FI65084B

FI65084B - Nytt foerfarande foer framstaellning av antibiotikumet sisomicin

Info

Publication number: FI65084B
Application number: FI800360A
Authority: FI
Inventors: Istvan Gado; Gyoergy Szvoboda; Miklos Jarai; Sandor Piukovich; Sandor Istvan; Antonia Jekkel
Original assignee: Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet
Priority date: 1979-02-06
Filing date: 1980-02-05
Publication date: 1983-11-30
Also published as: ATA61980A; AT369425B; DK144855C; JPS55104895A; FI800360A; HU179146B; DK144855B; IT1133061B; YU27980A; US4365020A; PL221821A1; ES8102592A1; SU1200854A3; PL120811B1; IT8067170A0; FI65084C; ES488972A0; CS222171B2; DK49180A; US4363876A

Description

I- rl rftl KUULUTUSJULKAISU £ C Π ft Δ 30¾ W <1,)UTL*OeNINOS$KlllFT 6&UH4 • jpJS c (45) :.: :z i::i ^ ^ (51) Kv.lk.3/lnt.CI.3 C 12 P 19/48 SUON I — FI N LAN D (21) PK*nulh»lwimi· — PitMUiwOknlng 800360 (22) H»k*mltptlvl — Aiuttknlnpdig 05. 02. 80 * * (23) Alkuptlvt —GUtl(h«tsdig 05. 02.80 (41) Tullut julklMktl — Bllvlt offentllj 07. 08. 80

Patentti- ia rekiatarihallitu· ______________ . . . ,, ,. , oL ™ 3o-u·83 (32)(33)(31) Pyr«l*ttr etuolkeut—Butrd priority 06.02.79

Unkari-Ungern(HU) Cl-1911 (71) Chinoin Gyogyszer £s Vegyeszeti Termekek Gylra Rt., 1-5, T6 utca, 101*5 Budapest, Unkari-Ungern(HU) (72) Istvan Gado, Budapest, Antonia Jekkel, Budapest,

György Szvoboda, Budapest, Miklös Järai, Budapest,

Sandor Piukovich, Budapest, Sindor Istvän, Szentendre,

Unkari-Ungern(HU) (7I+) Berggren Oy Ah (5l*) Uusi menetelmä sisomisiini-antibiootin valmistamiseksi -

Nytt förfarande för framställning av antibiotikumet sisomicin

Esillä oleva keksintö kohdistuu uuteen mikrobiologiseen menetelmään aikaisemmin tunnetun sisomisiini-antibiootin ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi viljelemällä sukuun Micromonospora kuuluvaa mikro-organismia aerobisissa olosuhteissa ravintoväliaineessa, joka sisältää assimiloituvia hiili- ja typpilähteitä sekä mineraalisuoloja, minkä jälkeen haluttaessa saatu sisomisiiniantibiootti eristetään fermentaatioliemestä ja erotetaan muista antibiooteista, puhdistetaan ja/tai haluttaessa muutetaan farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolakseen.

Sisomisiini (tai antibiootti 66-40) 0-2,6-diamino-2,3,4,6-tetradeoksi-a-D-glysero-heks-4-enopyranosyyli/l -*· 4/-0-(3-deoksi-4-C-metyyli-3-(metyyliamino)-8-L-arabinopyranosyyli-/l -+ 6//-2-deoksi-D-streptamiini) .

Sisanisiini on laajavaikutteinen antibiootti, joka estää grampositiivisten ja gramnegatiivisten bakteerien kasvua.

2 65084 Tämän antibiootin valmistamiseksi tunnetaan monia mikrobiologisia menetelmiä. Sitä tuotetaan esim. pääasiallisena tuotteena viljelemällä Micromonospora inyoensis NRRL 3292:ta (US-patentti 3 832 286 ja US-patentti 3 907 771) tai sitten sitä tuotetaan yhdessä verdamisiinin kanssa viljelemällä Micromonospora grisea NRRL 3800:a (US-patentti3 951 746) tai yhdessä G-52 antibiootin kanssa viljelemällä Micromonospora Zionensis NRRL 5466:a (US-patentti 3 956 068) tai yhdessä gentamisiinin kanssa viljelemällä Micromonospora purpurea var. nigrescens MNG 00122 (HU-patentti 168 778).

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että viljellään lajiin Micromonospora rosea kuuluvaa mikro-organismia, edullisesti kantaa MNG 00182.

Esillä olevan keksinnön mukainen sisomisiinin tuottamiseen soveltuva mikro-organismi eristettiin unkarilaisesta maanäyt-teestä. Tämä kanta, joka eroaa muista mikro-organismeista ja jolla on kyky tuottaa sisomisiiniä, on luokiteltu uudeksi Micromonospora-kannaksi ja on saanut nimen Micromonospora rosea species nova. Tästä mikro-organismista saatiin kanta Sl/109 erilaisilla spesifisillä kasvattamismenetelmillä. Micromonospora rosea Sl/109/-viljelmä on deponoitu 12 p:nä joulukuuta 1978 Budapestissä sijaitsevan laitoksen National Collection of Microorganisms, jossa sillä on deponointitunnus MNG 00182.

Se on myös deponoitu 16 päivänä tammikuuta 1980 Aberdenissä, Skotlannissa sijaitsevaan laitokseen National Collection of Industrial Bacteria deponointitunnuksella NCIB 11567. Viljelemällä organismia saadaan fermentaatioliuokseen korkea siso-misiinipitoisuus.

Yllä mainittuun laitokseen deponoidulla mikro-organismilla Micromonospora rosea Sl/109:llä on alla mainitut mikroskooppiset, makroskooppiset ja biokemialliset ominaisuudet.

Morfologia a) 10 päivän vanhan viljelmän, jota on inkuboitu 37°C:ssa Czapek agarilla, makroskooppisessa tarkastelussa voidaan havaita, että kasvu on suhteellisen hyvä, ilmamyseeliä ei näy, eikä diffundoituvaa pigmenttiä, pesäkkeet ovat hyvin kehittyneitä, säännöllisiä ja oranssinmustia väriltään.

3 65084 b) Organismia mikroskoopilla tarkasteltaessa nähdään pitkiä haarautuneita, säännöllisiä rihmoja, joissa ei ole väliseiniä ja joiden halkaisija on 0,5 ^u. Itiöt syntyvät yksinkertaisissa itiökapseleissa, joiden halkaisija on 1-1,5 ^u ja ne vaihtelevat ulkomuodoltaan pyöreästä munanmuotoiseen.

Biokemialliset ja fysiologiset ominaisuudet

Micromonospora rosea Sl/109-kanta kasvaa hyvin lämpötilassa 28-37°C, lämpötilassa 44°C ei esiinny kasvua.

Hiililähteen hyväksikäyttöä tutkittiin ravintoliuoksessa, jossa oli 0,5 % hiivauutetta, 1 % hiililähdettä, 0,1 % kalsiumkar-bonaattia, 1,5 % agaria tislatussa vedessä.

Taulukosta I ilmenee eri hiililähteiden käyttö.

Taulukko I

Hiilen hyväksikäyttö

Hiililähde Micromonospora rosea Sl/109

Arabinoosi huono

Riboosi varsin hyvä

Ramnoosi huono

Ksyloosi hyvä

Fruktoosi hyvä

Galaktoosi kohtalainen

Glukoosi hyvä

Laktoosi huono

Sakkaroosi hyvä

Raffinoosi kohtalainen-huono

Dulsitoli kohtalainen-huono

Mannitoli huono

Inositoli huono Tärkkelys hyvä

Typen hyväksikäyttöä tutkittiin ravintoliuoksessa, jossa oli 1 % glukoosia, 1,5 % agaria ja taulukon n mukaista typpiläh-dettä tislatussa vedessä. Taulukossa II on esitetty organismin typen hyväksikäyttö.

4 65084

Taulukko II Typen hyväksikäyttö

Typpilähde Micromonospora rosea Sl/109 0,5 % Hiivauutetta hyvä 1 % Asparagiinia kohtalainen-huono 1 % Glutamiinihappoa heikko 1 % Ammoniumnitraattia heikko 1 % NZ amiinia hyvä

Micromonospora rosea:n kasvava viljelmä hydrolysoi gelatiinia, maitoa ja tärkkelystä ja pelkistää nitraattia nitriitiksi. Organismi sietää korkeintaan 2 % NaCl:a ravintoliuoksessa.

Kasvuominaisuudet

Taulukossa III on esitetty Micromonospora rosea Sl/109:n kasvu-ominaisuudet. (Kuvailtaessa värinmuodostusta on käytetty seuraa-vaa viitettä: Baumanns Farbtonkarte Atlas II. Paul Baumann,

Aue I-SA 87350 LAu 302, GFR).

Taulukko III Kasvuominaisuudet Väliaine Micromonospora rosea Sl/109

Glukoosi-asparagiiniagar Ei kasvua

Peptoni-rauta-agar Kasvu heikkoa; likaisen keltaista muuttuen harmaaksi;

Co 40. Pieni itiökerros:

Co 63. Ei diffundoituvaa pigmenttiä

Emersonin agar Kasvu heikkoa: 1-2 pesäkettä.

Väri: oranssi, kirkas, heikosti rusehtava, 0 126 tai Oc 117

Glukoosihiivauuteagar Kasvu: varsin hyvä; väri: kirk kaan oranssi, muuttuen mustaksi, pesäkkeet voimakkaasti poimutettuja; Oc 98-Oc 120, ja myöhemmin 8 li 5 65084 Väliaine Micromonospora rosea Sl/109

Ravintoagar Kasvu: varsin hyvä; väri: kirk kaan oranssi, muuttuen mustaksi;

Oc 98-Oc 120 ja myöhemmin 8

Tyrosiiniagar Kasvu: hyvin heikkoa; väri: val koisen harmaa, paikoitellen musta; 8, vaaleanpunaista huokoista pigmenttiä, Oc 101

Czapek agar Kasvu: varsin hyvä; väri: kirkkaan oranssi ja myöhemmin musta;

Oc 97-Oc 120, ja myöhemmin 8

Bennetin agar Kasvu: varsin hyvä; väri: vaalean oranssi, muuttuen ruskeaksi;

Oc 97-Oc 119 tai 120, heikosti ruskeata liukenevaa pigmenttiä

Perunakappaleet Kasvu: juuri huomattavissa (ilman kalsiumkarbonaattia) väri: oranssi; Oc 96

Perunakappaleet Kasvu: juuri huomattavissa tai (kalsiumkarbonaatilla) hyvin heikkoa; väri: oranssi;

Oc 96-97 ja 99

Vertaamalla yllä esitettyjä kannan Sl/109 ominaisuuksia Luedemann'in Micromonosporan systeemiin voidaan kanta Sl/109 luokitella uudeksi Micromonospora-kannaksi.

6 65084

Kannan Micromonospora rosea Sl/109 vertaaminen tunnettuihin Micromonospora lajeihin

Kannan M. rosea Sl/109 ja muiden sisomisiinia tuottavien Micromonospora lajien - M. inyoensis, M. grisea ja M. zionensis -taksonomisen sukulaisuuden selvittämiseksi on suoritettu seu-raavat vertailukokeet.

1. Hiililähteen hyväksikäyttö

Hiililähde M. rosea M. inyoensis M. grisea M. zionensis

Arabinoosi huono huono hyvä hyvä

Ksyloosi hyvä (varsin huono) hyvä hyvä

Ramnoosi huono huono huono

Fruktoosi hyvä huono hyvä (hyvä)

Galaktoosi (hyvä) (varsin huono) hyvä hyvä

Glukoosi hyvä hyvä hyvä hyvä

Laktoosi huono (varsin huono) huono (hyvä)

Sakkaroosi hyvä hyvä hyvä hyvä

Raffinoosi (huono) huono huono huono

Dulsitoli (huono) huono huono huono

Mannitoli huono huono huono huono

Inositoli huono huono huono huono

Yllä olevista tuloksista havaitaan, että M. rosea eroaa selvästi muista lajeista. M. rosea eroaa M. inyoensiksesta fruktoosin, ksyloosin ja laktoosin hyväksikäytön suhteen. M. rosean ja M. grisean välillä on eroavaisuuksia mitä tulee arabinoosin ja galaktoosin hyväksikäyttöön. Verrattuna M. zionensikseen M. rosea ei käytä hyväkseen arabinoosia ja lisäksi on eroavaisuuksia galaktoosin ja laktoosin suhteen.

65084 7 2. Kasvuominaisuudet Väliaine M. rosea M. inyoensis M. grisea M. zionensis

Bennettin Varsin hyvä Varsin hyvä kas- Varsin voima- Varsin voimakas agar kasvu, orans- vu, tummenevia kas kasvu, kasvu, mustia sin värisiä voimakkaan rus- harmaanvih- pesäkkeitä myöhemmin rus- keitä pesäkkeitä reitä pesäkkeitä pesäkkei- keitä tä; Oc 97-Oc 119 tai 120, vaaleanruskeata liukenevaa pigmenttiä

Czapekin Varsin hyvä Heikko kasvu Heikko kasvu Tuskin lainkaan agar kasvu, kirk- kasvua kaan oranssin värisiä pesäkkeitä, Oc 97,

Oc 120 lopuksi mustia

Errersonin Heikko kasvu, Heikko kasvu, Heikko kasvu, Heikko kasvu, agar 1-2 pieniä punaisia pesäk- keltaisenrus- mustia pesäk- oranssin väri- keitä keitä pesäk- keitä siä pesäkkeitä keitä

Glukoosi- Ei kasvua Tuskin lainkaan Hyvin heikko Hyvin heikko asparagiini- kasvua kasvu kasvu agar

Glukoosi- Varsin hyvä Hyvä kasvu, har- Hyvä kasvu, Hyvä kasvu, hiivauute- kasvu, orans- maanpunaisia pe- keltaisenrus- harmaanpunerta- agar sin värisiä säkkeitä keitä pesäk- van ruskeita myöhennän mus- keitä pesäkkeitä - taksi muuttuvia pesäkkeitä;

Oc 98 - Oc 120 lopuksi 8

Ravinto- Varsin hyvä Tuskin lainkaan Tuskin lainkaan agar kasvu, oranssin kasvua kasvua värisiä, myöhemmin mustaksi muuttuvia pesäkkeitä, Oc 98, 8

Rauta- Heikko kasvu. Heikko kasvu Heikko kasvu Heikko kasvu peptoni- likaisen keltai- agar siä pesäkkeitä,

Co 40

Tyrosiini- Kaikissa tapauksissa heikko kasvu agar

Perunakappa- leet ilman CaCO^ta Kaikissa tapauksissa erittäin niukka kasvu

CaCO^rlla Niukka tai ei Varsin voimakas Varsin voimakas lainkaan kasvua kasvu kasvu 8 65084 Näistä tuloksista havaitaan esimerkiksi, että M. rosea on oranssin värinen Bennettin agarissa, kun taas M. grisea on vihreä ja M. inyoensis on ruosteenvärinen ja M. zionensis on mustahko samassa väliaineessa. Glukoosihiiva-agarissa M. rosea on oranssin värinen ja muuttuu myöhemmin mustaksi, M. grisea on ruskea, M. zionensis on punertavanruskea jne.

Edellä esitetyistä vertailukokeista voidaan päätellä, että Micro-monospora rosea eroaa selvästi muista sisomisiinia tuottavista lajeista.

Erään keksinnön mukaisen edullisen suoritusmuodon mukaan Micromonospora rosea Sl/109-organismia viljellään submerssi-olosuhteissa.

i; 9 65084

Ravintoliuos voi sisältää erilaisia assimiloituvia hiili- ja typpilähteitä, epäorgaanisia suoloja, hivenaineita ja vaahdon-estoaineita. Esimerkkeinä assimiloituvista hiili- ja typpiläh-teistä eli energialähteistä voidaan mainita soijajauho, soija-hydrolysaatti, kaseiinihydrolysaatti, maissin liuotusvesi, hiivauute ja erilaiset hiilihydraatit, kuten glukoosi, tärkkelys, liukoinen tärkkelys, dekstriini jne. Edullisia epäorgaanisia suoloja ovat esim. rauta-, magnesium- ja kobolttisuo-lat.

Ravintoliuoksen puskurikapasiteetin nostamiseksi lisätään edullisesti kalsiumkarbonaattia. Vaahdonestoaineina voidaan käyttää kasvisöljyjä (esim. palmuöljy, auringonkukkaöljy ja soija-öljy) .

Yhdistämällä ravintoliuoksen eri komponentteja saadaan erilaisia ravintoliuoksia. Ravistelukasvatuksessa tai ymppiä fermen-toitaessa eroaa ravintoliuos siitä, mitä käytetään itse fer-mentointiin.

Mainittua mikro-organismia viljellään edullisimmin ravintoliuoksessa, joka sisältää soijajauhoja, peptoni- tai kaseiini-hydrolysaattia, peruna- tai maissitärkkelystä, dekstriiniä tai liukoista tärkkelystä, glukoosia, kalsiumkarbonaattia, rauta- ja magnesiumsulfaattia, kobolttinitraattia ja palmu-öljyä .

Sisomisiinin tuotantoa voidaan ylläpitää lämpötilavälillä 25-40°C, edullisesti 28-33°C. Sekoituksen nopeus on 200-400 rpm. Ilmaa käytetään edullisesti 1/1 tilavuus/tilavuus minuuttia kohti.

Kokonaisantibioottiaktiivisuuden määrittämiseksi käytetään (sisomisiini ja muut vähäisessä määrin esiintyvät antibiootit) Staphylococcus epidermidis:tä testiorganismina. Määritys suoritetaan vertaamalla antibioottiaktiivisuutta sisomisiinin standardipitoisuuteen käyttämällä estovyöhykemeneteLmää (agar diffusion method).

Käymisliuoksen kokonaisaktiviteetti 100-130 tunnin kuluttua 10 65084 on noin 600-700 U/ml (1U = 1 ^ug/ml sisomisiiniemäksen ak tiivisuutta) .

85 % käymisliuoksen antibiooteista on sisomisiinia.

Kun antibioottiaktiivisuuden huippu saavutetaan, erotetaan sisomisiini yhdistämällä tekniikan tasosta tunnettuja vaiheita. Saatu sisomisiiniemäs muutetaan haluttaessa farmaseuttisesti hyväksyttäviksi suoloikseen.

Laboratorio-olosuhteissa saadaan sisomisiinia tuotettua 700- 3 800 yug/ml ja pilot-mittakaavassa, s.o. 1 m fermentointisäi-liössä saadaan 600-700 ^,ug/ml.

Saatu antibioottipitoisuus ylittää enemmän kuin kolme kertaa sen määrän mikä on esitetty US-patentissa 3 832 286, jota tähän asti on pidetty parhaana tuloksena. Käymisliuos sisältää sisomisiinin lisäksi vain 15 % tai vähemmän muita antibiootteja.

Seuraavat esimerkit kuvaavat tämän keksinnön edullisimpia suoritusmuotoja.

Esimerkki 1 1 ml kannan Micromonospora rosea Sl/109:n (MNG 00 182) kas-vurihmastoa (säilytetty syväjäädytettynä -20°C:ssa) lisättiin aseptisesti 3000 ml Erlenmeyer-pulloon, joka sisälsi 800 ml seuraavaa steriiliä ravintoliuosta:

Tryptonia ("Oxoid") 5 g

Soijajauhoa 10 g

Liukoista tärkkelystä 20 g

Glukoosia 1 g

Kalsiumkarbonaattia 2 g

Vesijohtovettä 1000 ml:aan

Ravintoliuoksen pH säädettiin arvoon 7,0 ennen sterilointia. Käymisliuosta inkuboitiin 3 päivää 28°C:ssa pyörivässä ravis-timessa (260 rpm, 10 cm isku). Täten saatua liuosta ympättiin (siirrostettiin) aseptisesti 100 litraan seuraavaa steriiliä ravintoliuosta:

II

11 65084

Soijajauhoa 10 g

Kaseiinihydrolysaattia (kuivapaino) 5 g

Perunatärkkelystä 22 g

Glukoosia 10 g

Kalsiumkarbonaattia 2 g

Palmuöljyä 2 g

Vesijohtovettä 1000 ml:aan

Kaseiini hydrolysoitiin pankreatiinilla. Ravintoliuoksen pH säädettiin arvoon 7,0 ennen sterilointia. Fermentointi suoritettiin aerobisesti 36-48 tuntia lämpötilassa 30°C, sekoituksella 400 rpm, käyttäen 1/1 tilavuus/tilavuus ilmaa. Vaahdon-estoaineena käytettiin palmuöljyä. 10 litraa täten saatua liuosta ympättiin 100 litraan ravintoliuosta, jonka koostumus oli:

Soijajauhoa 40 g

Peptonia 10 g

Perunatärkkelystä 10 g

Dekstriiniä 25 g

Glukoosia 5 g

Kalsiumkarbonaattia 4 g

Magnesiumsulfaattia (7H20) 2 g

Rautasulfaattia (7H20) 0,2 g

Kobolttinitraattia (6H2O) 0,8 mg

Palmuöljyä 2 g

Vesijohtovettä 1000 ml:aan

Edellä mainitun ravintoliuoksen pH säädettiin arvoon 8,0 ennen sterilointia. Sterilointi suoritettiin 121°C:ssa 1 tunnin ajan 1,3-1,4 at paineessa sekoittaen. Fermentointisäiliö oli ruostumattomasta teräksestä. Sekoitusnopeus oli 400 rpm ja ilmaa käytettiin 1/1 tilavuus/tilavuus. Vaahdonestoaineena käytettiin palmuöljyä.

Antibiootin tuotanto alkoi 35-40 tunnin kuluttua ja saavutti huippunsa 110-120 tunnin kuluttua. Fermentoinnin lopettamis-hetki määritettiin nopealla turbidimetrisellä menetelmällä käyttäen mikro-organismia Klebsiella pneumoniae (F. Kavanagh: 12 6 5 0 8 4

Dilution Methods of Antibiotic Assay, Analytical Microbiology, Acad. Press, New York, s. 125-140, /1963/).

Fermentoinnin lopulla saavutti tuotetun antibiootin määrä arvon 650 U/ml (1U vastaa 1 ^ug sisomisiiniemäksen standardi-aktiivisuutta määritettynä estovyöhykemenetelmällä käyttäen Staphylococcus epidermidistä testiorganismina (J.S. Simpson: Analytical Microbiology, Acad, Press, New York, s. 87-124, /1963/).

Esimerkki 2 1 ml kannan Micromonospora rosea Sl/109:n (MNG 00 182) kas-vurihmastoa (säilytetty syväjäädytettynä -20°C:ssa) lisättiin aseptisesti 3000 ml Erlenmeyer-pulloon, joka sisälsi 800 ml seuraavaa steriiliä ravintoliuosta:

Tryptonia ("Oxoid") 5 g

Soijajauhoa 10 g

Liukoista tärkkelystä 20 g

Glukoosia 1 g

Kalsiumkarbonaattia 2 g

Vesijohtovettä 1000 ml:aan

Ravintoliuoksen pH säädettiin arvoon 7,0 ennen sterilointia.

Käymisliuosta inkuboitiin 3 päivän ajan 28°C:ssa pyörivässä ravistimessa (260 rpm, 10 cm isku). Saatua liuosta ympättiin aseptisesti 100 litraan steriiliä ravintoliuosta, jolla oli seuraava koostumus:

Soijajauhoa 10 g

Sakkaroosia 10 g

Perunatärkkelystä 10 g

Kalsiumkarbonaattia 4 g

Palmuöljyä 2 g

Vesijohtovettä 1000 ml:aan

Ravintoliuoksen pH säädettiin arvoon 7,0 ennen sterilointia. Ilmastettua fermentointia ylläpidettiin 48-60 tuntia 30°C:ssa sekoittaen 400 rpm, ilmastuksen ollessa 1/1 tilavuus/tilavuus. Vaahdonestoaineena käytettiin palmuöljyä. Saatua liuosta ympättiin 1 in ravintoliuosta, jolla oli seuraava koostumus: 13 65084

Soijajauhoa 4Q g

Peptonia 10 g

Perunatärkkelystä 10 g

Dekstriiniä 25 g

Glukoosia 5 g

Kalsiumkarbonaattia 4 g

Magnesiumsulfaattia (7Η2<3) 2 g

Rautasulfaattia (7H20) 0,2 g

Kobolttinitraattia (6H20) 0,8 mg

Palmuöljyä 2 g

Vesijohtovettä 1000 ml:aan

Edellä mainitun ravintoliuoksen pH säädettiin arvoon 8,0 ennen sterilointia. Sterilointi suoritettiin 121°C:ssa 1 tunnin ajan 1,3-1,4 at paineessa, sekoittaen. Sekoitusnopeus oli 400 rpm, ilmastus oli 1/1 tilavuus/tilavuus. Vaahdonestoainee-na käytetiin palmuöljyä.

Antibiootin tuotanto alkoi 35-40 tunnin jälkeen ja saavutti huippunsa 110-120 tunnin fermentoinnin jälkeen. Fermentoinnin lopettamisajankohta määritettiin nopealla turbidimetrisellä menetelmällä käyttäen Klebsiella pneumoniae mikro-organismia.

Tuotettu antibioottimäärä saavutti arvon 600 U/ml fermentoinnin jälkeen (käytettiin estovyöhykemenetelmää).

Esimerkki 3 100 litraa esimerkin 1 mukaista itiösusoensiota lisättiin 1 m3 fer- mentaatioliuosta, jolla oli seuraava koostumus:

Soijajauhoa 40 g

Kaseiinihydrolysaattia (kuivapaino) 10 g

Perunatärkkelystä 10 g

Dekstriiniä 25 g

Glukoosia 5 g

Kalsiumkarbonaattia 4 g

Magnesiumsulfaattia (7H20) 2 g

Rautasulfaattia (7H20) 0,2 g

Kobolttinitraattia (6H20) 0,8 mg

Palmuöljyä 2 g

Vesijohtovettä 1000 mlraan 65084

Kaseiini hydrolysoitiin pankreatiinilla. Ravintoliuoksen pH säädettiin arvoon 8,0 ennen sterilointia. Sterilointi suoritettiin 121°C:ssa 1 tunnin ajan, 1,3-1,4 at paineessa, sekoittaen. Fermentointisäiliö oli ruostumattomasta teräksestä. Se-koitusnopeus oli 400 rpm ja ilmastus 1/1 tilavuus/tilavuus. Vaahdonestoaineena käytetiin palmuöljyä.

Tuotettu antibioottimäärä saavutti arvon 650 U/ml (käytettiin estovyöhykemenetelmää).

Esimerkki 4 100 litraa esimerkin 1 mukaista itiösuspensiota lisättiin 1 m^ fer-mentaatioliuosta, jolla oli seuraava koostumus:

Soijajauhoa 40 g

Kaseiinihydrolysaattia (kuivapaino) 10 g

Maissitärkkelystä 50 g

Glukoosia 5 g

Kalsiumkarbonaattia 4 g

Magnesiumsulfaattia (7H2O) 2 g

Rautasulfaattia (7H2O) 0,2 g

Kobolttinitraattia (6H20) 0,8 mg

Palmuöljyä 2 g

Vesijohtovettä 1000 mitään

Kaseiini hydrolysoitiin pankreatiinilla. Ravintoliuoksen pH säädettiin arvoon 8,0 ennen sterilointia. Sterilointi suoritettiin 121°C:ssa tunnin ajan paineessa 1,3-1,4 at sekoittaen. Fermentorisäiliö oli ruostumatonta terästä. Sekoitusno-peus oli 400 rpm ja ilmastus 1/1 tilavuus/tilavuus. Vaahdonestoaineena käytettiin palmuöljyä.

Antibiootin tuotanto alkoi 35-40 tunnin jälkeen ja saavutti huippunsa 110-120 tunnin fermentoinnin jälkeen. Fermentoinnin 65084 lopettamisajankohta määritettiin nopealla turbidimetrisellä menetelmällä käyttäen Klebsiella pneumoniae mikro-organismia.

Tuotetun antibiootin määrä saavutti fermentoinnin lopulla arvon 680 U/ml (käytettiin estovyöhykemenetelmää).

Fermentoinnin päätyttyä eristettiin puhdas sisomisiini alalla tunnetuilla menetelmillä.

Sp.: 198-201°C; (a>D = +188° (c = 0,3 vesi) IR spektri (KBr) : vOH, NH 3170-3360, vCH=COC 1690,v OOC 1060 cnf1 PMR spektri (D20): 61,20 (Me-4", s, 3H), 62,50 (Me-N-3", s, 3H), 62,56 (H-3", d, J2„ 3„ = 10 Hz, 1H), 63,17 (H-6'f bs, 2H), 63,30 (H -5”, d, J =12 Hz, 1H), 63,80 ax gem (H-2", dd, J2„ 3„ = 10 Hz, Jlit 2„ = 4 Hz, 1H) , 64,04 (Hf-5", d, Jge^ = 12 Hz, 1H), 64,88 (H-4', bt, 1H), 65,09 (H-l", d, Jin 2„ = 4 Hz, 1H), 65,35 (H-l’, d, , 2' = 2 Hz» 1H) ppm.

Massaspektri: molekyylipaino: 447

Karakterististen ionien massaluvut: (m/e): 447, 332, 304, 160, 145, 127, 118, 110, 100.

Esimerkki 5 (sisomisiinisulfaatin valmistaminen) 15 g puhdasta sisomisiiniemästä liuotettiin 60 ml:aan deioni-soitua vettä ja pH säädettiin arvoon 4,3 käyttäen 5-N rikkihappoa. Liuosta sekoitettiin 1,5 g aktiivihiilen kanssa 30 minuutin ajan, ja suodatettiin Seitz-suodatuspaperilla. Suodatuspa-peri pestiin kolme kertaa 5 ml :11a deionisoitua vettä ja suo-dokset yhdistettiin sekä tilavuus säädettiin 1 litraksi meta-nolia lisäämällä voimakkaasti sekoittaen. Liuosta säilytettiin viileässä ja muodostunut sakka suodatettiin pois. Saatua siso-misiinisulfaattia pestiin kolme kertaa 50 ml :11a metanolia ja kuivattiin tyhjössä 50°C:ssa fosforipentoksidin läsnäollessa ja saatiin 22 g sisomisiinisulfaattia.