FI104896B - Menetelmä 1,4,5-trisubstituoidun-3-hydroksi-pyridiniumyhdisteen valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä 1,4,5-trisubstituoidun-3-hydroksi-pyridiniumyhdisteen valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI104896B FI104896B FI930367A FI930367A FI104896B FI 104896 B FI104896 B FI 104896B FI 930367 A FI930367 A FI 930367A FI 930367 A FI930367 A FI 930367A FI 104896 B FI104896 B FI 104896B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- formula
- compound
- group
- acid
- optionally substituted
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
- C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D495/04—Ortho-condensed systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
- C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
- C07D213/62—Oxygen or sulfur atoms
- C07D213/63—One oxygen atom
- C07D213/65—One oxygen atom attached in position 3 or 5
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pyridine Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Soft Magnetic Materials (AREA)
- Paper (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
104896
MENETELMÄ. 1,4,5-TRISUBSTITUOIDUN-3-HYDROKSI-PYRIDI-NIUMYHDIS TEEN VALMISTAMISEKSI
• Keksintö koskee menetelmää 1,4,5-trisubsti- tuoidun-3-hydroksi-pyridiniumjohdannaisen valmistami-5 seksi.
Yhdisteitä, joilla on kaava IA, h2n h2n
H02C/\ («^vCOOH
10 ^ J Xj.® (IA) o* 15
HjN^^COOH
20 jossa Xi on H tai OH, ja X2a_ on kloridi- tai asetaatti-ioni, on uutettu virtsasta joko hydrolysoimalla 6 M HC1-liuoksella n. 108 °C lämpötilassa 24 h ajan (ks. Eyre et ai., Ann. Rev. Biochem., 1984, 53, 717-748) tai 25 kromatografisesti käyttäen etikkahappoa eluenttina (ks. D.R. Eyre et ai., Anal. Biochem. 137, 380-388 (1984)). Kaavan IA mukaisia yhdisteitä on käytetty ilmaisemaan kollageenin hajoamista metabolisissa luu-ja rustotaudeissa määrittämällä niiden pitoisuus kvan-30 titatiivisesti virtsanerityksestä tietyn aikajakson aikana (ks. Wu ja Eyre, Biochemistry, 1984, 23, 1850; Robins et ai., Analytical Biochem., 1988, 169, 197-203; D. Uebelhart et ai., Bone and Mineral, 1990, 8, 87-96).
35 Näihin yhdisteisiin (kirjallisuudessa tunne taan pyridinoliini- [Xi= OH] ja deoksipyridinoliini • · · ψ 2 104896 [Xi= H] ristisidosyhdisteinä) on kohdistunut kasvava mielenkiinto niiden käyttämiseksi merkkiaineena tuki-kudosmetabolian epänormaalisuuksien yhteydessä esim. määritettäessä ihmisen luuresorptiota.
5 Koska kaavan IA mukaiset yhdisteet ovat tähän mennessä olleet luonnosta uuttamalla saatavia yhdisteitä, niillä ei ole mahdollista toteuttaa standardisoituja, toistettavia, luotettavia ja nopeasti suoritettavia määrityksiä.
10 Siten tarkoin määritellyistä standardoiduista pyridinoliiniristisidosyhdisteistä on suuri puute.
Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on tuoda esiin menetelmä pyridiinijohdannaisten, kaavan IA mukaisten yhdisteiden valmistus mukaan lukien, valmis-15 tamiseksi oleellisesti puhtaassa muodossa kemiallisen synteesin avulla luunmuutosmääritysten suorittamisen mahdollistamiseksi hyvin standardoiduissa olosuhteissa .
Esillä oleva keksintö tuo esiin menetelmän 20 kaavan X mukaisen 1,4,5-trisubstituoidun-3-hydroksi-pyridiniumyhdisteen valmistamiseksi r5 R5 Ϊ® χ,θ jossa
Rs on -NH2, -NHYa tai NHZa-Yb, jossa Ya on aminosuojaryh-3 5 mä, Za on sukkinyyli, β-Ala tai divalenttinen jäännös, joka on saatu 3 -amino-propaanihaposta, 3-aminoisobutaanihaposta, 4-aminobutaanihaposta, NH2- « « 104896 C(CHj) 2-COOH:sta, 6-aminoheksaanihaposta, 1,8-diamino-oktaanista, 1,6-diaminoheksaanista tai NH2-(CH2)1.4-CO-NH-CH2 (1.6) -NH2:sta ja Yb on aminosuojaryhmä tai antigeeninen ryhmä, 5 aminosuojaryhmä on valittu bentsoyylistä, jonka fenyy-lirengas voi olla valinnaisesti substituoitu substi-tuentilla p-metoksikarbonyyli, p-metoksi tai p-nitro; t-butyylioksikarbonyyli; isobutyylioksikarbonyyli; metoksikarbonyyli; allyylioksikarbonyyli; 9- 10 fluorenyylimetoksikarbonyyli; bentsyylioksikarbonyyli, jonka fenyylirengas voi olla valinnaisesti substituoitu substituentilla p-metoksi, p-nitro, o- tai p-kloori, m-fenyyli tai 3,4-dimetyyli; bentsyyli, jonka rengas voi olla valinnaisesti substituoitu substituen-15 tiliä p-metoksi, p-nitro tai p-kloori; tai fenyylisul-fonyyli, jonka rengas voi olla valinnaisesti substituoitu substituentilla p-metyyli tai p-metoksi; antigeeninen ryhmä on valittu naudan seerumialbumiinistä, muna-albumiinistä, tyroglobuliinista tai keyhole lim-20 pet hemosyaniinistä,
Rs on -COOH, C2_7alkoksikarbonyyli, CONH2, CONHYa tai -C0NH-Za-Yb, jossa Ya, Za ja Yb tarkoittavat samaa kuin edellä,
Xx on H tai OH ja 2 5 X2' on anioni, jolloin yhdisteen, jolla on kaava II, ” jossa Rs ja R6 tarkoittavat samaa kuin edellä, annetaan reagoida yhdisteen kanssa, jolla on kaava III, 35 • · 4 104896 X5 - CH2 - CHXj - CH2 - CH2 - CHR5R6 (III) jossa
Xl, Rs ja R6 tarkoittavat samaa kuin edellä, ja 5 Xs on lohkeava ryhmä; ja otetaan talteen täten saatu kaavan X mukainen yhdiste vapaassa tai suolan muodossa.
Kaavan III mukaisissa yhdisteissä, Xs voi olla 10 esim. halogenidi, mahdollisesti substituoitu ammonium, metaani- tai etaanisulfonaatti, tosylaatti. Kun X5 on halogenidi, se voidaan konvertoida anioniksi X2‘.
Menetelmävaihe suoritetaan edullisesti ap-roottisessa liuottimessa, edullisesti lämpötilassa, 15 joka voi vaihdella huoneenlämpötilasta reaktioseoksen kiehumispisteen alapuolella olevaan lämpötilaan.
Lähtöaineena käytettävät kaavan II mukaiset yhdisteet ovat uusia.
Kaavan II mukaiset yhdisteet voidaan valmis-20 taa menetelmällä, jossa (i) kaavan II mukaisen yhdisteen aminoryhmästä tai karboksiryhmästä poistetaan ainakin yksi suojaryhmä tai siihen liitetään ainakin yksi suojaryhmä mahdollisesti tilaryhmän välityksellä; tai 25 (ii) yhdiste, jolla on kaava IV,
Rx-X Y-Rj °\ /° 30 Ϊ Z2 jossa X on -(CH2)2-, Y on -CH2-, R2 ja R2 ovat R5-CH-R6, 3 5 ja Rs ja R6 tarkoittavat samaa kuin edellä ja Z2 on lohkeava ryhmä, syklisoidaan, ja otetaan näin saatu kaavan II mukainen yhdiste tai- ψ • · 104896 5 teen vapaassa muodossa tai suolarauodossa.
Menetelmävaihe (i) voidaan suorittaa tunnettujen menetelmien mukaisesti.
Menetelmävaihe (ii) voidaan suorittaa sopi-5 vasti inertissä liuottimessa, edullisesti huoneenlämpötilassa. Syklistäminen voidaan suorittaa edullisesti emäksen, kuten 1,5-diatsabisyklo[4.3.0]non-5-eenin (DBN) tai 1,8-diatsabisyklo[5.4.0]undek-7-eenin (DBU) läsnäollessa.
10 Mikäli lähtöaineiden valmistusta ei ole eri tyisesti esitetty, ne voidaan valmistaa analogisesti esimerkin 4 kanssa.
Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksintöä. Kaikki lämpötilat on annettu °C. BOC = t.-15 butoksikarbonyyli.
Esimerkki 1: 3-hydroksi-l-(5-t.-butoksikarbonyyli- amino-5-t.-butoksikarbonyylipentyyli)-4-(1-t.-butoksi-karbonyyliamino-l-t.-butoksikarbonyyli-2-etyyli)-5-(3-20 t.-butoksikarbonyyliamino-3-t.-butoksikarbonyyli-propyyli)pyridiniumjodidi 2.0 g 3-hydroksi-4-(1-t.-butoksikarbonyyli-amino-l-t.-butoksikarbonyyli-2-etyyli)-5-(3-t.-butok-sikarbonyyliamino-3-t.-butoksikarbonyylipropyyli)-25 pyridiiniä ja 1.9 g t.-butyyli-6-jodi-2-t.-butoksikarbonyyliaminoheksanoaattia 25 ml dioksaanissa kuumennetaan 110 ° lämpötilaan 1 h ajaksi. Haihdutuksen jälkeen otsikon mukainen yhdiste eristetään pyl-väskromatografisesti silikageeliä käyttäen (metyleeni-30 kloridi/metanoli/ammoniakki, 95:5:0.5). MS (FAB): M* 881.
Esimerkki_2 : 3-hydroksi^l-(5-amino-5-karboksi- pentyyli)-4-(1-amino-1-karboksi-2-etyyli)-5-(3-amino-35 3-karboksipropyyli)pyridiniumhydrokloridi 206 mg esimerkin 1 mukaista yhdistettä sekoitetaan 20 ml trifluorietikkahappo/vedessä, 95:5, 90 • · · 6 104896 min ajan. Dietyylieetterilisäys aikaansaa raa'an otsikon mukaisen yhdisteen saostumisen ja saatu sakka suodatetaan. Saatu seos liuotetaan 2 ml metanoliin ja liuos tehdään happamaksi pH = 1 2 N HCl-dietyyli- 5 eetteriliuoksella. Haihdutuksen jälkeen jäännös puhdistetaan preparatiivisella HPLC-puhdistuksella.
Pylväs: Macherey/Nagel SA5/SCX 5 m 4.6 x 200 mm Liuottimet: A: 0.02 M LiCl B: 0.2 M LiCl 10 Gradientti: A + 0 - 100 % B, 50 min Detektointi: UV 290 nm
Otsikon mukaista yhdistettä sisältävät fraktiot tehdään suolattomiksi saattamalla ne Bio-Gel P2 pylvään (50 - 100 mesh) läpi vedellä eluoimalla. Kyl-15 mäkuivauksen jälkeen saadaan otsikon mukaista yhdistettä eristettynä. MS (FAB): M* 413.
Esimerkki 3: 2-t.-butoksikarbonyyliaminoamino-4-[3- hydroksi-4-(1-t.-butoksikarbonyyli-l-amino-2-etyyli)-20 5-pyridinyyli]butaanihapon t.-butyyliesteri 212 mg 1,13-di-1.-butyyli-7-1.-butoksi- karbonyyliatsa-2,12-di-t.-butoksikarbonyyliamino-5,9-diokso-tridekano-diaatti liuotetaan 10 ml tetrahydro-furaaniin ja joukkoon lisätään 0.26 ml 1,8- 25 diatsabisyklo[5,4,0]-undek-7-eenia. Saatua liuosta sekoitetaan 15 h ajan huoneenlämpötilassa ja sitten liuos haihdutetaan. Seos erotetaan pylväskromatografi-sesti silikageelillä (metyleenikloridi/metanoli 96:4), jolloin saadaan otsikon mukaista yhdistettä. MS (FAB): 30 MH* 596.
Esimerkki 4: 1,13-di-t.-butyyli-7-t.-butoksikarbonyy- liatsa-2,12-di-t.-butoksikarbonyyliamino-5,9-diokso-tridekano-diaatti, jota käytetään lähtöaineena esimer-35 kissa 3, voidaan valmistaa seuraavasti: a) t.-butyyli-2-t.-butoksikarbonyyliamino-5,6-epoksi- ψ «·« 7 104896 heksanoaatti 13.1 g m-klooriperoksibentsoehappo (90 %) lisätään 13.8 g t.-butyyli-2-t.-butoksikarbonyyli-amino-5-heksenoaatin 400 ml metyleenikloridiliuokseen.
5 Huoneenlämpötilassa 18 h sekoituksen jälkeen seosta käsitellään jää/kyllästetyllä NaHC03-liuoksella. Vesipitoista osaa uutetaan kahdesti metyleenikloridilla. Orgaaniset liuokset yhdistetään, kuivataan ja haihdutetaan. Kromatografointi silikageelillä etyyliasetaat-10 ti/heksaania, 1:2.5, käyttäen tuottaa otsikon 4a) mukaista yhdistettä. MS (FAB): MH* 286.
b) 1,13-di-t.-butyyli-7-N-bentsyyliatsa-5,9-dihydroksi-2,12-di-t.-butoksikarbonyyliamino- 15 tridekano-diaatti 1 g kohdan 4a) mukaisen yhdisteen ja 0.18 ml bentsyyliamiinin seosta kuumennetaan 70 0 lämpötilaan 18 h ajaksi. Tämä seos erotetaan pylväskromatografi-sesti silikageelillä (asetoni/heksaani 1:2), jolloin 20 saadaan otsikon 4b) mukaista yhdistettä. MS (FAB): MH* 710.
c) 1,13-di-t.-butyyli-7-atsa-5,9-dihydroksi-2,12-di-t.-butoksikarbonyyliamino-tridekanodiaatti 25 9.48 g kohdan 4b) mukaista tuotetta liuote- taan 350 ml etanoliin ja hydrataan 1.4 g 10 % Pd/hiili läsnäollessa huoneenlämpötilassa ja normaalipaineessa. Saatu seos sitten suodatetaan ja haihdutetaan. Otsikon 4c) mukainen yhdiste puhdistetaan pylväskromatografi-30 sesti silikageelillä (metyleenikloridi/metanoli, 9:1).
MS (FAB): MH* 620.
d) 1,13-di-t.-butyyli-7-tert-butoksikarbonyyliatsa- 5,9-dihydroksi-2,12-di-t.-butoksikarbonyyliamino-tri - 35 dekano-diaatti 4.1 g di-t.-butyylidikarbonaattia lisätään nopeasti 7.7 g kohdan 4c) mukaiseen tuotteeseen, joka > · · ψ 8 104896 on liuotettu 310 ml tetrahydrofuraania. Saatua liuosta sekoitetaan 3 h ajan huoneenlämpötilassa. Haihdutuksen jälkeen otsikon 4d) mukainen yhdiste puhdistetaan pyl-väskromatografisesti silikageelillä (heksaani/etyyli-5 asetaatti, 6:4) MS (FAB): MH+ 720.
e) 1,13-di-t.-butyyli-7-t.-butoksikarbonyyliatsa-2,12-di-t.-butoksikarbonyyliamino-5,9-diokso-tridekano-di-aatti 10 4.0 ml dimetyylisulfoksidin ja 42 ml mety- leenikloridin liuos lisätään tipoittain -70 0 lämpötilassa 140 ml metyleenikloridin ja 2.4 ml oksalyyliklo-ridin liuokseen. 15 min kuluttua liuokseen lisätään hitaasti 8.0 g kohdan 4d) mukaisen yhdisteen ja 80 ml 15 metyleenikloridin liuos -70 0 lämpötilassa. 3 h -70 0 lämpötilassa sekoituksen jälkeen seokseen lisätään 15.7 ml trietyyliamiinia -50 0 lämpötilassa. Tämän jälkeen seos kaadetaan jää/veteen. Fraktiot erotetaan ja vesipitoista osaa uutetaan kahdesti dietyylieette-20 rillä. Kaikki orgaaniset fraktiot yhdistetään, kuivataan ja haihdutetaan. Jäännös puhdistetaan pylväskro-matografisesti silikageelillä (heksaani/etyyli- asetaatti 6:4), jolloin saadaan puhdasta otsikon 4e) mukaista yhdistettä. MS (FAB): MH’ 716.
25
Esimerkki_5: 3-hydroksi-l-(2-hydroksi-5-amino-5- karboksipentyyli)-4-(1-amino-1-karboksi-2-etyyli)-5-(3-amino-3-karboksipropyyli)pyridiniumhydrokloridi
Esimerkeissä 1 ja 2 esitetyt toimenpiteet 30 toistetaan käyttäen t.-butyyli-5-hydroksi-6-jodi-2-t.- butoksikarbonyyliaminoheksanoaattia. MS (FAB): M+ 429.
3-hydroksi-l-(2-hydroksi-5-t.-butoksikarbonyyliamino-5-t.-butoksikarbonyylipentyyli)-4 -(1-t.-butoksi-35 karbonyyliamino-1-t.-butoksikarbonyyli-2-etyyli)-5-(3- t.-butoksikarbonyyliamino-3-t.-butoksikarbonyyli-propyyli)pyridiniumjodidi. MS (FAB): M’ 897.
1 · · # 104896
Esimerkki 6 : 3-hydroksi-l-[5-t.-butoksikarbonyyli- amino-5-N-(1-metoks ikarbonyyli-2 -etyyli)karboksamido-pentyyli]-4-(1-1.-butoksikarbonyyliamino-1-t. -butoksi-5 karbonyyli-2-etyyli)-5-(3-t.-butoksikarbonyyliamino-3 -t. -butoksikarbonyylipropyyli)pyridiniumjodidi 235 mg esimerkin 3 mukaista yhdistettä ja 230 mg ε-jodi-N-t.-butoksikarbonyyliamino-(metyyli-S-ala-nyyli)lysiiniä 1 ml dioksaanissa kuumennetaan 120 0 10 lämpötilaan 30 min ajaksi. Haihdutuksen jälkeen otsikon mukainen yhdiste puhdistetaan kromatografisesti silikageelillä (etyyliasetaatti/metanoli 7:3).
MS - FAB: M+ 910.
15 Esimerkki 7: 3-hydroksi-l-[5-t.-butoksikarbonyyli- amino-5-N-(1-karboksi-2-etyyli)karboksamidopentyyli]- 4-(1-t.-butoksikarbonyyliamino-l-t.-butoksikarbonyyli-2-etyyli)-5-(3-t.-butoksikarbonyyliamino-3-t.-butoksikarbonyylipropyyli)pyridiniumhydroksidi 20 50 mg esimerkin 6 mukaista yhdistettä liuote taan 5 ml metanoliin ja 2 ml 0.2 N natriumhydroksidiin ja seosta sekoitetaan 5 h ajan huoneenlämpötilassa. Sitten joukkoon lisätään 10 ml vettä ja 10 ml mety-leenikloridia ja saatuun seokseen lisätään voimakkaas-25 sa sekoituksessa 0.2 N suolahappoa, kunnes pH = 2 - 3.
- - - Orgaaninen faasi erotetaan, kuivataan natriumsulfaa- tilla ja haihdutetaan. Kromatografointi silikageelillä (metyleenikloridi/metanoli 6:4) tuottaa otsikon mukaista yhdistettä. MS - FAB: M+ 896.
30
Esimerkki 8 : 3-hydroksi-l-(5-t.-butoksikarbonyyli- amino-5-t.-butoksikarbonyylipentyyli)-4-[1-t.-butoksikarbonyyl iami no- 1 -N- (l-metoksikarbonyyli-2-etyyli)-karboksamido-2-etyyli]-5-(3-t.-butoksikarbonyyliamino-35 3-t.-butoksikarbonyylipropyyli)pyridiniumjodidi Tämä yhdiste valmistetaan esimerkin 1 mukaisesti. MS - FAB: M+ 910.
10 104896
Esimerkki 9 : 3-hydroksi-l-(5-t.-butoksikarbonyyli- amino-5-t.-butoksikarbonyyli-pentyyli)-4-[l-t.-butok-s ikärbonyyliamino-1-N-(1-karboks i-2 -etyy1i)karboks-5 amido-2-etyyli]-5-(3-t.-butoksikarbonyyliamino-3-t.-butoks ikarbonyy1ipropyy1i)pyridiniumhydroks idi Tämä yhdiste valmistetaan seuraten esimerkin 7 mukaista menetelmää. MS - FAB: M* 896.
10 Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettu yhdiste X sisältyy kaavan I tai IA mukaisten yhdisteiden määrittelyyn. Kaavan I mukaisen yhdisteen kemiallinen rakennekaava on 15 Y-Rj.
Ri-X I R4 \ ^ (I) νΘ I x2 Θ 20 .
CHX: Z-Rj jossa 25 X, Y ja Z tarkoittavat toisistaan riippumatta Cx_ 8alkyyliä; C^alkyyliä, joka on yhden tai kahden hete-roatomin keskeyttämä, joka heteroatomi on O, N tai S; sykloalkyyliä; sykloalkyyli-C1.4alkyyliä; (C^alkyyli) -sykloalkyyliä; (C^alkyyli) -sykloalkyleeni-C1.4alkyy-30 liä; mahdollisesti substituoitua aryyliä; mahdollisesti substituoitua heteroaryyliä; (C1.4alkyyli)aryyliä; (C^alkyyli) heteroaryyliä; (C^alkyyli)-aryleeni- C^alkyyliä; (C1.4alkyyli) -heteroaryleeni-C^alkyyliä; aryyli-C^alkyyliä; heteroaryyli-C1.4alkyyliä, edellä 35 mainittujen ryhmien aryyli- tai heteroaryyliyksikköjen ollessa mahdollisesti substituoituja; R3 on COOH tai sen funktionaalinen johdannainen; CHO;
• · I
11 104896 CN; Cj.galkoksi; S02; -P03H tai sen funktionaalinen johdannainen; -SOjH tai sen funktionaalinen johdannainen; primaarinen, sekundaarinen tai tertiäärinen aminoryh-mä; tyydytetty tai tyydyttämätön syklinen aminoryhmä; 5 tai radikaali, jolla on kaava (a),
Rs-CH-R* (a) 10 jossa
Rs on primaarinen, sekundaarinen tai tertiäärinen aminoryhmä; tai tyydytetty tai tyydyttämätön syklinen aminoryhmä; j a
Rs on -COOH tai sen funktionaalinen johdannainen; 15 Ri ja R2 tarkoittavat toisistaan riippumatta vetyä tai jotakin R3 määrittelyn mukaisista merkityksistä; R4 on hydroksi; C^galkoksi; tai polyalkyleenioksi;
Xl on H tai OH, ja X2- on anioni, 20 ehdolla, että i) kun sekä X että Y sisältää alkyyliyksikön, niin -Y-sisältämän alkyyliyksikön ketjunpituus on ainakin yhden hiiliatomin verran lyhyempi kuin -X- sisältämän alkyyliyksikön ketjunpituus, ja . 25 ii) X2- on muu kuin Cl- tai CH3COO-, kun -X-Rx ja -Z-R3 tarkoittavat kumpikin - (CH2) 2-CH-COOH, -Y-R2 on nh2 -CH2-CH-COOH ja R4 on hydroksi.
30 | NH2 C1.8alkyyli on edullisesti C^alkyyli, edullisemmin C1.4alkyyli, erityisesti C1.2alkyyli.
4
Aryyli tarkoittaa edullisesti fenyyliä tai 1-35 tai. 2-naftyyliä, erityisesti fenyyliä. Aryyli voi olla substituoitu, esim. mono-, di- tai trisubstituoitu hydroksilla, C1.4alkyylillä, C1.4alkoksilla ja/tai halo- • · 1 12 104896 geenillä. Aryyli on edullisesti substituoimaton tai monosubstituoitu fenyyli.
Heteroaryyli tarkoittaa edullisesti tyydyte-tettyä tai tyydyttämätöntä 5- tai 6-jäsenistä hetero-5 syklistä rengasta, esim. imidatsolyyliä, tiatsolyyliä, piperidinyyliä, piperatsinyyliä tai ftaloyyliä. Ollessaan substituoitu se voi olla mono-, di- tai trisubs-tituoitu hydroksilla, alkyylillä, alkoksilla ja/tai halogeenilla. Heteroaryyli on edullisesti substituoi-10 maton.
Kun Rj, R2, R3 tai R5 on sekundaarinen amino-ryhmä, se on edullisesti -NHRa, jolloin Ra on 8alkyyli; C^alkyyli, joka on mahdollisesti substituoitu COOH tai sen funktionaalisella johdannaisella; C2_ 15 8alkenyyli; sykloalkyyli; sykloalkyyli-C^ealkyyli; fenyyli; fenyyli-C^alkyyli; tai Ra on radikaali -Ya tai -Za - Yb, jolloin Ya on suojaryhmä tai ryhmä, joka kykenee reagoimaan kovalenttisesti antigeenin tai suo-jaryhmän kanssa, Za on tilaryhmä (a spacer) ja Yb on 20 suojaryhmä tai antigeeninen ryhmä, biotinyyli tai ryhmä, joka on johdettu molekyylistä, joka kykenee muodostamaan kompleksin toisen molekyylin kanssa, kuten biotiini-avidiini-työkalu.
Kun Rx, R2, Rj tai Rs tarkoittaa tertiääristä 25 aminoryhmää, se on edullisesti -NRaRa' , jossa Ra tar-. - koittaa samaa kuin edellä ja Ra' tarkoittaa itsenäises ti jotakin Ra määrittelyn mukaisista merkityksistä; Ra ja Ra' ovat edullisesti kaksi sellaista substituenttia, jotka eivät estä toisiaan.
30 N-suojaryhmiin Ya:na tai Yb:nä kuuluu esim.
ryhmät, joita on esitetty julkaisussa, "Protective Groups in Organic Synthesis", T. W. Greene, J. Wiley & Sons NY (1981), 219-287, esim. asyyli, kuten formyyli, asetyyli, trifluoriasetyyli, metoksisukkinyyli, hyd-35 roksisukkinyyli tai bentsoyyli, jonka fenyylirengas on mahdollisesti substituoitu esim. p-metoksi-karbonyylillä, p-metoksilla, p-nitrolla tai p-fenyyli- • · « 13 104896 sulfonamidokarbonyylillä; alkoksikarbonyyli, kuten t-butyylioksikarbonyyli, isobutyylioksikarbonyyli tai metoksikarbonyyli: allyylioksikarbonyyli; aryylimetok-sikarbonyyli, kuten fluorenyylimetoksikarbonyyli tai 5 bentsyylioksikarbonyyli, jonka fenyylirengas on mahdollisesti substituoitu p-metoksilla, p-nitrolla, o-tai p-kloorilla, m-fenyylillä tai 3,4-dimetyylillä; trityyli; aryylimetyyli, kuten bentsyyli, jonka rengas on mahdollisesti substituoitu p-metoksilla, p-nitrolla 10 tai p-kloorilla; tai aryylisulfonyyli, kuten fenyyli-sulfonyyli, jonka rengas on mahdollisesti substituoitu p-metyylillä tai p-metoksilla, tai naftyylisulfonyyli, joka on mahdollisesti rengassubstituoitu esim. aminol-la tai di (Cx.4alkyyli) aminolla.
15 Esimerkkeinä karboksyylihapon funktionaali sista johdannaisista mainittakoon happohalidit, happo-anhydridit (sekahappoanhydridit mukaan lukien), aktiiviset esterit, aktiiviset amidit jne. Happohalideista käytetään useimmiten happokloridia. Happoanhydrideista 20 tuodaan esimerkkinä esiin sykliset anhydridit ja seka-anhydridit, kuten dialkyylifosforihapon seka-anhydridit, dialkyylifosforihapokkeen seka-anhydridi jne. Esimerkkeinä aktivoiduista estereistä R3-, R2-, R3 - tai R6-substituenttina mainittakoon C^alkyyH-25 esteri, esim. metyyliesteri tai etyyliesteri, syanome-' tyyliesteri, p-nitrofenyyliesteri, N-hydroksisukkini- imidin kanssa muodostettu esteri, mahdollisesti rengassubstituoitu fenyyli- tai bentsyyliesteri, tai fluorenyylimetyyliesteri. Esimerkkinä aktiivisista 30 karboksyylihappoamideista Rx-, R2-, R3- tai R6- substituenttina mainittakoon amidit imidatsolin, dime-tyyli-imidatsolin tai triatsolin kanssa. Karboksyyli-set amidiryhmät R2-, R2-, R3- tai R6-substituenttina voivat olla myös esim. -CONH2, 35 -CONHRa tai -CONRaRa 1, kuten on esitetty edellä.
Esimerkkeinä -S03H tai -P03H funktionaalisista johdannaisista ovat esim. C1.6alkyyli-, bentsyyli-, • ·.
14 104896 fenyyli-, allyyli- tai trimetyylisilyyliesterit, hap-pohalidit, esim. happokloridi, tai alemmat dialkyy-liamidit, esim. dietyyli- tai di-isopropyyliamidit. Edullisina mainittakoon (alkoksi)(diamino)fosfiinit, 5 esim. kuten fosfiini, jossa "alkoksi" on metoksi, bu-toksi, allyylioksi tai bentsoksi ja "diamino" on di-etyyliamino, dipropyyliamino tai di-isopropyyliamino.
Esimerkkeinä anionista X2- mainittakoon esim. OH-, Cl-, Br-, I-, CHjCOO-, CF3COO-.
10 Sopivista tilaryhmistä Za-substituenttina mainittakoon esim. radikaali, jolla on kaava (b) -R,-X,- (b) 15 jossa X3 on divalenttinen ryhmä, joka on saatu funktionaalisesta yksiköstä, joka kykenee reagoimaan kovalentti-sesti suojaryhmän tai antigeenin kanssa, ja R7 on C^alkyleeni, joka on mahdollisesti keskeytynyt 20 yhdellä tai useammalla heteroatomilla tai radikaalilla, joka voi olla happi, rikki, CO, -NHCO-, -CO-NH-, -N (Cj^alkyyli) -CO- , -CO-N(C1_4alkyyli) - , -NH- tai -N(C1.4alkyyli) - ; hydroksisubstituoitu C^alkyleeni; C2. ealkenyleeni; -CH-; tai radikaali, jolla on kaava (a3) , 25 | R8 jossa s ja t tarkoittavat toisistaan riippumatta 0, 1, 2 tai 3, rengas A on mahdollisesti substituoitu ja Ra 35 on mahdollisesti suojattu tähde, joka on liittyneenä luonnon tai ei-luonnon a-aminohapon Ca:ssä.
Z3 ja X3 voivat toisistaan riippumatta olla »·· ψ 15 104896 esim. -CO-, -CS- tai -NH-.
Esimerkkeinä substituentista R„ mainittakoon esim. mahdollisesti N-suojattu tähde, joka esiintyy Lystin Ce-hiilessä.
5 Sopiviin esimerkkeihin kaavan (b) mukaisesta radikaalista kuuluu esim. sukkinyyli, β-Ala tai diva-lenttinen tähde, joka on saatu 3-amino-propaanihaposta, 3-aminoisobutaanihaposta, 4- aminobutaanihaposta, NH2-C (CH3) 2-COOH, βίο aminoheksaanihaposta, 1,8-diamino-oktaanista, 1,6- diaminoheksaanista tai NH2-(CH2) ^-CO-NH-(CH2) ^-NHj.
Sopivista, antigeenin tai suojaryhmän kanssa kovalenttisesti reagoimaan kykenevistä ryhmistä Ya-.na mainittakoon esim. radikaali, jolla on kaava (bL) , 15 -R7-x4 (b3) jossa R7 tarkoittaa samaa kuin edellä, ja 20 X4 funktionaalinen yksikkö, joka kykenee reagoimaan antigeenin tai suojaryhmän kanssa.
Esimerkkeinä X4-substituenteista mainittakoon esim. karboksi, amino tai näiden funktionaalinen johdannainen, joka kykenee reagoimaan antigeenin tai suo-25 jaryhmän kanssa. Kaavan (b3) mukaisessa radikaalissa R7 on edullisesti Cj.galkyleeni tai C2.6alkenyleeni.
Antigeenisellä ryhmällä tarkoitetaan ryhmää, joka on saatu kantajamolekyylistä, esim. sellaista, jota on käytetty vasta-aineiden valmistuksessa, kuten 30 naudan seerumialbumiinia, muna-albumiinia, tyroglobu- liinia tai keyhole limpet hemosyaniinia, tai immunos-.♦1 . timuloivasta lipoaminohaposta tai lipopept idistä, esim. sellaisista yhdisteistä, joissa lipofiilinen yksikkö on tripalmitoyyli, kuten on esitetty julkai-3 5 sussa, G. Jung et ai., Int. J. Peptide Protein Res.
37. 1991, 46-57, joka liitetään hakemuksen liitteeksi.
Esimerkkeihin lipopeptideistä kuuluu N-palmitoyyli-S- r 16 104896 [2,3-bis(palmitoyylioksi)-(2RS)-propyyli]-[R]-kysteiini (käytetään nimitystä Pam3Cys-OH), Pam3Cys-Ser, Pam3Cys-Ser-(Lys) 4 ja Pam3Cys-Ser-(Glu) 4.
Kaavan I mukaisissa yhdisteissä seuraavat 5 merkitykset ovat erityisen edullisia joko yksinään tai minä tahansa yhdistelmänä tai alayhdistelmänä: 1. X on -(CH2)n-, jossa n on kokonaisluku väliltä 2 -8. Edullisemmin, n on 2.
10 2. Y on -(CH2)m-, jossa m on n - 1. Edullisemmin, m on 1.
3. Z on - (CH2) p-, jossa p on kokonaisluku väliltä 1 -8. Edullisemmin, p on 2.
15 4 . R4 on OH.
5. R3 on vety, karboksi tai sen funktionaalinen johdannainen, primaarinen, sekundaarinen tai tertiäärinen 20 aminoryhmä, tai kaavan (a) mukainen radikaali, edullisesti kaavan (a) mukainen radikaali.
6. R2 on vety, karboksi tai sen funktionaalinen johdannainen, primaarinen, sekundaarinen tai tertiäärinen 25 aminoryhmä, tai kaavan (a) mukainen radikaali.
7. R3 on karboksi tai sen funktionaalinen johdannainen, primaarinen, sekundaarinen tai tertiäärinen aminoryhmä, tai kaavan (a) mukainen radikaali.
30 8. Kaavan (a) mukainen radikaali on R'5-CH-COOH tai sen funktionaalinen johdannainen, jossa R1 s on -NH2 tai -NHRa, esim. ryhmä, jossa R's on -NH2, 35 -NHYa tai -NHZa-Yb ja karboksi on korvattu sen funktionaalisella johdannaisella, esim. esterillä tai amidilla .
* 17 104896 9. Kaavan (a) mukaisessa radikaalissa R's on -NHZa-Yb.
10. Kaavan (a) mukaisessa radikaalissa, kun R's on 5 -NHZa-Yb, niin Yb on edullisesti antigeeninen ryhmä, edullisemmin antigeeninen ryhmä, joka on saatu naudan seerumialbumiinista tai keyhole limpet hemosyaniinistä .
10 11. Kaavan (a) mukainen radikaali on R1 s-CH-CO-NHRa, jossa R's on NH2 tai NHYa. Ra on edullisesti Za-Yb. Yb on edullisesti antigeeninen ryhmä, edullisemmin antigeeninen ryhmä, joka on saatu naudan seerumialbumiinista 15 tai keyhole limpet hemosyaniinista.
Edullisia kaavan I mukaisia yhdisteitä ovat yhdisteet, joissa X on -CH2-CH2-, Y on -CH2-, Rj ja R2 tarkoittavat kumpikin kaavan (a) mukaista tähdettä, 20 jossa Rs on -NHa tai NHY'a, jossa Y'a on suojaryhmä, ja Rs on -COOH tai C2_7alkoksikarbonyyli, X2 on H tai OH, edullisesti H, Z on -CH2-CH2- ja R3 on kaavan (a) mukainen tähde, jossa Rs on -NH2 tai NHY'a ja Re on -CONH-Za-Yb tai -CONHYa.
25 Lisäksi edullisia kaavan I mukaisia yhdistei- * tä ovat yhdisteet, joissa X on -CH2-CH2-, Z on -CH2-CH2- , Rj ja Rj tarkoittavat kumpikin kaavan (a) mukaista tähdettä, jossa Rs on -NH2 tai NHY'a ja Re on -COOH tai C2,7alkoksikarbonyyli, X2 on H tai OH, edullisesti H, Y 3 0 on -CH2- ja R2 on kaavan (a) mukainen tähde, jossa Rs on -NH2 tai -NHY'a ja Rfi on -CONH-Za-Yb tai -CONHYa.
Edelleen edullisia kaavan I mukaisia yhdisteitä ovat yhdisteet, joissa Z on -CH2-CH2-, Y on -CH2-35 , R2 ja Rj tarkoittavat kumpikin kaavan (a) mukaista
tähdettä, jossa Rs on -NH2 tai NHY'a ja R6 on -COOH tai C2_7alkoksikarbonyyli, X2 on H tai OH, edullisesti H, X
• · · m 18 104896 on -CH2-CH2- ja Rx on kaavan (a) mukainen tähde, jossa Rs on -NH2 tai -NHY' a ja R6 on -CONH-Za-Yb tai -CONHYa.
Kaavojen I ja IA mukaiset yhdisteet voivat olla esim. suolamuodossa. Suoloihin kuuluu happoaddi-5 tiosuolat esim. orgaanisten suolojen, polymeeristen happojen tai epäorgaanisten happojen kanssa, kuten hydrokloridin ja asetaattien kanssa, sekä suolamuodot, jotka ovat saatavissa molekyylissä olevien karboksyy-li-, sulfoni- tai fosforihapporyhmien kanssa, kuten 10 alkalimetallisuolat tai substituoidut tai substituoi-mattomat ammoniumsuolat sekä ns. sisäiset suolat, kun molekyyli sisältää ainakin yhden kaavan (a) mukaisen radikaalin.
Kaavan (a) mukainen radikaali sisältää asym-15 metrisen hiiliatomin ja se voi esiintyä D- tai L-konfiguraatiossa. Kaavojen I ja IA mukaiset yhdisteet sisältävät myös asymmetrisen hiilen, kun on OH. Esillä olevan keksinnön katsotaan käsittävän optiset isomeerit sekä kaavan IA mukaisten yhdisteiden ja kaa-20 van I mukaisten yhdisteiden, joissa X2 on OH ja joiden molekyylissä esiintyy aina kolme kappaletta saakka kaavan (a) mukaista radikaalia, diasteroisomeerit. Sama koskee lähtömateriaaleja, jotka sisältävät kaavan (a) mukaisen radikaalin tai joissa X2 on OH.
25 Kaavan X (sekä kaavojen I ja IA) mukaiset : yhdisteet ovat hyödyllisiä arvioitaessa kollageenin hajoamisessa muodostuneiden pyridinoliini- tai deoksi-pyridinoliiniristisidosyhdisteiden tasoja biologisista nesteistä, esim. virtsasta tai seerumista. Eläinten ja 30 ihmisten tiloista, joille on tunnusomaista korkea luun resorptiotaso tai luun muodostumisen ja luun resorpti-on välinen epänormaali tasapaino, mainittakoon esim. osteoporoosi, Pagetin tauti, luun hyvä- tai pahalaatuisten kasvaimien ja etäispesäkkeisen syövän etenemi-35 nen, osteomalasia, primaarinen hyperparatyroidismi, erilaiset hoidot luun resorptiota lisäävillä yhdisteillä (esim. glukokortikoideilla) , nivelrikko ja ni- ψ 19 104896 veireuma.
Näiden ristisidosyhdistetasojen kvantitatiivinen määrittely voidaan suorittaa käyttäen esim. immunologisia menetelmiä, elektrokemiallista titrausta, 5 luonnon fluoresenssispektroskopiaa tai ultraviolet- tiabsorbanssimääritystä. Nämä menetelmät voidaan suorittaa suoraan kehon nesteestä ilman enempää puhdistamista tai puhdistuksen jälkeen, mikäli esiintyy esim. ylimäärin kontaminoivaa ainesta. Biologisissa nesteis-10 sä vapaina esiintyvät ristisidosyhdisteet tai ris-tisidosyhdisteet, jotka ovat vapautuneet hydrolysoitumalla kollageenin hajoamispeptideistä ja joita esiintyy kehon nesteissä, voidaan määrittää kvantitatiivisesti. Kaikilla ristisidosyhdisteillä tarkoitetaan 15 kehon nesteessä esiintyvän ristisidosyhdisteiden va paan osan ja hydrolysoituneiden ristisidosyhdisteiden kokonaismäärää tai -pitoisuutta.
Pyridinoliini- tai deoksipyridinoliiniris-tisidosyhdisteiden kvantitatiivinen määrittäminen bio-20 logisista nesteistä suoritetaan edullisesti immunolo gisia menetelmiä käyttäen. Siten valmistetaan spesifisiä vasta-aineita kaavan X (ja I) mukaisille yhdisteille, jotka sisältävät ainakin yhden antigeenisen ryhmän ja joista käytetään myöhemmin nimitystä immuno-25 geeni. Voidaan valmistaa joko polyklonaalisia tai mo- *--- noklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat immunoreaktii- visia kaavan X ja kaavan I mukaisen yhdisteen kanssa, joka sisältää ainakin yhden antigeenisen ryhmän ja jossa X1 on vety, ja/tai tällaisen substituoidun yhdis-30 teen kanssa, jossa Χλ on hydroksi. Valmistetaan spesi fisiä vasta-aineita, jotka ovat immunoreaktiivisia kaavan X ja kaavan I mukaisen yhdisteen kanssa, joka sisältää ainakin yhden antigeenisen ryhmän ja jossa X^ on H.
35 Kuten edellä on esitetty, kaavan X (ja I) mukaisissa yhdisteissä antigeeninen ryhmä voidaan liittää suoraan tai epäsuorasti tiettyyn paikkaan: * 20 1 0 4 8 9 6 esim. antigeeninen ryhmä voi esiintyä substituentissa R2, R2 tai R3, erityisesti substituentissa R3 tai R2. Antigeeninen ryhmä on edullisesti liitetty tilaryhmän välityksellä. Kaavan IA mukaiset yhdisteet, jotka on 5 valmistettu esillä olevan keksinnön mukaisesti, ovat lisäksi hyödyllisiä käytettäväksi vastaavien kaavan X ja kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistamiseen, jotka sisältävät yhden, kaksi tai kolme antigeenistä ryhmää, kuten edellä on esitetty.
10 Vasta-aineen valmistus voidaan toteuttaa kon ventionaalisin menetelmin, jolloin kaavan X (ja I) mukaista yhdistettä, joka sisältää ainakin yhden antigeenisen ryhmän, voidaan esim. injektoida sopiviin nisäkäskohteisiin, kuten hiiriin, kaniineihin tai lam-15 paisiin alalla yleisesti tunnettujen immunologisten tekniikoiden mukaisesti (Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Campell, A. M., 1986, 13, Elsevier). Seerumit titrataan vasta- ainemuodostuksen määrittämiseksi immunogeenin suhteen. 20 Pernasolut tai periferaaliset veren lymfosyytit ote taan talteen, homogenisoidaan ja sitten fuusioidaan esim. syöpäsolujen kanssa fuusioidun soluhybridin saamiseksi, joka tuottaa halutun kaavan I omaavan keksinnön mukaisen ristisidosyhdisteen kanssa immunoreaktii-25 visia monoklonaalisia vasta-aineita. Monoklonaalinen *··· vasta-ainevalmistus voidaan suorittaa menetelmien avulla, joita on kuvattu julkaisussa G. Galfre ja C. Milstein, 1981, Meth. Enzymol. 7_3, 1.
Polyklonaalisia tai erityisesti monoklonaali-30 siä vasta-aineita tai niiden fragmentteja, jotka on valmistettu edellä mainituilla menetelmillä tai vas-.. _ taavilla menetelmillä, voidaan käyttää erilaisissa immunometrisissä määrityksissä mittaamaan kvantitatiivisesti kollageenin hajoamisessa muodostuvien pyri-35 dinoliini- tai deoksipyridinoliiniristisidosyhdistei- den pitoisuutta biologisista nesteistä. Näihin immuno-metrisiin määrityksiin kuuluu monoklonaalinen vasta- ψ 21 104896 aine tai vasta-ainefragmentti, joka on sidottu detek-toitavaan merkkiaineeseen. Esimerkkeinä sopivista de-tektoitavista merkkiaineista mainittakoon esim. entsyymit, koentsyymit, entsyymi-inhibiittorit, kromofo-5 rit, fluoroforit, kemiluminenssimateriaalit, paramag- neettiset metallit, spin-leimat ja radionuklidit. Esimerkkeinä standardi-immunometrisistä menetelmistä, jotka soveltuvat ilmaisemaan luun resorptiota, mainittakoon esim. entsyymisidottu immunosorbenttimääritys 10 (ELISA), radioimmunomääritys (RIA) ja sandwich- immunoradiometrinen määritys (IRMA).
Kaavan X (ja I) mukaista yhdistettä, joka on vapaa antigeenisestä ryhmästä, tai keksinnön mukaisesti valmistettua kaavan IA mukaista yhdistettä, jossa X1 15 on H tai OH, voidaan käyttää standardivertailunäyttee nä määritettäessä kvantitatiivisesti kollageenin hajoamisessa muodostuneiden pyridinoliini- tai deoksipy-ridinoliiniristisidosyhdisteiden pitoisuutta biologisesta nesteestä esim. millä tahansa edellä mainitulla 20 kvantitatiivisella menetelmällä tai kittipakkauksella, joka perustuu tällaiseen kvantitatiiviseen menetelmään.
»« ψ
Claims (5)
- 22 104896
- 1. Menetelmä kaavan X mukaisen 1,4,5-trisubstituoidun-3-hydroksi-pyridiniumyhdisteen valmistamiseksi 5 ?5 I1 f ' L Js^ ,OH
- 10 Xj 0 V R^R, 15 jossa R, on -NHj, -NHYa tai NHZj-Y.,, jossa Ya on aminosuojaryh-mä, Zs on sukkinyyli, δ-Aia tai divalenttinen jäännös, joka on saatu 3-amino-propaanihaposta, 3-20 aminoisobutaanihaposta, 4-aminobutaanihaposta, NH2-C(CH3) 2-COOH:sta, 6-aminoheksaanihaposta, 1,8-diamino-oktaanista, 1,6-diaminoheksaanista tai NH2-(CH2CO-NH-CH2 (i_e) -NHj: s ta ja Yb on aminosuoj aryhmä tai antigeeninen ryhmä, 25 aminosuojaryhmä on valittu bentsoyylistä, jonka fenyy-lirengas voi olla valinnaisesti substituoitu substituent ilia p-metoksikarbonyyli, p-metoksi tai p-nitro; t-butyylioksikarbonyyli; isobutyylioksikarbonyyli; metoksikarbonyyli; allyylioksikarbonyyli; 9- 30 fluorenyylimetoksikarbonyyli; bentsyylioksikarbonyyli, jonka fenyylirengas voi olla valinnaisesti substituoi-.. tu substituentilla p-metoksi, p-nitro, o- tai p- kloori, m-fenyyli tai 3,4-dimetyyli; bentsyyli, jonka rengas voi olla valinnaisesti substituoitu substituen-35 tiliä p-metoksi, p-nitro tai p-kloori; tai fenyylisul-fonyyli, jonka rengas voi olla valinnaisesti substitu- • · 104896 oitu substituentilla p-metyyli tai p-metoksi; antigeeninen ryhmä on valittu naudan seerumialbumiinista, muna-albumiinista, tyroglobuliinistä tai keyhole limpet hemosyaniinista,
- 5 Re on -COOH, C2_7alkoksikarbonyyli, CONH2, CONHYa tai -CONH-Za-Y„, jossa Ya, Za ja Yb tarkoittavat samaa kuin edellä, Xx on H tai OH ja X2~ on anioni, 10 tunnettu siitä, että menetelmässä yhdisteen, jolla on kaava II, jossa Rs ja R6 tarkoittavat samaa kuin edellä, 20 annetaan reagoida yhdisteen kanssa, jolla on kaava III, X5 - CH2 - CHX! - CHj - CH2 - CHRsRe (III) jossa
- 25 Xx, R5 ja Rs tarkoittavat samaa kuin edellä, ja • < *·: X5 on lohkeava ryhmä; ja otetaan talteen täten saatu kaavan X mukainen yhdiste vapaassa tai suolan muodossa. 1 ψ · 104896
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9202139 | 1992-01-31 | ||
| GB929202139A GB9202139D0 (en) | 1992-01-31 | 1992-01-31 | Improvements in or relating to organic compounds |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI930367A0 FI930367A0 (fi) | 1993-01-28 |
| FI930367A FI930367A (fi) | 1993-08-01 |
| FI104896B true FI104896B (fi) | 2000-04-28 |
Family
ID=10709643
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI930367A FI104896B (fi) | 1992-01-31 | 1993-01-28 | Menetelmä 1,4,5-trisubstituoidun-3-hydroksi-pyridiniumyhdisteen valmistamiseksi |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0556152B1 (fi) |
| JP (1) | JP3544549B2 (fi) |
| AT (1) | ATE210645T1 (fi) |
| AU (1) | AU663909B2 (fi) |
| CA (1) | CA2088396A1 (fi) |
| CZ (1) | CZ288038B6 (fi) |
| DE (1) | DE69331293T2 (fi) |
| DK (1) | DK0556152T3 (fi) |
| ES (1) | ES2169723T3 (fi) |
| FI (1) | FI104896B (fi) |
| GB (1) | GB9202139D0 (fi) |
| HU (1) | HU214677B (fi) |
| NO (1) | NO180779C (fi) |
| PT (1) | PT556152E (fi) |
| SG (1) | SG43065A1 (fi) |
| SK (1) | SK281137B6 (fi) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5620861A (en) * | 1992-07-31 | 1997-04-15 | Metra Biosystems, Inc. | Method and kit for pyridinium crosslink assay |
| US5756361A (en) * | 1992-12-17 | 1998-05-26 | Metra Biosystems, Inc. | Screening method for periodontal disease |
| US5736344A (en) * | 1992-12-17 | 1998-04-07 | Metra Biosystems, Inc. | Serum pyridinium crosslinks assay |
| US5661039A (en) * | 1995-03-01 | 1997-08-26 | Metra Biosystems, Inc. | Perspiration assay for bone resorption |
| US5723619A (en) * | 1997-01-13 | 1998-03-03 | Bayer Corporation | Method for the synthesis of deoxypyridinoline |
| US5834610A (en) * | 1997-05-06 | 1998-11-10 | Johnson; Gary M. | Conversion of pyridinoline to deoxypyridinoline |
| CN105801688A (zh) * | 2016-04-14 | 2016-07-27 | 苏州博源医疗科技有限公司 | 脱氧吡啶酚免疫原、抗体和检测试剂及制备方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59148766A (ja) * | 1983-02-10 | 1984-08-25 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | ピリジン誘導体 |
| US4973666A (en) * | 1987-11-06 | 1990-11-27 | Washington Research Foundation | Peptide fragments containing HP and LP cross-links |
| GB8929366D0 (en) * | 1989-12-30 | 1990-02-28 | Rowett Research Inst | Method to detect connective tissue disorder in humans and animals |
-
1992
- 1992-01-31 GB GB929202139A patent/GB9202139D0/en active Pending
-
1993
- 1993-01-15 HU HU9300108A patent/HU214677B/hu not_active IP Right Cessation
- 1993-01-26 SG SG1996003175A patent/SG43065A1/en unknown
- 1993-01-26 DK DK93810049T patent/DK0556152T3/da active
- 1993-01-26 PT PT93810049T patent/PT556152E/pt unknown
- 1993-01-26 ES ES93810049T patent/ES2169723T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-01-26 EP EP93810049A patent/EP0556152B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-01-26 AT AT93810049T patent/ATE210645T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-01-26 DE DE69331293T patent/DE69331293T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-01-28 SK SK42-93A patent/SK281137B6/sk unknown
- 1993-01-28 FI FI930367A patent/FI104896B/fi active
- 1993-01-28 NO NO930284A patent/NO180779C/no unknown
- 1993-01-29 AU AU32105/93A patent/AU663909B2/en not_active Ceased
- 1993-01-29 JP JP01341493A patent/JP3544549B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1993-01-29 CZ CZ1993106A patent/CZ288038B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1993-01-29 CA CA002088396A patent/CA2088396A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU663909B2 (en) | 1995-10-26 |
| JPH0641078A (ja) | 1994-02-15 |
| SK281137B6 (sk) | 2000-12-11 |
| NO180779B (no) | 1997-03-10 |
| AU3210593A (en) | 1993-08-05 |
| DE69331293D1 (de) | 2002-01-24 |
| GB9202139D0 (en) | 1992-03-18 |
| HU9300108D0 (en) | 1993-04-28 |
| HU214677B (hu) | 1998-04-28 |
| DK0556152T3 (da) | 2002-04-08 |
| NO180779C (no) | 1997-06-18 |
| CA2088396A1 (en) | 1993-08-01 |
| EP0556152A1 (en) | 1993-08-18 |
| PT556152E (pt) | 2002-05-31 |
| HUT70276A (en) | 1995-09-28 |
| CZ288038B6 (cs) | 2001-04-11 |
| SG43065A1 (en) | 1997-10-17 |
| FI930367A (fi) | 1993-08-01 |
| FI930367A0 (fi) | 1993-01-28 |
| ATE210645T1 (de) | 2001-12-15 |
| JP3544549B2 (ja) | 2004-07-21 |
| EP0556152B1 (en) | 2001-12-12 |
| NO930284L (no) | 1993-08-02 |
| DE69331293T2 (de) | 2002-07-18 |
| NO930284D0 (no) | 1993-01-28 |
| SK4293A3 (en) | 1993-11-10 |
| CZ10693A3 (en) | 1993-12-15 |
| ES2169723T3 (es) | 2002-07-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3327551B2 (ja) | 流体試料中のチロキシンを検出・定量するための試薬および方法 | |
| SU1621811A3 (ru) | Способ получени производных резоруфина | |
| AU2010284614B2 (en) | Imatinib immunoassay | |
| JP2015096549A (ja) | リスペリドンイムノアッセイ | |
| AU2011224719A1 (en) | Lenalidomide and thalidomide immunoassays | |
| AU2013305904A1 (en) | Antibodies to quetiapine haptens and use thereof | |
| AU2013305895A1 (en) | Antibodies to olanzapine haptens and use thereof | |
| CN104854110A (zh) | 奥氮平半抗原 | |
| JP2016510413A (ja) | 分子の検出のための光又は化学解離性コンジュゲート | |
| AU2013305935A1 (en) | Haptens of quetiapine for use in immunoassays | |
| CA2586511A1 (en) | Immunoassays for lamotrigine | |
| US8846411B2 (en) | Derivatives, reagents, and immunoassay for detecting levetiracetam | |
| FI104896B (fi) | Menetelmä 1,4,5-trisubstituoidun-3-hydroksi-pyridiniumyhdisteen valmistamiseksi | |
| WO2008145609A1 (en) | Method of making covalent conjugates with his-tagged proteins | |
| EP0931062B1 (en) | Conjugates and specific immunoassays for the methadone metabolite 2-ethylidine-1,5-dimethyl-3,3-diphenylpyrrolidine | |
| KR100259761B1 (ko) | 에스에이치기 표지용시약, 그의 제조방법 및 이를 이용한 표지법 | |
| CA2216880A1 (en) | Reagents and methods for the detection and quantification of vancomycin in biological fluids | |
| Adamczyk et al. | Synthesis of immunocomponents for the measurement of lead (Pb) by fluorescence polarization immunoassay | |
| US6175016B1 (en) | Pyridine derivatives | |
| Fagbure | Small Molecule Inhibitors of the Endoplasmic Reticulum Associated Degradation Pathway | |
| Bailey et al. | Strategies For Increasing The Sensitivity of N-Terminal Sequence Analysis | |
| EP0265496A1 (en) | Flecainide derivatives and their use in immunoassays. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GB | Transfer or assigment of application |
Owner name: NOVARTIS AG |