KR840000655B1 - 로자마이신의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

로자마이신의 제조방법

제1도는 본 발명의 마이크로모스노포라로자리아를 이용한 원형질체로 유도된 모습을 위상차 현미경으로 관찰한 확대사진(3×5판)

제2도는 로자마이신을 제조하는 본 발명의 신균주를 확인한 사진(3×5판)

본 발명은 마이크로모노스포라 로자리아(micromonospora rosaria) RK-2(균주기탁 접수번호 : 821228-06717) 신균주를 사용하여 그람양성균 및 그람음성균의 성장을 저해하는 작용을 갖는 다음 일반식(Ⅰ)의 로자마이신(rosamicin: 항생물질 67-694로 불리우기도 한다)을 미생물학적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

상기식에서

R₁가 아세틸기이고,

R₂가 수소이며,

R₁과 R₂가 동일하게 아세틸기이거나 또는 수소이다.

본 발명에 의하여 제조되는 상기 일반식(Ⅰ)의 로자마이신을 마크로라이드 계열 항생체로서 1970년 웨인스테인(weintein) 등에 의해 처음 발견되어 미국특허출원(출원번호 제 4916호, 1970.1.22)된 이후 와그만(wagman) 및 와이츠(waitz) 등에 의하여 처음 규명되었다. 즉, 60의 발효 및 정제결과 1.5g을 얻었으며, 이 물질의 순도는 700μg/mg이므로 결국 배양액 1ml당 17.5μg이 회수되었었다.

본 발명에 사용된 마이크로 모노스포라 로자리아 RK-2균주는 마이크로모노스포라로자리아(NRRL 3,718)를 원균으로 하고, 폴리에틸렌글리콜을 사용하여 원형질체의 유도, 균사체로의 환원, 원형질체의 융합, 제조합균주의 선발방법에 의하여 원균주보다 로자마이신 생산능력이 최고 76% 증대한 우수한 신균주이다.

이때 사용되는 폴리에틸렌글리콜은 1974년 이래, 식물, 동물 세포뿐만 아니라 세균, 효모 등의 원형질 접합도 매우 효율적으로 유도하는 물질로서 알려졌으며, 여러 학자등에 의하여 이에 대한 많은 논문이 발표되었고 산업적인 응용도 시사되어 왔다. 그러나 아직까지는 이 방법에 의하여 구체적으로 산업화, 혹은 응용화 되고 있는 보고는 제한되어 있었다. 이제까지 국, 내외적으로 산업계에서는 항생제 생산균주의 역가를 돌연변이로 처리하여 생기는 돌연변이균주를 우발적으로 선택하여 개량하여 왔으나, 이러한 방법은 매우 비효율적으로 많은 인력이 소요될 뿐만 아니라 그 방법 자체의 한계성을 지니고 있었다.

본 발명의 도면에 의한 상세한 제조방법은 다음과 같다.

가. 원형질체의 유도

마이크로모노스포라 로자리아 균(NRRL 3,718)을 복합 액체배지(비프익스트렉스 0.3%, 트립통 0.5%, 이스트익스트렉트 0.5%, 포도당 0.1%, 수용성 전분 2.4%, CaCO₃0.2% pH7.6)에 배양하여 32℃의 회전식 진탕 배양기에서 200rpm의 조건으로 3일 배양한 후, 배양된 균을 초음파로 처리(ultrasonication)하여 균사가 12-20미크론이 되게 하고, 이것을 5%(V/V)로 다시 접종하여 같은 배지에서 같은 조건으로 2일 배양한 후, 회수하고 원심분리한 다음, 리소자임(lysozyme)으로 처리하면 도면 1및 2와 같은 원형질체를 유도한다.

나. 균사체로의 환원

유도된 원형질체는 세포벽이 제거된 매우 민감한 세포로서 이들을 다시 균사체로 배양하는 데는 특수한 완충용액 및 배지를 사용해야 한다. 이미 스트렙토마이세테스 등 미생물들에 대하여 균사체로의 환원에 유리한 배지조성 및 배양조건에 대한 학자들의 연구가 있었으나, 본 발명자들이 마이크로모노스포라 로자리아에 대해 시험해본 결과 부분적인 변화가 필요함을 확인하였으며, 최종적으로 결정된 용액 및 배지의 조성은 다음표 1과 같다.

원형질체를 희석하여 배지 위에 접종한 후, 32℃에서 배양했을 때 1-10일 후 재생된 군락들을 관찰할 수 있었다.

[표 1]

본 발명의 용액 및 배지의 조성

* 이 성분들은 따로 멸균하였음.

** 이 용액의 조성은 다음과 같다. (리터당) : ZnCl₂, 40mg : FeCl₃·6H₂O, 200mg : CuCL₂·2H₂O, 10mg : MnCl₂·4H₂O, 10mg : Na₂B₄O₇·10H₂O, 10mg : (NH₄)₆Mo₂₄·4H₂O, 10mg

다. 원형질체의 융합(protoplast fusion)

서로 다른 2종의 영양요구주로부터 원형질체를 유도하여 2×109 개/ml 정도 되게 용액을 만든 후, 이들을 각각 1ml씩 혼합한 후 3,000g으로 1분간 원심분리하여 상등액을 버리고, 폴리에틸렌글리콜 (분자량 1,000) 용액 50%에서 잘 썩인 상태에서 15분간 실온에서 방치한 후 완충용액을 넣어 희석한 다음 이를 적절한 농도로 재생배지에 플레이팅(plating)시킨다. 이때 재생배지에는 일체의 복합성분을 배제하여 오직 비영양요구주로 바뀐 재조합균주들만 성장하도록 유도한다. 원형질 융합없이 실험하는 경우와 비교했을 때 위에 언급된 원형질 융합에 의하면 재조합 균주가 발생하는 확률이 10⁴-10⁵배 증가하는 것이 확인되었다. 즉 두가지의 영양요구주를 크로스 오버(cross over)시켰을 때 융합에 의하지 않는 경우에는 10^-6-10^-8빈도였으나, 융합에 의한 결과는 10^-1-10^-2이었다.

라. 재조합(recombination)균주의 선발

영양요구주들을 사용하여 원형질체 융합방법에 의하여 재조합 균주가 매우 효과적으로 유발된다는 것이 입증되었다. 그러나 항생제 생성능력에 대하여 우수 균주를 유도, 선발하는 과정에서 재조합 균주들을 일일히 발효에 의해 역가측정을 하는 것은 매우 힘든 작업이 아닐 수 없다. 그러므로 본 발명자들은 고체배지 위에서 다수의 균략에 대해 손쉽게 그 생성능력을 테스트하는 방법을 고안하였다. 물론 고체 배지에서의 생성능력과 발효에 의한 액체 배지에서의 생성능력 사이에 정확한 상관관계가 있다고는 할 수 없으나 이 방법으로써 1차 테스트를 수행하는 것은 충분한 합리성을 지니고 있음을 확인하였다. 이제까지 문헌상에서 언급되었던 방법들은 미생물 군락을 그 밑의 아가 배지(agar)까지 함께 떼어다가 시험 균주(test organism)위에 놓고 성장저지 반경(inhibition zone)으로 실험하는 플러그 방법(plug method)이나, 미생물 군락 위에 시험균주를 반고형화 배지(soft agar)에 섞어서 붓고 성장저지 반경을 조사하는 반고형화 배지 오버레이 방법 등이 있으나, 이들은 많은 군락을 테스트하려 할때 매우 번거로운 단점이 있었다.

따라서 본 발명자들은 배양액 오버레이 방법을 개발하여 이 방법으로 비교적 손쉽게 많은량의 군락들의 항생제 생산능력을 조사할 수 있었다.

이 배양액 오버레이 방법을 알기쉽게 도식으로 표시하면 다음 표 2와 같다.

[표 2]

배양액 오버레이 방법

여기서 외관상으로 항생제 생산에 우수하게 나타난 재조합 균주들은 액체배지에서 발효한 후바이오어세이(bioassay)에 의하여 정량적으로 그 생산역가를 조사하여 마이크로모노스포라로자리아 RK-2균주가 원균주보다 로자마이신생산력이 현격하게 우수하여 이를 선발하였다.

마. 로자마이신을 제조하였다.

본 발명은 다음표 3과 같은 종래의 배지와 상이한 특수한 배지를 이용하여 280rpm, 28℃에서 5일간 배양하여 바이오어세이하여 로자마이신의 제조

본 발명의 신균주가 원균주에 비하여 76% 이상의 역가의 증대를 나타내었다.

[표 3]

본 발명의 배지의 성분과 농도

[실시예 1]

항생제 생성에 관하여 유전자들의 재조합이 본 방법에 의해 효과적으로 유발될 수 있는지의 여부를 조사하기 위하여 본 발명자들은 먼저 마이크로모노스포라 로자라이균을 화학 돌연변이체 MNNG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosogusridine)로 처리하여 로자마이신을 생성 못하는 수종의 돌연변이주를 분리하였다. 이들을 원형질체 융합하여 재조합 균주들을 선발하고 배양액 오버레이방법에 의하여 분석한 결과 전체 군락의 3내지 6%가 로자마이신 생성능력을 회복한 재조합 균주인 것으로 나타났다. 제3도에 나타난 바와 마찬가지로 각 군락의 로자마이신의 생산능력은 배양액 오버레이 방법에 의하여 매우 선명하게 표현되었다.

또한 성장저지 반경의 크기와 액체배지 에서의 발효에 의한 생산역가 사이에도 일반적인 상관성을 확인할 수 있었다.

[실시예 2]

본 실험에서는 로자마이신 생성능력을 계속 보유하는 영양 요구주들을 다수 선발하여 이들 사이에 여러쌍으로 원형질체 융합을 시킨후 재조합 균주를 400여개 분리하여 이들에 대해 배양액 오버레이 방법에 의해 2번 반복해서 항생제 생성능력조사를 하였다. 이 가운데서 최종적으로 20개의 군락이 선발되어 (우수균주로 1차 추정) 복합액체배지에서 30℃, 3일간 배양한 후 바이오어세이로 정량 분석하였다. 표 4에서 나와 있듯이 2개의 균주는 원균주(wild type)보다 우수한 균주로 확인되었다.

[표 4]

분리된 재조합 균주들의 로자마이신 생산력

[실시예 3]

실시예 2에서 분리된 본 발명의 신균주인 RK-2균주의 상승된 생산역가를 더 확실히 확인하고, 또한 보다 많은 생산을 유도하기 위하여 배지조성 성분을 조사하여 결정된 배지에서의 생산성을 비교 연구하였다. 기본 배지의 성분은 사카로스 4%, L-아스파라긴 0.15%, KNO₃0.3%, CaCO₃0.1%, K₂HPO₄0.2%, MgSO₄·7H₂O 0.05%, FeSO₄·7H₂O 0.0028%, MnSO₄·(4-6)H₂O 0.00026%, CuSO₄·5H₂O 0.00025%, ZnSO₄0.0003%, NaCl 0.01%였으며, 배양조건은 280rpm, 28℃로서 5일간 배양하여 바이오어세이 하였다.

이 기본 배지를 기초로 하여 각 성분의 농도 효과 등을 조사하여 본 발명자들은 상술한 표 3의 본 발명의 배지를 개발하였으며, 이를 최종 발효배지로 사용하였다. 이 배지를 사용하여 발효했을 때 상기 표 4에 나타난 생산역가의 10배 가량의 로자마이신이 생산되었으며, (즉, 300μg/ml) 본 발명의 RK-2 균주의 우수성이 다음표 5와 같이 다시 확인되었다.

[표 5]

원균주와 신균주와의 상대역가 비교표

Claims (3)

1. 마이크로모노스포라로자리아 RK-2(균주기탁접수번호 : 821228-06717호)를 사용하여 특수한 배지에서 발효시켜 로자마이신을 제조하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 특수한 배지는 수용성 전분4.0(g/l), L-아스파라긴 1.5(g/l), CaCO₃6.0(g/l), K₂HPO₄0.75(g/l), MgSO₄·7H₂O 0.5(g/l), FeSO₄·7H₂O 0.028(g/l), CuSO₄·7H₂O 0.0025(g/l), ZnSO₄·7H₂O 0.003(g/l), MnSO₄·(4-6)H₂O 0.0026(g/l)인로자마이신을 제조하는 방법.
3. 제1항에 있어서 마이크로모노스포라로자리아 RK-2 균주는 마이크로모노스포라로자리아(NRRL 3,718)로부터 원형질체의 유도, 균사체로의 환원, 원형질체의 융합, 재조합균주의 선발에 의하여 변이시키는 로자마이신을 제조하는 방법.

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