmään lisätään kohdassa c) valmistettu steriili 11/3, llvC, 21-trihydroksi-60(-metyyli-4-pregneeni-3,20-dioniliuos ja kohdassa d) valmistetut lisäaineet. Sen jälkeen fermen-10 toidaan edelleen 7 tuntia.
Suoritetun fermentoinnin jälkeen 5 litralla etyleeni-kloridia stabiloitu viljelmäliemi uutetaan 3 kertaa 20 litran etyleenikloridierillä ja etyleenikloridiuute konsentroidaan pyörivässä haihduttimessa enintään 50°C:ssa vakuumissa. Tä-15 män jälkeen seuraa puhdistus kromatografoimalla aluminium-oksidilla.
Saadaan 19,1 g 11^5, Πο(, 21-trihydroksi-6*-metyyli-l, 4-pregnadieeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste on 235/236-238°C. Esimerkki 8 20 a) 2 litran erlenmeyer-pulloon, jossa on 1 litra ste riiliä ravintoliuosta, joka sisältää 0,5 % maissiliotetta 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,1 % hiivauutetta 25 - säädetty pH-arvoon 7,0 -, ympätään Arthrobacter simplex ATCC 6946:n pestyä kuivaviljelmää ja ravistellaan 30°C:ssa 72 tuntia kierrosnopeudella 180 kierrosta minuutissa.
b) 50 litran fermentointiastiaan, jossa on 30 litraa 30 steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 0,5 % maissiliotetta 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,1 % hiivauutetta 4 ml Silikon SH-valmistetta 35 4 ml Pluronic-valmistetta - säädetty pH-arvoon 7,0 -, 15 72744 ympätään 1 litra Arthrobacter simplex-viljelmää ja tätä esi-viljelmää inkuboidaan 30°C:ssa 24 tuntia ilmastamalla (2 m3/ tunti) ja sekoittamalla (220 kierros/minuutti).
c) 3 g 21-dihydroksi-175£-propoksimetoksi-4-preg- 5 neeni-3,20-dionia liuotetaan 200 ml:aan etyleeniglykolimono- metyylieetteriä ja sen jälkeen suodatetaan steriilisti.
d) 7,5 g CoSO^. 71^0: ta ja 7,5 g (NH^J^SO^ja liuotetaan 500 ml:aan vettä-, pH säädetään arvoon 6,5 ja steriloidaan .
10 e) 50 litran fermentointiastiaan pannaan 30 litraa steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 0,5 % maissiliotetta 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,3 % "proteiinihydrolysaattia" 15 4 ml Silikon SH-valmistetta 4 ml Pluronic-valmistetta - säädetty pH-arvoon 7,0 -, tähän ympätään 3 litraa Arthrobacter simplex-esiviljelmää ja inkuboidaan 9 tuntia 30°C:ssa ilmastamalla (2 in /tunti) ja 20 sekoittamalla (220 kierrosta/minuutti). Sitten viljelmään lisätään kohdassa c) valmistettu steriili 11/3,21-dihydroksi-17o£-propoksimetoksi-4-pregneeni-3,20-dioniliuos ja kohdassa d) valmistetut lisäaineet. Sen jälkeen fermentoidaan edelleen 6 tuntia.
25 Suoritetun fermentoinnin jälkeen 5 litralla etyleeni- kloridia stabiloitu viljelmäliemi uutetaan 3 kertaa 20 litran etyleenikloridierillä ja etyleenikloridiuute konsentroidaan pyörivässä haihduttimessa enintään 50°C:ssa vakuumissa. Sen jälkeen seuraa puhdistus kromatografoimalla aluminium-30 oksidilla.
Saadaan 2,4 g 11^6,21-dihydroksi-17°6-propoksimetoksi- 1,4-pregnadieeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste on 121/ 125-127°C.
Esimerkki 9 35 a) 2 litran erlenmeyer-pulloon, jossa on 1 litra ste riiliä ravintoliuosta, joka sisältää ie 72744 0,5 % maissiliotetta 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,1 % hiivauutetta - säädetty pH-arvoon 7,0 -, 5 ympätään Arthrobacter simplex ATCC 6946:n pestyä kuivaviljel-mää ja ravistellaan 72 tuntia 30°C:ssa kierrosnopeuden ollessa 180 kierrosta minuutissa.
b) 50 litran fermentointiastiaan, jossa on 30 litraa steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 10 0,5 % maissiliotetta 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,1 % hiivauutetta 4 ml Silikon SH-valmistetta 4 ml Pluronic-valmistetta 15 - säädetty pH-arvoon 7,0 -, ympätään 1 litra Arthrobacter simplex-viljelmää ja tätä esi-viljelmää inkuboidaan 30°C:ssa 24 tunnin ajan ilmastamalla (2 m^/tunti) ja sekoittamalla (220 kierrosta/minuutti).
c) 7,5 g lly3,21-dihydroksi-17«<'-isopropoksimetoksi- 20 4-pregneeni-3,20-dionia liuotetaan 200 ml:aan etyleeniglyko-limonometyylieetteriä ja sen jälkeen suodatetaan steriilisti.
d) 7,5 g CoSO^. 7H20:ta ja 7,5 g (NH^^SO^ta liuotetaan 500 ml saan vettä, pH säädetään arvoon 6,5 ja steriloidaan .
25 e) 50 litran fermentointiastiaan pannaan 30 litraa steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 0,5 % maissiliotetta 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,3 % "proteiinihydrolysaattia" 30 4 ml Silikon SH-valmistetta 4 ml Pluronic-valmistetta - säädetty pH-arvoon 7,0 -, tähän ympätään 3 litraa Arthrobacter simplex-esiviljelmää ja inkuboidaan 9 tunnin ajan 30°C:ssa ilmastamalla (2 m^/tunti) 35 ja sekoittamalla (220 kierrosta/minuutti). Sitten viljelmään lisätään kohdassa c) valmistettu steriili 11/?, 21-dihydroksi- 17 72744 17oC-isopropoksimetoksi-4-pregneeni-3,20-dioniliuos ja kohdassa d) valmistetut lisäaineet. Sen jälkeen fermentoidaan edelleen 12 tuntia.
Suoritetun fermentoinnin jälkeen 5 litralla etyleeni-5 kloridia stabiloitu viljelmäliemi uutetaan 3 kertaa 20 litran erillä etyleenikloridia ja etyleenikloridiuute konsentroidaan pyörivässä haihduttimessa enintään 50°C:ssa vakuu-missa. Sen jälkeen seuraa puhdistus kromatografoimalla alu-miniumoksidilla.
10 Saadaan 4,2 g lly$, 21-dihdyroksi-17oC-isopropoksimet- oksi-1,4-pregnadieeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste on 58/63-65°C.
Esimerkki 10 a) 2 litran erlenmeyer-pulloon, jossa on 1 litra 15 steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 0,5 % maissiliotetta 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,1 % hiivauutetta - säädetty pH-arvoon 7,0 -, 20 ympätään Arthrobacter simplex ATCC 6946:n pestyä kuivaviljel-mää ja ravistellaan 72 tuntia 30°C:ssa kierrosnopeuden ollessa 180 kierrosta minuutissa.
b) 50 litran fermentointiastiaan, jossa on 30 litraa steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 25 0,5 % maissiliotetta 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,1 % hiivauutetta 4 ml Silikon SH-valmistetta 4 ml Pluronic-valmistetta 30 - säädetty pH-arvoon 7,0 -, ympätään 1 litra Arthrobacter simplex-viljelmää ja tätä viljelmää inkuboidaan 30°C:ssa 24 tunnin ajan ilmastamalla (2 m /tunti) ja sekoittamalla (220 kierrosta/minuutti).
c) 9 g ll/$,21-dihydroksi-17o(-metoksimetoksi-4-preg-35 neeni-3,20-dionia liuotetaan 300 mlraan dimetyyliformamidia ja sen jälkeen suodatetaan steriilisti.
is 7 2744 d) 7,5 g CoSO^. 7H20: ta ja 7,5 g (NH^^SO^ra liuotetaan 500 ml:aan vettä, pH säädetään arvoon 6,5 ja steriloidaan .
e) 50 litran fermentointiastiaan pannaan 30 litraa 5 steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 0,5 % maissiliotetta 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,3 % "proteiinihydrolysaattia" 4 ml Silikon SH-valmistetta 10 4 ml Pluronic-valmistetta - säädetty pH-arvoon 7,0 -, tähän ympätään 3 litraa Arthrobacter simplex-esiviljelmää ja inkuboidaan 9 tunnin ajan 30°C:ssa ilmastalla (2 rn /tunti) ja sekoittamalla (220 kierrosta/minuutti). Sitten viljelmään 15 lisätään kohdassa c) valmistettu steriili 11^,21-dihydroksi-17oi-metoksimetoksi-4-pregneeni-3,20-dioniliuos ja kohdassa d) valmistetut lisäaineet. Sen jälkeen fermentoidaan edelleen 6 tunnin ajan.
Suoritetun fermentoinnin jälkeen 5 litralla etyleeni-20 kloridia stabiloitu viljelmäliemi uutetaan 3 kertaa 20 litran etyleenikloridierillä ja etyleenikloridiuute konsentroidaan pyörivässä haihduttimessa enintään 50°C:ssa vakuumissa. Tämän jälkeen seuraa puhdistus kromatografoimalla aluminium-oksidilla.
25 Saadaan 5,4 g 11^3,21-dihydroksi-17o£-raetoksimetoksi- 1,4-pregnadieeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste on 229/230-231°C.
Esimerkki 11 a) 2 litran erlenmeyer-pulloon, jossa on 1 litra ste-30 rilliä ravintoliuosta, joka sisältää 0,5 % maissiliotetta 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,1 % hiivauutetta - säädetty pH-arvoon 7,0 -, 35 ympätään Arthrobacter simplex ATCC 6946:n pestyä kuivavil- jelmää ja ravistellaan 30°C:ssa 72 tunnin ajan kierrosnopeu-den ollessa 180 kierrosta minuutissa.
19 7274 4 b) 50 litran fermentointiastiaan, jossa on 30 litraa steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 0,5 % maissiliotetta 0,05 % glukoosimonohydraattia 5 0,1 % hiivauutetta 4 ml Silikon SH-valmistetta 4 ml Pluronic-valmistetta - säädetty pH-arvoon 7,0 -, ympätään 1 litra Arthrobacter simplex-viljelmää ja tätä esi-10 viljelmää inkuboidaan 24 tunnin ajan 30°C:ssa ilmastamalla (2 m /tunti) ja sekoittamalla (220 kierrosta/minuutti).
c) 7,5 g 17/5-hydroksi-17oi-metyyli-4-androsten-3-onia liuotetaan 150 ml:aan dimetyyliformamidia ja sen jälkeen suodatetaan steriilisti.
15 d) 12 g CoSO^.7H20:ta ja 12 g (NH^)2SO^:a liuotetaan 500 ml:aan vettä, pH säädetään arvoon 6,5 ja steriloidaan.
e) 50 litran fermentointiastiaan pannaan 30 litraa steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 0,5 % maissiliotetta 20 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,3 % "proteiinihydrolysaattia" 4 ml Silikon SH-valmistetta 4 ml Pluronic-valmistetta - säädetty pH-arvoon 7,0 -, 25 tähän ympätään 3 litraa Arthrobacter simplex-esiviljelmää ja inkuboidaan 6 tuntia 30°C:ssa ilmastamalla (2 in /tunti) ja sekoittamalla (220 kierrosta/minututi). Sitten viljelmään lisätään kohdassa c) valmistettu steriili 17/3-hydroksi-17<s£-metyyli-4-androsten-3-oniliuos ja kohdassa d) valmistetut 30 lisäaineet. Sen jälkeen fermentoidaan edelleen 20 tuntia.
Suoritetun fermentoinnin jälkeen 5 litralla etyleeni-kloridia stabiloitu viljelmäliemi uutetaan 3 kertaa 20 litran erillä etyleenikloridia ja etyleenikloridiuute konsentroidaan pyörivässä haihduttimessa enintään 50°C:ssa vakuu-35 · missä. Tämän jälkeen seuraa puhdistus kromatografoimalla aluminiumoksidillä.
20 7 2 7 4 4
Saadaan 6,2 g 17^-hydroksi-17o(-metyyli-l, 4-androsta-dien-3-onia, jonka sulamispiste on 163-164,5°C.
Esimerkki 12 a) 2 litran erlenmeyer-pulloon, jossa on 1 litra 5 steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 0,5 % maissiliotetta 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,1 % hiivauutetta - säädetty pH-arvoon 7,0 -, 10 ympätään Arthrobacter simplex ATCC 6946:n pestyä kuivaviljel-mää ja ravistellaan 72 tuntia 30°C:ssa kierrosnopeuden ollessa 180 kierrosta minuutissa.
b) 50 litran fermentointiastiaan, jossa on 30 litraa steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 15 0,5 % maissiliotetta 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,1 % hiivauutetta 4 ml Silikon SH-valmistetta 4 ml Pluronic-valmistetta 20 - säädetty pH-arvoon 7,0 -, ympätään 1 litra Arthrobacter simplex-viljelmää ja tätä esi-viljelmää inkuboidaan 24 tuntia 30°C:ssa ilmastamalla (2 m^/ tunti) ja sekoittamalla (220 kierrosta/minuutti).
c) 6 g llf^, 17^-dihydroksi-16|3-metyli-4-pregneeni- 25 3,20-dionia liuotetaan 150 ml:aan etyleeniglykolimonometyy-lieetteriä ja sen jälkeen suodatetaan steriilisti.
d) 12 g CoSO^. 71^0: ta ja 12 g (NH^)250^:3 liuotetaan 500 ml:aan vettä, pH säädetään arvoon 6,5 ja steriloidaan.
e) 50 litran fermentointiastiaan pannaan 30 litraa 30 steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 0,5 % maissiliotetta 0,05 % glukoosimonohydraattia 0,3 % "proteiinihydrolysaattia” 4 ml Silikon SH-valmistetta 35 4 ml Pluronic-valmistetta - säädetty pH-arvoon 7,0 -, 2i 72744 tähän ympätään 3 litraa Arthrobacter simplex-esiviljelmää ja inkuboidaan 6 tuntia 30°C:ssa ilmastamalla (2 in /tunti) ja sekoittamalla (220 kierrosta/minuutti). Sitten viljelmään lisätään kohdassa c) valmistettu steriili 110(, 17c<-dihydroksi-5 16Ä-metyyli-4-pregneeni-3,20-dioniliuos ja kohdassa d) valmistetut lisäaineet. Sen jälkeen fermentoidaan edelleen 20 tuntia.
Suoritetun fermentoinnin jälkeen 5 litralla etyleeni-kloridia stabiloitu viljelmäliemi uutetaan 3 kertaa 20 lit-10 ran etyleenikloridierillä ja etyleenikloridiuute konsentroidaan pyörivässä haihduttimessa enintään 50°C:ssa vakuumissa. Tämän jälkeen seuraa puhdistus kromatografoimalla aluminium-oksidilla.
Saadaan 4,6 g llc<, 17o<-dihydroksi-16(3-metyyli-l, 4-15 pregnadieeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste on 203/204-205°C.
Esimerkki 13
Esimerkin 3 mukaisissa olosuhteissa fermentoidaan ste-riilisuodatettu liuos, jossa on 6 g 11<% IT*,21-trihydroksi-6ö(-metyyli-4-pregneeni-3,20-dionia, koboltti-ionien läsnäol-20 lessa Arthrobacter simplex (ATCC 6946)-viljelmän avulla 18 tuntia.
Fermentointiliemi käsitellään kuten esimerkissä 3 on kuvattu, jolloin saadaan 4,9 g 11/*, 17^, 21-trihydroksi-6<x-metyyli-1,4-pregnadieeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste 25 on 232-236°C.

Claims (5)

22 72744
1. I tai O -c\ /c\ 25 jossa Y on vety, fluori tai kloori, ja ryhmittymä U on V i CH_Z CH-Z
30 OH [ 2 | 2 ( ,R, C=0 C=0 ,C''' ' I - 'R0 tai I " \r Jz'' 2 1-----0^ Λ, 1 ?~R3 \h-0^ ''R, 35 joissa Z merkitsee vetyatomia, hydroksiryhmää, fluoriatomia tai klooriatomia, 23 72744 merkitsee vetyatomia tai alisyklistä hiilivetytähdettä, jossa on 1 - 4 hiiliatomia, R2 merkitsee vetyatomia, hydroksiryhmää, mahdollisesti happiatomin tai rikkiatomin katkaisemaa alkyyliryhmää, jossa 5 on 1 - 6 hiiliatomia, alkanoyylioksiryhmää, jossa on 1 - 6 hiiliatomia tai bentsoyylioksiryhmää, R^ merkitsee vetyatomia, hydroksiryhmää tai metyyliryhmää ja R4 ja R5 merkitsevät alkyyliryhmää, jossa on 1 - 4 hiiliatomia, tunnettu siitä, että 3-okso-A^-steroi-10 dia, jolla on yleinen kaava II j_I is y "y (11)' . X jossa / . U
20 X, A ja \ ovat merkitykseltään edellä mainittuja, B v tai sen ja 1 - 6 hiiliatomisten alkaanikarboksyylihappojen 21-esteriä fermentoidaan Arthrobacter simplex’in elävällä viljelmällä siten, että läsnä on 0,04g- 0,12 g koboltti(II)-25 ioneja viljelmän litraa kohden.
1. Menetelmä 3-okso- Δ^'^-steroidien valmistamiseksi, joilla on yleinen kaava I 5 K V - (I>’ i X jossa X merkitsee vetyatomia, klooriatomia, fluoriatomia tai metyy-15 liryhmää, ryhmittymä A on B / \ 20 0=c HOHC
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fermentointi suoritetaan Arthrobacter simplex ATCC 6946:n elävällä viljelmällä. 72744 24 '
FI814128A 1980-12-23 1981-12-22 Foerfarande foer framstaellning av 3-oxo- / 1,4-steroider. FI72744C (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3049399 1980-12-23
DE3049399 1980-12-23

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI814128L FI814128L (fi) 1982-06-24
FI72744B FI72744B (fi) 1987-03-31
FI72744C true FI72744C (fi) 1987-07-10

Family

ID=6120490

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI814128A FI72744C (fi) 1980-12-23 1981-12-22 Foerfarande foer framstaellning av 3-oxo- / 1,4-steroider.

Country Status (10)

Country Link
US (1) US4839282A (fi)
EP (1) EP0054810B1 (fi)
JP (1) JPS57170196A (fi)
AT (1) ATE21119T1 (fi)
DD (1) DD202049A5 (fi)
DE (1) DE3175049D1 (fi)
DK (1) DK572181A (fi)
FI (1) FI72744C (fi)
HU (1) HU187390B (fi)
RO (1) RO83629B (fi)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5192755A (en) * 1986-01-15 1993-03-09 Akzo N.V. Pregnane derivatives as immunomodulators
JPH04256202A (ja) * 1991-02-08 1992-09-10 Nec Corp ダイオード移相器
AU5873300A (en) * 1999-07-07 2001-01-30 Pharmacia & Upjohn Company Process to prepare exemestane
MXPA03011752A (es) * 2001-06-18 2004-07-01 Upjohn Co Proceso para preparar 21-acetato de 11b,17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-1, 4-dieno-3, 20- diona.
EP1359154A1 (en) * 2002-04-29 2003-11-05 BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH Further syntheses of cyproterone acetate
RU2480475C1 (ru) * 2011-11-16 2013-04-27 Российская Федерация, От Имени Которой Выступает Министерство Промышленности И Торговли Российской Федерации Микробиологический способ получения 21-ацетоксипрегна-1,4,9( 11 ),16-тетраен-3,20-диона из 21-ацетоксипрегна-4,9( 11 ),16-триен-3,20-диона
CN106699830A (zh) * 2016-11-20 2017-05-24 中国石油大学(华东) 一种16‑β甲基孕甾烯甾体激素中间体及其制备方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1070176B (de) * 1959-12-03 American Cyanamid Company, New York, N. Y. (V. St. A.) Verfahren zur Herstellung neuer Steroidverbindungen der 1, 4 - Pregnadienreihe
DE1093792B (de) * 1957-11-27 1960-12-01 Pfizer & Co C Verfahren zur Herstellung von 3-Keto-í¸-steroiden
DE1107225B (de) * 1959-08-05 1961-05-25 Hoechst Ag Verfahren zur Herstellung von 1, 4, 17(20)-Pregnatrienen
GB1092145A (en) * 1964-06-02 1967-11-22 Noda Inst For Scientific Res Microbiological conversion of steroids
US4101378A (en) * 1975-06-06 1978-07-18 Mitsubishi Chemical Industries Limited Process for the microbiological oxidation of steroids
DE3173923D1 (en) * 1980-12-23 1986-04-03 Schering Ag Process for the preparation of 11-beta, 21-dihydroxy-2'-methyl-5'-beta-h-1,4-pregnadieno-(16,17-d)-oxazole-3,20-dione

Also Published As

Publication number Publication date
JPH0260319B2 (fi) 1990-12-14
FI814128L (fi) 1982-06-24
DK572181A (da) 1982-06-24
ATE21119T1 (de) 1986-08-15
RO83629B (ro) 1984-08-30
HU187390B (en) 1985-12-28
RO83629A (ro) 1984-06-21
EP0054810A3 (en) 1983-09-28
DE3175049D1 (en) 1986-09-04
FI72744B (fi) 1987-03-31
JPS57170196A (en) 1982-10-20
EP0054810A2 (de) 1982-06-30
US4839282A (en) 1989-06-13
EP0054810B1 (de) 1986-07-30
DD202049A5 (de) 1983-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI72744C (fi) Foerfarande foer framstaellning av 3-oxo- / 1,4-steroider.
HU204305B (en) Process for 1,2-dehydrogenating 3-ketopregnen-21-esters with arthrobacter symplex or bacterium cyclooxydans
FI72144C (fi) Foerfarande foer framstaellning av 11 ,21- dihydroxi-2&#39;-metyl-5&#39; h-1,4-pregnadieno (16,17-d)-oxazol-3,20-dion.
EP0011235B1 (en) 9-alpha-hydroxy-3-oxopregna-4,17(20)-diene-20-carboxylic acid and its methyl ester and methods for the microbiological production thereof
CS258482B2 (en) Method of 4-androstane-3,17-dione and 1,4-androstadiene-3,17-dione production
US4336332A (en) Process for the manufacture of hydroxylated steroids
US4303754A (en) Method for obtaining 7β hydroxy steroids
Nakamatsu et al. Microbial Production of 3a α-H-4 α-(3′-Propionic acid)-5 α-hydroxy-7a β-methylhexahydro-1-indanone-δ-lactone from Soybean Sterol
KR970005319B1 (ko) 프레그네노-옥사졸린의 제조 방법
US2793162A (en) Production of 11beta-hydroxy-steroids by colletotrichum
GB1601168A (en) Hydroxylated 1a,2a-methylene-steroids
EP0046769B1 (en) Fermentation of bile
US4353985A (en) Process for the preparation of 11 β-hydroxy steroids
US4175006A (en) Composition of matter and process
EP0124903B1 (en) 11-hydroxypregn-4-en-3-one-20-carbaldehyde and a method for its production
US3076828A (en) 11-oxygenated-14alpha-hydroxy-9alpha-halogen-pregnenes
FI104736B (fi) Menetelmä 4-pregneeni-3,20-dionin ja sen johdannaisten valmistamiseksi
EP0126877A1 (de) Verfahren zur Herstellung von 3-Oxo-delta 1,4-steroiden
Weber et al. Preparation of 3-oxo-Δ 1, 4-steroids
US4223092A (en) Process for preparing 9α-OH BN acid methyl ester
JPH0120878B2 (fi)
EP0261187A1 (de) VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON 17a$g(a)-HYDROXY-D-HOMO-1,4-PREGNADIEN-3,20-DION
EP0042451A1 (de) Verfahren zur Herstellung von 11-beta-Hydroxysteroiden
JPH05503218A (ja) １７―オキソステロイドの製法
CS271347B2 (en) Method of 4-androstene-3,17-dione and 1,4-androstadiene-3,17-diene production

Legal Events

Date Code Title Description
MM Patent lapsed
MM Patent lapsed

Owner name: SCHERING AKTIENGESELLSCHAFT