FI120696B - Menetelmä solujen toipumisen ja jakautumisen lisäämiseksi - Google Patents

Description

Menetelmä solujen toipumisen ja jakautumisen lisäämiseksi Tämä keksintö tehtiin Yhdysvaltojen hallituksen tuella apurahalla DK42421, jonka myönsi National Institutes 5 of Health. Yhdysvaltojen hallituksella voi olla tiettyjä oikeuksia tähän keksintöön.

Keksinnön ala

Keho hylkii usein terveiden elinten tai solujen siirrännäisiä sairaudesta kärsiville potilaille immuunivas-10 teen vuoksi, joka alkaa vasteena vieraalle kudokselle tai soluille. Tämä keksintö tarjoaa menetelmän ex vivo -solujen toipumisen ja jakautumisen lisäämiseksi käsittäen solujen yhteisviljelyn Sertoli-solujen kanssa.

Keksinnön tausta 15 Tietyt krooniset sairaudet tuhoavat funktionaaliset solut sairauden vaivaamissa elimissä. Nisäkkäät, joissa on tällaisia sairauksia, eivät usein pysty tuottamaan proteiineja tai hormoneja, jotka ovat tarpeen homeostaasin säilyttämiseksi, ja vaativat yleensä lukuisia eksogeenisiä ai-20 neita selviytyäkseen. Terveiden elinten tai solujen siirtäminen nisäkkääseen, joka kärsii tällaisesta sairaudesta, voi olla tarpeen nisäkkään hengen pelastamiseksi. Tämän tyyppistä terapiaa pidetään yleisesti viimeisenä vaihtoehtona muuten kuolemaan johtavan sairaustilan parantamiseksi. 25 Keho kuitenkin usein hylkii tällaisia siirrännäisiä johtuen immuunivasteesta, joka alkaa vasteena vieraalle kudoksella tai soluille. Nykyään ainoa turvautuminen taistelemaan tätä immuunivastetta vastaan on antaa kroonisia ei-spesifisiä immunosupressioaineita. Valitettavasti tämä vain vaihtaa 30 yhden kroonisen sairauden komplikaatiot toisiin komplikaatioihin, joita immunosupressioaine aiheuttaa.

Yksi sairaus, jota tiedemiehet ovat yrittäneet hoitaa elin- ja/tai solusiirrännäisillä erittäin rajoittuneella onnistumisella, on sokeritauti. Sokeritauti on yleinen 35 degeneratiivinen sairaus nisäkkäissä. Sille on tunnusomaista insuliinierityksen suhteellinen tai täydellinen puute 2 beta-soluilla haiman Langerhansin saarekkeissa tai puutteellisilla insuliinireseptoreilla.

Tämä insuliinin puute estää veren glukoositasojen normaalia säätelyä ja johtaa usein hyperglykemiaan ja keto-5 asidoosiin. Nisäkkäälle annettuna insuliini edistää glukoosin käyttöä, proteiinisynteesiä, neutraalien lipidien muodostumista ja varastointia ja tiettyjen solutyyppien kasvua .

Yksinomaan Yhdysvalloissa on noin 13 miljoonaa dia-10 beetikkoa. Näistä 2,6 miljoonaa on insuliinista riippuvaisia diabeetikkoja. Drug Market Dev., 4_:210 (1994). Tervey- denhuoltoanalyytikot arvioivat, että diabeteksen kustannukset ovat 92 miljardia dollaria vuodessa, mikä aiheutuu lää-kekuluista ja menetetystä tuottavuudesta.

15 Diabeteksen erilaisia muotoja on järjestetty katego- riasarjoiksi, jonka kehitti National Insitutes of Healthin National Diabetes Data Group. Tyypin I diabetes tässä luoki-tuskaaviossa käsittää potilaat, jotka ovat riippuvaisia insuliinista ketoosin ehkäisemistä varten. Tätä diabeetikkojen 20 ryhmää kutsuttiin aikaisemmin nuoruusiän diabetekseksi, brittle-diabetekseksi tai ketoosiin taipuvaiseksi diabetekseksi. Tyypin I diabeteksen aiheuttaa autoimmuunireaktio, joka aiheuttaa beta-solujen täydellisen tuhoutumisen.

Tyypin II diabetes luokitellaan aikuisiän diabeeti-25 koina. Diabeettipotilas voi olla tai ei ole insuliinista riippuvainen. Tyypin II diabeteksen voi aiheuttaa lukuisat tekijät. Useimmille nisäkkäille, joilla on tyypin II diabetes, beta-saarekesolut ovat puutteellisia insuliinin erityksessä .

30 Nykyisin käytetään monia terapioita hoitamaan dia betesta, kullakin on kuitenkin rajoituksensa. Suurin ongelma, joka kohtaa useimpia potilaita, joilla on sokeritauti, on että nykyisin käytettävissä olevat terapiat eivät onnistu ehkäisemään sairausprosessin komplikaatioita. Yleisin 35 tyypin I diabeteksen hoitomenetelmä nisäkkäillä on insuliinin endogeenisen lähteen tarjoaminen, kuten sian, naudan 3 tai ihmisen insuliini. Insuliini-injektioterapia ehkäisee vakavan hyperglykemian ja ketoasidoosin, mutta ei täysin normalisoi veren glukoositasoja. Tämä hoito edelleen epäonnistuu ehkäisemään sairausprosessin komplikaatioita, mukaan 5 lukien ennenaikaisen verisuonien huonontumisen. Ennenaikainen verisuonien huonontuminen on diabetes-potilaiden johtava sairastavuuden syy. Lisäksi komplikaatioihin, jotka johtuvat pitkäaikaisesta diabeteksestä, kuuluvat munuaisten vajaatoiminta, verkkokalvon huonontuminen, angina pectoris, 10 valtimonkovetustauti, myokardiaalinen infarkti ja perifeerinen neuropatia.

Toinen menetelmä diabeteksen hoitamiseksi on siirtämällä haima samalla, kun annetaan kroonisia ei-spesifisiä immunosupressioaineita. Tätä hoitoa annetaan yleensä yksi-15 lölle, jolla on pitkälle edennyt diabetes, kuten yksilölle, jolla on munuaisten vajaatoiminta. Koko haiman siirtäminen voidaan tehdä onnistuneesti 75 %:n yhden vuoden eloonjää-misprosentilla, mutta haiman kirurginen siirtäminen on erittäin vaikeaa. Lisäksi koska koko elin täytyy luovuttaa, 20 ainoa käyttökelpoinen lähde on kuollut luovuttaja. Lisäksi kun syklosporiinia, yleisin elinsiirränäisiä varten käytetty immunosupressiivinen lääke, annetaan annoksessa, joka on tarpeen tukahduttamaan immuunivaste, lääke inhiboi hai-masolun toimintaa. Lisäksi steroidit, joita annetaan usein 25 elinsiirrännäisen kanssa, tekevät usein potilaasta diabeet-tisen.

Kolmas hoito käsittää Langerhansin saarekesolujen siirtämisen diabetes-potilaaseen. Saarekesiirrännäinen on yleensä epäonnistunut johtuen saarekesiirrännäisten agres-30 siivisesta immuunihyljinnästä. (Gray, 1991, Immunology Letters 2_9:153; Jung et ai. , 1990, Seminars in Surgical Oncology 6:122). Erityisesti, eristettyjen haiman saarekesolujen onnistunut siirtäminen on ollut erittäin vaikea saada aikaan johtuen immunosuppressiivisten lääkkeiden, joita vaa-35 ditaan ehkäisemään siirtämistä seuraavaa solujen hylkimistä, kroonisesta antamisesta. Nämä immunosupressiivisten 4 lääkkeiden annokset voivat aiheuttaa lisääntynyttä alttiutta infektiolle, kohonnutta verenpainetta, munuaisten vajaatoimintaa ja kasvainten kasvua. Lisäksi, toisin kuin useimmat elinsiirrännäiset, saarekesolujen täytyy kasvattaa oma 5 verilähteensä implantaation jälkeen isännässä, jotta solut selviytyisivät. Tavanomaiset siirrännäistekniikat eivät tarjoa tarpeellisia tekijöitä stimuloimaan uusien verisuonien tuotantoa.

Tämä keksintö vähentää monia ongelmia, jotka liit-10 tyvät nykyisiin terapioihin kroonisia sairauksia varten, jotka tuhoavat elintärkeiden elinten toiminnallisia soluja. Tämä keksijä on aikaisemmin osoittanut saarekesolujen allo-transplantaattien ja vierassiirrännäisten laajaa toiminnallista selviytymistä kiveksessä. (Selawry et ai, 1989, Dia-15 betes 3_8:220). Yllättäen on havaittu, että immunologisesti etuoikeutettu kohta voidaan luoda nisäkkäässä siirtämällä Sertoli-soluja ei-kiveskohtaan nisäkkäässä. Juuri luotu immunologisesti etuoikeutettu kohta sallii solujen, jotka tuottavat biologisia tekijöitä, jotka ovat käyttökelpoisia 20 sairauksien hoidossa, erityisesti diabeteksen, siirtämisen ja eloonjäämisen.

Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö koskee menetelmää ex vivo -solujen toipumisen ja jakautumisen lisäämiseksi käsittäen mainittu-25 jen solujen yhteisviljelyn Sertoli-solujen kanssa sellaisen ajan ja sellaisissa olosuhteissa, jotka ovat riittävät saamaan aikaan mainitun toipumisen ja jakautumisen.

Piirrosten lyhyt kuvaus

Kuvio 1 esittää glukoosivasteet oraalisille susta-30 kaalitoleranssikokeille, jotka tehtiin apinalla "Lucky" aikavälein ennen haimanpoistoleikkausta (Lucky-pre); haiman-poistoleikkauksen jälkeen, mutta ennen transplantaatioita (Lucky-post); ja aikavälein transplantaation jälkeen (143, 730 ja 930 vrk, vastaavasti).

5

Kuvio 2 esittää C-peptidivasteet oraaliselle susta-kaalitoleranssikokeelle samoilla aikaväleillä kuin kuviossa 1 on kuvattu.

Kuvio 3 esittää glukoosivasteet oraalisille susta-5 kaalitoleranssikokeille apinassa "Oscar".

Kuvio 4 esittää glukoosivasteet samassa eläimessä ja samoilla aikaväleillä kuin kuviolle 3 esitetään.

Kuvio 5a ja 5b esittää kiveksensisäisten saarekeal-lotransplantaattien vaikutuksen seerumin glukoositasoihin 10 ja insuliinivasteet oraaliselle glukoosille spontaanisti diabeettisissa BB/Wor dp -rotissa. Kuvio 5a esittää plasman glukoosipitoisuudet (mg/dl) vasteessa oraaliselle glukoosin antamiselle 2 g/kg 50-%:ista glukoosiliuosta kolmessa ryhmässä rottia: hoitamattomat kontrolli Sprague Dawley, 15 transplantoidut diabeettiset BB/Wor dp ja insuliinilla hoi detut diabeettiset BB/Wor dp -rotat. Kuvio 5b esittää seerumin insuliinitasot vasteessa samalle annokselle oraalista glukoosia hoitamattomissa kontrolli Sprague Dawley ja transplantoiduissa BB/Wor dp -rotissa.

20 Kuviot 6a ja 6b esittävät kiveksensisäisten saare- keallotransplantaattien vaikutuksen plasmaglukagonin eri-tysvasteilla oraaliseen glukoosiin ja glukoosin ja glipit-sidin yhdistelmään spontaanisti diabeettisissa BB/Wor dp -rotissa. Kuvio 6a esittää plasman glukagonivasteet 2 g/kg 25 50-%risen glukoosiliuoksen oraaliselle antamiselle kolmessa ryhmässä rottia: hoitamattomat kontrolli Sprague Dawley, transplantoidut diabeettiset BB/Wor dp ja insuliinilla hoidetut diabeettiset BB/Wor dp -rotat. Kuvio 6b esittää plasman glukagonivasteet 7 mg/kg glipitsidiä ja 2 g/kg 50-%:ista 30 glukoosiliuosta oraaliselle antamiselle, annettuna 30 minuuttia myöhemmin, kolmessa ryhmässä rottia: hoitamattomat kontrolli Sprague Dawley, transplantoidut diabeettiset BB/Wor dp ja insuliinilla hoidetut diabeettiset BB/Wor dp -rotat. Tietopisteet ovat kahdeksan eläimen keskiarvo ± SE 35 kussakin ryhmässä.

6

Kuvio 7 esittää valomikroskooppikuvan haiman Lan-gerhansin saarekkeista ja eristetyistä rotan Sertoli-soluista, jotka on siirretty diabeettisen rotan munuaisen subkapsulaariseen tilaan.

5 Kuvio 8 esittää siirretyssä saarekkeessa olevan yk sittäisen solun elektronimikroskooppikuvan.

Kuvio 9 esittää elektronimikroskooppikuvan saarekkeen ulkoisten solujen, jotka on merkitty "S" kuviossa 7, hienosta rakenteesta.

10 Kuvio 10 esittää porsaan saarekkeiden ja Sertoli- solujen siirtämisen munuaiskapselin alapuolelle vaikutuksen seitsemän siirrännäisen saaneen naarasrottavastaanottajan keskimääräiseen vuorokauden virtsan ulostuloon. Kukin pylväs esittää keskimääräistä vuorokauden virtsan ulostuloa 10 15 vuorokauden jakson aikana transplantaation jälkeen.

Kuvio 11 esittää porsaan saarekkeiden ja Sertoli-solujen siirtämisen ihon alle vaikutuksen kolmen rotan keskimääräisiin vuorokauden virtsatilavuuksiin 50 vuorokauden jakson aikana.

20 Kuvio 12 esittää valomikrovalokuvan porsaan Langer- hansin saarekkeista ja rotan Sertoli-soluista, jotka on siirretty diabeettisen rotan munuaisen subkapsulaariseen tilaan. IL esittää beta-solujen saarekkeiden (IL) läsnäolon ympäröitynä pienten lymfosyyttien tunkeutumisella munuais-25 kapselin (K) alle; B (ylhäällä vasemmalla) esittää suuremmassa suurennoksessa, että saarekkeet (IL) koostuvat beta-soluista, ja B (alhaalla oikealla) osoittaa, että beta-solut sisältävät karakteristisia insuliinijyväsiä.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 30 Tässä kuvataan menetelmä sairauden hoitamiseksi, joka johtuu biologisen tekijän puutteesta nisäkkäissä, joka menetelmä käsittää Sertoli-solujen ja solujen, jotka tuottavat biologista tekijää, antamisen nisäkkäälle. Kuten on määritelty, biologinen tekijä on proteiini- tai ei-35 proteiiniyhdiste, joka on välttämätön solumetabolialle ja homeostaasille. Edullisessa toteutusmuodossa biologinen te- 7 kijä on hormoni. Hormonia tuottaviin soluihin, jotka voidaan antaa käyttäen kuvattua menetelmää, kuuluvat esimerkiksi haiman Langerhansin saareke-, aivolisäke-, maksa-, lisäkilpirauhas- ja kilpirauhassolut.

5 Sertoli-solut ja solut, jotka tuottavat biologista tekijää, voivat olla samasta lajista kuin hoidettava nisäkäs tai eri lajista. Lisäksi Sertoli-soluja ja soluja, jotka tuottavat biologista tekijää, ei tarvitse johtaa samasta lajista. On osoitettu, että Sertoli-soluja sioista yhdessä 10 Langerhansin saarekkeen sioista kanssa voidaan käyttää sokeritaudin hoidossa rotissa. Edullisessa toteutusmuodossa Sertoli-solut ovat naudan, sian tai ihmisen.

Sertoli-solut, jotka ovat vallitsevia uroksen kivesten soluja ja joita käytetään tässä kuvatussa menetel-15 mässä, voidaan erottaa muista kivessoluista, kuten Leydig-soluista, siementiehyitä ympäröivistä soluista ja sukusoluista, käyttäen tavanomaisia tekniikoita. Esimerkiksi urosnisäkkään kivekset, kuten karjun tai pässin, otetaan ensin talteen kuohitsemalla. Sitten kivekset pilkotaan 20 useisiin paloihin ja myöhemmin pestään sentrifugoimalla.

Kiveksen Leydig-solut voidaan poistaa kudossuspen-siosta käyttäen digestointiaineita, kuten trypsiiniä ha DNaasia. Jäljelle jäävä solususpensio pestään sitten sentrifugoimalla useita kertoja. Pelletti suspendoidaan uudel-25 leen kollagenaasiin, inkuboidaan ja pestään sentrifugoimalla, jolloin eliminoidaan kiveksissä olevat siementiehyitä ympäröivät solut. Kivessukusolut voidaan poistaa inkuboi-malla pellettiä hyaluronidaasin ja DNaasin kanssa. Useiden sentrifugointipesujen jälkeen Sertoli-solut voidaan ottaa 30 talteen siirtämistä varten käyttäen tämän keksinnön menetelmää .

Biologinen tekijä on proteiini- tai ei-proteiiniyhdiste, joka on poissa, puuttuva tai muuttunut sairaustilassa. Solut, jotka tuottavat biologista tekijää, 35 voidaan eristää esimerkiksi poistamalla nisäkkäästä ensin kirurgisesti kudos, joka tuottaa tekijää. Tämä kudos pilko- 8 taan myöhemmin ja digestoidaan käyttäen tavanomaisia tekniikoita. Esimerkiksi kudos voidaan digestoida käyttäen kollagenaasidigestointia. Tiettyä tekijää tuottavat solut voidaan myöhemmin ottaa talteen digestointiseoksesta käyt-5 täen erotusgradienttia, kuten Ficoll-gradienttia. Sitten tekijää tuottavia soluja kasvatetaan kudosviljelmässä seerumissa käyttäen tavanomaisia tekniikoita. Tekijää tuottavia soluja voidaan viljellä yhdessä Sertoli-solujen kanssa kudosviljelmässä. Kudosviljelmässä kasvatetut solut voidaan 10 siirtää nisäkkääseen Sertoli-solujen yhteydessä käyttäen tämän keksinnön menetelmää. Tekijää tuottavat solut voidaan varastoida käyttäen erilaisia tavanomaisia menetelmiä, kuten solujen kylmäsäilöntää ennen kudosviljelmässä kasvatusta myöhempää transplantaatiota varten. On havaittu, että 15 Sertoli-solut, joita viljellään yhdessä tekijää tuottavien solujen kanssa, kuten saarekesolujen, lisäävät solujen jakautumista ja tekijää tuottavien solujen toipumisnopeutta kudosviljelmässä ja erityisesti lisäävät tekijää tuottavien solujen, toipumisnopeutta ja jakautumista, jotka solut on 20 aikaisemmin varastoitu käyttäen tekniikoita, kuten kylmäsäilöntää.

Edullisessa toteutusmuodossa tekijä on hormoni, ja hormonia tuottavat solut eristetään kudoslähteestä, kuten edellä on kuvattu. Esimerkiksi insuliinia tuottavat solut 25 eristetään haimasta. Toisessa edullisessa toteutusmuodossa tekijää tuottavat solut tarjotaan muuttamalla sopivat isän-täsolut nukleiinihapolla, joka pystyy ilmentämään kiinnostavaa tekijää. Muutetut solut tarjotaan alan ammattimiehen tuntemilla menetelmillä, ja ne voidaan löytää lukemattomis-30 ta oppikirjoista ja laboratorionisäkkäistä, mukaan lukien julkaisun Sambrook et ai. (1989) Molecular Cloning: A Labo ratory Mammal, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring, New York. Jos tarpeen, nukleiinihappo, joka koodaa kiinnostavaa tekijää, voidaan muokata alan ammattimiehen 35 tuntemilla menetelmillä vaikuttamaan tekijän eritykseen muutetusta solusta. Sertoli-solujen käyttö tekijää tuotta- 9 vien solujen yhteydessä sallii immunologisesta etuoikeutetun kohdan tuottamisen hoidettavassa nisäkkäässä.

Tekijää tuottavien solujen ja Sertoli-solujen antaminen nisäkkääseen suoritetaan tavanomaisilla tekniikoilla.

5 Edullisessa toteutusmuodossa antaminen tapahtuu transplantaatiolla ja tekijää tuottavat solut injektoidaan nisäkkääseen samanaikaisesti tai heti Sertoli-solujen injektion jälkeen samaan kohtaan. Eksogeenista biologista tekijää voidaan antaa tekijää tuottavien solujen ja Sertoli-solujen 10 siirtämisen jälkeen kunnes siirretyt solut tuottavat terapeuttisesti tehokkaan määrän biologista tekijää. Diabeteksen hoitamiseksi, esimerkiksi insuliinia voidaan antaa haiman saarekesolujen ja Sertoli-solujen siirtämisen jälkeen, kunnes siirretyt saarekesolut tuottavat terapeuttisesti te-15 hokkaan määrän insuliinia.

Tämän keksinnön Sertoli-solut ja tekijää tuottavat solut voidaan siirtää käyttäen mitä tahansa tekniikkaa, joka pystyy viemään solut nisäkkääseen, kuten parenteraalista antamista tai ihonalaista antamista kirurgisen altistuksen 20 jälkeen halutulle kohdalle. Ennen transplantaatiota vas-taanottajanisäkäs nukutetaan käyttäen paikallispuudutusta tai yleisnukutusta tavanomaisen tekniikan mukaisesti. Edullisessa toteutusmuodossa hoidettava nisäkäs on ihminen. Toisessa toteutusmuodossa tämä menetelmä sairauden hoitami-25 seksi käsittää lisäksi immunosupressiivisen aineen antami sen, kuten esimerkiksi syklosporiinin, takrolimuksen, des-pergualiinin ja monoklonaalisten vasta-aineiden, esim. T-soluihin. Edullisessa toteutusmuodossa immunosupressiivinen aine on syklosporiini. Toisessa edullisessa toteutusmuodos-30 sa syklosporiini annetaan annoksessa 0,5 - 200 mg/kg kehon paino. Edullisimmassa toteutusmuodossa syklosporiini annetaan annoksessa 5-40 mg/kg kehon paino.

On havaittu, että Sertoli-solujen ja tekijää tuottavien solujen antaminen johtaa immunologisesti etuoikeute-35 tun kohdan luomiseen hoidettavassa nisäkkäässä. Immunologisesti etuoikeutettu kohta, kuten on määritelty tällä kek- 10 sinnöllä, on kohta nisäkkäässä, jossa immuunivaste, joka tuotetaan vasteena siirretyille soluille, estetään johtuen immunosupressiivisista aineista, joita Sertoli-solut tuottavat. Immunologisesti etuoikeutetuille kohdille on tunnus-5 omaista käytettävissä oleva verilähde, jolloin tarjotaan ravintoa siirretyille soluille ja tiiviille kudokselle, jolloin siirretyt solut pidetään toistensa läheisyydessä. Esimerkkeihin immunologisesti etuoikeutetuista kohdista, kuten tässä keksinnössä on määritelty, kuuluvat munuaisen 10 subkapsulaarinen tila, ihonalainen pinta, aivot ja maksa- porttilaskimo.

Tämän keksinnön mukaisesti on osoitettu, että Sertoli-solut lisäävät astetta, jolla siirretyt tekijää tuottavat solut suonittuvat transplantoidussa kohdassa. Siksi 15 on osoitettu, että Sertoli-solut (so. relevantit aineet, joita Sertoli-solut tuottavat) edistävät siirrettyjen solujen, esimerkiksi saarekesolujen, lisääntynyttä suonittu- misastetta.

Allotransplantaatit kuvaavat kudosten tai solujen 20 siirtämistä kahden geneettisesti erilaisen saman lajin nisäkkään välillä. Termi vierassiirrännäiset kuvaa kudosten tai solujen siirtämistä kahden eri lajin nisäkkään välillä.

Siirretyt Langerhansin saarekesolut ja Sertoli-solut, joita käytetään kuvatussa menetelmässä, voidaan val-25 mistaa käyttäen mitä tahansa määrää tavanomaisia tekniikoita. Esimerkiksi Langerhansin saarekesolut voidaan valmistaa useiden saman lajin nisäkkäiden haimoista. Haimat yhdistetään, pilkotaan ja digestoidaan käyttäen kollagenaasia. Langerhansin saarekesolut voidaan edelleen eristää käyttäen 30 tavanomaisia gradientteja. Kun saarekesolut on eristetty, niitä voidaan kasvattaa viljelmässä ja sitten siirtää yhdessä Sertoli-solujen kanssa luomaan immunoetuoikeutettu kohta.

Sertoli-solut, joita käytetään tässä kuvatussa me-35 netelmässä, voidaan eristää urosnisäkkään kiveksistä. Saarekesolujen talteen ottamiseksi kivekset pilkotaan ensin 11 useiksi paloiksi ja pestään sitten sentrifugoimalla. Ley-dig-solut, jotka ovat läsnä raakaseoksessa, voidaan poistaa kudossuspensiosta käyttäen digestointiaineita, kuten tryp-siiniä ja DNaasia. Jäljelle jäävä solususpensio pestään 5 sitten sentrifugoimalla useita kertoja. Seuraavaksi pelletti voidaan suspendoida uudelleen kollagenaasiin, inkuboida ja pestä sentrifugoimalla, jolloin eliminoidaan kiveksissä olevat siementiehyitä ympäröivät solut. Kivessukusolut voidaan poistaa inkuboimalla pellettiä hyaluronidaasin ja 10 DNaasin kanssa. Useiden sentrifugointipesujen jälkeen Ser-toli-solut voidaan ottaa talteen transplantaatiota varten.

Sertoli-solut voidaan siirtää luomaan immunoetuoi-keutettu kohta nisäkkääseen käyttäen erilaisia tekniikoita. Esimerkiksi kun nisäkäs on nukutettu, Sertoli-solut voidaan 15 injektoida kudosmassaan luoden siten immunoetuoikeutettu kohta.

Sertoli-solut annetaan määrässä, joka on tehokas tarjoamaan immunologisesti etuoikeutetun kohdan. Tällainen tehokas määrä määritellään sellaiseksi, joka estää myöhem-20 min tai yhdessä annettujen solujen, jotka tuottavat biologista tekijää, immuunihylkimisen. Immuunihylkiminen voidaan määrittää esimerkiksi histologisesti tai solujen tuottaman tekijän funktionaalisella arvioinnilla.

Edullisessa toteutusmuodossa Sertoli-solut annetaan 25 määrissä, jotka vaihtelevat 101 - 1010 soluun. Edullisemmassa totetusmuodossa annetaan 105 - 1010 solua.

Solut, jotka tuottavat biologista tekijää, annetaan terapeuttisesti tehokkaassa määrässä. Alan ammattimies voi määrittää sopivan määrän soluja, jotka tuottavat biologista 30 tekijää, alalla tunnetuilla menetelmillä. Solujen määrä riippuu solujen tuottaman tekijän määrästä ja tekijän tunnetusta terapeuttisesti tehokkaasta määrästä, joka on tarpeen hoitamaan sairautta. Esimerkiksi 1 - 1 000 saare- kesolua grammaa kehon painoa kohti voidaan antaa hoitamaan 35 diabetestä käyttäen allotransplantaatteja, 20-1 000 saa-rekesolua grammaa kehon painoa kohti voidaan antaa hoita- 12 maan diabetesta käyttäen vierassiirrännäisiä. Toisessa edullisessa toteutusmuodossa 5 - 100 saarekesolua grammaa kehon painoa kohti annetaan hoitamaan diabetesta. Edulli-simmassa toteutusmuodossa 5-20 saarekesolua grammaa kehon 5 painoa kohti annetaan, käyttäen allotransplantaatteja, ja 100 - 1000 saarekesolua grammaa kehon painoa kohti annetaan vierassiirrännäisille.

Toisessa toteutusmuodossa tämä menetelmä diabeteksen hoitamiseksi käsittää edelleen immunosupressiivisen ai-10 neen antamisen, kuten esimerkiksi syklosporiinin, takroli-muksen, despergualiinin ja monoklonaalisten vasta-aineiden, esim. T-soluihin. Edullisessa toteutusmuodossa immunusu-pressiivinen aine on syklosporiini. Toisessa edullisessa toteutusmuodossa syklosporiini annetaan annoksessa 0,5 -15 200 mg/kg kehon paino. Edullisimmassa toteutusmuodossa syk losporiini annetaan annoksessa 5-40 mg/kg kehon paino.

Yleisemmin, immunosupressiivinen aine voidaan antaa ajan, joka on riittävä sallimaan siirrettyjen saarekkeiden olevan toiminnallisia. Tämä jakso laajenee pisteestä ennen 20 tai heti saarekkeiden siirtämisen jälkeen pisteeseen, jolloin solut pystyvät tuottamaan terapeuttisesti tehokkaat määrät insuliinia. Edullisessa toteutusmuodossa riittävä ajan jakso antamaan immunosupressiivista ainetta on noin 40 - 100 vuorokautta saarekkeiden siirtämisen jälkeen.

25 Edullisemmassa toteutusmuodossa riittävä ajanjakso on noin 50 - 60 vuorokautta.

Toisin kuin tunnetussa tekniikassa kuvatut diabetes-terapiat, tässä kuvattu menetelmä diabeteksen hoitamiseksi estää sairausprosessin komplikaatioita, eikä johda 30 haitallisiin sivuvaikutuksiin, jotka liittyvät tavanomaiseen diabetes-terapiaan. Lisäksi tässä kuvattu menetelmä saarekesolujen siirtämiseksi tarjoaa välttämättömät tekijät saarekesiirrännäisten verisuonien syntyä varten.

Menetelmää immunologisesti etuoikeutetun kohdan 35 luomiseksi nisäkkäässä kuvataan edelleen. Immunologisesti etuoikeutettu kohta luodaan siirtämällä eristettyjä Serto- 13 li-soluja nisäkkääseen määrässä, joka on tehokas luomaan immunologisesti etuoikeutettu kohta. Edullisessa toteutus-muodossa annetaan 101 - 1010 solua. Edullisemmassa toteutus-muodossa annetaan 105 - 1010 solua. Edullisessa toteutusmuo-5 dossa Sertoli-solut siirretään munuaisen subkapsulaariseen tilaan tai ihonalaiseen pintaan injektiolla. Edullisessa totetusmuodossa nisäkäs on ihminen ja Sertoli-solut ovat ihmisen tai sian.

Keksintö koskee menetelmää ex vivo -solujen parane-10 misen ja jakautumisen lisäämiseksi, joka menetelmä käsittää mainittujen solujen viljelemisen yhdessä Sertoli-solujen kanssa sellaisen ajan ja sellaisissa olosuhteissa, jotka ovat riittäviä saamaan aikaan lisääntyneen paranemisen ja jakautumisen.

15 Havainnollistamaan lisää tätä keksintöä suoritet tiin kokeet, jotka on kuvattu seuraavissa esimerkeissä. Tulisi ymmärtää, että keksintö ei rajoitu tässä kuvattuihin spesifisiin esimerkkeihin tai yksityiskohtiin. Esimerkeissä kuvatuista kokeista saadut tulokset esitetään mukana ole-20 vissa kuvissa ja taulukoissa.

Esimerkki 1

Kuudelle koiras Rhesus-apinalle siirrettiin saare-keallotransplantaatteja niiden kiveksiin, jolloin tutkittiin näiden siirrännäisten hengissä pysymistä. Vastaanotta-25 jista tehtiin diabeettisia lähes totaalisen haimanpoisto-leikkauksen keinoilla, mitä seurasi kaksi viikkoa myöhemmin laskimonsisäinen injektio 35 mg streptotsotosiinia/kg kehon painoa. Tämä menettely johti vaikean sokeritaudin aiheuttamiseen. Plasman glukoositasot olivat ylimäärässä 400 mg/dl 30 ja eläimet olivat ketoottisia. Puutteellinen imeytyminen estettiin VIOKÄSE®:n oraalisella antamisella, yksi tabletti annettiin kahdesti vuorokaudessa ennen kutakin ruokaa.

Saarekkeet eristettiin naaras Rhesus-apinoista. Ensin viiden eläimen haimat poistettiin, yhdistettiin ja pil-35 kottiin hienoksi pienemmiksi palasiksi. Kollageenidiges-toinnin jälkeen vesihauteessa 37 °C:ssa saarekkeet erotet- 14 tiin avoerityskudoksista ja muista solujätteistä ainakin kahdella Ficoll-gradientilla, jotka oli valmistettu peräkkäin. Saarekkeet pestiin kolme kertaa sentrifugoimalla jääkylmässä Hanksin puskurissa ja sitten poimittiin käsin ja 5 siirrettiin 150 ryhmissä biologisen asteen Petri-maljoille. Kukin malja sisälsi 6 ml viljelyväliainetta CMRL-1066, jota oli täydennetty 5 % vasikansikiöseerumilla, glukoosilla pitoisuudessa 250 mg/dl, penisilliinillä (100 U/ml) ja streptomysiinillä (100 pg/ml). Saarekkeiden inkubointi suoritet-10 tiin 35 °C:ssa 5-%:isessa C02:ssa ja ilmassa 4-6 vuorokauden ajan. Saarekkeet siirrettiin tuoreeseen väliaineeseen 48 tunnin aikavälein.

Saarekkeiden elinkykyisyyttä ja laskentaa helpotettiin väriaine dititsonin pidättymisen keinoilla. Kukin api-15 na sai keskimäärin noin 104 saareketta/kg kehon paino in jektoituna molempiin kiveksiin. Ensimmäisissä kolmessa eläimessä kivekset kohotettiin vatsaonteloon, kun taas lopuissa kolmessa vastaanottajassa siirretyt elimet ankkuroitiin nivuskanavaan. Syklosporiinia (CsA) annettiin vaihte-20 levissä annoksissa ensimmäiselle kolmelle siirrännäisen saaneelle eläimelle 30 vuorokauden jakson aikana, kun taas loput kolme isäntää saivat 7 injektiota CsA:ta (20 mg/kg) vuorokausina -4 ja +3. Oraaliset sustakaalitoleranssikokeet tehtiin päivänä 30 ja sitten aikavälein normoglykeemisissä 25 eläimissä seuraavasti.

Apinat majoitettiin yksittäin häkkeihin ja niille annettiin standardi apinaruokaa ja hedelmiä kahdesti vuorokaudessa. Lisäksi haimaentsyymi sekoitettiin ruuan kanssa, koska apinoille oli tehty haimanpoistoleikkaus niiden teke-30 miseksi diabeettisiksi ennen transplantaatiota.

Koetta edeltävänä yönä eläimiä paastotettiin 12 tunnin ajan. Seuraavana aamuna klo 8 ne sitten nukutettiin ja valmistettiin koeateriaa varten. Sustakaalia käytettiin koeaineena. Sustakaali koostuu hiilihydraattien, proteiini-35 en ja rasvan fysiologisesta seoksesta, joka jäljittelee lä- 15 heisesti standardiateriaa ja joka on voimakas ärsyke insuliinin vapautumista varten.

Sustakaali injektoitiin suoraan nukkuvan eläimen vatsaan nenämahalaukkuputken kautta. Verinäytteet saatiin 5 sitten 0, 15, 30, 60, 90, 120 ja 180 minuutin kuluttua.

Näytteet sentrifugoitiin ja seerumia varastoitiin -20 °C:ssa, kunnes mittaukset insuliinia ja C-peptidiä varten voitiin suorittaa. C-peptidi on erittäin herkkä leima beta-solutoiminnalle. Tulokset esitetään kuvissa 1-4.

10 Kuvio 1 esittää glukoosivasteen oraalisille susta- kaalitoleranssikokeille, jotka tehtiin apinalla "Lucky" aikaväleillä ennen haimanpoistoleikkausta (Lucky-pre); hai-manpoistoleikkauksen jälkeen, mutta ennen transplantaatiota (Lucky-post); ja aikavälein transplantaation jälkeen (143, 15 730 ja 930 vrk, vastaavasti).

Voidaan helposti ymmärtää, että eläimestä tuli vaikeasti diabeettinen sen haiman poiston jälkeen (Lucky-post) . Transplantaation jälkeen glukoosivasteet palautuivat normaaleille tasoille kaikissa mitatuissa aikaväleissä 20 (143, 730 ja 930 vuorokautta transplantaation jälkeen).

Lucky ei osoittanut todisteita siirrännäisen epäonnistumisesta. Siirrännäisen epäonnistumisessa glukoositasoista tulisi kohonneita ja lähestyisivät niitä, jotka havaittiin sen haimanpoistoleikkauksen jälkeen.

25 Kuvio 2 esittää C-peptidivasteet oraaliselle susta- kaalitoleranssikokeelle samoilla aikaväleillä kuin kuviossa 1 on esitetty. Haimanpoistoleikkauksen jälkeen C-peptidi-vasteista tuli heikentyneitä, mikä osoittaa vaikeaa diabetesta. Mutta transplantaation jälkeen tasot eivät vain pa-30 lautuneet normaaleiksi, vaan näyttivät osoittavan "ylireagoivaa" C-peptidin vapautumisen mallia ja tasot, jotka tehtiin 730 vuorokautena, ylittivät normaalit tasot kaikissa mitatuissa pisteissä. Kohonneet tasot voivat johtua siitä tosiasiasta, että kiveksestä vapautunut insuliini menee 35 systeemiseen verenkiertoon. Vastakohtana haimasta vapautunut insuliini menee porttilaskimoon ja kulkeutuu heti mak- 16 saan, jossa noin 60 % hajotetaan ensimmäisen kauttakulun aikana. Systeemiseen verenkiertoon vapautunut insuliini saavuttaa maksan paljon myöhemmin, siitä kohonneet tasot. Kuten glukoosipitoisuuksien tutkimuksessa oli ilmeistä, 5 C-peptidivasteet eivät osoittaneet todisteita epäonnistumisesta 30 kuukautta transplantaation jälkeen.

Kuvio 3 osoittaa glukoosivasteet oraaliselle susta-kaalitoleranssikokeille apinassa "Oscar". Haiman poiston jälkeen siitä tuli vaikeasti diabeettinen kohonneilla glu-10 koositasoillaan. Saarekkeiden siirtämisen jälkeen glu-koosivasteista tuli samanlaisia kuin niistä, jotka on määritetty ennen haiman poistoa. Glukoositasot säilyvät normaaleilla tasoilla 32 kuukautta transplantaation jälkeen.

Kuvio 4 esittää C-peptidivasteet samassa eläimessä 15 ja samoilla aikaväleillä kuin kuviolle 3 on kuvattu. Eläimestä tuli hyvin diabeettinen sen haiman poiston jälkeen ja tuloksena se osoittaa heikentyneitä C-peptidivasteita. Transplantaation jälkeen ja seuraavat 730 vuorokautta C-peptidivasteet olivat suurempia verrattuna normaaleihin. 20 930 vuorokautena transplantaation jälkeen C-peptidivas- teista on tullut jonkin verran pienempiä verrattuna normaaleihin. Huolimatta jonkin verran alemmista C-peptidita-soista eläin säilyy normoglykeemisenä.

Tämä esimerkki osoittaa, että kädellisille voidaan 25 onnistuneesti siirtää kiveksensisäisiä saarekeallotrans- plantaatteja ilman, että tarvitaan jatkuvaa immunosupres-siota, ja että kiveksensisäisten saarekeallotransplantaat-tien toiminnallinen kokonaisuus säilyy yli kahden vuoden jaksojen ajan ilman todisteita siirrännäisen epäonnistuma-30 sesta.

Esimerkki 2 Tämä tutkimus tutki insuliinin ja glukagonin eri-tysmalleja spontaanisti diabeettisissa bb/Wor dp -rotissa, joille oli siirretty vatsa-, kiveksensisäisiä, saarekesiir-35 rännäisiä. Diabeettiset BB/Wor dp -rotat saivat kiveksen- sisäiset saarekesiirrännäiset MHC-yhteensopivilta BB/Wor dr 17 -rotilta eivätkä lainkaan immunosupressiota. 74 ± 15 vuorokauden normoglykemian jakson jälkeen kolmelle eri ryhmälle (kontrollit; BB/Wor dp siirrännäisen saaneet; ja BB/Wor dp insuliinilla hoidetut) annettiin seuraavat ärsykkeet; (1) 5 oraalinen glukoositoleranssikoe (OGTT), (2) yksittäinen oraalinen annos glipitsidiä, minkä jälkeen OGTT, ja (3) ar-giniini laskimonsisäisellä infuusiolla. Tämän tutkimuksen tulokset esitetään taulukoissa 1 ja 2 ja kuvissa 5 ja 6.

18

Taulukko 1

Metaboliset parametrit ja inmunoreaktiiviset seerumin insuliini- ja glukagonitasot kontrollissa ja siirrännäisen saaneissa ja insuliinilla hoidetuissa BB/Wor dp -rotissa 5 ,β=======^=^===^^=====^_===^===!=_=1

Kontrollit BB/Wor dp BB/Wor dp siirrännäi- insuliinilla sen saaneet* hoidetut

Plasmaglukoosi 112 ± 5 502 ± 8+ 510 ± 13 + (mg/dl): ennen terapiaa____ 2,5 kuukauden 97 ± 4 110 ± 3 350 ± 40 # jälkeen

Kesto p.t. 75 ± 6 70 ± 11 78 ± 19 OGTT (vrk)____

Painon lisäys 120 ± 6 105 ±17 48 ± 14 $ (g)____

Paaston plas- 21,9 ± 3 20,4 ±2 ND

mainsuliini (μυ/ml)____

Paaston plas- 37,8±5,7 43,4±4,6 47,4±4,9 maglukagoni (pg/ml)___ *Normoglykemian kesto siirränäisen saamisen jälkeen (vrk) = 279 ± 25; +P < 0,0001 vs. kontrolli; #P < 0,0001 vs. siirrännäisen saanut; 10 $P < 0,02 vs. siirrännäisen saanut.

19

Taulukko 2

Haiman ja kivesten insuliini- ja glukagonipitoisuus kontrollissa ja siirrännäisen saaneissa ja insuliinilla hoidetuissa BB/Wor dp -rotissa

Kontrollit BB/Wor dp BB/Wor dp siirrännäi- insuliinilla _ sen saaneet hoidetut

Haima (mg) 1573 ± 171 757 ± 122__920 ± 32_

Insuliini 66 ± 5,03 0,58 ± 0,18 0,76 ± 0,12 (μσ/g)____

Glukagoni 4,1 ± 0,35* 4,9 ± 0,33** 6,9 ± 0,80 (ng/mg)____

Kivesfrakti- 493 ± 49,6 582 ± 59,2 430 ± 28,0 ot: (mg)____

Insuliini 0,0 59,70 ± 0,49 0,0 (ug/g)____

Glukagoni 0,0 1,4 ± 3,7 0,0 (ng/mg) *P < 0,03 ja **P < 0,08, vs. diabeettinen vastaavasti.

Kuvio 5 esittää kiveksensisäisten saarekeallotrans-10 plantaattien vaikutuksen seerumin glukoosi- ja insuliini- vasteisiin oraaliselle glukoosille spontaanisti diabeetti-sissa BB/Wor dp -rotissa. Kuvio 6 esittää kiveksensisäisten saarekeallotransplantaattien vaikutuksen plasman gluka-gonieritysvasteisiin oraaliselle glukoosille ja glukoosin 15 plus glipitsidin yhdistelmälle spontaanisti diabeettisissa BB/Wor dp -rotissa. Tämä koe osoittaa, että transplantoidut kivekset spontaanisti diabeettisissa BB/Wor dp -rotissa sisältävät sekä alfa- että beta-soluja ja että alfa- ja beta-soluilla on kyky vastata spesifisiin eritystä lisääviin ai-20 neisiin itsenäisesti.

20

Esimerkki 3 Tämä tutkimus tutki Sertoli-soluilla parannetun fraktion (SEF) vaikutusta saarekeallotransplantaatin eloonjäämiseen diabeettisten rottien munuaisen subkapsulaarises-5 sa tilassa.

Tässä tutkimuksessa käytetyt eläimet olivat PVG-rottia, jotka painoivat 150 - 200 g. Diabetes aiheutettiin yksittäisen laskimonsisäisen injektion keinoilla, 65 mg/dl streptotsotosiinia. Vain rotat, joiden plasman glukoosita-10 sot olivat ylimäärässä 400 mg/dl, transplantoitiin. Sprague

Dawley (S-D) etäissiitettyjä -rottia käytettiin saarekkeen luovuttajina. Sertoli-solun luovuttajina käytettiin 16 - 18 vuorokauden ikäisiä joko PVG- tai S-D-rottia.

Saarekkeen valmistus 15 Saarekkeet valmistettiin London et ai. (1990)

Transplantation, _49:1109-1113 menetelmän modifikaation mukaisesti. Saarekkeet puhdistettiin Ficoll-gradienteilla ja eristettyjä soluja inkuboitiin sitten 4 vuorokautta 37 °C:ssa kostutetussa 5-%:isen C02:n ja ilman atmosfääris-20 sä ennen käyttöä. Mitään erityisiä yrityksiä tyhjentää saarekkeet kontaminoivista matkustajaleukosyyteistä ei tehty.

Sertoli-soluilla parannetun fraktion valmistus

Hyvin puhdistetut Sertoli-solujen valmisteet eristettiin nuorten urosten kiveksistä Cheng et ai., J. Bio!. 25 Chem., 2_6:12768-12779, menetelmän mukaisesti. Kivekset poistettiin, pilkottiin useiksi paloiksi ja asetettiin 50 ml kartiomaiseen putkeen, joka sisälsi 50 ml Hamin F12/DMEM väliainetta. Paloja pestiin kerran sentrifugoimal-la kierrosnopeudella 800 x g 2 minuutin ajan. Supernatantti 30 aspiroitiin ja kudos suspendoitiin uudelleen 40 ml:aan väliainetta, joka sisälsi 40 mg trypsiiniä ja 0,8 mg DNaasia steriilissä 250 ml:n erlenmeyerkolvissa. Kolvi asetettiin 37 °C:n oskilloivaan inkubaattoriin 60 - 90 värähtelyä/min 30 minuutin ajan. Tämä vaihe poisti Leydig-solut. Tiehyet 35 siirrettiin sitten 50 ml:n kartiomaiseen putkeen ja sentri-fugoitiin kierrosnopeudella 800 x g 2 minuutin ajan. Super- 21 natanttifraktio aspiroitiin ja pelletti suspendoitiin uudelleen 40 ml:aan 1 M glysiiniä, 2 mM EDTA:ta, joka sisälsi 0,01 % soijapaputrypsiini-inhibiittoria ja 0,8 mg DNaasia, ja inkuboitiin huoneenlämpötilassa 10 minuutin ajan. Tämä 5 vaihe liuotti kaikki jäljelle jääneet Leydig-solut. Soluja pestiin sentrifugoimalla 2 minuutin ajan ja vaihe toistettiin kahdesti, tai kunnes väliaine ei enää ollut samea. Pelletti suspendoitiin uudelleen homogenisoimalla varovasti lasisella pasteur-pipetillä 40 mlrssa väliainetta, joka si-10 sälsi 20 mg kollagenaasia erlenmeyerkolvissa, ja inkuboitiin 37 °C:ssa 5 minuutin ajan 60 - 90 värähtelyä/min. So-lususpensiota sentrifugoitiin kierrosnopeudella 800 x g kahden minuutin ajan ja pelletti suspendoitiin uudelleen homogenisoimalla varovasti lasisella pasteur-pipetillä 40 15 ml:ssa väliainetta, joka sisälsi 40 mg kollagenaasia ja 0,2 mg DNaasia erlenmeyerkolvissa, ja inkuboitiin 37 °C:ssa 30 minuutin ajan 60 - 90 värähtelyä/min. Sitten solut pestiin sentrifugoimalla 2 minuutin ajan, ja menettelyä toistettiin ainakin kolme kertaa, jolloin eliminoitiin siementiehyitä 20 ympäröivät solut. Solut suspendoitiin uudelleen homogeni soimalla varovasti lasisella pasteur-pipetillä 40 mlrssa väliainetta, joka sisälsi 40 mg hyaluronidaasia ja 0,2 mg DNaasia, ja inkuboitiin 37 °C:ssa 30 minuutin ajan 60 - 90 värähtelyä/min. Solut pelletoitiin lempeällä sentrifugoin-25 nilla 2 minuutin ajan ja pestiin ainakin viisi kertaa, jolloin eliminoitiin sukusolut. Saatu SEF suspendoitiin uudelleen 0,25 ml:aan väliainetta ja siirrettiin heti vastaanot-tajarottaan. Kukin siirrännäisen saanut rotta sai ekvivalentin kokonaismäärän Sertoli-soluja sisällytettynä yksit-30 täiseen kivekseen.

Rottien transplantaatio

Diabeettinen rotta nukutettiin metoksifluraanilla USP steriilissä vetokaapissa ja jätettiin kylki avattuna, jolloin paljastettiin munuainen. Sertolilla parannettu 35 fraktio, joka sisälsi noin 5 miljoonaa Sertoli-solua, injektoitiin ensin munuaiskapseIin alle. Solut voitiin nähdä 22 maitomaisena kuplana kapselin alla. Heti jälkeenpäin yhteensä 10 saareketta/g kehon paino injektoitiin samaan maitomaiseen kuplaan. Neula vedettiin pois hitaasti siirrettyjen solujen vuodon estämiseksi. Syklosporiini (CsA) annet-5 tiin ihonalaisesti vaihtelevissa annoksissa 20 vuorokauden jakson aikana ryhmille kaksi ja neljä. Koska siirrännäisen saaneet rotat reagoivat samalla tavalla kun lääke annettiin 20 vuorokauden tai 3 vuorokauden jakson aikana, kaikkia seuraavista ryhmistä, mukaan lukien naarasrotat, hoidettiin 10 vain kolmella injektiolla, 25 mg/kg CsA, annettuna vuorokausina 0, +1 ja +2 suhteessa siirrännäiseen. Rotat eivät saaneet muuta terapiaa.

Yhteensä 36 uros ja 21 naaras PVG-rottaa jaettiin kuuteen eri hoitoryhmään: Ryhmä 1, kontrolliryhmä, koostui 15 6 urosrotasta, joille oli siirretty vain saarekkeita S-D- luovuttajarotilta. Ne eivät saaneet SEF:ä eivätkä CsA:a. Ryhmä 2 koostui 10 rotasta, joille oli siirretty S-D-rotis-ta saatujen saarekkeiden ja CsA yhdistelmä transplantaation jälkeen, mutta SEF:ä. Ryhmä 3 koostui yhteensä 10 rotasta, 20 joille oli siirretty S-D-luovuttajarotista saatujen saarekkeiden ja PVG-luovuttajarotista saadun SEF:n yhdistelmä, mutta ei CsA:a transplantaation jälkeen. Ryhmä 4 koostui 10 rotasta, joille oli siirretty S-D-luovuttajarotista saatujen saarekkeiden ja PVG-luovuttajarotista saadun SEF:n yh-25 distelmä, ja CsA:a transplantaation jälkeen. Ryhmä 5 koostui 11 naarasrotasta, joille oli siirretty sama yhdistelmä soluja kuin ryhmälle neljä on kuvattu. Ryhmä 6 koostui 10 naarasrotasta, joille oli siirretty saarekkeiden ja SEF:n yhdistelmä, molemmat solutyypit S-D-luovuttajilta, ja CsA:a 30 transplantaation jälkeen.

Rottien transplantaation jälkeinen arviointi

Siirrännäisen saaneet rotat siirrettiin metabo-liahäkkeihin, ja plasman glukoositasot saatiin viikon välein. Virtsatilavuudet ja virtsan glukoosipitoisuudet saa-35 tiin vuorokauden välein. Rottaa pidettiin parantuneena dia- beettisesta prosessista, jos seuraavat kriteerit täytet- 23 tiin: Satunnainen plasman glukoositaso < 150 mg/dl; glu koosia virtsassa; ja välitön kääntyminen hyperglykemiaan siirretyn munuaisen kirurgisen poiston jälkeen.

Sen määrittämiseksi oliko yksikään rotista tullut 5 passiivisiksi niiden siirrännäisille, normoglykeemisiä rottia ärsytettiin toisella saarekeallotransplantaatilla, joka koostui ainakin 500 juuri valmistetusta Sprague Dawley -saarekkeesta, jotka injektoitiin vastapuolella olevaan munuaisen subkapsulaariseen tilaan. Immunosupressiota ei an-10 nettu ärsykkeen jälkeen.

SEF-transplantaation vaikutuksen naarasrottien hedelmällisyyteen tutkimiseksi yli 30 vuorokautta normogly-keemiset eläimet paritettiin PVG-urosten kanssa. Metabo-liaparametrejä, kuten edellä on esitetty, tarkkailtiin lä-15 heisesti, kuten niiden raskauksien kulkua.

Siirrettyjen kudosten rakenneanalyysi Yhteensä viideltä onnistuneesti siirrännäisen saaneelta rotalta poistettiin munuaiset transplantaatiota seu- raavina aikaväleinä. Munuaiskudoksen kiilaosat, jotka saa- 20 tiin kohdista, joihin saarekkeet ja SEF oli injektoitu, valmistettiin valo- ja elektronimikroskopialla tutkimista varten, kuten aikaisemmin on kuvattu julkaisussa Cameron et ai. (1990) Transplantation, f50 :649-653. Lyhyesti, kudoskii-loja uppokiinnitettiin 5-%:isella glutaraldehydillä 0,1 M 25 s-kollidiinipuskurissa 1 tunnin ajan, pestiin puskurissa ja jälkikiinnitettiin 1 tunnin ajan l-%:isella osmiumtetroksi-dilla 0,1 M puskurissa. Pienet kudoslohkot leikattiin kiiloista ja dehydratoitiin etyylialkoholien luokiteltujen sarjojen läpi, siirrettiin propyleenioksidiin ja upotettiin 30 Epon 812/Araldite-muovihartsiin. Paksut (0,5 pm) ja ohuet (900 mg) osat värjättiin rutiininomaisesti toluidiinisini-sellä ja uraniiliasetaatti/lyijysitraatilla vastaavasti rakenneanalyysiä varten valo- ja elektronimikroskopialla. Tulokset esitetään taulukossa 3 ja kuvissa 7-9.

24

Taulukko 3

Sertoli-solujen vaikutus saarekeallotransplantaatin eloonjäämiseen ei-immunologisesti etuoikeutetussa munuaisen subkapsu-laarisessa kohdassa 5 _____________________

Ryhmä Suku- Sertoli-solu CsA Normoglykemian kesto (n) puoli (luovuttaja- (vrk) yksilölliset ___alkuperä)___vasteet_ 1 (6) uros__-__0,0,0,0,0,0_ 2 (10) uros - + 0,0,0,0,0,0,0,130 _____> 441, > 445_ 3 (10) uros + (PVG) - 0,0,0,0,9,10,12, _____13,13,14_ 4 (10) uros + (PVG) + 19,76,58*,84*, 167*,127t,139t, _____>4181,>4221, >425t 5 (11) naa- + (PVG) + 7,11,14,28, ras >287t,>305t, >306t,>308t, >441f,>4471, _____>4571_ 6 (10) naa- + (S-D) + 8,10,96*,128*, ras >168,>172,>184, _____>193,>193,>196_ *munuainen poistettu, tärsytetty toisella saarekeallotransplantaatilla.

Ryhmä 1: Yksikään kuudesta rotasta, joille siirret-10 tiin vain saarekkeita, ilman SEF:ä ja CsA:a, ei tullut nor-moglykeemiseksi.

Ryhmä 2: Kolme kymmenestä rotasta, joille siirrettiin saarekkeet ja joita hoidettiin CsA:11a, tuli normogly-keemiseksi yli 100 vuorokauden ajaksi. Niitä kolmea normo-15 glykeemistä rottaa ärsytettiin toisella siirrännäisellä vuorokausina 116, 192 ja 197 vastaavasti. Yksi rotta palau- 25 tui hyper glykeemi seksi 130 vuorokautena, kun taas kaksi säilyi normoglykeemisenä.

Ryhmä 3: Aluksi kuusi kymmenestä rotasta, joille siirrettiin saarekkeet ja SEF, mutta ei CsA:a, tuli normo-5 glykeemiseksi, mutta niistä kaikki palautui hyperglykeemi-seksi 14 vuorokauteen mennessä.

Ryhmä 4: Kaikista kymmenestä rotasta, joille siirrettiin SEF:n ja saarekkeiden yhdistelmä ja joille annettiin myös CsA:a, tuli normoglykeemisiä. Kaksi palautui 10 spontaanisti diabetekseen vuorokausina 19 ja 76, vastaavasti. Kolmelta poistettiin munuainen vuorokausina 58, 84 ja 167 transplantaation jälkeen. Kaikista näistä kolmesta tuli hyperglykeemisiä seuraavan 24 tunnin kuluessa. Jäljelle jääneitä viittä rottaa ärsytettiin toisella saarekeallo-15 transplantaatilla vuorokausina 119, 129, 280, 342 ja 400, vastaavasti. Näistä ensimmäiset kaksi palautui diabetekseen vuorokausina 127 ja 139, vastaavasti, kun taas kolme viimeistä säilyi normoglykeemisinä.

Ryhmä 5: Kaikista yhdestätoista naarasrotasta, 20 joille siirrettiin saarekkeiden ja SEF:n yhdistelmä ja annettiin sitten CsA:a, tuli normoglykeemisiä. Näistä neljä palautui spontaanisti hyperglykemiaan vuorokautena 28. Seitsemästä normoglykeemisestä rotasta, jotka paritettiin uros PVG-rottien kanssa, kuusi tuli raskaaksi, ja näistä 25 kahdeksalla oli 1-10 pennun poikueet. Ne pystyivät hoitamaan pentuja onnistuneesti. Yhteensä seitsemää pitkään elossa pysyvää naarasta ärsytettiin toisella saarekeallo-transplantaatilla ainakin 200 vrk transplantaation jälkeen. Yksikään niistä ei palautunut hyperglykemiaan.

30 Ryhmä 6: Kymmenestä rotasta, joille siirrettiin saarekkeet ja SEF saman lajin rottaluovuttajasta, kaikista kymmenestä tuli normoglykeemisiä. Kaksi palautui hyperglyk-semiaan 10 päivään mennessä. Munuaisenpoistoleikkaus siirrännäisen poistamiseksi tehtiin kahdelle pitkään hengissä 35 säilyneelle rotalle päivinä 96 ja vastaavasti 201. Molemmat palautuivat hyperglykeemisiksi heti seuraavan 24 tunnin ku luessa .

26

Kudosmorfologia

Pitkäaikaisesta siirretystä munuaisesta saatu munu-5 aiskudos näytti rakenteellisesti normaalilta valomikroskoo-pilla (kuvio 7). Siirretyt saarekkeet tässä elimessä olivat heti munuaiskapselin alapuolella ja näyttivät myös rakenteellisesti normaaleilta. Ne osoittivat kudos- ja soluark-kitehtuurin, joka on identtinen saarekkeiden kanssa in situ 10 (kuvio 7) . Yksittäiset saarekesolut jaettiin soluryhmiin ohuilla yhdistävillä väliseinillä, jotka sisälsivät pieniä tiehyitä ja hiussuonia (kuvio 7). Näytti siltä, että useimmat saarekesolut sisälsivät eritysjyväsiä. Erotettuna elektronimikroskopialla saarekesolut identifioitiin β-solu-15 tyypiksi ultrarakenteellisesti erottuvien ja ainutlaatuisten insuliinia sisältävien eritysjyvästen mukaan lukemisella (kuvio 8). Kaikki havaitut β-soluryhmät olivat lähellä saarekkeensisäisiä hiussuonia (kuvio 8).

Siirrettyjen saarekkeiden ja munuaisperuskudoksen 20 välillä, ja suoraan niiden vieressä, oli suuri solutiheys. Valomikroskoopilla ne eivät näyttäneet olevan saarekesolu-ja, munuaissoluja eivätkä solu- tai verialkuperää (kuvio 7). Elektronimikroskoopilla havaittuna nämä solut olivat samanlaisia ultrarakenteeltaan Sertoli-solujen kanssa sii-25 nä, että niiden nukleiini oli epäsäännöllinen profiililtaan ja ne sisälsivät syviä ydinhalkioita, erottuvat tumajyväset olivat usein läsnä, ja mitokondriarakenne oli tiheä. Vaikka nämä solut eivät säilyttäneet tyypillistä Sertoli-solujen polaarisuutta in vivo, ne olivat kuitenkin identtisiä ulko-30 näöltään Sertoli-solujen kanssa in vitro, kun soluista ei tehty maljaviljelmää pohjamembraanisubstraatilla. Solut eivät yhdistyneet pohjamembraaniin ja ne näyttivät satunnaisesti järjestäytyneiltä (kuvio 9). Soluja, jotka osoittivat joko suku- tai Leydig-solujen ultrarakennepiirteitä, ei ha-35 vaittu.

27 Tämä esimerkki osoittaa, että immunologisesti etuoikeutettu kohta eristetyn saarekkeen siirtämistä varten voidaan luoda uros ja naaras diabeettisissä vastaanottajissa Sertoli-solujen siirtämisellä ilman jatkuvan immunosu-5 pression tarvetta.

Esimerkki 4 Tämä tutkimus määritti erilaisten saarekevieras-siirrännäisten eloonjäämisen erilaisissa ei-immunologisesti etuoikeutetuissa elinkohdissa koe-eläimissä.

10 Saarekkeet valmistettiin nuorista porsaista seuraa vasti: Käytettiin yksinomaan urosporsaita, jotka eivät painaneet enempää kuin 2,2 kg. Porsas nukutettiin ja veren päästämisen jälkeen sekä haima että kivekset otettiin talteen steriileissä olosuhteissa. Kollagenaasiliuos, joka 15 koostui 2 mg/ml kollagenaasi tyypistä XI (Sigma), injektoitiin suoraan haimaan. Haimaa inkuboitiin 37 °C:ssa 17 minuutin ajan ja digestoidut kudokset pestiin kolme kertaa sent-rifugoimalla ja 1 ml: n erät siirrettiin kukin Petri-maljoille. Saarekkeita inkuboitiin 32 °C:ssa kudosviljelyvä-20 liaineessa 199, jota oli täydennetty 10 % hevosen seerumilla, kuuden vuorokauden ajan.

Seitsemäntenä päivänä viljellyt saarekkeet otettiin talteen ±4 000 erissä ja kylmäsäilöttiin käyttäen standardi-menettelyä. Soluja varastoitiin nestemäisessä typessä 25 -96 °C:ssa 2-4 viikon jaksojen ajan. Saarekkeet poistet tiin nestemäisestä typestä ja sulatettiin käyttäen vakiintunutta menetelmää. Sulaneet saarekkeet siirrettiin Petri-maljoille ja viljeltiin yhdessä porsaan Sertoli-solujen kanssa kolmen vuorokauden ajan 32 °C:ssa samassa 199 vilje-30 lyväliaineessa kuin edellä on kuvattu. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet sulatettujen saarekkeiden, joita on viljelty Sertoli-solujen ollessa läsnä, parantuneen eloon-j äämisprosentin.

Kolmantena päivänä sulatuksen jälkeen saarekkeet 35 poimittin käsin ja laskettiin, ja yhteismäärä 12 saareket-ta/g kehon paino siirrettiin naaras diabeettisiin Sprague 28

Dawley -rottiin. Yhteensä 5 miljoonaa Sertoli-solua, jotka saatiin porsaan kiveksistä, siirrettiin samanaikaisesti samaan sijaintiin. Saarekkeiden siirtämistä varten testattaviin elinkohtiin kuuluvat: a] munuaisen subkapsulaarinen ti-5 la, b] ihon alla ja c] maksa. Transplantaation jälkeen rottia hoidettiin syklosporiinilla seuraavasti: 25 mg/kg 7 vuorokauden ajan; 15 mg/kg 5 vuorokauden ajan; 10 mg/kg 5 vuorokauden ajan; 5 mg/kg vielä 13 vuorokauden ajan. Päivänä 30 lääke lopetettiin.

10 Eristettyjen porsaan saarekkeiden elinkykyisyyden ja toiminnallisen kokonaisuuden osoittamiseksi tehtiin seuraa-vat tutkimukset: a) solujen värjäys dititsonilla, väri on erittäin spesifinen insuliinille; b) solujen värjäys 0,4-%:isella tryptaanisinisellä, joka osoittaa saarekkeiden 15 elinkykyisyyden; ja c) 5 saarekkeen erien viljely insuliinin eritystä lisäävien aineiden ollessa läsnä, kuten alhaiset ja korkeat glukoosipitoisuudet tietyillä aikaväleillä viljelyn, kylmäsäilönnän ja sulatuksen jälkeen. Tulokset esitetään taulukossa 4.

29

Taulukko 4

Insuliinin eritys (mikroyksikkö/ml) inkuboiduista ja kyl-mäsäilytetty-sulatetuista saarekkeista, jotka tehtiin viljelyn päivinä 3, ja 7, ja vastaavasti 14 5

Insuliinin vapautumisen mikroyksiköt 5 saareketta kohti eristämistä ja inku-bointia seuraavina päivinä __3 vrk__7 vrk_ 14 vrk

Inkuboidut saarek- 15,3 ± 3,8 21,8 ± 1,1 17,29 ± 2,4 keet ennen kyl-mäsäilöntää: a] Alhainen glu- koosi (90 mg/dl)____ b] Korkea glukoosi 32,2 ± 5,4 37,14 ± 3,4 23,3 ± 1,8 (300 mg/dl)____

Kylmäsäilötyt ja 14,52 ± 2,8 7,13 + 1,3 5,38 ± 2,02 sulatetut saarekkeet : a] Alhainen glu- koosi (90 mg/dl)____ b] Alhainen glu- 10,31 ± 2,8 9,17 ± 2,6 8,38 ± 0,41 koosi + Sertoli- solut_____ 30

Taulukko 5

Sian saarekkeiden saanto 1, 3 ja 7 vuorokauden viljelyn jälkeen ja 7 vuorokauden viljelyn aikana menetettyjen saarekkeiden prosenttiosuus

Sika nro BW (kg) Haiman Dl-saa- D3-saa- D7- Menetetyt paino g rek- rek- saarek- saarekkeet keet/g keet/g keet/g % D7/D1 haima haima haima 1 1,6 1,79 36 536 31 659 27 212 26 2 2,0 1,89 37 272 32 962 27 883 25 3 __2^3__2,46_ 29 268 26 046 20 884 29 4 1,8 1,66 39 904 37 726 31 664 21 5 __1/3__1,76_ 37 846 34 578 30 046 21 6 _ 1,6 1,74 39 866 37 888 32 424 19 7 1,4 1,61 42 126 39 456 33 872 20 8 __2^3__2,48_ 33 682 29 334 24 892 26 9 _ 2,1 2,28 43 478 41 226 37 394 14 10 _ 2,1 2,09 40 126 36 448 33 282 17 11 __2Λ_ 2,12 31 248 27 170 26 415 15 12 __2/L__1,98__38 848 36 465 29 293 25_ 13 __2/!_ 2,06 29 146 37 446 31 709 19 14 _ 2,2 2,24 27 892 25 028 21 342 23 15 __2/7__2,69_ 44 610 38 364 31 524 29_ 16 __1/5__1,44_ 42 222 40 414 31 244 26

Keskiar- 2,0 ± 2,0 ± 37692 + 34513 ± 29442 ± 22,1 ± 1,2 vo + SE 0,3 0,4 1233 1307 1119 %

Taulukko 6

Saarekkeiden toipuminen pakastuksen ja sulatuksen jälkeen

Sertoli-solujen ollessa läsnä ja poissa 31

Saarekkeet yksinään Saarekkeet + Sertoli- _____solut_

Saarek Ennen Sula- Toipu- Ennen Sula- Toipu- keiden kylmää tuksen minen kylmää tuksen minän nro jäi- (%) jäi- (%) ___keen____ keen D3F/ 25Θ- 152 61 290 212 73 D3T______ __230 131 57__260 228 88 __440__278__63__430__380__88 __420__366__87__410__324__79 __450__290__64__440__358 81

Kes- 66,4 % 81,8 % kiarvo D7F / 260 136 52 250 229 92 D3T____ __300__208__69__300__202__67 __280 177__63__290 238 82 __360__205__57__350__300__86 __320__218__68__390__289__74 __380 217 57__320 270 84

Kes- 61,0 % 80,8 % ___kiarvo 5

Kuten taulukossa 5 on esitetty, saarekkeiden saanto grammaa haimaa kohti oli 37 692 ± 1 233, 34 513 ± 1 307 ja 29 442 ± 1 119 viljelyn 1, 3 ja vastaavasti 7 vuorokauden kuluttua. Kylmäsäilönnän ja sulatuksen ja solujen uudel-10 leenviljelyn jälkeen Sertoli-solujen ollessa läsnä noin 20 % soluista oli vaurioitunut tai menetetty, kuten taulukossa 6 esitetään. Siten ± 24 000 saareketta/gramma sian 32 haima oli käytettävissä siirrännäistarkoituksia varten kyl-mäsäilönnän ja sulatuksen jälkeen.

Tulokset osoittivat, että insuliinin eritys heikentyi, kun glukoosia käytettiin insuliinin eritystä lisäävänä 5 aineen ennen kylmäsäilöntää. Vaikutus oli ilmeisempi kyl-mäsäilönnän ja sulatuksen jälkeen. Vaikka Sertoli-solujen läsnä ololla oli merkittäviä vaikutuksia saarekkeiden lukumäärään, joka selviytyi kylmäsäilönnästä ja sulatuksesta niiden läsnä ololla oli vähän vaikutusta saarekkeiden ky-10 kyyn vastata alhaiseen glukoosipitoisuuteen insuliinia vapauttavana aineena. Kuten esimerkissä 8 esitetään, Sertoli-solujen läsnäolo kuitenkin lisäsi insuliinin eritystä suurten glukoosipitoisuuksien ja glukoosin plus Forskolinin ollessa läsnä.

15 Esimerkki 5

Diabeettisten Sprague Dawley -rottien reaktio saarekkeiden siirtämiseen porsasluovuttajilta (erilaiset vie-rassiirrännäiset)

Rotista tehtiin diabeettisia yksittäisen i.v. in-20 jektion, 55 mg/kg streptotsotosiinia, keinoilla. Ne saivat siirrännäisen vain, jos veren sokeri oli yhtä suuri tai yli 400 mg/dl. Transplantaation jälkeen rotat asetettiin yksitellen aineenvaihduntahäkkeihin ja virtsatilavuus, virtsan glukoosipitoisuus ja kehon painot mitattiin päivittäin. Ve-25 ren glukoositasot tehtiin viikoittain. Rottaa pidettiin parantuneena diabeteksesta, jos veren glukoositaso on 160 mg/dl tai alle ja/tai päivittäinen virtsatilavuus on 15 ml tai alle.

Tulokset esitetään kuvissa 10 ja 11.

30 Kuvio 10 esittää porsaan saarekkeiden ja Sertoli- solujen transplantaation munuaiskapselin alle vaikutuksen seitsemän siirrännäisen saaneen naarasrottavastaanottajan vuorokauden virtsan ulostulon keskiarvoon. Kukin pylväs merkitsee vuorokauden virtsan ulostulon keskiarvoa 10 vuo-35 rokauden jakson aikana transplantaation jälkeen. Tutkimus on suoritettu 80 vuorokauden jakson aikana, kauimpana oike- 33 alla oleva pylväs osoittaa siten virtsan ulostulon keskiarvon vuorokautta kohti päivästä 80 päivään 89 jne.

Kuvio osoittaa, että vuorokauden virtsatilavuuden keskiarvo ensimmäiselle 60 vuorokaudelle vaihteli 19,7 5 ml:sta 27 ml:aan tai diabeettisella alueella. Voidaan helposti ymmärtää, että virtsatilavuudet pienenivät lähes normaalitasoille vain päivästä 70 päivään 89. Vastaavat plasman glukoositasot ensimmäisen ja viimeisen 10 vuorokauden jakson aikana olivat 474 ± 46 ja vastaavasti 155 ± 70 10 mg/dl.

Nämä tulokset osoittavat, että transplantaation porsaan saarekkeilla ja Sertoli-soluilla jälkeen rotat osoittivat todisteen siirrettyjen saarekkeiden eloonjäämisestä. Palautuminen normoglykemiaan vei noin 80 vuorokaut-15 ta.

Tulisi huomata, että yksi parantuneista rotista on raskaana ja se on ollut normoglykeeminen koko raskauden ajan.

Kuvio 11 esittää porsaan saarekkeiden ja Sertoli-20 solujen transplantaation ihon alle vaikutuksen kolmen rotan vuorokauden virtsatilavuuksien keskiarvoon 50 vuorokauden jakson aikana. Tulokset osoittavat, että virtsatilavuuden keskiarvo laski keskiarvosta 41,7 ml ensimmäisen 10 vuorokauden jakson aikana keskimäärin 12,3 ml:aan viidennen vii-25 kon aikana. Vastaavat glukoositasot olivat 509 ± 45 ja vastaavasti 200 ± 12 mg/dl.

Edellä kuvatut tiedot osoittavat, että sekä munuaisen subkapsulaarista tilaa että ihonalaista aluetta voidaan käyttää kohtana luomaan immunologisesti etuoikeutettu kohta 30 saarekevierassiirrännäisten transplantaatiota varten.

Esimerkki 6 Tämä tutkimus määritti viljeltyjen Sertoli-solujen vaikutuksen erilaisten saarekevierassiirrännäisten eloonjäämiseen diabeettisissa rotissa minimi aikaisella ekso-35 geenisellä immunosupressiolla.

34

Saarekkeiden valmistus

Vastasyntyneet porsaat, iältään alle seitsemän vuorokautta, tapettiin anestesialla ja saarekkeet eristettiin Kuo C. Y., Burghen G. A., Myvacle A. ja Herrod H. G. (1994) 5 "Isolation of islets from neonatal pig pancreativ tissue", J, Tissue Culture Methods, 1_6:1-7, menetelmän mukaisesti. Lyhyesti, haimoja venytettiin kollagenaasiliuoksen injektiolla, 2 mg/ml kollagenaasi tyyppi Xl viljelmäväliaineessa DMEM. 17 minuutin 39 °C:ssa inkuboinnin jälkeen digestoidut 10 fragmentit pestiin sentrifugoimalla ja digestoitua kudosta inkuboitiin sitten 32 °C:ssa yhden viikon ajan väliaineessa 199, jota oli täydennetty 10 % hevosen seerumilla ja 1 % antibiooteilla. Saarekkeita kylmäsäilöttiin sitten Lakey J. R. T., Warnock G. L., Kneteman N. M., Ao Z., Rajotte R.V. 15 (1994) "Effects of Pre-cryopreservation culture on human islet recovery and in vitro function", Transplant Proc., .26:820, menetelmän mukaisesti ja varastoitiin nestemäisessä typessä -196 °C:ssa. Kolme vuorokautta ennen transplantaatiota kylmäsäilötyt saarekkeet sulatettiin nopeasti ja vil-20 jeltiin 32 °C:ssa kahden vuorokauden ajan. Yksi vuorokausi ennen transplantaatiota joitakin saarekkeita otettiin talteen ja viljeltiin yhdessä Sertoli-solujen kanssa 24 tunnin ajan.

Sertoli-solun eristys 25 Nuorten S-D-rottien kivekset poistettiin ja Ser- toli-solut eristettiin Cheng C. Y. ja Bardin C. W. (1987) "Identification of two testosterone-responsive proteins in Sertoli cell-enriched culture medium whose secretion is suppressed by cells of the intact seminiferous tubule." J^_ 30 Biol. Chem., 262:12768-12779, menetelmällä. Lyhyesti, ki vekset digestoitiin ensin DMEM:ssä, joka sisälsi 1,0 % trypsiiniä, ja sitten DMEM:ssä, joka sisälsi 1,0 % kolla-genaasia, tyyppi 1, 15 minuutin jaksojen ajan 37 °C:ssa.

Puhdistettuja Sertoli-soluja viljeltiin 37 °C:ssa 35 DMEM/F12:ssa, jota oli täydennetty transferriinillä, 10 pg/ml, FSH:lla 10 ng/ml, insuliinilla 20 pg/ml ja 1,0 % 35 FCS:llä, kolmen vuorokauden ajan. Transplantaatiota varten Sertoli-solut ja saarekkeet yhdistettiin ja rotille siirrettiin joko yhdistelmä, joka koostuu 5 x 106 Sertoli-solusta ja 3 000 saarekkeesta, tai saarekkeet yksinään (15 5 saareketta/g kehon paino).

Rottien transplantaatio

Naaras S-D-rotat, jotka painoivat 170 - 200 g tehtiin diabeettisiksi yksittäisen i.v. injektion, 60 mg/kg streptotsotosiinia, keinoilla. Yhteensä 31 diabeettista 10 rottaa jaettiin kolmeen ryhmään ja ne saivat siirrännäisen seuraavasti: Ryhmä 1, kontrolliryhmä (n=8), sai yhteensä 15 saareketta/g kehon paino injektoituna munuaiskapselin alle. Sertoli-soluja ei siirretty. Transplantaation jälkeen rottia hoidettiin syklosporiinilla 55 vuorokauden ajan: 25 15 mg/kg 3 vuorokauden ajan, 15 mg/kg 10 vuorokauden ajan, 10 mg/kg 10 vuorokauden ajan ja 5 mg/kg seuraavien 32 vuorokauden ajan. Sitten immunosupressio lopetettiin. Kukin rotta sai lisäksi 1 - 3 U Ultralente-insuliinia vuorokauden välein, jos 24 tunnin virtsan glukoosipitoisuus ylitti 1 g. 20 Insuliiniterapia lopetettiin päivänä 55. Ryhmälle 2, kudos- kontrolliryhmä (n=8), annettiin munuaisen subkapsulaarinen injektio, joka on yhdistelmä noin 5 x 106 Sertoli-solusta ja 3 000 saarekkeesta. CsA:a ei annettu. Insuliinia annettiin kuten edellä on kuvattu. Ryhmälle 3, koeryhmä (n=15), 25 siirrettiin sekä Sertoli-soluja että saarekkeita ja sitten hoidettiin CsA:lla ja insuliinilla edellä kuvatun suunnitelman mukaisesti.

Rottien transplantaation jälkeinen arviointi

Plasman glukoositasot saatiin viikon välein. 24 30 tunnin virtsatilavuudet ja virtsan glukoosipitoisuudet tallennettiin päivittäin. Rottaa pidettiin parantuneena dia-beettisesta prosessista, jos seuraavat kriteerit täytettiin: plasman glukoositaso yhtäsuuri tai alle 10 iranol/1, 24-tunnin virtsatilavuus alle 15 ml ja välitön kääntyminen 35 hyperglykemiaan seuraa siirretyn munuaisen kirurgista pois- 36 toa. Yksi normoglykeeminen rotta paritettiin päivänä 69, jolloin testattiin sen kykyä tulla raskaaksi.

Siirretyn kudoksen rakennealanyysi

Kahdelta normoglykeemiseltä rotalta poistettiin mu-5 nuainen päivinä 117 ja 330 ja siirretty kudos valmistettiin valo- ja elektronimikroskopiaa varten. Selawry H. P., Cameron D. F. (1992) "Sertoli cell-enriched fractions in successful islet cell-transplantation", Cell Trans. , 2p 123-129. Lyhyesti, kudoskiiloja upotuskiinnitettiin 5-%:isella gluta-10 raldehydillä 0,1 M kollidiinipuskurissa 1 tunnin ajan, pestiin puskurissa ja jälkikiinnitettiin 1 tunnin ajan l-%:isella osmiumtetroksidilla 0,1 M puskurissa. Pienet ku-doslohkot leikattiin kiiloista ja dehydratoitiin etyylialkoholien luokiteltujen sarjojen läpi, siirrettiin propyleeni-15 oksidiin ja upotettiin Epon 812/Araldite-muovihartsiin. Paksut (0,5 pm) ja ohuet (900 mg) osat värjättiin rutiininomaisesti toluidiinisinisellä ja uraniiliasetaatti/lyijysit- raatilla vastaavasti rakenneanalyysiä varten valo- ja elektronimikroskopialla .

20 Sertoli-solujen ja syklosporiinin vaikutuksen tulokset sian saarekesolujen ksenografisen transplantaation diabeettisten naarasrottien munuaisen subkapsulaariseen tilaan eloonjäämiseen esitetään taulukossa 7.

_Taulukko 7_

Ryhmä (n) Sertoli- CsA Siirrännäisen hen- solut gissä pysyminen ___ (päivää) 1 (8)__-__+__0,0,0,0,0,0,0,0 2 (8)__+__-__0,0,0,0,0,0,0,0 3 (15) + + 0,0,0,0,0, 71, 77, 96, 117*, 148#, >154, >165, >327, ____330*_ 25 *rotat, joilta on poistettu munuainen vierassiirrännäisen poistamiseksi #rotat, jotka kuolivat sydänpunktion aikana 37

Kuten taulukossa 7 esitetään, yksikään rotista, joille siirrettiin vain saarekkeet ja sitten annettiin CsA ja alhainen annos insuliinia (Ryhmä 1), ei tullut merkittävästi vähemmän hyperglykeemiseksi. Lisäksi yksikään rotis-5 ta, joille siirrettiin saarekkeiden ja Sertoli-solujen yhdistelmä, mutta ilman CsA:a, ei osoittanut minkäänlaista hyperglykemian paranemista (Ryhmä 2). Viidestätoista rotasta, joille siirrettiin saarekkeet ja Sertoli-solut ja sitten annettiin CsA:a (Ryhmä 3), 10 osoitti todisteen dia- 10 beettisen tilan kääntymisestä. Neljä kymmenestä on silti normoglykeemisiä yli 154, 165, 165 ja vastaavasti 327 vuorokauden jakson ajan. Normoglykeemisistä rotista, joilta poistettiin munuainen päivinä 117 ja 330, tuli heti hyper-glykeemisiä. Niiden plasman glukoositasot olivat 4,9 mmol/1 15 ja 8,2 mmol/1, ennen, ja vastaavasti 20,7 mmol/1 ja 32,2 mmol/1 munuaisenpoistoleikkauksen jälkeen. Naarasrotta, joka paritettiin 69 päivänä, tuli raskaaksi ja synnytti yhteensä 10 pentua 89 päivänä, joista kaikksi se hoiti onnistuneesti samalla, kun se pysyi normoglykeemisenä. Se kuoli 20 148 päivänä sydänpunktion seurauksena. Kolme kymmenestä ro tasta palautui hyperglykemiaan päivinä 71, 77 ja vastaavasti 96, lyhyen euglykemian jakson jälkeen.

Nämä tulokset osoittavat, että pitkittynyt erilaisen saarekevierassiirrännäisen (sialta rotalle) hengissä 25 pysyminen voidaan saada aikaan naaras diabeettisissa rotissa. Saarekevierassiirrännäisten hengissä pysyminen riippui kahdesta tekijästä, jotka oli annettava samanaikaisesti: Transplantaatio yhdessä Sertoli-solujen kanssa ja käsittely syklosporiinilla.

30 Transplantaatiota sian saarekkeen ja rotan Sertoli- soluj en yhdistelmällä seuraavien kokonaisvirtsatilavuuksien vaste, joka mitattiin 10 vuorokauden välein 80 vuorokauden jakson aikana seitsemälle parantuneelle rotalle, osoitti keskimääräisen vuorokauden virtsatilavuuden 27,0 ± 13,0 35 ml/rotta ensimmäisen 10 vuorokauden jakson aikana, mikä 38 laski hitaasti keskiarvoon 12,0 ± 4,0 ml/rotta 70 vuorokautta transplantaation jälkeen.

Kuviossa 10 esitetyt kudosmorfologiatutkimukset osoittavat, että munuaisperuskudoksen kudos- ja solurakenne 5 näytti normaalilta rotassa, jolle oli tehty munuaisenpois-toleikkaus 117 päivänä transplantaation jälkeen. Normaalilta näyttävät saarekkeet, joissa oli rakenteellisesti selvästi erotettavat B-solut, olivat näkyviä hyvin suonittu-neilla munuaiskapselin alapuolella olevilla alueilla. Li-10 säksi normaalilta näyttäviä Sertoli-soluja havaittiin siirrettyjen saarekkeiden vieressä yhdessä lukuisten lymfosyyttien kanssa. Yhtään plasmasolua ei identifioitu transplan-taatiokohdassa. Elinkykyisiä umpierityssoluja havaittiin samalla tavalla rotan, jolle oli tehty munuaisenpoistoleik-15 kaus 330 päivänä transplantaation jälkeen, munuaisen sub-kapsulaarisessa tilassa.

Nämä tutkimukset osoittavat, että erilaisen saare-kevierassiirrännäisen hengissä pysymisen merkittävä pitkittyminen voidaan saada aikaan ilman jatkuvaa immunosupres-20 siota. Nämä tutkimukset osoittavat, että mekanismi, jolla Sertoli-solut edistävät saarekevierassiirrännäisen hengissä pysymistä on kolmiosainen: (1) Sertoli-solut stimuloivat transplantaation aikana vaurioituneiden saarekkeiden toipumista (so. parantavat viljeltyjen saarekkeiden saantoa ja 25 toimintaa), (2) Sertoli-solut suojaavat siirrettyjä saarek keita immunologiselta hylkimiseltä tuottamalla tekijöitä, jotka voimakkaasti estävät T-solujen lisääntymistä, ja (3) Sertoli-solut suojaavat siirrettyjä saarekkeita syklospo-riinin toksisilta vaikutuksilta.

30 Esimerkki 7 Tämä tutkimus osoittaa menetelmän sian haimasaarek-keiden eristämiseksi ja kylmäsäilömiseksi tulevia ksenogra-fisia transplantaatteja varten nisäkkäissä.

Luovuttajina käytettiin urosporsaita, < 7 vuorkau-35 den ikäisiä ja 2± kg painavia. Haimat, jotka painoivat 1,4 ± 0,3 g, otettiin talteen ja injektoitiin DMEM-liuoksella, 39 joka sisälsi 2 mg/ml kollagenaasia XI. Venytettyä haimaa inkuboitiin ravisteluvesihauteessa 39 °C:ssa 17 minuutin ajan. Digestoitu kudos suodatettiin 500 gm ruostumatonta terästä olevan suodattimen läpi ja suodokset pestiin 3x 5 kylmällä DMEM:llä. Ilman lisäpuhdistusta soluja viljeltiin Ml99:ssä ja 10-%:isessa hevosen seerumissa 32 °C:ssa 7 vuorokauden ajan. Saarekesolut kylmäsäilöttiin sitten käyttäen standardimenetelmiä. Täsmällisesti mainituilla aikaväleillä saarekkeet sulatettiin ja viljeltiin Ml99:ssä, sekä läsnä-10 ollessa että urosporsaiden kiveksistä eristettynä standardimenetelmän mukaisesti.

Funktionaalisen kapasiteetin testaamiseksi saarekkeista, joita viljeltiin 3 ja 7 vuorokautta, arvioitiin insuliinin vapautuminen staattisessa inkuboinnissa. Erilli-15 sissä kokeissa insuliinin eritystä lisäävien aineiden vaikutus testattiin saarekkeisiin, jotka on viljelty Sertoli-solujen kanssa ja ilman. Tämän tutkimuksen tulokset esitetään taulukoissa 8 ja 9.

40

Taulukko 8

Insuliinin eritystä lisäävien aineiden, glukoosin ja glukoosin plus Forskolinin, vaikutus insuliinin vapautumiseen inkuboiduista ja pakastettu/sulatetuista (F/T) saarekkeista 5 sian Sertoli-solujen ollessa läsnä ja poissa

Insuliinin vapautuminen (μυ/ml/lO saareketta)_ 3,3 mmol/1 16,7 mmol/1 16,7 mmol/1 glukoosia glukoosia glukoosia + 100 μχηοΐ _ Forskolinia

Vrk 3 inku- 42,3 ± 1,2 112,8 ± 267,7 ± boitu Serto- 17,7*# 43,0**# li-solujen kanssa_ _

Vrk 3 inku- 31,3 ± 2,1 57,3 ± 3,8* 123,4 ± boitu yksin 15,3**_

Vrk 7 inku- 22,9 ± 1,9 64,5 + 153,9 ± boitu Serto- 6,4*# 14,6** li-solujen kanssa _

Vrk 7 inku- 21,3 ± 1,2 37,3 ± 6,0* 120,3 ± boitu yksin__11,4**_

Vrk 3 F/T 20,6 ± 4,3 44,9 ± 9,9* 77,1 +

Sertoli- 13,7** solujen kanssa_ __

Vrk 3 F/T 11,7 ± 2,3 27,9 ± 6,6* 54,5 ± yksin 10,7**

Anova-koe: *vs 3,3 mmol/1 p 0,05, **vs sekä 3,3 että 16,7 mmol/1 P<0,05, 10 #Sertoli-solujen kanssa vs saarekkeet yksin P<0,05

Taulukko 9

Sertoli-solujen vaikutus inkuboitujen ja pakastettu- sulatettujen sian saarekkeiden insuliinipitoisuuteen 41

Insuliinipitoisuus (μυ/10 saareketta)_

Saarekkeet yksin Saarekkeet & Ser-___toli-solut_

Inkuboitu Dl__257,0 ±19,6__391,1 ± 51,4+_

Inkuboitu D3__201,1 ± 19,1#__400,1 ± 41,0+#

Inkuboitu D7__179,1 ± 26,2#__271,9 ± 39,9+#

Pakastettu 52,4 ± 10,3 132,5 ± 35,1 D3/Sulatettu D3

Pakastettu 10,4+0,9 35,1+8,2 D7/Sulatettu D3 5 Anova: +saarekkeet + Sertoli-solut vs. saareke yksin P<0,05 #inkuboidut saarekkeet D3, D7 vs. pakastettu D3, D7 P<0,05 Nämä tulokset osoittavat, että (1) suuria määriä 10 vastasyntyneen porsaan saarekkeita voidaan eristää yksin kertaisella menetelmällä; (2) kylmäsäilöntä ja sulatus johtaa noin 40 %:n menetykseen saarekkeiden lukumäärässä Ser-toli-solujen ollessa poissa ja noin 20 %:n menetykseen Ser-toli-solujen ollessa läsnä; (3) viljellyillä saarekkeilla 15 on kyky vastata sekä glukoosiin ja glukoosi + Forskoliniin insuliinin eritystä lisäävinä aineina; (4) yhdessä viljellyn saarekkeen funktionaalinen kapasiteetti lisääntyi kaksinkertaiseksi Sertoli-solujen ollessa läsnä; (5) kylmäsäi-lönnän ja sulatuksen jälkeen saarekkeet toipuvat nopeammin 20 Sertoli-solujen ollessa läsnä ja vaste sekä glukoosille että glukoosi + Forskolinille kasvoi kaksinkertaiseksi Sertoli-solujen ollessa läsnä.