FI58332C - Foerfarande foer framstaellning av estrar av klavulansyra - Google Patents

Description

raSFH [B] (11)KUULUTUSjULKAlSU C g 7 7 O

flgjTffi L J ' } UTLÄGGN INGSSKRIFT 0 ° ° ^ ^ jg^fe c (4S) Patentti «y-vnnctty 12 01 1231 ^ T ^ (51) Kv.ik.3/int.ci.3 C 07 D 498/04 SUOMI —FINLAND (21) P«*nttlh»lMnHM — P»t*nttn*öknln| 780201 (22) H*k*ml*ptlvl — Arottkntnpdtf 23.01.78 ^ ^ (23) Alku pilvi — Clltl|h«ttdtg 16.04.75 (41) Tullut luikituksi — Bllvlt offuntllf 23.01.78

Patentti· ]a rekisterihallitut (44) Nihtmicp™* μ kUul.|ulk.iWn pvm.-

Patent· och registerstyrelsen Amttktn utltfd och uti.skrifttn public·™* 30.09.80 (32)(33)(31) ^yydutty utuolkuut—Bu|lrd prlorltut 20.0l+. 7l+ 09.10.7^, 21.06.71*, 11.12.7!+ Iso-Britannia-Storbritannien(GB) 17^+10/7^, 43651/74, 27715/7^, 53525/7!+ (71) Beecham Group Limited, Beecham House, Great West Road, Brentford,

Middlesex, Englanti~England(GB) (72) Martin Cple, Dorking, Surrey, Thomas Trevor Howarth, Rudwick, Sussex, Christopher Reading, Southwater, Sussex, Englanti-England(GB) (7!+) Berggren Oy Ah (5!+) Menetelmä klavulaanihapon estereiden valmistamiseksi - Förfarande för framställning av estrar av klavulansyra

(62) Jakamalla erotettu hakemuksesta 751133 (patentti 54l44) - Avdelad frän ansökan 751133 (patent 5^1 !+M

Tämä keksintö kohdistuu menetelmään klavulaanihapon estereiden valmistamiseksi klavulaanihaposta tai sen suolasta. Klavulaanihappoa voidaan valmistaa viljelemällä aerobisesti Streptomyces clavulige-rusta.

a. Streptomyces clavuligerusta on selostettu yksityiskohtaisesti Higgens'in ym. julkaisussa Int. J. Systematic Bacteriology, 2_1, 326 (1971). Tällä streptomyseetilla on mielenkiintoa, koska se tuotti määrättyjä β-laktaamiantibiootteja, kuten penisilliiniä N, 7-(5-amino-5-karboksivaleramido)-3-karbamoyylioksimetyyli-3-kefem-4-karboksyylihappoa ja 7-(5-amino-5-karboksivaleramido)-3-karbamoyyli-oksimetyyli-7-metoksi-3-kefem-4-karboksyylihappoa. Streptomyseetti on deponoitu Agricultural Research Service Collection'iin nimikkeellä NRRL 3585 ja American Type Culture Collections'iin nimikkellä ATCC 27064. Streptomyces clavuligerukseen on myös viitattu US-patentissa n:o 3 770 590 sekä myös Nagarajan'in ym. artikkelissa julkaisussa J. Amer. Chem. Soc., 9_3, 2308 (1971), Brannaon' in ym. artikkelissa julkaisussa Antimicrob. Agents Chemother., 1, 237 (1972) ja julkaisussa Antimicrob. Agents Chemother., 3^, 247 (1972) sekä Higgens'in ym. artikkelissa julkaisussa J. Antibiotics, 2T_, 298 (1974).

2 58332 b. B-laktamaasit ovat entsyymejä, jotka avaavat penisilliinien ja kefalosporiinien β-laktaamirenkaan antaen tuotteita, joilta puuttuu bakteerienvastäinen vaikutus. Näitä entsyymejä tuottavat useat bakteerit, erityisesti Escherichian, Klebsiellan, Proteuksen, Pseudo-monaksen, Enterobachterin ja Staphylococcuksen lajit tai kannat ja ne ovat useissa tapauksisa selityksenä tällaisten organismien määrättyjen kantojen vastustuskyvylle muutamiin penisilliineihin ja ke-falosporiineihin nähden, β-laktamaasituotannon tärkeys ymmärretään, kun oivalletaan että suuri osa kliinisesti eristetyistä organismeista tuottavat 'B-laktamaasia /katso esim. M. Wilson ja I.A. Freeman, Bacteriological Proceedings, 80 (1969) , jossa he artikkelissa "Penicillin Inactivation by Gram-negative Bacilli" osoittavat että 84 % amerikkalaisessa sairaalassa eristeytistä gram-negatiivisista organismeista tuottavat B-laktamaasia7· Monissa tapauksissa jotkut penisilliinit tai kefalosporiinit ovat tehottomia hoidettaessa β-lakta-maasia tuottavien organismien aiheuttamia sairauksia johtuen β-lakta-maasia tuottavan aineen yhteisinfektion tavallisesta esiintymisestä /katso esim. R. May ym? Brit. J. Dis. Chest., 66, 185 (1972/7· B-lakta-maasia inhiboivan aineen yhdistäminen penisilliinin tai kefalosporii-nin kanssa luulisi suojaavan jälkimmäistä bakteerien β-laktamaasi-hajotukselta ja siten parantavan niiden bakteerienvastaista vaikutusta monia infektioita aiheuttavia organismeja vastaan. Tätä bakteerien-vastaisen vaikutuksen tehostumisprosessia kutsutaan synergismiksi, kun yhdistelämän bakteerienvastainen vaikutus on paljon suurempi kuin molempien erillisten aineiden aktiviteettien yksinkertainen summa. Seoksen B-laktamaasia inhiboivaa ainesosaa kutsutaan synergistiksi ja tällaiset aineet ovat arvokkaita penisilliinien ja kefalosporiinien bakteerienvastaista vaikutusta lisääviä aineita vastustuskykyisiä organismeja vastaan. Tämän keksinnön tarkoituksena on aikaansaada tällaisia synergistejä.

c. Esimerkkejä määrättyjen 3-laktamaasiin nähden vastustuskykyisten puolisynteettisten penisilliinien ja kefalospotiinien, kuten B-laktamaasi-inhibiittoreiden ja penisilliinien sekä kefalosporiinien synergistien käyttöä on jo selostettu kirjallisuudessa, katso esim. Sutherland ym., Nature, 201, 868 (1964)? Sabath ym., Nature 204, 1066 (1964)? O'Callaghan ym., Antimicrob. Agents and Chemothera-py, 1968, 67 (1969). Millään näistä tunnetuista aineista ei kuitenkaan ole mitään dramaattista vaikutusta seoksessa läsnä olevan toisen antibioottisen aineen vaikutusalueeseen.

3 58332 d. On selostettu että määrätyt aktinomyseetti-viljelmät tuottavat 3-laktamaasia inhiboivia aineita, jotka toimivat synergistisesti penisilliinien tai kefalosporiinien kanssa, kuten esim. brittiläisessä patentissa n:o 1 363 075 jaHata'n ym. J. Antibiotics, 25, 473 (1972) ja Umezawa'n ym., J. Antibiotics, ,26, 51 (1973) selostamat viljelmät. Millään näistä aktinomysetaali-alkuperää olevista 3-laktamaasi-inhi-biittoreista ei kuitenkaan ole havaittu olevan kliinistä käyttöä. Erityisen huomattavia piirteitä, jotka erottavat klavulaanihapon muista aktinomysetaali-alkuperää olevista B-laktamaasi-inhibiitto-reista ovat sen uutettavuus orgaanisiin liuottimiin suodosviljelmis-tä pH-arvossa 2, sen stabiliteetti ihmisveressä ja sen laaja baktee-rienvastaisen ja 8-laktamaasia inhiboivan aktiviteetin spektri, sen alhainen molekyylipaino ja korkeat R^-arvot paperikromatografiässä, jossa on käytetty lukuisia liuotinjärjestelmiä.

On havaittu, että Streptomyces clavuligeruksen aerobinen viljelmä tavanomaisissa ravintOväliaineissa noin 25-30°C:ssa karkeasti ottaen neutraaleissa olosuhteissa tuottaa 8-laktamaasia inhiboivan aineen, jolla myös on bakteerienvastainen vaikutus. Tälle uudelle aineelle on annettu nimitys "klavulaanihappo".

Klavulaanihapolla on seuraavat ominaisuudet: (a) Se on karboksyylihappo.

(b) Se muodostaa natriumsuolan.

(c) Se kykenee inhiboimaan Staphylococcus aureuksen kantojen kasvun.

(d) Se kykenee synergoimaan ampisilliinin bakteerienvastaisen vaikutuksen Escherichia colin, Klebsiella aerogenesin ja Staphylococcus aureuksen 3-laktamaasia tuottavia kantoja vastaan.

(e) Se kykenee synergoimaan kefaloridiinin bakteerienvastaisen vaikutuksen Proteus mirabiliksen ja Staphylococcus aureuksen 3-laktamaasia tuottavia kantoja vastaan.

(f) Se muodostaa metyyliesterin, jolla on molekyylipaino (massa-spektroskopian mukaan) 213, 0635, joka vastaa kaavaa CgH^NOs.

Klavulaanihapon voidaan siten katsoa oleva kaavan CgHgNO^ mukainen yksiemäksinen karboksyylihappo.

4 58332

Streptomyces clavuligeruksen tuottamalla yhdisteellä, jolla on yllä olevat ominaisuudet, on kaava (II): _S°\ /cn20a * / ^ (II) nco2h

Siten klavulaanihappoa voidaan nimittää 3-(3-hydroksietylideeni)-7-okso-4-oksa-l-atsabisyklo/3,2,07heptaani-2-karboksyylihapoksi.

Klavulaanihapon stereokemia kohdassa C5 ja C2 on sama kuin luonnossa esiintyvissä penisilliineissä ja kefalosporiineissa, joten klavulaanihappoa voidaan kuvata rakennekaavalla (I): ^<\ ch2oh Γ f* <I> co2h

Siten täydellisempi kemiallinen nimitys klavulaanihapolle on Z-(2R, 5R)-3-(3-hydroksietylideeni)-7-okso-4-oksa-l-atsabisyklo/3,2, 0/hep-taan i-2-karboksyy1ihappo.

Klavulaanihapon suuri käyttökelpoisuus on ilmeinen oivallettaessa, että Kelbsiella aerogenesin A määrätyt kannat, joiden kasvua ei inhiboi ampisilliinin, amoksisilliinin, karbenisilliinin tai bentsyyii-penisilliinin läsnäolo määrässä 125^ug/ml tai klavulaanihapon läsnäolo määrässä 10yug/ml, inhiboituvat kun läsnä on alle 12,5^ug/ml edellä mainittuja penisilliinejä, jos läsnä on myös 5^ug/ml klavulaanihappoa. Samanlaisia tuloksia on myös havaittu erilaisia klavu-laanihappoestereitä sisältävissä yhdistelmissä. Esimerkiksi Klebsiella aerogenesin A kannat, joiden kasvua ei 125^,ug/ml ampisillii-nia tai 10^ug/ml klavulaanihappometyyliesteriä inhiboi, inhiboituvat vähemmästä kuin 12,5^,ug/ί sta/ml ampisilliinia klavulaanihappome-tyyliesterin läsnäollessa määrässä 5^ug/ml.

Tämän keksinnön tarkoituksena on näin ollen valmistaa klavulaanihapon estereitä.

5 58332

Klavulaanihapon sopivia estereitä ovat sellaiset, jotka ovat peräisin alkoholeista kuten metanolista, etanolista, propanolista, buta-nolista, 2,2,2-trikloorietanolista, 2,2,2-trifluorietanolista, bent-syylialkoholista, p-nitrobentsyylialkoholista, fenolista, asetoksi-metanolista, pivaloyylioksimetanolista, 2-dimetyyliaminoetanolista ja muista tavanomaisista alkoholeista. Lukuisat klavulaanihapon esterit ovat käyttökelpoisia välituotteita määrätyissä klavulaanihapon puhdistusprosessissa. Monet klavulaanihappoesterit ovat käyttökelpoisia synergistisiä yhdisteitä. Tällaisten esterien aktiviteetti voi johtua esterin hydrolyysistä kantahapoksi.

Tässä yhteydessä sanonta esteri käsittää esterit, jotka ovat peräisin alkoholista tai tiolista, jolla on kaava RÖH tai RSH, jossa R on orgaaninen tähde. Sopivia ryhmiä R ovat alkyyli, alkenyyli, alky-nyyli, aryyli, aryylialkyyli tai muut samantapaiset ryhmät, joista mikä tahansa voi olla haluttaessa substituoitu. Jottei molekyyli-paino kohoaisi suhteettomassa määrin ryhmät R eivät tavallisesti sisällä enemmän kuin 16 hiiliatomia, edullisesti korkeintaan 12 hiili-atomia ja kaikkein sopivimmin korkeintaan 8 hiiliatomia.

Ryhmä R on edullisesti peräisin alkoholista RÖH tai (vähemmän edullisesti) tiolista RSH, joka on farmaseuttisesti hyväksyttävä.

Sopivia substituentteja, joita voidaan sisällyttää ryhmään R ovat halogeeniatomi ja alhaiset alkoksyyli-, hydroksyyli-, alhaiset asyy-lioksyyli-, alhaiset alkyyliamino-, alhaiset dialkyyliamino-, ja sentapaiset ryhmät. Sanonta "alhainen" tarkoittaa että ryhmä sisältää korkeintaan 6 hiiliatomia ja edullisesti korkeintaan 4 hiiliatomia. Siten R voi esim. olla metyyli, etyyli, n-propyyli, isopropyyli, suora tai haarautunut butyyli, pentyyli, heptyyli, oktyyli, nonyyli, dekyyli, undekyyli, dodekyyli, vinyyli, allyyli, butenyyli, syklo-propyyli, syklobutyyli, syklopentyyli, sykloheksyyli, sykloheptyyli, sykloheksenyyli, sykloheksadienyyli, metyylisyklopentyyli, metyyli-sykloheksyyli, bentsyyli, bentshydryyli, fenyylietyyli, naftyyli-metyyli, fenyyli, naftyyli, propynyyli, tolyyli, 2-kloorietyyli, 2,2,2-trikloorietyyli, 2,2,2-trifluorietyyli, asetyylimetyyli, bentsoyylimetyyli, 2-metoksietyyli, 2-dimetyyliaminoetyyli, 2-dietyy-liaminoetyyli, 2-piperidinoetyyli, 2-morfolinoetyyli, 3-dimetyyli-aminopropyyli, p-klooribentsyyli, p-metoksibentsyyli, p-nitrobent-syyli, p-bromibentsyyli, m-klooribentsyyli, 6-metoksinaftyyli-2- 6 58332 metyyli-p-kloorifenyyli, p-metoksifenyyli tai mikä tahansa sellainen ryhmä kuten myös sellaiset ryhmät, joiden penisilliini- tai ke-falosporiinitekniikasta tiedetään tuottavan sellaisia estereitä, jotka helposti hydrolysoituvat elävässä elimistössä kanta-antibiootiksi.

Helposti hydrolysoitavia estereitä ovat esim. ne, joilla on kaavat (V) ja (VI) : __/ , ch2oh I / ^ (v) J— ° \ co ; N0- C — x — CO — A-, i 3 Ä2

_/CH20H

J—(vi) o '

^CO

^-0— CH-Z

I I

X_ C = Y

joissa A^ on vetyatomi, alkyyli-, aryyli- tai aralkyyliryhmä, A2 on vetyatomi tai metyyliryhmä, A3 on alkyyli-, aryyli- tai aralkyyliryhmä, X on happi tai rikki, Y on happi tai rikki ja Z on kaksiarvoinen orgaaninen ryhmä. Kaavojen (V) ja (VI) mukaisia estereitä, jotka verraten helposti vapauttavat klavulaanihappoa verivirtaan antamisen jälkeen, ovat sellaisia, joissa A^ on vetyatomi, A2 on vety-atomi tai metyyliryhmä ja A3 on metyyli-, etyyli-, propyyli-, bu-tyyli-, bentsyyli- tai fenyyliryhmä ja ne joissa X on happi, Y on happi ja Z on -CH2CH2-, -CH:CH-, . ^ OCH, X) “ -

Edellisen kaavan yhteydessä käytettynä sanonta "alkyyli" tarkoittaa 7 58332 korkeintaan 6 hiiliatomia sisältävää alkyyliä, sanonta "aryyli" tarkoittaa fenyyliä, naftyyliä tai fenyyliä, joka on substituoitu iner-tillä substituentilla, kuten fluori- tai klooriatomilla tai metyyli-tairaetoksyyliryhmällä tai sen tapaisella, tässä yhteydessä käytettynä sanonta "aralkyyli" tarkoittaa aryyliryhmällä substituoitua alkyyli-ryhmää.

Kaavojen (V) ja (VI) mukaisia erityisen sopivia estereitä ovat ne, joilla on kaavat (VII) ja (VIII): . 0

-s' v . CH~OH

/=^ a4 (VII) }—»-—c t o XC0 - O - CH - 0 - CO - A5

, CH*>OH

H

J- N -—/ & NC0 - 0 - /A6 o I iT (Vili) o 6 joissa A4 on vetyatomi tai metyyliryhmä, Ag on metyyli, t-butyyli tai fenyyliryhmä ja Αβ on vetyatomi tai metoksiryhmä.

Monet klavulaanihapon esterit eroavat penisilliinien tai kefalospo-riinien analogisista estereistä siinä, että niillä on suurempi pyrkimys hydrolysoitua k1avuläänihapoksi lievissä olosuhteissa. Siten esim. yksinkertaiset alkyyliesterit, kuten metyyliesteri, hitaasti hydrolysoituvat klavulaanihapoksi vedessä, joka on puskuroitu pH-arvoon 7. Esterit, jotka läpikäyvät jonkin verran hydrolyysia lievissä olosuhteissa ovat kaavan (IX) mukaisia:

I-f°\-/ CH2°H

J—»-( (IX) 0 \

C02R

jossa R on 1-9 hiiliatomia sisältävä hiilivetyryhmä, joka mahdollisesti on substituoitu halogeenilla, alhaisella alkoksilla, hydrok-s-yIillä tai mahdollisesti suolan muodossa olevilla emäksisisillä 8 58332 ryhmillä, joilla on kaava NR R , jossa R on vetyatomi tai alhainen 3 alkyyliryhmä, R on vetyatomi tai alhainen alkyyliryhmä tai sitou- 2 3 tunut ryhmään r2, niin että NR RJ on 5- tai 6-jäseninen rengas.

Kaavan (I) yhteydessä käytettynä sanonta "alhainen" tarkoittaa että ryhmä sisältää 1-4 hiiliatomia.

Sopivia Rl-ryhmiä ovat alkyyli- ja aralkyyliryhmät, jotka mahdollisesti on substituoitu halogeenilla, metoksyylillä, hydroksyyIillä tai suolatuilla NR2R3-ryhmillä, joissa r2 on metyyli- tai etyyli- ryhmä ja R3 on metyyli- tai etyyliryhmä tai sitoutunut ryhmään R^, 2 3 niin että NR R on pyrrolidiini-, piperidiini- tai morfoliiniryhmä.

Alkyyliryhmät Rl ovat kaikkein edullisimmin suoraketjuisia korkeintaan 6 hiiliatomia sisältäviä ryhmiä, jotka mahdollisesti on substi- 2 3 tuoitu yhdellä nietoksilla, hydroksyylillä, NR R -suola- ryhmällä tai yhdellä kloori-, bromi- tai jodiatomilla tai CCI3- tai CF3-ryhmällä.

Klavulaanihapon synergisteinä erityisen käyttökelpoisia estereitä ovat ne, jotka hydrolysoituvat nisäkkäiden kudoksissa, erityisesti ihmisveressä, klavulaanihapon tai sen suolan muodostamiseksi, koska uskotaan, että k.lavulaanihappo ja sen suolat pyrkivät olemaan hieman käyttökelpoisempia synergistisiä aineita kuin itse esterit. Monet kaavojen (V)-(IX) mukaiset esterit ovat käyttökelpoisia tähän tarkoitukseen.

Tämän keksinnön erityisen sopivien estereiden lisäryhmä ovat ne käyttökelpoiset välituotteet, jotka ovat helposti muunnettavissa klavulaanihapoksi tai sen suolaksi sellaisilla kemiallisilla tai biokemiallisilla menetelmillä, joita tunnetaan penisilliini- tai ke-falosporiinitekniikasta riittävän lieviksi hajottamatta reaktiivisia happolabiileja β-laktaamirenkaita.

Esteri on kaikkein edullisimmin sellainen, joka on poistettavissa hydraamalla. Tällaiseen prosessiin sopivia tavanomaisia este reitä ovat bentsyyli, substituoitu bentsyyli, bentshydryyli, substituoitu bentshydryy1i, trityyli ja sentapaiset. Bentsyyliesteri on osoittautunut erityisiin käyttökelpoiseksi tähän tarkoitukseen.

Minkä tahansa substituentin luonne esteriryhmässä on epäolennainen niin kauan kun se ei häiritse hydraasireaktiota.

9 58332 Tämän keksinnön tarkoituksena on aikaansaada menetelmä klavulaani-hapon esterien valmistamiseksi klavulaanihaposta tai sen suolasta muodostamalla esteri sinänsä tunnetuilla menetelmillä.

Klavulaanihappo tai sen suola voidaan muuttaa esteriksi alla selostetuilla esteröintireaktioilla. Suosittu menetelmä klavulaanihapon halutun esterin muodostamiseksi on saattaa klavulaanihapon suola reagoimaan esteröintiaineen kuten reaktiivisen halogenidin, sulfonaat-tiesterin tai sentapaisen kanssa, kuten alla on selostettu. Tällaiset reaktiot suoritetaan usein orgaanisessa liuottimessa, jolla on korkea dielektrisyyskerroin kuten dimetyyliformamidissa, dimetyyli-formamidi/asetonissa, dimetyylisulfoksidissa, N-metyyliasetamidissa, heksametyylifosforämidiäsa ja sentapaisessa.

Haluttaessa voidaan klavulaanihapon suola liuottaa liuottimeen tavanomaiseen tapaan tai se voidaan sitoa polymeeriseen kantajaan. Sopivia tässä menetelmässä käytettäviä kantajia ovat voimakkaasti emäksiset anioninvaihtohartsit, erityisesti ne joilla on makroverkkoi-nen luonne, joka sallii vedettömien liuotinjärjestelmien käytön. Amerblyst A26 on havaittu sopivaksi tähän tarkoitukseen. Klavulaani-happosuola voidaan adsorboida hartsille viljelmäsuodoksesta ja hartsi sen jälkeen suspendoida dimetyyliformamidiin, joka sisältää natrium-jodidia tai vaihtoehtoisesti eluoida kolonnikohtaisesti natriumjo-didin dimetyyliformamidiliuoksella tai dimetyyliformamidin ja asetonin seoksessa.

Muodostuttuaan puhdistetaan klavulaanihapon epäpuhdas esteri tavallisesti kromatograafisesti. Tällaisissa menetelmissä liuotetaan esteri tavallisesti orgaaniseen liuottimeen kuten etyyliasetaattiin, metyleenikloridiin, kloroformiin, sykloheksaaniin tai samantapaisiin liuottimiin. Kromatograafisessa prosessissa käytetty kiinteä faasi on tavallisesti inertinen aine kuten piigeeli tai kromatograa-fisesti samantapainen aine.

Jakeet, jotka tulevat kolonnista, voidaan testata klavulaanihapon läsnäolon suhteen käyttämällä hyväksi tämän synergistisiä ominaisuuksia. Aktiiviset jakeet yhdistetään tavallisesti ja orgaaninen liuotin poistetaan haihduttamalla alennetussa paineessa.

10 5 8332 Tällä menetelmällä saatu esteri on tavallisesti riittävän puhdas, mutta yhdiste voidaan kromatografoida uudestaan haluttaessa.

Keksinnön mukainen menetelmä klavulaanihapon estereiden valmistamiseksi on tunnettu siitä, että klavulaanihappo tai sen suola saatetaan reagoimaan yhdisteen kanssa, jolla on kaava Q - R, jossa Q on helposti korvattava ryhmä ja R on 1-9 hiiliatomia sisältävä hii-livetyryhmä, joka mahdollisesti on substituoitu halogeenilla,alemmalla alkoksiryhmällä, hydroksyyliryhmällä tai mahdollisesti suolan 2 3 2 muodossa olevalla emäksisellä ryhmällä NR R , jossa R on vetyatomi 3 tai alempi alkyyliryhmä ja R on vetyatomi tai alempi alkyyliryhmä 2 2 3 tai on liittynyt ryhmään R niin, että NR R on 5- tai 6-jäseninen rengas.

Sopivia klavulaanihapon suoloja, joita voidaan saattaa reagoimaan yhdisteiden R - Q kanssa, ovat alkalimetallisuolat kuten natrium-tai kaliumsuolat tai muut tavanomaiset suolat kuten hopeasuola.

Sopivia Q-ryhmiä ovat ne atomit tai ryhmät, joiden tiedetään olevan korvattavissa karboksylaattianioneilla ja ovat kloori-, bromi- ja jodiatomi, sulfonihappoesterit kuten O-SC^CH^ tai O'SC^CgH^CH^, aktiiviset esteriryhmät kuten OCO-H tai O-CO-CF^ ja muut tavanomaiset nukleofiileilla korvattavat ryhmät.

Edellinen reaktio suoritetaan tavallisesti orgaanisessa liuottimessa, jolla on suhteellisen korkea dielektrisyyskerroin, kuten dimetyyli-formamidissa, asetonissa, dioksaanissa, tetrahydrofuraanissa tai sentapaisessa ja kohtuullisessa lämpötilassa kuten lämpötiloissa, joka on välillä -5 ja 100°C, tavallisesti 5 - 30°C:ssa, esim. ympäristön lämpötilassa.

Klavulaanihapon saattaminen reagoimaan diatsoyhdisteen kanssa on hellävarainen menetelmä alkyyli-, aralkyyli- tai sentapaisten esterien valmistamiseksi. Diatsotointireaktio voidaan suorittaa tavanomaisissa reaktio-olosuhteissa, esim. kohtuullisessa lämpötilassa ja tavanomaisessa liuottimessa. Tällaiset reaktiot suoritetaan tavallisesti lämpötilassa välillä noin -5 ja 100°C, tavallisesti 5 - 30°C:ssa, esim. ympäristön lämpötilassa. Sopivia liuottimia tätä reaktiota varten ovat alhaiset alkanolit kuten metanoli ja etanoli ja liuottimet kuten 11 58332 tetrahydrofuraani, dioksaani ja sentapaiset. Etanoli on osoittautunut erityisen käyttökelpoiseksi liuottimeksi tässä reaktiossa.

Klavulaanihapon reaktio alkoholin tai tiolin kanssa kondensaatiota edistävän aineen läsnäollessa tapahtuu tavallisesti inertissä orgaanisessa liuottimessa, jolla on suhteellisen korkea dielektrisyys-kerroin, kuten asetonitriilissä. Tämä reaktio suoritetaan tavallisesti ympäristön lämpötilassa tai alennetussa lämpötilassa, esim. lämpötilassa välillä -10 ja 22°C, tavallisesti lämpötilassa välillä -5 ja 18°C, esim. alunperin 0°C:ssa ja sen jälkeen asteittain lämmittäen noin 150C:een. Käytetty kondensaatiota edistävä aine on tavallisesti sellainen, joka poistaa vettä reaktioseoksesta. Sopivia aineita ovat karbodi-imidit, karbodi-imidatsolit tai sentapaiset reagenssit. Disykloheksyylikarbodi-imidi on osoittautunut erityisen sopivaksi kondensaatiota edistäväksi aineeksi tässä prosessissa käytettäväksi. Klavulaanihapon itsekondensoitumisen vähentämiseksi mahdollisimman pieneksi, suoritetaan tämä reaktio tavallisesti alkoholin tai tiolin huomattavan ylimäärän läsnäollessa.

Muita sopivia esterinmuodostusmenetelmiä ovat (d) hiilidioksidin poistaminen yhdisteestä, jolla on kaava (XI):

_1^°\ CH«OH

\ V

/—Ν~-( \:0-0 -CO-O-R4 jossa r4 on inertinen orgaaninen ryhmä, ja (e) kaavan (XI) mukaisen yhdisteen saattaminen reagoimaan alkoholin RÖH kanssa (tai vähemmän edullisesti tiolin RSH kanssa).

Hiilidioksidi voidaan poistaa kaavan (XI) mukaisesta yhdisteestä spontaanisesti sen valmistuksen aikana tai vaihtoehtoisesti kuumentamalla kaavan (XI) mukaista yhdistettä inertissä liuottimessa. Sopivia intertisiä liuottimia ovat eetteriliuottimet kuten dietyyli-eetteri, tetrahydrofuraani, dioksaani ja sentapaiset. Monissa tapauksissa kaavan (XI) mukainen yhdiste hajoaa spontaanisesti jo alennetussa lämpötilassa, esim. -5°C:ssa, jolloin saadaan esteri, jolla on kaava: ” 58332 -fy/*·

J-N

0 nco2r4 jossa R4 on määrityksen R piiriin kuuluva inertti ryhmä.

Kun kaavan (XT) mukainen yhdiste on saatettava reagoimaan alkoholin (tai vähemmän edullisesti tiolin) kanssa suoritetaan tämä reaktio tavallisesti inertissä liuottimessa kuten eetteriliuottimessa alkoholiyli-määrän (tai tioliylimäärän) läsnäollessa klavulaanihappojohdannaisen itse-kondensoitumisen ehkäisemiseksi.

Tällaiset esteröintimenetelmät eivät yleensä ole yhtä käyttökelpoisia kuin ne, joissa klavulaanihapon suola saatetaan reagoimaan edellä selostetun R - Q:n kanssa.

Kaavan (XI) mukainen yhdiste voidaan valmistaa saattamalla klavulaanihapon suola reagoimaan yhdisteen C1*C0*0*R4 kanssa tai sen kemiallisen ekvivalentin kanssa. Tavallisesti tämä reaktio suoritetaan alhaisessa lämpötilassa, esim. korkeintaan 5°C:ssa ja inertissä liuottimessa, esim. dietyylieetterissä, tetrahydrofuraanissa, dioksaanissa ja sentapaisessa. Tässä reaktiossa käytetty klavulaanihapon suola on edullisesti lipofiilinen suola, niin että se liukenee liuottimeen, joskin vähemmän edullista natriumsuolaa voidaan käyttää suspendoi-malla se reaktioväliaineeseen.

13 58332

Esimerkki 1

Klavulaanihapon esterin (metyyliesteri) valmistus ,_/η20Η _2£- pA/V· 0 '' “2Na 0)— -/ 'co2ch3 19,8 mg klavulaanihapon natriumsuolaa liuotettiin 0,5 ml:aan kuivaa dimetyyliformamidia ja käsiteltiin 0,25 ml:11a metyylijodidia. Seistyään huoneen lämpötilassa 1 1/2 tuntia vedettömissä olosuhteissa poistettiin liuottimet tyhjössä. Jäännös puhdistettiin P.L.C.: llä piigeelillä (piigeeli 60F254, E. Merck, Darmstadt, Saksan Liittotasavalta) eluoimalla etyyliasetaatilla, jolloin saatiin klavulaanihapon metyyliesteri värittömänä öljynä (R^ 0,38, punainen väri trifenyylitetratsoliumkloridisuihkeella), jolla oli seuraavat ominaisuudet:

Analyysi: havaittu C 50,49; H 5,43; N 6,29 C9Hi:lN05 edellyttää C 50,70; H 5,20; N 6,57

Amaks (metanoli): ei absorptiota yli 215 nm vmaks (filmi): 3300-3600 (leveä), 1800, 1750, 1695 cm-^

Likimääräinen ensimmäisen suuruusluokan N.M.R. (CDCl^): 2,49 (leveä S, 1, korvattu D20:lla), 3,05 (d, 1, J =17,5 Hz), 3,54 (dd, 1, J = 17,5 Hz, J2 = 2,5 Hz), 3,84 (S, 3) 4,24 (d, 2, J = 7 Hz), 4,93 (dt, 1, J = 7 Hz, J2 = 1,5 Hz), 5,07 (d, 1, J = 1,5 Hz), 5,72 (d, 1, J = 2,5 Hz)

Molekyylipaino (massakirjo): 213,0635.

Laskettu yhdisteelle C^H^NO^: 213,0637.

Metyyliesterin ohutkerroskromatografia osoitti yhden vyöhykkeen kussakin seuraavista liuotinjärjestelmistä: butanoli/etanoli/vesi 4:1:5 t/t ylin faasi R^ 0,75, isopropanoli/vesi, 7:3 t/t Rf 0,95, etyyliasetaatti/etyylialkoholi 8:2 t/t R^ 0,87. Vyöhykkeet todettiin bioautografiällä käyttäen Klebsiella aerogenesia bentsyyli-penisilliinilisäyksellä (synergismijärjestelmä).

Esimerkki 2

Klavulaanihapon esterin (p-nitrobentsyyliesteri) valmistus 14 583 32 CH-OH _ jYV —> j-fW1*·

^ \ 0 / . I

C02Na \ -jT\_ C02CH2 \ V-NO 2

Klavulaanihapon natriumsuolan käsittely p-nitrobentsyylibromidilla kuivassa DMF:ssä antoi P.L.C.:n jälkeen värittömän öljyn, joka kiteytyi kloroformi-eetteristä, jolloin saatiin klavulaanihapon p-nitrobentsyyliesteri valkoisina sulkamaisina neuloina, sp. 111-112° C, uudelleenkiteytyksen jälkeen sp. oli 117,5-118°C.

Esimerkki 3

Klavulaanihapon esterin (bentsyyliesteri) valmistus CH2OH ch2oh

—> f H

A--N-L I

o NCO»a J-N-k, 0 CO,CH2Ph

Epäpuhdasta 3-(β-hydroksietylideeni)-7-okso-4-oksa-l-atsabisyklo-/3,2,07heptaani-2-karbonihapon natriumsuolaa (oletettavasti suurin piirtein 55 mg puhdasta ainetta) kuivassa dimetyyliformamidissa (0,64 ml) käsiteltiin bentsyylibromidilla (0,18 ml). Liuosta pidettiin huoneen lämpötilassa (noin 17-18°C) 3 tuntia vedettömissä olosuhteissa. Reaktioseos fraktionoitiin piigeelillä, eluoitiin etyyliasetaatilla, jolloin saatiin 3-(β-hydroksietylideeni)-7-okso- 4-oksa-l-atsabisyklo-/3,2,07heptaani-2-karbonihapon bentsyyliesterin olennaisesti puhdas muoto (63 mg) värittömänä öljynä. Infranpuna (filmi) 1800, 1745, 1695 cm-1; n.m.r. (CDCl3), 2,25 (s, 1, korvattavissa D20:lla), 3,05 (d, 1, J = 17 Hz), 3,51 (dd, 1, J = 17 Hz, J2 = 2,5 Hz), 4,24 (d, 2, J = 7,5 Hz), 4,92 (dt, 1, J = 7,5 Hz, J2 = 1,5 Hz), 5,15 (d, 1, J = 1,5 Hz), 5,24 (s, 2), 5,71 (d, 1, J = 2,5 Hz), 7,456 (s, 5).

15 58332

Esimerkki 4

Klavulaanihapon bentsyyliesterin valmistaminen S. clavuligeruksen viljelysuodoksien raakauutteista

Patentin 54 144 esimerkissä 10 selostetulla tavalla saatua viljelysuodosta (20 1) tyhjöhaihdutettiin käyttäen liuoksen kalvon nousuun perustuvaa haihdutinta 5 litraksi. Väkevöite pakastekuivattiin sen jälkeen käyttäen Edwards E.F.6-hyllypakastekuivainta, jota valmistaa Edwards High Vacuum Ltd. 300 g siten saatua kiintoainetta sisälsi 3 g natriumklavulaanihappoa entsyymin inhibiitioanalyysin mukaan. Kiintoaine suspendoitiin 900 ml:aan kuivaa dimetyyliformamidia ja 150 ml bentsyylibromidia lisättiin. Seosta sekoitettiin 2 tuntia huoneen lämpötilassa ja laimennettiin sen jälkeen 1 litralla etyyliasetaattia. Reaktioseos suodatettiin ja suodate väkevöitiin mahdollisimman pieneen tilavuuteen. öljymäinen jäännös uutettiin vielä 1 litralla etyyliasetaattia ja uute suodatettiin. Suodate väkevöitiin jälleen ja saatu öljymäinen jäännös panostettiin 6,72 cm x 35,56 cm:n piigeelipilarille (Biogel Biosil A 100 meshiä) syklohek-saanissa. Kolonni eluoitiin sykloheksaanilla bentsyylibromidin poistamiseksi ja liuotin vaihdettiin sen jälkeen etyyliasetaattiin ja 20 ml:n jakeita otettiin talteen. Jakeet testattiin klavulaanihapon bentsyyliesterin läsnäolon suhteen täplittämällä lasipohjaisille piigeeli-ohutkerroskromatografialevyille (Merck-esipäällystetty pii-geeli 60 F 254) ja ruiskuttamalla 2,3,5-trifenyylitetratsoliumklo-ridi (TTC)-suihkereagenssilla. Intensiivisen punaisia täpliä tämän reagenssin kanssa antavat jakeet tutkittiin edelleen ohutkerros-kromatografiällä piigeelilevyillä käyttäen liuottimena kloroformi-etyyliasetaattia 8:2 ja suihkuttamalla kehitetyt levyt TTC-suihkeel-la. Klavulaanihapon bentsyyliesteri juoksee R^-arvossa 0,31 lämpötilassa 22°C. Tätä esteriä sisältävät jakeet yhdistettiin ja väkevöitiin 15 ml:aan ja tämä liuos kromatografoitiin edelleen 3,81 cm x 40,64 cm:n piigeelikolonnissa (Merck piigeeli H, tyyppi 60) kloro-formi/etyyliasetaatti 8:2 liuottimena. 15 ml:n jakeita otettiin talteen ja testattiin bentsyyliesterin suhteen kuten yllä on selostettu. Esteriä sisältävät jakeet väkevöitiin 8 ml:aan ja puhdistettiin lopuksi kolonnikromatografoimalla 2,54 cm x 40,64 cm:n piigeelikolonnissa (Merck piigeeli H, tyyppi 60) etyyliasetaatti/ sykloheksaanilla 8:2 liuottimena. Valitut jakeet yhdistettiin ja tyhjöhaihdutettiin, jolloin saatiin puhdas bentsyyliesteri öljynä, 160 mg.

16 58332

Esimerkki 5

Klavulaanihappobentsyyliesterin valmistus

Suihkukuivattua kiintoainetta (3,3 kg), joka sisälsi 69,4 g klavulaa-nihappoa entsyymi-inhibiitioanalyysillä määritettynä,saatiin patentin 54 144 esimerkissä 16 selostetuilla tavalla. Kiintoaine lietettiin 5,5 litraan dimetyyliformamidia ja 500 ml bentsyylibromidia lisättiin. Huoneen lämpötilassa 2 tuntia suoritetun sekoituksen jälkeen lisättiin 12 1 etyyliasetaattia ja kiintoaineet poistettiin suodattamalla. Suodate tyhjöhaihdutettiin öljymäiseksi jäännökseksi (212 g). Jäännös panostettiin kolonnille, jossa oli 10,16 cm x 33,02 cm:n piigeelipatja (Hopkins & Williams MFC) sykloheksaanissa. Ko-lonni eluoitiin 12 litralla sykloheksaania bentsyylibromidiylimää-rän poistamiseksi. Eluentti vaihdettiin sen jälkeen etyyliasetaatiksi ja 500 ml:n jakeita otettiin talteen. Nämä testattiin bentsyy-liklavulanaattipitoisuuden suhteen täplittämällä piigeeli-ohut-kerroskromatografialevyillä (Merck esipäällystetty piigeeli 60 F 254) ja suihkutettiin 2,3,5-trifenyylitetratsoliumkloridilla (TTC) suihkereagenssina. Intensiivisen punaisia täpliä antavat jakeet tutkittiin edelleen ohutkerroskromatografiällä piigeelillä käyttäen liuottimena kloroformi/etyyliasetaattia 8:2 ja suihkuttamalla kehitetyt levyt TTC-suihkeella. Jakeet 5-13 sisälsivät esterin pääosan ja nämä yhdistettiin sekä tyhjöväkevöitiin öljyksi (79,3 g). Tämä valmiste kromatografoitiin sen jälkeen 10,16 cm x 45,72 cm:n piigeelikolonnilla (Merck piigeeli H tyyppi 60) kloroformi/ etyyliasetaatilla 8:2 liuottimena. Jakeet valittiin kuten yllä on selostettu ja antoivat väkevöitettäessä 45,9 g öljyä, jonka puhtaus-aste oli 62 % NMR-spektroskopialla määritettynä.

Tämä tuote kromatografoitiin lopuksi 6,97 cm x 45,72 cm:n Sepbadex LH 20 kolonnilla sykloheksaani/kloroformissa 1:1. Jakeiden valinnan ja väkevöittämisen jälkeen saatiin väritön öljy (27,6 g), joka osoittautui 95 %:sesti puhtaaksi klavulaanihapon bentsyyliesterik-si NMR-spektroskooppisen tarkastelun perusteella. (Sephadex LH 20 on Sephadex'in Q25 hydroksipropyylijohdannainen, jota valmistaa Pharmacia, Iso Britannia, 75 Uxbridge Road, Lontoo W5, Englanti).

Esimerkki 6

Klavulaanihappobentsyyllesterin valmistus

Viljelysuodos (150 1), pH 7,0 sisälsi 16,2 g klavulaanihappoa (nat-riumsuola) entsyymin inhibiitioanalyysillä määritettynä. Tätä suo- 17 58332 datetta sekoitettiin 5 kg:n kanssa Amberlyst A. 26-anioninvaihtohart-sia kloridimuodossa (Rohm & Haas Company, Philadelphia, USA) 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Hartsi suodatettiin sen jälkeen ja suodate analysoitiin uudestaan,jolloin osoittautui, että 6,4 g kla-vulaanihappoa oli poistunut. Hartsi pestiin 20 litralla deionoitua vettä, sitten 20 litralla asetonia ja 10 litralla dimetyyliformami-dia (DMF). Uudelleensuodatuksen jälkeen suspendoitiin hartsi 2,3 litraan DMF/0,2-m NaJ. Tähän lisättiin 200 ml bentsyylibromidia ja suspensiota sekoitettiin perinpohjaisesti. Seistyään huoneen lämpötilassa 16 tuntia lisättiin etyyliasetaattia (21) ja hartsi suodatettiin sitten, jolloin hartsin lisäpesunesteet (etyyliasetaatti) yhdistettiin suodoksen kanssa. Uute väkevöitiin sen jälkeen pieneen tilavuuteen ja kromatografoltiin 6,72 cm x 45,72 cm:n piigee-likolonnilla (Merck piigeeli H tyyppi 60) etyyliasetaatti/syklo-heksaanilla 8:2 liuottimena. Bentsyyliklavulanaattia sisältävät jakeet valittiin täplittämällä piigeeli-ohutkerroskromatografiale-vyillä ja suihkuttamalla TTC-reagenssilla, kuten edellä on selostettu (esimerkki 24). Valitut jakeet väkevöitiin 20 ml:aan ja kromatografoitiin sen jälkeen 3,81 cm x 45,72 cm:n piigeelikolon-nilla (Merck piigeeli H tyyppi 60) kloroformi/etyyliasetaatilla 8:2 liuottimena. Valitut jakeet yhdistettiin ja haihdutettiin värittömäksi öljyksi (440 mg), josta 90 % oli bentsyyliklavulanaattia NMR-spektroskopialla määritettynä.

Esimerkki 7

Klavulaanihapon bentsyyliesterin valmistus S. clavuligeruksen vil-jelysuodoksen raakauutteista

Patentin 54 144 esimerkissä 14 selostetulla tavalla saadun viljelysuodoksen buta-noliuutteen vesipitoisen takaisinuutteen alikvootti pakastekuivat-tiin käyttäen Edwards'in kammiokuivaintä. 24 g:n annos saatua kiin toainetta sisälsi 0,96 g natriumklavulaanihappoa entsyymi-inhibii-tioanalyysillä määritettynä. Tämä kiintoaine suspendoitiin 75 ml: aan kuivaa dimetyyliformamidia ja 75 ml bentsyylibromidia lisättiin. Seosta sekoitettiin 2 tuntia huoneen lämpötilassa. Suspensio laimennettiin sen jälkeen 500 ml:11a etyyliasetaattia ja seos suodatettiin. Suodate väkevöitiin öljymäiseksi jäännökseksi pyörivässä tyhjöhaihduttimessa. Tämä jäännös panostettiin 5,08 cm x 35,56 cm:n piigeelikolonnille (Biogel Biocel A.100 mesh) syklohek-saanissa. Bentsyylibromidia eluoitiin kolonnista ja liuotin vaihdettiin sen jälkeen etyyliasetaattiin ja 10 ml:n jakeita otettiin tai- 18 58332 teen. Klavulaanihapon bentsyyliesteriä sisältävät jakeet valittiin kuten esimerkissä 24. Lisäpuhdistus aikaansaatiin myös kuten esimerkissä 4 on selostettu kolonnikromatografiällä. Tämä menetelmä antoi 220 mg puhdasta bentsyyliesteriä.

Esimerkki 8

Klavulaanihappometyyliesterin hydrolyysi klavulaanihapoksi 2,17 mg klavulaanihappoesteriä liuotettiin 0,1 ml:aan metanolia ja käsiteltiin 0,208 ml:lla natriumhydroksidiliuosta (0,0482-n).

1 tunnin jälkeen huoneen lämpötilassa sisälsi reaktioseos useita tuotteita. Ohutkerroskromatografia-analyysi osoitti, että eräällä pääkomponenteista oli R^-arvo, joka oli identtinen klavulaanihapon natriumsuolan kanssa, värireaktiot ja biologinen analyysi oli yhtäpitävä tämän klavulaanihapon natriumsuolan kanssa.

Esterin hidasta muuttumista klavulaanihapoksi havaittiin, kun 1 mg/ml yhdistettä haudutettiin 37°C:ssa 0,05-m fosfaattipuskurissa pH-arvossa 7. Reaktiota seurattiin paperikromatografiällä (bio-autografinen järjestelmä). Käytettäessä butanoli/etanoli/vesi-järjestelmää reaktion seuraamiseen 2 tunnin ajanjakson aikana havaittiin, että metyyliesterin vyöhyke Rf-arvossa 0,79 pieneni kooltaan, kun taas klavulaanihapon vyöhyke R^-arvossa 0,12 suureni.

Esimerkki 9

Esimerkkejä klavulaanihapon metyyliesterin aktiviteetista Testit bakteerienvastaisen vaikutuksen suhteen liemessä osoittivat, että klavulaanihapon metyyliesterillä on laaja aktiviteettispektri vaikka suuruusluokaltaan alhaisempi kuin klavulaanihapolla. Ei ollut selvää johtuiko tämä aktiviteetti itse yhdisteen aktiviteetistä tai esterin hitaan vesipitoisen hydrolyysin vapauttamasta klavulaanihaposta. Klavulaanihapon metyyliesteri osoitti merkittävää bakteerienvastaista synergismiä yhdessä ampisilliinin tai kefa-loridiinin kanssa näihin antibiootteihin vastustuskykyisiä bakteereja vastaan. Siten ampisilliinin pienin inhiboiva väkevyys (M.I.C.) Staphylococcus aureusta (Russell) vastaan aleni 500 ^ug:sta/ml alle 0,4 1,0 ^ug/ml:n klavulaanihapon metyyliesteriä läsnäollessa.

Kefaloriidinin M.I.C. aleni 1,5 ^,ug:sta/ml alle 0,03 ^,ug/ml klavulaanihapon metyyliesterin läsnäollessa 1 ^ug/ml. Ampisilliinin M.I.C. Proteus mirabilista C889 vastaan aleni 500 yUg:sta/ml 31 ^,ug:aan/ml klavulaanihapon metyyliesterin läsnäollessa 5 ^,ug/ml.

19 58332

Esimerkki 10

Pivaloyylioksimetyyliklavulanaatin valmistus

Bromimetyylipivalaatin (0,37 g) sekoitettuun liuokseen kuivassa dimetyyliformamidissa (5 ml) lisättiin natriumklavulanaattia (0,49 g). 2 tunnin jälkeen huoneen lämpötilassa käsiteltiin reak- tioseosta etyyliasetaatilla (20 ml), sykloheksaanilla (10 ml) ja vedellä (20 ml). Seos erottui kahdeksi kerrokseksi ja vedetön kerros erotettiin, pestiin vedellä (20 ml) ja kuivattiin natrium-sulfaatilla. Kuivattu liuos haihdutettiin jättäen jäljelle halutun tuotteen vaaleankeltaisena öljynä (500 mg). N.m.r. (CDCl-j) , 1,26 (s, 9), 3,13 (d, 1, J = 17 Hz), 3,62 (dd, 1, J = 17 Hz, J = 2,5 Hz, 4,3 (d, 2, J = 7,5 Hz), 5,0 (dt, 1, J = 7,5 Hz, J2 = 1,5 Hz), 5,16 (d, 1, J = 1,5 Hz), 5,79 (d, 1, J = 2,5 Hz), 5,92 δ (s, 2); i.r. (nestefilmi), v β-laktaami C.O. 1800 cm-1, esteri C=0 1760 cm 1.

Esimerkki 11

Klavulaanihapon ftalidiesterlen valmistus 3-bromiftaiidin (0,43 g) sekoitettuun liuokseen kuivassa dimetyyliformamidissa (5 ml) lisättiin natriumklavulanaattia (0,5 g) ja liuos jätettiin huoneen lämpötilaan 2 tunniksi. Liuos käsiteltiin etyyliasetaatilla (20 ml), sykloheksaanilla (10 ml) ja vedellä (30 ml) ja ravistettiin perinpohjaisesti. Vedetön kerros pestiin vedellä (20 ml), kuivattiin (Na^O^) ja haudutettiin, jolloin saatiin vaaleankeltainen kumi. Molemmat diastereoisomeeriset esterit erotettiin käyttäen korkeapainenestekromatografiaa 40 cm x 10 mm:n piigeelikolonnilla (Mercosorb SI 60, 5^u) eluoiden etyyliasetaatilla virtausnopeudella 3 ml/min.

Ensimmäinen ftalidiesteri (viiveaika 7,15 min) kiteytyi etyyliasetaatista neuloina, sp. 102°C ja sillä oli seuraava i.r. (nujol mull) v 3-laktaami C=0 1790 cm”1, esteri C=0 1755 cm 1, n.m.r. (CD^COCD^): 3,14 (d, 1, J = 17,5 Hz), 3,76 (dd, 1, J = 17,5 Hz, J2 = 2,5 Hz), 4,25 (d, 2, J - 7,5 Hz), 5,0 (dt, 1, J1 = 7,5 Hz, J2 = 1,5 Hz), 5,4 (s, 1, J = 1,5 Hz), 5,82 (d, 1, J = 2,5 Hz), 7,7 (s, 1), 8,06 δ (m, 4); molekyylipaino (massaspektrometria: 331,0696 vastaa kaavaa C16H13N07 (las^ettu 331,0692). Toisella diastereoisomeerilla (viiveaika 8,85 min) oli seuraava i.r. (CH2Cl2-liuos) v 8-laktaami C=0 1800 cm 1, esteri C=0 1780 cm 1; nmr (CDCl^) 2,42 (leveä S, 1, korvattavissa D20:lla), 3/12 (d# i; j = i8 Hz), 3,60 (dd, 1, 20 58332 J1 = 18 Hz, J2 = 2,5 Hz), 4,30 (d, 2, J = 7,5 Hz), 5,0 (dt, 1, J]_ = 7,5 Hz, J2 = 1,5 Hz), 5,12 (d, 1, J = 1,5 Hz), 5,76 (d, 1, J = 2,5 Hz), 7,52 (s, 1), 7,85 δ (m, 4).

—ro\_/H2°H oJ_ »7 • y0 \ 0 = CO. .S >=0

HM

^0 CH-OH // \ yy — · °

' „ ^0, CH-OH

--S \ / 2 J-N—/ o = do

Esimerkki 12

Nonyyliklavulanaatin valmistus

Natriumklavulanaattia (44 mg) kuivassa dimetyyliformamidissa (2 ml) käsiteltiin nonyylijodidilla (76 mg) ja jätettiin huoneen lämpötilaan 2 tunniksi. Liuotin haihdutettiin ja jäännös fraktionoitiin piigeelille, eluoitiin etyyliasetaatti-heksaanilla (2:1), jolloin saatiin tuote öljynä, i.r. (filmi) 1800, 1745, 1690 cm Molekyy-lipaino (massaspektrometria) = 325,1890 mikä vastaa kaavaa C17H27N05 <laskettu 325,1889).

Esimerkki 13

Metyyliklavulanaatin valmistus

Klavulaanihappoa (130 mg) etanolissa (10 ml) käsiteltiin diatso-metaanin ylimäärällä eetterissä. 2 minuutin jälkeen huoneen lämpötilassa reaktio vaikutti (ohutkerroskromatografia) loppuunvledyltä.

21 58332

Liuos haihdutettiin tyhjössä ja jäännös puhdistettiin kromatogra-foimalla piigeelillä, eluoiden etyyliasetaatilla. Metyyliklavu-lanaattia sisältävät jakeet yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin kirkas öljy (104 mg).

Esimerkki 14

Metyyliklavulanaatin valmistus

Klavulaanihappoa (200 mg) asetonitriilissä (5 ml) jäähdytettiin ja sekoitettiin 0°C:ssa. Metanolia (0,5 ml) ja disykloheksyylidikarbo-di-imidiä (206 mg) lisättiin ja reaktioseosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa yön yli. Suspensio suodatettiin ja suodate haihdutettiin tyhjössä, jolloin saatiin raakaa metyyliklavulanaattia. Raa-katuote puhdistettiin kromatografoimalla piigeelillä, eluoiden etyyliasetaatilla, jolloin saatiin kirkas öljy (140 mg).

Esimerkki 15

Fenyyliklavulanaatin valmistus

Klavulaanihappoa (100 mg) asetonitriilissä (5 ml) jäähdytettiin ja sekoitettiin 0°C:ssa. Liuokseen lisättiin fenolia (0,94 g) ja disykloheksyylidikarbodi-imidiä (100 mg) ja reaktioseosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa yön yli. Suspensio suodatettiin ja suodate haihdutettiin. Jäännös fraktionoitiin piigeelillä, eluoitiin etyyliasetaatti-heksaanilla (1:1), jolloin saatiin fenyy-liklavulanaattia (70 mg). I.r. (filmi) 1800, 1770, 1690 cm N.m.r. (CDCl-j) 2,18 (leveä s, 1) , 3,06 (dd, 1, J = 17 Hz, J2 = 0,9 Hz), 3,54 (dd, 1, Jx = 17 Hz, J2 = 2,6 Hz), 4,29 (d, 2, J = 7,5 Hz), 5,1 (dt, 1, = 7,5 Hz, J2 = 1,5 Hz) 5,29 (d, 1, J = 1,5 Hz), 5,76 (dd, 1, = 2,6 Hz, J2 = 0,9 Hz), 7,35 δ (m, 5). Molekyyli- paino, (massaspektrometria) = 275,0777 mikä vastaa kaavaa ci4Hi3N05 (laskettu 275,0794).

Esimerkki 16 2,2,2-trikloorietyyliklavulanaatin valmistus

Natriumklavulanaattia (221 mg) suspendoitiin kuivaan tetrahydro-furaaniin (5 ml) ja sekoitettiin 0°C:ssa. Trikloorietyylikloori-formiaattia (211 mg) kuivassa tetrahydrofuraanissa (1 ml) lisättiin yllä olevaan suspensioon 20 minuutin aikana. Seoksen annettiin saavuttaa huoneen lämpötila ja sekoitettiin yön yli. Suspensio suodatettiin ja suodate haihdutettiin tyhjössä. Jäännös kro-matografoitiin piigeelillä eluoiden etyyliasetaatti-heksaanilla 22 58332 (2:1), jolloin saatiin haluttu tuote öljynä. I.r. (filmi) 1800, 1760, 1690 cm-1. N.m.r. (CDC13) 1,56 (leveä S, 1), 3,07 (dd, 1, J1 = 17,5 Hz, J2 = 0,7 Hz), 3,56 (dd, 1, = 17,5 Hz, J2 = 2,5

Hz), 4,24 (d, 2, J = 7,5 Hz), 4,69 (d, 1, J = 12 Hz), 4,92 (d, 1, J = 12 Hz), 5,02 (dt, 1, J1 = 7,5 Hz, J2 = 1,3 Hz), 5,19 (d, 1, J = 1,3 Hz), 5,73 δ (dd, 1, = 2,5 Hz, J2 = 0,7 Hz). Molekyylipaino (massaspektrometria) = 328,9621 mikä vastaa kaavaa H-^NO^Cl^ (laskettu 328,9625).

,_/CH20H ,-y°\ /H20H

\J C1C0-0R-> \_J

y-"C

;

CO Na S' C0-0-C0-0-R

X

I-f^°\/CH20H

co2r

Esimerkki 17

Natriumklavulanaatin valmistus

Bentsyyliklavulanaattia (840 mg) etanolissa (30 ml) ja vedessä (5 ml) hydrattiin 10 %:sella Pd/c:llä (267 mg) ja natriumbikarbonaattina (244 mg) 25 min huoneen lämpötilassa ja ilmakehän paineessa. Katalysaattori suodatettiin, pestiin vedellä ja etanolilla ja yhdistetyt suodatteet haihdutettiin tyhjössä. Tuote kiteytyi vesi-asetoniseoksesta mikroneuloina (565 mg). Uudelleenkiteytys vesi-asetonista antoi neuloja jotka P20^:llä tyhjössä kuivattuina 24 tuntia antoivat seuraavan analyysin: C 41,01, 40,86; H 3,77, 3,64; N 5,68, 5,51; i.r. (KBr-levy) 1785, 1700, 1620 cm-1; Nmr (D20) 3,06 (d, 1, J = 18,5 Hz), 3,57 (dd, 1, J1 = 18,5 Hz, J2 = 2,5 Hz), 4,15 (d, 2, J = 8 Hz), 5,3 (HOD), 4,9 (m), 5,71 (d, 1, J = 2,5 Hz).

Esimerkki 18

Ampisilliinin ja klavulaanlhapon esterien välinen bakteerienvastai-nen synergismi

Ampisilliinin, klavulaanihapon, natriumsuolan ja ampisilliinin 23 5 8 3 3 2 pienin inhiboiva väkevyys (M.I.C.-arvot) 1 ^,ug/ml:n klavulaaniha-pon natriumsuolan läsnäollessa määritettiin useille $-laktamaasia tuottaville bakteereille. Organismit ympättiin Oxoid-herkkyystes-tiliemeen, jota oli pienissä syvennyksissä muovikaukalossa ja joka sisälsi ampisilliinin, klavulaanihapon natriumsuolan tai ampisillii-nin plus 1 ^ug/ml:n klavulaanihapon natriumsuolan erillisiä väkevyys-gradientteja (mikrotiitterimenetelmä). Yön yli seisseen liemiympin lopullinen laimennus oli 0,5 x 10 Kaukaloa haudutettiin 37° C:ssa yön yli ja bakteerien kasvun päätepisteet merkittiin muistiin seuraavana aamuna. M.I.C.-arvot yug:ssa/ml on esitetty taulukossa 1, mikä paljastaa, että synergisti 1 yug/ml:n alhaisessa väkevyydessä merkittävästi lisää ampisilliinin bakteerienvastaista vaikutusta tiettyjä gram-positiivisia ja gram-negatiivisia bakteereja vastaan. Synergismimekanismi todennäköisesti käsittää ampisillii-niä tuhoavien β-laktamaasientsyymien inhibiition, joskaan muiden mekanismien esiintymistä ei voida sulkea pois.

Samanlaisia tuloksia kuin taulukossa 1 saatiin, kun ampisilliini korvattiin amoksisilliinillä tai ampisilliinin ftalidyyliesterillä.

Taulukko 1

Ampisilliinin ja klavulaanihapon estereiden välinen bakteerien- vastainen synergismi Klebsiella aerogenesin rotuja vastaan

Rotu Ampisilliini Ampisilliini + Ampisilliini + yksinään 5 ,ug/ml klavulaa- 5 ,ug/ml klavulaa- ninapon metyyli- ninapon bentsyyli- esteriä esteriä A 500 1,9 1,9 E 70 500 3,9 3,9 62 500 3,9 3,9

Ei klavulaanihapon metyyliesteri eikä klavulaanihapon bentsyyli-esteri inhiboinut testiorganismien kasvua väkevyydessä 100 ^ug/ml.

Esimerkki 19

Klavulaanihappoesterln bakteerienvastainen vaikutus Klavulaanihapon natriumsuolan bakteerienvastainen vaikutus erilaisia bakteereja vastaan määritettiin käyttäen mikromäärämenetelmää. Klavulaanihapon natriumsuolan sarjalaimennuksia Oxoid-herkkyystesti-liemessä, joka oli mikromäärä muovikaukalossa, ympättiin kunkin organismin yön yli seisseellä liemiviljelmällä, niin että ympin lop- -4 24 58332 pulaimennus oli 0,5 x 10 . Viljelmiä haudutettiin yön yli ja bakteerien kasvukohdat mitattiin seuraavana aamuna havainnoimalla viljelmän sameutta. Tulokset ilmaistuna likimääräisinä MIC-arvoina (minimi-inhibiitioväkevyys ^ug/ml) onesistetty taulukossa 2, joka osoittaa, että yhdisteellä on laaja bakteerienvastaisen vaikutuksen alue.

Taulukko 2

Klavulaanihappoesterien bakteerienvastainen vaikutus

Organismi Klavulaanihapon esterin MIC_ Klavulaa-

Bentsyyli- Nonyyli- Pivaloyyli- Ftalidyyli- nihapon esteri esteri oksimetyy- esteri natrium- liesteri suolan MIC*

Bacillus subtilis A 250 31 62 125 62

Staph.aureus

Oxford 62 31 31 31 15

Staph.aureus

Russell 125 31 62 15 15

Escherichia coli 10418 125 >500 125 125 125 xKlavulaanihapon natriumsuolan MIC on lisätty vertailun vuoksi, korkeat MIC-arvot johtuvat käytetystä raskaasta ympistä.

Esimerkki 20

Bentsyylioksikarbonyylimetyyliklavulanaatti ^ -CI?20H ch oh rrv _, n-V’ J \ CO Na u ^ 2 CO^CH-CO-CH-C^Hc 2 2 2 2 6 5

Natriumklavulanaattia (0,6 g) ja bentsyylibromiasetaattia (0,46 ml) liuotettiin N,N-dimetyyliformamidiin (7 ml). Kun liuos oli seissyt 2 tuntia huoneenlämpötilassa, liuotin haihdutettiin tyhjössä. Di-etyylieetteriä (50 ml) etyyliasetaattia (25 ml) ja jäävettä (50 ml) lisättiin, ravisteltiin ja erotettiin. Vesikerros pestiin vielä 25 58332 50 ml:lla liuotinseosta. Yhdistetyt liuotinkerrokset pestiin 10 ml:lla jäävettä, kuivattiin natriumsulfaatilla ja haihdutettiin öljyksi, joka kromatografoitiin piihappogeelillä käyttäen sykloheksaania ja etyyliasetaattia eluentteina. Jakeet jotka sisälsivät bentsyylioksi-karbonyylimetyyliklavulanaattia, kerättiin talteen ja haihdutettiin värittömäksi öljyksi.

I.r. (kalvo): 3510 (b, OH), 1805 (3“laktaami C=0), 1760 (br, esteri C=0's), 1700 cm-1 (C=C).

N.m.r. (CDC13): 1,86 (1H, bs, häviää deuteroinnissa, CH2OH), 3,04 (1H, d, J 18Hz, 60-H), 3,46 (1H, dd, J 18Hz, J 2,5Hz, 6a-H), 4,19 (2H, d, J 8HZ, CH2OH), 4,71 (2H, s, OCH2CO), 4,97 (1H, t, J 8Hz, =CHCH2OH), 5,14 (1H, s, 3-CH), 5,19 (2H, s, PhCH2), 5,66 (1H, d, J 2,5Hz, 5-CH) , 7,34 (5H, S, PliCH2) .

Esimerkki 21

Natriumkarboksimetyyliklavulanaatti

CHo0H CH-OH

ny rr-y C02CH2C02CH2C6H5 0 io2CH2C02Na

Bentsyylioksikarbonyylimetyyliklavulanaattia (0,2 g) uudelleentisla-tussa tetrahydrofuraanissa (5 ml) hydrattiin 22°C:ssa 5 %:lla palladiumia käsitellyllä bariumsulfaatilla (0,2 g) 30 minuutin ajan. Katalyytti poistettiin suodattamalla. Suodokseen lisättiin sitten vettä (1,0 ml) ja kiinteää natriumvetykarbonaattia (0,11 g). Seos jäähdytettiin 10°C:en ja sekoitettiin 5 minuuttia. Ylimääräinen NaHC03 suodatettiin pois ja suodos haihdutettiin tyhjössä hauraaksi vaahdoksi.

I.r. (väkevä DMSO-liuos): 1801 (β-laktaami C = 0), 1753 (esteri C=0), 1700 (C=C), 1630 cm"1 (C02~).

26 58332

Esimerkki 22

Bentshydryyliklavulanaatti

CH0OH CH-OH

rry _ O \ υ \ C02H C02CH(C6H5)2

Difenyylidiatsometaania (112 mg) petrolieetterissä (40-60°C) lisättiin liuokseen, jossa oli klavulaanihappoa (38 mg) tetrahydrofuraa-nissa (4 ml). Saatua liuosta sekoitettiin yli yön huoneenlämpötilassa ja liuotin poistettiin sitten alipaineessa, jolloin saatiin öljymäinen jäännös, joka kromatografoitiin piihappogeelillä, eluoiden etyyliasetaatti-heksaani-seoksella, jolloin saatiin otsikon yhdistettä (135 mg).

I.r. (CHC13): 3400 (OH), 1805 (3-laktaami C=0), 1755 cm"1 (esteri C=0), 1700 (C=C).

N.m.r. (CDC13): 2,05 (1H, s, OH), 3,03 (1H, d, J 17Hz, 6B-CH), 3,53 (1H, dd, J 17Hz, J' 2,5Hz, 6a-CH), 4,22 (2H, d, J 7Hz, =CHCH2), 4,94 (1H, t, J 7Hz, =CHCH2), 5,27 (1H, s, 3-CH), 5,76 (1H, d, J 2,5Hz, 5-CH), 7,03 (1H, s, CHPh2), 7,46 δ (10H, s, aromaattiset protonit).

Esimerkki 23 2-bentsyylioksikarbonyyliamino-2-metoksikarbonyylietyyliklavulanaatti

C/H20H CH OH

_f* / 5'H2OH

yy — rcy C02H 0 CO-CH-CHCO_CH^ 2 2 j 2 3 NHCO-CH 0CcHc 2 2 6 5

Bentsyylioksikarbonyyli-L-seriinimetyyliesteriä (500 mg) ja disyklo-heksyylikarbodi-imidiä (143 mg) lisättiin jäähdytettyyn (0°C) ja sekoitettuun liuokseen, jossa oli klavulaanihappoa (138 mg) tetrahydro-furaanissa (4 ml). Reaktioseoksen annettiin lämmetä huoneenlämpötilaan ja sekoitettiin yli yön. Reaktioseos suodatettiin, pestiin, 27 58332 kuivattiin ja liuotin poistettiin alipaineessa,jolloin saatiin jäännös, joka kromatografoitiin piihappogeelillä eluoiden etyyli-asetaatti-heksaanilla, jolloin saatiin otsikon yhdistettä kumina (103 mg).

I.r. (CHC13): 3400, (br, OH ja NH), 1805 (β-laktaami C=0), 1760 ja 1725 (C=0 x 3), 1700 cm"1 (C=C) .

N.m.r. (CDC13): 2,42 (1H, s, OH), 3,08 (1H, d, J 17Hz, 68-CH), 3,58 (1H, d, J 17Hz, J' 2,5Hz, 6a-CH), 3,88 (3H, s, C02CH3), 3,98 - 5,15 (6H, m, =CHCH2 ja C02CH2CH), 5,2 (1H, m, 3-CH), 5,25 (2H, s, CH2Ph), 5,73 (1H, d, J 2,5Hz), 6,01 (1H, m, NH), 7,53 δ (5H, s, aromaattiset protonit).

Esimerkki 24 2-Amino-2-metoksikarbonyylietyyliklavulanaatin hydrokloridi

CH-OH CHo0H

rr%J _> rrw C02CH2CH-C02CH3 co2ch2chco2ch3 l MU Uf’ 1 NH.C0-CHoCÄHc 2 2 2 6 5 2-bentsyylioksikarbonyyliamino-2-metoksikarbonyylietyyliklavulanaattia (85 mg) tislatussa tetrahydrofuraanissa (2 ml), joka sisälsi etikka-happoa (10 mg) hydrattiin 10 %:sella Pd/C-katalyytillä (40 mg). 60 minuutin kuluttua ohutlevykromatografia (liuotin etyyliasetaatti) osoitti yhden tuotteen muodostumista ja jonkin verran reagoimatonta lähtöainetta. Katalyytti suodatettiin pois ja suodos väkevöitiin, jolloin saatiin öljy, joka kromatografoitiin ioninvaihtokolonnilla ("Amberlite" IRA 401 Cl -muodossa) (eluoiden etyyliasetaatti-heksaa-nilla). Saadun liuoksen haihdutus antoi haluttua materiaalia viskoosina kumina.

I.r. (nestekalvo): 1805 (β-laktaami), 1760 (esteri CO), 1695 cm 1 (C=C). N.M.r. (D20): 3,13 (1H, d, J 17 Hz, 63-CH), 3,57 (1H, dd, J 17Hz, J 3Hz, 6a-CH), 3,8 (3H, s, OCH3), 4,14 (2H, d, J 7Hz, =CHCH2), 5,70 δ (1H, d, J 3Hz, 5-CH), muut piikit HOD:n pimentämiä.

58332 28

Esimerkki 25 2-(2-Fenyylisulfonyyli)etyyliklavulanaatti ° \ \ C00CH„CHoS0oCcHc co2h 2 2 2 265

Liuos, jossa oli klavulaanihappoa (199 mg) tetrahydrofuraanissa (8ml), jäähdytettiin 0°C:en ja sitä käsiteltiin disykloheksyyli-karbodi-imidillä (206 mg), pyridiinillä (79 mg) ja β-(fenyylisulfo-nyyli)etanolilla (1,0 g). Sekoitetun liuoksen annettiin saavuttaa huoneenlämpötila ja sitä sekoitettiin huoneenlämpötilassa yli yön. Suspensio suodatettiin ja suodos väkevöitiin alipaineessa. Saatu jäännös kromatografoitiin piihappogeelillä eluoiden etyyliasetaatti-heksaaniseoksilla, jolloin saatiin otsikon yhdistettä öljynä (155 mg). I.r. (CHC13): 3400 (br, OH), 1800 (β-laktaami C=0) , 1750 (esteri C=0), 1695 (C=C), 1310 ja 1150 cm-1 (S02)j N.m.r. (CDC13): 2,18 (1H, s, OH), 3,08 (1H, d, J 17Hz, 63-CH), 3,52 (1H, dd, J 17Hz, J' 2,5Hz, 6a-CH), 3,59 (2H, t, J 6Hz, CH2S02), 4,25 (2H, d, J 7,5Hz, =CHCH2), 4,57 (2H, t, J 6Hz, CH2CH2S02); 4,7 - 5,01 (2H, m, =CHCH2 ja 3-CH), 5,7 (1H, d, J 2,5Hz, 5-CH), 7,5 - 8,2 δ (5H, m, Ph).

Esimerkki 26 2-Metyylitioetyyliklavulanaatti

CH,OH ,CH20H

0/ \ \ C02H C02CH2CH2SCH3

Liuos, jossa oli klavulaanihappoa (199 mg) tetrahydrofuraanissa (8 ml), jäähdytettiin 0°C:en ja sitä käsiteltiin disykloheksyyli-karboli-imidillä (200 mg) ja β-(metyylitio)etanolilla (960 mg). Sekoitetun liuoksen annettiin saavuttaa huoneenlämpötila ja sitä sekoitettiin huoneenlämpötilassa yli yön. Susoensio suodatettiin ja 29 58332 suodos väkevöitiin alipaineessa. Saatu jäännös kromatografoitiin piihappogeelillä eluoiden etyyliasetaatti-heksaaniseoksilla, jolloin saatiin otsikon yhdistettä öljynä (145 mg).

I.r. (CHC13): 3400 (OH), 1805 (β-laktaami C=0), 1750 (esteri C=0), 1695 cm"1 (C=C).

N.m.r. (CDC13): 1,72 (1H, s, OH), 2,15 (3H, s, SCH^ , 2,85 (2H, t, J 7Hz, CH2SCH3), 3,05 (1H, dd, J 17Hz, J' 1Hz, 68-CH), 3,55 (1H, dd, J 17Hz, J' 2,5Hz, 6ot-CH), 4,32 (2H, t, J 7Hz, CH2CH2SCH3), 4,30 (2H, d, J 7,5Hz, =CHCH2), 4,97 (1H, dt, J 7,5Hz, J' 1,5Hz, =CHCH2), 5,09 (1H, m, 3-CH), 5,73 δ (1H, dd, J 2,5Hz, J' 1Hz, 5-CH).

Esimerkki 27 2-Pyridyylietyyliklavulanaatti

_ ^H20H CH-OH

r-ry rCV

N-·/ >-NV »= ° \ ^ \ ^ co2h co2ch2ch2—n

Liuos, jossa oli klavulaanihappoa (135 mg) tetrahydrofuraanissa (5 ml), jäähdytettiin 0°C:en ja sitä käsiteltiin 2-(2-hydroksietyyli)-pyridiinillä (200 mg) (2,5 ekvivalenttia) ja disyklokarbodi-imidillä (143 mg) (1-ekvivalentti). Sekoitetun liuoksen annettiin saavuttaa huoneenlämpötila ja sitä sekoitettiin huoneenlämpötilassa yli yön. Suspensio suodatettiin ja suodos väkevöitiin alipaineessa. Saatu jäännös kromatografoitiin piihappogeelillä eluoiden etyyliasetaatilla, joka sisälsi 5 % metanolia, jolloin saatiin otsikon yhdistettä öljynä (100 mg).

I.r. (CHC13): 3400 (OH), 1805 (0-laktaami C=0), 1750 (esteri C=0) , 1695 cm-1 (C=C); N.m.r. (CDC13): 2,20 (1H, s, OH), 2,97 (1H, d, J 17Hz, 60-CH), 3,11 (2H, t, J 7Hz, CH2CH2Py) , 3,42 (1H, dd, J 17Hz, J' 2,5 Hz, 6ct-CH) , 4,15 (2H, d, J 7Hz, =CHCH2), 4,45 - 4,9 (3H, m, CH2CH2Py ja =CHCH2), 4,97 (1H, m, 3-CH), 5,51 (1H, d, J 2,5Hz, 5-CH), 7,0 - 7,4 (2H, m, pyridyyli-3-CH ja 5-CH), 7,45 - 7,85 (1H, m, pyridyyli-4-CH), 8,35 -8,70 δ (1H, m, pyridyyli-6-CH).

30 58332

Esimerkki 28

Ftaali-imidometyyliklavulanaatti

CHo0H CH-OH

r^W rTW.

« \ » ''"“Λο C02Na

O

Ftaali-imidometyylikloridia (1,95 g) lisättiin sekoitettuun liuokseen, jossa oli natriumklavulanaattia (221 mg) kuivassa dimetyyli-formamidissa (2 ml) ja liuos jätettiin huoneenlämpötilaan neljäksi tunniksi. Liuosta käsiteltiin etyyliasetaatilla ja vedellä ja ravisteltiin perusteellisesti. Vedetön kerros erotettiin, kuivattiin ja väkevöitiin alipaineessa, jolloin saatiin jäännös, joka kiteytyi etyyliasetaatin ja kevyen maaöljyjakeen (40-60°C) seoksesta, jolloin saatiin otsikon yhdistettä (130 mg); sp. 163°C.

I.r. (CHC1,): 3400 (br, OH), 1805 (β-laktaami C=0), 1785, 1760 ja -1 J

1735 cm (ftaali-imidyyli C=0, esteri C=0).

N.m.r. 1,7 (1H, s, OH), 3,08 (1H, d, J 17Hz, 60-CH), 3,56 (1H, dd, J 17Hz, J’ 2,5Hz, 6a-CH), 4,25 (2H, d, J 7,0Hz, =CHCH2), 4,95 (1H, dt, J 7,5Hz, J· 1Hz, =CHCH2), 5,11 (1H, d, J 1Hz, 3-CH), 5,75 (1H, d, J 2,5Hz, 5-CH), 5,87 (2H, d, CH2Phth), 7,75 - 8,2 δ (4H, m, Phth).

Esimerkki 29 p-Bronri-dbentsyyliklavulanaatti

|— OH

__/Q\ J

vXX

O "'C02CH2^ Br

Natriumklavulanaattia (70 mg) kuivassa dimetyyliformamidissa (1,0 ml) käsiteltiin p-bromibentsyylibromidilla (245 mg) ja seos jätettiin huoneenlämpötilaan 2 tunniksi. Liuotin haihdutettiin tyhjössä ja jäännös fraktioitiin piihappogeelillä eluoiden etyyliasetaatti-heksaanilla (3:1), jolloin saatiin tuote neulasina, sp. 101-2°C; 31 58332 ir(CHCl3), 1805, 1750 ja 1695 cm-1; nmr (CDCl-j) δ 1,94 (1H, S, OH), 3,12 (1H, dd, J 17,5 ja 0,8 Hz, 6&-CH), 3,62 (H, dd, J 17,5 ja 2,5 Hz, 6a-CH), 4,32 (2H, d, J 7,0 Hz, 9-CH2), 4,99 (1H, dt, J 7,0 ja 1,5 Hz, =CHCH2OH), 5,20 (1H, S, 3-CH), 5,28 (2H, S, C02CH2), 5,81 (1H, dd, J 2,5 ja 0,8 Hz, 5-CH), 7,45 (2H, d, J 8,5Hz, aromaattiset protonit) ja 7,68 (2H, d, J 8,5 Hz, aromaattiset protonit).

Esimerkki 30 β-(Ν,Ν-dietyyli)aminoetyyliklavulanaatti ι-r'V0"

N VeAg9 C1C—C-H2N--^} 2Jt— N

υ C02 υ C02CH2CH2N(Et)2 a) Hopeaklavulanaatti

Kaikki seuraavat toimenpiteet suoritettiin lähes täydellisessä pimeydessä .

Natriumklavulanaatin tetrahydraattia (2,93 g) ionivaihdetussa vedessä (6 ml) lisättiin hopeanitraattiin (1,69 g) ionivaihdetussa vedessä (2 ml). Viiden minuutin kuluttua ruskehtavan keltainen sakka suodatettiin, pestiin ionivaihdetulla vedellä (2 ml) ja sitten asetonilla (10 ml) ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin hopeaklavulanaattia (620 mg) ruskehtavan keltaisena kiinteänä aineena; v (nujoli)

m m 3.X

1785, 1695 (olkapää) ja 1580 (leveä) cm b) Esterin muodostus

Hopeaklavulanaattia (500 mg) lisättiin β-(Ν,Ν-dietyyli)aminoetyyli-kloridiin (135 mg; 0,6 ekvivalenttia) dimetyyliformamidissa (3 ml) ja seosta sekoitettiin magneettisesti pimeässä 1 tunnin ajan ympäristön lämpötilassa. Suspensio laimennettiin etyyliasetaatilla (10 ml) ja suodatettiin. Suodos haihdutettiin tyhjössä, jolloin saatiin vaaleankeltainen öljy, joka vähitellen tummeni seistessään; υ ^ (kalvo) 1800, 1750 ja 1695 cm'1; n.m.r. (CDClj) 6 1,04 (t., J 7,5Hz, N(CH2CH3)2), 2,43 - 3,0 (M, -CH2CH2N(CH2CH3)2), 3,07 (d, J 17Hz, 63-CH), 3,53 (dd, J 17 ja 2,5Hz, 6a-CH), 3,62 (leveä s., OH), 4,32 58332 32 (m, 9-CH2 ja -CC>2CH2CH2N) , 4,98 (br.t., J 7HZ, 8-CH), 5,12 (br,s., 3-CH), 5,76 (d, J 2,5Hz, 5-CH).

Esimerkki 31 (Antrasen-2-yyli)metyyliklavulanaatti

— OH

r-f"0 I

°^N οδο

Natriumklavulanaattia (0,5 g) ja 9-kloorimetyyliantraseenia (1,0 g) sekoitettiin dimetyyliformamidissa huoneenlämpötilassa yli yön. Re-aktioseos jaettiin etyyliasetaatin ja veden kesken ja etyyliasetaatti-kerros väkevoitiin alipaineessa. Fraktiointi piihappogeelillä eluoiden etyyliasetaatti-heksaanilla (1:1) antoi keltaisen, kiteisen tuotteen (0,5 g; 57 %), sp. 120°C; ir (CHCl-j) 1805, 1745 ja 1695cm"1; n.m.r. (CDCl-j) δ 1,35 (1H, br., OH), 2,90 (1H, d, J 17Hz, 6&-CH), 3,33 (1H, dd, J 17 ja 2,5 Hz, 6a-CH), 3,96 (2H, d, J 7Hz, 9-CH2>, 4,61 (1H, br.t., J 7 Hz = CH CH2OH), 4,98 (1H, S, 3-CH), 5,52 (1H, d, J 2,5Hz, 5-CH), 6,13 (2H, S, C02CH2), 7,2 - 8,5 (9H, m, aromaattiset protonit).

Esimerkki 32 N-bentsoksatsolonyylimetyyliklavulanaatti

_^0 CH-OH

0/ XCO-0-CH„

Natriumklavulanaatin tetrahydraattia (0,6 g) liuotettuna N,N-dimetyyliformamidiin (6 ml) käsiteltiin N-kloorimetyylibentsoksätso-lonilla (0,4 g) huoneenlämpötilassa sekoittaen. Neljän tunnin kuluttua Liuotin haihdutettiin tyhjössä ja jäännös jaettiin etyyliasetaatin (25 ml) ja veden (25 ml) kesken. Etyyliasetaattikerros 58332 kuivattiin natriumsulfaatilla ja haihdutettiin öljyksi, joka puhdistettiin pylväskromatografisesti piihappogeelillä käyttäen syklo-heksaania ja etyyliasetaattia eluentteina; saanto 0,5 g haurasta vaahtoa liuottimien poiston jälkeen.

Ir. (kalvo) 3400 (br, OH) 1790 (br, β-laktaami, molemmat esteri C=0) 1695cm 1 (C=C). N.m.r. 1,6 (1H, bs, vaihdot D20:n kanssa, CH2OH), 3,0 (1H, d, J 17Hz, 6-&-CH), 3,44 (1H, dd, J 17Hz, J 3Hz, 6-cx-CH) , 4,08 (2H, d, J 7Hz, CH2OH) , 4,79 (1H, t, J 7Hz, CH=) , 5,02 (1H, S, 3-CH), 5,60 (1H, d, J 3Hz, 5-CH), 5,86 (2H, S, CH2~N), 7,12 (4H, bs, C6H4).

Toinen näyte, joka valmistettiin analogisesti, jähmettyi seistessään ja sen sp. oli tällöin 95°C.

Sillä oli IR-spektri (nujoliliete) 3560, 3490, 1795 ja 1690 cm \ Esimerkki 33 2- (Bentsyylioksikarbonyyli)-2-(bensyylioksikarbonyyli-amino)etyyll-klavulanaatti

|— OH

p"T^ 1— N-k ^NHC02CH2C6H5 O CO-CH^CH ~ co2ch2c6h5

Klavulaanihappo (199 mg) kuivassa tetrahydrofuraanissa jäähdytettiin 0°C:en ja sitä käsiteltiin N-bent^ylioksikarbonyyli-L-seriinin ben-syyliesterillä (660 mg) ja disykloheksyylikarbodi-imidillä. Seoksen annettiin saavuttaa huoneenlämpötila ja se jätettiin siihen yli yön (magneettisekoitus). Liuottimen haihdutus alipaineessa ja jäännöksen fraktiointi piihappogeelillä eluoiden etyyliasetaatti-heksaaniseok-silla, antoi tuotteen (108 mg) öljynä, infrapunaspektri (CHCl^) 1805, 1760, 1725cm"1; n.m.r. (CDCl-j) δ 2,2 (1H, br. , OH), 2,94 (1H, d, J 17Hz, 63-CH), 3,33 (1H, dd, J 17 ja 2,5Hz, 6a-CH), 4,99 (1H, S, 3- CH), 5,10 (2H, S, C02CH2CgH5) , 5,18 (2H, S, , 5,45 (1H, d, J 2,5Hz, 5-CH), 5,81 (1H, br.d, J 8Hz, NH), 3,35 (10H, S, 2 x CgH5).

Muut protonit esiintyivät alueella 4,1-4,9 δ monimutkaisena rakenteena .

34 58332

Esimerkki 34

Klavulaanihapon 3-syanopropyyliesteri _s ch.ch2oh + N-k O ' C02Na

-CH. CH9OH

-* cA“N--k

u C02CH2CH2CH2CN

Spektritiedot esimerkille 34 N.m.r. (CDC13): 2,03 (2H, m, CH^CN) , 2,50 (2H, t, J 6Hz, CH2CN), 2,68 (1H, br., OH), 3,05 (1H, d, J 17,5 Hz, 68-CH), 3,55 (1H, dd, J 17,5 ja 2,5 Hz, 601-CH) , 4,1-4,5 (4H, m, C02CH2 ja CH2OH) , 4,93 (1H, t, J 7,5 Hz, 8-CH) , 5,13 (1H, S, 3-CH) , 5,72 (lii, d, J, 2,5Hz, 5-CH).

Natriumklavulanaatin tetrahydraattia (2, 9 g) liuotettiin dimetyyli-formamidiin (50 ml) huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen lisättiin 4-bromibutyronitriiliä (2,2 g). Reaktiota sekoitettiin 3 tuntia huoneenlämpötilassa, jolloin näyte tutkittuna ohutlevykromatogra-fisesti (piihappolevyt kehitettynä etyyliasetaatissa) osoitti huomattavaa esterimuodostusta, 0,6. Reaktiota puhdistettiin tavalliseen tapaan, so, uuttamalla etyyliasetaattiin, pesemällä sen jälkeen useita kertoja vedellä, kuivaamalla MgS04:lla, mikä johti liuottimen haihdutuksen jälkeen keltaiseen öljyyn. NMR-tutkimus osoitti ylimäärin reagoimatonta nitriiliä. öljy liuotettiin kloroformiin ja kaadettiin G60-piihappokolonniin (20 g) ja eluoitiin kloroformilla. Tuotetta sisältävät jakeet (tie) kerättiin talteen ja haihdutettiin tyhjössä, jolloin saatiin haluttua tuotetta vaaleankeltaisena öljynä.

IR ja NMR yhdenmukaisia rakenteen kanssa (sisälsi hivenmääriä liuottimia) .

35 58332

Esimerkki 35

Bentsyyliklavulanaatin p-trityylieetteri «v-cxS * J3CC""·" O x C02Na

-r^0·^ CH.CH-OH

-^ I 2 N ^CO„CH? —^3— 0C ~ Ph Z Z ^ Ph

Natriumklavulanaatin tetrahydraattia (17,1 g) liuotettiin dimetyyli-formamidiin (500 ml) huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen bentsyylibro-midin p-trityylieetteriä (23 g erittäin epäpuhdasta materiaalia) lisättiin. Liuosta sekoitettiin 1 tunti huoneenlämpötilassa ja puhdistettiin sitten tavalliseen tapaan uuttamalla etyyliasetaattiin jne. Tuote eristettiin pylväskromatografisesti G60-piihapolla (400 g) käyttäen kloroformi-n-heksaania suhteessa 1:1. Näin saatu tuote sisälsi yhä jonkin verran UV-herkkiä epäpuhtauksia (ei klavulaaniepäpuhtauksia) ja uusi kromatografinen erotus suoritettiin G60-piihapolla (40 g) käyttäen etyyliasetaatti-n-heksaania suhteessa 1:1 eluanttina. Tämä tuotti tyydyttävän tuloksen.

NMR yhdenmukainen rakenteen kanssa.

Spektritiedot esimerkille 35

Infrapuna (nujoli) 1805, 1747 ja 1695cm Nmr (CDCl^) 2,94 (1H, d, J, 17 Hz, 6B-CH), 3,40 (1H, dd, J 17 ja 2,5 Hz, 6a-CH), 4,16 (2H, d, J 6,5 Hz, CH2OH), 4,83 (1H, t, J 6,5Hz, 8-CH), 4,99 (3H, br.S, C02CH2 ja 3-CH), 5,61 (1H, d, J 2,5Hz, 5-CH), 6,6-7,7 (m, aromaattiset protonit).

Esimerkki 36 2-Bromietyyliklavulanaatti

[—r°v_r0H

° V--+ z C02CH2CH2Br 36 58332

Liuosta, jossa oli natriumklavulanaatin tetrahydraattia (2,05 g) dimetyyliforraamidissa (5 ml), käsiteltiin 1,2-dibromietaanilla (1 ml). Seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 7 päivää ja sen jälkeen suurin osa liuottimesta poistettiin tyhjössä 30°C:ssa. Vettä lisättiin jäännökseen ja seos uutettiin etyyliasetaatilla. Etyyli-asetaattiliuos pestiin vedellä, kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin. Tuote eristettiin pylväskromatografisesti (piigeeli, etyyliasetaatti eluenttina). Saalis 168 mg.

N.m.r. (CDC13) 2,0 (1H, leveä s, vaihtokelpoiset), 3,04 (1H, d, J 17Hz), 3,49 (2H, t, J 7Hz), 3,48 (1H, dd, J 3 ja 17Hz), 4,18 (2H, d, J 7Hz), 4,43 (2H, t, J 7Hz), 4,93 (1H, t, J 7Hz), 5,05 (1H, s jossa hienoa kytkeytymistä), 5,67 (1H, d, J 3Hz).

Esimerkki 37 Fenasyyllklavulanaatti

I— OH

rTf o λ in S CO-CH-C C£Hc O 2 2 6 5

Natriumklavulanaatin tetrahydraattia (0,5 g) minimimäärässä dime-tyyliformamidia, käsiteltiin fenasyylibromidilla (0,34 g) ja seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 3 tuntia. Liuotin poistettiin tyhjössä ja jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin. Etyyliasetaattiliuos pestiin vedellä, kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin, jolloin saatiin fenasyyliesteriä (400 mg) kiinteänä aineena; sp. 89-90°C, infra-punaspektri (kalvo) 3450, 1800, 1760 ja 1700cm 1; n.m.r. (CDCl^) δ 3,02 (1H, dd, J 17 Hz ja 1Hz, 68-CH), 3,65 (1H, dd, J 17 ja 3Hz, 6a-CH) , 4,20 (2H, d, J 8Hz, 9-¾) , 5,00 (1H, dt, J 8Hz, =CH CH2OH) , 5,23 (1H, br. s., 3-CH), 5,58 (2H, S, CHjCOCgHg), 5,74 (1H, dd, J 17 ja 1Hz, 5-CH), 7,7 (5H, m, COCgHg); molekyylipaino (massaspektroskopia) 317,0894 (todettu), 317,0899 (laskettu).

Analyysi kokeellisesti C 60,23; H 5,00; N 4,40 % laskemalla C 60,57; H 4,73; N 4,42 % 37 58332

Esimerkki 38 2-Pyridyylimetyyliklavulanaatti

rTV"0H

' / N ^ n)

Liuokseen, jossa oli natriumklavulanaatin tetrahydraattia (1,17 g) ja 2 - pyridyylimetyylibromidin hydrobromidia (1,01 g) DMF:ssa (8 ml), lisättiin kaliumkarbonaattia (552 mg). Seosta sekoitettiin yli yön ja laimennettiin sitten yhtä suurella tilavuusmäärällä etyyliasetaattia. Liuos suodatettiin, suodos haihdutettiin ja jäännös uutettiin etyyliasetaatilla. Tämä menettely toistettiin ja tuote puhdistettiin kromatografisesti (piigeeli, etyyliasetaatti). Saalis 335 mg.

I.r. (kalvo): 3450, 1805, 1750, 1695cm-1 N.m.r (CDCl^) δ 2,48 (1H, br., vaihtokelpoiset) 3,01 (1H, d, J 17Hz), 3,45 (lH,dd, J 17 ja 3Hz), 4,19 (2H, d, J 7Hz), 4,91 (1H, t jossa hienoa kytkeytymistä, J 7Hz), 5,1 (1H, s jossa hienoa kytkeytymistä) 5,25 (2H, s), 5,66 (1H, d, J 3Hz), 7,1-7,4 (2H, m), 7,67 (1H, dt, J 8 ja 1Hz), 8,52 (1H, d, J 6Hz).

Esimerkki 39 N-bentsyylioksikarbonyyli-N-metyyliaminoetyyllklavulanaatti /- O \ / CH3

CO,CH CH N

C0-,CHoC,Hc 2 2 6 5

Bentsyyliklavulanaattia (1 g) hydrattiin 10 %:sella Pd/C-katalyytiliä (400 mg) THFrssa (30 ml), kunnes mitään esteriä ei ollut jäljellä. Liuos suodatetun ja sitä käytettiin alla kuvatulla tavalla.

Liuos, jossa oli N-metyyli-N^-nitroso-N^^-dibentsyylioksikarbonyyli- 1,2-diaminoetaania (3,71 g) Cl^C^rssa (10 ml), jäähdytettiin -30°C:en 38 58332 ja sitä käsiteltiin pyrrolidiinilla (0,71 g). Liuosta sekoitettiin -25 --30°:ssa 30 minuuttia ja jäähdytettiin sitten -35°C:en. Yllä kuvatulla tavalla valmistettu klavulaanihappoliuos lisättiin sitten näin valmistetun diatsoyhdisteen sekoitettuun liuokseen sellaisella nopeudella, että lämpötila ei noussut yli -30°C. Vielä 15 minuutin sekoituksen jälkeen lisättiin BF-^-eteraattia (0,5 ml) ja liuosta sekoitettiin 5 minuuttia. Ylimäärin NaHC03~liuosta lisättiin, vesi-kerros erotettiin ja uutettiin metyleenikloridilla. Yhdistetyt me-tyleenikloridiliuokset pestiin vedellä, kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin. Jäännöksen toistettu kromatografinen käsittely (piigeeli H, etyyliasetaatti, kloroformi ja eetteri eluentteina) antoi väritöntä kumia (180 mg).

Ir (kalvo): 3450, 1800, 1745, 1600cm * N.m.r. (CDClj): δ 2,25 (1H, br. s, vaihtokelpoiset) 2,93 (3H, s), 3,00 (1H, d), 3,3-3,6 (5H, m), 4,17 (2H, d, J 7Hz), 3,85 (1H, t, J 7Hz jossa pientä parittumista), 4,98 (1H, s), 5,08 (2H, s), 7,28 (5H, s).

Esimerkki 40 1-Asetoksietyyliklavulanaatti

Kuivaan DMF:an (5 ml), jota sekoitettiin 0°C:ssa, lisättiin natrium-klavulanaatin tetrahydraattia (1,025 g) ja sitten 10 minuutin kuluttua 1-bromietyyliasetaattia (1 ml). Seoksen annettiin seistä yli yön jääkaapissa, minkä jälkeen liuotin poistettiin tyhjössä. Vettä lisättiin jäännökseen ja seos uutettiin etyyliasetaatilla. Orgaaninen faasi pestiin vedellä, kuivattiin (MgS04) ja haihdutettiin. Jäännöksen kromatografointi (piigeeli 60, etyyliasetaatti) antoi otsikon yhdistettä (176 mg) (R^ 0,49).

Ir (CHC13): 3350, 1810, 1770, 1695cm-1 N.m.r. (CDC13): δ 1,47 ja 1,49 (3H, kaksi duplettia, J 5Hz, isomeerien seos etyyli-Cl:ssä), 2,04 (3H, s), 3,01 (1H, d, J 17Hz), 3,45 (1H, dd, J 17 ja 3Hz), 3,15 (1H, br, vaihtokelpoiset), 4,17 (2H, d, J 7Hz), 4,80 (1H, m), 4,98 (1H, s jossa hienoa kytkeytymistä), 5,63 (1H, d, J 3Hz), 6,78 (1H, q, J 5Hz).

39 58332

Esimerkki 41 1-Etoksikarbonyylioksietyyliklavulanaatti (a) 1-kloorietyyliklooriformaatti

Etyyliklooriformaattia (108,5 g) ja a-atsoisobutyronitriiliä (0,5 g) sekoitettiin ja refluksoitiin. Kuivaa kloorikaasua johdettiin liuoksen läpi, kunnes havaittiin 34,5 g:n painon nousu (vastaten monokloo-rausta). Neste fraktioitiin normaalipaineessa, jolloin saatiin 1-kloorietyyliklooriformaattia (33 g), kp. 117-118°C.

(b) Etyyli-l-kloorletyylikarbonaatti

Yllä olevan kohdan (a) tuotetta (14,3 g) lisättiin sekoittaen etanoliin (50 ml) lämpötilan noustessa itsestään 62°C:en. Kun lämpötila oli laskenut 30°C:en, vettä (200 ml) lisättiin. Raskas öljy erottui ja sen kerättiin talteen. Vesifaasi uutettiin dikloorimetaanilla (3 x 50 ml), uutteet yhdistettiin, kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin. Saatu öljy tislattiin normaalipaineessa, jolloin saatiin vaadittua yhdistettä (12,1 g), kp. 155-157°C. Rakenne varmistettiin NMR- ja alkuaineanalyysillä (kokeellisesti: C 39,5, H, 6,2, Cl 23,25 %; laskemalla kaavasta C^HgClO^: C 39,4, H, 5,9, Cl 23,2 %.

(c) 1- (Etoksikarbonyylloksi) etyyllklavulanaatti

Kohdasta (b) yllä saatua tuotetta (3,04 g) DMFrssa (5 ml) lisättiin sekoitettuun liuokseen, jossa oli natriumklavulanaattia (5,86 g) ja kaliumjodidia (500 mg) DMFissa (15 ml). 21 tunnin kuluttua seos laimennettiin etyyliasetaatilla (250 ml), pestiin kyllästetyllä NaHCO^-liuoksella, kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin öljyksi. Tuote puhdistettiin kromatografisesti (Sephadex LH 20, kloroformi/syklohek-saani 1:1), jolloin saatiin vaaleankeltainen öljy (206 mg), joka antoi yhden täplän tlc-analyysissä käyttäen kloroformi/syklohek-saania suhteessa 1:1. Rakenne varmistettiin NMR-spektroskopialla.

Täten NMR-spektri, joka vastaa 1-(etoksikarbonyylioksietyyliklavula-naattia, on seuraava: N.m.r. (CDCl^)» 1,33 (3H, t, J 8Hz, OCH2CH3), 1.58 (3H, d, J 5,5Hz, -OCH(CH3)O-), 3,08 (1H, d, J, 17,5Hz, 6&-CH), 3.58 (1H, br.s., OH), 3,57 (1H, dd, J 17,5 ja 3Hz, 6a-CH), 4,23 (2H, d, J 7Hz, 9-CH2) , 4,29 (2H, q, J 8Hz, OCH^H-j) , 4,95 (1H, br.t., J 7Hz, 8-CH), 5,12 (1H, br.s., 3-CH), 5,76 (1H, d, J, 3Hz, 5-CH), 6,83 (1H, q, J, 5,5Hz, -OCH(CH3)O-).

40 58332

Esimerkki 42 p-Kloorifenoksimetyyliklavulanaatti Jäähdytettyä (jäävesi), sekoitettua liuosta, jossa oli natriumkla-vulanaatin tetrahydraattia (6 g, 0,02 mol) dimetyyliformamidissa (60 ml), käsiteltiin p-kloorifenoksimetyylikloridilla (3,5 g, 0,02 mol). 2 1/2 tunnin kuluttua <10°C:ssa dimetyyliformamidi haihdutettiin suureksi osaksi tyhjössä huoneenlämpötilassa (20°C). Tähän siirappiin lisättiin etyyliasetaattia (200 ml) ja jääkylmää vettä (20 ml). Etyyliasetaattia kuivattiin natriumsulfaatilla, haihdutettiin siirapiksi ja jäännökselle suoritettiin pylväskromatografinen käsittely piihappogeelillä käyttäen etyyliasetaattia ja sykloheksaa-nia eluentteina (sekoitettuna suhteissa 1:2 - 2:1). Pieni määrä klavulaanihapon dieenin p-kloorifenoksimetyyliesteriä eluoitui ensiksi, mitä seurasi vaadittu puhdas p-kloorifenoksimetyyliklavulanaatti (4,7 g). (Tämä sisälsi hyvin pienen määrän dieeniä, joka oli riittävästi havaittavissa ohutlevykromatografiällä, jotta se voitiin nähdä NMR-spektrissä). Ir: 3400 (br, OH) 1805 (β-laktaami C=0) 1765 (esteri C=0) 1695cm_1 (C=C).

N.m.r.: (CDC13), 1,5 (OH), 3,00 (1H, d, J 17Hz, 6-p-CH), 3,44 (1H, dd, J 17 ja 3Hz, 6-a-CH), 4,14 (2H, d, J 7Hz, CH2OH), 4,77 (1H, bt, J 7Hz, CH=CH2), 5,02 (1H, bs, 3-CH), 5,60 (1H, d, J 3 Hz, 5-CH), 5,70, 5,77 (2H, ABq, J 7Hz, 0CH20) , 6,89, 7,218 (4H, A^q, J 9Hz, W*

Esimerkki 43

Bentsyylioksimetyyliklavulanaatti

Natriumklavulanaatin tetrahydraattia (2,93 g) liuotettiin dimetyyli-formamidiin (20 ml) ja saatu samea liuos suodatettiin. Kirkas keltainen liuos jäähdytettiin jäillä ja sitä sekoitettiin samalla, kun bentsyylikloorimetyylieetteriä (1,57 g, valmistettu menetelmän mukaisesti, jonka ovat esittäneet Graham ja McQuillin J. Chem. Soc.

1963, 4634) lisättiin tipoittain. Sekoitusta ja jäähdytystä ylläpidettiin 2 1/2 tuntia. Reaktioseos haihdutettiin, jolloin saatiin oranssin värinen öljy, jota uutettiin useita kertoja etyyliasetaatilla. Yhdistetyt etyyliasetaattiuutteet haihdutettiin keltaiseksi öljyksi.

öljyn analyysi ohutlevykromatografisesti (piihappogeelilevyillä, eluointi metyyliasetaatti:etyyliasetaatti:metyylisyklopentaanilla suhteessa 1:1:2, näkyväksi teko permanganaattisuihkulla) osoitti 41 58332 kahta vyöhykettä kohdissa 0,21 ja 0,55, joiden voimakkuus oli suunnilleen yhtä suuri, öljy kromatografoitiin kolonnilla, joka oli täytetty piihappogeelillä, ja eluoitiin etyyliasetaatin ja syklo-heksaanin seoksella (1:1). Eluoitujen jakeiden koostumus analysoitiin ohutlevykromatografisesti ja hitaasti etenevä materiaali kerättiin vapaaksi kaikseta havaittavasta epäpuhtaudesta. Haihdutus antoi lähes väritöntä öljyä (0,7 g).

N.m.r. (CDC13): δ 2,08 (1H, bs), 3,02 (1H, d, J 16Hz), 3,38 (1H, dd, J 16Hz, J' 3Hz), 4,15 (2H, d, J 7Hz), 4,64 (2H, s), 4,87 (1H, bt, J 7Hz), 4,99 (1H, bs), 5,34 (2H, s), 5,58 (1H, d, J 2Hz), 7,25 (5H, bs).

Esimerkki 44 p-Nitrobentsyylioksimetyyliklavulanaatin valmistus

Natriumklavulanaatin tetrahydraattia (2,93 g) liuotettiin dimetyyli-formamidiin (20 ml) ja saatu samea liuos suodatetiin. Kirkas keltainen liuos jäähdytettiin jäillä ja sekoitettiin samalla kun kloorime-tyyli-p-nitrobentsyylieetteriä (2,02 g) lisättiin tipoittain. (Tämä reagenssi valmistettiin menetelmällä, jota ovat käyttäneet D.N. Kursanov ja P.A. Solodkov, J. Applied Chem. (USSR) (1943) , _16^ sivut 351-5). Reaktioseosta sekoitettiin 2 tuntia ja reaktion edistymistä seurattiin ohutlevykromatografisesti (piihappogeelilevyt, eluointi metyyliasetaatin, etyyliasetaatin ja metyylisyklopentaanin seoksella suhteessa 1:1:2). Tämän ajan kuluttua päätuote oli p-nitro-bentsyylioksimetyyliklavulanaati (Rf 0,18), jossa oli myös pieni määrä eetteriesteriä (kohdassa Rf 0,35). Liuotin poistettiin haihduttamalla ja epäpuhdas reaktiotuote puhdistettiin pylväskormatografiällä piihappogeelillä eluoiden sykloheksaanin ja etyyliasetaatin seoksella suhteessa 5:4. Tuote saatiin haihduttamalla sopivat kromatografia-jakeet ja oli aluksi keltaista öljyä, mutta kiteytyi myöhemmin.

Infrapunaspektri liitteenä. Röntgensädediffraktogrammi (CuK-säteily), heijastukset kohdalla 2Θ :- 9,7, 11,65, 14,0, 15,6, 16,6, 18,0, 19,55, 20,4, 21,1, 22,8, 23,5, 24,75, 26,3, 28,05, 29,95, N.m.r. (CDC13) δ 1,85 (1H, bs), 3,01 (1H, d, J=16Hz), 3,42 (1H, dd, J=16Hz, 3Hz), 4,14 (2H, d, J=7Hz), 4,73 (2H, s), 4,85 (1H, bt, J=7Hz), 4,97 (1H, s), 5,39 (2H, s), 5,59 (1H, d, J=3Hz), 7,75 (4H, dd, J=62Hz, 8Hz).

42 5 8 3 3 2

Esimerkki 45 Allyyliklavulanaatti

CH-OH CHo0H

rrW —> rry y~‘-< fn Ma \ 2 co2ch2ch=ch2

Sekoitettuun liuokseen, jossa oli natriumklavulanaatin tetrahydraat-tia (2,05 g) kuivassa dimetyyliformamidissa (9 ml), lisättiin allyy-libromidia (2,44 ml). Seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 3 tuntia ja liuotin poistettiin sitten tyhjössä alle 30°C:ssa. Jäännös jaettiin veden ja etyyliasetaatin kesken. Etyyliasetaattikerros pestiin vedellä, kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin. Jäännös puhdistettiin pylväskromatografisesti (piigeeli 60/etyyli-asetaatti, Rf ~ 0,53), jolloin saatiin otsikon yhdistettä (1,31 g) öljynä.

I.r. (kalvo): 3400, 1805, 1745, 1695.

N.m.r. (CDCl^/ 90ΜΗ^) δ 1,98 (1H, singletti vaihtokelpoinen), 3,02 (1H, dupletti, J 17Hz), 3,46 (1H, kaksoisdupletti, J 17Hz x 3 Hz), 4,19 (2H, dupletti, J 7Hz), 4,61 (2H, dupletti, jossa hienompaa kytkeytymistä J 6Hz), 4,88 (1H, tripletti, jossa hienoa kytkeytymistä, J 7Hz), 5,02 (1H, singletti, jossa hienoa kytkeytymistä), 5,29 (2H, tripletti, jossa hienoa kytkeytymistä, J 8Hz), 5,64 (1H, dupletti, J 3Hz), 5,7-6,1 (1H, multipletti).

Esimerkki 46 Asetonyyliklavulanaatti

CHo0H CH0OH

py —* O \ 0 \ C02Na C02CH2C0CH3

Sekoitettuun liuokseen, jossa oli natriumklavulanaatin tetrahydraat-tia (2,05 g) kuivassa dimetyyliformamidissa (9 ml), lisättiin bromi-asetonia (2,35 ml). Seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa yli yön 43 5 8 3 3 2 ja sen jälkeen liuotin poistettiin tyhjössä alle 30°C:ssa. Jäännös jaettiin veden ja etyyliasetaatin kesken. Etyyliasetaattiliuos pestiin vedellä, kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin. Esteri eristettiin pylväskromatografisesti (piigeeli 60/etyyliase-taattieluentti;Rf 0,36), jolloin saatiin otsikon yhdistettä (565 mg).

I.r. (kalvo): 3400, 1800, 1755, 1730.

N.m.r. (CDCl^ 90ΜΗ^) δ 2,14 (3H, singletti), 2,20 (1H, leveä vaihtokelpoinen), 3,04 (1H, dupletti, 17Hz), 3,46 (1H, kaksoisdupletti, J 17Hz x 3Hz), 4,20 (2H, dupletti, jossa hienoa kytkeytymistä, J 8Hz), 4,7 (2H, singletti), 4,97 (1H, kaksoistripletti, 8Hz,

Jdupl ~ 1,5Hz), 5,12 (1H, hienosti kytkeytynyt singletti), 5,67 (1H, dupletti J 3Hz).

Esimerkki 47

Sykloheksyyliklavulanaatti

CH^OH

n—CH2°H

o \ o \ /-v CO H v _/ \ 2 co2—<y

Liuosta, jossa oli N-karboetoksi-N-nitrososykloheksyyliamiinia (1,4 g- valmistettu antamalla typpidioksidin reagoida N-karboetok-si-sykloheksyyliamiinin kanssa CCl^rssa vedettömän natriumasetaatin läsnäollessa) dikloorimetaanissa (25 ml) 0°C:ssa, käsiteltiin pyrro-lidiinilla (0,62 ml) ja sekoitettiin 0°C:ssa 30 minuuttia. Tähän liuokseen lisättiin 5 minuutin aikana klavulaanihapon liuosta tetra-hydrofuraanissa (valmistettu hydraamalla bentsyyliklavulanaattia (1 g) tetrahydrofuraanissa (30 ml) 10 %:sella palladium-hiilikata-lyytillä). Saatua liuosta käsiteltiin ylimäärin olevalla natriumbi-karbonaattiliuoksella. Saatu seos uutettiin useilla erillä kloroformia ja kloroformiliuos kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin. Toistettu kromatografinen käsittely (kahdesti etyyliasetaatin ja sykloheksaanin seoksella suhteessa 1:1 ja kerran kloroformilla piigeelillä H) antoi otsikon yhdistettä (46 mg).

I.r. (kalvo): 3400, 1800, 1740, 1695 cm"1.

N.m.r. (CDC12): δ 1,1 - 2,0 (11H, m 1H vaihtokelpoinen), 3,01 (1H, 44 58332 d, J = 16Hz), 3,45 (1H, dd, J = 16 ja 3Hz), 4,17 (2H, d, J = 7Hz), 4,5 - 5,0 (1H, m), 4,87 (1H, t, J = 7Hz), 4,96 (1H, s), 5,63 (1H, d, J = 3Hz).

Esimerkki 48 Propargyyliesteri ch2oh I—f-0\/CH20H ΓΙ'* “''T™ J_+ HCSC-CH2Br -> >— N-

CT \ 0 VxCOOCH_-C=CH

C02Na 2

Natriumklavulanaatin tetrahydraattia (4,4 g, 0,0150 mol) liuotettiin kuivaan DMF:an (25 ml) ja propargyylibromidia (1,6 ml, 2,53 g, 0,0212 mol) lisättiin hitaasti samalla sekoittaen. Seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 2 tuntia ja se kaadettiin sitten veteen (250 ml) ja tuote uutettiin etyyliasetaatilla (3 x 100 ml). Yhdistetyt etyyliasetaattiuutteet pestiin vedellä (4 x 100 ml) ja kuivattiin magnesiumsulfaatilla. Kirkas, kuiva etyyliasetaattiliuos haihdutettiin kuiviin tyhjössä, jolloin saatiin paksu öljy, jonka osoitettiin ohutlevykromatografisesti (piihappogeelilevyt/etyyli-asetaattikehitysaine) sisältävän kaksi komponenttia.

öljy liuotettiin kloroformiin (2 ml) ja kromatografoitiin Sephadex LH-20-hartsilla käyttäen kloroformin ja sykloheksaanin seosta suhteessa 1:1 eluenttina. Jakeet (25 ml) analysoitiin ohutlevykroma-tografisesti ja ne jakeet, jotka sisälsivät nopeammin liikkuvaa komponenttia huomattavat määrät, kerättiin yhteen ja väkevöitiin tyhjössä, jolloin saatiin paksu öljy (2,2 g). Tämä öljy jähmettyi seistessään yli yön. Ohutlevykromatografinen analyysi osoitti vain yhtä komponenttia. NMR-spektri osoitti kloroformia olevan jonkin verran läsnä.

Tuote pestiin eetterillä, jolloin saatiin kiinteää ainetta (700 mg, sp. 65-6°C). Alhainen talteenotto johtui sen huomattavasta liukoisuudesta tähän liuottimeen. Saatiin seuraavat analyysitulokset: 45 58332

Alkuaineanalyysi, kokeellisesti: C 55,55; H 4,68; N 6,12 %

Laskemalla kaavasta chhiin<^5! C 55,69; H 4,68; N 5,91 % NMR-spektri δ (CDC13); 2,01 (s 1H), 2,6 (t 1H), 2,95 - 3,75 (m 2H), 4,29 (d 2H) , 4,79 - 5,00 (m 3H) , 5,13 (d 1H) , 5,75 (d 1H) .

DMF = dimetyyliformamidi tie = ohutlevykromatografia

Esimerkki 49 6-Metoksinaft-2-yylimetyyliesteri

^CX -r—<\ PH20H

<[γ' 0J

C02Na c°2 -OMe

Liuosta, jossa oli vedetöntä natriumklavulanaattia (2,2 g, 10 mmol) ja 6-metoksi-2-bromimetyylinaftaleenia (2,51 g, 10 mmol) kuivassa DMF:ssa (80 ml), sekoitettiin huoneenlämpötilassa. Kolmen tunnin kuluttua reaktioseoksen tutkiminen ohutlevykromatografisesti osoitti, että bromimetyylinaftaleenia ei ollut läsnä. Reaktioliuotin poistettiin tyhjössä 30°C:ssa ja jäännöstä käsiteltiin etyyliasetaatilla (100 ml). Suspensio suodatettiin ja suodos pestiin vedellä (2 x 25 ml), kuivattiin magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja stripattiin, jolloin saatiin oranssi öljy (3,2 g). Tämän tuotteen kromatografointi Sepha-dex LH 20-hartsilla (100 g) (eluentti 50:50 kloroformi:sykloheksaani, keräten 10 ml:n jakeet; jakeet 12-20 sisälsivät vaadittua esteriä määritettynä ohutlevykromatografisesti tehden näkyväksi TTC-suihkul-lax) tuotti kirkaan öljyn, joka jähmettyi seistessään. Tämä materiaali liuotettiin dikloorimetaaniin ja 60-80°C:ssa kiehuvaa bensiiniä lisättiin, kunnes liuos tuli sameaksi. Seoksen seistessä avoimessa keittolasissa muodostui kumi. Yläpuolisen nesteen annettiin haihtua edelleen ja valkoinen kiteinen kiinteä aine muodostui, 2,52 g, 68 %, sp. 89-90°C.

46 5 8 3 3 2

Alkuaineanalyysi, kokeellisesti: C 64,91; H 5,00; N 3,77 %

Laskemalla kaavasta ^20H19N^6: ^ 65,04; H 5,15; N 3,79 % nmr (CDC13) 6 1,45 (1H, bs, CH20H), 2,9 (1H, d, 60-H), 3,36 (1H, H dd, 6σ-Η), 3,8 (3H, s, 0CH3), 4,03 (2H, d, CH2OH), 4,7 (1H, t,=^ ), 4,93 (1H, s, CHC02-), 5,27 (2H, s, -CH2OCO), 5,65 (1H, d, 50-H), 7,37 (6H, m, aromaattisia H's).

χ 4 % trifenyylitetratsoliumkloridi mc.*tanolissa + yhtä suuri tilavuus-määrä NaOH:n 1-N metanoliliuosta.

Esimerkki 50 2-Metoksietyyliesteri ch2oh

ch3och2ch2ch ch3och2ch2i r~f ΎCH

2) Nai 4H20 ^-N-

C02CH2CH20CH

2-metoksietyylikloridia (43 g, 0,455 mol) (JACS 1930, 52, 653) lisättiin liuokseen, jossa oli natriumjodidia (75 g, 0,50 mol) asetonissa (500 ml) ja reaktiota refluksoitiin 3-4 tuntia. Suurin osa asetonista tislattiin pois normaalipaineessa, jäännös jäähdytettiin ja laimennettiin eetterillä (200 ml). Eetteriliuos suodatettiin puhtaaksi epäorgaanisista suoloista, pestiin peräkkäin suolaliuoksella (100 ml), 5 %:sella natriumtiosulfaatin vesiliuoksella (100 ml), jälleen suolaliuoksella (100 ml) ja kuivattiin magnesiumsulfaatilla. Suodatuksen jälkeen eetteri poistettiin tislaamalla normaalipaineessa ja tuote eristettiin tislaamalla ottaen talteen jae, joka kiehui 130-140°C:n välillä (normaalipaine). Tuote, raskas vaaleankeltainen neste painoi 20 G (23 % mikäli 100 %:sesti puhdasta).

Liuokseen, jossa oli natriumklavulanaatin tetrahydraattia (6 g, 0,0205 mol) dimetyyliformamidissa (100 ml), lisättiin 2-metoksi-etyylijodidia (5,6 g, 0,03 mol) huoneenlämpötilassa. Reaktiota sekoitettiin 5 tuntia, minkä ajan kuluttua ohutlevykromatografia (pii-happolevyt kehitettynä etyyliasetaatissa, täplät tehty näkyviksi al-kaalisella TTC-suihkulla, Rf natriumklavulanaatti 0,0, Rf esteri 0,5) osoitti jonkin verran esterin muodostumista. Reaktio laimennettiin 47 58332 etyyliasetaatilla (200 ml) ja vedellä (500 ml), vesiliuos uutettiin uudelleen etyyliasetaatilla (100 ml) ja yhdistetyt orgaaniset uutteet pestiin vedellä (4 x 100 ml). 1-N natriumbikarbonaatilla (100 ml) ja jälleen vedellä (3 x 100 ml) ja kuivattiin sitten magnesiumsulfaatilla. Suodatuksen jälkeen liuotin haihdutettiin tyhjössä ja näin vaaleankeltaisena öljynä saatu esteri kuivattiin lopuksi suurtyhjössä liuottimen ja reagoimattoman jodiyhdisteen viimeisten jälkien poistamiseksi. Saatu tuote oli oleellisesti puhdas pmr-spektrin mukaan.

Saalis: alle 5 %.

pmr (CDC13): 6 5,65 (1H d): δ 5,05 (1H s) ja 6 4,9 (1H t) peittäen toisiaan: δ 4,2 (4H m): δ 3,6 (2H m): δ 3,35 (3H s) peittäen δ 3,3 (1H m) : δ 2,9 (1H s) .

Esimerkki 51 4-Metcksibentsyyliesteri CH-Br CH2°H ^ X _^ .<kx»2oh o^_N 0 "cO^C^OCl^

Natriumklavulanaattia (18,2 g, n. 0,07 mol vedetöntä natriumklavula-naattia, vesipitoisuus 22,8 %) liuotettiin dimetyyliformamidiin (100 ml) ja käsiteltiin liuoksella, jossa oli 4-metoksibentsyyli-bromidia (13,5 g, 0,07 mol) dimetyyliformamidissa (25 ml). Kirkasta liuosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 80 minuuttia ja laimennettiin sitten etyyliasetaatilla (300 ml) ja vedellä (200 ml). Vesiker-ros erotettiin pois ja uutettiin uudelleen etyyliasetaatilla (300 ml). Etyyliasetaattiuutteet yhdistettiin ja pestiin vedellä (200 ml x 6) ja kuivattiin MgS04:lla. Haihdutus tuotti öljyä 19,5 g.

öljy liuotettiin kloroformi/sykloheksaaniin (1:1) ja kromatografoi-tiin 65 x 400 mm:n Sephadex-kolonnissa (500 g, LH 20 täydennetty kloroformi/sykloheksaanin seokseen suhteessa 1:1). Vaadittua esteriä sisältävät jakeet yhdistettiin ja haihdutettiin tyhjössä, jolloin saatiin vaaleankeltainen öljy. Hiertäminen n-heksaanissa antoi kiinteän jauhemaisen tuotteen, joka suodatettiin pois, pestiin suo-datintyynyllä tuoreella n-heksaanilla ja kuivattiin tyhjössä, saalis 12,6 g (57 %), sp. 54,5-55,5°C.

Claims (1)

1. 48 5 8 3 3 2 IR (KBr-kiekko) 3400, 2950, 2840, 1795, 1735, 1690, 1615, 1515, max n 1305, 1250, 1175, 1005, 890, 825 cm . Sama tuote voitiin valmistaa klavulaanihaposta tetrahydrofuraani-liuoksessa ja 4-metoksibentsyylialkoholista ja disykloheksyylikar-bodi-imidistä. Saalis (0,1052 mooliasteikolla) 0,3 g (18 %). Patenttivaatimus Menetelmä bakteereja tappavasti vaikuttavien klavulaanihapon estereiden valmistamiseksi, joilla on kaava ^O. CH-OH ΓΤ >/ s— 0 'co2R jossa R on 1-9 hiiliatomia sisältävä hiilivetyryhmä, joka mahdollisesti on substituoitu halogeenilla, alemmalla alkoksiryhmällä, hydrok- syyliryhmällä tai mahdollisesti suolan muodossa olevalla emäksisellä 2 3 2 3 ryhmällä NR R , jossa R on vetyatomi tai alempi alkyyliryhmä ja R 2 on vetyatomi tai alempi alkyyliryhmä tai on liittynyt ryhmään R 2 3 niin, että NR R on 5- tai 6-jäseninen rengas, tunnettu siitä, että kaavan 0 £o2h mukainen klavulaanihappo tai sen suola saatetaan reagoimaan yhdisteen kanssa, jolla on kaava R-Q, jossa Q on helposti poistuva ryhmä ja R on sama kuin edellä. Förfarande för framställning av antibakteriellt verksamma estrar av klavulansyra, vilka har formeln