FI57782C - Foerfarande och reagens foer enzymkinetisk koncentrationsbestaemning hos ett substrat - Google Patents

Foerfarande och reagens foer enzymkinetisk koncentrationsbestaemning hos ett substrat Download PDF

Info

Publication number
FI57782C
FI57782C FI2876/74A FI287674A FI57782C FI 57782 C FI57782 C FI 57782C FI 2876/74 A FI2876/74 A FI 2876/74A FI 287674 A FI287674 A FI 287674A FI 57782 C FI57782 C FI 57782C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
substrate
reaction
enzyme
concentration
inhibitor
Prior art date
Application number
FI2876/74A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI57782B (fi
FI287674A7 (fi
Inventor
Reinhard Mueller-Matthesius
Wolfgang Gruber
Original Assignee
Boehringer Mannheim Gmbh
Eppendorf Geraetebau Netheler
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19742440011 external-priority patent/DE2440011C2/de
Application filed by Boehringer Mannheim Gmbh, Eppendorf Geraetebau Netheler filed Critical Boehringer Mannheim Gmbh
Publication of FI287674A7 publication Critical patent/FI287674A7/fi
Publication of FI57782B publication Critical patent/FI57782B/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI57782C publication Critical patent/FI57782C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/62—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving uric acid

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Description

Γβΐ m.KUULUTU$JULKAISU c o r, q 0 jgrj· m en) utuäcgninosskaipt 57782 C (45) Patentti myönnetty 10 10 1030 Patent medaelat ' (51) Κ».Λ?/Ιη».α3 C 12 Q 1/00, G 01 N 33/50
SUOMI —FINLAND (21> PMwrnlWwmu·—PauManattftiftg 2876M
(22) HakwnltpUvt—AMftkninpdH 02.10.7^ (23) AJkupUvt—Giltlghttsdaj 02.10.7^ (41) Tullut JuIMmIuI — Bltvtt offandlg 05. oU. 75
Pstmttl· \x rekisterihallitut (44) NlhtMtolpM0„,. ku^utw™,
Patent- och registerstyrelsen ' ' AmMu» utUgd och utUkrMtun pubiicund 30.06.80 (32)(33)(31) Pyydetty muoIImu<—Bugtni priority 0U.IO.73 2i.O8.7U Saksan Liittotasavalta-Förbunds-republiken Tyskland(DE) P 23^9819.3, P 2UU0011.1 " (71) Eppendorf Gerätebau Netheler & Hinz GjnbH, Barkhausenweg 1, 2 Hamburg 63,
Boehringer Mannheim GmbH, Sandhofer Str. 112-132, 68 Mannheim-Waldhof,
Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (72) Reinhard Miiller-Matthesius, Hamburg-Norderstedt, Wolfgang Gruber, Unter-zeismering, Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (7U) Berggren Oy Ab (5U) Menetelmä ja reagenssi substraatin entsyymikineettisen väkevyysmäärityk-sen suorittamiseksi - Förfarande och reagens för enzymkinetisk koncent-rationsbestämning hos ett substrat
Esillä oleva keksintö koskee menetelmää liuotetun tai suspendoidun substraatin väkevyyden kineettiseksi määrittämiseksi, jolloin lisätään vähintään yhtä spesifistä entsyymiä ja mitataan entsyymireaktion nopeus. Erittäin sopiva tämä menetelmä on veriseerumissa tai veriplasmassa olevien substraattien kvantitatiivisen määrityksen suorittamiseksi. Keksintö koskee edelleen reagensseja menetelmän toteuttamiseksi. Keksinnön merkitys on erikoisesti, kliinisen kemian, biokemian, elintarvike-' kemian ja farmaasian alueilla.
Entsymaattisesti katalysoidut reaktiot ovat erikoisen edullisia analysoitaessa biologisia nesteitä, joilla on monimutkainen koostumus johtuen niiden substraatti-spesifisyydestä reaktion aikana ja johtuen niiden suuresta herkkyydestä. Usein on tarkka substraattimääritys mahdollinen ainoastaan entsymaattista menetelmää käyttäen.
Tavallisesti suoritetaan substraatin väkevyysmääritykset entsymaattisesti katalysoidun reaktion avulla loppuarvomäärityksenä. Loppuarvo-määrityksessämitataan parametri ennen ja jälkeen reaktion ja tästä muodostuu tarvittava eroavaisuus.
2 57782
Poikkeuksen tästä muodostaa virtsahappo.määritys Kageyama-menetelmällä, jossa lisätään kaksi entsyymiä. Kineettisesti mitataan kuitenkin hitaasti tapahtuva ei -entsymaattinen osavaihe niin, että periaatteessa on kysymyksessä täysin toinen menetelmä. Nämä tunnetut menetelmät vaativat huomattavan pitkän ajan, koska mittaukset on suoritettava 6 ja 12 minuutin kuluttua. Tämän lisäksi on tämä nanetelmä monimutkainen,. koska siinä on ylläpidettävä 37°C suuruista korotettu? lämpötilaa.
Olisi edullista voida suorittaa myös tämä määritys entsyymiaktiivisuuden kineettisessä määrityksessä useimmin käytetyssä mittauslämpötilassa 25°C ja voida se suorittaa täten jo käytössä olevien laitteiden avulla.
Erään toisen poikkeuksen muodostaa glukoosimääritys glukoosioksidaasin avulla, joka voidaan suorittaa entsyymikineettisesti tavanomaisilla fotometreillä koska ä.ichaelis-vakioiden arvo reaktiossa on erittäin - ° J uij~ .
loppuarvomäärityksen suhteen on substraattiväkevyyksien kineettisellä määrityksellä, jossa mitataan jonkin parametrin muuttuminen eri aikoina, reaktion kuluessa huomattavia etuja: 1. Tarvittava aika on aina lyhyempi verrattuna vastaavaan loppuarvo-mer.etelmäftn.
2. Näytteen lähtöarvo on tavallisesti sopiva. Tällöin pienenee käsittelyvaiheiden lukumäärä koeliuoksia lisättäessä, tutkittavan aineen kulutus ja reagenssien kulutus sekä sopivassa tapauksessa tietokone-tutkimusten laitteisto- ja linjakäsittelytarve.
3. Substraattimääritys voi tapahtua tavanomaisilla entsyymin aktiivi s uus määritykseen käytetyillä laitteilla. Tällöin on myös mahdollinen tähän asti laitteistoteknisistä syistä vaikeasti toistensa kanssa yhdistettävissä olevien määritysten samanaikainen toteuttaminen.
4. Yksitiemaljojen käyttö, joiden avulla vältetään mittausvirheet fotometrisissä mittaus- ja huuhtelukäsittelyissä, on rajoittamattomasti mahdollinen, koska maljojen erilaisten ominaisekstinktiöiden johdosta ei voi muodostua virheitä.
huolimatta kaikista näistä ilmeisistä eduista eivät entsyymikineetti-set substraattimääritykset ole olleet tähän asti yleisiä ja ainoastaan 3 57782 poikkeustapauksissa mielekkäästi toteutettavissa. Tunnetuilla entsyy-nikineettisillä menetelmillä (’'initial rate", "time-fixed") on vain tutkimuksessa jonkinlainen merkitys. Miille on ominaista se, että käytetään ainoastaan erittäin pieniä substraattiväkevyyksiä ja täten voidaan mitata vain erittäin pieniä substraattireaktioita.
Rajoitus erittäin pieniin substraattiväkevyyksiin koeliuoksessa on välttämätön siksi, että ainoastaan täten aikaansaadaan suora suhde osoitettavan substraatin väkevyyden ja reaktionopeuden välillä, so. lineaarinen vertauskäyrä, joka on tarpeellinen yksinkertaisissa rutiinimäärityksissä.
Entsymaattisesti katalysoitujen reaktioiden nopeuteen nähden pätee nimittäin Michaelis-Menten^-yhtälö: v . vmaks · CS__
CS * KM
(v = reaktionopeus; v = maksiminopeus substraatin kyllästys-alueella; Cg = substraatin väkevyys; = Michaelis-vakio).
Tämän yhtälön avulla voidaan saada suhde reaktionopeuden v ja subs-traattiväkevyyden c„ välillä ainoastaan silloin, kun on hyvin pieni K^,-arvoon nähden. Jäsen Cg nimittäjässä voidaan jättää tällöin huomioonottamatta niin, että tällöin saadaan pseudo-ensikertaluvun mukaisesti tapahtuva kineettinen reaktio. Teoreettisten laskelmien pohjalla voidaan todeta, että Cg saa olla korkeintaan 0,2 jotta analyyttinen virhe kineettisessä määrityksessä olisi siedettävissä rajoissa.
KT, on useimmissa reaktioissa erittäin pieni ja suuruusluokkaa 10 ^ - ‘‘-7 . .
10 moolia/1. Tästä ilmenee, että mittaus tähänastisilla menetelmillä on rajoittunut alunperin erittäin vähäisiin substraattiväkevyyksiin.
Tämä vaikeus on yritetty poistaa siten, että on lisätty entsyymiä, jolla on mahdollisimman korkea K^-arvo. Käytössä oleva valintamahdollisuus on kuitenkin vähäinen ja K^-arvot ovat edullisimmassakin tapauksessa käytännön substraattimäärityksiä varten säännöllisesti liian alhaiset (poikkeuksen muodostaa, kuten edellä mainittiin, glukoosinää-ritys GOD:n avulla).
4 57782
Edellä mainitusta ilmenee, että tunnetuilla entsyymikineettisillä menetelmillä on seuraavat haitat: 1. Ne tarvitsevat erittäin tarkkoja, tarkasti liuottavia ja kalliita mittauslaitteita, koska mittausalue erittäin vähäisiä sub-straattireaktioita käytettäessä on tähänastisten laitteiden, esim. fotometrin, tarkkuusalueen rajoilla.
2. Voidaan todeta ainoastaan näytteiden väkevyysspektrin alaosa ilman esilaimennusta ja esilaimennus aiheuttaa lisävirheitä ja vaatii analyysin toistamisen.
3. Likaosaset ja ilmakuplat voivat huonontaa voimakkaasti mittaustuloksia eikä käytännössä tarvittavaa erittäin puhdasta työskentelytapaa voidaa aina toteuttaa.
Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on mahdollistaa yksinkertainen ja myös tavanomaiseen käytäntöön soveltuva substraattiväkevyyk-sien entsyymikineettinen määritys ja parantaa tähänastisia menetelmiä siten, että niitä voidaan käyttää yleisesti ja suorittaa mittaukset käytäntöön soveltuvien aikojen kuluessa, sekä mahdollistaa suurempi väkevyysalue ilman edeltäkäsin suoritettua lisälaimen-nusta.
Tämä tehtävä ratkaistaan keksinnön mukaisesti menetelmällä substraatin ja erityisesti veriseerumiin tai veriplasmaan liuenneen tai suspentoituneen substraatin pitoisuuden määrittämiseksi lisäämällä yksi tai useampi spesifinen entsyymi ja mittaamalla entsy-maattisen reaktion nopeus, ja jolle on tunnusomaista se, että lisätään ainakin yhtä entsymaattisen substraattireaktion nopeutta määräävän vaiheen mukaan valittua kilpailevaa inhibiittoria substraat-tipitoisuuden Cg ja näennäisten Michaelis-vakioiden K'M välisen suhteen saattamiseksi arvoon 0,2:1 ja reaktio-olosuhteiden säätämiseksi pseudo-ensimmäisen kertaluvun reaktiota vastaaviksi, seos homogenoidaan, määrättyjen ajanjaksojen kuluttua määritetään reaktiolle spesifisen reaktioparametrin muutos ja tästä saadaan tutkittavan substraatin pitoisuus.
Edullisesti saatetaan suhde cs:K'M arvoon alle 0,05:1, erikoisesti alle 0,01:1.
5 57782 "Kilpailevilla inhibiittoreilla" ymmärretään keksinnön puitteissa kahta yhdisteryhmää: a) yhdisteitä, jotka (massalakisäännösten mukaisesti) kilpailevat substraatin kanssa palautuvasti entsyymistä, mutta eivät reagoi tällöin joko ollenkaan tai vain huomattavan hitaasti (kilpailevat inhibiittorit tavanomaisessa mielessä); b) yhdisteitä, jotka sitovat substraatin palautuvasti ja pienentävät täten sen vapaata väkevyyttä (massavaikutuslain mukaisesti), jolloin " substraatti/inhibiittori-kompleksi ei reagoi entsyymin vaikutuksesta.
Sopiviksi kilpaileviksi inhibiittoreiksi valitaan edullisesti sellaisia ^ aineita, joiden rakenne muistuttaa lähtöaineita ja/tai jotain nopeu den määräävän reaktion lopputuotetta, mutta jotka eivät reagoi tässä reaktiossa käytetyn entsyymin kanssa.
Keksinnön mukaisessa menetelmässä tulee mittaus suuremman substraatti-reaktion johdosta tarkemmaksi. Voidaan työskennellä yksinkertaisia laitteita käyttäen. Mittausaika voi olla alueella 0,5*3 minuuttia. Suhteellisuus reaktionopeuden ja substraattiväkevyyden välillä saavutetaan siinä määrin, että aikaansaadaan analyyttisiin tarkoituksiin riittävä tarkkuus.
Tämän menetelmän monipuolisuutta ja soveltuvuutta tunnettuihin menetelmiin verrattuna voidaan parantaa huomattavasti siten, että substraatin ja entsyymin välisen väkevyyden suhdetta kilpailevaan inhibiittoriin nähden säädetään, jotta aikaansaadaan analyyttisiin tarkoituksiin riittävä mittausherkkyys ja myös alhaisempi substraattiväke-vyys ja mittaus voidaan toteuttaa käytännössä edullisen ajanjakson kuluessa.
Tässä yhteydessä on eräs tarkoituksenmukainen toteuttamismypto sellainen, että toiselta puolen parannetaan suhdetta reaktionopeuden ja suuremman substraattiväkevyyden välillä lisäämällä inhibiittoria, ja toiselta puolen kompensoidaan reaktionopeuden aleneminen suurentamalla entsyymin väkevyyttä. Reaktionopeuden kasvu voidaan aikaansaada myös reaktiolämpötilaa korottamalla.
Huolimätta kilpailevan inhibiittorin lisäämisestä vaikuttaa entsyymi-väkevyyden korottaminen edullisesti, koska herkkyys tällöin kasvaa 6 57782 ja saman mittausajan kuluessa tapahtuu reaktio suuremmassa määrässä, mikä toiselta puolen aiheuttaa suhteellisuuden parantumisen reaktionopeuden ja substraattiväkevyyden välillä näytteessä. Ennen kaikkea ei entsyymiväkevyyden kasvamista suhteettoman lyhyen mittausajan kuluessa tarvitse ottaa huomioon, koska reaktionopeutta voidaan säätää joustavasti valitsemalla kilpailevan inhibiittorin väkevyys. Keksinnön mukaisesti aikaansaadaan täten se ratkaiseva etu, että korkeammissa substraattiväkevyyksissä voidaan mittaus suorittaa tavanomaisilla laitteilla kohtuullisia mittausaikoja käyttäen. Erikoisesti on mahdollista, valitsemalla sopivasti näytemäärät, voida mitata entsyymiväkevyys ja inhibiittoriväkevyys näytteessä olevan substraatin yhteisellä vastaavalla väkevyysalueella ilman edeltävää tai jälkeenpäin suoritettua laimennusta.
Asiantuntijalla on täten mahdollisuus käyttää hyväksi tätä kilpailevien inhibiittoreiden vaikutusta entsyymikineettisissä määrityksissä mikä tähän saakka on jäänyt täysin huomioon ottamatta. Tämä vaikutus voidaan jälkeenpäin osoittaa siten, että edellä kuvatun Michaelis-pfenten-yhtälön nimittäjään lisätään lisäjäsen v _ _vmaks ‘ CS__
CS + KM + KM * CI ’ KI
CSI
jolloin KT = - , kun substraatti sitoutuu ja 1 Cs-Cj Cg j
Kj = - , kun entsyymi sitoutuu.
c~.cT ώ I
(c = inhibiittorin väkevyys; CSI= substraatti/,inhibi^ttori'lcomPlelcs^n väkevyys; cs = vapaan substraatin väkevyys; cEi= entsyymi/inhibiittori-kompleksin väkevyys; c£ = vapaan entsyymin \ftkevyys).
Koska termi KM + . Cj . Kj (näennäisiä Michaelis-vakioita KfM) on aina suurempi kuin K^, voidaan suhteellisuus reaktionopeuden v ja substraattiväkevyyden cg välillä saavuttaa määrätyn ajan kuluessa käyttämällä suurempia substraattiväkevyyksiä kuin mikä on mahdollista lisäämättä kilpailevaa inhibiittoria.
Keksinnön mukaisesti määritetään vapaan entsyymin väkevyys ja suhde 5 7782 c ,/c- vast. Cot/c0 siten substraattiväkevyyteen nähden, että riittä- iii i oi o vän suhteellisuuden vallitessa voidaan mittaus suorittaa määrätyn ajan kuluessa riittävällä herkkyydellä. Keksinnön eräs oleellinen etu on se, että herkkyyttä voidaan säätää ei ainoastaan substraatti- ja entsyymi väkevyyden avulla vaan myös kilpailevan inhibiittorin väkevyyden avulla.
Ottaen huomioon nämä näkökohdat säädetään edullisesti pienen substraat-tiväkevyyden varmaan osoittamiseen riittävä herkkyys substraatin cs ja entsyymin c- välisen väkevyyden suhteen avulla kilpailevaan inhj-biittoriin Cj nähden.
Jos mahdollisesti pidemmän aikaa kestävää nolla-arvon (lähtöarvon) muodostumista ei haluta odottaa, voidaan se tarkoituksenmukaisesti korjata ottamalla huomioon nolla-arvo.
Piittaus suoritetaan tarkoituksenmukaisesti välittömästi seoksen homoge-noimisen ja mahdollisesti esiintyvän lämpötilan nousun tasoittumisen jälkeen käyttäen edullisesti määräaikaistekniikkaa (”time-fixed"-tek-niikkaa). Tällöin suoritetaan ensimmäisen kertaluvun reaktioalueen tärkeämmällä osalla kaikki mittaukset samassa analyysisarjassa saman ajanjakson kuluessa määrätyn ajan jälkeen. Edullisesti suoritetaan määrättyjen ajanjaksojen kuluttua mittausarvojen merkitseminen mit-tausajanjakson aikana, tai kineettinen kaksipistemittaus ajanjakson alussa ja lopussa, tai hetkellinen nopeus määrättynä ajankohtana esim. määräämällä mittauskäyrän nousukulma. Ajanjakso voidaan valita vapaasti ensimmäisen kertaluvun reaktiotyypin huomioonottaen, mutta se on kuitenkin valittava samaksi analyysisarjan kaikissa mittauksissa.
Tämän johdosta voidaan valita käytännölliset ja lyhyet mittausajat. Ennen kaikkea on mahdollista käyttää tarkoituksenmukaista, myös lyhyttä mittausaikaa mikäli tämä on tarpeen. On myös mahdollista mitata alkunopeus ("initialrate^-tekniikka).
Määrätyissä olosuhteissa voi olla edullista lisätä yhden inhibiittorin sijasta useampia inhibiittoreita.
On myös mahdollista soveltaa keksinnön mukaista menetelmää useampi-vaiheisiin reaktioihin, jolloin kaikkien osavaiheiden ei tarvitse olla entsymaattisesti katalysoituja. Esim, osoitettava substraatti voidaan saattaa reagoimaan yhdessä nopeuden määrittävässä entsymaatti- 8 57782 sessa vaiheessa* johon liittyy nopea ei-entsymaattinen indikaattori-reaktio. Tässä tapauksessa lisätään ensimmäisen (entsymaattisen) reaktion inhibiittoria. Voidaan menetellä analogisella tavalla jos ιη/Ös; in-dikaattorireaktio katalysoidaan entsymaattisesti. Tällöin esiintyy kuitenkin myös toinen mahdollisuus, jonka mukaisesti ennen varsinaista mittausta ensimmäisen vaiheen annetaan tapahtua kvantitatiivisesti ja sen reaktiotuotteet lohkeavat täten, ja tämän jälkeen seurataan kineettisestä toista vaihetta lisäämällä samalla toisen vaiheen vaatimaa inhibiittoria.
Eräässä erittäin edullisessa toteuttamismuodossa käytetään mittaustavan vaatimaa puskuria. Ottaen huomioon eri tapauksissa mahdolliset osareaktiot valitaan tällöin puskurin pH-arvo siten että se vastaa mahdollisimman hyvin pH-nopeus-tmaksimia ottaen samalla huomioon massojen yhdistetty reaktionopeus, ja siten, ettei entsyymin K^-arvo oleellisesti laske.
Eräs erittäin yllättävä keksinnön mukaisen menetelmän vaikutus on edelleen siinä, että mahdollisesti näytteessä jo olevat inhibiittorit, jotka voivat vääristää analyysituloksia, voidaan tunkea taka-alalle in-hibiittoriväkevyyttä korottamalla. Tällaisilla häirintävaikutuksilla on käytännössä huomattava merkitys koska esimerkiksi useat potilaiden veriseerumissa olevat lääkkeet voivat vaikuttaa estävästi. Myös luonnostaan esiintyvillä yhdisteillä on usein es tovaikutut. . Keksinnön mukainen menetelmä avaa täten mahdollisuuden saada oikeita analyysi-tuloksia myös sellaisissa tapauksissa, joissa esiintyy tuntematonta inhibiittoria tuntemattomassa määrässä.
Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on näin ollen edelleen aikaansaada sellainen edellä mainitun kaltainen menetelmä, jolle on tunnusomaista se, että käytetään määrätyn substraatin sellaista liuosta, jolla on kilpaileva estovaikutus määrityksessä käytettyyn entsyymiin nähden. Tällöin lisätään tarkoituksella lisättyä kilpailevaa inhibiittoria edullisesti määrässä, joka aikaansaa entsyymin 60-95-prosenttisen estymisen. Parhaat tulokset aikaansaadaan tällöin silloin, kun määritettävällä substraattiliuoksella on jo estovaikutus määrityksessä käytettyyn entsyymiin nähden, joka aikaansaa entsyymin aina 50 %:sen estymi-a on.
Keksinnön mukainen menetelmä entsyymikineettisen substraattimäärityksen 9 57782 suorittamiseksi tuntemattomien inhibiittorien läsnäollessa lisäämällä samalla tunnettuja inhibiittoreita tunnetussa määrässä on erittäin yllättävä ja kumoaa asiantuntijoiden käsityksen, ettei kineettinen substraattimääritys tuntemattomien estoaineiden läsnäollessa olisi mahdollinen. Niinpä aikakausijulkaisusta Analytical Chemistry, 31» sivu 980 (1959) on tunnettua, että entsyymikatalysoidun reaktion estävän aktiivisuuden esiintyminen on entsymaattisen substraattimäärityksen vaikein probleema ja ettei tällaista määritystä voida toteuttaa jos läsnä on tuntemattomia ja ei-spesifisiä estoaineita. Erikoisesti viitataan tällöin siihen, ettei itse estoaineita voida myöskään määrittää jos ne ^ sisältävät muita estäviä epäpuhtauksia.
Menetelmän tämän toteuttamismuodon suorittamiseen nähden pätevät edellä " esitetyt seikat samalla tavoin. Tarkoituksenmukaisesti todetaan kuitenkin esikokeella tuntematonta näytettä käytettäessä sisältääkö se jo estävää aktiivisuutta, joka ei kykene estämään entsyymiä enempää kuin 50 55: s es ti. Tämä voidaan toteuttaa yksinkertaisesti lisäämällä tunnettu substraattimäärä ja tunnettu entsyymiaktiivisuus. Jos kineettisesti tai loppuarvomäärityksen avulla·saadaan takaisin vähintään 50 % lisätystä substraatista, voidaan käyttää keksinnön mukaista menetelmää ilman, että on otettava huomioon huomattavasti suurempaa virhettä kuin suoritettaessa mittaus estoainevapaassa liuoksessa. Jos tulos taas on huomattavasti alle 50 %, voidaan keksinnön mukainen menetelmä kuitenkin toteuttaa, mutta tällöin on otettava huomioon jonkin verran suurempi virhemahdollisuus. Viimemainitussa tapauksessa on tarkoituksenmukaista suorittaa tarkoituksella lisätyn inhibiittorin määrän lisäys käyttäen käyttökelpoisen estovyöhykkeen ylärajaa, joka on suunnilleen 95 %· Vieraiden aineiden estovaikutuksen ollessa alle 40 % lisätään edullisesti sellainen kilpailevan inhibiittorin määrä, että aikaansaadaan " välillä 65 ja 85 % oleva entsyymin estyminen.
Keksinnön kohteena on edelleen reagenssi substraattiväkevyyden entsyy-mikineettiseksi määrittämiseksi keksinnön mukaisen menetelmän avulla. Tällainen reagenssi sisältää järjestelmän tämän substraatin entsymaat-tiseksi määrittämiseksi ja sille on tunnusomaista se, että se sisältää määrätyn määrän vähintään yhtä kilpailevaa inhibiittoria mitattavaa entsyymisubstraattireaktiota varten. Periaatteessa ovat sopivia tätä reagenssia varten sellaiset tunnetut järjestelmät entsymaattisen substraattimäärityksen suorittamiseksi loppuarvomenetelmällä, joita pidetään kaupan useissa muodoissa. Keksinnön mukainen reagenssi sisältää 57782 10 tällaisen järjestelmän ohella lisäksi vähintään yhtä kilpailevaa inhibiittoria. Inhibiittori ja entsyymi voivat tällöin esiintyä yhteisen kompleksin muodossa, joka aikaansaa entsyymin lisästabiloitumisen samalla tavoin kuin entsyymin substraattistabiloitumisenkin.
Järjestelmä substraatin entsymaattiseksi mittaamiseksi sisältää yleisesti tälle substraatille spesifisen entsyymin, tälle entsyymille sopivan puskurin sekä mahdollisesti kofaktoreita ja/tai apu-entsyymejä ja/tai stabiloimisaineita.Kofaktoreilla ymmärretään tällöin koentsyymejä, myös koentsyymeinä toimivia metalli-ioneja ja ko-substraatteja.
Keksinnön mukaiset reagenssit ja reagenssiyhdistelmät voivat esiintyä sekä liuosten että myös lyofilisoitujen, jäähdytyskuivattujen seosten muodossa. Erään erittäin edullisen toteuttamismuodon muodostaa lyofi-lisoitujen reagenssien pakkaus yksitiemaljoissa, jotka liuottimen (esim. puskurin) lisäämisen jälkeen ovat heti käyttövalmiita ja voidaan heittää määrityksen jälkeen pois.
Keksinnön tarkemmaksi kuvaamiseksi esitetään seuraavat esimerkit, jotka esittävät yksityiskohtaisesti virtsahappomääritystä ja glukoosimääritystä, Samalla tavoin voidaan määrittää esimerkiksi triglyseridi glyserokinaasi-menetelmällä urea ureaasi/GIDH-menetelmällä, kolesteroli kolesteroli-oksidaa-simeneteImellä ja laktaatti LDH-menetelmällä. Muita entsymaattisia määrityksiä, jotka voidaan suorittaa kineettisesti keksinnön mukaisesti, on esitetty esimerkiksi H.U. Bergneyer'in kirjassa Methoden der enzy-matischen Analyse, Verlag Chemie Weinheim, 197*1.
Esimerkki 1
Fotometrinen virtsahappomääritys kytkemättömän urikaasireaktion mukaisesti .
Tällöin tapahtuu tunnettu reaktio seuraavasti: virtsahappo + 2 H?0 + 0? u-^--a-s-1 > allantoiini + C0? + H?0? EC 1.7.3.3
Mittaussuure on virtsahapon ekstinktio lähellä sen absorptiomaksimia arvossa 293 nm.
Laitteisto
Laitteistona oli "Eppendorf Enzymmesplatz 5086" (fotometri, jossa 11 57782 suodatin Hg 302 nm, laskijalaite 1 P 28 ja spektraalilamppu Hg 15). Käytettiin "Eppendorf"-pipettejä tai koereagenssi-annostelulaitbeita.
Reagensslt 1. Xaliumtiosyanaatti 2. Virtsahappo 3. Litiumkarbonaatti 4. 0,1 moolia/1 boraattipuskuria, pH 9,5 5. Urikaasi, 5 U/ml (valmistettu sian maksasta).
" Työskentelytapa
Estolajin osoittaminen ^ 50/Ul standardiliuosta, joka sisälsi 0,178-0,297-0,476-0,595-0,733- 0,892-1,19 mmoolia/1 virtsahappoa (laimentamalla perusliuos, jossa 5,95 mmoolia/1 virtsahappoa 54 moolissa/1 litiumkarbonaattia kahteen kertaan tislatulla vedellä), inkuboidaan 500^,ul:lla puskuria ilman inhibiittoria, vast. SOO^ulrlla 103 mmoolia/1 kaliumtiosyanaattipusku-ria maljassa (kerrospaksuus 1,00 cm) lämpötilassa 25°C, ja reaktio aloitetaan sekoittamalla 50/Ul 1+10 kahdesti tislatulla vedellä laimennettua urikaasia. Kun on kulunut 20 sekuntia reaktion alkamisesta todetaan seuraavat seikat: paperin syöttö 2 cm/min, leviäminen 20 cm arvossa E=0-1. Kulmamittarilla mitataan kulma a aika-akselin suhteen aina mittauksia aloitettaessa. Saadun tangentti a-arvon käänteisarvo merkitään ordinaataksi vastaavan virtsahappoväkevyyden käänteisarvon funktiona (Lineweaver-Burk-diagramma). Kulloinkin kalium-tiosyanaattilisäyksen avulla tai ilman tätä saadut pisteet sovitetaan tasaussuoralle. Kilpailevan estotyypin esiintyessä on tämän suoran jatkeen leikattava ordinaatta samassa pisteessä.
Koeolosuhteiden optimointi 50/Ul standardiliuosta inkuboidaan 500^ul:n kanssa 825 mmoolia/1 ka-liumtiosyanaattia puskurissa lämpötilassa 25°C, reaktio aloitetaan lisäämällä 50/Ul laimentamatonta urikaasia ja sekoittaminen suoritetaan edellä esitetyllä tavalla. Näennäisten Michaelis-vakioiden saamiseksi merkitään tangentti a:n käänteisarvot ordinaatalle ja substraattiväkevyyksien molaarisuuksien käänteisarvot koe-erässä abskissalle. Michaelis-vakioiden näennäisarvo saadaan alenevien suorien abskissan leikkauspisteiden negatiivisina käänteisarvoina (annetaan sopiva pieni arvo tekijälle 1/Cg ja tämän jälkeen suoritetaan arvon graafinen määrityn ) . Näennäisten Michaelis-vakioiden K'^- 57782 12 arvo on tärkeä kokeeseen lisättävän virtsahapon maksimiväkevyyden määrittämiseksi,jonka mahdollisuuksien mukaan tulee olla pienemmän kuin 0,05 K’^.
Tulokset ja niiden arvostelu Käytettäessä kirjallisuudesta saatua arvoa 17/Umoolia/l virtsahappoa sianmaksasta saadun urikaasin Michaelis-arvojen määrittämiseksi (T.O. Tiffany ym. Anal. Chem j£5, 1716-25 (1973)), saadaan lisättävä maksimi väkevyys 0,85/Umoolia/l virtsahappoa pidettäessä suhdetta c^/K^ = 0,05 perusteena alkunopeuden määrityksessä. Lähdettäessä koetilavuu-desta 600/Ul on lisättävä seerumimäärä rajoitettava arvoon 0,85/Ul jotta voitaisiin mitata aina pitoisuuteen 0,6/Umoolia/l virtsahappoa saakka seerumissa ilman edeltävästä suoritettua lisälaimennusta. Katsomatta siihen, että seerumi on esilaimennettava, koska niin pientä tilavuutta kuin 0,85/Ul ei voida suoraan annostella tarkasti, saavutetaan näissä olosuhteissa loppuarvomenetelmää käytettäessä ihmis-seerumin alemmilla normaalirajoilla (0,12/Umoolia/l virtsahappoa) ainoastaan 0,002 suuruinen ekstinktio laskettuna virtsahapon ekstink-tiokertoinaesta 12,6 cm^/^umoolia arvossa 293 nm (Boehringer Mannheim GmbH, koehakemisto, 3. painos, 1969, osa virtsahappo). Menetelmä on liian herkkä kineettistä määritystä varten.
Käyttämällä bakteeri-urikaasia voidaan lähtöväkevyys kuitenkin nostaa noin 6-kertaiseksi. Vastaava herkkyys saadaan kuitenkin vain silloin, jos ensimmäinen mittauspiste otetaan jo 4 sekuntia reaktion alkamisen jälkeen ja valitaan aikajaksotukseksi — 1,5 min. (katso Tiffany edellä). Kaliumtiosyanaattia käytettäessä todettiin sopiva kilpaileva inhibiittori (sama ordinaatan leikkauspiste suoritettaessa piirtäminen Lineweaver-Burk* in mukaisesti samaa entsyymiaktiivisuutta käytettäessä), joka aikaansai koeliuoksen väkevyysarvossa 687 mmoolia/1 näennäisen Michaelis-vakion arvoksi 1 mmooli/1. Tästä voidaan laskea laimentamattoman näytteen lisäykseksi 50^ul, ja koe-tilavuuden ollessa 600^ul Cg/Kjyj-arvoksi 0,05 väkevyyden ollessa 0,6 mmoolia/1 virtsahappoa näytteessä niin, että mitä tulee herkkyyteen ja vertailukäyrän lineaarisuuteen näyttävät edellytykset esiintyvän yksinkertaisen rutiinimenetelmän toteuttamista varten.
Näitä laskelmia vastaavasti todettiin kun kulman mittaus suoritettiin 20 sekunnin kuluttua, ja suoritettaessa mittaus tangentin ja väkevyyden välillä aina arvoon 0,6 mmoolia/1 virtsahappoa vedessä saakka, 13 57782 virheeksi -3 % suurinta pitoisuutta käytettäessä, mikä virhe on siedettävissä raj oissa ottaen huomioon yleiset seerumianalyysiolosuh-teet. Kulma oli alemmalla normaaliarvoalueella näissä olosuhteissa eli noin 8° niin, että menetelmän herkkyys riittää myös alhaisia substraattiväkevyyksiä käytettäessä.
Vesipitoisia virtsahappoliuoksia käytettäessä todetut olosuhteet voidaan täten säilyttää myös seerumianalyysissä. Kuitenkin on urikaa-sia lisättäessä määrättävä nolla-arvo, joka riippuu seerumissa vaih-televissa määrissä esiintyvän askorbiinihapon hapettumisesta.
Korottamalla inhibiittoriväkevyyttä voidaan lineaarinen mittausaine laskea ja korottaa suurempien virtsahappoväkevyyksien määritystark-^ kuutta, jolloin samanaikaisesti voidaan parantaa herkkyyttä siirty mällä mittausaaltopituudelle 293 nm ja/tai korottamalla edelleen entsyymiaktiivisuutta ja/tai lämpötilaa korottamalla.
Esimerkki 2
Glukoosin fotometrinen määrittäminen glukoosi-dehydrogenaasimenetelmän avulla Tällöin tapahtuvat seuraavat tunnetut reaktiot: mutarotaasi .
o -glukoosi ^ — ·::--:;,=£ί β -glukoosi (EC 5.1.3.3) B -D-glukoosi+NAlP g^uicoos^~^ehydrogenaasi^giukoni^appo^NADH+^ (EC 1.1.1.47)
Laitteisto ^ Eppendorf-entsyymilaitteisto 5086 (kineettiset määritykset), Eppendorf- substraattimittauslaitteisto 5091 (loppuarvomääritykset ), Eppendorf-pipetit vast. Eppendorf-koereagenssi-annostelulaitteet (mikrolitra-alueella), vaaitetut pipetit (millilitra-alueella). Laboratorio-pH-mittari, jota toimittaa toiminimi Knick, laskulaite Combitron S, jota toimittaa toiminimi Diehl keskiohjelma, vakiopoikkeamat ja vaihtelu-kertoimet, sekä e· rikoi s ohjelma (Archiv-Nr. 103^*0 lineaarista regressiota, korrelaatiokertoimia ja regressiosuorien hajottamista varten.
Reagenssit 1. Kaliumtiosyanaatti 57782 14 2. Kaliumkloridi 3. Etyleenidinitrilotetraetikkahapon dinatriumsuola 4. D(+)-glukoosi, vedetön, puhdistettu 5· Vesipitoinen glukoosi-vakioliuos 6. Nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidi, vapaa happo (130 mg/ml ^0) 7- "Blutzucker, GlucDH-Methode" (näytepakkaus "Mercotest")-
Liuokset 1. Puskuri: 120 mmoolia/1 fosfaattipuskuria, pH 7,6 2. Puskuri-entsyymi-seos: glukoosi-dehydrogenaasin ja mutarotaa- sin liuos puskurissa, valmistettu näytepakkauksessa olevien ohjeiden mukaisesti.
3· Stabiloitu puskuri-entsyymi-inhibiittori-seos: liuos, jossa 825 mmoolia kaliumtiosyanaattia j:a 55 mmcolia etyleenidinitrilo-tetraetikkahapon dinatriumsuoläa 1 litrassa puskuri-entsyymi-seos-ta. pH-arvo 6,6:;
Työskentelytapa 1. Glukoosi-dehydrogenaasi-aktiivisuuden toteaminen: 20/Ul 1 + 10 puskurilla laimennettua puskuri-entsyymiseosta inkuboi-tiin 500^ul:n kanssa 280 mmoolia glukoosi/1 puskuria (korkeammissa glukoosiväkevyyksissä substraattiestyminen) lämpötilassa 25°C ja seurattiin ekstinktiolisäyksen nopeutta 3 min sen jälkeen kun oli lisätty 20/Ul 150 mmoolia/1 NAlP.
Tulosten laskenta (e = mooliekstinktio NADH, d = kerroksen paksuus, EV = koetilavuus, PV = näytteen tilavuus, F = laimennuskerroin): U/ml = A0·3 — F = 0,205 -^— 11 = 18,5 min ε · d PV 3,3 105 1,00 20 2. Estolaji : lOOyUl standardiliuosta, joka sisälsi 27,8-33,3-58,8-44,4-50,0-55,5 mmoolia glukoosia/1, inkuboitiin maljassa 500^ul:n kanssa seuraavia liuoksia lämpötilassa 25°C: (a) puskuri-entsyymiseos, 1 + 40 puskurilla laimennettu, (b) 410 mmoolia/1 kaliumtiosyanaattia laimeassa puskuri-entsyymi-seoksessa, (c) 620 mmoolia/1 kaliumtiosyanaattia laimennetussa puskuri-entsyymi-seoksessa. (Tiosyanaattipitoiset liuokset lisättiin kulloinkin tuoreina). Sekoittamalla 20 ,ul 200 fö . . . . . ' mmoolia/1 NAD pantiin reaktio käyntiin ja 10 sekuntia tämän jälkeen voitiin todeta seuraavat arvot: paperin siirtyminen 5 cm/min, leviä- 57782 15 minen 20 cm arvossa E=0-1.
Kulman α toteamiseksi aika-akselin suhteen mitattiin käytännöllisesti katsoen lineaarinen automaattisen piirtolaitteen alkualue, estotyy-oin määrittämiseksi merkittiin ordinaatalle tangentin a käänteisarvot (käytännön tarkoituksessa Identtiset alkunopeuden kanssa) ja abskissalle kokeeseen lisättyjen millimolaaristen glukoosiväkevyyksien arvot (Line-weaver-Burk-kaavio).
^ Sen kysymyksen selvittämiseksi johtuuko estyminen tiosyanaatin muo dostumisesta, korvattiin kaliumtiosyanaatti ekvimolaarisella määrällä kaliumkloridia.
3. Väkevyysmääritykset
Kokeen yleinen kulku: 20^ul näyte inkuboitiin 500^ul:n kanssa stabiloitua puskuri-entsyymi^inhibiittori-seosta maljassa lämpötilassa 25°C ja reaktio pantiin käyntiin lisäämällä 20/Ul NAD® (150 mg/ml HjO). 20 sekuntia reaktion alkamisen jälkeen todettiin paperin siirtymisen olevan 5 cm/min arvossa Hg 366 nm ja kerroksen paksuuden ollessa 1,00 cm, ja kulma a merkittiin kulloinkin 20 sekunnin kuluttua reaktion alkamisen jälkeen.
Standardin laskeminen käytettäessä 5>55 mmoolia glukoosia/1: S°> näyte 'tan'“näyte tan<>st!ndardi
Ihmisestä saadun plasman analyysi: näytteenä lisättiin sellaista ihmisestä saatua plasmaa, joka oli saatu sentrifugoimalla fluoridi-EDTA-bent-soehapolla stabiloidusta valtimoverestä.
Rinnakkaisanalyysit suoritettiin käyttäen heksokinaasi-loppuarvomene-telmää ja poistaen munanvalkuainen menetelmällä Eppendorf-Vorschrift AV 707 - T. Toisin kuin tässä ohjeessa käytettiin standardia lasku-perusteena .
Koetulosten tarkastelu
Kaliumtiosyanaatti kilpailevana inhibiittorina
Kuvio 1 osoittaa Lineweaver-Burk-kaaviota (ordinaattarekstinktio-aika-käyrän käänteisnousu 10 sekuntia reaktion alkamisen jälkeen; abskissa: kokeessa käytetyn millimolaarisen glukoosiväkevyyden käänteisarvo). Ilman inhibiittorilisäystä (a), lisättäessä 330 mmoolia ie 57782 KSCN/l koeliuosta (b), sekä lisättäessä 500 mmoolia KSCN/1 koe-liuosta (c) saadut suorat leikkaavat ordinaatan käytännöllisesti katsoen samassa pisteessä, kun taas abskissan leikkauskohta inhibiittori väkevyyden kasvaessa lähenee alkupistettä mikä on tyypillinen kilpailevalle estotyypille.
Mittausalue ja herkkyys
Kuvioissa 2 a ja b on esitetty vertauskäyrät, jotka saadaan kun näennäiset Michaelis-vakiot säädetään käyttämällä inhibiittorili-säystä 50 mmoolia glukoosia/1: ensiksi ekstinktio-aika-käyrän nousun toteamiseksi 20 sekuntia reaktion alkamisen jälkeen, toiseksi käyttäen vakio-aika-jaksoa 60 vast. 300 sekuntia, ja kummallakin kerralla uudelleen 20 sekuntia reaktion alkamisen jälkeen (paperin liike 10 cm/min, mitattu aaltopituus Hg 366 nm).
Menetelmän toteuttamiseksi käytännössä ovat seuraavat seikat tärkeitä: 1) Jos hyväksytään 3 ί:η virhe, joka on huomattavasti normaaliarvojen yläpuolella (noin 5 mmoolia/1 näytettä), on laimennusraja kulmaa määrättäessä ja vastaavasti alhaisempi "time fixed^-ajanjakso, arvossa 50 mmoolia/1, ja täten tämä on vieläpä edullisempi kuin erilaisia nykyisiä loppuarvomenetelmiä käytettäessä.
Kysymyksen ollessa 30 sekunnin väliajoista riittää vertailukäyrän lineaarisuus aina arvoon 20 mmoolia/1. Säilyttäen olosuhteet voidaan mennä kuitenkin ainoastaan hieman yli tämän arvon, koska 2) ekstinktioeroavaisuus tavanomaisten fotometrien mittausalueella on liian suuri, varsinkin jos mekaanisessa mittauksessa on otettava huomioon näytteiden itse-ekstinktio. Muuttelemalla koeolosuhteita (esim. suurempi inhibiittoriväkevyys, pienempi näytemäärä) voidaan herkkyyttä kuitenkin alentaa ja samanaikaisesti laajentaa käytettävissä olevaa väkevyysaluetta.
Kysymyksen ollessa kulmamittauksesta käyttäen 60 sekunnin väliaiko-ja on herkkyyttä säädettävä esim. mittaamalla lähempänä NADH-absorp-tiomaksimia ja/tai pienentämällä paperinsyöttönopeutta. Menetelmän herkkyysreservit ovat niin suuret, että käytettävää väkevyysaluetta rajoittavat myös lyhyttä mittausaikaa käytettäessä ainoastaan foto-metrin mittausalue ja rutiininomaisen kulmamittauslaitteen toteamis- 17 57782 rajat. Entsyymiväkevyyden nostaminen yli reagenssin valmistajan esittämien arvojen ei tämän johdosta ole tarpeellista.
Luotettavuus ja tarkkuus
Menetelmän luotettavuutta kokeiltiin toteamisarvojen yhteydessä käyttäen vertausmittauksia heksokinaasi-loppuarvomenetelmällä ja vertai-lusarjojen avulla.
Uudelleenmittausarvot (taulukko 1) voidaan merkitä erittäin tarkasti. Vertailumittausta varten käyttäen kinaasi-loppuarvomenetelmää lisät-tiin plasmaa, koska glukoosi-dehydrogenaasi-reaktio estyy vielä tuntemattomasta syystä mikäli suurempia määriä verisoluja joutuu koe-erään. (Esikokeet osoittivat kuitenkin, että kineettinen määritys "" muunnetuissa olosuhteissa voidaan suorittaa myös tällöin valkuais aineen poistamisen jälkeen niin, että täysveri-analyysi on myös mahdollinen). Suora plasman (vast, seerumin) käyttö aikaansaa mittauksen nopeamman toteuttamisen sekä yleensä samanaikaisen kineettisen määrityksen muiden substraattien vast, entsyymien suhteen.
Taulukko 1
Vertailuarvot määritettäessä glukoosi qualtrolissa.
Väkevyysarvot ovat yksikössä mmoolia glukoosia/1 näytettä.
Mitattu Todettu Väkevyys lähtöarvon Vertailu- väkevyys väkevyys poistamisen jälkeen arvo 31.4 37,7 31,8 101,5 % 15,7 22,0 15,9 101,0 % 12.5 18,5 12,6 100,5 % 8,99 15,1 9,21 102,0 % 5,24 11,2 5,27 100,5 %
Tuloksista, jotka on saatu käyttäen 60 ihmisplasman näytettä (väke-vyysalue noin 4-16 mmoolia/1 plasmaa, vert. kuvio 3, joka osoittaa suhteen glukoosimäärityksessä suoran kineettisen määrittämisen ja epäsuoran heksokinaatti-loppuarvomenetelmän mukaisesti), saatiin ver-tailusuoraksi y = 0,1255 + 0,9272 x sekä huomattavasti nollasta eroavat vertailukertoimet r = + 0,9965 ja vertailuasteen hajoamiseksi = 0,2085. Näiden arvojen mukaisesti on kummankin menetelmän välillä läheinen yhteys. Kineettisestä määrityksestä saadut tulokset ovat kuitenkin käytännöllisesti katsoen väkevyydentä riippumatta keskimäärin 7 % alhaisemmat kuin samojen arvojen perusteella laske- 18 57782 tut loppuarvomenetelmän väkevyysarvot. Tämä ero vastaa .valkuaisaineen poistossa aiheutettua tilavuuden pienengmisvaikutusta.
Mielenkiintoinen on vertailu tavanomaisen täysverianalyysin vastaavien arvojen kanssa, joka analyysi suoritettiin heksokinaasi-loppu-arvomenetelmällä käyttäen valkuaisaineen poistamista. Tällöin oli laskussa käytetty kerroin 2,5 % vesipitoisille glukoosi-liuoksille "teoreettisesti" saadun arvon alapuolella. Kineettiseen analyysiin verrattuna saatiin keskimäärin 14 % pienempi arvo ja plasma-analyysin suhteen heksokinaasi-loppuarvomenetelmää käyttäen vieläpä noin 20 % pienempi arvo.
Viidestä vertailusarjasta kineettisellä menetelmällä saadut glukoosi-väkevyydet olivat käytettäessä "Precinorm S" aina jonkin verran korkeammat kuin esitetyt vertailuarvot (taulukko 2). Hyland-vertailu-seerumin avulla saadut tulokset voidaan ehkä selittää alhaisten lähtöarvojen avulla mikä on tyypillistä glukoosi-oksidaasimenetelmässä.
Taulukko 2
Vertailuseerumianalyysi. Väkevyysarvot ja vakiopoik-keamat on esitetty yksikössä mmoolia glukoosia/1.
Seerumi selvitetty todettu
x x _+ 2 s n x s VK
"Hyiand"-vertailu- 11,41) 10,5 - 12,2 12 12,44 0,25 2,0 "Monitrol1!!" H>62) 10>7 “ 12>5 12 U'89 °’32 2>7 "Precinorm S" 5,95 5*35- .6,55 12 5*86 0,13 2,2 "Pathotrol" 13,92) 13*2 - 14,6 12 14,67 0,29 2,0 "Labtrol" 5,152) 4,80- 5,50 12 5,37 0,16 3,0 1) Glukoosi-oksidaasi (Hyland) 2) HK/GöP-DH-loppuarvomenetelmä käyttäen valkuaisaineen poistamista (Boehringer)
Taulukossa 2 on esitetty myös vertailusarjaile todettu tarkkuus tässä sarjassa, joka kokemustemme mukaan on vertailtavissa myös käsin suoritetun heksokinaasi-loppuarvomenetelmän kanssa.
Tarkkuus päivästä toiseen siirryttäessä on esitetty suhteena Precinorm S: VK = 3,4 %.
Esimerkki 3
Keksinnön mukaisesti saavutettavissa oleva vieraiden inhibiittoreiden 19 57782 häiritsevän vaikutuksen eliminoiminen ilmenee alla olevasta kahdesta taulukosta käytettäessä kahta erillistä entsyymiä ja kulloinkin kahden erilaisen inhibiittorin avulla saatuja mittausarvoja.
Taulukko 3
Kineettinen glukoosimääritys GlucDHrn avulla KSCN Ploretiinia 0-esto- mmoolia ^umoolia % 310 - 78 1,1* 20 310 1,4 81 38.5 - 17 ^ 14 76 38.5 14 78
Taulukko 4
Kineettinen virtsahappomääritys urikaasin avulla KSCN Ksantiinia 0-esto- mmoolia ^umoolia % 500 - 82 20 34 500 20 82 10 - 17 80 76 10 80 72 40 - 41 40 60 40 40 62
Taulukot 3 ja 4 osoittavat, että kulloinkin määrässä, joka aikaansaa vähintään 60 %:n estymisen, kumoaa käytetty inhibiittori täysin sen toisen inhibiittorin vaikutuksen, jota esiintyy vähemmän kuin 50 %:n estämisen aikaansaavassa määrässä, ja kysymykseen tulee ainoastaan voimakkaamman inhibiittorin aikaansaama estovaikutus.
Ksimerkki 4
Kineettinen glukoosi määritys glukoosi-dehydrogenaasin avulla. Käytettiin seuraavaa koe-erää: 20 57782
0,12 moolia fosfaattipuskuria, pH 7,6 40 mmoolia sulfosalisyylihappoa 55 moolia EDTA 150 mmoolia NAD
0,86 mmoolia - 2,59 mmoolia glukoosia 1,8 U glukoosi-dehydrogenaasia 0,31 moolia.KSCN, vast.
1,4 nmoolia floretiinia
Mitatut arvot on esitetty taulukossa 5·
Taulukko 5
Ilman 1,4 nmoolia
Glukoosia, inhibiittoria, 0,31 moolia KSCN floretiinia mmoolia ΔΕ/min esto-? ΔΕ/min esto-# ΔΕ/min esto-36 Γ S_7 2.59 75,4 - 17 77,5 62,5 17,1 1.72 54,0 - 10,5 80,6 45,5 15,8 1.29 40,6 - 8,0 80,3 30,0 26,0 0,86 31,1 - 4,5 85,5 24,0 22,8 0,31 moolia KSCN + 1,4 nmoolia floretiinia ΔΕ/min esto-% 2.59 16,0 78,8 1.72 10,5 80,6 1.29 7,0 82,7 0,86 5,0 83,9
Esimerkki 5
Kineettinen glukoosimääritys glukoosi-dehydrogenaasin avulla.
Käytettiin seuraavaa koe-erää: 90 mmoolia fosfaattipuskuria, pH = 7,6 40 mmoolia sulfosalisyylihappoa
55 mmoolia EDTA
4,65 mmoolia NAD
0,86-3,45 mmoolia glukoosia 95 mU glukoosi-dehydrogenaasia
38,5 mmoolia KSCN
14 nmoolia floretiinia
Koetulokset on esitetty taulukossa 6.
21 57782
Taulukko 6
Ilman 14 nmoolia
Glukoosia, inhibiittoria 38,5 mmoolia KSCN floretiinia mmoolia ΔΕ/min esto-$ ΔΕ/min esto-$ ΔΕ/min esto-# /"s_7 3.45 108,3 - 90 17 26,7 75 2.59 78,7 - 72,3 8 20,3 76 1.72 63,3 - 49,7 21,69 14,0 78 1.29 49,7 - 40,3 18,8 11,3 77 0,86 33,7 - 28,0 17 8,7 74 14 nmoolia floretiinia + 38,5 mmoolia KSCN ΔΕ/min esto-# 3.45 27,7 75,5 2.59 19,7 75 1.72 15,7 75 1.29 10,7 78,5 0,86 5,7 83
Esimerkki 6 Urikaasin estäminen.
Käytettiin seuraavaa koe-erää: 96 mmoolia boraattipuskuria, pH 9,5 114-7,6/umoolia virtsa-happoa 29 mU urikaasia/ml
0,5 moolia KSCN
0,02 mmoolia ksantiinia
Koetulokset on esitetty taulukossa 7·
Taulukko 7
Ilman 0,5 moolia 0,02 mmoolia inhibiittoria KSCN ksantiinia
Urikaasia ΔΕ/min esto-# ΔΕ/min esto-# ΔΕ/min esto-# -τ'· /"S_7 114/Umoolia 1?1 - 46 73 127 26 38/umoolia 87 - 16,3 81 66 25 7,6/Umoolia 23 - 3,3 86 14 49 0,5 moolia KSCN + 0,02 mmoolia ksantiinia ΔΕ/min esto-% 114/Umoolia 44,5 74 38^umoolia 15,0 83 7,6/umoolia 3,0 87

Claims (16)

  1. 22 5 7 7 8 2
  2. 1. Menetelmä substraatin ja erityisesti veriseerumiin tai veriplasmaan liuenneen tai suspendoituneen substraatin pitoisuuden määrittämiseksi lisäämällä yksi tai useampi spesifinen entsyymi ja mittaamalla entsymaattisen reaktion nopeus, tunnettu siitä, että lisätään ainakin yhtä entsymaattisen substraattireaktion nopeutta määräävän vaiheen mukaan valittua kilpailevaa inhibiittoria substraattipitoisuuden Cg ja näennäisten Michaelis-vakioiden K'M välisen suhteen saattamiseksi arvoon Us 0,2:1 ja reaktio-olosuhteiden säätämiseksi pseudo-ensimmäisen kertaluvun reaktiota vastaaviksi, seos homogenoidaan, määrättyjen ajanjaksojen kuluttua määritetään reaktiolle spesifisen reaktioparametrin muutos ja tästä saadaan tutkittavan substraatin pitoisuus.
  3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että substraattipitoisuuden Cg suhde näennäisiin Michaelis-vakioihin on korkeintaan 0,05:1, edullisesti korkeintaan 0,01:1.
  4. 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että kilpailevina inhibiittoreina käytetään sellaisia aineita, jotka sitovat entsyymin ja/tai substraatin palautuvasti ilman kemiallista reaktiota.
  5. 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kilpailevina inhibiittoreina käytetään sellaisia aineita, jotka ovat kemiallisesti samankaltaisia kuin lähtöaineen ja/tai mittausreaktion lopputuotteet.
  6. 5. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että substraatin, entsyymin ja kilpailevan inhibiittorin pitoisuuksien suhteen avulla säädetään analyyttisiin tarkoituksiin sopiva herkkyys.
  7. 6. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mittaustarkkuutta suurennetaan korottamalla entsyymipitoisuutta ja/tai nostamalla reaktiolämpötilaa. 1 2 3 Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, 2 tunnettu siitä, että mittaus suoritetaan välittömästi seok 3 sen homogenoimisen, mahdollisesti esiintyvän lämpötilan nousun ja/ ” 57782 tai mahdollisesti esiintyvän nolla-arvon tasoittumisen jälkeen.
  8. 8. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mahdollisesti pidemmän aikaa kestävä nolla-arvon tasoittuminen korjataan ottamalla nolla-arvo huomioon.
  9. 9- Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että käytetään mitattavan erän suhteen sopivaa puskuria, jonka pH-arvo oleellisesti vastaa tämän erän kokonais-reaktionopeuden pH-maksimia.
  10. 10. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pseudo-ensimmäisen kertaluvun reaktio- "" alueella käytetään analyysisarjassa samoja ajanjaksoja määrätyn valitun ajan kuluttua reaktion alkamisesta ("time-fixed"-tekniikka).
  11. 11. Jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritetään alkunopeus ("initial-rate"-tekniikka).
  12. 12. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään määritettävän substraatin liuosta, jossa jo on kilpaileva estovaikutus.
  13. 13· Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kilpailevaa inhibiittoria lisätään sellainen määrä, joka aikaansaa entsyymin 60-95~$:isen estymisen.
  14. 14. Patenttivaatimuksen 12 tai 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään substraattiliuosta, joka aikaansaa entsyymin 50~^:isen estymisen. 1 Reagenssi patenttivaatimuksen 1 mukaisen substraatin pitoisuuden entsyymikineettisen määritysmenetelmän suorittamiseksi, erityisesti veriseerumiin tai veriplasmaan liuenneen tai suspendoitu-neen substraatin määrittämiseksi lisäämällä yksi tai useampi spesifinen entsyymi ja mittaamalla entsymaattisen reaktion nopeus, tunnettu siitä, että reagenssi koostuu järjestelmästä substraatin entsymaattiseksi määrittämiseksi, joka sisältää yhtä tai useampaa spesifistä entsyymiä ja sellaisesta määrästä ainakin yhtä ent- 57782 24 symaattisen substraattireaktion nopeutta määräävän vaiheen mukaan valittu kilpailevaa inhibiittoria, että substraattipitoisuu-den Cg suhde näennäiseen Michaelis-vakioon K'M saatetaan arvoon — 0,2:1 ja että saavutetaan olosuhteet pseudo-ensimmäisen kertaluvun reaktion syntymiselle.
  15. 16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että entsyymi ja inhibiittori esiintyvät toisiinsa nähden kompleksimuodossa.
  16. 17. Patenttivaatimuksen 15 tai 16 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että järjestelmä substraatin entsymaattiseksi mittaamiseksi sisältää tälle substraatille spesifisen entsyymin, tälle entsyymille sopivan puskurin ja mahdollisesti kofaktorei- ta ja/tai apuentsyymejä ja/tai stabiloimisaineita.
FI2876/74A 1973-10-04 1974-10-02 Foerfarande och reagens foer enzymkinetisk koncentrationsbestaemning hos ett substrat FI57782C (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19732349819 DE2349819A1 (de) 1973-10-04 1973-10-04 Verfahren zur enzymkinetischen konzentrationsbestimmung eines substrats
DE2349819 1973-10-04
DE19742440011 DE2440011C2 (de) 1974-08-21 Verfahren und Reagenz zur enzymkinetischen Konzentrationsbestimmung eines Substrates
DE2440011 1974-08-21

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI287674A7 FI287674A7 (fi) 1975-04-05
FI57782B FI57782B (fi) 1980-06-30
FI57782C true FI57782C (fi) 1980-10-10

Family

ID=25765898

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI2876/74A FI57782C (fi) 1973-10-04 1974-10-02 Foerfarande och reagens foer enzymkinetisk koncentrationsbestaemning hos ett substrat

Country Status (14)

Country Link
US (1) US3977944A (fi)
JP (1) JPS5724119B2 (fi)
BE (1) BE820736A (fi)
CA (1) CA1031676A (fi)
CH (1) CH614534A5 (fi)
DD (1) DD113813A5 (fi)
DE (1) DE2349819A1 (fi)
FI (1) FI57782C (fi)
FR (1) FR2257905B1 (fi)
GB (1) GB1486474A (fi)
HU (1) HU172778B (fi)
IT (1) IT1030641B (fi)
NL (1) NL181936C (fi)
SE (1) SE414409B (fi)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2558536B2 (de) * 1975-12-24 1979-07-12 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur kinetischen Substratbestimmung und Reagens zu seiner Durchführung
US4162194A (en) * 1976-02-13 1979-07-24 Beckman Instruments, Inc. Kinetic assay for acid phosphotase and composition therefore
US4218535A (en) 1976-03-16 1980-08-19 Beckman Instruments, Inc. Determination of enzyme substrate concentration
US4159923A (en) * 1977-01-11 1979-07-03 Beckman Instruments, Inc. Kinetic assay for inorganic phosphates and composition therefore
US4120755A (en) * 1977-04-28 1978-10-17 Beckman Instruments, Inc. Kinetic method for determination of glucose concentrations with glucose dehydrogenase
FR2418462A1 (fr) * 1978-02-22 1979-09-21 Anvar Procede de dosage de substrats intervenant dans des reactions enzymatiques
IT1099355B (it) * 1978-10-12 1985-09-18 Sclavo Inst Sieroterapeut Composizione adatta alla determinazione in cinetica del glucosio
US4322496A (en) 1980-04-17 1982-03-30 Eastman Kodak Company Inhibition of lactate oxidase
US4318985A (en) * 1981-01-29 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Method and device for detecting glucose concentration
IE820943L (en) * 1982-04-21 1983-10-21 Bartos Patent Dev Holding Serological investigations by complement fixation test
JPS59159796A (ja) * 1983-03-02 1984-09-10 Oriental Yeast Co Ltd 酵素活性の測定方法
DE3340709A1 (de) * 1983-11-10 1985-05-23 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Kompetitiver inhibitor fuer gk
HU9201058D0 (en) * 1987-04-10 1992-06-29 Boehringer Mannheim Gmbh Method for determination of ions in solutions at presence disturbing ions by means of masking
FI81120C (fi) * 1988-09-26 1990-09-10 Kone Oy Foerfarande foer bestaemning av glukos ur biologiska vaetska samt reagensblandning foer tillaempning av foerfarandet.
SE466158B (sv) * 1989-04-25 1992-01-07 Migrata Uk Ltd Analysmetod foer glukosbestaemning i helblod
US5429930A (en) * 1989-07-21 1995-07-04 Bio-Research Products, Inc. Kinetic enzyme assay for determining the CO2 content of body fluids using PEP carboxylase with inhibitor
US20030068655A1 (en) * 2001-09-12 2003-04-10 Protiveris, Inc. Microcantilever apparatus and methods for detection of enzymes
SE523240C2 (sv) * 2001-12-12 2004-04-06 Akzo Nobel Nv Användning av hydroxyetylsubstituerad amin som korrosionsinhibitor i saltvattenhaltig miljö i oljefältsapplikationer
US7555933B2 (en) * 2006-08-01 2009-07-07 Thermo Fisher Scientific Inc. Method and software for detecting vacuum concentrator ends-of-runs
DE102016121553A1 (de) * 2016-11-10 2018-05-17 Technische Universität Darmstadt Kompetitiver Test eines Enzymsubstrates mit interner Kompensation der Enzymaktivität
CN114577745A (zh) * 2022-02-28 2022-06-03 深圳市乐土生物医药有限公司 一种检测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2活性的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3627645A (en) * 1969-07-31 1971-12-14 Arequipa Foundation Method and reagents for the determination of nicotine adenine dinucleotide phosphate and of glutathione

Also Published As

Publication number Publication date
FI57782B (fi) 1980-06-30
NL181936C (nl) 1987-12-01
SE7412391L (fi) 1975-04-07
NL7413057A (nl) 1975-04-08
FR2257905A1 (fi) 1975-08-08
GB1486474A (en) 1977-09-21
FR2257905B1 (fi) 1979-09-28
NL181936B (nl) 1987-07-01
DE2349819A1 (de) 1975-04-17
BE820736A (fr) 1975-04-04
AU7397574A (en) 1976-04-08
DD113813A5 (fi) 1975-06-20
FI287674A7 (fi) 1975-04-05
SE414409B (sv) 1980-07-28
US3977944A (en) 1976-08-31
JPS5084298A (fi) 1975-07-08
DE2440011B1 (de) 1975-10-23
IT1030641B (it) 1979-04-10
HU172778B (hu) 1978-12-28
DE2440011A1 (fi) 1975-10-23
JPS5724119B2 (fi) 1982-05-22
CH614534A5 (fi) 1979-11-30
CA1031676A (en) 1978-05-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI57782C (fi) Foerfarande och reagens foer enzymkinetisk koncentrationsbestaemning hos ett substrat
FI70727B (fi) Foerfarande och reagens foer enzymatisk bestaemning av enzymsubstrat
Matsubara et al. Spectrophotometric determination of hydrogen peroxide with titanium 2-((5-bromopyridyl) azo)-5-(N-propyl-N-sulfopropylamino) phenol reagent and its application to the determination of serum glucose using glucose oxidase
EP0200540B1 (en) Analytical element and method for determination of creatine kinase isoenzyme
CN104483487B (zh) 检测人血液中1,5‑脱水山梨醇的试剂盒
US20080173064A1 (en) Creatinine Sensor Calibration
Noma et al. Polarographic method for rapid microdetermination of cholesterol with cholesterol esterase and cholesterol oxidase.
SE466158B (sv) Analysmetod foer glukosbestaemning i helblod
Morin et al. Single Glucose Oxidase—Peroxidase reagent for two-minute determination of serum glucose
JPH0640836B2 (ja) 血液又は血液から誘導された試料中の血清フルクトサミン含量を特異的に測定する際に蛋白質基質効果を回避するための方法及び製剤
EP0116307B1 (en) Composition, analytical element and method for the quantification of creatine kinase
Sampson et al. Chemical inhibition used in a kinetic urease/glutamate dehydrogenase method for urea in serum.
FI57024C (fi) Foerfarande foer kvantitativ bestaemning av ammoniak i blodet
CN101498662A (zh) 单胺氧化酶mao单试剂测定试剂盒
CS199692B2 (en) Method of photometric determination of hydrogen peroxides
Jelikić-Stankov et al. Determination of uric acid in human serum by an enzymatic method using N-methyl-N-(4-aminophenyl)-3-methoxyaniline reagent
JPH045348B2 (fi)
CN111944872A (zh) 测定肌酐含量的试剂组合、试剂或试剂盒
Deeg et al. Kinetic determination of serum glucose by use of the hexokinase/glucose-6-phosphate dehydrogenase method
JPH01108997A (ja) 血液又は血液から導出した試料中の血清のフルクトスアミン含量を特異的に測定する方法及び試薬、及び非特異的還元作用を有するか、又は／及び溷濁を惹起する試料成分を除去する方法
Price et al. Analytical reviews in clinical biochemistry: the measurement of urate
JPH0571239B2 (fi)
JPH07155196A (ja) 生体成分の測定法
JP4542541B2 (ja) 安定化コリンエステラーゼ基質溶液
Rietz et al. Fluorometric assay of serum acid or alkaline phosphatase, either in solution or on a semisolid surface