FI121338B - Mikro-organismeja ja menetelmä streptogramiinin A- tai B-aineosan valmistamiseksi - Google Patents

Description

Mikro-organismeja ja menetelmä streptogramiinin A- tai B-aineosan valmistamiseksi

Esillä oleva keksintö koskee uusia mikro-organis-5 meja ja menetelmää streptogramiinin A- tai B-aineosan val mistamiseksi. Tarkemmin ottaen keksintö koskee antibiootteja tuottavia mikro-organismeja.

Alan teknisen tason puitteissa kuvatuista lukuisista antibiooteista tietyillä on erikoisuutena koostua useam-10 mistä aktiivisista aineosista, jotka vaikuttavat yhdessä synergistisellä tavalla. Näin on asianlaita etenkin strep-togramiinien ryhmän antibioottien kohdalla, jotka koostuvat makrolaktonista (ryhmän A yhdiste) ja depsipeptidistä (ryhmän B yhdiste). Näiden antibioottien mikrobivastainen ak-15 tiivisuus ja vaikutustapa ovat olleet tutkimusten kohteena, etenkin Tanakan ("Antibiotics", osa III, Springer, Berliini, 1975, s. 487) ja Vasquezin ("Antibiotics", osa III, Springer, Berliini, 1975, s. 521) toimesta. Ryhmien A ja B molekyylien yleinen rakenne esitetään kuvioissa 1 ja 2.

20 Streptogramiinien ryhmän tunnetuista antibiooteista voidaan mainita etenkin: pristinamysiinit, mikamysiinit, virginiamysiinit, 25 vernamysiinit, ostreogrysiinit, synergistiinit, plaurasiinit, etamysiinit, 30 streptogramiinit, viridogriseiinit, griseoviridiinit tai neoviridogriseiinit.

35 Kunkin näistä antibiooteista aktiivinen muoto koostuu kuviossa 1 esitetyn mukaisten ryhmään A kuuluvien 2 molekyylien ja kuviossa 2 esitetyn mukaisten ryhmään B kuuluvien molekyylien, tai sukulaismolekyylien, synergis-tisestä yhdistelmästä.

Sukulaismolekyyleillä tarkoitetaan esillä olevan 5 keksinnön mielessä molekyylejä, joilla on kuvioissa 1 ja 2 esitettyjen yleisrunko, mutta jotka voivat poiketa näistä substituutioilla tai muilla sekundaarisilla variaatioilla, ja joilla on saman luonteista aktiivisuutta.

Streptogramiinien ryhmän antibiootteja tuottaa laa-10 ja valikoima mikro-organismeja, ja tuottavat erityisesti suvun Actinomycetes bakteerit ja tietyt sienet. Näille mikro-organismeille on tunnusomaista, että ne syntetisoivat samanaikaisesti kyseisiä kahta aineosaa A ja B.

Taulukossa 1 mainitaan pääasialliset tuottajamikro-15 organismit sekä vastaavat antibiootit.

Tutkimuksia on suoritettu päämääränä lisätä näiden mikro-organismien tuotantotasoa. Voidaan mainita etenkin Biotin ΓBiotechnology of Industrial Antibiotics 22 (1984) 695] tai Prikrylovan ei ai. ΓBiotechnology and Bioindustry 20 2 (1988) 20] työt, jotka koskevat viljelyolosuhteiden pa rantamista ja mutageenisten aineiden vaikutusta S.*, virgi-naen virginiamysiinin tuotantotasoihin. Kuten kirjoittajat mainitsevat, saadut runsastuottoiset mutantit tuottavat aina samanaikaisesti aineosia A ja B.

25 Kuitenkin se seikka, että alan teknisen tason puit teissa käytettävissä olevat streptogramiineja tuottavat mikro-organismit syntetisoivat samanaikaisesti samassa fermentointialustassa antibiootin kahta synergististä aineosaa A ja B muodostaa tietyissä tapauksissa merkittävän 30 haitan.

Itse asiassa jotta näiden antibioottien arvo saa taisiin käyttöön ja jotta niitä kyettäisiin käyttämään farmaseuttisina aineina, edullisesti voidaan erottaa ja puhdistaa streptogramiinien aineosat A ja B. Tämä on sa-35 moin välttämätöntä, jotta streptogramiineilla voitaisiin 3 suorittaa kemiallisia tutkimuksia, erityisesti päämääränä puolisynteettisten johdannaisten valmistus, kuten esimerkiksi niiden, joita kuvataan patenttijulkaisuissa FR-2 549 063, FR-2 549 065, EP-191 662 tai EP-248 703.

5 Kuitenkin näiden eri aineosien saaminen on vaikea ta, mikä johtuu etenkin niiden samanaikaisesta tuotannosta ja niiden fysikokemiallisten ominaisuuksien samankaltaisuudesta. Lisäksi nämä mikro-organismit syntetisoivat yleensä kunkin aineosan useampia erilaisia molekyylejä, 10 mikä johtaa fermentointiliemessä lukuisten yhdisteiden seokseen hyvin vaihtelevissa suhteissa. Itse asiassa nykyään tunnetaan lukuisia molekyylejä, jotka kuuluvat streptogramiinien ryhmiin A ja B ja joilla on hyvin erilaisia biologisia aktiivisuuksia ja joita nämä mikro-or-15 ganismit tuottavat samanaikaisesti. Täten alan teknisen tason puitteissa tunnetaan seuraavat ryhmään A kuuluvat molekyylit: pristinamysiinit PIIA ja PUB, virginiamysii-nit Ml ja M2, mikamysiini A tai ostreogrysiinit A ja G. Samoin alan teknisen tason puitteissa tunnetaan seuraavat 20 ryhmään B kuuluvat molekyylit: pristinamysiinit PIA, PIB ja PIC; virginiamysiinit SI, S2, S3, S4 ja S5; mikamysiini B; vernamysiinit Βα, Ββ, Βγ ja Βδ; ostreogrysiinit B, Bl, B2 ja B3 tai neoviridogriseiinit I, II, III ja IV.

Näistä syistä on vaikeata saada tyydyttävällä ta-25 valla teollisella tasolla streptogramiinien synergistisiä aktiivisia seoksia, jotka ovat farmaseuttisesti hyväksyttäviä. On samoin vaikeata suorittaa streptogramiineilla kemiallisia tutkimuksia (rakenne-funktiosuhde, vesiliukoisten muotojen valmistaminen jne.). Esillä oleva keksin-30 tö tekee mahdolliseksi korjata alan teknisen tason haitat tällä alueella.

Hakija on nyt osoittanut, että on mahdollista saada mikro-organismeja, jotka tuottavat erikseen streptogramiinien aineosia A ja B stabiililla tavalla. Hakija on 35 siis valmistanut, ja tämä muodostaa esillä olevan keksin- 4 non kohteen, mikro-organismeja, jotka kykenevät tuottamaan selektiivisesti streptogramiinien aineosia A ja B. Keksintö koskee yhtä hyvin mikro-organismeja, jotka kykenevät tuottamaan selektiivisesti streptogramiinien ryhmän A molekyy-5 lejä tai streptogramiinien ryhmän B molekyylejä kuin mikro-organismeja, jotka kykenevät tuottamaan selektiivisesti yhden näistä ryhmistä spesifistä molekyyliä.

Keksintö mahdollistaa täten streptogramiinin A tai B erillisen tuotannon merkittävinä määrinä.

10 Keksintö tekee samoin mahdolliseksi menetelmien käytön streptogramiinien puhdistamiseksi, jotka ovat yksinkertaisempia ja siten suorituskykyisempiä ja taloudellisempia, koska uuttamisen aikana ei ole enempää tai vähempää vuorovaikutuksia eri aineosien välillä.

15 Keksintö tekee myös mahdolliseksi aineosien A ja B

vastaavien määrien vaihtelemisen seoksessa, ja siten sekä puhtauden että synergistisen tehokkuuden tasolla optimaalisten antibioottikoostumusten valmistuksen.

Keksinnöllä on edelleen mahdollista saada tuottei-20 ta, joiden määrä ja puhtaus ovat riittävät kemiallisten tutkimusten suorittamiseksi streptogramiinien ominaisuuksien edelleen parantamiseksi.

Keksintö antaa täten käyttöön streptogramiinien tuottamiseksi systeemin, joka tekee mahdolliseksi näiden 25 antibioottien paljon suorituskykyisemmän teollisen hyödyn tämisen .

Tarkemmin ottaen keksintö koskee mikro-organismeja, jotka kykenevät tuottamaan selektiivisesti pristinamysii-nin, virginiamysiinin, mikamysiinin, ostreogrysiinin, sy-30 nergistiinin, viridogriseiinin, vernamysiinin, plaurasii- nin, etamysiinin, griseoviridiinin, neoviridogriseiinin ja streptogramiinin käsittävästä ryhmästä valittujen streptogramiinien aineosia A ja B.

Keksintö koskee siten mikro-organismia, joka kyke-35 nee tuottamaan selektiivisesti streptogramiinin aineosaa A tai streptogramiinin aineosaa B ja jolle on tunnusomaista 5 että se on valittu ryhmästä, jonka muodostavat kannat S. pristinaespiralis nro CBS 182.92 ja CBS 183.92; ostreo-qriseus nro CBS 142.93 ja 143.93; ja virginae nro CBS 140.93 ja 141.93. Keksintö koskee myös menetelmää strepto-5 gramiini A -aineosan tai B -aineosan valmistamiseksi. Menetelmälle on tunnusomaista, että edellä kuvattua mikro-organismia viljellään tuotanto-olosuhteissa ja tuotettu aineosa otetaan talteen.

Edullisessa suoritusmuodossa keksintö koskee mikro-10 organismeja, jotka kykenevät tuottamaan selektiivisesti streptogramiinien aineosia A, jotka vastaavat kuviossa 1 esitettyä yleistä kaavaa, jossa: Y on D-proliini, 4,5-dehydroproliini, D-alaniini tai D-kysteiini, 15 RO on ryhmä C=0 tai CHOH,

Rl on vetyatomi tai metyyliryhmä, R2 on vetyatomi tai metyyliryhmä, ja R3 on metyyli- tai isopropyyliryhmä.

Toisessa edullisessa suoritusmuodossa keksintö kos-20 kee mikro-organismeja, jotka kykenevät tuottamaan selektii visesti streptogramiinien aineosia B, jotka vastaavat kuviossa 2(a) esitettyä yleistä kaavaa, jossa: Z on L-proliini, L-asparagiinihappo, pipekoolihap-po, 4-oksopipekoolihappo, L-4-hydroksipipekoolihappo, L-5-25 hydroksi-4-oksopipekoolihappo, R4 on vetyatomi tai amiini, jonka kaava on NH(CH3) tai N(CH3)2, R5 on vetyatomi tai metyyliryhmä, ja R6 on metyyli- tai etyyliryhmä.

30 Edell een edullisessa suoritusmuodossa keksintö kos kee mikro-organismeja, jotka kykenevät tuottamaan selektiivisesti streptogramiinien aineosia B, jotka vastaavat kuviossa 2(b) esitettyä yleistä kaavaa, jossa: R7 on vetyatomi tai hydroksyyliryhmä ja 35 R8 on metyyli- tai etyyliryhmä.

β

Edullisemmin keksintö koskee mikro-organismeja, jotka kykenevät tuottamaan selektiivisesti yksinään tai seoksessa pristinamysiinin, virginiamysiinin, ostreogrysii-nin ja mikamysiinin käsittävästä ryhmästä valittujen strep-5 togramiinien aineosia A tai B.

Esimerkiksi keksintö koskee mikro-organismeja, jotka kykenevät tuottamaan selektiivisesti streptogramiinien aineosia A, jotka vastaavat kuviossa 1 esitettyä yleistä kaavaa, jossa RO on C=0-ryhmä, Rl on metyyliryhmä, R2 on 10 metyyliryhmä, R3 on isopropyyliryhmä ja Y on D-proliini tai 4,5-dehydroproliini; ja mikro-organismeja, jotka kykenevät tuottamaan selektiivisesti streptogramiinien aineosia B, jotka vastaavat kuviossa 2(a) esitettyä yleistä kaavaa, jossa: 15 R4 on amiini, jonka kaava on N(CH3)2, R5 on metyy liryhmä, R6 on etyyliryhmä ja Z on 4-oksopipekoolihappo; tai R4 on amiini, jonka kaava on NHCH3, R5 on metyyli-ryhmä, R6 on etyyliryhmä ja Z on 4-oksopipekoolihappo; tai 20 R4 on amiini, jonka kaava on N(CH3)2, R5 on metyy liryhmä, R6 on metyyliryhmä ja Z on 4-oksopipekoolihappo; tai R4 on amiini, jonka kaava on N(CH3)2, R5 on metyyliryhmä, R6 on etyyliryhmä ja Z on L-5-hydroksi-4-25 oksopipekoolihappo; tai R4 on vetyatomi, R5 on metyyliryhmä, R6 on etyyliryhmä ja Z on 4-oksopipekoolihappo; tai R4 on vetyatomi, R5 on metyyliryhmä, R6 on metyyli-ryhmä ja Z on 4-oksopipekoolihappo; tai 30 R4 on vetyatomi, R5 on metyyliryhmä, R6 on etyyli ryhmä ja Z on L-5-hydroksi-4-oksopipekoolihappo; tai R4 on vetyatomi, R5 on vetyatomi, R6 on etyyliryhmä ja Z on L-4-hydroksipipekoolihappo.

Keksinnön mukaisia mikro-organismeja voidaan vil-35 jellä aerobisen fermentoinnin vakio-olosuhteissa. Etenkin ravintokasvualusta koostuu yleensä hiililähteestä, typpi- 7 lähteestä ja mineraalisuoloista. Hiililähteenä voidaan käyttää erityisesti sokereita, öljyjä, orgaanisia happoja, dekstriiniä, tärkkelyksiä, glyserolia jne. Typpilähteenä voidaan mainita aminohapot, kasvijauhot ja uutteet (mallas, 5 soija, puuvillansiemenet, tomaatit, maissi jne.), sisälmykset, erilaiset hydrolysaatit (kaseiini, hiiva jne.) ja teollisista tuotteista esimerkiksi "liukoiset tislausjätteet". Mineraalilähteenä voidaan käyttää natriumin, kaliumin, ammoniumin tai kalsiumin klorideja, nitraatteja, 10 karbonaatteja, sulfaatteja ja fosfaatteja, tai hivenaineita, kuten magnesium, rauta, kupari, sinkki, mangaani tai koboltti.

Esillä olevan keksinnön mukaiset mikro-organismit saadaan edullisesti lähtien streptogramiinien ei-selektii-15 visistä tuottajamikro-organismeista.

Ei-selektiivisillä mikro-organismeilla tarkoitetaan esillä olevan keksinnön mielessä mikro-organismeja, jotka syntetisoivat samanaikaisesti streptogramiinien aineosia A ja B. Kaikki taulukossa 1 mainitut mikro-organismit ovat 20 ei-selektiivisiä mikro-organismeja keksinnön mielessä. Ha kija on nyt osoittanut, että streptogramiinien selektiivisiä tuottajamikro-organismeja voidaan saada lähtien streptogramiinien ei-selektiivisistä tuottajamikro-organismeista. Tässä tarkoituksessa on kehitetty alkuperäinen menetel-25 mä, johon liittyy mutagenisoinnin ensimmäinen valinnainen vaihe, jota seuraa valikointivaihe.

Menetelmässä edellä määriteltyjen mikro-organismien valmistamiseksi suoritetaan seuraavat vaiheet: ensimmäisessä valinnaisessa vaiheessa suoritetaan 30 mutagenisointi streptogramiinien ei-selektiiviselle tuotta- jamikro-organismille, ja toisessa vaiheessa valikoidaan selektiiviset mikro-organismit .

Ei-selektiiviset mikro-organismit ryhmitellään 35 yleensä Actinomyceteiksi ja sieniksi. Edullisemmin keksin nön mukaisessa menetelmässä käyttökelpoiset lähtömikro- 8 organismit ovat ei-selektiivisiä tuottajamikro-organismeja streptogramiinille, joka valitaan ryhmästä, joka käsittää pristinamysiinin, virginiamysiinin, mikamysiinin, ostreo-grysiinin, synergistiinin, viridogriseiinin, vernamysiinin, 5 plaurasiinin, etamysiinin, neoviridogriseiinin, griseoviri-diinin ja streptogramiinin. Esimerkiksi taulukossa 1 mainitut mikro-organismit muodostavat menetelmässä käyttökelpoisia ei-selektiivisiä mikro-organismeja. Edelleen edullisemmin menetelmä suoritetaan lähtien mikro-organismeista, jot-10 ka valitaan seuraavista: Streptomyces alborectus, Strepto- myces diastaticus, Streptomyces graminofaciens, Streptomyces griseus, Streptomyces loidensis, Streptomyces mitakaen-sis, Streptomyces olivaceus, Streptomyces ostreogriseus, Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces virginae, 15 Streptomyces lavendulae, Streptomyces griseoviridus, Micro-monospora sp., Actinomyces auranticolor, Actinomyces daqhestanicus ja Actinomyces azureus.

Edelleen edullisemmin menetelmä suoritetaan lähtien mikro-organismeista, jotka valitaan seuraavista: Streptomy-20 ces alborectus, Streptomyces mitakaensis, Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces ostreogriseus ja Streptomyces virginiae.

Menetelmän ensimmäisessä vaiheessa ei-selektiivistä mikro-organismia modifioidaan sen kaikenkaikkisten anti-25 biootin tuotantokapasiteettien nostamiseksi ja/tai siten, ettei se syntetisoi kuin yhtä streptogramiinien kahdesta aineosasta. Tämä voidaan saada geneettisillä modifioinneilla (mutaatio niiden entsyymien rakennegeenien tasolla, jotka osallistuvat biosynteesitiehen, tai sekvenssien ta-30 solia, jotka mahdollistavat tällaisten rakennegeenien il mentymisen esimerkiksi) tai biokemiallisilla modifioinneilla (translaation jälkeisen mekanismin modifiointi, retroinhibitiomekanismin muuttaminen jne.). Tässä tarkoi- 9 tuksessa voidaan käyttää erilaisia mutagenisointivälinei-tä, ja etenkin seuraavia: fysikaaliset agentit: röntgensäteet, ultraviolettisäteet; tai 5 kemialliset agentit, kuten: alkyloivat aineet, ku ten etyylimetaanisulfonaatti (EMS), N-metyyli-N'-nitro-N-nitrosoguanidiini (Delic et ai. . Mutation Res. 2 (1970) 167 - 182), tai 4-nitrokinoleiini-l-oksidi (NQO); bialkyloivat aineet; 10 interkaloivat aineet; tai mikä tahansa DNA:n insertointimutaatiosysteemi, ja erityisesti transposonit, integroituvat plasmiditi, fagit tai profagit; tai edelleen, protoplastien fuusio [Cohen, Nature 268 (1977) 15 171 - 174].

Kutakin näistä työvälineistä voidaan käyttää ei-selektiivisiin mikro-organismeihin itiöinä, itäneinä itiöinä tai itämisen aikana tai myseeliin. Sitä paitsi näitä eri työvälineitä voidaan samoin käyttää yhdistelmä- 20 nä.

Vaikka voitaisiin kehitellä tiettyjä edullisia mu-taatiokaavioita, jotka johtavat haluttujen selektiivisten mikro-organismien muodostumiseen, tulee huomata, että alan ammattilainen voi soveltaa mutagenisointivaihetta käytetyn 25 lähtömikro-organismin, halutun streptogramiinin ja sovit tujen päämäärien (halutun aineosan synteesinopeuden lisäys, tämän tuotantotason kohottaminen, mikro-organismin alkuaineiden kulutuksen vähentäminen jne.) funktiona. Näissä olosuhteissa esillä oleva keksintö ei rajoitu täs-30 mälliseen mutaatiokaavioon, vaan kattaa kaikki manipulaa tiot (satunnaiset tai kohdennetut), joilla on mahdollista saada mikro-organismeja, jotka kykenevät tuottamaan selektiivisesti streptogramiinien aineosaa lähtien ei-selektii-visistä mikro-organismeista.

10

Spesifisenä esimerkkinä mutagenisointi etyylime-taanisulfonaatin läsnä ollessa tai käsittelemällä UV-sä-teillä antaa hyviä tuloksia.

Mitä tulee menetelmän toiseen vaiheeseen, sillä on 5 mahdollista identifioida ja eristää selektiiviset mikro-organismit. Tämä vaihe voidaan suorittaa eri tavoin ja etenkin käyttämällä jonkin mikrobin herkkyystestiä. Tähän tarkoitukseen on olemassa erilaisia mikrobeja, jotka ovat herkkiä spesifisesti streptogramiinien ryhmän A tai ryhmän 10 B aineosille. Voidaan etenkin mainita Bacillus subtilis (ATCC6633), Bacillus circulans. Bacillus cereus [Watanabe, J. Antibio. Ser. A XIII;1 (1960) 62] tai CL. xerosis (em. Watanabe), jotka ovat herkkiä spesifisesti ryhmän B aineosille. Voidaan samoin mainita Streptococcus agalac-15 tiae B96 fAntimicrob. Agents Chemother 10:5 (1976) 795], Micrococcus luteus (em. Prikrylova) tai Sareina lutea (ATCC9341), jotka ovat herkkiä spesifisesti ryhmän A aineosille. Sitä paitsi on samoin mahdollista valmistaa keinotekoisesti mikrobeja, jotka ovat herkkiä spesifisesti 20 streptogramiinien yhdelle aineosalle, insertoimalla streptogramiinien 2 aineosalle herkkään mikrobiin toisen niistä resistenssigeeni. Tiettyjä näistä geeneistä on itse asiassa kloonattu [Le Goffic g£ ai. f J. Antibio. XXX:8 (1977) 655; Le Goffic et ai. r Ann. Microbiol. Inst.

25 Pasteur 128B (1977) 471; Solh et Path. Biol. 32:5 (1984) 362] ja alan ammattilainen voi käyttämällä molekyylibiologian tavanomaisia tekniikoita viedä tällaisia geenejä eri mikrobeihin. Valikointivaihe voidaan samoin suorittaa ELISA-testillä käyttämällä aineosille A tai B spe-30 sifisiä vasta-aineita, tai edelleen analyyttisillä tekniikoilla, kuten kromatografia (nestekromatografia, ohutle-vykromatografia jne.). Kun kyseessä on tietyn mikrobin herkkyyden testi, lisäksi edullisesti valikointi vahvistetaan kromatografisella määrityksellä.

11

Esillä olevan keksinnön toinen kohde koskee menetelmää streptogramiinien yhden aineosan A tai B valmistamiseksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että edellä määritellyn mukaista mikro-organismia viljellään tuotanto-5 olosuhteissa ja tuotettu ainesoa erotetaan kasvualustasta. Streptogramiinien aineosat A ja B voidaan erottaa fermen-tointiliemestä tavanomaisilla liuottimena uuttamisen menetelmillä. On etenkin mahdollista menetellä seuraavan menettelyjärjestelyn mukaan: liemen suodattaminen happa- 10 maksi tekemisen noin pH:hon 3 jälkeen, suodoksen neutralointi pHrhon 7, tuotetun aineosan uuttaminen dikloori-etaanilla, konsentrointi ja saostaminen huonolla liuottimena, kuten petro1ieetteri. Näin saatua aineosaa voidaan sitten puhdistaa tutuilla menetelmillä, kuten kromatogra-15 fisesti. Menetelmiä streptogramiinien puhdistamiseksi lähtien ei-selektiivisten mikro-organismien fermentointilie-mestä on kuvattu kirjallisuudessa ja niitä voidaan soveltaa esillä olevassa keksinnössä [vrt. etenkin Chapin et ai. r J. of Liquid Chromatography .11:11 (1988) 2367; 20 Prikrylova et ai.f Biotechnology and Bioindustry 2 (1988) 20; Biot, A., Biotechnology of Industrial Antibiotics 22 (1984) 695].

Erityisessä suoritusmuodossa keksintö koskee menetelmää makrolaktonin valmistamiseksi, jonka yleinen kaava 25 esitetään kuviossa 1 ja jossa kaavassa eri substituentit määritellään kuten edellä, tai tällaisten makrolaktonien seoksen valmistamiseksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että viljellään edellä määritellyn mukaista spesifistä mikro-organismia ja erotetaan saadut tuotteet 30 kasvualustasta.

Toisessa erityisessä suoritusmuodossa keksintö koskee menetelmää depsipeptidin valmistamiseksi, jonka yleinen kaava esitetään kuviossa 2(a) ja jossa kaavassa eri substituentit määritellään kuten edellä, tai tällais-35 ten depsipeptidien seoksen valmistamiseksi, jolle mene- 12 telmälle on tunnusomaista, että edellä määritellyn mukaista spesifistä mikro-organismia viljellään ja erotetaan saadut tuotteet kasvualustasta.

Näin saatuja streptogramiinien aineosia A ja B 5 (lähtien keksinnön mukaisten selektiivisten mikro-organismien kasvualustasta) voidaan käyttää rakenne-funktiotutki-muksiin, puolisynteettisten johdannaisten valmistukseen tai antibioottikoostumusten valmistukseen.

Esillä olevaa keksintöä kuvataan täydellisemmin 10 seuraavien esimerkkien avulla, jotka on katsottava havainnollistaviksi eikä rajoittaviksi.

Esimerkkejä

Esimerkki 1

Pristinamysiini PII:n spesifisten tuottajamikro-15 organismien valmistaminen lähtien kannasta DS5647 Tämä esimerkki suoritettiin ilman edeltävää muta-genisointivaihetta.

1. Valikointi mikrobin herkkyyden mukaan S. pristinaespiralis DS5647 (ATCC25486) -itiösus- 20 pensiota levitetään laimentamisen jälkeen täydelliselle ge-latiinikasvualustalle (kasvualusta HT: 10 g valkoista dekstriiniä; 2 g tyypin A NZ-amiinia; 1 g hiivauutetta; 1 g lihauutetta; 0,02 g CoCl2-6H20: ta; 20 g baktoagaria; de-mineralisoitua vettä q.s. 1 litra; vrt. Pridham, Antibiotic 25 Annual 1956 957) erillisten pesäkkeiden saamiseksi. Kasvuvaiheen jälkeen nämä erilliset pesäkkeet noukitaan tuotan-tokasvualustalle (HT-kasvualusta). Määrätyssä iässä näytteitä poistetaan kasvualustasta tuotettujen pristinamysii-nien määrittämiseksi.

30 1.1. Pristinamysiinien PI määrittäminen

Osa otetuista näytteistä sijoitetaan gelatiinikas-vualustalle [25 g/litra kasvualustaa Merieux nro 2 (Merieux 5 177 1), 20 g/litra NaClrää, 5 g/litra puskuria TAPS, pH

8,5], johon on lisätty 40 mg/litra pristinamysiiniä PII ja 35 siirrostettu 3,6 x 108 itiöitä/litra Bacillus subtilis -kantaa ATCC6633. Tämä kasvualusta valmistetaan näytteenot- 13 topäivänä seuraavalla tavalla: 200 ml:n erlenmeyereihin jaettu gelatiinikasvualusta sulatetaan mikroaaltouunissa, minkä jälkeen tulppien lämpötila saatetaan noin 50 °C:ksi vesihauteessa, minkä jälkeen sitä kontrolloidaan "katoksen" 5 alla kasvualustaan upotetulla lämpömittarilla samalla kevyesti sekoittaen. Kun 48 °C:n lämpötila on saavutettu, kuhunkin tulppaan lisätään: 2 ml pristinamysiini PII -liuosta, jonka pitoisuus on 4 mg/ml (loppupitoisuus 40 mg/litra), ja 10 0,4 ml Bacillus subtilis -kannan ATCC6633 suspen siota, jossa pitoisuus on 3,6 x 109 itiöitä/ml ja jota on laimennettu 20-kertaisesti (loppupitoisuus 3, 6 x 108 itiö-tä/litra).Kasvualusta homogenisoidaan kevyesti sekoittamalla, minkä jälkeen se kaadetaan määränä yksi tulppa levyä 15 kohden ("Screening Plate" NUNC) tarkasti tasaiselle pinnalle .

Kun näytteet on sijoitettu levyille (näytteenotti-men halkaisija: 4,0 mm), suoritetaan 6 tunnin esidiffuusio 4 °C:ssa, minkä jälkeen levyjä inkuboidaan 16 tunnin ajan 20 37 °C:ssa.

1.2. Pristinamysiinien PII määritys

Osa otetuista näytteistä sijoitetaan gelatiinikas-vualustalle [52 g/litra aivo-sydäninfuusioagaria], johon on lisätty 10 mg/litra pristinamysiiniä PI ja siirrostettu 5 x 25 108 itiötä/litra Streptococcus agalactiae -kantaa B96. Tämä kasvualusta valmistetaan näytteenottopäivänä seuraavalla tavalla: 200 ml:n erlenmeyereihin jaettu gelatiinikasvu alusta sulatetaan mikroaaltouunissa, minkä jälkeen tulppien lämpötila saatetaan noin 50 °C:ksi vesihauteessa, minkä 30 jälkeen lämpötilaa kontrolloidaan "katoksen" alla kasvualustaan upotetulla lämpömittarilla samalla kevyesti sekoittaen. Kun on saavutettu 45 °C:n lämpötila, kuhunkin tulppaan lisätään: 1 ml pristinamysiini PI -liuosta, jonka pitoisuus 35 on 2 mg/ml (loppupitoisuus 10 mg/litra) ja 14 0,7 ml Streptococcus aqalactiae -kannan B96 suspensiota, jossa pitoisuus on 5 x 108 itiötä/ml.

Kasvualusta homogenisoidaan kevyesti sekoittamalla, minkä jälkeen se kaadetaan määränä yksi tulppa levyä kohden 5 ("Screening Plate" NUNC) tarkasti tasaiselle pinnalle.

Kun näytteet on sijoitettu levyille (näytteenotti-men halkaisija: 3,5 mm), suoritetaan 6 tunnin esidiffuusio 4 °C:ssa, minkä jälkeen levyjä inkuboidaan 16 tunnin ajan 37 °C:ssa.

10 1.3. Tulokset

Inhibitiokehien halkaisijat mitataan kullekin tes-timikrobeja sisältävälle levylle. Ne ovat kasvualustan sisältämän antibioottipitoisuuden (aineosa A tai B) funktio, jolloin on mahdollista identifioida kloonit, jotka eivät 15 tuota jompaakumpaa aineosista.

Testatuista 3 600 kloonista 36 identifioitiin täten ei pristinamysiiniä PI tuottaviksi.

2. Valikointi kromatografisella määrityksellä Näin identifioidut kloonit, jotka eivät tuota pris-20 tinamysiiniä PI mutta tuottavat pristinamysiiniä PII kiin teällä kasvualustalla, testataan sitten nestemäisessä kasvualustassa. Tätä varten 0,5 ml kohdassa 1 valikoitujen kantojen itiöiden suspensiota lisätään steriileissä olosuhteissa 40 ml:aan siirrostuskasvualustaa 300 ml: n erlen-25 meyerissä. Siirrostuskasvualusta koostuu seuraavista: 10 g/litra maissinliotusvettä, 15 g/litra sakkaroosia, 10 g/litra (NH4) 2SO4: ää, 1 g/litra K2HP04:ää, 3 g/litra NaCl:ää, 0,2 g/litra MgS04-7H20: ta, ja 1,25 g/litra CaC03:a. pH säädetään 6,9:ksi lisäämällä natriumhydroksidia ennen 30 kalsiumkarbonaatin lisäämistä. Erlenmeyereitä sekoitetaan 44 tunnin ajan 27 °C:ssa pyörivällä sekoittajalla nopeudella 325 kierrosta/min. 2,5 ml 44 tunnin ikäistä edeltävää viljelmää lisätään steriilistä 30 ml:aan tuotantokasvualus-taa 300 ml: n erlenmeyerissä. Tuotantokasvualusta koostuu 35 seuraavista: 25 g/litra soijajauhoa, 7,5 g/litra tärkkelystä, 22,5 g/litra glukoosia, 3,5 g/litra rehuhiivaa, 0,5 15 g/litra sinkkisulfaattia ja 6 g/litra kalsiumkarbonaattia. pH säädetään 6:ksi lisäämällä kloorivetyhappoa ennen kalsiumkarbonaatin lisäämistä. Erlenmeyereitä sekoitetaan 24 tunnin, 27 tunnin tai 30 tunnin ajan. 10 g lientä punnitaan 5 sitten sileään erlenmeyeriin ja tähän lisätään 20 ml liikkuvaa faasia, joka koostuu 62,5 %:sta asetonitriiliä ja 37,5 %: sta konsentroitua 0,1 M K2HP04-liuosta. Sekoitetaan sekoittajalla (325 kierrosta/min) 20 minuutin ajan ympäristön lämpötilassa, minkä jälkeen seos suodatetaan pape-10 risuodattimella ja suodoksen sisältämä pristinamysiini määritetään CPL:llä. Tätä varten 2,4 ml suodosta liuotetaan laimentimeen, joka koostuu asetonitriilistä ja vedestä suhteessa 30:70. Tämä liuos ruiskutetaan SFCC-kolonniin (pituus: 25 cm; halkaisija: 1/4"; stationaarifaasi: Nucleosil 15 C8 5 mikronia). Liikkuva faasi koostuu 630 ml:sta 0,1 M KH2P04-liuosta (säädetty pH:hon 3 H3P04:llä) ja 370 ml:sta asetonitriiliä, ja eluointi suoritetaan virtauksella 1 ml/minuutti. Streptogramiinit todetaan mittaamalla absorptio 206 nm:ssä LDC Spectromonitor III -detektorilla.

20 Tällä analyysillä voidaan osoittaa 3 kloonia, jot ka ovat pristinamysiinin PII selektiivisiä tuottajia 36:sta aiemmin identifioidusta. Klooni Pr4R12 on talletettu 11.11.1992 talletuslaitokseen Centraalbureau voor Schimmel-cultures ä Baarn (Hollanti) Budapestin sopimuksen ehtojen 25 nojalla hakunumeron ollessa CBS 183.92.

Esimerkki 2

Pristinamysiinin PI spesifisten tuottajamikro- organismien valmistaminen kannasta DS5647 Tämä esimerkki käsittää ei-selektiivisen mikro-30 organismin mutagenisointivaiheen, jota seuraa valikointi-vaihe .

1. Mutagenisointi 1.1. Mutagenisointi etyylimetaanisulfonaatilla (EMS) 35 Ensimmäisen tyypin mutagenisointi suoritettiin ei- selektiiviselle kannalle DS5647 käyttäen mutageenisenä 16 agenttina kemiallista ainetta: etyylimetaanisulfonaattia (EMS).

Kannan DS5647 itiösuspensiota lietetään 40 ml:aan 0,2 M fosfaattipuskuria, pH 7 (K2HPO4 0,2 M; pH säädetään 5 7: ksi lisäämällä 0,2 M KH2P04-liuosta) . Tämä suspensio jae taan sitten neljään 100 ml:n erlenmeyeriin määränä 10 ml erlenmeyeriä kohden, eli noin 6 x 108 itiötä/erlenmeyer. 0,4 ml EMS:ää lisätään sitten kuhunkin erlenmeyeriin (lop-pupitoisuus 4 %) ja suspensioita sekoitetaan nopeudella 280 10 kierrosta/min 30 °C:ssa vaihtelevan ajan (vrt. taulukko).

Sitten suspensiot siirretään suuriin 250 ml: n astioihin ja niihin lisätään 90 ml 0,16 M Na2S303-5H20-liuosta. Kustakin astiasta otetaan 0,5 ml:n näyte, joka levitetään HT-kasvualustaa sisältävälle maljalle eloonjääntimäärien mää-15 rittämiseksi laskemalla verrattuna verrokkiin (vrt. taulukko) . Loput suspensiosta sentrifugoidaan, solut huuhdotaan kerran 10 ml:11a 0,16 M Na2S303-5H20-liuosta, sentrifugoidaan toistamiseen, minkä jälkeen ne lietetään 10 ml:aan Hirsch-kasvualustaa [J. Bacteriol. 126 (1976) 13]. Yhden yön feno-20 tyyppi-ilmentymisen jälkeen 30 °C:ssa sekoittaen (280 kierrosta/min) solut levitetään HT-kasvualustaa sisältävälle maljalle pesäkkeiden auksotrofiatason ja morfologisen heterogeenisyyden määrittämiseksi. Auksotrofiatason mittaamiseksi pesäkkeet noukitaan minimivaatimuskasvualustalle ja 25 määritetään kasvamaan kykenemättömien pesäkkeiden prosentuaalinen osuus. Minimivaatimuskasvualusta koostuu seuraavis-ta: agaria 10 g; L-asparagiinia 0,5 g, K2HP04:ää 0,5 g;

MgS04-7H20: ta 0,2 g; FeS04-7H20: ta 0,01 g; autoklavoitua glukoosia 10 g; tislattua vettä 1 litra [Hopwood, D.A., Bact. 30 Rev. 31 (1967) 373]. Saadut tulokset esitetään seuraavassa taulukossa.

Parametrit RO Rl R2 R3 EMS (%) 0 4 4 4 35 Sekoitusaika (min) 150 130 150 180

Eloonjäämis-% 100 5,7 0,94 0,21 17

Auksotrofia-% 0,4 4,3 6,0 5,8

Heterogeenisyys + /- + +++ +++ 1.2. Mutagenisointi UV-säteillä 5 Toisen tyypin mutagenisointi suoritettiin ei-selek- tiiviselle kannalle DS5647 käyttäen mutageenisena agenttina fysikaalista agenttia: ultraviolettisäteitä.

Kannan DS5647 itiösuspensiota (7 x 108 itiöitä/ml) laimennetaan Tween-valmistetta 0,01 % sisältävällä vedellä 10 (loppupitoisuus: 5 x 107 itiötä/ml) . Tämä suspensio jaetaan petrimaljoihin määränä 10 ml maljaa kohden, eli noin 5 x 108 itiötä/malja. Sitten maljat altistetaan UV-säteille käyttäen erilaisia säteilytystehoja (vrt. taulukko). Sitten kunkin maljan sisältöä sentrifugoidaan 10 minuutin ajan no-15 peudella 3 000 kierrosta/min ja pelletit lietetään 5 ml:aan Hirsch-kasvualustaa. Soluja pidetään 30 °C:ssa sekoittajalla, kunnes havaitaan itämisen alkaminen. Sitten solut levitetään ja seuraavat parametrit, jotka osoittavat muta-genisoinnin tehokkuutta, määritetään: eloonjääntitaso ja 20 auksotrofiataso. Nämä parametrit määritetään kuten edellisessä esimerkissä.

Parametrit TO Tl T2 T3 T4 T5 T6 Säteilytys- 25 teho 0 3420 4050 5940 7200 8100 9120 erg/mm1

Eloonjääneitä 107 102 103 3 ·101 101 4 · ΙΟ1 101 soluja/ml

Eloonjäänti-% 0,1 0,01 0,003 0,001 0,004 0,001 30 Auksotrofia-% <0,4 0,4 3,2 2,8 5,6 2,8 3,8

Pristinamysiinin PI spesifisten tuottajien vali 2

Valikointi suoritetaan, kuten esimerkissä 1, kah-35 dessa vaiheessa (mikrobin herkkyyden testi kiinteällä kasvualustalla ja vahvistus nestemäisessä kasvualustassa kro- 3 kointi 18 matografisella analyysillä) lähtien EMS-mutagenisoinnilla saaduista pesäkkeistä (R2). 3 600 lähtökloonista identifioitiin kiinteällä kasvualustalla 6 kpl, joista 3 vahvistettiin nestemäisessä kasvualustassa pristinamysiinin PI spe-5 sifisiksi tuottajiksi. Klooni Pr4R31 talletettiin 11.11.1992 talletuslaitokseen Centraalbureau voor Schimmel-cultures ä Baarn (Hollanti) Budapestin sopimuksen ehtojen nojalla hakunumeron ollessa CBS 182.92.

Esimerkki 3 10 Ostreogrisiinin A ja B spesifisten tuottajamikro- organismien valmistaminen lähtien kannasta Sk^ ost-reogriseus ATCC 27455 Tämä esimerkki käsittää ei-selektiivisen mikro-organismin mutagenisointivaiheen, jota seuraa valikointi-15 vaihe.

1. Mutagenisointi

Mutagenisointi suoritettiin käyttämällä etyylime-taanisulfonaattia (EMS).

Kannan ATCC 2745 itiöiden suspensiota lietetään 20 50 ml: aan 0,2 M fosfaattipuskuria, pH 7 (K2HP04 0,2 M; pH

säädetään 7: ksi 0,2 M KH2P04-liuoksella) . Tämä suspensio jaetaan sitten viiteen 100 ml:n erlenmeyeriin määränä 10 ml erlenmeyeriä kohden, eli noin 9,3 x 108 itiötä/erlenmeyer. Sitten EMS:ää lisätään kuhunkin erlenmeyeriin vaihteleva 25 pitoisuus (vrt. taulukko) ja suspensioita sekoitetaan no peudella 280 kierrosta/min 30 °C:ssa 150 tai 180 minuutin ajan. Sitten suspensiot siirretään ja niitä käsitellään kuten esimerkin 2 kohdassa 1.1. Saadut tulokset esitetään seuraavassa taulukossa.

30

Parametrit QOl Q02 Q03 Q06 Q07 EMS (%) 0 4 4 5 6

Sekoitusaika (min) 150 150 180 180 180

Eloonjäänti-% 100 15,6 4,4 2,9 0,13 35 Auksotrofia-% 0 2,8 3,3 2,3 4,3

Heterogeenisyys +/- + ++ +++ +++ 19 2. Ostreogrisiinin A spesifisten tuottajien valikointi

Valikointi suoritetaan, kuten esimerkissä 1, kahdessa vaiheessa (mikrobin herkkyyden testi kiinteällä kas-5 vualustalla ja vahvistus nestemäisessä kasvualustassa kromatografisella analyysillä) lähtien EMS-mutagenisoinnilla saaduista pesäkkeistä (Q03 ja Q06). 1 800 kloonista kummastakin mutageenikäsittelystä (3 600 kloonia kaikkiaan) identifioitiin 4 kiinteällä kasvualustalla (2 kummallekin kä-10 sittelylle). Kaksi kantaa vahvistettiin nestemäisessä kasvualustassa samoissa olosuhteissa kuin esimerkissä 1 ostreogrisiinin tyypin A spesifisiksi tuottajiksi. Klooni Pr4Q063 talletettiin 27.1.93 talletuslaitokseen Centraalbu-reau voor Schimmelcultures ä Baarn (Hollanti) Budapestin 15 sopimuksen ehtojen nojalla hakunumeron ollessa CBS 143.93.

3. Ostreogrisiinin B spesifisten tuottajien valikointi

Valikointi suoritettiin, kuten esimerkissä 1, kahdessa vaiheessa (mikrobin herkkyyden testi kiinteällä kas-20 vualustalla ja vahvistus nestemäisessä kasvualustassa kromatografisella analyysillä) lähtien EMS-mutagenisoinnilla saaduista pesäkkeistä (Q03). 1 800 lähtökloonista kiinteällä kasvualustalla identifioitiin yksi ainoa klooni, joka vahvistettiin nestemäisessä kasvualustassa. Tämä ostreogri-25 siinin tyypin B spesifinen tuottajaklooni, joka nimettiin Pr4Q031:ksi, talletettiin 27.1.93 talletuslaitokseen Cent-raalbureau voor Schimmelcultures ä Baarn (Hollanti) Budapestin sopimuksen ehtojen nojalla hakunumeron ollessa CBS 142.93.

30 Esimerkki 4

Virginiamysiinin A ja B spesifisten tuottajamikro- organismien valmistaminen lähtien kannasta vir- ginae ATCC 13161 Tämä esimerkki käsittää ei-selektiivisen mikro-35 organismin mutagenisointivaiheen, jota seuraa valikointi-vaihe .

20 1. Mutagenisointi

Mutagenisointi suoritettiin käyttämällä etyylime-taanisulfonaattia (EMS), kuten esimerkissä 3, itiösuspensi-olle, joka oli jaettu viiteen 100 ml:n erlenmeyeriin määrä-5 nä 10 ml erlenmeyeriä kohden, eli noin 3,2 x 109 itiö-tä/erlenmeyer. Mutagenisointiolosuhteet ja saadut tulokset on koottu seuraavaan taulukkoon. Noudatettiin esimerkissä 3 kuvattua menettelyjärjestelyä.

10 Parametrit QV4 QV5 QV6 QV9 QV7 QV10 EMS (%) 0 0,5 1 1,5 2 3

Sekoitusaika (min) 100 100 100 100 100 100

Eloonjäänti-% 100 72 55 25 10 0,7 Äuksotrofia-% < 0,4 0,7 8,3 4,6 4,2 3,1 15 Heterogeenisyys +/- +/- +/- ++ + ++ 2. Virginiamysiinin VM spesifisten tuottajien valikointi

Valikointi suoritetaan, kuten esimerkissä 1, kahdes-20 sa vaiheessa (mikrobin herkkyyden testi kiinteällä kasvualustalla ja vahvistus nestemäisessä kasvualustassa kromatografisella analyysillä) lähtien EMS-mutagenisoinnilla saaduista pesäkkeistä (QV9 ja QV7). 1 800 kloonista kummastakin mutageenikäsittelystä (3 600 kloonia kaikkiaan) iden-25 tifioitiin 2 kiinteällä kasvualustalla esimerkin 1 kohdassa 1.2 kuvatun menettelyjärjestelyn mukaan (käyttäen 107 itiö-tä/litra Streptococcus-kantaa B96) . Nämä 2 kantaa vahvistettiin nestemäisessä kasvualustassa esimerkin 1 olosuhteissa virginiamysiinin tyypin VM spesifisiksi tuottajiksi. 30 Klooni Pr4QV71 talletettiin 27.1.93 talletuslaitokseen Centraalbureau voor Schimmelcultures ä Baarn (Hollanti) Budapestin sopimuksen ehtojen nojalla hakunumeron ollessa CBS 140.93.

Valikointiin nestemäisessä kasvualustassa seurat-35 tiin kuitenkin esimerkin 1 kohdan 2 menettelyjärjestelyä 21 käyttäen siirrostuskasvualustana ja tuotantokasvualustana seuraavia kasvualustoja:

Siirrostuskasvualusta: sumutettu maissinliotusvesi 20 g; soijajauhoa 10 g; hiiva-autolysaattia 5 g; maapäh-5 kinäöljyä 15 g; vedetöntä glukodia 40 g; MnSO^ää 0,01 g; CaCOsitä 5 g; vettä q.s. 1 litra. pH säädetään 6,80:ksi lisäämällä natriumhydroksidia ennen kalsiumkarbonaatin lisäämistä .

Tuotankasvualusta: sumutettua maissinliotusvettä, 10 20 g; hiiva-autolysaattia, 5 g; maapähkinäöljyä 10 g; vede töntä glukodia 5 g; glyserolia 25 g; pellavaöljyä 10 g; Ca-CO3 5 g; vettä q.s. 1 litra. pH säädetään 6,80:ksi lisäämällä natriumhydroksidia ennen kalsiumkarbonaatin lisäämistä .

15 3. Virginiamysiinin tyypin VS spesifisten tuottaji en valikointi

Valikointi suoritetaan, kuten esimerkissä 1, kahdessa vaiheessa (mikrobin herkkyyden testi kiinteällä kasvualustalla ja vahvistus nestemäisessä kasvualustassa kro-20 matografisella analyysillä) lähtien EMS-mutagenisoinnilla saaduista pesäkkeistä (QV9). 3 700 lähtokloonista kiinteällä kasvualustalla identifioitiin yksi ainoa klooni (vrt. esimerkin 1 kohdan 1.1. menettelyjärjestely), joka vahvistettiin nestemäisessä kasvualustassa (vrt. kasvualustat 25 edellä). Tämä virginiamysiinin tyypin VS spesifinen tuotta-jaklooni, joka nimettiin Pr4QV91:ksi, talletettiin 27.1.93 talletuslaitokseen Centraalbureau voor Schimmelcultures ä Baarn (Hollanti) Budapestin sopimuksen ehtojen nojalla ha-kunumeron ollessa CBS 141.93.

30 22

Taulukko 1

Mikro-organismit Antibiootit

Sienet 5 Micromonospora sp. vernamysiini

Streptomyces S. alborectus virginiamysiini

S. conganensis (ATCC13528) F1370A,B

10 diastaticus plaurasiini streptogramiini S. graminofaciens streptogramiini S. griseus (NRRL2426) viridogriseiini S. griseoviridus griseoviridiini 15 griseoviridus (FERM P3562) neoviridogriseiini S. lavendulae etamysiini S. loidensis (ATCC11415) vernamysiini S. mitakaensis (ATCC15297) mikamysiini S . olivaceus (ATCC12019) synergistiini 20 S_;_ ostreogriseus (ATCC27455) osterogrysiini S . pristinaespiralis (ATCC25486) pristinamysiini S. virginae (ATCC13161) virginiamysiini S. antibioticus H-827 jakusimysiini S. kurssanovii (ATCC15824) A14725 25 £Α_ komoroensis 1753-Z3 1745-Z3

Nocardiopsis flava (ATCC29533) madumysiini

Actinomyces A. auranticolor (ATCC31011) plaurasiini 30 A^ azureus (ATCC31157) plaurasiini A. daghestanicus etamysiini

Actinoplanes sp. A17002

Actinoplanes sp. (ATCC33002) A15104 23

No de la demande Internationale: PCT/ /

MICRO-ORGANISMES

Fanilla facultative relative au mlcro-orpanUma manllonni an page 12 , Eigne 29-30 de la deacription t A. IDENTIFICATION OU DEPOT * 0'autrej dipöti ioni Identify» tur une huilit tuppNmenlalre 1 f j Nom de ^institution de döpdt *

Centraalbureau voor Sehimmelcultures (CBS)

Adresie de i'inttilullon de d4pdt (y compel* ie code postal et te pay-ι) *

Oosterstraat 1, P.O. Box 273 - 3740 AG BAARN (Pays-Bas)

Oate du d4pdl* , ·. ·, 000 N* d'ordre · 11 mars 1992 CBS 183.92

B. INDICATIONS SUPPL^MENTAIRES t (Ä ne rempilr qu* st n4cettaire). Une («Ullia *6par4« e*t joint* pour la »uite de ces renselgnements Q

En ce qui conceme les designations dans lesquelles un brevet europeen est demande,' un echantillon du microorganisme depose ne sera accessible, jusqu'a la publication de la mention de la delivrance du brevet europeen ou jusqu'a la date ä Iaquelle la demande sera rejetee, retiree ou reput6e retiree, que par la remise d'un echantillon ä un expert design^ par le requerant (regie 28(4) de Ia CBE).

C. ETATS OESICNES POUR LESQUELS LES INDICATIONS SONT OONNEes > (tl taa Indication. ne ioni pas donniea pour tous (os Stats d£sign£s) O. INDICATIONS FOURNIES S£PAR£MENT · (h ne remplir que sl mScassnira)

Les indications 4num£rÄe» cl*apris seront ioumiae* uitdriöurement au Suroau international s (specifier (a nature οάηέτβίο des indications p. es., «No d'ordre du döpitx) E, Q La pr^sonte feullle a 4U regue avec la demande Internationale iorsque cellö-cl a έ(6 d£pos0e (A verifier par I'ofTtce rAcepteur) (Fonctlonnalte autorisA) [~~~j Oato do f^coptton (on provenance du d^poeant) par te Bureau international 1" formulako PCT/RO/134 (Janvior t9Öt) (Fonctionnairo autorisi)

No de la demande Internationale: PCT/ / 24

MICRO-ORGANISMES

FeuiHe facultative relative au micro-organisme montionni en page 14 , ligne 23-25 de ta description ‘ A. IDENTIFICATION OU ΟέΡΟΤ * D'autres d£p6ls töni identifies tur une fauille supplimenlalf# 1Q Horn da Γ/ηβΗΙυΗοη da άέρύΐ 4

Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS)

Adrosae da I'imlltution da d4pöt (y compria ta coda postal at ie pays) *

Oosterstraat 1, P.O. Box 273 - 3740 AG BAARN (Pays-Bas)

Oato du dOp0t1 N' d'Ofdr* ♦ 9 11 mars 1992 CBS 182.92

B. INDICATIONS SUPPLEMENTäIRES τ (A ne rempilr qua ai nicessaire). Un» feulile sAparäe ait joints pour la auito de ces renselgnomonls Q

En ce qui conceme les designations dans lesquelles un brevet europeen est demande, un echantillon du microorganisme d6pose ne sera accessible, jusqu'a la publication de la mention de la delivrance du brevet europeen ou jusqu'a la date ä iaquelle la demande sera rejetee, retiree ou reputee retiree, que par la remise d'un 6chantillon ä un expert designe par le requerant (regie 28(4) de la CBE).

C. £TATS D^SIGN^S POUR LESQUELS LES INDICATIONS SONT DONNIES > (tl loi Indication· n. loot pas donnias pour tout lot Etats dösignAs) D. INDICATIONS FOURNIES s£pARÖMENT * (A ne rempilr que »I n6co*jalre)

Lea Indications inumörios ci*aprAs eeront toumiset ullörieurement au Bureau International 9 (specifier (a nature g6n4rala des indi* cations p. ex., «No d'ordro du d£p6t») E. Q La prAsonte feuillo a όΐό regue avec la demande Internationale iorsquo celle-cl a At<S depos6a (A verifier par I'ofTice rScepteur) (Fonctionnalro auiotis^) I [ Dato de rAcoptlon (on provenance du döposant) parte Bureau Inlernallonal »" (Fonclionnelro auu>ri$6)

Formulaire PCT/RO/134 (Janvlor 1981)

No da ia demands Internationale; PCT/ / 25

M1CRO-ORGANISMES

Fflulllo facultative rotative au micro-organi jmo montionni en page 15 , ligno 24-25 de la description < A. IDENTIFICATION DU D*POT * D'autros dOpöts lont idantlfida sur una Iduille lupplOmantalre 1Q Nom de {'institution de döp6t *

Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS)

Adressa de I'lnstltutlon de <J4p0t (y comprls ie code postal et te pays) <

Oosterstraat 1, P.O. Box 273 - 3740 AG BAARN (Pays-Bas)

Date du d6p6t * N* d'ordre 4 27 janvier 1993 CBS 143,93

B. INDICATIONS SUPPLE-MEHTAIRES * (i ne rempllr que tl nicossalre). Une fiullla ιόρβηίβ est jolnte pour la sullo do cot renselgnomonts Q

En ce qui conceme les designations dans lesquelles un brevet europeen est demande, un echantillon du microorganisme depose ne sera accessible, jusqu'ä la publication de la mention de la delivrance du brevet europeen ou jusqu'a la date ä laquelle la demande sera rejetee, retiree ou reputee retiree, que par Ia remise d'un echantillon ä un expert designe par le requerant (regie 28(4) de la CBE).

C. iTATS DgSIGNgS POUR LESQUELS LES INDICATIONS SONT DONNiES > td loi Indication· no «ont pas donndos pour tous les Etals dösignds) D. INDICATIONS FOURNI6S SiPARiMENT · (4 no rempllr quo II nOceuoiro)

Les Indications 6num4r£es cl*epr6s «eroni soumlses ultdrleuroment au Bureau International 9 (specifier ta nature g4n£rate deJ indications p. ex., «No d’ordro du d0p6t») E. Q La pr^sonte louillo a Mi regue avec la demande Internationale lorsquo cello-ci α όέροιέβ (Ä verifier par 1’oflica räcepteur) (Ponclionnalre aulorisÄ) | | Dale de r6cepiion (on provenance du dÄposant) par le Bureau international “* (Fonctionnalro autorlsö)

Formulako PCT/RO/134 (Janvier 1981)

No da la demanda Internationale; PCT/ / 26

MICRO-ORGAN1SMES

Feuille facultative relative au micro-organUme menlionni en page 16 , Ugne 7-8 de ia description t A. IDENTIFICATION DU ΟέΡΟΤ * D’autras dipits ioni Identifioi *ur une feuille *uppi$mentaire 3 Q Nom de rinstllution de d^pOt *

Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS)

Adrosae de 1‘lnalitulion de dipöt (y compile le code poilal et le pay*}3

Oosterstraat 1, P.O. Box 273 - 3740 AG BAARN (Pays-Bas)

Dale du ddpöt * N* d'prdre * 27 januier 1993 CBS 142.93

B. INDICATIONS SUPPLiMENTAIRES ' (4 ne rempllr qua il nicoiiairs). Una feullla liparia atl lointa pour la lulla da caa ramalgnomonts Q

En ce qui conceme les designations dans lesquelles un brevet europeen est demande, un 6chantillon du microorganisme depose ne sera accessible, jusqu'a Ia publication de la mention de la deltvrance du brevet europeen ou jusqu'a la date ä iaquelle Ia demande sera rejetöe, retiree ou reputee retiree, que par la remise d'un 6chantillon ä un expert designe par le requerant (regie 28(4) de la CBE), C. έΤΑΤβ OiSIONiS POUR LESQUELS EES INDICATIONS SONT OONNltES ' (il Ui Indlcallom ne «ont paidonnial pour tous ies Etats disignόs) D. INDICATIONS FOURNISS SäPARäMENT * (ä ne rempiir que el niceesaire)

Los indications 6numdf6e» cUapröt seront aoumlses ultörieurement au Bureau International 8 (specifier !a nature g$n4rala de* indi CÄllons p. ex., «No d'ordre du d6p6t») E. La presents fouillo a 0t0 rogue avec ta demande Internationale loraque celle-cl a 414 d4po*4o (4 verifier par I’ofTice r4ceptour) (fonciionnako βυιοΠιέ)

Date de f4ception (en provenance dii d4posant) par ie Bureau international (Fonctionneiro auto»U4)

Formutaire PCT/RO/J34 (Janvier 1981)

No de la demande internafionale: PCT/ / 27

MICRO-ORGANISMES

fouille facultative relative au mlcrOOrganiime men!ionn6 en page 17 , tigne 4 — 5 da la description * A. IDENTIFICATION DU DEPOT' ~ D'aulrei dipits sont Identifioi *ur uno loulllo lupplimenUire 1 Q N o m de rinstituUon de d^pöt *

Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS)

Adrease do I'instltution de dipöt (y comprit le code postal et le pays) *

Oosterstraat 1, P.O. Box 273 - 3740 AG BAARN (Pays-Bas)

Oale du dipöt * N· d'ordre * 27 jänvier 1993 CBS 140.93

β, INDICATIONS SUPPLI-MENTAIRES r (i ne rempllr que ti n6cetia!r$), Une feuille idparöe et( jolnie pour fa tulle de ces reneeignomont* Q

En ce qui conceme Ies designations dans iesquelles un brevet europeen est demande, un echantillon du microorganisme depose ne sera accessible, jusqu'a la publication de la mention de la delivrance du brevet europeen ou jusqu'a la date ä laquelle Ia demande sera rejetee, retiree ou reputee retiree, que par la remise d'un echantillon ä un expert designe par le requerant (regie 28(4) de la CBE).

C. έτATS DiSIGN^S POUR LESQUELS CES INDICATIONS SONT DONNIES > (li lei Indication! ne ioni pas donnios pour tous les Eiais d6slgn6s) D. INDICATIONS FOURNIES S^PAR^MENT * (4 ne rompilf que *1 rticessaire)

Cos Indications 6nunt0r4es ci-apr4s soront toumite* ullörteuremenl au Bureau International * (tpicifier la nature oäniralo det indications ρ. ok., «No d’ordre du d4p<5i») E. Q] ta prösento leuille a 414 re?ue avec la demande Internationale lorsque ceile-cl a έΐ6 d4po$4e (4 verifier par 1‘ofiko räeeptour) (fonetionnaire eutorii6) [~~| Osto de reception (en provenance du ddposant) par te Bureau international >" (Fonetionnaire eutorU4)

Formulaire PCT/RO/134 (Janvier 1981)

No de la demands Internationale; PCT/ / 28

MICRO-ORGANISMES

Fanilta facullaliye relative au micro.organlsma mentions en paga 17 , ligna 24 — 25 da la daiciipiion 1 A. IDENTIFICATION DU D^POT' D'autroa däpOu sonl IdantiiUa sur una faullla supplömanlalre 1 Q Nom de i'instltution de d6p6l *

Centraalbureau voor Sdiimmelcultures (CBS)

Adresse de (‘institution de döpdt {y comprl* 1« code postal et le pay·) *

Oosterstraat 1, P.O. Box 273 - 3740 AG BAARN (Pays-Bas)

Osto du d£pdt* N* d'ordre 6 27 janvier 1993 CBS 141.93 B. INDICATIONS SUPPL(:MENTAiRES 1 (i ne rempllr qua tl nicessake). Une feulils s6par6« «st Jolnte pour la suite de cea reftidlgnementi Q]

En ce qui conceme les designations dans lesqueiles un brevet europeen est demande, un echantillon du microorganisme depose ne sera accessible, jusqu'a la publication de la mention de la delivrance du brevet europeen ou jusqu'a la date ä laquelle la demande sera rejetee, retiree ou reputee retiree, que par la remise d'un echantillon ä un expert designe par le requerant (regie 28(4) de la CBE).

C. έΤΑΤβ DESIGNEs POUR LESQUELS LES INDICATIONS SORT DONNIES > (tl lei indication. ne tent pas donniSos pour lous les £tats d6sion4s) O. INDICATIONS FOURNIES SiPAR^MENT * (4 ne rempiir que ci n0ce*saire)

Los indications 6num6r6e* ci*apri» seront soumlset ult6rieuremenl «u Bureau international * (specifier la nature qdndralo des indi* cations p. ex., «No d'ordre du d6p<M») E. Q La pr^sente feullle a 6t6 re$ue avec la domando Internationale lorsque colle-ci a 016 d6po«6o <4 v6riftor par ('office ricepteur) (Foncllonnalro autorisö)

| | Oate de r6ceplion (en provenance du d6po$ani) par ie Bureau international ,M

Formulako PCT/RO/134 (Janvier 1981} (Fonciionnalre aulorisS}

Claims (9)

1. Mikro-organismi, joka kykenee tuottamaan selektiivisesti streptogramiinin aineosaa A tai streptogramiinin 5 aineosaa B, tunnettu siitä, että mikro-organismi on va littu ryhmästä, jonka muodostavat kannat pristinaespira-lis nro CBS 182.92 ja CBS 183.92; ostreogriseus nro CBS 142.93 ja 143.93; ja S^ virginae nro CBS 140.93 ja 141.93.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen mikro-organismi, 10 tunnettu siitä, että streptogramiini valitaan ryhmästä, jonka muodostavat pristinamysiini, virginiamysiini, mikamy-siini, ostreogrysiini ja vernamysiini.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen mikro-organismi, tunnettu siitä, että se tuottaa selektiivisesti strep- 15 togramiini A -aineosaa, joka vastaa kuviossa 1 esitettyä yleistä kaavaa, jossa Y on D-proliini, 4,5-dehydroproliini, D-alaniini tai D-kysteiini, RO on ryhmä C=0 tai CHOH, Rl on vetyatomi tai metyyliryhmä, R2 on vetyatomi tai metyyliryh-mä ja R3 on metyyli- tai isopropyyliryhmä.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen mikro-organismi, tunnettu siitä, että se tuottaa selektiivisesti streptogramiini B -aineosaa, joka vastaa kuviossa 2(a) esitettyä yleistä kaavaa, jossa Z on L-proliini, L-asparagiinihappo, pipekoolihappo, 4-oksopipekoolihappo, L-4-hydroksipipekoo- 25 lihappo, L-5-hydroksi-4-oksopipekoolihappo, R4 on vetyatomi tai amiini, jonka kaava on NH(CH3) tai N(CH3)2, R5 on vety-atomi tai metyyliryhmä ja R6 on metyyli- tai etyyliryhmä.

5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen mikro-organismi, tunnettu siitä, että se tuottaa selektiivisesti strep- 30 togramiini B -aineosaa, joka vastaa kuviossa 2(b) esitettyä yleistä kaavaa, jossa R7 on vetyatomi tai hydroksyyliryhmä ja R8 on metyyli- tai etyyliryhmä.

6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen mikro-organismi, tunnettu siitä, että streptogramiini valitaan ryhmästä, 35 jonka muodostavat pristinamysiini, virginiamysiini, ostreogrysiini ja mikamysiini.

7. Menetelmä streptogramiini A -aineosan tai B -aineosan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukaista mikro-organismia viljellään tuotanto-olosuhteissa ja tuotettu aineosa otetaan tal- 5 teen.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä makro-laktonin valmistamiseksi, jonka yleinen kaava esitetään kuviossa 1 ja jossa kaavassa substituentit määritellään kuten patenttivaatimuksessa 3, tai tällaisten makrolaktonien seok- 10 sen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään patenttivaatimuksen 1 mukaista spesifistä mikro-organismia, joka tuottaa streptogramiinin aineosaa A, ja saadut tuotteet erotetaan kasvualustasta.

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä depsi- 15 peptidin valmistamiseksi, jonka yleinen kaava esitetään ku viossa 2(a) ja jossa kaavassa substituentit määritellään kuten patenttivaatimuksessa 4, tai tällaisten depsipeptidi-en seoksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään patenttivaatimuksen 1 mukaista spesifistä mikro- 20 organismia, joka tuottaa streptograminin aineosaa B, ja saadut tuotteet erotetaan kasvualustasta.