FI119059B - Ihmisestä peräisin olevat Lactobacillus-kannat, niiden koostumukset ja niiden käytöt - Google Patents

Description

119059

Ihmisestä peräisin olevat Lactobacillus-kannat, niiden koostumukset ja niiden käytöt

Lactobacillus-stammar av människoursprung, deras sammansättningar 5 och deras användningar

Esillä olevan keksinnön kohteena ovat Lactobacillus-kannat ja niitä sisältävät 10 farmaseuttiset koostumukset.

Erityisemmin, keksinnön kohteena ovat kolme uutta, ihmisestä peräisin olevaa Lactobacillus-kantaa, jotka eivät ole Lactobacillus acidofilus-kantoja, ja joita voidaan kuvata koodinumeroilla CNCM1-1390, CNCM1-1391 ja CNCM1-1392, ja jotka on 15 talletettu Institut Pasteur:in kantakokoelmaan CNCM 13.01.1994, sekä uusi, ihmisestä peräisin oleva Lactobacillus acidophilus-kanta, johon on liitetty talletusnu-mero CNCM 1-1447, ja joka on talletettu tähän samaan kantakokoelmaan 13.07.1994 Budapestin sopimuksen mukaisesti.

20 Maitohappobakteereita sisältävien valmisteiden terapeuttisella käytöllä on pitkät ja a ···» * * hyvin vakiintuneet perinteet, jotka juontavat juurensa tämän vuosisadan alkuun, ja * « • · · '·*·* jotka perustuvat tutkimuksiin, joissa on korostettu hapatetun maidon edullisia • * vaikutuksia nauttijan terveyteen (viitteet 1—5).

ι<· • · · ·

» I J

25 Näistä ajoista lähtien maitohappobakteereita on käytetty laajasti farmaseuttisessa · » • » » * teollisuudessa ja ne toimivat aktiivisena aineosana erilaisissa valmisteissa, joilla on .. ( tarkoitus hoitaa patogeenien aiheuttamia suolistosairauksia, sekä apuaineina antibioot-

* M

] · . ·. tihoidossa (viitteet 6—9).

* « « * 30 Viime vuosikymmenien aikana tiedemiehet ovat syventäneet tietämystään maitohap- • * *;’ pobakteereista yleensä ja laktobasilleista erityisesti, ja tällä tavalla kokoon on saatu • · \v huomattava määrä tietoa.

*«· • · • · ··« 119059 2 Tällä hetkellä markkinoitavissa tuotteissa ei ole kuitenkaan otettu huomioon kaikkein uusimpien tieteellisten tutkimusten tuloksia (viitteet 10—11).

Erityisesti voidaan korostaa useiden tutkimusten osoittaneen, että: 5 — laktobasillit näyttelevät omalaatuista osaa suoliston mikroflooran säätelyssä siinä suhteessa, että ne tuottavat sekä maitohappoa että erityisiä, bakteereja torjuvia aineita (viitteet 12—16); — näiden bakteereiden on oltava peräisin siitä suolistoympäristöstä, johon ne on tarkoitus istuttaa uudestaan (ne on siis eristettävä ihmisen suolistojäijestelmäs- 10 tä, jotta niitä voitaisiin käyttää ihmisessä, ja niin edelleen), kolonisoitumisen takaamiseksi huomioonottaen "isäntäspesifisyys"-vaatimukset (viite 17); — laktobasillit osallistuvat useisiin aineenvaihdunnallisiin toimintoihin, jotka liittyvät erityisesti hyvän terveyden säilymiseen sekä monien patologisten tilojen estämiseen; erityisesti mainitsemisen arvoisia esimerkkejä ovat nit- 15 rosamiinien hajotus, bakteeritoksiinien neutralointi sekä syövän syntyä toijuva aktiivisuus (viite 18); — kyky tarttua suoliston epiteeliin on suolistobakteereiden eräs erityisen edullinen piirre (tunnettua on, että monet patogeeniset bakteerit menettävät viru- . lenttisuutensa menettäessään kykynsä tarttua limakalvoihin); niinpä mahdolli- ·« · · • · . . 20 suus epiteelin kolonisoimiseksi saattaa olla erityisen tärkeätä myös laktobasil- • * ♦ * * ♦ * lien tapauksessa, jotta ne voisivat toimia patogeenisten bakteereiden ko- * · · **! lonisaation esteenä (viitteet 10,19); — suolistosta eristettyjen kantojen taksonomista luokitusta on muutettu huomatta- • · · vasti; alalla on todettu uusien bakteerilajien olemassaolo tässä ekosysteemissä • * · 25 sekä erityisten biotyyppien erilaistuminen kunkin lajin puitteissa (viite 20); — kantojen "teknologiset" ominaisuudet (ennen kaikkea kyky kestää pakastuskä- * :' · *; sittelyjä kannan säilyttämiseksi) ovat erityisen tärkeät maitohappobakteerikan- * tojen mahdollisen hyväksikäytön määrittämiseksi; itse asiassa tähän saakka • · ···, probioottisiin tarkoituksiin käytetyt Lactobacillus-kannat kestävät yleensä 30 jonkin verran lyofilisoinnin olosuhteita (viite 21). Tarttumisominaisuuksien on * · · I.* säilyttävä lyofilisoinnin jälkeen (tämä vaatimus ei aina täyty).

• · • · #·* 119059 3

Erityisesti Lactobacillus-kantojen, jotka kykenivät tarttumaan suoliston limakalvon soluihin erittäin hyvin, eristämiseen liittyen alalla on kuvattu menetelmiä bakteerin eristämiseksi "homologisista" lähteistä, kuten terveiden yksilöiden ulosteesta.

5 Esimerkiksi patenttijulkaisuissa US 4839281, EP-A-199535 ja US 5032399 on kuvattu aikuisista eristetyt Lactobacillus acidophilus-kannat, joiden tunnusomaisena piirteenä ovat voimakkaat tarttumisominaisuudet, joita kuvataan ihmisen suoliston limakalvon soluun tarttuvien bakteerisolujen lukumäärän avulla vertailukantaan verrattuna. Tällaisen kannan tarkka taksonominen luokitus on kuitenkin epäilyttävä, 10 sillä sinä aikana kun tämän hakemuksen asiasisältöä tutkittiin Amerikan patenttivirastossa, kirjoittaja itse esitti, että kokeellisten tulosten perusteella kuvattu Lactobacillus oli muu kuin acidophilus-kanta (US-patentti 4839281, käsittelyhistoria, vastaus välipäätökseen, joka on päivätty 30. lokakuuta 1987, sivu 7, viimeinen kappale).

15 Muita sellaisia Lactobacillus-kantoja, jotka kykenevät tarttumaan suoliston soluihin, on kuvattu patenttijulkaisuissa EP 577904 sekä US 4 946 791.

Reniero et ai. (viite 27) ovat esittäneet kahden Lactobacillus casei-kannan eristämisen , kahden pikkulapsen ulosteesta. Näiden samojen kantojen läsnäolo ulosteessa useiden • · 20 vuorokausien ajan sai kirjoittajan olettamaan, että näillä kannoilla on tarttumisomi- • · t naisuuksia. Hän ei ole kuitenkaan maininnut millään tavalla niitä muita, edellä • i i 1 • · * **·, kuvatun kaltaisia biologisia tai teknologisia ominaisuuksia, jotka ovat esillä olevan . ,·. keksinnön kohteena olevan Lactobacillus-kantojen selviä piirteitä.

« « IM • ·· * · * • · · 25 Itse asiassa on todettu, että sen lisäksi, että CNCM1-1390-, CNCM1-1391-, CNCM ·**., 1-1392- sekä CNCM I-1447-kannat tarttuvat suoliston ja posken soluihin usein vertailukantoja paremmin, niillä oli myös seuraavat tunnusomaiset piirteet: — ne kykenevät estämään ihmisen suolistossa esiintyvien patogeenien kasvua;

• I

,*··. — ne kykenevät kasvamaan erilaisissa, sekä aerobisissa että anaerobisissa · • * · .*, 30 olosuhteissa, erilaisissa pH-arvoissa; näiden ominaisuuksien ansiosta kannat

• f I

• · kykenevät sopeutumaan hyvin niihin fysiologisiin ja patologisiin tilanteisiin, • joita esiintyy ruuansulatuskanavaa pitkin siirryttäessä; 119059 4 — ne tuottavat suuria määriä maitohappoa; — ne kestävät hyvin sappea; — ne kestävät lyofilisointia menettämättä tarttumiskykyään.

5 Nämä kannat kuuluvat Lactobacillus-sukuun, ja niiden tunnusomaisena piirteenä on joukko ominaisuuksia, joiden ansiosta ne ovat erityisen mielenkiintoisia useiden patologisten tilojen ennaltaehkäisyä ja hoitoa ajatellen.

Esillä olevassa keksinnössä saadaan aikaan farmaseuttiset, eläinlääketieteelliset tai 10 ravitsemukselliset koostumukset, jotka käsittävät vähintään yhtä CNCM 1-1390-, CNCM1-1391-, CNCM 1-1392- sekä CNCM I-1447-kantaa edullisesti lyofilisoidussa muodossa, sopivaan kuljettuneen sekoitettuna. Näitä koostumuksia voidaan antaan suun kautta tai niitä voidaan sekoittaa elintarviketuotteisiin kuten maitoon, jugurttiin tai maitotuotteisiin, sellaisten ruuansulatuskanavassa esiintyvien patologisten tilojen 15 hoitamiseksi tai ennaltaehkäisemiseksi, joiden patologisten tilojen tapauksessa on toivottavaa antaa laktobasilleja, ja joista esimerkkeinä voidaan mainita suoliston mik-robitasapainon järkkyminen, eri syistä johtuva ripuli, haavainen paksusuolentulehdus ja muut samankaltaiset patologiset tilat. Esillä olevan keksinnön mukaisia koostumuk- , siä voidaan myös antaa antibioottihoidon jälkeen suoliston ei-patologisen bakteerikas- ···· • · , , 20 vuston säilyttämiseksi.

» · · « ♦ · • · • · • i i "j( Esillä olevan keksinnön mukaisten kantojen eräs muu tärkeä piirre on se, että ne on eristetty terveiden vastasyntyneiden sekä rintaruokinnasta vieroitettujen vauvojen • · · • « · ulosteesta. Tunnettua on itse asiassa se, että nisäkkäiden ruuansulatuskanava on • · · » 25 steriili syntymähetkellä; siihen kolonisoituu nopeasti yleensä äidin emättimestä ja : \ peräaukon ympäriltä peräisin olevaa kasvustoa. Tämä hyödyllisten mikro-organismi- 9 en luonnollinen siirtymistapa puuttuu keisarinleikkauksen avulla syntyneiltä lapsilta; f 'ii; näiden lasten ruuansulatuskanavaan kolonisoituu itse asiassa alttiimmin epäedullisen!- • · ···, pia mikro-organismeja. Epäedullisempien mikro-organismien kolonisokumista Ϊ * 30 suolistoon on myös havaittu keskosissa. Kummassakin tapauksessa tätä vaaraa * · · voidaan vähentää huomattavasti antamalla suun kautta esillä olevan keksinnön • · t *’* mukaisia kantoja. Lisäksi pullolla ruokittujen vauvojen suolistossa esiintyy suurempia 119059 5 clostridia-populaatioita, coli-muotoisten baktereiden populaatioita sekä enterokokki-populaatioita rintaruokittuihin vauvoihin verrattuna. Myös tässä tilanteessa käsittely esillä olevan keksinnön mukaisilla laktobasilleilla edesauttaa suolistokasvuston uutta tasapainottumista.

5

Mainituista kannoista voidaan myös muodostaa seoksia, jotka sisältävät vain esillä olevan keksinnön mukaisia kantoja, ja/tai jotka sisältävät myös muita sellaisia kantoja, joilla on täydentäviä ominaisuuksia, eli erilaisia luontaisia ominaisuuksia. Esimerkkinä tällaisesta valmisteesta voidaan mainita seos, joka koostuu vähintään 10 yhdestä sellaisesta kannasta, jolla on voimakasta tarttumista aikaansaavia ominaisuuk sia, yhdistettynä vähintään yhteen sellaiseen kantaan, joka tuottaa suuria määriä L-maitohappoa. Edullinen, muttei millään tavalla rajoittava koostumus voidaan valmistaa sekoittamalla keskenään, sopivina määrinä, esillä olevan keksinnön mukaista kantaa CNCM 1-1394 sekä Enterococcus faecium SF68-kantaa, käyttäen 15 kumpaakin kantaa esimerkiksi ΙΟ6—1010 solua, sekä tavallisesti käytettyjä lisäaineita tai täyteaineita.

Kukin yksikköannos, joka on tyypillisesti kapseleina, liuoksina tai juotavina suspensioina, pussiin pakattuna jauheena tai muussa samankaltaisessa muodossa, sisältää * * 20 yleensä ΙΟ6—1010 solua kummastakin kannasta.

• * * f · · « * · * * » • · ·

Esillä olevan keksinnön mukaiset laktobasillit ovat myös osoittautuneet erittäin • · · * *'’; käyttökelpoisiksi elintarviketuotteiden ravintoarvon pararantajiksi. Erityisen edullisia t : : ::: ovat meijerituotteet, jotka on saatu maidosta ja sen johdannaisista.

S · · 25 .<t Seuraavassa kuvataan kantojen eristäminen sekä niiden tunnusomaisten piirteiden • · * ]···. selvitys.

« · · • · I*· i : • · · • · • · · • · % • ·

Ml • * * * ··· 119059 6

Esimerkki 1

Kantojen eristäminen ja karakterisointi 5 Kannat eristettiin vastasyntyneistä vauvoista ensimmäisten kuuden elinvuorokauden aikana. Näytteitä otettiin myös muista vauvoista vieroitusjakson aikana.

Näytteitä otettiin sairaalassa kohteiden ulosteista kahdesti vuorokaudessa, ja niitä säilytettiin steriileissä tupoissa anaerobisissa olosuhteissa. Laktobasillin selektiivinen 10 alustava eristäminen tapahtui selektiivisessä LBS1" -alustassa (Lactobacillus Selection Agar, Oxoid). Maljoja inkuboitiin anaerobisissa olosuhteissa (Gas Pack System, BBL) 48 tuntia 37 °C:ssa. Sitten täten saadut pesäkkeet eristettiin nestemäiseen MRS-alustaan (de Man - Rogosa - Sharpe-alusta, Oxoid) ja niillä toteutettiin ensimmäiset peräkkäiset uudelleeneristämistoimenpiteet puhdasviljelmien saamiseksi 15 (käsittäen levityksen selektiiviselle agaralustalle sekä yksittäisten pesäkkeiden eristämisen). Nämä toimenpiteet perustuvat Sharpe:in ehdottamaan menettelytapaan (viite 22). Eristämisen ja puhdistamisen jälkeen kantoja karakterisoitiin edelleen vain Lactobacillus-sukuun kuuluvien kantojen valikoimiseksi. Tällöin tutkittiin vain seuraavia ominaisuuksia: morfologia (optinen tarkastelu faasikontrastimikroskoopil- »·· ) / 20 la), reaktio Gram-väijäyksessä (positiivinen kaikilla lactobasilleilla), katalaasin läs- « · * ***·/ näolo (negatiivinen kaikilla laktobasilleilla) sekä maitohapon kahden stereoisomeerin * · t • · · *** määritys kunkin kannan viljelyalustassa 24 tuntia kestäneen inkuboinnin jälkeen

«M

(entsymaattinemn määritys Boehringer:in reagenssipakkauksella). Näiden kokeiden t · · V,lt tulosten perusteella eristettyjen kantojen voitiin katsoa kuuluvan Lactobacillus- • « · 25 sukuun. Sitten kannat lyofilisoitiin ja niitä säilytettiin 4 °C:ssa.

• » • ·

• M

.···. Sitten kaikkien laktobasilleiksi tunnistettujen kantojen tapauksessa analysoitiin * . plasmidiprofiilit alkaliuuton jälkeen (viite 23). Tämän analyysin avulla voitiin • · ... tunnistaa eristetyt kannat (viite 24). Samoin selvitettiin liukoisen sytoplasmisen *·' 30 proteiinin profiili (viite 25) sekä eri antibioottien vastustuskyky (viite 26).

« » · • · · • · »*· • · • · M· 119069 7 Tämän jälkeen näiden kaikkien eristeiden edustavien kantojen taksonominen jaottelu analysoitiin tavanomaisilla fenotyyppikokeilla kuten sokerin käymiskuvion avulla (API CH 50 Galleries System, Biomerieux).

5 Keksinnön mukaisten kantojen taksonomia ja ominaisuudet on havainnollisesti esitetty seuraavissa taulukoissa.

• · • · * · · t · · • · • * · ♦ · · • •f **· ··»· • 4 · · I · · ··· • · • · · • * · • · • * • «» ·*· • * · ♦ · · e • · ·«· t : ··· • · • * * • * · e » ··· * · • · ··· 8 119059 , ,+ + + + + +> , 1+,+ I s______ - g -a « -s S § o ? g ·3 ή 2 2 S a s « g 1 s 1 II § Ji ill li 1 2?jal Sl-ag-S£·§1 ill 11 q^oö^IsoqIqoo Λ .3 & i 3 II Ί §

. ,.+ 1+1+1.+ + +1 II

bO

*n °' is 8 •g. 8 „ is * ^'Sil 111 -af 111!111 P MQtaQlSiJiSiSHaSiQJal'g I », I tn

g f %&i> g, ά <N hJ

Λ I g s s M

§| a S ro ,,+ + + + J +......i+i +

_ :3 Q .2 jS

* illl^b 1 **. U 2gS S3?S« !: ί ä 1 i I I s ¥ 1 s- ..

• 1 · .s

* · N

• 1 · Q

··· n d ...: | | * 1·1: 1 st . ^ -g ·.· g e. s m g « 9 — — o '9 ia **'1: 1 ϊ I 1 -S 1.111 8 -a -g 8 ! s a | 11 1 ! 1 3 lii f HfcJliSsSlItJlsfgll f : ·1 | äl .fä fe£:?-s 1 ::: § £2 2 a | 8 ja ! • ββ. , . »4 I ' ( »1-J , • H ^ rt ir> ä 55 »r> P5 Ό « « · *»· : : »»· * » • 1 · • · · • 1 1 · • i • · 2 · 9 119059 I ,+ + + + + +, , ,+ ,+ ______ - g -a a -s

I I 8 1 -a -a g I I * a I S I III II § Ϊ3 «s s ilI

3 q j a q [2 S ελ Ξ o Q λ q q a e i 11 ä 3 3 ,,,+ 1+ ,+ 1+ + + +1111

II I

•3 I *Ί CO Oi o

*PM

*T3 ° I 11 5 ·κ ω § ä* S O ° 1111 ii la tliill1^1 |t|Iliiiiiliis fii v 2

1 I

s -g a _ a I s ω ^ § J g 3 ·-·· S ee ™ .,+ + + + + +..,+ ,,,+ ,+ .. Z SlIfl.HrtSa . V. S 1 S i S i3 ? 1 8 ;ϊ s Ills lillu • ♦ · .s ♦ *# 2 ··* ä *··· *3 ϋ t '*! H '1 I §L i I g *a 1 :l '% ' J * t llilllliillnlliMl s a iät i | li·? il? ii ti fill il f

Ϊ 3 ^äw § Jä >,0 U < Ö U Λ U H O £ Jä < Q Q 3 || S

• 3 3« g; m._ a 1 ! S -a-3 g S ά 8 s * 1 a s s £ f f||s

* # H ^ (S P) Ti* V") ö ^ ΙΛ (¾ 'O

««··» • · ··* X ! • t* * • * • ♦ · • · · Ψ 9 ··· • · * · • · · 10 1 19059 , ,+ + + + + +, , ,+ ,+

S

π I I « - - -g -a -a - a Έ 8 ‘3 ‘3 g * S § <§ -s § S 8 S § ‘3 ‘3 8 « 8 a a g 8 a

5^2§:=o2'5SpooSSS

sf Q^OQbjSmSOQäQÖO

s s

II

1 § ά Pi

, . , + , + ,+ ,+ + + +, . , I

3

"wS

.m o ,m

S

3 3 S

i. '8 * i - 9 '3 ·- .1 '3 — 9 -¾ I i 3 I S 1 8 I^ifiliiilfi i |.§ 1 nil lull ill ?i Hi

g -g j§* j5* ‘8 8L wQ«Q^3SSHc!iS5öJ3fiHJ

Λ Λ I <2

...: S ! i I

* ' π . 3 3 5 .g » · z s p s j3 as 1,3 s-λ ··· cj a 5 p o a 5 u » » · “ ‘3 s S ή -¾ .3, S « ,.*, sJiIjcqIJI* , ,+ + + + + +, , , , , , , + ,+ • · · d t»« *a •1* 2

·”· -¾ S

• 9 a t;: § 1 ίΤ: I .. I ^1.-3-3 ·3 1 .1 -3 a 1 1 _ 1

If I I!i i!J«1!I ^ i1J i III

«Ib I I 111! I i 1 ^ 111 f I ? I !! f I Ρ I S δ 1

*.•'3 £ E X g S s J E

, eg ,175

• H iH fsj (fj rf ö 2 ΙΛ Oi »O

• f··· • · »Il 1 : • · * • * t • * * » * ·*· • · « ·

«M

11 119059 , ,+ + + + + +, ,++,+ 8 w '3 S g sl I -a 1 11! 1 i 1 i I '-s! i 1 g ?·+'ϊ3τ·ΐ3^4ί·£:’ι3ο·'^

Jj Q J O G iS S <2 S O G ¢8 Q G O

8 i ·§ -g 3.

<N

I I ,+ ,+ ,+ + + + + +, I , I

s .. o, «a Ω 9 3 §< Jj 5 I 2 3 3 52 50 * Is 12 go co .s 53 p O .- ofi g a *r £ r g *§ — S — Q 9 1,. i llllillifUlIIlf! ^ tss-sl IfiSiilsiiexllisSIss 3 s i ! 8 ! ®i :*#i B a II a ·§ Λ /.*. S1 g 1 I |;|1| v:* .,, + , + , + .,, + ,,, + ,, * · # p * · · »a

*9* S

·· 5 — a*»· a v * ·*# 3 Έ ! i ! 9., 2 S3 SxS'w '3S :3 'S 5 S I „ ·>, ft I . 111!1!11!!1111|Ii11 ..

*··.. *isl I ftdlHlUlillihli f

i ·· -¾ ä 2 S .-S >% B

= ! O '3 s §f i I I

·,·»! <2 S Sec gg^JcL, • H + (sco + >/-i 3 Z >n Di si • * x : ·** · I · · * * * 9 9 t·· t · Ψ 99 9 119059 12

Esimerkki 2

Esillä olevan keksinnön mukaisia kantoja verrattiin vertailukantoihin kokeissa, joilla haluttiin selvittää se, säilyykö näiden kantojen kyky taittua eri tyyppisiin soluihin, 5 kasvaa erilaisissa pH-arvoissa, kasvaa erilaisissa sappipitoisuuksissa sekä kasvaa erilaisissa inkubointiolosuhteissa, sekä kyky vaikuttaa suoliston patogeenien kasvuun. Ennen kutakin koetta näiden kantojen lyofilisoitu näyte kasteltiin uudestaan ja sitä inkuboitiin MRS-alustassa.

10 Vertailukannat olivat seuraavat:

Lactobacillus acidophilus ATCC 53103

Lactobacillus acidophilus ATCC 4357

Lactobacillus delbrueckii ATCC 7994

Salmonella enteritidis IMM2 15 Escherichia coli ATCC 35401

Tarttuminen ihmisen epiteelisoluihin

Tarttumiskokeet toteutettiin in vitro käyttäen epiteelisolujen kahta tyyppiä, jotka * ' 20 olivat: • · • « · '·*·* — ihmisen poskesta juuri eristettyjä soluja, • · · *··;* — suoliston soluja (solulinjakokoelma, Intestine 407, saatu tutkimuslaitoksesta • · · ·**·* Istituto Zooprofilattico Sperimentale, Brescia).

: ; : * * · * · · a · · • * * 25 Poskisolut eristettiin terveistä tupakoimattomista henkilöistä. Nämä solut kerättiin ..( raapimalla posken sisäpintaa kielen alaspainamiseksi tarkoitetulla puisella lastalla.

• · a

Sitten nämä suun limakalvon solut pestiin PBS-liuoksella (fosfaatilla puskuroitu • ♦ · • . suolaliuos).

• · ··· • · • · V 30 Suoliston soluja kasvatettiin Hanks:in BSS-liuokseen tehdyssä Eaglen perusalustassa, • ♦ · · *·*·’ joka sisälsi 10 % sikiövasikan seerumia, ja soluja inkuboitiin 37 °C:ssa 48 tuntia • · *···* ilmakehässä joka sisälsi 5 % C02:ta. Muodostuneet yksikerrokset trypsinoitiin 119059 13 tavanomaisten menetelmien mukaisesti (kasvualusta poistettiin, substraatti pestiin PBS-liuoksella, siihen lisättiin 2 ml trypsiini-verseeniä 0,25 %:n pitoisuudeksi). Sitten saatua suspensiota sentrifugoitiin nopeudella 1700 x g 10 minuuttia. Solut pestiin kahdesti PBS-liuoksella ja sitten ne laimennettiin tällä samalla liuoksella siten, 5 että pitoisuudeksi saatiin 100 solua/ml.

Tarttumiskoe toteutettiin lisäämällä 107 sopivissa olosuhteissa kasvatettua bakteerisolua 105 epiteelisoluun (joko posken tai suoliston soluun) PBS-liuoksessa. Seosta inkuboitiin 30 minuuttia 37 °C:ssa samalla jatkuvasti sekoittaen. Tämän jälkeen ne 10 bakteerit, jotka eivät olleet tarttuneet, poistettin suodattamalla suspensio polykar-bonaattikalvon (Sartorius) läpi, jossa kalvossa oli halkaisijaltaan 5 μπι:η huokosia. Toistetun pesun jälkeen kalvot laitettiin lasilevylle, ne kuivattiin ilmassa, kiinnitettiin metanolilla ja ne värjättiin kristallivioletilla tarttuneiden bakteereiden toteamiseksi. Solua kohden tarttuneiden bakteereiden keskimääräinen lukumäärä (X) määritettiin 15 laskemalla 100 soluun tarttuneiden bakteereiden lukumäärä.

Tarkastelun kohteena olevien solujen tarttumista verrattiin vertailukantana käytettyyn ATCC 53103-kantaan seuraavan yhtälön avulla: bakteereiden lkm/epiteelisolu :··1 20 Tarttumis- - -------------------------------------------------------- x 100 indeksi (Ή) ATCC 53103-laktobasillien lkm/epiteelisolu • · · * · • · · • · · • · · Näiden kokeiden tulokset on esitetty taulukossa 1.

25 ··· * · 1 • 1 · ·· * 1 • · · « * · · « · · • 1 1 • · ·2 i : ··1 • · * · · « · 1 « 1 · · « · * · 2 »1

Taulukko 1 14 119059

Laktobasillikantojen tarttuminen poskisoluihin ja ihmisen suoliston soluihin 5 Kami Poskisolut Suoliston solut __X ± SD__Ή__X ± SD__Ή CNCM 1-1390 27,3 ± 7,5 63,5 20,9 ± 6,1 123,7 CNCM1-1391 49,1 ± 6,4 114,2 42,6 ± 5,9 252,1 CNCM 1-1447 - - 14,4 ± 5,8 85,2 10 ATCC 53103 43 ± 5,95 100,0 16,9 ± 5,3 100,0 ATCC 4357 4 ± 3,2 9,3 2,9 ± 1,6 17,1 ATCC 7994 3,1 ± 1,7 7,2 1,6 ± 1,5 9,5 X = laktobasillien lkm. solua kohden; SD = standardipoikkeama; TI = tarttumisin-15 deksi Näistä tuloksista nähdään, että esillä olevan keksinnön mukaiset kannat kykenevät tarttumaan erinomaisella tavalla suoliston ja posken limakalvolta saatuihin soluihin; ...) eräissä tapauksissa tuloksena oli huomattavasti suurempi kuin vertailukantojen 20 tapauksessa.

• · m · · • · * • · · ;· Kasvu erilaisissa pH-arvoissa 4 · · · t :]: Laktobasilleja kasvatettiin nestemäisessä MRS-alustassa (Oxoid), pH-arvossa 3 (saatu · lisäämällä HCl:ia), pH-arvossa 5 (alusta normaali pH-arvo) sekä pH-arvossa 8 (saatu 25 lisäämällä NaOH:ia).

* · • · • ·» • · · : Näytteitä inkuboitiin 37 °C:ssa 5 % C02:ta sisältävässä ilmakehässä ja bakteerisolut *;**: laskettiin eri ajanhetkillä (12 h, 24 h, 48 h). Näiden kokeiden tulokset on esitetty t**‘: taulukossa 2.

• · · 30 • · · • · ··« * m • · ·· · 15 119C59

Taulukko 2

Bakteerikantojen kasvu eri qjanhetkillä ja eri pH-arvoissa 5 pH3 pH5 pH8

Kanta 12 h 24 h 48 h 12 h 24 h 48 h 12 h 24 h 48 h CNCM1-1390 5,0 6,8 6,5 9,6 10,0 10,3 9,5 9,7 9,5 CNCM 1-1391 4,9 6,5 6,3 9,5 9,8 10,6 9,5 9,5 10,4 CNCM 1-1447 4,5 4,8 4,0 9,0 9,8 9,6 9,0 9,4 9,3 10 ATCC 53103 5,3 6,6 6,1 9,5 9,5 9,5 9,3 9,5 9,8 ATCC 4357 4,0 4,6 4,8 7,5 8,6 8,8 7,8 8,0 8,5 ATCC 7994 <3 <3 <3 7,5 8,0 8,8 <3 <3 <3

Arvot on esitetty muodossa log CFU/ml. CFU (colony forming unit) = pesäkkeitä 15 muodostava yksikkö.

Näistä tuloksista nähdään, että esillä olevan keksinnön mukaiset kannat voivat kasvaa laajalla pH-alueella. Erityisesti, nämä kannat kestävät happamia pH-arvoja yhtä hyvin tai paremmin kuin vertailukannat.

* »· · * 1 20 • ·

Sapen sieto t • · 1 • · · • · 1 • · 1 ···; Esillä olevan keksinnön mukaisia kantoja ja vertailukantaa ATCC 53103 inkuboitiin | · · 48 tuntia nestemäisessä MRS-alustassa. Nämä elatusalustat laimennettiin (107 • · · 25 CFU/ml) ja niitä kasvatettiin MRS-agarilla, jota oli täydennetty sapelia pitoisuutena .. 1,5 g/1 tai 3 g/1 [häränsappijauhe (Ox gall), Sigma). Sen jälkeen, kun näytteitä oli • · • «4 *... inkuboitu 48 tuntia 37 °C:ssa anaerobisissa olosuhteissa, bakteerit laskettiin sapen * · · 1 « i « sietokyvyn selvillesaamiseksi.

• · ·<· | · ·;·1 30 Tulokset on esitetty taulukossa 3.

• · • · · • ♦ 1 • · · · * · • ·

• M

Taulukko 3 16 119059

Lactobacilli-kantojen kyky sietää sappea 5 Kanta MRS-agar MRS + sappi MRS + sappi (vertailu) 1,5 g/1 3,0 g/1 __CFU/ml__CFU/ml__CFU/ml CNCM1-1390 140 134 90 CNCM1-1391 187 186 176 CNCM 1-1447 289 283 290 ATCC 53103 201 202 161 10 CFU = pesäkkeitä muodostava yksikkö.

Näistä tuloksista nähdään, että nämä uudet kannat sietävät hyvin sappea jopa silloin, kun sen pitoisuus on suuri. Erityisen yllättävää oli CNCM I-1447-kannan kyky sietää 15 hyvin jopa suuria pitoisuuksia.

Kasvu anaerobisissa ja aerobisissa olosuhteissa a aaaa a a a a :.V Laktobasilleja inkuboitiin yön yli nestemäisessä MRS-alustassa, 37 °C:ssa anaerobi- * • a Φ *.:·* 20 sissa ja aerobisissa olosuhteissa, minkä jälkeen solut laskettiin. Tulokset on esitetty a aaa *··: taulukossa 4.

a (· · • a aa· a*a • a · a a a a a· a a a a · a • •a a a a a a a a • a a a »aa i : • aa • a a a a a a a a a a aa· a · a a • a· 119059 17

Taulukko 4

Laktobasillien kasvu anaerobisissa ja aerobisissa olosuhteissa

Kanta Anaerobinen kasvu Aerobinen kasvu log CFU/ml log CFU/ml 5 CNCM1-1390 9,6 9,1 CNCM1-1391 10,0 10,1 CNCM 1-1447 9,8 9,7 ATCC 4357 7,3 7,0 ATCC 7994 9,3 9,9 10 ATCC 53103 9,7 9,8 CFU = pesäkkeitä muodostava yksikkö.

Tulokset osoittavat, että esillä olevan keksinnön mukaiset kannat kasvavat sekä 15 anaerobisissa että aerobisissa olosuhteissa.

Vaikutus suoliston patogeenien kasvuun ··· » • · • · 5.:.: Esillä olevan keksinnön mukaisten kantojen kyky estää suoliston patogeenien kasvua 20 arvioitiin kokeissa, joissa näitä kantoja viljeltiin yhdessä Escherichia coli:n (entero- • · · ·"! toksigeeninen; ATCC 35401) sekä Salmonella enteritidis:in (IMM2) kanssa.

* ··· ··· I * * ** * Ensimmäisessä koesarjassa esillä olevan keksinnön mukaisia kantoja ja viitekantoja .. kasvatettiin yön yli, sitten niihin siirrostettiin mainittuja patogeenejä 37 °C:ssa 5 % • · • »· 25 C09:ta sisältävässä ilmakehässä viljelyalustassa, joka koostui kaksinkertaisena • a · * » « » pitoisuutena käytetystä nestemäisestä MRS-alustasta sekä kaksinkertaisena pitoisuute- [ ’ na käytetystä nestemäisestä Mueller-Hilton-alustasta muodostetusta l:l-seoksesta.

| · ·;·' Patogeeniset bakteerit ja tarkastelun kohteena olevat Lactobacillus-kannan bakteerit a · :laskettiin 24 ja 48 tunnin kuluttua. Vertailuina käytettiin puhdasviljelminä kasvatettua ·· · • a • * • a* 119059 18 patogeeniä sekä Lactobacillus-kantoja. Näiden kokeiden tulokset on esitetty taulukoissa 5 ja 6.

Toisessa koesaijassa esillä olevan keksinnön mukaisiin kantoihin ja vertailukantoihin S siirrostettiin samanaikaisesti patogeenejä, ja niitä kasvatettiin yhdessä edellä esitetyissä olosuhteissa. Sen jälkeen, kun inkubointi oli kestänyt 24 ja 48 tuntia, patogeeniset bakteerit ja Lactobacillus-kannan bakteerit laskettiin. Vertailut olivat samat kuin edellä. Näiden kokeiden tulokset on esitetty taulukoissa 7 ja 8.

10 Näistä kokeista, joissa patogeenejä kasvatettiin yhdessä laktobasillien kanssa, saadut tulokset osoittavat yllättävällä tavalla, että esillä olevan keksinnön mukaiset kannat estävät tehokkaasti haitallisten mikro-organismien kasvua. Itse asiassa, kuten taulukoista 5 ja 6 nähdään, Escherichia coli:n ja Salmonella enteritidis:in kasvu estyi voimakkaasti, kun näihin patogeeneihin siirrostettiin riittävä määrä laktobasilleja (alle 15 3 oleva arvo, yksikössä log CFU/ml, todettiin kaikissa tapauksissa). Nämä kannat voivat estää näiden patogeenien kasvun silloinkin, kun niitä siirrostetaan samanaikaisesti (tauluko 7 ja 8). Erityisesti Salmonella enteritidis:in tapauksessa samanlainen estyminen todettiin, kun laktobasilleja kasvatettiin ensin yön yli, minkä jälkeen toteutettiin siirrostus (vertaa taulukkoja 8 ja 6). Edelleen mielenkiintoista on huoma- * mm»· * 20 ta, ettei patogeenin samanaikainen läsnäolo vaikuta Lactobacillus-kantojen kasvuun.

• · · ***** Näissä kaikissa kokeissa tuloksia, jotka liittyivät laktobasillien kasvuun yhteisviljel- * m m *·"’ mässä, verrattiin puhdasviljelmänä kasvatetuilla laktobasilleilla saatuihin tuloksiin.

·· · *··· * * · * · · #·· ·«· *· · 9 4 4 44 • 4 4 · * • • •4 • « · * · * • · • *♦ i : 4 4 9 * * 4 4 · 4 4 4 9 4 4 4 4 4 4 4 44· 19 119059

Taulukko 5 Enterotoksigeenisen Escherichia coli:n (ATCC 35401) ja lakto-basillin kasvu yhteisvilj elmässä1

Viljelmä Bakteerikasvu (log CFU/ml)

Escherichia coli (ATCC 35401) Lactobacillus (tutkittu kanta) 5__24h_48h__24h_48 h CNCM 1-1390 - - 9,9 10,8 ATCC 35401 9,5 9,6 CNCM 1-1390 + ATCC 35401 <3 <3 9,8 10,6 10 CNCM 1-1391 - - 9,5 10,8 ATCC 35401 9,5 9,6 CNCM 1-1391 + ATCC 35401 <3 <3 9,8 10,9 CNCM 1-1447 - - 9,6 9,9 15 ATCC 35401 9,5 9,6 CNCM 1-1447 + ATCC 35401 <3 <3 9,6 9,8 ATCC 53101 - - 9,7 10,8 ATCC 35401 9,5 9,6 . 20 ATCC 53103 + ···· ATCC 35401 <3 <3 9,8 10,9 • · · .*.*·. ATCC 4357 - - 9,0 9,3 « « > ATCC 35401 9,5 9,6 **·; ATCC 4357 + • * * ’::f 25 ATCC 35401 <3 <3 9,0 9,6 i! :___ ATCC 7994 - - 8,0 8,8 ATCC 35401 9,5 9,6 i... ATCC 7994 + • · · *\ ' ATCC 35401 <3 <3 8,6 8,8 30 --- • · · 1 Laktobasilleja kasvatettiin yön yli ja sitten niihin siirrostettiin Escherichia coli-:Y: bakteereita. 24 ja 48 tunnin kuluttua patogeeniset bakteerit ja laktobasillit laskettiin.

!*],·* CFU = colony forming unit.

20 119059

Taulukko 6 Salmonella enteritidis.-in (1MM 2) ja laktobasillin kasvu yhteisvil-jelmässä1

Viljelmä Bakteerikasvu (log CFU/ml)

Escherichia coli (IMM 2) Lactobacillus (tutkittu kanta) 5__24h_48h__24h_48 h CNCM 1-1390 - - 9,8 10,3 IMM 2 9,5 9,7 CNCM 1-1390 + IMM 2 <3 <3 9,3 10,9 10 CNCM 1-1391 - - 9,8 10,3 IMM 2 9,5 9,7 CNCM 1-1391 + IMM 2 <3 <3 9,9 10,9 CNCM 1-1447 - - 9,5 9,8 15 IMM 2 9,5 9,7 CNCM 1-1447 + IMM 2 <3 <3 9,3 9,9 ATCC 53103 - - 9,6 9,9 IMM 2 9,5 9,7 „.j 20 ATCC 53103 -I- • · . . IMM 2 <3 <3 9,7 10,9 ::: ____________ : atcc 4357 - - 8,3 9,0 IMM 2 9,5 9,7 ATCC 4357 + • · · "I 25 IMM 2 <3 <3 8,6 8,8 • · · • · · • «·ιι..ι··ι im —^I « > I - — - ATCC 7994 - - 8,7 8,3 I*. IMM 2 9,5 9,7 • «* '···. ATCC 7994 +

III

\ IMM 2 <3 <3 8,7 8,3 ····· _ • * 30 ·*· | · - ·;·* 1 Laktobasilleja kasvatettiin yön yli ja sitten niihin siirrostettiin Salmonella enteriti- m · v.* dis-bakteereita. 24 ja 48 tunnin kuluttua patogeeniset bakteerit ja laktobasillit • ·· laskettiin. CFU = colony forming unit.

21 119059

Taulukko 7 Enterotoksigeenisen Escherichia coli:n (ATCC 35401) ja laktoba-sillin kasvu yhteisviljelmässä samaan aikaan tapahtuneen siirros-tuksen jälkeen1

Viljelmä Bakteerikasvu (log CFU/ml) 5 Escherichia coli (ATCC 35401) Lactobacillus (tutkittu kanta) __24h_48h__24h_48 h CNCM 1-1390 - - 10,3 11,0 ATCC 35401 9,7 9,8 CNCM 1-1390 + 10 ATCC 35401 5,5 4,6 9,8 11,4 CNCM 1-1391 - - 10,0 10,9 ATCC 35401 9,7 9,8 CNCM 1-1391 + ATCC 35401 5,3 5,2 9,7 11,4 15 CNCM 1-1447 - - 9,6 9,8 ATCC 35401 9,7 9,8 CNCM 1-1447 + ATCC 35401 5,6 5,0 9,6 9,8 ATCC 53101 - - 9,8 10,9 20 ATCC 35401 9,7 9,8 ATCC 53103 + « · ,V, ATCC 35401 4,9 5,0 9,5 11,0 « · i • * ,r - , ---- S ϊ*ϊ ATCC 4357 - - 9,0 9,3 ··· ... ATCC 35401 9,7 9,8 !'!·. 25 ATCC 4357 -I- I * « ATCC 35401 5,6 5,3 8,9 9,5 S · · a — - - ATCC 7994 - - 8,8 8,9 "... ATCC 35401 9,7 9,8 ATCC 7994 + • · · 30 ATCC 35401 5,4 5,0 8,6 8,9 • * L·— l'M«— I I 1— I. .............. — *** | · *"’ 1 Laktobasilleja ja Escherichia coli-bakteereita siirrostettiin samanaikaisesti ja 24 ja • · 48 tunnin kuluttua patogeeniset bakteerit ja laktobasillit laskettiin. CFU = colony • ·· *·*·* forming unit.

22 119059

Taulukko 8 Salmonella enteritidis:in (IMM 2) ja laktobasillin kasvu yhteis-viljelmässä samanaikaisen siirrostuksen jälkeen1

Viljelmä Bakteerikasvu (log CFU/ml)

Escherichia coli (IMM 2) Lactobacillus (tutkittu kanta) 5__24h_48 h 24 h_48 h CNCM 1-1390 - - 9,6 10,7 IMM 2 9,7 9,6 CNCM 1-1390 + IMM 2 <3 <3 9,1 11,7 10 CNCM 1-1391 - - 9,6 10,7 IMM 2 9,7 9,6 CNCM 1-1391 + IMM 2 <3 <3 10,0 10,5 CNCM 1-1447 - - 9,5 9,8 15 IMM 2 9,7 9,6 CNCM 1-1447 + IMM 2 <3 <3 9,2 9,7 ATCC 53103 - - 9,7 10,3 IMM 2 9,7 9,6 20 ATCC 53103 + ! . IMM 2 <3 <3 9,1 11,5 :::___ j ·*; ATCC 4357 - - 8,8 9,5 IMM 2 9,7 9,6 j"*.. ATCC 4357 + IV. 25 IMM 2 <3 <3 9,0 9,3 I ' * • < t • "M“ 1 1 .............

ATCC 7994 - - 8,8 9,0 i\ IMM 2 9,7 9,6 * ·· *·;·. ATCC 7994 + « * · *. IMM 2 <3 <3 8,0 8,5 *···· . ..... I - * * 30 »·· 1*1 · « ···' 1 Laktobasilleja ja Salmonella enteritidis-bakteereita siirrostettiin samanaikaisesti ja Λ 9 *.v 24 ja 48 tunnin kuluttua patogeeniset bakteerit ja laktobasillit laskettiin. CFU = 99% colony forming unit.

119059 23

Eräässä toisessa koesarjassa esillä olevan keksinnön mukaisten laktobasillien seoksiin siirrostettiin Escherichia coli- ja Salmonella enteritidis-bakteereita, millä pyrittiin selvittämään se, onko tällaisilla seoksilla patogeenisten kantojen kasvua estävää synergististä vaikutusta. Taulukkoon 9 on koottu eräitä niitä tuloksia, joita saatiin 5 enterotoksigeenisellä Escherichia coli-kannalla ATCC 35401, jota viljeltiin yhdessä samanaikaisesti siirrostettujen laktobasillien kanssa.

Taulukko 9 Enterotoksigeenisen Escherichia coli:n (ATCC 35401) kasvun estyminen erilaisten laktobasilliseosten vaikutuksesta yhteisvi(jelmäs-10 sä samanaikaisen siirrostuksen jälkeen1

Viljelmä Bakteerikasvu (log CFU/ml)

Escherichia coli (ATCC 35401) 24 h 48 h ATCC 35401 8,65 8,72 ATCC 35401 + CNCM M 390 + 15 CNCM 1-1391 3,40 <2 ATCC 35401 + CNCM 1-1390 + CNCM 1-1447 3,18 2,70 M·· ATCC 35401 + CNCM 1-1391 + CNCM 1-1447 <2 <2 « t * m'[\, 20 ATCC 35401 + CNCM 1-1390 + !7\ CNCM 1-1391 + CNCM 1-1447 2,30 <2 1 · · * *# ___________ • »f • f * • · · 1 Escherichia coli siirrostettiin samanaikaisesti erilaisten laktobasilliseosten kanssa.

24 ja 48 tunnin kuluttua patogeeniset bakteerit ja laktobasillit laskettiin. CFU = ;T; 25 colony forming unit.

* * • · j*··. Näistä tuloksista nähdään selvästi, että laktobasilliseokset kykenivät estämään «•f patogeenin kasvun täydellisesti sekä 24 että 48 tunnin kuluttua. Lisäksi nämä • * t • · · laktobasilliseokset estivät tehokkaammin patogeenin kasvua kuin yksittäiset Lactoba- f « 30 cillus-kannat (vertaa taulukkoja 9 ja 7). Nämä tulokset saatiin patogeeneillä, joihin 119059 24 oli siirrostettu samanaikaisesti laktobasilleja. Samoin näissä kokeissa patogeenien tai muiden laktobasillikantojen samanaikainen läsnäolo ei vaikuttanut laktobasillien kasvuun. Samankaltaisia tuloksia saatiin Salmonella enteritidis: illä.

5 Edellä esitettyjen tulosten perusteella on ilmeistä, että esillä olevan keksinnön mukaisilla kannoilla on joukko piirteitä, joiden ansiosta ne sopivat erityisen hyvin lääkkeiden valmistamiseksi. Esillä olevan keksinnön mukaiset kannat kykenevät tarttumaan ihmisen epiteelisoluihin (tärkeä piirre kolonisoitumista ajatellen), ja ne sietävät hyvin, eivät kuitenkaan erinomaisesti sappea. Ne kestävät happamia pH- 10 arvoja ja kykenevät kasvamaan niissä, ja ne kasvavat sekä anaerobisissa että aerobisissa olosuhteissa. Edelleen, esillä olevan keksinnön mukaisilla kannoilla on niitä joko yksinään tai seoksina käytettäessä se yllättävä piirre, että ne estävät patogeenien kasvua ruuansulatuskanavassa. Nämä ominaisuudet säilyvät lyofilisoinnin jälkeen.

15 Esillä olevan keksinnön mukaisten kantojen kyky kestää lyofilisointia vaihtelee alueella 35—60 % 3 kuukauden ajan 4 °C:ssa tapahtuneen säilytyksen jälkeen. Samoin ne kasvavat nopeasti ja lysogeenisyys puuttuu.

. Näiden ominaisuuksien ansiosta näitä kantoja voidaan käyttää erityisen hyvin • · . . 20 kontaminoituneen ruuan tai veden aiheuttaman sairauden ennaltaehkäisemiseksi ja • · · • · * ' hoitamiseksi sekä apuaineena antibioottihoidon aikana tai yleisessä stressitilanteessa, i Ϊ * "Jt Lisäksi niiden stabiilisuuden ansiosta niiden mahdollinen käyttö paljon matkustavissa • f*· t>, henkilöissä esiintyvien patologisten tilojen ennaltaehkäisemiseksi ja hoitamiseksi on t * » *·· {’j', erityisen lupaavaa. Nämä kannat sopivat myös erityisen hyvin vastasyntyneiden * 25 käsittelemiseksi kaikissa niissä tilanteissa, joissa saattaa esiintyä vähemmän edullisten :\t> mikroorganismien pesiytymistä suolistoon (esimerkkeinä keisarinleikkauksella syntyneet lapset, keskoset, pulloruokitut vauvat). Lopuksi, niitä voidaan myös t ')(. käyttää maidon ja sen kaltaisten elintarviketuotteiden valmistuksessa.

·♦* t : « • ψ • 9 · • Ψ ¥ 4 » 1 Ψ t • t *·· 119059 25

Kirj allisuusviitteet 1. Drasar B.S., Hill M.J. (1974) Human intestinal flora, academic Press, London.

2. Bottazzi V. et al. ¢1981) Probiotica con batteri lattici, Centro Sperimentale 5 Latte, Milano.

3. Gilliland S.e. et al. ¢1978) Influence of consuming non fermented milk containing Lactobacillus acidophilus on fecal flora of healthy males. J. Dairy Sci. 61, 1-10.

4. Flora intestinale normale nel bambino e sue modificazioni in condizioni 10 patologiche, Analisi Istituto Superiore di Sanita, Roma, 1986.

5. Bottazzi V. (1987) Aggiomamenti di Microbiologia dei batteri lattici, Centro Sperimentale Latte, Milano.

6. Aly R., Shinefield H.R. (1982) Bacterial Interference, CRC Press, Boca Raton, USA.

15 7. Shapiro S. (1960) Control of antibiotic-induced gastrointestinal symptons with yogurt. Clinical Medicine, 295—299.

8. Gumma A. et al. (1972) Etude de quelque proc£d6s galdniques appliquös ä la th6rapeutique de substitution par Lactobacillus acidophilus, Pharm. Acta Helv. 47, 433—437.

···· 20 9. Gilliland S.E. (1979) Beneficial interrelationships between certain microor- ganisms and humans: candidate microorganisms for use as dietary adjunts. J.

« · : :*: Food Protect. 42, 164—167.

* · · ;:· 10. Lee a. (1985) Neglected niches: the microbial ecology of the gastrointestinal te-"s tract. Advances in Microbial Ecology 8, 115—162, Marshall K.C. - Plenum 0 · 25 Press N.Y.

11. Zoppi G. et al. (1982) Oral bacteriotherapy in clinical practice, Eur. J.

:*'*·· Pediatr. 139, 18-21.

* · * v *’ 12. Akiyoshi H. et al. (1977) Isolation and characterization of an inhibitory *:·; substance against Escherichia coli produced by Lactobacillus acidophilus.

: 30 Milchwissenschaft 32, 727—730.

* · · 7 t 13. Babel F.J. (1977) Antibiosis by lactic culture bacteria J. Dairy Sci. 60, ;1; 815-821.

• · * 119059 26 14. Barefoot S.F., Klaenhammer T.R. (1983) Detection and activity of Lactacin B., a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus. Appi. environ. Microbiol. 45, 1808-1815.

15. Tagg J.R. et al. (1976) Bacteriocins of gram positive bacteria. Bacteriol.

5 Rev. 40, 722-756.

16. Silva M. et al. (1987) Antimicrobial substance from a human Latobacillus strain. Antimicrob. Agents Chemother. 31, 1231—1233.

17. Fuller R., Brooker B.E. (1980) The attachment of bacteria to the squamous epithelial cells and its importance in the microecology of the intestine in 10 Microbial adhesion to surfaces (Berkeley R.C.W., Lynch J.M., Melling J.,

Rutter P.R., Vincent B., Eds.), Society of Chemical Industry/Ellis Horwood Ltd, London.

18. Bottazzi V. et al. (1985) Proprieta antitumorali dei batteri lattici e degli alimenti fermentati con batteri lattici. II Latte 10, 873—879.

15 19. Van Der Waaij D. (1979) The colonization resistance of the digestive tract in experimental animals and its consequences for infection prevention, in New Criteria for Antimicrobial Therapy (Excerpta Medica, Ed.), Utrecht.

20. Savage D.C. (1977) Microbial ecology of the gastrointestinal tract. Annu. Rev. Microbiol. 31, 107—133.

:*·; 20 21. Ray B., Johnson M.C. (1986) Freeze-drying injury of surface layer protein and its protection in Lactobacillus acidophilus. Cryo-Lett. 7, 210.

• · : 22. Sharpe M.E. (1981) The genus Lactobacillus, in: The Prokaryotes (Starr, „*·* Stolp, Truper, Balows, Schlegel, Ed.) pp 1653—1679, Springer, N.Y.

:.j.: 23. Morelli L. et al. (1982) Characterization of plasmid DNA molecules in L.

· 25 acidophilus strain D137. Annali di Microbiologia 32, 99—105.

24. Davies F.L. et al. (1982) The value of plasmid profiles for strain identifi- • · • · : " cation in lactic streptococci and the relationship between Streptococcus lactis '**; *’ 712, ML2 and C2. J. Appi. Bacteriol. 51, 325-337.

*: : 25. Kersters K., De Ley J. (1980) Classification and identification of bacteria by • · · l...: 30 electrophoresis of their proteins, in Microbiological classification and identi- * : Vi fication (Goodfellow M. & Board R.G., Ed.), pp 273—297, Academic Press, • · ·

London.

119059 27 26. Vescovo M. et al. ¢1982) Drug resistance plasmids in Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus reuteri. Appi. Environ. Microbiol. 43, 50—56.

27. Reniero et al. (1991) Detection of permanent Lactobacillus casei subsp. casei strains in weaned infants ’gut’. Lett. Appi. Microbiol. 13, 3—6.

5 • · · · • · • · • · · • · · • · • 1 t • » · ·♦· • · · • »«· * « · • · · * ·♦ • · • · · * • · • 1 • 1 *·· • · · • · · • · ·#« t : « · * • · * · 1 • · · • · 1 · • · φ • · 1

Claims (12)

119059

1. Lactobacillus-suvun karmat, jotka on talletettu Institut Pasteur: in kantakokoelmaan CNCM talletusnumeroilla 1-1390, 1-1391, 1-1392 ja 1-1447. 5

2. Farmaseuttiset, eläinlääketieteelliset tai ravitsemukselliset koostumukset, tunnettu siitä, että ne käsittävät vähintään yhtä patenttivaatimuksen 1 mukaista Lactobacillus-kantaa CNCM 1-1390, CNCM 1-1391, CNCM 1-1392 tai CNCM I-1447 yhteensopivaan kuljettuneen sekoitettuna. 10

3. Farmaseuttiset, eläinlääketieteelliset tai ravitsemukselliset koostumukset, tunnettu siitä, että ne käsittävät yhtä tai useampaa patenttivaatimuksen 1 mukaista Lactobacillus-kantaa seoksena muiden sellaisten kantojen kanssa, joilla kannoilla on täydentäviä ominaisuuksia. 15

4. Patenttivaatimuksen 2 mukaiset farmaseuttiset, eläinlääketieteelliset tai ravitsemukselliset koostumukset, tunnettu siitä, että niissä vähintään yksi kannoista on Lactobacillus acidophilus-lajin edustaja, ja vähintään yksi kanta on muu kuin acidophilus-lajin edustaja. 0/ 20

5. Patenttivaatimuksen 2 mukaiset koostumukset, tunnettu siitä, että ne ··· j sisältävät seoksena kaikkia kantoja CNCM 1-1390, CNCM 1-1391, CNCM 1-1392 ja *»·: CNCM 1-1447. • ·* * * * i · ·

6. Patenttivaatimuksen 2 mukaiset koostumukset, tunnettu siitä, että niissä • * kannat CNCM 1-1390 ja/tai CNCM 1-1391 ja/tai CNCM 1-1392 ja/tai CNCM 1-1447 · · • · · ovat läsnä lyofilisoidussa muodossa. *···· • » «·· | { ··* 7. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 2—6 mukaiset koostumukset, tunnettu • · V.’ 30 siitä, että ne ovat kapseleina, liuoksina tai juotavina suspensioina tai lääkepussiin »·· pakattuna jauheena. 119059

8. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 2—7 mukaiset koostumukset, tunnettu siitä, että ne sisältävät kutakin yksittäistä kantaa 106—1010 solua yksikköannosta kohden.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukaisten Lactobacillus-kantojen käyttö sellaisten lääkkei den valmistamiseksi, joilla voidaan hoitaa ja ehkäistä sellaisia ruuansulatuskanavassa esiintyviä patologisia tiloja, joissa laktobasillien antaminen on toivottavaa.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen käyttö sellaisten lääkkeiden valmistamiseksi, 10 joilla voidaan hoitaa ja ehkäistä suoliston mikrobitasapainon järkkymistä, eri syistä johtuvaa ripulia tai haavaista paksusuolentulehdusta.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukaisten Lactobacillus-kantojen käyttö sellaisten lääkkeiden valmistamiseksi, joilla voidaan käsitellä vastasyntyneitä kaikissa niissä tilan- 15 teissä, j oissa esiintyy epäedullista pesiytymistä ruuansulatuskanavaan.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukaisten Lactobacillus-kantojen käyttö elintarvikkeiksi tarkoitettujen meijerituotteiden valmistamiseksi. • · • · • · · • · · • · ♦ · · • ♦ 1 2 3 ·«· ··· • ♦ · • · · ·♦· ··· • · · • · · * · • · 1 • · · • · « « • · • · · ♦ ♦ · • · 1 • · ♦ ψ «·· • · * · ·· · • · · • · ♦ · · 2 • · 3 30 1 1 9059