KR100354931B1 - 췌도의 대량 배양증식 및 증식한 췌도에 의한 당뇨치료방법 - Google Patents

췌도의 대량 배양증식 및 증식한 췌도에 의한 당뇨치료방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 췌도의 배양증식 및 이 증식한 췌도의 이식에 의한 당뇨병 치료에 관한 것으로 쥐의 췌장 또는 사람의 췌장으로부터 바로 분리하여 증식시키지않은 후레쉬 췌도에 혈청, 라디칼 살균제인 니코틴아마이드, 만니톨, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, IGF, ITS, VeGF, 트롬빈, PDGF, IGF-1,2, EGF, 리놀레산-BSA, 항-인테그린 β1 항체, 매트리겔, HGF 및 NGF을 배양시기에 따라 요구되는 성분만을 배지에 적정량 첨가하여 3차원으로 배양하고 섬유아세포를 제거하여 3차원 형상이며 중앙에 괴사가 일어나지 않은 쥐의 췌도 및 인간의 췌도를 대량으로 제조하는 뛰어난 효과가 있고 대량으로 얻는 쥐의 췌도는 자가이식의 경우 면역거부 없이 혈당을 조절하고 특히 췌장에서 췌도를 재생시키는 뛰어난 효과가 있다.

Description

췌도의 대량 배양증식 및 증식한 췌도에 의한 당뇨치료방법{Islet proliferation and diabetes treatment methods by proliferated islet transplantation and transplantation-induced normoglycemia stimulated islet regeneration}
본 발명은 췌도의 배양증식 및 이 증식한 췌도의 이식에 의한 당뇨병치료에 관한 것이다. 더욱상세하게는, 췌장에서 분리한 췌도를 배양증식한 후 자가이식하여 혈당을 조절하는 방법에 관한 것이다.
당뇨병(diabetes)은 인슐린 의존형 당뇨병(insulin dependent diabetes)과 인슐린 비의존형 당뇨병(insulin-independent diabetes)으로 크게 나누어지지만 상기 2종의 당뇨병을 구별하는 정확한 당뇨병 발생 기작은 아직까지 밝혀져 있지 않다. 인슐린 의존형 당뇨병 환자는 인슐린을 생성하는 능력이 크게 떨어졌기 때문에 외부로부터 인슐린을 계속 공급받아야 한다. 그러나 생리적인 요구에 알맞게 인슐린을 계속적으로 공급하기란 거의 불가능하고 더욱이 체내에서는 인슐린이 농도구배(concentration gradient)로 존재하여 간문맥→간→간정맥→대동맥→근육의 순으로 인슐린 농도가 감소하고 있다. 따라서 외부로부터 인슐린을 체내로 주사하면 이러한 농도 구배가 형성되지 못하므로 부작용이 발생한다. 또 췌장의 β-세포에서는 인슐린 이외에도 11종류 이상의 물질이 분비돼 대사를 원활히 유지시키므로 인슐린만 투여하는 것은 혈당을 강하시킬 수 있지만 저혈당 방지 및 합병증 치료는 불가능하다. 당뇨병 치료를 위해 사용하는 혈당강하제는 혈당강하기능이 있으나 강하제 내성이 나타나 장시간 사용이 어렵고 신체부작용이 심하여 사용하지 않는다. 또 상기 설명한 바와 같이 인슐린은 혈당강하능력이 있고 인슐린 내성 발생빈도가 혈당강하제 보다 휠씬 낮으나 매 시기마다 인슐린 필요량이 다르므로 적절한 인슐린 투여가 불가능하고 부적절한 인슐린 투여로 인한 항체로 당뇨병이 악화되는 경향이 있다. 췌장이식은 현재 시행되고는 있으나 평생 억제제를 사용해야만 하므로 최근에는 췌도이식을 통해 신체적으로 요구하는 인슐린을 알맞게 공급하여 혈당조절을 하고 있다. 그러나 이 방법은 가용 췌장입수가 어렵고 면역거부반응이 발생하는 단점이 있다.
선진국에서는 1921년 밴팅(Banting), 비트(Beat)에 의한 인슐린 요법에 의해 약물 투여로 당뇨병을 치료하고자 하였으나 당뇨병성 합병증이 유발되어 치료가 불가능하다는 것을 인지하였고 그 후 1966년 미네소타 대학 릴리헤이(lillihei) 교수가 부분 췌장이식을 시행하고 1977년 까지 55 ~ 57명에게 췌장이식을 시행하였으나 2명만이 성공하였다. 그러나 췌장 이식후 1년 이상 장기 생존자는 10% 미만이였다. 최근에는 신장, 췌장 이식자의 경우 면역억제제를 계속 사용하는 경우에 70%의 생존율을 보이고 있고 췌도 이식의 경우는 성공률이 선진국의 경우 90% 이상에 이르고 있다. 이러한 췌도 이식에 있어서, 가장 먼저 고려해야 할 문제는 조직 공여자와 수혜자 간에 면역 거부반응이다. 이 면역 거부반응 때문에 수혜자 수에 비해 췌장 공여자 수가 항상 부족하고 일반적으로 50명 췌장 공여자가 있으면 1명에게 이식할 수 있어서 매우 비능률적이다. 또 분리한 췌도를 바로 이식하면 췌도로부터 많은 섬유성 조직들이 나와서 췌도를 분할하고 분할된 췌도를 감싸므로 췌장 β-세포의 자극에 따른 인슐린 분비능력이 크게 감소한다.
본 발명자는 상기와 같은 점들을 감안하여 첫째로, 췌도가 체외에서 증식하려면 췌도 내에 있는 전구세포(stem cell 또는 progenitor cell)가 존재해야 하고 완전히 분화된 세포는 증식 가능성이 매우 낮으나 미분화 세포는 증식 가능성이 매우 높으며 다행히 췌도에는 전구세포들이 많이 존재하여 증식 가능성이 매우 높다는 점, 둘째로, 면역거부는 주로 혈액 세포에 있는 MHC class Ⅱ가 일으키지만 이 MHC class Ⅱ 항원은 췌도 세포에는 없어서 췌도 내에 있는 혈액세포를 제거하면 면역거부를 크게 줄일 수 있다는 점, 세째로, 섬유성 조직은 상피세포(fibroblast cells)에서 발생하므로 체외에서 췌도를 배양할 때 발생된 섬유성 조직은 쉽게 제거할 수 있다는 점에 착안하여 체외(in vitro)에서 췌도를 배양증식한 후 그것을 이식하여 당뇨병을 치료하고자 시도하였다. 췌장으로부터 분리한 췌도를 배양함에 있어서는 단층배양법은 최고 80% 까지 증식시켰으나 췌도의 기능면에서 질이 떨어져 이식 후 혈당에 따른 인슐린 분비가 약해 혈당조절이 불가능하다. 배양증식된 췌도가 이식에 사용될 정도가 되려면 최소한 500% 이상의 증식율을 나타내야 하고 질적인 면에서도 면역거부가 없고, 혈당에 따른 인슐린 분비기능을 갖고 있어야 한다.
본 발명자는 췌도이식에 있어서, 종래의 이와같은 문제점을 해결하고자 다수의 실험을 실시한 결과, 쥐의 췌장으로부터 분리한 췌도를 체외(in vitro)에서 배양하면 췌도 속에 있는 혈액세포들이 방출되고 오래동안 배양하면 남아있던 혈액 세포들도 죽어 면역거부를 일으키는 정도를 대폭 감소시킬 수 있으며 시험관(in vitro)내에서 특수 배양증식하여 그동안 췌도이식에 있어서 부족했던 췌도 수요를 충족시키고 또 쥐의 췌장으로부터 분리한 췌도는 이식 후 당뇨병 치료효과를 최대로 높힐 수 있음을 확인하고 동일한 방법으로 사람의 췌도를 분리하여 대량 배양하므로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 췌장에서 분리한 췌도를in vitro에서 배양증식함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기와 배양증식한 췌도를 이식하여 혈당을 조절함으로서 당뇨병을 치료함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 성장촉진인자와 라디칼 제거제를 함유하는 평판배지에 쥐로부터 분리한 췌도를 1일 배양하고 다시 항 인테그린 β-1 항체, 매트리겔을 넣고 1 ~2일 더 배양하고 이어서 췌도의 상태에 따라 적당한 성장 인자를 첨가하고 1 ~ 2일 더 배양하는 상기 과정을 몇차례 반복하여 췌도를 대량으로 배양한 후 배양한 췌도의 증식정도를 DNA를 추출하여 조사하였다. 상기와 같이 증식한 췌도의 섬유아세포를 제거한 후 혈당조절능을in vitro에서 글루코스와 함께 반응시켜 분비되는 인슐린 농도를 측정하여 조사하고 나아가in vivo에서 당뇨병에 걸린 쥐에 상기 배양 증식한 췌도를 이식한 후 혈당조절능을 조사하고 또 상기 혈당조절과정 중에 신생되는 췌도의 갯수를 계수하여 이식한 췌도가 혈당을 조절함과 동시에 췌장에서 췌도를 재생시키는 기능이 있음을 확인하였다. 이어서, 상기한 동일한 방법으로 사람의 췌도를 분리하여 배양증식하여 제공함으로서 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명의 상세한 구성 및 작용을 상세히 설명한다.
도 1은 쥐의 췌장으로부터 분리한 췌도를 라디칼제거제와 성장촉진인자를 함유하는 배지에서 1일 배양한 모습을 현미경으로 100배 확대하여 나타낸 사진도이다.
도 2는 쥐의 췌장으로부터 분리한 췌도를 라디칼제거제와 성장촉진인자를 함유하는 배지에서 1일 배양한 모습을 현미경으로 200배 확대하여 나타낸 사진도이다.
도 3은 매트리겔의 첨가에 의해 췌도가 3차원 모양을 형성하는 모습을 나타낸 사진도이다.
도 4는 항-인테그린 β1-항체에 의해 췌도가 활성화된 모습을 나타낸 사진도이다.
도 5는 HGF에 의해 산소공급이 원활히 되도록 췌도가 옆으로 성장하는 모습을 나타낸 사진도이다.
도 6a는 10일 배양하여 완전히 성장한 췌도를 위에서 본 모양의 사진도이다.
도 6b는 10일 배양하여 완전히 성장한 췌도를 옆에서 본 모양의 사진도이다.
도 7은 췌도 배양중 증식되고 있는 췌도의 DNA 양을 시간경과에 따라 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 라디칼 제거제를 첨가하지 않은 배양배지에서 배양한 췌도의 모습을 나타낸 사진도이다.
도 9a는 췌장으로부터 바로 분리하여 증식시키 않은 후레쉬 췌도에 섬유아세포가 성장하여 방출한 모습을 나타낸 사진도이다.
도 9b, 9c는 배양증식시킨 췌도의 섬유아세포를 완전히 제거한 결과를 나타낸 사진도이다.
도 10은in vitro에서 증식시킨 췌도의 글루코스 조절능을 나타낸 그래프이다.
도 11은 췌장에서 바로 분리하여 증식시키지 않은 후레쉬 췌도 1650개와 1350개를 자가이식한 후 혈당변화를 시간경과에 따라 측정한 결과이다.
도 12는 증식시킨 췌도 500개를 자가이식한 후 혈당변화를 시간경과에 따라 측정한 결과이다.
도 13은 췌장에서 바로 분리하여 증식시키지 않은 후레쉬 췌도 500 ~ 1200개를 누드 마우스의 비장에 이식한 후 혈당변화를 시간경과에 따라 측정한 결과이다.
도 14은 증식시킨 췌도 150 ~ 200개를 누드 마우스의 비장에 이식한 후 혈당변화를 시간경과에 따라 측정한 결과이다.
도 15는 췌장에서 바로 분리하여 증식시키지 않은 후레쉬 췌도가 비장에 이식되어 있는 모습을 나타낸 사진도이다.
도 16은 증식시킨 췌도가 비장에 이식되어 있는 모습을 나타낸 사진도이다.
도 17은 인간의 췌장에서 분리한 췌도를 사람 혈청이 든 배양액에서 배양증식한 모습을 나타낸 사진도이다.
본 발명은 쥐의 췌장에서 바로 분리한 후레쉬한 췌도를 쥐로부터 분리한 혈청, EGF, PDGF, 트롬빈, 라디칼제거제, VEGF, ITS, IGF-I, Ⅱ 및 항-인테그린 β1-항체, 매트리겔를 첨가한 배지에서 5 ~ 7일간 배양하는 단계; 상기 배양한 췌도의 섬유아세포와 매트리겔을 디스페이즈(dispase)로 처리하여 완전히 제거하는 단계;in vitro에서 상기 증식시킨 췌도와 대조군으로 췌장에서 바로 분리한 후레쉬한 췌도를 글루코스와 함께 배양하면서 혈당을 측정하여 증식시킨 췌도가 췌장에서 바로 분리한 후레쉬 췌도보다 혈당 조절능이 우수함을 확인하는 단계;in vivo에서 증식시킨 췌도와 대조군으로 췌장에서 바로 분리한 후레쉬한 췌도를 당뇨병이 걸린 쥐에 자가이식한 후 시간경과에 따른 혈당변화를 측정하고 재생되는 췌도의 개수를 계수하여 자가이식된 췌도가 혈당을 조절할 뿐만아니라 췌도를 재생시킴을 확인하는 단계 및; 인간으로부터 분리한 췌도를 쥐로부터 분리한 췌도와 동일한 방법으로 대량 배양증식하는 단계로 구성된다.
본 발명은 상기 구성에서도 본 바와 같이 쥐의 췌도를 분리하여 증식시키고 이를 이용한in vivo실험에서 혈당조절능과 췌도를 재생시키는 뛰어난 효과를 확인하므로써 사람의 췌도도 상기와 동일한 방법으로 증식시키고 이를 당뇨병 환자에게 적용하고자 하였다. 즉, 췌도증식기술은 유전자 조작을 이용한 기술이 아니라 쥐의 췌도를 이용하여 개발한 것으로 췌도의 생존성을 높이고, 췌도에 적합한 환경을 만들며, 성장인자를 적절한 시기에 첨가하여 췌도의 증식, 분화를 촉진시킨 것으로 그대로 사람의 췌도에 적용시켰다.
본 발명에서 사용한 성장인자, 항-자연살해 인자(anti-apoptosis factors), 항-괴사인자 및 췌도성장을 위해 첨가하는 물질로 EGF는 대부분의 상피세포를 유사분열시키는 물질(Bromberg, et al 1998)이며 HGF는 성인 췌도를 성장시키는데 주로 사용(Lefebvre.et al 1998)되며 라디칼 제거제중 니코틴아마이드는 쥐의 췌도, 사람 췌도 모두에서 일어나는 질소산화에 의한 β-세포 파괴를 방지한다. 따라서 라디칼 제거제는 인간 췌도, 쥐의 췌도 모두의 생존성을 높이는데 공통으로 사용(Kanto, et al, 1995)되며 인테그린은 트랜스막 단백질으로서 외부세포 매트릭스(extracellular matrix), 성장인자(growth factor) 들의 자극을 세포내의 사이코스켈톤에 전달하여 세포, 조직의 성장을 촉진시킨다. 실제적으로, 인테그린-β1은 쥐, 사람 모두에 공통적으로 존재한다(Ben-Zeen, et al 1994). 특히 항-인테그린 β1 항체는 인테그린-β1 항체를 집중 자극시켜 쥐, 인간 췌도 성장을 촉진하였으며 상피세포 조직인 인간 췌도 증식에 있어서 적절한 시기에 사용하는 성장 인자들은 인간의 췌도를 증식시켰다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 췌도의 배양증식 및 DNA 측정에 의한 확인
본 실시예에서는 쥐로부터 분리한 췌도를 즉시 배양증식시켰다. 이때 반드시 쥐로부터 분리한 혈청을 첨가하여야 한다. 즉, 혈청의 제조는 쥐로부터 얻은 혈액 2 ~ 5mL을 15mL 팔콘 튜브(procuct No. 352097, BectonDickinson, USA)에 넣은 후 혈액을 2 ~ 4시간 동안 상온에서 방치하였다가 3000g로 10분 동안 원심분리하고 상층액을 1.5 ~ 2mL 튜브에 옮겼다. 이를 4℃에서 하룻밤 방치하였다가 3000g로 10분간 원심분리하여 얻었으며 상층액을 -20℃에서 저장하면서 사용하였다. 먼저 DMEM 배지[1mg 피루베이트(100㎕)(Cat. No. 11360-070), GIBCOBRL, USA), 0.25㎍(100㎕) 하이드로코티손(H-0135, Sigma USA), 100unit/100㎍(1mL) 페니실린/스트렙토마이신(Cat. No 15140, GIBCOBRL, USA), 4,456mg(4㎕) β-머캡토에탄올(product No M-6250, Sigma, USA), 14.6mg(500㎕)L-글루타메이트(Cat No, 25930-081, GIBCO, USA), 238,3mg 헤퍼스 버퍼(Cat No. 15630-080, GIBCO, USA)]를 넣어 기본 배양액을 만들었다. 먼저 1일째에는 상기 기본 배양액 6mL에 혈청 600㎕와 라디칼 제거제(radical scavenger)로 만니톨(M-9546, Sigma, USA) 10-4M, 109.32㎍ 과 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(product No. s-9636, Sigma, USA) 10-4M, 187.2mg 니코틴아마이드(N-0636, Sigma, USA) 61mg를 ITS(insulin transfferin selenite)(I-1884, Sigma, USA) 30㎍, 트롬빈(T-4393, sigma, USA) 600ng, PDGF(platelet derived growth factor)(P8147, Sigma, USA) 60ng, 항괴사 및 항자연살해제로 IGF-1,2(I-3769, I-2139, sigma, USA) 각각 농도 5㎍/mL을 600ng, VeGF(Vascular endothelial growth factor)(V-7259, Sigma, USA) 12ng, 캡스파아제 저해제, EGF (E-1264, Sigma, USA) 60ng, 리놀레산-BSA(L-8384, Sigma, USA) 6mg(1mg/mL)을 함유하는 배지에 췌도 500개를 넣고 37℃에서 밤새 배양하였다. 도 1은 이를 100배 비율의 현미경으로 본 모습으로 주위에 혈액세포가 다량있음을 나타내고 도 2는 200배의 비율의 현미경으로 본 모습니다. 2일째에는 1일째에 제조하여 사용했던 기본배양액 또는 DMEM 배양액 2mL에 5mg 항-인테그린 β1 항체(Cat,No I-41720, Transduction Laboratories, USA)를 넣고 서서히 셰이킹하면서 30 ~ 150분간 배양하였다. 이어서 췌도를 매트리겔(Collaborative Biomedical product, USA) 200㎕에 섞어 24웰 플레이트에 넣어 3차원 환경을 만들어주고 상기 1일째 배양과 동일한 배지에서 배양을 1 ~ 2일간 계속하였다. 이때, 매트리겔 외에 콜라겐, 콜라겐 복합체, 테일 콜라겐으로 대체할 수 도 있다. 도 3은 매트리겔 첨가에 의해 3차원 모양으로 된 췌도의 모양이고 계속 배양을 진행시켰을 경우 도 4에 나타낸 바와 같이 항-인테그린 β1 항체에 의해 췌도가 활성화되었다. 3일째에 역시 VeGF를 제외한 상기 1일째 배양과 동일한 배양액을 추가하고 성장하는 췌도의 모양에 따라 췌도의 중앙부가 검게 변하면서 괴사가 일어날 가능성이 있는 경우는 HGF(Lot. 902287, Sigma, USA) 50ng와 NGF(N-6009, Sigma, USA) 20ng를 추가로 첨가하고 지나치게 옆으로 퍼지면 NGF 20ng, 항-인테그린 β1 항체 100ng을 추가하여 배양하였다. 도 5는 상기와 같이 HGF 처리에 의해 한쪽으로 췌도가 더 자라면서 산소공급이 원활히 이루어지고 있음을 나타낸다. 이를 더 배양하여 10일 경과했을 때 췌도는 도 6a와 도 6b에 나타낸 바와 같이 상하, 좌우로 모두 자랐음을 알 수 있었다. 이때, 배양을 계속하면서 생성되는 췌도의 양은 DNA를 추출하여 그 양을 측정함으로서 확인하였다. 배양한 췌도를 500㎕ PBS 버퍼에 넣고 얼음속에서 5초간 파쇄기로 파쇄하고 5초 동안 쉬었다가 하는 것을 반복 처리하여 30초간 파쇄하였다. 이를 4℃에서 10분간 500g로 원심분리하였다. 상등액을 다른 튜브에 넣고 -20℃에서 보관하였다. 이 상등액을 Brunk의 DNA assay 방법을 이용해 DNA 양을 측정했다. 이 결과는 도 7에 나타낸 바와 같이 DNA는 시간 경과에 따라 꾸준히 증가하였다.
비교실시예 1: 라디칼 제거제 없이 췌도 배양
본 비교실시예에서는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 쥐에서 췌도를 분리하여 배양하되 라디칼 제거제를 배지에 첨가하지 않은 상태로 배양을 실시하였다. 즉, 1일째에는 혈청 60㎕, IGF 30㎍, ITS 30㎍, VeGF 12ng, 트롬빈, PDGF, IGF-1,2, EGF, 리놀레산-BSA 만을 함유하는 배지에 췌도 500개를 넣고 37℃에서 밤새 배양하고 2일째에 역시 DMEM 배지 50mL 에 항-인테그린 β1 항체(Cat,No I-41720, TransductionLaboratories, USA) 2mL를 넣고 서서히 셰이킹하면서 30 ~ 150분간 배양하였다. 이어서 췌도에 매트리겔(collaborative Biomedical product, USA) 200㎕을 첨가하고 24웰 플레이트에서 배양하여 3차원 환경을 만들어주고 상기 1일째 배양과 동일하나 역시 라디칼 제거제가 제거된 배지에서 배양을 1 ~ 2일간 계속하였다. 3일째에 역시 VeGF와 라디칼 제거제가 제거된 상기 1일째 배양과 동일한 배지를 추가하고 배양을 계속한 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 죽은 췌도 세포가 옆으로 떨어져 나온 것을 볼 수 있었다.
실시예 2: 섬유아세포 제거 및 겔 제거
증식하지 않은 췌장에서 바로 분리한 후레쉬 췌도는 도 9a에 나타낸 바와 같이 순수하게 수집하여도 증식시키는 동안 섬유아세포가 췌도에서 자라 나오기 때문에 췌도에 이미 섬유아세포 함유되어 있음을 알 수 있다. 따라서 증식시킨 췌도에서 섬유아세포는 췌도 이식 전에 반드시 완전하게 제거하여야만 한다. 따라서. 상기 실시예 1에서 배양된 췌도의 배양배지에 디스페이즈(dispase)를 첨가하고 37℃에서 약 2 ~ 30분간 배양한 후 여러 번 아스피레이트(aspirated)하였다. 실험결과, 도 9b, 9c에 나타낸 바와 같이 증식한 췌도의 섬유아세포는 완전히 제거되었으며 췌도에 붙어있던 매트리겔 역시 완전히 제거되었다.
실시예 3: 증식시킨 췌도의 in vitro 에서 혈당조절능
증식시키지 않은 췌장에서 바로 분리한 후레쉬 췌도와 실시예 1 및 실시예 2에서 배양증식 및 섬유아세포 제거한 췌도를 1시간동안 글루코스 2.7mM, 16.7mM과 함께 각각 배양하고 분비되는 인슐린의 농도를 I251-인슐린 RIA KIT(Linco Research Inc, USA)를 사용하여 측정하였다. 실험결과, 도 10에 나타낸 바와 같이 증식시킨 췌도는 저농도 글루코스에서 거의 0에 췌장에서 바로 분리한 후레쉬한 췌도보다 훨씬 낮은 인슐린 분비반응을 보이고 고농도 글루코스에 대해서는 보다 높은 반응을 나타났다. 이는in vitro에서 증식시킨 췌도가 혈당이 높아질 경우 인슐린을 다량으로 분비하고 혈당이 낮을 경우에는 인슐린 준비를 적게 분비하여 혈당조절에 상당히 기여함을 알 수 있다. 이에 반해 췌장에서 바로 분리한 후레쉬 췌도는 혈당이 낮을 경우에 증식시킨 췌도보다 인슐린 분비가 많아 혈당조절에 문제가 있음을 나타냈다.
실시예 4: 증식시킨 췌도의 자가이식 및 혈당조절능
53 ~ 55ng/kg의 스트렙토조토신(streptozotocin:STZ)을 SD랫트 복강에 주사하고 2주일간 매일 혈당을 측정해서 250ng/mg이상이 되면 당뇨병이 걸린 랫트로 판정하여 당뇨병에 걸린 쥐를 준비하였다. 췌도는 배양증식시키기 전의 췌장에서 바로 분리한 후레쉬 췌도와 실시예 1, 2에서 배양증식 및 섬유아세포를 제거한 췌도를 각각 준비한 후 마취제(Entobal:한림제약) 60mg/kg을 당뇨병이 있는 랫트의 복강에 주사하여 마취된 랫트의 배를 갈라 복개하고 췌장에서 바로 분리한 후레쉬 췌도는 1350개, 1650개를 각각 간문맥(hepatic poral vein)에 서서히 주입하고 증식시킨 췌도는 500개를 간문맥에 서서치 주입한 후 복개 부분을 수술용 실로 꿰맨 후 베리시달(Berrycidal)로 소독하였다. 일정기간 마다 상기 랫트의 꼬리혈액 한방울을 슬립(slip)위에 놓고, 혈당농도를 일정간격을 두고 측정하였다. 실험결과, 췌장에서 바로 분리한 후레쉬 췌도 1350을 자가이식한 경우 혈당 농도는 감소하여 20일 동안 200대 값을 유지하였다가 마침내 1 ~ 2일 동안은 정상 혈당을 유지하게 되었다(도 11). 쥐를 치사시킨 후 췌도를 70개 수집하였다. 이 췌도들은 인슐린이 분비되어 디티존에 염색되었다. 바로 분리한 후레쉬 쥐의 췌도 1650은 도 11에서 보는 바와 같이 25일간 정상혈당을 유지하였다. 상기 쥐를 치사시킨 후 226개(IEQ 156)의 작은 췌도를 수집하였고 이를 디티존(dithizone)으로 염색하였으나 염색되지 않았다. 이는 정상혈당이 유지되므로 더 이상 인슐린이 분비되지 않았음을 나타낸다. 또 증식시킨 췌도는 도 12에 나타낸 바와 같이 여러번 반복실험한 결과 이식 후 10일 경과 후부터 정상 혈당을 유지하였으며 13개월동안 정상혈당을 유지하였다. 상기 쥐를 치사시킨 후 매우 큰 췌도 164(IEQ 264)개를 수집하였다. 따라서 1650의 췌장에서 바로 분리한 후레쉬 췌도는 정상혈당을 유지하는데 충분한 양이지만 1360 췌장에서 바로 분리한 후레쉬 췌도는 정상혈당을 유지하는데는 충분하지 못하였다. 그러므로 췌장에서 바로 분리한 후레쉬 췌도 1650은 정상혈당을 유지하는데 필요한 최소의 후레쉬 췌도 갯수이고 5일 증식한 췌도 500개에 해당하는 기능을 갖고 있다. 즉, 5일 증식한 췌도는 후레쉬 췌도보다 3배 크기의 혈당조절 기능을 갖고 있음을 나타내는 것이다.
실시예 5: 증식시킨 췌도의 자가이식 및 재생
상기 실시예 4에서 정상혈당을 유지하는데 필요한 최소의 후레쉬 췌도 1650개와 충분하지 않았던 1350개는 정상혈당을 유지한 25일 후, 증식시킨 췌도 500개는 정상혈당을 유지한 13개월 후에 각각의 췌도 수를 계수하고 그 크기를 살펴보았다. 본 실시예에서는 췌장 세포를 80%, 90% 정도 잘라낸 후 남은 10 ~ 20%의 췌장이 정상혈당을 유지하는 시기의 췌도 수를 계수하고 상기 실시예 4의 결과와 비교하고 췌도의 재생여부를 판별하였다. 평균계수(IEQ)는 췌도의 크기를 직경 150㎛에 기준으로 계수한 것이다. 실험결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 정상혈당을 유지하는 1, 2, 4, 5의 경우는 췌도수(IEQ)가 증가하였음을 알 수 있었다. 이는 췌도 자가이식에 의해 정상혈당이 유지되면 췌도의 재생이 일어남을 나타내는 것으로 췌도가 이식된 후 정상혈당을 유지하는 경우 당뇨병 환자는 영구적으로 당뇨병을 완치할 수 있음을 나타낸다.
자가이식한 췌도의 수 및 정상혈당을 유지하는 췌장의 췌도 수
1 2 3 4 5
췌도의 상태 80 ~ 90% 췌장 분리 후 0일 90% 췌장 분리 2개월 후 췌도 1350 이식 후 25일간 비안정적인 혈당 유지 췌도 1650 이식 후 25일간 정상 혈당 유지 증식된 췌도 500개 이식 후 13개월 동안 정상 혈당 유지
췌도 수 113(IEQ 223) 235(IEQ 505) 70(IEQ 100) 226(IEQ 168) 164(264)
췌도 크기 매우 큼 작은 췌도와 큰 췌도가 고르게 분포 작은 췌도 매우 큼
인슐린분비정도 높은 높음 높음 낮음 높음
실시예 6: 누드 마우스에 췌도 이식 및 혈당조절능
정상혈당을 회복하는데 요구되는 쥐로부터 분리한 췌도의 최소 갯수를 결정하기 위해 상기 췌도와 증식시킨 췌도 갯수에 차이를 두어 STZ-유도 식이 누드 마우스의 비장내로 이식하고 실시예 4과 같은 방법으로 누드 마우스의 혈당 수준을 측정하고 대응하는 시간을 측정하였다. 즉, 췌장에서 바로 분리한 후레쉬 췌도는 500, 600, 800, 1000, 1200개를 각각의 누드 마우스에 이식하였으며 증식시킨 췌도는 150개씩 2마리에, 180개씩 2마리에, 200개를 1마리에 이식하였다. 실험결과, 도 13과 도 14에 나타낸 바와 같이 췌장에서 바로 분리한 후레쉬 췌도의 경우는 800인 경우 재생 및 정상혈당 유지에 최소로 요구되는 양이였고 증식시킨 췌도는 150 ~ 200가 정상혈당을 유지 및 재생을 위해 충분한 수였다. 도 13과 도 14을 비교해보면in vitro에서 증식시킨 췌도는 췌장에서 바로 분리한 후레쉬 췌도보다in vivo기능면에서 3 ~ 5배 높음을 알 수 있었다. 비장에 이식한 췌장에서 바로 분리한 후레쉬 췌도는 도 15에 나타낸 바와 같았으며 증식시킨 췌도는 도 16에 나타낸 바와 같았다.
실시예 7: 인간 췌도의 배양증식
콜라게나이제 XI을 인간의 담즙관에 주사하여 췌장을 팽창시킨 후 37℃에서 17분간 반응시켜 다이제스쳔시키고 다이제스쳔된 췌장을 DMEM으로 3회 세척하고 불연속 BSA 농도구배 방법으로 췌도를 분리수집한 후 실시예 1에서 쥐의 췌도 배양에 사용한 동일한 시료와 동일한 방법으로 배양하였다. 단, 인간췌도는 인간 혈액 2 ~5mL을 팔콘 튜브에 넣고 2 ~ 4시간 동안 상온에서 방치하였다가 3000g로 10분 원심분리하여 얻은 상층액을 1.5 ~ 2mL 튜브에 옮기고 다시 하룻밤 방치하였다가 3000g로 10분간 원심분리하여 얻은 혈청을 사용하였다. 즉, 1일째에 상기 혈청 60㎕과 실시예 1에서 사용한 기본 배양액에 라디칼 제거제로 만니톨 10-4M, 109.32㎍ 과 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 10-4M, 187.2mg 니코틴아마이드 61mg를 ITS 30㎍, VeGF 12ng, 트롬빈 600ng, PDGF, IGF-1,2 각각 농도 5㎍/mL을 600ng, EGF 60ng, 리놀레산-BSA 6mg(1mg/mL)을 함유하는 배양액에 인간췌도 500개를 넣고 37℃에서 밤새 배양하고 2일째에 실시예 1과 동일한 2mL DMEM 또는 기본배양액에 항-인테그린 β1 항체 5ng를 넣고 서서히 셰이킹하면서 30 ~ 150분간 배양하였다. 이어서 췌도를 매트리겔 200㎕에 섞은 후 24웰 플레이트에서 넣어 3차원 환경을 만들어주고 상기 1일째 배양과 동일한 배지에서 배양을 1 ~ 2일간 계속하였다. 3일째에 역시 VeGF를 제외한 상기 1일째 배양과 동일한 배지를 추가하고 성장하는 췌도의 모양에 따라 췌도의 중앙부가 검게 변하면서 괴사가 일어날 가능성이 있는 경우는 HGF 50ng와 NGF 20ng를 추가로 첨가하고 지나치게 옆으로 퍼지면 NGF 20ng, 항-인테그린 β1 항체 100ng을 추가하여 배양하였다. 인간 췌도 역시 실시예 2와 동일한 방법으로 섬유아세포를 제거하였다. 도 17는 배양한 인간 췌도의 모습을 나타냈다.
이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 쥐의 췌장 또는 사람의 췌장으로부터 분리한 후레쉬 췌도에 혈청, 라디칼 살균제인 만니톨과 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 및 니코틴아마이드, IGF, ITS, VeGF, 트롬빈, PDGF, IGF-1,2, EGF, 리놀레산-BSA, 항-인테그린 β1 항체, 매트리겔, HGF 및 NGF을 배양시기에 따라 요구되는 성분만을 배지에 적정량 첨가하여 배양하고 섬유아세포를 제거하여 3차원 형상이며 중앙에 괴사가 일어나지 않은 쥐의 췌도 및 인간의 췌도를 대량으로 제조하는 뛰어난 효과가 있고 대량으로 얻는 쥐의 췌도는 자가이식의 경우 면역거부 없이 혈당을 조절하고 특히 췌도가 대부분 파괴되었던 췌장에서 췌도를 재생시키는 뛰어난 효과가 있으며 이는 인간의 췌도와 동일한 적용이 가능하므로 의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (10)

  1. 췌장으로부터 바로 분리한 후레쉬 췌도를 기본 배양액 또는 DMEM 배지에 혈청, 라디칼 살균제, 항괴사 및 항자연살해제, IGF, ITS, 트롬빈, PDGF, EGF, 리놀레산-BSA을 함유하는 배지에 넣고 37℃에서 밤새 배양하는 단계 1; 항-인테그린 β1 항체를 함유하는 DMEM 배지 또는 기본 배양액에 상기 밤새 배양한 췌도를 첨가하고 셰이킹하면서 30 ~ 150분간 배양하는 단계 2; 상기 췌도에 매트릭스 물질을 첨가하고 배양하여 3차원 환경을 만들어준 후 단계 1의 배지와 동일한 배지에서 배양을 1 ~ 2일간 계속하는 단계 3; VeGF를 제외한 단계 1과 동일한 배지를 단계 3의 배지에 추가하고 성장하는 췌도의 중앙부가 검게 변하면 HGF와 NGF를 더 첨가하고 췌도가 옆으로 퍼지면 NGF, 항-인테그린 β1 항체을 더 첨가하여 배양하는 단계 4; 상기 단계 1 ~ 4를 2 ~ 3번 반복하여 증식시킨 췌도의 섬유아세포를 제거하는 단계 5로 이루어진 것을 특징으로 하는 췌도의 배양증식방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 췌도가 쥐 또는 인간의 췌장으로부터 분리한 췌도임을 특징으로 하는 췌도의 배양증식방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 라디칼 제거제는 만니톨, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, 니코틴아마이드로 이루어진 군중에서 어느 하나 이상을 선택함을 특징으로 하는 췌도의 배양증식방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 단계 1에 사용한 혈청은 쥐에서 분리한 혈청 또는 인간으로부터 분리한 혈청을 종-특이적으로 사용하는 것을 특징으로 하는 췌도의 배양증식방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 2에 사용한 기본배양액은 DMEM 배지에 피루베이트, 하이드로코티손, 페니실린/스트렙토마이신, β-머캡토에탄올, L-글루타메이트, 헤퍼스 버퍼를 함유하는 것임을 특징으로 하는 췌도의 배양증식방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 항괴사 및 항자연살해제는 VeGF, IGF-1,2 및 캡스파아제 저해제로 이루어진 군중에서 어느 하나 이상을 선택함을 특징으로 하는 췌도의 배양증식방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 매트릭스 물질은 매트리겔 콜라겐, 콜라겐 복합체, 테일콜라겐으로 이루어진 군중에서 어느 하나 이상을 선택함을 특징으로 하는 췌도의 배양증식방법.
  10. 삭제
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