ES3066493T3 - Compositions for treating tauopathy - Google Patents

Abstract

La presente divulgación se enmarca en el campo del diagnóstico y la terapéutica de la enfermedad de Alzheimer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Composiciones para el tratamiento de la tauopatía

[0003] Campo técnico

[0004] La presente divulgación está en el campo de las composiciones y procedimientos para modular la expresión de tau, incluyendo para el tratamiento y/o prevención de tauopatías tales como la enfermedad de Alzheimer.

[0005] Antecedentes

[0006] Los niveles anómalos y/o la agregación de la proteína tau, una proteína asociada a microtúbulos (también denominada MAPT) que se puede acumular en los ovillos neurofibrilares (ONF), se ha relacionado con una serie de afecciones, denominadas conjuntamente tauopatías. Estas incluyen enfermedad de Alzheimer (EA), demencia frontotemporal (DFT, véase Benussiet al.(2015) Front Aging Neurosci. 7(171):1-19), parálisis supranuclear progresiva (PSP), las epilepsias genéticas intratables (por ejemplo, síndrome de Dravet, véase Gheyaraet al.(2014) Ann Neurol 76:443-456), traumatismo craneoencefálico (TCE) y la degeneración corticobasal (DCB, véase Scholz y Bras (2015) Int J. Mol Sci 16(10): 24629-24655). Estudios previos han demostrado que una reducción de la expresión de la proteína tau en ratones adultos usando oligonucleótidos antisentido administrados directamente en el líquido cefalorraquídeo (LCR) causó una reducción completa o parcial de los niveles de proteína tau y también protegió a los ratones tratados de las convulsiones inducidas químicamente en términos de gravedad de las convulsiones (DeVoset al.(2013) J of NeuroSci 33(31):12887). En la EA, por ejemplo, existe una correlación directa entre la presencia de ONF de tau en el cerebro y el deterioro cognitivo (Spires-Jones y Hyman (2014) Neuron 82:756).

[0007] También se ha sugerido que la proteína tau puede tener propiedades similares a priones, ya que la proteína tau con plegamiento incorrecto altamente fosforilada es asimilada más fácilmente por las neuronas y puede propagar la enfermedad por todo el cerebro, y que esta proteína tau con plegamiento incorrecto aislada de cerebros de pacientes con EA puede ser asimilada fácilmente por neuronas de ratón (Takedaet al.(2015) Nat Comm, doi: 10.1038/ncomms9490; Hyman (2014) Neuron 82:1189). La expresión limitada por la corteza entorrinal de una proteína tau humana asociada a ovillos en un modelo de ratón transgénico dio lugar al plegamiento incorrecto de la proteína tau de ratón y a la agregación de esa proteína tau en neuronas sin ninguna expresión detectable de proteína tau humana (de Calignonet al.(2012) Neuron 73:685-697). Este trabajo sugiere que la proteína humana con plegamiento incorrecto puede "sembrar" el plegamiento incorrecto y provocar la agregación de las proteínas de ratón. Además, la reducción o pérdida génica de tau de ratón endógena protege contra la toxicidad neuropatológica provocada por la sobreexpresión de un transgén de tau humana mutante (Wegmannet al.(2015) EMBO J.34(24):3028-41).

[0008] Se estima que 5,3 millones de estadounidenses tienen enfermedad de Alzheimer (EA), lo que la convierte en una de las diez principales causas de muerte en Estados Unidos, y se estima que, para el año 2050, habrá 106,2 millones de personas en todo el mundo con la enfermedad (van Dijket al.(2015) Front Neurosci 9:173). La enfermedad es más prevalente en mujeres (dos tercios de los casos) y las personas de ascendencia africana o hispana tienen más probabilidades de desarrollar EA que las personas de ascendencia caucásica. Las causas de la EA parecen estar relacionadas con la genética (especialmente para el inicio temprano, un 5 % de los casos) y con factores ambientales y de estilo de vida. Típicamente, la enfermedad se diagnostica en una persona de alrededor de 65 años, aunque en el momento en que se realiza un diagnóstico, la enfermedad ha estado progresando durante años o incluso décadas. La enfermedad progresa con el tiempo y, hasta ahora, no se han identificado intervenciones terapéuticas que limiten o reviertan los efectos de la enfermedad.

[0009] La represión o activación de genes asociados a la enfermedad se ha logrado a través del uso de factores de transcripción genomanipulados. Los procedimientos de diseño y uso de factores de transcripción con dedos de cinc (ZFP-TF) genomanipulados están bien documentados (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.º 6.534.261) y, más recientemente, también se han descrito tanto factores de transcripción efectores similares a activadores de la transcripción (TALE-TF) como factores de transcripción basados en Cas 9 con agrupaciones de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares (CRISPR-Cas-TF) (véase la revisión Kabadi y Gersbach (2014) Methods 69(2): 188-197). Los ejemplos no limitantes de genes seleccionados incluyen fosfolamban (Zhanget al.(2012) Mol Ther 20(8):1508-1515), GDNF (Laganiereet al.(2010) J. Neurosci 30(49):16469) y VEGF (Liuet al.(2001) J Biol Chem 276:11323-11334). Además, se ha logrado la activación de genes mediante el uso de una fusión CRISPR/Cas-acetiltransferasa (Hiltonet al.(2015) Nat Biotechnol 33(5):510-517). También se ha demostrado que los TF genomanipulados que reprimen la expresión génica (represores) son eficaces en el tratamiento de trastornos de trinucleótidos tales como enfermedad de Huntington (EH), véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.º 8.956.828 y la publicación de patente de EE. UU. n.º 2015/0335708. La publicación de patente de EE. UU. n.º 2018/0153921 divulga moduladores de tau.

[0010] Sin embargo, todavía se necesitan composiciones y procedimientos mejorados para el diagnóstico, prevención y/o tratamiento de tauopatías. Por tanto, en el presente documento se describen composiciones y procedimientos para la prevención y/o el tratamiento de tauopatías, incluyendo EA.

[0011] El documento EP 3 080 611 A1 se refiere a composiciones que comprenden especies de tau de alto peso molecular solubles responsables de la propagación entre neuronas y aplicaciones de las mismas, así como a procedimientos de tratamiento y diagnóstico de neurodegeneración asociada a tau en un sujeto.

[0012] El documento WO 2017/011556 A1 se refiere a formas de especies de tau de alto peso molecular fosforiladas y aplicaciones de las mismas, así como a procedimientos de diagnóstico y/o tratamiento de neurodegeneración asociada a tau.

[0013] El documento US 2018/153921 A1 se refiere a procedimientos y composiciones para tratar o prevenir la enfermedad de Alzheimer.

[0014] Sumario

[0015] La invención es como se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto. Cualquier parte de la descripción que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones no forma parte de la invención, pero sirve para la comprensión de la invención reivindicada. Cualquier modo de realización de la descripción que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones no forma parte de la invención, pero forma parte de la presente divulgación para propósitos ilustrativos.

[0016] Cualquier referencia en la descripción a procedimientos de tratamiento, incluyendo la administración a un paciente en un procedimiento de tratamiento, se ha de interpretar como referencia a las composiciones de la presente divulgación para su uso en un procedimiento para el tratamiento del cuerpo de un ser humano (o animal) por tratamiento, o para su uso en la administración a un paciente en un procedimiento de tratamiento. La invención se refiere a una composición para su uso en un procedimiento para la prevención y/o tratamiento de tauopatía en un sujeto que lo necesita, comprendiendo la composición un primer y un segundo factores de transcripción de proteínas con dedos de cinc (ZFP-TF) artificiales que reprimen la expresión deMAPT, en la que el primer ZFP-TF se une a los nucleótidos en mayúscula en (SEQ ID NO:1) y el segundo ZFP-TF se une a los nucleótidos en mayúscula en

[0017] (SEQ ID NO:2), en la que

[0018] (a) el dominio de unión a ADN del primer ZFP-TF comprende seis regiones de dedos de cinc F1 a F6 que comprenden las SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 5 y 7, respectivamente; y

[0019] (b) el dominio de unión a ADN del segundo ZFP-TF comprende seis regiones de dedos de cinc F1 a F6 que comprenden (i) las SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12 y 13, respectivamente, y (ii) una sustitución de R a Q en la posición -5 de F1 y F5.

[0020] La invención se refiere además a una composición para su uso en un procedimiento para la prevención y/o tratamiento de tauopatía en un sujeto que lo necesita, comprendiendo la composición un primer y un segundo factores de transcripción de proteínas con dedos de cinc (ZFP-TF) artificiales que reprimen la expresión deMAPT, en la que el primer ZFP-TF se une a los nucleótidos en mayúscula en (SEQ ID NO:1) y el segundo ZFP-TF se une a los nucleótidos en mayúscula en

(SEQ ID NO:2), en la que

[0021] (a) el dominio de unión a ADN del primer ZFP-TF comprende seis regiones de dedos de cinc F1 a F6 que comprenden las SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 5 y 7, respectivamente; y

[0022] (b) el dominio de unión a ADN del segundo ZFP-TF comprende seis regiones de dedos de cinc F1 a F6 que comprenden las SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13, respectivamente.

[0023] En el presente documento se divulgan procedimientos y composiciones para diagnosticar, prevenir y/o tratar una o más tauopatías, tales como enfermedad de Alzheimer (EA). En particular, en el presente documento se proporcionan procedimientos y composiciones para modificar (por ejemplo, modular la expresión de) un alelotaupara tratar al menos una tauopatía tal como EA, incluyendo represores de factores de transcripción genomanipulados (que reprimen la expresión de la proteína tau). Además, estos procedimientos y composiciones se pueden usar para modificar un aleloMAPTpara el tratamiento y/o prevención de otras tauopatías, incluyendo EA, DFT, PSP, DCB y/o convulsiones. Además, el uso de dos o más represores de tau proporciona un efecto sinérgico sorprendente e inesperado en comparación con el uso de represores individuales. En particular, en el presente documento se proporcionan procedimientos y composiciones para detectar, reducir y/o eliminar agregados de proteína tauin vivoen un sujeto con una tauopatía.

[0024] Por tanto, en el presente documento se describen moduladores génicos de un gen de proteína tau asociada a microtúbulos (MAPT) para su uso en la modulación de la expresión de tauin vivo. El modulador comprende al menos una molécula de fusión que comprende un dominio de unión a ADN que se une a un sitio diana de al menos 12 nucleótidos en el genMAPT; y un dominio funcional (por ejemplo, un dominio regulador de la transcripción (tal como un dominio de represión o un dominio de activación) o dominio de nucleasa). Se puede usar cualquier dominio de unión a ADN, incluyendo, pero sin limitarse a, una proteína con dedos de cinc (ZFP), una proteína de dominio efector TAL (TALE), un ARN guía monocatenario (de un sistema CRISPR), una proteína argonauta y similares. En determinados modos de realización, el dominio de unión a ADN es un dominio de unión a ADN de proteínas con dedos de cinc, por ejemplo, un ZFP-TF, a saber una proteína de fusión que comprende una ZFP que se une específicamente a un alelotauy un dominio de represión transcripcional (por ejemplo, KOX, KRAB, etc.). En determinados modos de realización, los dominios de unión a ADN de proteínas con dedos de cinc tienen las hélices de reconocimiento en las proteínas mostradas en la tabla 1, incluyendo, pero sin limitarse a, las ZFP designadas como 57890, 65918, 57930. En cualquiera de las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento se usan dos o más moduladores génicos (por ejemplo, 65918 en combinación con 57890). Las dos o más proteínas de fusión se pueden unir a diferentes sitios diana y comprender los mismos o diferentes dominios funcionales. Los dos o más represores de tau pueden proporcionar un efecto sinérgico sorprendente e inesperado en comparación con el uso de represores individuales. De forma alternativa, las dos o más proteínas de fusión como se describe en el presente documento se pueden unir al mismo sitio diana pero incluir diferentes dominios funcionales. En algunos casos se usan tres o más proteínas de fusión, en otros se usan cuatro o más proteínas de fusión, mientras que, en otros, se usan 5 o más proteínas de fusión. En modos de realización preferentes, las dos o más, tres o más, cuatro o más, o cinco o más proteínas de fusión se administran a la célula como ácidos nucleicos (por ejemplo, rAAV). Se pueden usar uno o más ácidos nucleicos (por ejemplo, vectores AAV) para administrar los represores de tau descritos en el presente documento. En determinados modos de realización, el represor de tau comprende dos o más represores de tau transportados por un vector de ácido nucleico individual (por ejemplo, un vector AAV) en el que las secuencias que codifican el represor están separadas por una secuencia 2A (por ejemplo, T2a). En estos modos de realización, las secuencias que codifican los dos o más represores de tau pueden estar en cualquier orden (por ejemplo, represor 65918 - T2a - represor 57890 o represor 57890 - T2A -represor 65918). En modos de realización preferentes, las proteínas de fusión provocan una represión de la expresión del gen diana. En algunos modos de realización, se administran dos proteínas de fusión a dosis a las que cada proteína está activa por sí sola, pero en combinación, la actividad de represión es aditiva. En modos de realización preferentes, se administran dos proteínas de fusión a dosis a las que ninguna está activa por sí sola, pero en combinación, la actividad de represión es sinérgica.

[0026] Los moduladores génicos descritos en el presente documento se pueden proporcionar al sujeto en cualquier forma, incluyendo en forma de polinucleótido y/o proteína, así como composiciones farmacéuticas que comprenden dichos polinucleótidos y/o proteínas.

[0028] En algunos aspectos, los moduladores génicos (o un componente de los mismos, por ejemplo, la proteína de unión a ADN) se proporcionan en forma de polinucleótido. En determinados modos de realización, el polinucleótido es un vector de transferencia génica que comprende cualquiera de los polinucleótidos (por ejemplo, que codifica los moduladores génicos (represores)) como se describe en el presente documento. En determinados modos de realización, el vector es un vector de adenovirus (por ejemplo, un vector Ad5/F35), un vector lentivírico (LV) que incluye vectores lentivíricos competentes o de integración deficiente, o un vector víricos adenoasociados (AAV). En determinados modos de realización, el/los modulador(es) génico(s) se transporta(n) en al menos un vector AAV (o pseudotipo o variante del mismo), incluyendo, pero sin limitarse a, uno o más AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV 8.2, AAV9, AAV rh10, pseudotipos de estos vectores (por ejemplo, como AAV2/8, AAV2/5, AAV2/6, AAV2/9, etc.), incluyendo variantes de vectores AAV conocidas en la técnica (por ejemplo, patentes de EE. UU. n.º 9.585.971 y 7.198.951; publicación de patente de EE. UU. n.º 2017/0119906). En algunos modos de realización, el vector AAV es una variante AAV que puede atravesar la barrera hematoencefálica (por ejemplo, patente de EE. UU. n.º 9.585.971).

[0030] En determinados modos de realización, se proporcionan en el presente documento moduladores génicos de tau que están compuestos de uno o más vectores, incluyendo vehículos de transferencia génica víricos y no víricos (por ejemplo, como ARNm, plásmidos, vectores AAV, vectores lentivíricos, vectores de Ad), que codifican los moduladores génicos como se describe en el presente documento (o uno o más componentes de los mismos en los mismos o diferentes polinucleótidos). En determinados modos de realización, el polinucleótido es un ARNm. En algunos aspectos, el ARNm se puede modificar químicamente (véase, por ejemplo, Kormannet al.(2011) Nature Biotechnology 29(2):154-157). En otros aspectos, el ARNm puede comprender una caperuza (por ejemplo, una caperuza ARCA (véanse las patentes de EE. UU. n.º 7.074.596 y 8.153.773)). En otros modos de realización, el ARNm puede comprender una mezcla de nucleótidos no modificados y modificados (véase la publicación de patente de EE. UU n.º 2012/0195936).

[0032] También se proporcionan composiciones farmacéuticas y células aisladas que comprenden uno o más de los moduladores génicos, uno o más polinucleótidos y/o uno o más vehículos de transferencia génica. En determinados modos de realización, la composición farmacéutica comprende dos o más moduladores génicos.

[0033] Por ejemplo, determinadas composiciones incluyen un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una de las ZFP, Cas o TALE moduladoras de tau descritas en el presente documento enlazadas de forma funcional a una secuencia reguladora, combinado con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, donde la secuencia reguladora permite la expresión del ácido nucleico en una célula. En determinados modos de realización, las ZFP, CRISPR/Cas o TALE codificadas son específicas para un aleloMAPTmutante o natural. En algunos modos de realización, las composiciones farmacéuticas comprenden ZFP, CRISPR/Cas o TALE que modulan un aleloMAPTmutante o natural. Las composiciones basadas en proteínas incluyen una o más ZFP, CRISPR/Cas o TALE como se divulga en el presente documento y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

[0034] En otros modos de realización, en el presente documento se describen procedimientos y usos para reprimir la expresión deMAPTen un sujeto que lo necesita, incluyendo proporcionar al sujeto uno o más polinucleótidos, uno o más vehículos de transferencia génica y/o una composición farmacéutica. En determinados modos de realización, las composiciones descritas en el presente documento se usan para reprimir la expresión deMAPTen el sujeto, incluyendo para el tratamiento y/o la prevención de una tauopatía (por ejemplo, reduciendo la cantidad de tau en el sujeto). Las composiciones descritas en el presente documento reducen los niveles de tau durante periodos de tiempo sostenidos (4 semanas, 3 meses, 6 meses a un año o más) en el cerebro (incluyendo, pero sin limitarse a, el lóbulo cortical frontal, la corteza prefrontal, lóbulo cortical parietal, lóbulo cortical occipital, lóbulo cortical temporal incluyendo, pero sin limitarse a, la corteza entorrinal, hipocampo, tronco encefálico, cuerpo estriado, tálamo, mesencéfalo, cerebelo) y la médula espinal (incluyendo, pero sin limitarse a, las regiones lumbar, torácica y cervical). Las composiciones descritas en el presente documento se pueden proporcionar al sujeto por cualquier medio de administración, incluyendo, pero sin limitarse a, administración intracerebroventricular, intratecal, intracraneal, intravenosa, orbital (retroorbital (RO)), intranasal y/o suboccipital. También se proporcionan kits que comprenden una o más de las composiciones (por ejemplo, moduladores génicos, polinucleótidos, composiciones farmacéuticas y/o células) como se describe en el presente documento, así como instrucciones para el uso de estas composiciones.

[0035] Por tanto, en el presente documento se proporcionan procedimientos para tratar y/o prevenir una tauopatía tal como enfermedad de Alzheimer o convulsiones usando los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento. En algunos modos de realización, los procedimientos implican composiciones donde los polinucleótidos y/o proteínas (o composiciones farmacéuticas que comprenden los polinucleótidos y/o proteínas) se pueden administrar usando un vector vírico, un vector no vírico (por ejemplo, plásmido) y/o combinaciones de los mismos. La administración de composiciones como se describe en el presente documento (proteínas, polinucleótidos, células y/o composiciones farmacéuticas que comprenden estas proteínas, polinucleótidos y/o células) da como resultado un efecto terapéutico (clínico), que incluye, pero sin limitarse a, mejora o eliminación de cualquiera de los síntomas clínicos asociados con EA, tauopatías o convulsiones, así como un incremento de la función y/o el número de células del SNC (por ejemplo, neuronas, astrocitos, mielina, etc.). En determinados modos de realización, las composiciones y procedimientos descritos en la presente reducen la expresión del gen y/o proteína tau (en comparación con controles que no reciben los represores artificiales como se describe en la presente) en al menos un 30 %, o un 40 %, preferentemente en al menos un 50 %, incluso más preferentemente en al menos un 70 %, o al menos un 80 % o al menos un 90 %, o al menos un 95 % o más de un 95 %. En algunos modos de realización, se logra una reducción de al menos un 50 %. La administración puede ser a cualquier región cerebral, por ejemplo, el hipocampo o la corteza entorrinal por cualquier medio adecuado, incluyendo a través del uso de una cánula o cualquier otra tecnología de administración. Cualquier vector AAV puede proporcionar una administración generalizada del represor al cerebro del sujeto, incluyendo a través de transporte axonal anterógrado y retrógrado a regiones cerebrales no administradas directamente por el vector (por ejemplo, la administración al putamen da como resultado la administración a otras estructuras tales como la corteza, sustancia negra, tálamo, etc.). En determinados modos de realización, el sujeto es un ser humano y, en otros modos de realización, el sujeto es un primate no humano (NHP). La administración puede ser en una dosis individual, o en una serie de dosis administradas al mismo tiempo, o en múltiples administraciones (en cualquier momento entre administraciones).

[0036] Además, en cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, los represores se pueden administrar a cualquier concentración (dosis) que proporcione el efecto deseado. En modos de realización preferentes, el represor se administra usando un vector vírico adenoasociado (AAV) a 10.000-500.000 genomas de vector/célula (o cualquier valor comprendido entre los mismos). En determinados modos de realización, el represor se administra usando un vector lentivírico a una multiplicidad de infección (MdI) de entre 250 y 1000 (o cualquier valor comprendido entre los mismos). En otros modos de realización, el represor se administra usando un vector plasmídico a 0,01-1000 ng/100.000 células (o cualquier valor comprendido entre los mismos). En otros modos de realización, el represor se administra como ARNm a 0,01-3000 ng/número de células (por ejemplo, 50.000-200.000 (por ejemplo, 100.000) células (o cualquier valor comprendido entre los mismos). En otros modos de realización, el represor se administra usando un vector vírico adenoasociado (AAV) a un volumen fijo de 1-300 µl en el parénquima cerebral a 1E10-1E14 VG/ml (o cualquier valor comprendido entre los mismos). En otros modos de realización, el represor se administra usando un vector vírico adenoasociado (AAV) a un volumen fijo de 0,5-10 ml en el LCR a 1E10-1E14 VG/ml (o cualquier valor comprendido entre los mismos).

[0038] Por tanto, en otros aspectos, en el presente documento se describe un procedimiento para prevenir y/o tratar una tauopatía (por ejemplo, EA) en un sujeto, comprendiendo el procedimiento administrar un represor de un alelotaual sujeto usando uno o más vectores AAV. En determinados modos de realización, el AAV que codifica el represor se administra al SNC (cerebro y/o LCR) por medio de cualquier procedimiento de administración, incluyendo, pero sin limitarse a, administración intracerebroventricular, intratecal, intracraneal, intravenosa, intranasal, retroorbital o suboccipital. En otros modos de realización, el AAV que codifica el represor se administra directamente en el parénquima (por ejemplo, hipocampo y/o corteza entorrinal) del sujeto. En otros modos de realización, el AAV que codifica el represor se administra por vía intravenosa (i.v.). En cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, la administración se puede realizar una vez (administración individual) o se puede realizar múltiples veces (con cualquier tiempo entre administraciones) a la misma o diferentes dosis por administración. Cuando se administran múltiples veces, se pueden usar las mismas o diferentes dosificaciones y/o vehículos de administración de modos de administración (por ejemplo, diferentes vectores de AAV administrados i.v. y/o i.c.v.). Los procedimientos incluyen procedimientos de reducción de la agregación de tau en el sujeto (por ejemplo, reducción de ONF característicos de la agregación de tau), por ejemplo, en neuronas EA de un sujeto con EA; procedimientos de reducción de la apoptosis en una neurona o población de neuronas (por ejemplo, una neurona EA o población de neuronas EA); procedimientos de reducción de la hiperexcitabilidad neuronal; procedimientos de reducción de la toxicidad inducida por amiloide beta (por ejemplo, pérdida de sinapsis y/o distrofia neurítica); y/o procedimientos de reducción de la pérdida de una o más funciones cognitivas en sujetos con EA, todo en comparación con un sujeto que no recibe el procedimiento, o en comparación con el propio sujeto antes de recibir los procedimientos. Por tanto, los procedimientos descritos en el presente documento dan como resultado la reducción de biomarcadores y/o síntomas de tauopatías, incluyendo uno o más de los siguientes: neurotoxicidad, especies de tau patológicas (por ejemplo, ONF o tau fosforilada), cadena ligera de neurofilamentos (Nfl), tau en LCR, gliosis, neuritas distróficas, pérdida de espinas dendríticas, excitotoxicidad, contracción cortical e hipocampal, cambios volumétricos asociados con la región afectada por la tauopatía específica, acumulación de tau dendrítica, déficits cognitivos (por ejemplo, el laberinto de brazo radial y el laberinto acuático de Morris en modelos de roedores, acondicionamiento del miedo, etc.) y/o motores.

[0040] En algunos aspectos, se proporcionan procedimientos y composiciones para reducir la cantidad de una especie de tau patógena en una célula. En algunos modos de realización, los procedimientos dan como resultado una reducción de tau hiperfosforilada. En algunos casos, la reducción de tau hiperfosforilada da como resultado una reducción de tau soluble o granular. En otros modos de realización, la reducción de especies de tau patógenas disminuye la agregación de tau y provoca una reducción de los ovillos neurofibrilares (ONF) en comparación con una célula o sujeto al que no se ha tratado siguiendo los procedimientos y/o con las composiciones descritas en el presente documento. En otros modos de realización, se proporcionan los procedimientos para revertir la cantidad de ONF observados en una célula. Todavía en otros modos de realización, los procedimientos y composiciones de la divulgación provocan una ralentización de la propagación de especies de tau patógenas (por ejemplo, ONF, tau hiperfosforilada) dentro del cerebro de un sujeto. En algunos modos de realización, se detiene la propagación de tau patógena a través del cerebro y, en otros modos de realización, se revierte la propagación de tau patógena a través del cerebro. En otros modos de realización, se reduce el número de neuritas distróficas asociadas con placas de amiloide β en el cerebro. En algunos modos de realización, se reduce el número de neuritas distróficas a los niveles encontrados en un cerebro intacto de la misma edad. En otros modos de realización, en el presente documento se proporcionan procedimientos y composiciones para reducir la tau hiperfosforilada asociada con placas de amiloide β en el cerebro de un sujeto.

[0042] En algunos modos de realización, después de la administración al sujeto, se inserta (integra) la secuencia que codifica un modulador génico (represor génico) como se describe en el presente documento (por ejemplo, ZFP-TF, TALE-TF o CRTSPR/Cas-TF) en el genoma mientras que, en otros modos de realización, la secuencia que codifica el represor se mantiene episomalmente. En algunos casos, el ácido nucleico que codifica la fusión con el TF se inserta (por ejemplo, por medio de integración mediada por nucleasas) en un sitio de puerto genómico seguro (safe harbor) que comprende un promotor, de modo que el promotor endógeno dirige la expresión. En otros modos de realización, la secuencia donante del represor (TF) se inserta (por medio de integración mediada por nucleasas) en un sitio de puerto genómico seguro (safe harbor) y la secuencia donante comprende un promotor que dirige la expresión del represor. En algunos modos de realización, la secuencia que codifica el modulador génico se mantiene extracromosómicamente (episomalmente) después de la administración, y puede incluir un promotor heterólogo. El promotor puede ser un promotor constitutivo o inducible. En algunos modos de realización, la secuencia promotora se expresa ampliamente mientras, en otros modos de realización, el promotor es específico del tejido o célula/tipo. En modos de realización preferentes, la secuencia de promotora es específica para células neuronales. En otros modos de realización preferentes, el promotor elegido se caracteriza por que tiene baja expresión. Los ejemplos no limitantes de promotores preferentes incluyen los promotores neuronales específicos NSE, sinapsina, CAMKiia y MECP. Los ejemplos no limitantes de promotores ubicuos incluyen CMV, CAG y Ubc. Otros modos de realización incluyen el uso de promotores autorreguladores como se describe en la publicación de patente de EE. UU. n.º 2015/0267205.

[0044] En cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el procedimiento puede proporcionar aproximadamente un 50 % o más, aproximadamente un 55 % o más, aproximadamente un 60 % o más, aproximadamente un 65 % o más, aproximadamente un 70 % o más, aproximadamente un 75 % o más, aproximadamente un 85 % o más, aproximadamente un 90 % o más, aproximadamente un 92 % o más, aproximadamente un 95 % o más, un 98 % o más, o un 99 % o más represión de los alelostauen una o más neuronas EA del sujeto.

[0046] En determinados aspectos, se describen procedimientos para prevenir y/o tratar una tauopatía usando los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento. En determinados modos de realización, el uso de un factor de transcripción artificial (por ejemplo, una proteína con dedos de cinc (ZFP-TF), un TALE (TALE-TF) y/o CRTSPR/Cas-TF), opcionalmente un ZFP-TF que comprende una ZFP designado como 65918, 57890 y/o 57930) que modula (por ejemplo, reprime) la expresión del genMAPTy/o los niveles de proteína tau en el sistema nervioso central (SNC) de un sujeto se usa para la prevención y/o tratamiento de tauopatía (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer (EA), demencia frontotemporal, parálisis supranuclear progresiva, traumatismo craneoencefálico (TCE), trastornos convulsivos y/o degeneración corticobasal), preferentemente en los que los síntomas de la tauopatía se reducen o eliminan, opcionalmente reduciendo la aparición de ovillos neuronales en el cerebro del sujeto. En cualquiera de los procedimientos y usos descritos en el presente documento, el/los) factor(es) de transcripción artificial(es) se administra(n) al SNC (por ejemplo, cerebro o médula espinal) del sujeto mediante un vector vírico, tal como un vector AAV (por ejemplo, AAV9), por ejemplo por vía intravenosa o al SNC, opcionalmente en el cuerpo estriado o hipocampo en uno o ambos hemisferios del cerebro del sujeto. En determinados modos de realización, el vector AAV comprende un promotor de CMV o sinapsina (SYN). Todavía en otros modos de realización, los factores de transcripción artificiales reducen la expresión del genMAPTy/o los niveles de tau en el cerebro del sujeto primate en un 50 % o más, opcionalmente un 70 % o más y hasta un 99 % en comparación con los sujetos no tratados. En cualquiera de los modos de realización descritos en el presente documento, el factor de transcripción artificial es transportado por un vector AAV que comprende un promotor de CMV o SYN a 6E11 genomas de vector rAAV por hemisferio.

[0047] También se proporciona un kit que comprende uno o más de los moduladores de tau AAV (por ejemplo, represores) y/o polinucleótidos que comprenden componentes de y/o codifican los moduladores de tau (o componentes de los mismos) como se describe en el presente documento. Los kits pueden comprender además células (por ejemplo, neuronas), reactivos (por ejemplo, para detectar y/o cuantificar la proteína tau, por ejemplo en LCR) y/o instrucciones de uso, incluyendo los procedimientos como se describe en el presente documento.

[0049] Por tanto, en el presente documento se proporciona una composición que comprende dos o más factores de transcripción de proteínas con dedos de cinc (ZFP-TF) artificiales que reprimen la expresión deMAPT(por ejemplo, las ZFP designadas como 65918 en combinación con 57890 o 57930).

[0051] Las composiciones que comprenden dos o más ZFP-TF pueden reprimir la expresión deMAPTen un factor de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más en comparación con represores individuales y/o controles (sujetos) no tratados. La composición comprende típicamente uno o más polinucleótidos que codifican los dos o más ZFP-TF codificados por polinucleótidos, que pueden ser transportados por uno o más vectores víricos (por ejemplo, AAV tal como AAV9), por ejemplo, un vector AAV individual que comprende un polinucleótido que codifica ambos ZFP-TF o vectores AAV separados que codifican cada uno de los ZFP-TF. Se puede usar cualquier promotor para dirigir la expresión de los ZFP-TF, incluyendo, pero sin limitarse a, un promotor de CMV y/o sinapsina (SYN). Se pueden usar una o más composiciones (por ejemplo, uno o más vectores AAV que comprenden secuencias que codifican los dos o más ZFP-TF) descritas en el presente documento para la prevención y/o tratamiento de tauopatía (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer (EA), demencia frontotemporal, parálisis supranuclear progresiva, traumatismo craneoencefálico (TCE), trastornos convulsivos y/o degeneración corticobasal) en un sujeto que lo necesita, opcionalmente en la que los síntomas de la tauopatía se reducen o eliminan, opcionalmente reduciendo la aparición de ovillos neuronales en el cerebro del sujeto. Las composiciones se pueden administrar al sujeto por vía intravenosa o en el SNC (por ejemplo, en el cuerpo estriado o hipocampo en uno o ambos hemisferios del cerebro del sujeto), opcionalmente en el que los uno o más vectores AAV se administran a entre aproximadamente de 1E10 a 6E11 genomas de vector rAAV por hemisferio. La expresión de dos o más ZFP-TF de la composición reduce la expresión del genMAPTy/o los niveles de tau en el cerebro del sujeto primate en un 50 % o más, opcionalmente un 70 % o más y hasta un 99 % en comparación con los sujetos no tratados.

[0052] Breve descripción de los dibujos

[0054] LaFIG. 1es un gráfico que representa la expresión de tau y los niveles de transcrito de ZFP en una muestra ejemplar ("punzón 088") tomada del hipocampo caudal de primates no humanos (NHP) tratados con represores de tau como se describe en el presente documento. El gráfico superior muestra el % de represión de tau normalizada y el gráfico inferior muestra copias de ARNm de ZFP (transcritos/ng de ARN). La mitad izquierda de la gráfica representa los datos del punzón 088 obtenidos del hemisferio izquierdo de cada animal del estudio, y la mitad derecha muestra los datos del punzón 088 obtenidos del hemisferio derecho de cada animal del estudio. Los promotores usados en las diferentes construcciones se muestran a lo largo de la parte inferior, donde "CMV" indica el uso del promotor de CMV y "SYN" indica el uso del promotor de sinapsina.

[0056] LaFIG. 2son gráficos que representan la expresión de tau y los niveles de ZFP en muestras ejemplares ("punzón 088" en el panel superior tomado del hipocampo caudal y "punzón 035" en el panel inferior tomado del hipocampo rostral) tomadas de NHP tratados con represores de tau como se describe en el presente documento. El gráfico superior de cada panel muestra el % de represión de tau normalizada y el gráfico inferior de cada panel muestra los niveles de ARNm de ZFP (copias/ng de ARNm).

[0058] LaFIG. 3A a FIG. 3Cmuestran gráficas que representan los niveles de ZFP y los niveles de expresión de proteína tau no ajustados a escala (gráficas superiores), ajustados a escala para el promedio de los tres animales tratados con vehículo (gráficas intermedias), o ajustados a escala para el promedio de los animales tratados con vehículo y los animales tratados con ZFP sin expresión de ZFP detectable (gráficas inferiores) de las muestras de cerebro de NHP indicadas. La FIG. 3A muestra los resultados para el punzón 037; la FIG.3B muestra los resultados para el punzón 039; y la FIG. 3C muestra los resultados para el punzón 061, siendo cada muestra (punzón) del hipocampo. El gráfico superior (círculos abiertos) de cada panel muestra el % de represión de tau normalizada (eje izquierdo) y la gráfica inferior (círculos negros) de cada panel muestra los niveles de ARNm de ZFP (copias/ng de ARNm) (eje derecho).

[0060] LaFIG.4es una gráfica que representa la expresión de tau y los niveles de ZFP de 74 punzones tomados de diversos cortes cerebrales ordenados de rostral a caudal (5, 6, 7, 8 y 9 en cada hemisferio) en un sujeto NHP ejemplar (NHP07) tratado con represores de tau como se describe en el presente documento. El gráfico superior de cada panel muestra el % de represión de tau normalizada (eje izquierdo) y la gráfica inferior de cada panel muestra los niveles de ARNm de ZFP (copias/ng de ARNm) (eje derecho).

[0062] LaFIG. 5A a FIG. 5Crepresentan la expresión de tau y los niveles de ZFP e imágenes de RMN correspondientes en sujetos NHP de control y tratados. La FIG. 5A y la FIG. 5B son gráficas que muestran la expresión de tau y los niveles de ZFP, con un enfoque en punzones del corte cerebral 7 que muestran la corteza y el hipocampo en un sujeto NHP de control ("vehículo" como se muestra en la FIG.5A) y uno tratado con los represores de tau 65918 ("918") y 57890 ("890") transportados por un vector AAV (AAV9) donde la expresión de los represores (918 y 890) está dirigida por el promotor de sinapsina (SYN1) y los represores están unidos por un péptido de escisión T2A. El gráfico superior de la FIG. 5A y FIG. 5B muestra el % de represión de tau normalizada y el gráfico inferior de la FIG. 5A y FIG. 5B muestra los niveles de ARNm de ZFP (copias/ng de ARNm). La FIG. 5C representa imágenes de RMN de los mismos sujetos de control (imagen izquierda) y tratados (imagen derecha) a nivel del trayecto de inyección. Un trazador de gadolinio coinfundido es evidente en la región del hipocampo en ambos hemisferios.

[0064] LaFIG. 6A a FIG. 6Oson gráficas que representan la expresión de tau y los niveles de ZFP en muestras tomadas de sujetos NHP de control y tratados. La FIG. 6A a la FIG. 6C muestran resultados de sujetos de control (NHP01 como se muestra en la FIG. 6A, NHP02 como se muestra en la FIG. 6B y NHP03 como se muestra en la FIG.6C). La FIG.6D a la FIG.6F muestran resultados de sujetos NHP (NHP04 como se muestra en la FIG. 6D, NHP05 como se muestra en la FIG. 6E y NHP06 como se muestra en la FIG. 6F) tratados con los represores génicos 65918 ("918") y 57890 ("890") transportados por un vector AAV (AAV9) donde la expresión del represor (918 y 890) está dirigida por el promotor de sinapsina (SYN1) ("SYN1.918-890"). La FIG.

[0065] 6G a la FIG. 6J muestran resultados de sujetos (NHP07 y NHP08) tratados con los represores génicos 65918 ("918") y 57890 ("890") transportados por un vector AAV (AAV9) donde la expresión del represor (918 y 890) está dirigida por un promotor de CMV ("CMV.918-890") (FIG. 6G y FIG. 6H), y sujetos (NHP09 y NHP10) tratados con el represor génico 57930 ("930") transportado por un vector AAV (AAV9) donde la expresión del represor (930) está dirigida por un promotor de sinapsina (SYN1) ("SYN1.930") (FIG.6I y FIG.6J). La FIG.6K a la FIG.6M muestran resultados de sujetos (NHP11 como se muestra en la FIG.6K, NHP12 como se muestra en la FIG.6L y NHP13 como se muestra en la FIG.6M) tratados con 57890 ("890") transportado por un vector AAV (AAV9) donde la expresión del represor está dirigida por el promotor de sinapsina (SYN1) ("SYN1.890"). La FIG.6N y la FIG.6O muestran resultados de sujetos (NHP14 como se muestra en la FIG.6N y NHP15 como se muestra en la FIG.6O) tratados con 65918 ("918") transportado por un vector AAV (AAV9) donde la expresión del represor está dirigida por el promotor de sinapsina (SYN1) ("SYN1.918"). El gráfico superior de cada gráfica muestra el % de represión de tau normalizada y el gráfico inferior de cada gráfica muestra los niveles de ARNm de ZFP (copias/ng de ARNm).

[0066] LaFIG. 7A a FIG. 7Fson gráficas que representan un análisis compuesto de los niveles de ZFP y los niveles de expresión de tau no ajustados a escala (FIG.7A y FIG.7D), o la expresión de tau ajustada a escala para el promedio de los tres animales tratados con vehículo (FIG. 7B y FIG. 7E), o la expresión de tau ajustada a escala para el promedio de los animales tratados con vehículo y los animales tratados con ZFP sin expresión de ZFP detectable (FIG. 7C y FIG. 7F) de las muestras de cerebro de NHP indicadas (ID de punzón en el eje de abscisas). La FIG. 7A, FIG. 7B y FIG. 7C muestran sujetos de control ("vehículo") y la FIG. 7D, FIG. 7E y FIG.7F muestran todos los sujetos tratados ("Todos los NHP tratados con AAV").

[0068] LaFIG. 8A a FIG. 8Dson gráficas que representan un análisis compuesto de la expresión de tau (FIG. 8A y FIG.8C) y los niveles de ZFP (FIG.8B y FIG.8D) en sujetos de control (FIG.8A y FIG.8B) y tratados (FIG.8C y FIG. 8D) usando el procedimiento de ajuste a escala de la expresión de tau al promedio de los animales tratados con vehículo y los animales tratados con ZFP sin expresión de ZFP detectable.

[0070] LaFIG.9A y FIG. 9Bson gráficas que representan la expresión de tau en los hemisferios izquierdo (FIG. 9A) y derecho (FIG.9B) del sujeto de control y del tratado como se indica. "VEH" indica un sujeto de control al que se le administró vehículo solo; "SYN918-890" se refiere a sujetos que reciben vectores AAV que codifican los represores génicos 65918 y 57890, donde la expresión está dirigida por un promotor de sinapsina; "CMV918-890" se refiere a sujetos que reciben vectores AAV que codifican los represores génicos 65918 y 57890, donde la expresión está dirigida por un promotor de CMV; "SYN930" se refiere a sujetos que reciben vectores AAV que codifican el represor génico 57930, donde la expresión está dirigida por un promotor de sinapsina; "SYN890" se refiere a sujetos que reciben vectores AAV que codifican el represor génico 57890, donde la expresión está dirigida por un promotor de sinapsina; y "SYN918" se refiere a sujetos que reciben vectores AAV que codifican el represor génico 65918, donde la expresión está dirigida por un promotor de sinapsina. Para este análisis, la expresión de tau normalizada se ajustó a escala para el promedio de los niveles de tau medidos en animales tratados con vehículo y animales tratados con ZFP sin expresión de ZFP detectable para cada punzón.

[0072] LaFIG. 10A a FIG. 10Fson gráficas que representan niveles de expresión de tau donde los niveles de transcritos de ZFP en los sujetos NHP indicados fueron inferiores a 1E4 transcritos de ZFP (copias/ng de ARNm) (la FIG.10A muestra niveles en el hemisferio izquierdo y la FIG.10B muestra niveles en el hemisferio derecho); entre 1E4 y 1E5 transcritos (copias/ng de ARNm) (la FIG. 10C muestra niveles en el hemisferio izquierdo y la FIG. 10D muestra niveles en el hemisferio derecho); y mayores de 1E5 transcritos (copias/ng de ARNm) (la FIG. 10E muestra niveles en el hemisferio izquierdo y la FIG. 10F muestra niveles en el hemisferio derecho). Para este análisis, la expresión de tau normalizada para un punzón dado se ajustó a escala para el promedio de los niveles de tau medidos en animales tratados con vehículo y animales tratados con ZFP sin expresión de ZFP detectable.

[0074] LaFIG. 11A a FIG. 11Dson gráficas que representan los niveles de expresión de tau en los hemisferios izquierdo y derecho donde se muestran los niveles de transcritos de ZFP en los sujetos NHP indicados para niveles de transcritos de ZFP (FIG. 11A) que fueron inferiores a 1E4 transcritos de ZFP (copias/ng de ARNm) (FIG. 11B); entre 1E4 y 1E5 transcritos (copias/ng de ARNm) (FIG. 11C); y mayores de 1E5 transcritos (copias/ng de ARNm) (FIG.11D). Para este análisis, la expresión de tau normalizada para un punzón dado se ajustó a escala para el promedio de los niveles de tau medidos en animales tratados con vehículo y animales tratados con ZFP sin expresión de ZFP detectable.

[0076] LaFIG.12son gráficas que representan gráficos de correlación que muestran la expresión de tau y los niveles de transcritos de ZFP en sujetos de control (panel izquierdo - "vehículo") y sujetos tratados con vectores AAV que codifican los represores génicos 65918 y 57890, donde la expresión está dirigida por un promotor de sinapsina ("hSYN1.5789-65918"). El límite del ensayo de qRT-PCR de ZFP para la cuantificación absoluta es de aproximadamente 1E2 transcritos/ng de ARNm, que se indica como por debajo del límite de cuantificación (DLdC). Para este análisis, la expresión de tau se ajusta a escala para el promedio de los animales tratados con vehículo y los animales tratados con ZFP sin expresión de ZFP detectable.

[0078] LaFIG.13A a FIG.13Eson gráficos de correlación que muestran la expresión de tau a los niveles de transcritos de ZFP indicados para los grupos de tratamiento indicados. La FIG. 13A muestra resultados para grupos tratados con hSYN1.57890-65918; la FIG.13B muestra resultados para grupos tratados con CMV.57890-65918; la FIG. 13C muestra resultados para grupos tratados con hSYN1.57930; la FIG.13D muestra resultados para grupos tratados con hSYN1.57890; y la FIG. 13E muestra resultados para grupos tratados con hSYN.65918. Para este análisis, los niveles de expresión de tau para cada punzón se ajustan a escala para el promedio de los tres animales tratados con vehículo. Los paneles superiores de cada una de la FIG. 13A a la FIG. 13E muestran la relación en todos los niveles de ARNm de ZFP; los paneles inferiores de cada una de la FIG.13A a la 13E muestran solo el intervalo de expresión de ZFP asociado con la reducción de tau, aproximadamente 1E4-1E6 transcritos de ZFP/ng de ARNm. También se muestran los valores de R al cuadrado y deP. Para este análisis, la expresión de tau se ajusta a escala para el promedio de los animales tratados con vehículo y los animales tratados con ZFP sin expresión de ZFP detectable.

[0079] LaFIG.14son gráficos de correlación que muestran la expresión de tau y los niveles de transcritos de ZFP en sujetos de control (panel izquierdo - "vehículo") y sujetos tratados con vectores AAV que codifican los represores génicos 65918 y 57890, donde la expresión está dirigida por un promotor de sinapsina ("hSYN1.5789-65918"). El límite del ensayo de qRT-PCR de ZFP para la cuantificación absoluta es de aproximadamente 1E2 transcritos/ng de ARNm, que se indica como por debajo del límite de cuantificación (DLdC). En contraste con la figura 12, para este análisis, los niveles de expresión de tau se ajustan a escala para el promedio de los tres animales tratados con vehículo.

[0081] LaFIG.15A a FIG.15Eson gráficos de correlación que muestran la expresión de tau a los niveles de transcritos de ZFP indicados para los grupos de tratamiento indicados: La FIG. 15A muestra resultados para grupos tratados con hSYN1.57890-65918; la FIG.15B muestra resultados para grupos tratados con CMV.57890-65918; la FIG.15C muestra resultados para grupos tratados con hSYN1.57930; la FIG. 15D muestra resultados para grupos tratados con hSYN1.57890; y la FIG. 15E muestra resultados para grupos tratados con hSYN.65918. Para este análisis, los niveles de expresión de tau para cada punzón se ajustan a escala para el promedio de los tres animales tratados con vehículo. Los paneles superiores de cada una de la FIG. 15A a la FIG. 15E muestran la relación en todos los niveles de ARNm de ZFP; los paneles inferiores de cada una de la FIG.15A a la FIG. 15E muestran solo el intervalo de expresión de ZFP asociado con la reducción de tau, aproximadamente 1E4-1E6 transcritos de ZFP/ng de ARNm. También se muestran los valores de R al cuadrado y deP. En contraste con la FIG.13A a la FIG.13E, para este análisis, los niveles de expresión de tau se ajustan a escala para el promedio de los tres animales tratados con vehículo.

[0083] LaFIG.16son gráficos de correlación que muestran la expresión de tau y los niveles de transcritos de ZFP en sujetos de control (panel izquierdo - "vehículo") y sujetos tratados con vectores AAV que codifican los represores génicos 65918 y 57890, donde la expresión está dirigida por un promotor de sinapsina ("hSYN1.5789-65918"). El límite del ensayo de qRT-PCR de ZFP para la cuantificación absoluta es de aproximadamente 1E2 transcritos/ng de ARNm, que se indica como por debajo del límite de cuantificación (DLdC). Para este análisis, los niveles de expresión de tau no se ajustaron a escala para corregir los niveles de tau de referencia en animales no tratados o negativos para ZFP.

[0085] LaFIG.17A a FIG.17Eson gráficos de correlación que muestran la expresión de tau a los niveles de transcritos de ZFP indicados para los grupos de tratamiento indicados: La FIG. 17A muestra resultados para grupos tratados con hSYN1.57890-65918; la FIG.17B muestra resultados para grupos tratados con CMV.57890-65918; la FIG.17C muestra resultados para grupos tratados con hSYN1.57930; la FIG. 17D muestra resultados para grupos tratados con hSYN1.57890; y la FIG. 17E muestra resultados para grupos tratados con hSYN.65918. Para este análisis, los niveles de expresión de tau para cada punzón se ajustan a escala para el promedio de los tres animales tratados con vehículo. Los paneles superiores de cada una de la FIG. 17A a la FIG. 17E muestran la relación en todos los niveles de ARNm de ZFP; los paneles inferiores de cada una de la FIG.17A a la FIG. 17E muestran solo el intervalo de expresión de ZFP asociado con la reducción de tau, aproximadamente 1E4-1E6 transcritos de ZFP/ng de ARNm. También se muestran los valores de R al cuadrado y deP. Para este análisis, los niveles de expresión de tau no se ajustaron a escala para corregir los niveles de tau de referencia en animales no tratados o negativos para ZFP.

[0087] LaFIG. 18A a FIG. 18Dson gráficos de barras que representan resultados de ratones Tau humanizados tratados con ZFP-TF detaucomo se describe en el presente documento. La FIG. 18A muestra los niveles relativos (gráfica de la izquierda) y absolutos (gráfica de la derecha) de ZFP de los ratones tratados con las construcciones indicadas. Como se muestra, los ratones tratados con la combinación sinérgica de 65918 y 57890 mostraron niveles de expresión 2 veces mayores que con 57890 solo. La FIG. 18B muestra los niveles de expresión de tau humana ("hTAU", gráfica de la izquierda), tau de ratón ("mTAU", gráfica del medio) y GFP (gráfica de la derecha) en ratones tratados con las construcciones indicadas. Como se muestra, el ARNm de tau humana se reprimió en un ~90 % por 65918-T2a-57890 en comparación con un ~60 % de represión por 57890. Del mismo modo, el ARNm de tau de ratón se reprimió en un ~87 % por 65918-T2a-57890 en comparación con un ~81 % de represión por 57890 solo. La FIG.18C representa la expresión de hTAU (gráfica de la izquierda) y Saitohin humana ("hSTH", gráfica de la derecha) en los ratones Tau humanizados tratados en las condiciones indicadas. Se observaron niveles similares de reducción de tau y STH humanas consecuentes con el hecho de que la STH está anidada dentro de la tau y, por lo tanto, los dos genes están corregulados. La FIG. 18D muestra los niveles de expresión de GFAP (marcador astrocítico) (gráfica de la izquierda), IBA1 (marcador microglial) (gráfica central) y NeuN (marcador neuronal) (gráfica de la derecha) de ratones Tau humanizados tratados con las construcciones indicadas.

[0089] LaFIG. 19A a FIG. 19Kson gráficas que representan niveles incrementados de expresión de marcadores microgliales y astrocíticos en primates no humanos (NHP) después del tratamiento con el ZFP-TF específico de tau indicado expresado a partir de una construcción de ZFP-TF que incluye un promotor de CMV o sinapsina (SYN). La FIG.19A a la FIG.19F muestran niveles de molécula adaptadora de unión a calcio ionizado 1 (IBA1), un marcador de microglía en los grupos de tratamiento indicados: La FIG. 19A muestra el grupo tratado con hSYN1.57890-65918; la FIG.19B muestra resultados para grupos tratados con CMV.57890-65918; la FIG.19C muestra resultados para grupos tratados con hSYN1.57930; la FIG. 19D muestra resultados para grupos tratados con hSYN1.57890; la FIG. 19E muestra resultados para grupos tratados con hSYN.65918; y la FIG.

[0090] 19F muestra resultados uno al lado del otro para grupos tratados con CMV.57890-65918 (panel izquierdo) y hSYN1.57890-65918 (panel derecho). La activación microglial es indicativa de una respuesta inflamatoria. La FIG. 19G a la FIG. 19K muestran la activación de astrocitos (medida por los niveles de GFAP) en los grupos de tratamiento indicados: La FIG. 19G muestra resultados para grupos tratados con hSYN1.57890-65918; la FIG.19H muestra resultados para grupos tratados con CMV.57890-65918; la FIG.19I muestra resultados para grupos tratados con hSYN1.57930; la FIG. 19J muestra resultados para grupos tratados con hSYN1.57890; y la FIG.19K muestra resultados para grupos tratados con hSYN.65918. Los paneles superiores de la FIG.19A a la FIG. 19E y de la FIG. 19G a la FIG. 19K muestran resultados en todos los niveles de ZFP y los paneles inferiores muestran expresión a niveles de 10<3>a 10<6>ZFP. Como se muestra, no se observó elevación dependiente de ZFP en los niveles microgliales o astrocíticos para ninguna de las construcciones que comprenden el promotor de SYN, mientras que los marcadores microgliales y astrocíticos se elevaron con construcciones que comprenden el promotor de CMV.

[0092] LaFIG.20A a FIG.20Dson gráficas que muestran los niveles globales de IBA1 (FIG.20A y FIG.20B) y GFAP (FIG.20C y FIG.20D) en los hemisferios izquierdo ("L") y (FIG.20A y FIG.20C) derecho ("R") (FIG.20B y FIG.

[0093] 20D) de los primates tratados como se indica. Como se muestra, aunque los niveles de IBA1 y GFAP varían entre NHP, no se observó un efecto global importante para ningún grupo de tratamiento.

[0095] LaFIG. 21A a FIG. 21Eson gráficas que representan la expresión normalizada del gen constitutivoEIF4a2para ZFP en sujetos tratados en las condiciones indicadas. La FIG. 21A muestra resultados para grupos tratados con hSYN1.57890-65918; la FIG.21B muestra resultados para grupos tratados con CMV.57890-65918; la FIG. 21C muestra resultados para grupos tratados con hSYN1.57930; la FIG.21D muestra resultados para grupos tratados con hSYN1.57890; y la FIG. 21E muestra resultados para grupos tratados con hSYN.65918. Los paneles superiores de la FIG. 21A a la FIG. 21E muestran resultados en todos los niveles de ZFP y los paneles inferiores muestran expresión a niveles de 10<3>a 10<6>ZFP. Como se muestra, no existió correlación entre los niveles de un gen constitutivo (EIF4A2) y la expresión de ZFP en ninguno de los grupos de tratamiento.

[0096] LaFIG. 22es una gráfica que representa los niveles totales de proteína tau en neuronas (IPS) derivadas de CMPi (células madre pluripotentes inducidas) humanas en las condiciones indicadas. "Simulación" se refiere a células que se transfectaron con vectores AAV vacíos; "control" se refiere a células transfectadas con un vector AAV que codifica una ZFP que no se dirige a tau; "57930" se refiere a células tratadas con un vector AAV que codifica el represor 57930; "57890" se refiere a células tratadas con un vector AAV que codifica el represor 57890; "65918" se refiere a células tratadas con un vector AAV que codifica el represor 65918; y "65918/57890" se refiere a células tratadas con un vector AAV que codifica los represores tanto 65918 como 57890. Todas las construcciones AAV que codifican los represores de ZFP comprendían un promotor de sinapsina (SYN1) que dirige la expresión del represor. Niveles de proteína tau evaluados por ELISA 32 días después de la administración del vector AAV.

[0098] Descripción detallada

[0100] En el presente documento se divulgan composiciones y procedimientos para la prevención y/o tratamiento de tauopatías. En particular, las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento se usan para reprimir la expresión de una proteína MAPT (tau) para prevenir o tratar tauopatías tales como enfermedad de Alzheimer (EA), demencia frontotemporal, parálisis supranuclear progresiva, traumatismo craneoencefálico (TCE), trastornos convulsivos y/o degeneración corticobasal. Los represores de MAPT (por ejemplo, factores de transcripción moduladores de MAPT, tales como factores de transcripción moduladores de MAPT que comprenden proteínas con dedos de cinc (ZFP-TF), TALE (TALE-TF) y/o CRTSPR/Cas-TF), modifican el SNC de modo que se reducen o eliminan los efectos y/o síntomas de la tauopatía, por ejemplo, reduciendo la agregación de tau en el cerebro de un sujeto con una tauopatía (por ejemplo, EA) y reduciendo la aparición de ovillos neuronales. En modos de realización preferentes, los factores de transcripción moduladores de MAPT se administran al cerebro por un vector vírico tal como un AAV. Se ha demostrado que el AAV es muy adecuado para la administración al cerebro, por lo que el uso de estos vectores víricos para administrar factores de transcripción moduladores de MAPT es especialmente útil para el tratamiento de enfermedades tales como enfermedad de Alzheimer asociadas con la expresión inapropiada y, por lo tanto, la agregación de la proteína tau.

[0102] La proteína tau asociada a microtúbulos (MAPT) está estrechamente relacionada con la patogenia de varios trastornos neurodegenerativos, incluyendo enfermedad de Alzheimer, parálisis supranuclear progresiva y demencia frontotemporal. Si bien los enfoques de reducción de tau genéticos y basados en antisentido han demostrado ser eficaces y bien tolerados en ratones, el desarrollo de un tratamiento dirigido a tau intracelular de administración única sigue siendo un objetivo perseguido desde hace años. Los avances en el diseño de proteínas con dedos de cinc (ZFP) y la administración mediante AAV han creado un nuevo potencial para un tratamiento en una sola dosis dirigido a ADN para enfermedades neurodegenerativas. Se administraron represores de ZFP dirigidos a elementos reguladores de la transcripción de tau de ratón, de primate no humano (NHP) y humana al cerebro de ratones y de NHP usando vectores AAV. Las ZFP dirigidas a MAPT redujeron la tau de ratón y humana en hasta un 99 % sin regulación génica inespecífica detectable en neuronas primarias y de CMPi. La administración intrahipocampal de ZFP a ratones adultos dio como resultado una reducción de tau >90 %. La administración intravenosa de ZFP redujo los niveles de tau en un 50-70 % en todo el cerebro. La expresión de ZFP y la reducción de tau de ratón fueron estables durante al menos seis meses sin efectos inespecíficos detectables, dieron como resultado una reducción de >80 % de tau en LCR y redujeron las neuritas distróficas en un 50 % en ratones APP/PS1. Se usó estereotaxis bilateral guiada por RMN en tiempo real para administrar las ZFP al hipocampo de NHP, que fueron bien toleradas y dieron como resultado una disminución de tau de hasta >80 % en el hipocampo y la corteza entorrinal. Los niveles de ZFP estaban fuertemente correlacionados con la reducción de tau. La potencia, eficacia, especificidad y tolerabilidad de las ZFP muestran que logran una regulación por disminución permanente de tau para el tratamiento de tauopatías humanas.

[0103] General

[0104] La práctica de los procedimientos, así como la preparación y el uso de las composiciones divulgadas en el presente documento emplean, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales en biología molecular, bioquímica, estructura y análisis de cromatina, química computacional, cultivo celular, ADN recombinante y campos relacionados que están dentro de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrooket al.MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 y tercera edición, 2001; Ausubelet al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Nueva York, 1987 y actualizaciones periódicas; la serie METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, tercera edición, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, vol.304, "Chromatin" (P.M. Wassarman y A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; y METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.

[0105] Definiciones

[0106] Los términos "ácido nucleico", "polinucleótido" y "oligonucleótido" se usan de manera intercambiable y se refieren a un polímero de desoxirribonucleótido o ribonucleótido, en conformación lineal o circular, y en forma monocatenaria o bien bicatenaria. Para los propósitos de la presente divulgación, estos términos no se deben interpretar como limitantes con respecto a la longitud de un polímero. Los términos pueden englobar análogos conocidos de nucleótidos naturales, así como nucleótidos que están modificados en la base, glúcido y/o restos de fosfato (por ejemplo, cadenas principales de fosforotioato). En general, un análogo de un nucleótido particular tiene la misma especificidad de emparejamiento de bases; es decir, un análogo de A se emparejará con T.

[0107] Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan de manera intercambiable para referirse a un polímero de residuos de aminoácido. El término también se aplica a polímeros de aminoácidos en los que uno o más aminoácidos son análogos químicos o derivados modificados de un aminoácido natural correspondiente. "Unión" se refiere a una interacción no covalente específica de secuencia entre macromoléculas (por ejemplo, entre una proteína y un ácido nucleico). No es necesario que todos los componentes de una interacción de unión sean específicos de la secuencia (por ejemplo, contactos con residuos de fosfato en una cadena principal de ADN), siempre que la interacción en su conjunto sea específica de la secuencia. Dichas interacciones se caracterizan, en general, por una constante de disociación (K<d>) de 10<-6>M<-1>o menor. "Afinidad" se refiere a la fuerza de unión: estando un incremento de la afinidad de unión correlacionado con una menor K<d>.

[0108] Una "proteína de unión" es una proteína que se puede unir de forma no covalente a otra molécula. Una proteína de unión se puede unir, por ejemplo, a una molécula de ADN (una proteína de unión a ADN), una molécula de ARN (una proteína de unión a ARN) y/o una molécula de proteína (una proteína de unión a proteína). En el caso de una proteína de unión a proteínas, se puede unir a sí misma (para formar homodímeros, homotrímeros, etc.) y/o se puede unir a una o más moléculas de una proteína o proteínas diferentes. Una proteína de unión puede tener más de un tipo de actividad de unión. Por ejemplo, las proteínas con dedos de cinc tienen actividad de unión a ADN, unión a ARN y unión a proteínas.

[0109] Una "proteína de unión a ADN con dedos de cinc" (o dominio de unión) es una proteína, o un dominio dentro de una proteína más grande, que se une a ADN de manera específica de la secuencia a través de uno o más dedos de cinc, que son regiones de la secuencia de aminoácidos dentro del dominio de unión cuya estructura se estabiliza a través de la coordinación de un ion de cinc. El término proteína de unión a ADN con dedos de cinc se abrevia a menudo como proteína con dedos de cinc o ZFP.

[0110] Un "dominio de unión a ADN de TALE" o "TALE" es un polipéptido que comprende uno o más dominios/unidades de repetición de TALE. Los dominios de repetición están implicados en la unión del TALE a su secuencia de ADN diana afín. Una "unidad de repetición" (también denominada "repetición") individual tiene típicamente 3335 aminoácidos de longitud y presenta al menos cierta homología de secuencia con otras secuencias de repetición de TALE dentro de una proteína TALE natural. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.º 8.586.526.

[0112] "TtAgo" es una proteína argonauta procariota que se cree que está implicada en el silenciamiento génico. TtAgo se deriva de la bacteriaThermus thermophilus. (Véanse, por ejemplo, Swartset al.(2014) Nature 507(7491):258-261, G. Shenget al.(2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(2):652). Un "sistema TtAgo" es todos los componentes requeridos, incluyendo, por ejemplo, ADN guía, para la escisión por una enzima TtAgo. "Recombinación" se refiere a un proceso de intercambio de información genética entre dos polinucleótidos, incluyendo, pero sin limitarse a, captura del donante por unión de extremos no homólogos (NHEJ) y recombinación homóloga. Para los propósitos de la presente divulgación, "recombinación homóloga (RH)" se refiere a la forma especializada de dicho intercambio que tiene lugar, por ejemplo, durante la reparación de cortes bicatenarios en células por medio de mecanismos de reparación dirigidos por homología. Este proceso requiere homología de secuencia de nucleótidos, usa una molécula "donante" para la reparación del molde de una molécula "diana" (es decir, la que experimentó el corte bicatenario) y se conoce de diversas maneras como "conversión génica sin entrecruzamiento" o "conversión génica de tramo corto" porque da lugar a la transferencia de información genética del donante a la diana. Sin pretender vincularse a ninguna teoría particular, dicha transferencia puede implicar la corrección de emparejamientos erróneos de ADN heterodúplex que se forma entre la diana rota y el donante, y/o la "hibridación de cadenas dependiente de síntesis", en la que el donante se usa para resintetizar información genética que se pasará a formar parte de la diana, y/o procesos relacionados. Dicha RH especializada a menudo da como resultado una alteración de la secuencia de la molécula diana, de modo que parte o toda la secuencia del polinucleótido donante se incorpora en el polinucleótido diana.

[0114] Los dominios de unión a ADN tales como ARNgm, dominios de unión con dedos de cinc o dominios de unión a ADN con TALE se pueden "genomanipular" para que se unan a una secuencia de nucleótidos predeterminada, por ejemplo, por medio del diseño de un ARNgm que se una a un sitio diana seleccionado o por genomanipulación (alterando uno o más aminoácidos) de la región de hélice de reconocimiento de una proteína con dedos de cinc natural o por genomanipulación de los RVD (diresiduos variables repetidos) de una proteína TALE. Por lo tanto, las proteínas con dedos de cinc o TALE genomanipuladas son proteínas que no son naturales. Los ejemplos no limitantes de procedimientos para genomanipular dominios de unión a ADN son el diseño y la selección. Una proteína con dedos de cinc o TALE "diseñada" es una proteína que no se produce en la naturaleza cuyo diseño/composición resulta principalmente de criterios racionales. Los criterios racionales para el diseño incluyen la aplicación de reglas de sustitución y algoritmos computarizados para procesar información en una base de datos que almacena información de diseños de ZFP existentes y datos vinculantes. Una proteína con dedos de cinc o TALE "seleccionada" es una proteína que no se encuentra en la naturaleza cuya producción resulta principalmente de un procedimiento empírico tal como la presentación en fagos, la trampa de interacción o la selección de híbridos. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.º 8.586.526; 6.140.081; 6.453.242; 6.746.838; 7.241.573; 6.866.997; 7.241.574; y 6.534.261; véase también la publicación de patente internacional n.º WO 03/016496.

[0116] El término "secuencia" se refiere a una secuencia de nucleótidos de cualquier longitud, que puede ser ADN o ARN; puede ser lineal, circular o ramificada y puede ser monocatenaria o bicatenaria. El término "secuencia donante" se refiere a una secuencia de nucleótidos que se inserta en un genoma. Una secuencia donante puede ser de cualquier longitud, por ejemplo, de entre 2 y 10.000 nucleótidos de longitud (o cualquier valor entero comprendido entre los mismos o superior a los mismos), preferentemente de entre aproximadamente 100 y 1000 nucleótidos de longitud (o cualquier número entero comprendido entre los mismos), más preferentemente de entre aproximadamente 200 y 500 nucleótidos de longitud.

[0118] Un "sitio diana" o "secuencia diana" es una secuencia de ácido nucleico que define una porción de un ácido nucleico a la que se unirá una molécula de unión, siempre que existan condiciones suficientes para la unión.

[0119] Una molécula "exógena" es una molécula que normalmente no está presente en una célula, pero que se puede introducir en una célula por uno o más procedimientos genéticos, bioquímicos u otros. La "presencia normal en la célula" se determina con respecto a la etapa de desarrollo y las condiciones ambientales particulares de la célula. Por tanto, por ejemplo, una molécula que está presente solo durante el desarrollo embrionario del músculo es una molécula exógena con respecto a una célula muscular adulta. De forma similar, una molécula inducida por choque térmico es una molécula exógena con respecto a una célula no sometida a choque térmico. Una molécula exógena puede comprender, por ejemplo, una versión funcional de una molécula endógena no funcional o una versión no funcional de una molécula endógena con funcionamiento normal.

[0121] Una molécula exógena puede ser, entre otras cosas, una molécula pequeña, tal como se genera mediante un procedimiento de química combinatoria, o una macromolécula tal como una proteína, ácido nucleico, carbohidrato, lípido, glucoproteína, lipoproteína, polisacárido, cualquier derivado modificado de las moléculas anteriores, o cualquier complejo que comprenda una o más de las moléculas anteriores. Los ácidos nucleicos incluyen ADN y ARN, pueden ser mono o bicatenarios; pueden ser lineales, ramificados o circulares; y pueden ser de cualquier longitud. Los ácidos nucleicos incluyen aquellos que pueden formar cadenas dobles, así como ácidos nucleicos que forman cadenas triples. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.º 5.176.996 y 5.422.251. Las proteínas incluyen, pero no se limitan a, proteínas de unión a ADN, factores de transcripción, factores de remodelación de cromatina, proteínas de unión a ADN metilado, polimerasas, metilasas, desmetilasas, acetilasas, desacetilasas, cinasas, fosfatasas, integrasas, recombinasas, ligasas, topoisomerasas, girasas y helicasas.

[0123] Una molécula exógena puede ser el mismo tipo de molécula que una molécula endógena, por ejemplo, una proteína o ácido nucleico exógeno. Por ejemplo, un ácido nucleico exógeno puede comprender un genoma vírico infeccioso, un plásmido o episoma introducido en una célula, o un cromosoma que normalmente no está presente en la célula. Los procedimientos para la introducción de moléculas exógenas en células son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, transferencia mediada por lípidos (es decir, liposomas, incluyendo lípidos neutros y catiónicos), electroporación, inyección directa, fusión celular, bombardeo de partículas, coprecipitación con fosfato de calcio, transferencia mediada por DEAE-dextrano y transferencia mediada por vector vírico. Una molécula exógena también puede ser el mismo tipo de molécula que una molécula endógena, pero derivada de una especie diferente de la que se deriva la célula. Por ejemplo, se puede introducir una secuencia de ácido nucleico humano en una línea celular derivada originalmente de un ratón o hámster.

[0125] En contraste, una molécula "endógena" es una que normalmente está presente en una célula particular en una etapa de desarrollo particular en condiciones ambientales particulares. Por ejemplo, un ácido nucleico endógeno puede comprender un cromosoma, el genoma de una mitocondria, cloroplasto u otro orgánulo, o un ácido nucleico episómico natural. Las moléculas endógenas adicionales pueden incluir proteínas, por ejemplo, factores de transcripción y enzimas.

[0127] Una molécula de "fusión" es una molécula en la que dos o más moléculas subunitarias están unidas, preferentemente de forma covalente. Las moléculas subunitarias pueden ser el mismo tipo químico de molécula, o pueden ser diferentes tipos químicos de moléculas. Los ejemplos del primer tipo de molécula de fusión incluyen, pero no se limitan a, proteínas de fusión (por ejemplo, una fusión entre un dominio de unión a ADN de ZFP o TALE y uno o más dominios de activación) y ácidos nucleicos de fusión (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión descritasupra). Los ejemplos del segundo tipo de molécula de fusión incluyen, pero no se limitan a, una fusión entre un ácido nucleico que forma cadenas triples y un polipéptido, y una fusión entre un ligando del surco menor y un ácido nucleico. El término también incluye sistemas en los que un componente polinucleotídico se asocia con un componente polipeptídico para formar una molécula funcional (por ejemplo, un sistema CRISPR/Cas en el que un ARN guía monocatenario se asocia con un dominio funcional para modular la expresión génica).

[0129] La expresión de una proteína de fusión en una célula puede resultar de la administración de la proteína de fusión a la célula o de la administración de un polinucleótido que codifica la proteína de fusión a una célula, donde el polinucleótido se transcribe, y el transcrito se traduce, para generar la proteína de fusión. El corte y empalme en trans, la escisión de polipéptidos y la ligación de polipéptidos también pueden estar implicados en la expresión de una proteína en una célula. Los procedimientos para la administración de polinucleótidos y polipéptidos a las células se presentan en otra parte de esta divulgación.

[0131] Un "dominio de multimerización" (también denominado "dominio de dimerización" o "dominio de interacción de proteínas") es un dominio incorporado en las regiones del extremo amino, carboxi o amino y carboxi de un ZFP-TF o TALE-TF. Estos dominios permiten la multimerización de múltiples unidades de ZFP-TF o TALE-TF, de modo que tramos más grandes de dominios de repetición de trinucleótidos se unen preferentemente por ZFP-TF o TALE-TF multimerizados en relación con tramos más cortos con valores de longitudes naturales. Los ejemplos de dominios de multimerización incluyen cremalleras de leucina. Los dominios de multimerización también se pueden regular por moléculas pequeñas donde el dominio de multimerización asume una conformación apropiada para permitir la interacción con otro dominio de multimerización solo en presencia de una molécula pequeña o ligando externo. De esta manera, se pueden usar ligandos exógenos para regular la actividad de estos dominios.

[0133] Un "gen" para los propósitos de la presente divulgación incluye una región de ADN que codifica un producto génico (véaseinfra), así como todas las regiones de ADN que regulan la producción del producto génico, ya sean dichas secuencias reguladoras contiguas o no a las secuencias codificantes y/o transcritas. En consecuencia, un gen incluye, pero no se limita necesariamente a, secuencias promotoras, terminadores, secuencias reguladoras de la traducción tales como sitios de unión a ribosomas y sitios internos de entrada a ribosomas, potenciadores, silenciadores, aislantes, elementos delimitadores, orígenes de replicación, sitios de unión a la matriz y regiones de control de locus.

[0135] "Expresión génica" se refiere a la conversión de la información contenida en un gen en un producto génico. Un producto génico puede ser el producto transcripcional directo de un gen (por ejemplo, ARNm, ARNt, ARNr, ARN antisentido, ribozima, ARN estructural o cualquier otro tipo de ARN) o una proteína producida por traducción de un ARNm. Los productos génicos también incluyen ARN que se modifican por procesos tales como adición de caperuza, poliadenilación, metilación y edición, y proteínas modificadas, por ejemplo, por metilación, acetilación, fosforilación, ubiquitinación, ADP-ribosilación, miristilación y glucosilación.

[0137] "Modulación" de la expresión génica se refiere a un cambio en la actividad de un gen. La modulación de la expresión puede incluir, pero no se limita a, activación génica y represión génica. Se puede usar la edición del genoma (por ejemplo, escisión, alteración, inactivación, mutación aleatoria) para modular la expresión. La inactivación génica se refiere a cualquier reducción de la expresión génica en comparación con una célula que no incluye una proteína ZFP o TALE como se describe en el presente documento. Por tanto, la inactivación génica puede ser parcial o completa.

[0139] Un "modulador génico" se refiere a cualquier molécula que altera la expresión y/o secuencia de uno o más genes. Los ejemplos no limitantes de moduladores génicos incluyen factores de transcripción (tales como factores de transcripción artificiales como se describe en el presente documento) que se unen al gen diana y alteran su expresión y nucleasas que modifican la secuencia del gen diana, que a su vez altera su expresión (por ejemplo, inactivación de la diana por medio de inserciones y/o deleciones). Por tanto, un modulador génico puede ser un represor génico (que reprime y/o inactiva la expresión génica) o un activador genético.

[0141] Una "región de interés" es cualquier región de cromatina celular, tal como, por ejemplo, un gen o una secuencia no codificante dentro de o contigua a un gen, en la que es deseable la unión de una molécula exógena. La unión puede ser para los propósitos de escisión de ADN dirigida y/o recombinación dirigida. Una región de interés puede estar presente en un cromosoma, un episoma, un genoma organular (por ejemplo, mitocondrial, de cloroplasto) o un genoma vírico infeccioso, por ejemplo. Una región de interés puede estar dentro de la región codificante de un gen, dentro de regiones no codificantes transcritas tales como, por ejemplo, secuencias líder, secuencias remolque o intrones, o dentro de regiones no transcritas, ya sea en dirección 5' o en dirección 3' de la región codificante. Una región de interés puede ser tan pequeña como un par de nucleótidos individual o hasta 2000 pares de nucleótidos de longitud, o cualquier valor integrante de pares de nucleótidos.

[0143] Las células "eucariotas" incluyen, pero no se limitan a, células fúngicas (tales como de levaduras), células vegetales, células animales, células de mamífero y células humanas (por ejemplo, linfocitos T).

[0145] Los términos "enlace funcional" y "enlazado de forma funcional" se usan de manera intercambiable con referencia a una yuxtaposición de dos o más componentes (tales como elementos de secuencia), en los que los componentes se disponen de modo que ambos componentes funcionan normalmente y permiten la posibilidad de que al menos uno de los componentes pueda mediar en una función que se ejerce sobre al menos uno de los otros componentes. A modo de ilustración, una secuencia reguladora de la transcripción, tal como un promotor, está enlazada de forma funcional a una secuencia codificante si la secuencia reguladora de la transcripción controla el nivel de transcripción de la secuencia codificante en respuesta a la presencia o ausencia de uno o más factores reguladores de la transcripción. Una secuencia reguladora de la transcripción está, en general, enlazada de forma funcional enciscon una secuencia codificante, pero no es necesario que sea directamente contigua a ella. Por ejemplo, un potenciador es una secuencia reguladora de la transcripción que está enlazada de forma funcional a una secuencia codificante, aunque no sean contiguas.

[0147] Con respecto a los polipéptidos de fusión, el término "enlazado de forma funcional" se puede referir al hecho de que cada uno de los componentes realiza la misma función en el enlace con el otro componente como lo haría si no estuviera enlazado. Por ejemplo, con respecto a una molécula de fusión en la que un dominio de unión a ADN de ZFP o TALE se fusiona a un dominio de activación, el dominio de unión a ADN de ZFP o TALE y el dominio de activación están enlazados de forma funcional si, en el polipéptido de fusión, la porción de dominio de unión a ADN de ZFP o TALE se puede unir a su sitio diana y/o su sitio de unión, mientras que el dominio de activación puede regular por incremento la expresión génica. Las ZFP fusionadas a dominios que pueden regular la expresión génica se denominan colectivamente "ZFP-TF" o "factores de transcripción con dedos de cinc", mientras que las TALE fusionadas a dominios que pueden regular la expresión génica se denominan colectivamente "TALE-TF" o "factores de transcripción con TALE". Cuando un polipéptido de fusión en el que un dominio de unión a ADN de ZFP se fusiona con un dominio de escisión (una "ZFN" o "nucleasa con dedos de cinc"), el dominio de unión a ADN de ZFP y el dominio de escisión están enlazados de forma funcional si, en el polipéptido de fusión, la porción de dominio de unión a ADN de ZFP se puede unir a su sitio diana y/o su sitio de unión, mientras que el dominio de escisión puede escindir ADN en las proximidades del sitio diana. Cuando un polipéptido de fusión en el que un dominio de unión a ADN de TALE se fusiona con un dominio de escisión (una "TALEN" o "nucleasa TALE"), el dominio de unión a ADN de TALE y el dominio de escisión están enlazados de forma funcional si, en el polipéptido de fusión, la porción de dominio de unión a ADN de TALE se puede unir a su sitio diana y/o su sitio de unión, mientras que el dominio de escisión puede escindir ADN en las proximidades del sitio diana. Con respecto a una molécula de fusión en la que un dominio de unión a ADN de Cas (por ejemplo, ARN guía monocatenario) se fusiona a un dominio de activación, el dominio de unión a ADN de Cas y el dominio de activación están enlazados de forma funcional si, en el polipéptido de fusión, la porción de dominio de unión a ADN de Cas se puede unir a su sitio diana y/o su sitio de unión, mientras que el dominio de activación puede regular por incremento la expresión génica. Cuando un polipéptido de fusión en el que un dominio de unión a ADN de Cas se fusiona con un dominio de escisión, el dominio de unión a ADN de Cas y el dominio de escisión están enlazados de forma funcional si, en el polipéptido de fusión, la porción de dominio de unión a ADN de Cas se puede unir a su sitio diana y/o su sitio de unión, mientras que el dominio de escisión puede escindir ADN en las proximidades del sitio diana.

[0149] Un "fragmento funcional" de una proteína, polipéptido o ácido nucleico es una proteína, polipéptido o ácido nucleico cuya secuencia no es idéntica a la proteína, polipéptido o ácido nucleico de longitud completa, pero conserva la misma función que la proteína, polipéptido o ácido nucleico de longitud completa. Un fragmento funcional puede poseer más, menos o el mismo número de residuos que la molécula natural correspondiente, y/o puede contener una o más sustituciones de aminoácidos o nucleótidos. Los procedimientos para determinar la función de un ácido nucleico (por ejemplo, función codificante, capacidad de hibridarse con otro ácido nucleico) son bien conocidos en la técnica. De forma similar, los procedimientos para determinar la función de un proteína son bien conocidos. Por ejemplo, la función de unión a ADN de un polipéptido se puede determinar, por ejemplo, mediante ensayos de retención en filtro, de variación de movilidad electroforética o de inmunoprecipitación. La escisión del ADN se puede analizar mediante electroforesis en gel. Véase Ausubelet al.,supra. La capacidad de una proteína para interactuar con otra proteína se puede determinar, por ejemplo, mediante coinmunoprecipitación, ensayos de dos híbridos o complementación, tanto genética como bioquímica. Véanse, por ejemplo, Fieldset al.(1989) Nature 340:245-246; patente de EE. UU. n.º 5.585.245 y publicación de patente internacional n.º WO 98/44350.

[0151] Un "vector" puede transferir secuencias génicas a células diana. Típicamente, "construcción de vector", "vector de expresión" y "vector de transferencia génica" significan cualquier construcción de ácido nucleico que puede dirigir la expresión de un gen de interés y que puede transferir secuencias génicas a células diana. Por tanto, el término incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores de integración.

[0153] Un "gen indicador" o "secuencia indicadora" se refiere a cualquier secuencia que produce un producto proteico que se mide fácilmente, preferentemente aunque no necesariamente en un ensayo de rutina. Los genes indicadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, secuencias que codifican proteínas que median la resistencia a antibióticos (por ejemplo, resistencia a ampicilina, resistencia a neomicina, resistencia a G418, resistencia a puromicina), secuencias que codifican proteínas coloreadas o fluorescentes o luminiscentes (por ejemplo, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente verde potenciada, proteína fluorescente roja, luciferasa) y proteínas que median el crecimiento celular potenciado y/o la amplificación génica (por ejemplo, dihidrofolato reductasa). Las marcas de epítopo incluyen, por ejemplo, una o más copias de FLAG, His, myc, Tap, HA o cualquier secuencia de aminoácidos detectable. Las "marcas de expresión" incluyen secuencias que codifican indicadores que pueden estar enlazados de forma funcional a una secuencia génica deseada para monitorizar la expresión del gen de interés.

[0155] En toda esta memoria descriptiva y los modos de realización, los términos "tener" y "comprender", o variaciones tales como "tiene", "que tiene", "comprende" o "que comprende", se entenderá que implican la inclusión de un número entero o grupo de números enteros establecido, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros.

[0157] Aunque en el presente documento se citan una serie de documentos, esta cita no constituye una admisión de que ninguno de esos documentos forme parte del conocimiento general común en la técnica. Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente", como se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia establecido. En determinados modos de realización, el término se refiere a un intervalo de valores que se encuentran dentro de un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o menos en cualquier dirección (mayor que o menor que) del valor de referencia establecido, a menos que se establezca de otro modo o sea evidente de otro modo a partir del contexto.

[0159] Tau y enfermedad de Alzheimer

[0161] La proteína tau se codifica por el gen MAPT que comprende 16 exones. De forma interesante, los exones 1, 4, 5, 7, 9, 11 y 12 se expresan constitutivamente, mientras que los exones 2, 3 y 10 pueden estar presentes en especies de proteína tau derivadas de variantes sometidas a corte y empalme de forma alternativa, lo que da lugar a la presencia de seis isoformas de proteína tau diferentes en el cerebro adulto. Tau se une a los microtúbulos por medio de 3 o 4 motivos repetidos de unión a tubulina en la mitad C terminal de la proteína, y se cree que estabiliza los túbulos, donde se cree que tau4R (4 motivos de unión a tubulina) interactúa más fuertemente con los microtúbulos que tau3R. La proporción de 3R a 4R es en general estable, pero se puede ver afectada en estados patológicos. La forma de tau que interactúa con los microtúbulos está fosforilada, y parece que la hiperfosforilación provoca que la tau se separe de los microtúbulos. La tau hiperfosforilada se puede secuestrar en la célula, lo que a continuación da lugar a cambios conformacionales en la proteína y a agregación. Estos agregados pueden ser la etapa inicial en la formación de ovillos neurofibrilares (ONF) patógenos; sin embargo, la tau hiperfosforilada puede ser patógena en una forma soluble, así como cuando está presente en los ovillos (Bodeaet al.(2016)J of Neurochem138(Suppl 1):71-94). Los ONF están restringidos a la corteza entorrinal y al lóbulo temporal medial en las primeras fases de la EA y, en el momento en que se presentan síntomas clínicos graves de la enfermedad, los ONF están extendidos por todo el cerebro. Coincidiendo con la presencia de abundantes ONF, también se produce una distribución generalizada de las placas de amiloide. De hecho, parece que la deposición de amiloide en la corteza da lugar a un incremento en la velocidad de propagación de tau y la diseminación de ONF a las regiones distales del cerebro. A medida que se diseminan los ovillos de tau, existen un incremento concomitante de pérdida neuronal (Pooleret al.(2015) Acta Neuropathol Commun 3:14, doi:10.1186/s40478-015-0199-x).

[0163] Tau tiene 95 residuos aminoacídicos que se pueden fosforilar, y se han identificado varias cinasas que pueden ser responsables de la fosforilación de tau, que pueden ser posibles candidatos diana para nuevos tratamientos, incluyendo glucógeno sintasa-3, cinasa 5 dependiente de ciclina, miembros de la familia MAPK, cinasa regulada por señales extracelulares, cinasa N terminal c-Jun y cinasa reguladora de la afinidad por microtúbulos (Bodea (2016)ibid).

[0165] La proteína amiloide β (Aβ) es el principal constituyente de las placas seniles que, conjuntamente con los ONF, son el sello distintivo de una confirmación neuropatológica de enfermedad de Alzheimer. Aβ es un péptido que tiene entre 39 y 42 cadenas de aminoácidos; los 42 aminoácidos forman agregados más ávidamente y se cree que están implicados en la patogenia de la enfermedad y es la base de la hipótesis amiloide (la propuesta de que la acumulación de Aβ en el cerebro es la causa principal de la EA, véase la revisión Hardy y Selkoe (2002) Science 297:353). Los Aβ son productos de la escisión proteolítica de la proteína precursora amiloidea (APP), una proteína de membrana integral ubicua, glucosilada, sulfatada y fosforilada (Sorrentinoet al.(2014) FEES Lett 588:641-652). Sin embargo, está quedando claro que la patogenia que da lugar a la EA es extremadamente compleja y que la patogenia de la acumulación de Aβ puede desempeñar un papel en el comportamiento anómalo de tau (Andoet al.(2016) PLoS Genet 12(3):e1005917.

[0167] Se ha mostrado que la reducción de tau en el cerebro mejora la patología de la EA. La supresión regulada de la expresión de un transgén de tau en un modelo murino de EA demostró una reducción de los agregados de tau asociados al transgén y una disminución de la concentración de tau hiperfosforilada y de los ONF. De hecho, este trabajo también mostró una pérdida de los ONF totales, lo que indica que la acumulación de ONF puede ser reversible (Polydoroet al.(2013) J of Neurosci 33(33):13300-13311). Además, estudios realizados con un anticuerpo anti-tau intracelular administrado por medio de AAV directamente a través de administración intrahipocampal demostraron una reducción de las especies de tau insolubles, los ONF y una reversión de la atrofia hipocampal que se observa en el modelo de ratón no tratado (Liuet al.(2016) J Neurosci 36(49):12425-12435).

[0169] Dominios de unión a ADN

[0171] Los procedimientos descritos en el presente documento hacen uso de composiciones, por ejemplo, factores de transcripción moduladores de tau, que comprenden un dominio de unión a ADN que se une específicamente a una secuencia diana en un gentau(MATP). Se puede usar cualquier dominio de unión a ADN polinucleotídico o polipeptídico en las composiciones y procedimientos divulgados en el presente documento, por ejemplo, proteínas de unión a ADN (por ejemplo, ZFP o TALE) o polinucleótidos de unión a ADN (por ejemplo, ARN guía monocatenarios). Por tanto, se describen moduladores génicos (represores) de genestau.

[0173] En determinados modos de realización, el represor detau, o dominio de unión a ADN en el mismo, comprende una proteína con dedos de cinc. La selección de sitios diana; ZFP y procedimientos para el diseño y la construcción de proteínas de fusión (y polinucleótidos que codifican las mismas) son conocidos por los expertos en la técnica y se describen en detalle en las patentes de EE. UU n.º 6.140.081; 5.789.538; 6.453.242; 6.534.261; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.200.759; y las publicaciones de patente internacional n.º WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536; y WO 03/016496.

[0174] Los sitios diana detauincluyen típicamente al menos un dedo de cinc, pero pueden incluir una pluralidad de dedos de cinc (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 o más dedos). Normalmente, las ZFP incluyen al menos tres dedos. Algunas de las ZFP incluyen cuatro, cinco o seis dedos, mientras que algunas ZFP incluyen 8, 9, 10, 11 o 12 dedos. Las ZFP que incluyen tres dedos típicamente reconocen un sitio diana que incluye 9 o 10 nucleótidos; las ZFP que incluyen cuatro dedos típicamente reconocen un sitio diana que incluye 12 a 14 nucleótidos; mientras que las ZFP que tienen seis dedos pueden reconocer sitios diana que incluyen 18 a 21 nucleótidos. Las ZFP también pueden ser proteínas de fusión que incluyen uno o más dominios reguladores, cuyos dominios pueden ser dominios de activación o represión transcripcional. En algunos modos de realización, la proteína de fusión comprende dos dominios de unión a ADN de ZFP enlazados entre sí. Por tanto, estas proteínas con dedos de cinc pueden comprender 8, 9, 10, 11, 12 o más dedos. En algunos modos de realización, los dos dominios de unión a ADN se enlazan por medio de un conector flexible extensible de modo que un dominio de unión a ADN comprende 4, 5 o 6 dedos de cinc y el segundo dominio de unión a ADN comprende 4, 5 o 5 dedos de cinc adicionales. En algunos modos de realización, el conector es un conector entre dedos estándar de modo que la matriz de dedos comprende un dominio de unión a ADN que comprende 8, 9, 10, 11 o 12 o más dedos. En otros modos de realización, el conector es un conector atípico tal como un conector flexible.

[0175] Los dominios de unión a ADN se fusionan con al menos un dominio regulador y se pueden considerar como una arquitectura "ZFP-ZFP-TF". Los ejemplos específicos de estos modos de realización se pueden denominar "ZFP-ZFP-KOX", que comprende dos dominios de unión a ADN enlazados con un conector flexible y fusionados a un represor KOX y "ZFP-KOX-ZFP-KOX", donde dos proteínas de fusión ZFP-KOX se fusionan entre sí por medio de un conector.

[0177] Un dominio de unión con dedos de cinc genomanipulado puede tener una especificidad de unión novedosa en comparación con una proteína con dedos de cinc natural. Los procedimientos de genomanipulación incluyen, pero no se limitan a, diseño racional y diversos tipos de selección. El diseño racional incluye, por ejemplo, el uso de bases de datos que comprenden secuencias de nucleótidos en tripletes (o cuartetos) y secuencias de aminoácidos de dedos de cinc individuales, en las que cada secuencia de nucleótidos en tripletes o cuartetos se asocia con una o más secuencias de aminoácidos de dedos de cinc que se unen a la secuencia en tripletes o cuartetos particular. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. de propiedad conjunta n.º 6.453.242 y 6.534.261.

[0179] Además, como se divulga en estas y otras referencias, los dominios con dedos de cinc y/o las proteínas con dedos de cinc de múltiples dedos se pueden enlazar entre sí usando cualquier secuencia de conector adecuada, incluyendo, por ejemplo, conectores de 5 o más aminoácidos de longitud. Véanse, también, las patentes de EE. UU. n.º 6.479.626; 6.903.185; y 7.153.949 para secuencias de conectores ejemplares de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas descritas en el presente documento pueden incluir cualquier combinación de conectores adecuados entre los dedos de cinc individuales de la proteína.

[0181] Una ZFP se puede asociar (enlazar) de forma funcional a uno o más reguladores transcripcionales (por ejemplo, dominios de represión) para formar un ZF-TF (por ejemplo, represor). También se pueden usar procedimientos y composiciones para incrementar la especificidad de una ZFP por su diana prevista con respecto a otros sitios de escisión no previstos, conocidos como sitios fuera de diana, por ejemplo, mediante mutaciones en la cadena principal de la ZFP como se describe en la publicación de patente de EE. UU. n.º 2018/0087072. Por tanto, los represores de tau descritos en el presente documento pueden comprender mutaciones en una o más de sus regiones de la cadena principal del dominio de unión a ADN y/o una o más mutaciones en sus dominios reguladores de la transcripción. Estas ZFP pueden incluir mutaciones a aminoácidos dentro del dominio de unión a ADN de ZFP ("cadena principal de ZFP") que pueden interactuar de forma no específica con fosfatos de la cadena principal de ADN, pero no comprenden cambios en las hélices de reconocimiento de ADN. Por tanto, la divulgación incluye mutaciones de residuos de aminoácidos catiónicos en la cadena principal de ZFP que no se requieren para la especificidad por la diana nucleotídica. En algunos modos de realización, estas mutaciones en la cadena principal de ZFP comprenden mutar un residuo de aminoácido catiónico a un residuo de aminoácido neutro o aniónico. En algunos modos de realización, estas mutaciones en la cadena principal de ZFP comprenden mutar un residuo de aminoácido polar a un residuo de aminoácido neutro o no polar. En modos de realización preferentes, las mutaciones se realizan en la posición (-5), (-9) y/o la posición (-14) con respecto a la hélice de unión a ADN. En algunos modos de realización, un dedo de cinc puede comprender una o más mutaciones en (-5), (-9) y/o (-14). En otros modos de realización, uno o más dedos de cinc en una proteína con dedos de cinc de múltiples dedos pueden comprender mutaciones en (-5), (-9) y/o (-14). En algunos modos de realización, los aminoácidos en (-5), (-9) y/o (-14) (por ejemplo, una arginina (R) o lisina (K)) se mutan a una alanina (A), leucina (L), Ser (S), Asp (N), Glu (E), Tyr (Y) y/o glutamina (Q).

[0183] De forma alternativa, el dominio de unión a ADN se puede derivar de una nucleasa. Por ejemplo, se conocen las secuencias de reconocimiento de endonucleasas y meganucleasas de asentamiento tales como I-SceI, I-CeuI, PI-FspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-Tev11 e I-TevIII. Véanse también la patente de EE. UU n.º 5.420.032; la patente de EE. UU n.º 6.833.252; Belfortet al.(1997) Nucleic Acids Res.25:3379-3388; Dujonet al.(1989) Gene 8.2:115-118; Perleret al.(1994) Nucleic Acids Res.22:1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet.12:224-228; Gimbleet al.(1996) J. Mol. Biol.263:163-180; Argastet al.(1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 y el catálogo de New England Biolabs. Además, la especificidad de unión a ADN de las endonucleasas y meganucleasas de asentamiento se puede genomanipular para unirse a sitios diana no naturales. Véanse, por ejemplo, Chevalieret al.(2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinatet al.(2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworthet al.(2006) Nature 441:656-659; Paqueset al.(2007) Current Gene Therapy 7:49-66; publicación de patente de EE. UU n.º 2007/0117128.

[0184] Las proteínas con dedos de cinc "de dos manos" son aquellas proteínas en las que dos agrupaciones de dominios de unión a ADN con dedos de cinc están separadas por aminoácidos intercalados, de modo que los dos dominios con dedos de cinc se unen a dos sitios diana discontinuos. Un ejemplo de un tipo de proteína de unión con dedos de cinc de dos manos es SIP1, donde una agrupación de cuatro dedos de cinc se localiza en el extremo amino de la proteína y una agrupación de tres dedos se localiza en el extremo carboxilo (véase Remacleet al.(1999) EMBO Journal 18 (18):5073-5084). Cada agrupación de dedos de cinc en estas proteínas se puede unir a una secuencia diana única y el espaciado entre las dos secuencias diana puede comprender muchos nucleótidos. Las ZFP de dos manos pueden incluir un dominio funcional, por ejemplo, fusionado a una o ambas de las ZFP. Por tanto, será evidente que el dominio funcional se puede fijar al exterior de una o ambas ZFP o se puede situar entre las ZFP (fijado a ambas ZFP).

[0185] En determinados modos de realización, el dominio de unión a ADN comprende un dominio de unión a ADN efector TAL (TALE) natural o genomanipulado (no natural). Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.º 8.586.526.

[0187] En determinados modos de realización, la proteína de unión a ADN de TALE comprende la unión a 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleótidos contiguos de un sitio diana de tau, como se muestra en la publicación de patente de EE. UU n.º 2018/0153921. Los RVD de la proteína de unión a ADN de TALE que se une a un sitio diana de tau pueden ser RVD naturales o no naturales. Véanse las patentes de EE. UU. n.º 8.586.526 y 9.458.205.

[0189] Se conoce que las bacterias fitopatógenas del géneroXanthomonasprovocan muchas enfermedades en importantes plantas de cultivo. La patogenia deXanthomonasdepende de un sistema de secreción de tipo III (T3S) conservado que inyecta más de 25 proteínas efectoras diferentes en la célula vegetal. Entre estas proteínas inyectadas se encuentran efectores de tipo activador de la transcripción (TALE) que imitan los activadores transcripcionales de las plantas y manipulan el transcriptoma de las plantas (véase Kayet al.(2007) Science 318:648-651). Estas proteínas contienen un dominio de unión a ADN y un dominio de activación transcripcional. Uno de los TALE mejor caracterizados es AvrBs3 deXanthomonas campestgrispv.Vesicatoria(véanse Bonaset al.(1989) Mol Gen Genet 218: 127-136 y la publicación de patente internacional n.º WO 2010/079430). Los TALE contienen un dominio centralizado de repeticiones en tándem, conteniendo cada repetición aproximadamente 34 aminoácidos, que son clave para la especificidad de unión a ADN de estas proteínas. Además, contienen una secuencia de localización nuclear y un dominio de activación transcripcional ácido (para una revisión, véase Schornacket al.(2006) J Plant Physiol 163(3):256-272). Además, en la bacteria fitopatógenaRalstonia solanacearum, se han encontrado dos genes, designados brg11 y hpx17, que son homólogos a la familia AvrBs3 deXanthomonasen la cepa GMIl000 deR. solanacearumbiovar 1 y en la cepa RS1000 de biovar 4 (véanse Heueret al.(2007) Appl and Envir Micro 73(13):4379-4384). Estos genes son un 98,9 % idénticos entre sí en su secuencia de nucleótidos, pero difieren en una deleción de 1575 pb en el dominio de repetición de hpx17. Sin embargo, ambos productos génicos tienen menos de un 40 % de identidad de secuencia con las proteínas de la familia AvrBs3 deXanthomonas.

[0191] La especificidad de estos TALE depende de las secuencias encontradas en las repeticiones en tándem. La secuencia repetida comprende aproximadamente 102 pb y las repeticiones son, típicamente, un 91-100 % homólogas entre sí (Bonaset al.,ibid.). El polimorfismo de las repeticiones se localiza normalmente en las posiciones 12 y 13 y parece haber una correspondencia uno a uno entre la identidad de los diresiduos hipervariables en las posiciones 12 y 13 y la identidad de los nucleótidos contiguos en la secuencia diana de TALE (véanse Moscou y Bogdanove (2009) Science 326:1501 y Bochet al.(2009) Science 326:1509-1512). Experimentalmente, se ha determinado el código para el reconocimiento de ADN de estos TALE de modo que una secuencia HD en las posiciones 12 y 13 da lugar a una unión a citosina (C), NG se une a T, NI a A, C, G o T, NN se une a A o G, y NG se une a T. Estas repeticiones de unión a ADN se han ensamblado en proteínas con nuevas combinaciones y números de repeticiones para preparar factores de transcripción artificiales que pueden interactuar con nuevas secuencias. Además, la patente de EE. UU. n.º 8.586.526 y la publicación de patente de EE. UU. n.º 2013/0196373 describen TALE con polipéptidos de caperuza en el extremo N, polipéptidos de caperuza en el extremo C (por ejemplo, 63, 231 o 278) y/o RVD novedosos (atípicos).

[0192] Los TALE ejemplares se describen en las patentes de EE. UU. n.º 8.586.526 y 9.458.205.

[0194] En determinados modos de realización, los dominios de unión a ADN incluyen un dominio de dimerización y/o multimerización, por ejemplo, una superhélice (CC) y un dedo de cinc dimerizante (DZ). Véase la publicación de patente de EE. UU. n.º 2013/0253040.

[0196] Todavía en otros modos de realización, el dominio de unión a ADN comprende un ARN guía monocatenario de un sistema CRISPR/Cas, por ejemplo, ARNgm como se divulga en el documento 20150056705.

[0198] Recientemente han surgido pruebas convincentes de la existencia de una vía de defensa del genoma mediada por ARN en arqueas y muchas bacterias que han planteado la hipótesis de que es paralela a la vía de ARNi eucariota (para revisiones, véanse Godde y Bickerton (2006) J. Mol. Evol. 62:718-729; Lillestolet al.(2006) Archaea 2:59-72; Makarovaet al.(2006) Biol. Direct 1:7; Soreket al.(2008) Nat. Rev. Microbiol. 6:181-186). Conocido como el sistema CRISPR-Cas o ARNi procariota (pARNi), se propone que la vía surge de dos locus génicos vinculados evolutiva y a menudo físicamente: el locus CRISPR (agrupaciones de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares), que codifica componentes de ARN del sistema, y el locus cas (asociado a CRISPR), que codifica proteínas (Jansenet al.(2002) Mol. Microbiol.43:1565-1575; Makarovaet al.(2002) Nucleic Acids Res.30:482-496; Makarovaet al.(2006) Biol. Direct 1:7; Haftet al.(2005) PLoS Comput. Biol.1:e60). Los locus CRISPR en huéspedes microbianos contienen una combinación de genes asociados a CRISPR (Cas), así como elementos de ARN no codificantes que pueden programar la especificidad de la escisión de ácidos nucleicos mediada por CRISPR. Las proteínas Cas individuales no comparten una similitud de secuencia significativa con los componentes proteicos de la maquinaria de ARNi eucariota, pero tienen funciones previstas análogas (por ejemplo, unión a ARN, nucleasa, helicasa, etc.) (Makarovaet al.(2006) Biol.

[0199] Direct 1:7). Los genes asociados a CRISPR (cas) se asocian a menudo con matrices de espaciadores y repeticiones CRISPR. Se han descrito más de cuarenta familias diferentes de proteínas Cas. De estas familias de proteínas, Cas1 parece ser ubicuo entre los diferentes sistemas CRISPR/Cas. Se han usado combinaciones particulares de genescasy estructuras de repetición para definir 8 subtipos de CRISPR (E. coli,Y. Pest,N. meni,D. vulg,T. neap,H. mari,A. pernyM. tube), algunos de los cuales se asocian con un módulo génico adicional que codifica proteínas asociadas a repeticiones de función inicialmente desconocida (RAMP). Se puede producir más de un subtipo de CRISPR en un genoma individual. La distribución esporádica de los subtipos de CRISPR/Cas sugiere que el sistema está sujeto a transferencia génica horizontal durante la evolución microbiana.

[0201] El CRISPR de tipo II, descrito inicialmente enS. pyogenes, es uno de los sistemas mejor caracterizados y lleva a cabo el corte bicatenario dirigido de ADN en cuatro etapas secuenciales. En primer lugar, se transcriben dos ARN no codificantes, la matriz de pre-ARNcr y ARNcrtra, desde el locus CRISPR. En segundo lugar, el ARNcrtra se hibrida con las regiones de repetición del pre-ARNcr y media en el procesamiento del pre-ARNcr en ARNcr maduros que contienen secuencias espaciadoras individuales donde el procesamiento se produce por una RNasa III específica de doble hebra en presencia de la proteína Cas9. En tercer lugar, el complejo ARNcr:ARNcrtra maduro dirige Cas9 hacia el ADN diana por medio de emparejamiento de bases de Watson-Crick entre el espaciador en el ARNcr y el protoespaciador en el ADN diana cercano al motivo contiguo al protoespaciador (PAM), un requisito adicional para el reconocimiento de la diana. Además, el ARNcrtra también debe estar presente, ya que se empareja con el ARNcr en su extremo 3', y esta asociación desencadena la actividad de Cas9. Finalmente, Cas9 media en la escisión del ADN diana para crear un corte bicatenario dentro del protoespaciador. La actividad del sistema CRISPR/Cas comprende tres etapas: (i) inserción de secuencias de ADN exógeno en la matriz CRISPR para prevenir futuros ataques, en un procedimiento llamado "adaptación", (ii) expresión de las proteínas relevantes, así como expresión y procesamiento de la matriz, seguido de (iii) interferencia mediada por ARN con el ácido nucleico exógeno. Por tanto, en la célula bacteriana, varias de las llamadas proteínas "Cas" están involucradas con la función natural del sistema CRISPR/Cas.

[0203] Se han encontrado sistemas CRISPR de tipo II en muchas bacterias diferentes. Las búsquedas BLAST en genomas disponibles públicamente por Fonfaraet al.(2013) Nuc Acid Res 42(4):2377-2590 encontraron ortólogos de Cas9 en 347 especies de bacterias. Además, este grupo demostró la escisión por CRISPR/Casin vitrode una diana de ADN usando ortólogos de Cas9 deS. pyogenes,S. mutans,S. therophilus,C. jejuni,N. meningitides,P. multocidayF. novicida. Por tanto, el término "Cas9" se refiere a una ADN nucleasa guiada por ARN que comprende un dominio de unión a ADN y dos dominios de nucleasa, donde el gen que codifica la Cas9 puede derivar de cualquier bacteria adecuada.

[0205] La proteína Cas9 tiene al menos dos dominios de nucleasa: un dominio de nucleasa es similar a una endonucleasa HNH, mientras que el otro se asemeja a un dominio de endonucleasa Ruv. El dominio de tipo HNH parece ser responsable de escindir la hebra de ADN que es complementaria al ARNcr, mientras que el dominio Ruv escinde la hebra no complementaria. La nucleasa Cas 9 se puede genomanipular de modo que solo uno de los dominios de nucleasa sea funcional, creando una nucleasa Cas monocatenaria (véase Jineket al.(2012)Science337:816). Las nucleasas monocatenarias se pueden generar por mutación específica de aminoácidos en el dominio catalítico de la enzima, o por truncamiento de parte o todo el dominio de modo que ya no sea funcional. Dado que Cas 9 comprende dos dominios de nucleasa, este enfoque se puede adoptar en cualquiera de los dominios. Se puede lograr un corte bicatenario en el ADN diana mediante el uso de dos de dichas nucleasas Cas9 monocatenarias. Cada una de las nucleasas monocatenarias escindirá una hebra del ADN y el uso de dos creará un corte bicatenario.

[0207] El requisito del complejo ARNcr-ARNcrtra se puede evitar mediante el uso de un "ARN guía monocatenario" (ARNgm) genomanipulado que comprende la horquilla normalmente formada por la hibridación del ARNcr y el ARNcrtra (véase Jineket al.,ibidy Conget al.(2013)Sciencexpress/10.1126/science.1231143). EnS. pyrogenes, la fusión ARNcrtra:ARNcr genomanipulada, o el ARNgm, guía a Cas9 para escindir el ADN diana cuando se forma un heterodímero ARN:ADN bicatenario entre los ARN asociados a Cas y el ADN diana. Este sistema, que comprende la proteína Cas9 y un ARNgm genomanipulado que contiene una secuencia de PAM, se ha usado para la edición del genoma guiada por ARN (véase Ramalingamet al.(2013) Stem Cells and Development 22(4):595-610) y ha sido útil para la edición genómica de embriones de pez cebra in vivo (véase Hwanget al.(2013) Nature Biotechnology 31 (3):227) con eficacias de edición similares a las ZFN y TALEN.

[0208] Los productos principales de los locus CRISPR parecen ser ARN cortos que contienen las secuencias dirigidas al invasor, y se denominan ARN guía o ARN de silenciamiento procariotas (pARNsi) en base a su papel hipotético en la vía (Makarovaet al.(2006) Biol. Direct 1:7; Haleet al.(2008) RNA, 14:2572-2579). El análisis de ARN indica que los transcritos del locus CRISPR se escinden dentro de las secuencias de repetición para liberar intermedios de ARN de ~60 a 70 nt que contienen secuencias dirigidas al invasor individuales y fragmentos de repetición flanqueantes (Tanget al.(2002) Proc. Natl. Acad. Sci.99:7536-7541; Tanget al.(2005) Mol. Microbiol. 55:46.9-481; Lillestolet al.(2006) Archaea 2:59-72; Brounset al.(2008) Science 321:960-964; Haleet al.(2008) RNA, 14:2572-2579). En la arqueaPyrococcus furiosus, estos ARN intermedios se procesan adicionalmente a pARNsi maduros abundantes y estables de ~35 a 45 nt (Haleet al.(2008) RNA, 14:2572-2579).

[0210] El requisito del complejo ARNcr-ARNcrtra se puede evitar mediante el uso de un "ARN guía monocatenario" (ARNgm) modificado que comprende la horquilla normalmente formada por la hibridación del ARNcr y el ARNcrtra (véase Jineket al.(2012) Science 337:816 y Conget al.(2013) Sciencexpress/10.1126/science.1231143). EnS. pyrogenes, la fusión ARNcrtra:ARNcr genomanipulada, o el ARNgm, guía a Cas9 para escindir el ADN diana cuando se forma un heterodímero ARN:ADN bicatenario entre los ARN asociados a Cas y el ADN diana. Este sistema, que comprende la proteína Cas9 y un ARNgm genomanipulado que contiene una secuencia de PAM, se ha usado para la edición del genoma guiada por ARN (véase Ramalingam,ibid) y ha sido útil para la edición genómica de embriones de pez cebrain vivo(véase Hwanget al.(2013) Nature Biotechnology 31 (3):227) con eficacias de edición similares a las ZFN y TALEN.

[0211] Los ARNgm o ARN quiméricos se pueden genomanipular para comprender una secuencia complementaria a cualquier diana deseada. En algunos modos de realización, una secuencia guía es de aproximadamente o más de aproximadamente 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 o más nucleótidos de longitud. En algunos modos de realización, una secuencia guía es de menos de aproximadamente 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 o menos nucleótidos de longitud. En determinados modos de realización, el ARNgm comprende una secuencia que se une a 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleótidos contiguos de un sitio diana de tau, como se muestra en la publicación de EE. UU n.º 20180153921. En algunos modos de realización, los ARN comprenden 22 bases de complementariedad con una diana y de la forma G[n19], seguidas de un motivo contiguo al protoespaciador (PAM) de la forma NGG o NAG para su uso con un sistema CRISPR/Cas deS. pyogenes. Por tanto, en un procedimiento, los ARNgm se pueden diseñar mediante la utilización de una diana de ZFN conocida en un gen de interés (i) alineando la secuencia de reconocimiento del heterodímero de ZFN con la secuencia de referencia del genoma relevante (humano, de ratón o de una especie vegetal particular); (ii) identificando la región espaciadora entre los semisitios de ZFN; (iii) identificando la localización del motivo G[N20]GG que está más cerca de la región espaciadora (cuando más de un motivo de este tipo se superpone al espaciador, se elige el motivo que está centrado con respecto al espaciador); (iv) usando ese motivo como el núcleo del ARNgm. Este procedimiento se basa, de forma ventajosa, en dianas de nucleasa probadas. De forma alternativa, los ARNgm se pueden diseñar para dirigirse a cualquier región de interés simplemente identificando una secuencia diana adecuada que se ajuste a la fórmula G[n20]GG. Junto con la región de complementariedad, un ARNgm puede comprender nucleótidos adicionales para extenderse a la región de la cola de la porción de ARNcrtra del ARNgm (véase Hsuet al.(2013) Nature Biotech doi:10.1038/nbt.2647). Las colas pueden ser de 67 a 85 nucleótidos, o cualquier número comprendido entre los mismos, con una longitud preferente de 85 nucleótidos. También se pueden usar ARNgm truncados, "ARNgtru" (véase Fuet al.(2014) Nature Biotech 32(3):279). En los ARNgtru, la región de complementariedad disminuye a 17 o 18 nucleótidos de longitud.

[0213] Además, también se pueden utilizar secuencias de PAM alternativas, donde una secuencia de PAM puede ser NAG como alternativa a NGG (Hsu 2013,ibid) usando una Cas9 deS. pyogenes. Las secuencias de PAM adicionales también pueden incluir aquellas que carecen de la G inicial (Sander y Joung (2014) Nature Biotech 32(4):347). Además de las secuencias de PAM de Cas9 codificadas porS. pyogenes, se pueden usar otras secuencias de PAM que son específicas para proteínas Cas9 de otras fuentes bacterianas. Por ejemplo, las secuencias de PAM mostradas a continuación (adaptado de Sander y Joung,ibid, y Esveltet al.(2013) Nat Meth 10(11):1116) son específicas para estas proteínas Cas9:

[0215] Especie

[0216] S. pyogenes

[0217] S. pyogenes

[0219] S. mutans

[0220] S. thermophilius

[0222] S. thermophilius

[0224] S. thermophilius

[0225] S. thermophilius

[0227] C. jejuni

[0229] N. meningitides

[0230] P. multocida

[0231] F. novicida

[0233] Por tanto, se puede elegir una secuencia diana adecuada para su uso con un sistema CRISPR/Cas deS. pyogenesde acuerdo con la siguiente guía: [n17, n18, n19 o n20](G/A)G. De forma alternativa, la secuencia de PAM puede seguir la guía G[n17, n18, n19, n20](G/A)G. Para proteínas Cas9 derivadas de bacterias distintas deS. pyogenes, se pueden usar las mismas guías cuando las secuencias de PAM deS. pyogenesse sustituyen por PAM alternativos.

[0235] Lo más preferente es elegir una secuencia diana con la mayor probabilidad de especificidad que evite potenciales secuencias fuera de diana. Estas secuencias fuera de diana no deseadas se pueden identificar considerando los siguientes atributos: i) similitud en la secuencia diana que va seguida de una secuencia de PAM que se sabe que funciona con la proteína Cas9 que se está utilizando; ii) una secuencia diana similar con menos de tres emparejamientos erróneos con respecto a la secuencia diana deseada; iii) una secuencia diana similar como en ii), donde los emparejamientos erróneos se localizan todos en la región distal de PAM en lugar de en la región proximal de PAM (existen algunas pruebas de que los nucleótidos 1-5 inmediatamente contiguos o proximales al PAM, a veces denominados región "semilla" (Wuet al.(2014) Nature Biotech doi: 10.1038/nbt2889) son los más críticos para el reconocimiento, por lo que los supuestos sitios fuera de diana con emparejamientos erróneos localizados en la región semilla pueden ser los tienen la menor probabilidad de ser reconocidos por el ARNgm; y iv) una secuencia diana similar donde los emparejamientos erróneos no están consecutivamente espaciados o están espaciados por más de cuatro nucleótidos de distancia (Hsu 2013,ibid). Por tanto, al realizar un análisis del número de potenciales sitios fuera de diana en un genoma para cualquier sistema CRISPR/Cas que se esté empleando, usando estos criterios anteriores, se puede identificar una secuencia diana adecuada para el ARNgm.

[0237] En algunos modos de realización, se usa el sistema CRISPR-Cpf1. El sistema CRISPR-Cpf1, identificado enFrancisell.spp, es un sistema CRISPR-Cas de clase 2 que media una interferencia robusta de ADN en células humanas. Aunque funcionalmente conservados, Cpf1 y Cas9 difieren en muchos aspectos, incluyendo sus ARN guía y la especificidad por el sustrato (véase Fagerlundet al.(2015) Genom Bio 16:251). Una diferencia importante entre las proteínas Cas9 y Cpf1 es que Cpf1 no utiliza ARNcrtra y, por tanto, solo requiere un ARNcr. Los ARNcr de FnCpf1 tienen una longitud de 42-44 nucleótidos (repetición de 19 nucleótidos y espaciador de 23-25 nucleótidos) y contienen un tallo-bucle individual, que tolera cambios de secuencia que conservan la estructura secundaria. Además, los ARNcr de Cpf1 son significativamente más cortos que los ARNgm genomanipulados de ~100 nucleótidos requeridos por Cas9, y los requisitos de PAM para FnCpf1 son 5'-TTN-3' y 5'-CTA-3' en la hebra desplazada. Aunque tanto Cas9 como Cpf1 realizan cortes bicatenarios en el ADN diana, Cas9 usa sus dominios similares a RuvC y a HNH para realizar cortes de extremos romos dentro de la secuencia semilla del ARN guía, mientras que Cpf1 usa un dominio similar a RuvC para producir cortes escalonados fuera de la semilla. Debido a que Cpf1 realiza cortes escalonados lejos de la región semilla crítica, NHEJ no alterará el sitio diana, garantizando por lo tanto que Cpf1 pueda continuar cortando el mismo sitio hasta que haya tenido lugar el evento de recombinación HDR deseado. Por tanto, en los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento, se entiende que el término "Cas" incluye tanto proteínas Cas9 como Cpf1. Por tanto, como se usa en el presente documento, un "sistema CRISPR/Cas" se refiere a ambos sistemas CRISPR/Cas y/o CRISPR/Cfp1, incluyendo ambos sistemas de nucleasa, nucleasa monocatenaria y/o factor de transcripción.

[0239] En algunos modos de realización, se pueden usar otras proteínas Cas. Algunas proteínas Cas ejemplares incluyen Cas9, Cpf1 (también conocida como Cas12a), C2c1, C2c2 (también conocida como Cas13a), C2c3, Cas1, Cas2, Cas4, CasX y CasY; e incluyen variantes genomanipuladas y naturales de las mismas (Bursteinet al.(2017) Nature 542:237-241), por ejemplo HF1/spCas9 (Kleinstiveret al.(2016) Nature 529:490-495; Cebrian-Serrano y Davies (2017) Mamm Genome 28(7):247-261); sistemas Cas9 divididos (Zetscheet al.(2015) Nat Biotechnol 33(2):139-142), Cas9 con empalme en trans basada en un sistema inteína-exteína (Trounget al.(2015) Nucl Acid Res 43(13): 6450-8); mini-SaCas9 (Maet al.(2018) ACS Synth Biol 7(4):978-985). Por tanto, en los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento, se entiende que el término "Cas" incluye todas las proteínas variantes de Cas, tanto naturales como genomanipuladas. Por tanto, como se usa en el presente documento, un "sistema CRISPR/Cas" se refiere a cualquier sistema CRISPR/Cas, incluyendo ambos sistemas de nucleasa, nucleasa monocatenaria y/o factor de transcripción. En determinados modos de realización, la proteína Cas puede ser un "derivado funcional" de una proteína Cas natural. Un "derivado funcional" de un polipéptido de secuencia natural es un compuesto que tiene una propiedad biológica cualitativa en común con un polipéptido de secuencia natural. Los "derivados funcionales" incluyen, pero no se limitan a, fragmentos de una secuencia natural y derivados de un polipéptido de secuencia natural y sus fragmentos, siempre que tengan una actividad biológica en común con un polipéptido de secuencia natural correspondiente. Una actividad biológica contemplada en el presente documento es la capacidad del derivado funcional de hidrolizar un sustrato de ADN en fragmentos. El término "derivado" engloba tanto variantes de secuencias de aminoácidos de polipéptido como modificaciones covalentes y fusiones de las mismas. En algunos aspectos, un derivado funcional puede comprender una propiedad biológica individual de una proteína Cas natural. En otros aspectos, un derivado funcional puede comprender un subconjunto de propiedades biológicas de una proteína Cas natural. Los derivados adecuados de un polipéptido Cas o un fragmento del mismo incluyen, pero no se limitan a, mutantes, fusiones, modificaciones covalentes de proteína Cas o un fragmento de la misma. La proteína Cas, que incluye la proteína Cas o un fragmento de la misma, así como derivados de proteína Cas o de un fragmento de la misma, pueden ser obtenibles a partir de una célula o sintetizarse químicamente o mediante una combinación de estos dos procedimientos. La célula puede ser una célula que produce proteína Cas de forma natural, o una célula que produce proteína Cas de forma natural y se genomanipula para que produzca la proteína Cas endógena a un nivel de expresión mayor o para producir una proteína Cas a partir de un ácido nucleico introducido de forma exógena, ácido nucleico que codifica una Cas que es igual a o diferente de la Cas endógena. En algunos casos, la célula no produce proteína Cas de forma natural y se genomanipula para que produzca una proteína Cas.

[0240] Se divulgan sistemas de nucleasa CRISPR/Cas ejemplares dirigidos a genes específicos (incluyendo genes de puerto seguro), por ejemplo, en la publicación de patente de EE. UU. n.º 2015/0056705.

[0241] Por tanto, la nucleasa comprende un dominio de unión a ADN que se une específicamente a un sitio diana en cualquier gen en el que se desee insertar un donante (transgén) en combinación con un dominio de nucleasa que escinde el ADN.

[0242] Moduladores del gen tau

[0243] Los dominios de unión a ADN de tau se pueden fusionar o asociar de otro modo con cualquier molécula adicional (por ejemplo, polipéptidos) para su uso en los procedimientos descritos en el presente documento. En determinados modos de realización, los procedimientos emplean moléculas de fusión que comprenden al menos una molécula de unión a ADN (por ejemplo, ZFP, TALE o ARN guía monocatenario) y un dominio regulador (funcional) heterólogo (o fragmento funcional del mismo).

[0244] En determinados modos de realización, el dominio funcional del modulador de tau comprende un dominio regulador de la transcripción. Los dominios comunes incluyen, por ejemplo, dominios de factores de transcripción (activadores, represores, coactivadores, correpresores), silenciadores, oncogenes (por ejemplo, miembros de la familia myc, jun, fos, myb, max, mad, rel, ets, bel, myb, mos, etc.). Enzimas de reparación del ADN y sus factores y modificadores asociados; enzimas de reordenamiento de ADN y sus factores y modificadores asociados; proteínas asociadas a la cromatina y sus modificadores (por ejemplo, cinasas, acetilasas y desacetilasas); y enzimas modificadoras de ADN (por ejemplo, metiltransferasas, topoisomerasas, helicasas, ligasas, cinasas, fosfatasas, polimerasas, endonucleasas), modificadores de la degradación de proteínas (desubiquitinasas, ligasas, degrones) y sus factores y modificadores asociados. Véase, por ejemplo, la publicación de EE. UU. n.º 2013/0253040.

[0245] Los dominios adecuados para lograr la activación incluyen el dominio de activación VP16 de HSV (véase, por ejemplo, Hagmannet al.(1997) J. Virol.71:5952-5962); receptores de hormonas nucleares (véase, por ejemplo, Torchiaet al.(1998) Curr. Opin. Cell. Biol. 10:373-383); la subunidad p65 del factor nuclear kappa B (Bitko & Barik (1998) J. Virol.72:5610-5618 y Doyle & Hunt (1997) Neuroreport 8:2937-2942); Liuet al.(1998) Cancer Gene Ther. 5:3-28), o dominios funcionales quiméricos artificiales tales como VP64 (Beerliet al.(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14623-33), y degron (Molinariet al.(1999) EMBO J. 18:6439-6447). Los dominios de activación ejemplares adicionales incluyen Oct-1, Oct-2A, Sp1, AP-2 y CTF1 (Seipelet al.(1992) EMBO J.

[0246] 11:4961-4968), así como p300, CBP, PCAF, SRC1 PvALF, AtHD2A y ERF-2. Véanse, por ejemplo, Robyret al.(2000) Mol. Endocrinol.14:329-347; Collingwoodet al.(1999) J. Mol. Endocrinol.23:255-275; Leoet al.(2000) Gene 245:1-11; Manteuffel-Cymborowska (1999) Acta Biochim. Pol.46:77-89; McKennaet al.(1999) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 69:3-12; Maliket al.(2000) Trends Biochem. Sci. 25:277-283; y Lemonet al.(1999) Curr. Opin. Genet. Dev.9:499-504. Los dominios de activación ejemplares adicionales incluyen, pero no se limitan a, OsGAI, HALF-1, C1, AP1, ARF-5, -6, -7 y -8, CPRF1, CPRF4, MYC-RP/GP y TRAB1. Véase, por ejemplo, Ogawaet al.(2000) Gene 245:21-29; Okanamiet al.(1996) Genes Cells 1:87-99; Goffet al.(1991) Genes Dev.

[0247] 5:298-309; Choet al.(1999) Plant Mol. Biol. 40:419-429; Ulmasonet al.(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5844-5849; Sprenger-Hausselset al.(2000) Plant J. 22:1-8; Gonget al.(1999) Plant Mol. Biol.41:33-44; y Hoboet al.(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:15.348-15.353,

[0248] Los dominios de represión ejemplares que se pueden usar para preparar represores de tau incluyen, pero no se limitan a, KRAB A/B, KOX, gen temprano inducible por TGF-beta (TIEG), v-erbA, SID, MBD2, MBD3, miembros de la familia de DNMT (por ejemplo, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B), Rb y MeCP2. Véanse, por ejemplo, Birdet al.(1999) Cell 99:451-454; Tyleret al.(1999) Cell 99:443-446; Knoepfleret al.(1999) Cell 99:447-450; y Robertsonet al.(2000) Nature Genet. 25:338-342. Los dominios de represión ejemplares adicionales incluyen, pero no se limitan a, ROM2 y AtHD2A. Véanse, por ejemplo, Chemet al.(1996) Plant Cell 8:305-321; y Wuet al.(2000) Plant J.22:19-27.

[0249] En algunos casos, el dominio está implicado en la regulación epigenética de un cromosoma. En algunos modos de realización, el dominio es una histona acetiltransferasa (HAT), por ejemplo, de tipo A, localizada en el núcleo, tal como los miembros de la familia de MYST MOZ, Ybt2/Sas3, MOF y Tip60, los miembros de la familia de GNAT Gen5 o pCAF, los miembros de la familia de p300 CBP, p300 o Rttt109 (Berndsen y Denu (2008) Curr Opin Struct Biol 18(6):682-689). En otros casos, el dominio es una histona desacetilasa (HDAC) tal como de la clase I (HDAC-1, 2, 3 y 8), clase II (HDAC IIA (HDAC-4, 5, 7 y 9), HDAC IIB (HDAC 6 y 10)), clase IV (HDAC-11), clase III (también conocidas como sirtuinas (SIRT); SIRT1-7) (véase Mottamalet al.(2015) Molecules 20(3):3898-3941). Otro dominio que se usa en algunos modos de realización es una histona fosforilasa o cinasa, donde los ejemplos incluyen MSK1, MSK2, ATR, ATM, DNA-PK, Bub1, VprBP, IKK-α, PKCβ1, Dik/Zip, JAK2, PKC5, WSTF y CK2. En algunos modos de realización, se usa un dominio de metilación y se puede elegir de grupos tales como Ezh2, PRMT1/6, PRMT5/7, PRMT 2/6, CARM1, set7/9, MLL, ALL-1, Suv 39h, G9a, SETDB1, Ezh2, Set2, Dot1, PRMT 1/6, PRMT 5/7, PR-Set7 y Suv4-20h. También se pueden usar dominios implicados en la sumoilación y biotinilación (Lys9, 13, 4, 18 y 12) en algunos modos de realización (véase una revisión en Kousarides (2007) Cell 128:693-705).

[0250] Las moléculas de fusión se construyen por procedimientos de clonación y conjugación bioquímica que son bien conocidos para los expertos en la técnica. Las moléculas de fusión comprenden un dominio de unión a ADN y un dominio funcional (por ejemplo, un dominio de activación o represión transcripcional). Las moléculas de fusión también comprenden opcionalmente señales de localización nuclear (tales como, por ejemplo, las del antígeno T del medio SV40) y marcas epitópicas (tales como, por ejemplo, FLAG y hemaglutinina). Las proteínas de fusión (y los ácidos nucleicos que las codifican) se diseñan de modo que se conserve el marco de lectura traduccional entre los componentes de la fusión.

[0251] Las fusiones entre un componente polipeptídico de un dominio funcional (o un fragmento funcional del mismo) por un lado y un dominio de unión a ADN no proteico (por ejemplo, antibiótico, intercalador, ligando del surco menor, ácido nucleico) por el otro se construyen por procedimientos de conjugación bioquímica conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, el catálogo de Pierce Chemical Company (Rockford, IL). Se han descrito procedimientos y composiciones para realizar fusiones entre un ligando del surco menor y un polipéptido. Mappet al.(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3930-3935. Del mismo modo, los TF de CRISPR/Cas y las nucleasas que comprenden un componente de ácido nucleico de ARNgm en asociación con un dominio funcional del componente polipeptídico también son conocidos por los expertos en la técnica y se detallan en el presente documento.

[0252] La molécula de fusión se puede formular con un vehículo farmacéuticamente aceptable, como es conocido por los expertos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17.ª ed., 1985; y la publicación de patente internacional de propiedad conjunta n.º WO 00/42219,

[0253] El componente/dominio funcional de una molécula de fusión se puede seleccionar de cualquiera de una variedad de diferentes componentes que pueden en la transcripción de un gen una vez que la molécula de fusión se une a una secuencia diana por medio de su dominio de unión a ADN. Por consiguiente, el componente funcional puede incluir, pero no se limita a, diversos dominios de factores de transcripción, tales como activadores, represores, coactivadores, correpresores y silenciadores.

[0254] En determinados modos de realización, la molécula de fusión comprende un dominio de unión a ADN y un dominio de nucleasa para crear entidades funcionales que pueden reconocer su diana de ácido nucleico prevista a través de sus dominios de unión a ADN (ZFP o TALE o ARNgm) genomanipulados y crear nucleasas (por ejemplo, nucleasa con dedos de cinc o nucleasas TALE o nucleasas CRISPR/Cas) que provocan que el ADN se corte cerca del sitio de unión a ADN por medio de la actividad nucleasa. Esta escisión da como resultado la inactivación (represión) de un gentau. Por tanto, los represores de tau también incluyen nucleasas de tau.

[0255] Por tanto, los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento son ampliamente aplicables y pueden implicar cualquier nucleasa de interés. Los ejemplos no limitantes de nucleasas incluyen meganucleasas, TALEN y nucleasas con dedos de cinc. La nucleasa puede comprender dominios de unión a y escisión de ADN heterólogos (por ejemplo, nucleasas con dedos de cinc; TALEN; dominios de unión a ADN de meganucleasas con dominios de escisión heterólogos, ARNgm en asociación con dominios de nucleasa) o, de forma alternativa, se puede alterar el dominio de unión a ADN de una nucleasa natural para que se una a un sitio diana seleccionado (por ejemplo, una meganucleasa que se ha genomanipulado para que se una a un sitio diferente del sitio de unión afín).

[0256] El dominio de nucleasa se puede derivar de cualquier nucleasa, por ejemplo, cualquier endonucleasa o exonucleasa. Los ejemplos no limitantes de dominios de nucleasa (escisión) adecuados que se pueden fusionar con dominios de unión a ADN de tau como se describe en el presente documento incluyen dominios de cualquier enzima de restricción, por ejemplo, una enzima de restricción de tipo IIS (por ejemplo, FokI). En determinados modos de realización, los dominios de escisión son semidominios de escisión que requieren dimerización para la actividad de escisión. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.º 8.586.526; 8.409.861; y 7.888.121.

[0257] En general, se requieren dos proteínas de fusión para la escisión si las proteínas de fusión comprenden semidominios de escisión. De forma alternativa, se puede usar una proteína individual que comprende dos semidominios de escisión. Los dos semidominios de escisión se pueden derivar de la misma endonucleasa (o fragmentos funcionales de la misma), o cada semidominio de escisión se puede derivar de una endonucleasa diferente (o fragmentos funcionales de la misma). Además, los sitios diana para las dos proteínas de fusión se disponen preferentemente, uno con respecto al otro, de modo que la unión de las dos proteínas de fusión a sus respectivos sitios diana coloque los semidominios de escisión en una orientación espacial entre sí que permita que los semidominios de escisión formen un dominio de escisión funcional, por ejemplo, por dimerización. El dominio de nucleasa también se puede derivar de cualquier dominio de meganucleasa (endonucleasa de asentamiento). con actividad de escisión también se puede usar con las nucleasas descritas en el presente documento, incluyendo, pero sin limitarse a, I-SceI, I-CeuI, PI-PspI,P1-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII e I-TevIII.

[0258] En determinados modos de realización, la nucleasa comprende una TALEN compacta (cTALEN). Estas son proteínas de fusión monocatenarias que unen un dominio de unión a ADN de TALE a un dominio de nucleasa TevI. La proteína de fusión puede actuar como una nucleasa monocatenaria localizada por la región TALE o bien puede crear un corte bicatenario, dependiendo de dónde se localice el dominio de unión a ADN de TALE con respecto al dominio de nucleasa de meganucleasa (por ejemplo,TevI) (véase Beurdeleyet al.(2013) Nat Comm 4(1762):1-8, DOI: 10.1038/ncomms2782).

[0259] En otros modos de realización, la nucleasa TALE es una megaTAL. Estas nucleasas megaTAL son proteínas de fusión que comprenden un dominio de unión a ADN de TALE y un dominio de escisión de meganucleasa. El dominio de escisión de meganucleasa es activo como monómero y no requiere dimerización para la actividad. (Véase Boisselet al.(2013) Nucl Acid Res 42(4):2591-2601, doi: 10.1093/nar/gkt1224).

[0260] Además, el dominio de nucleasa de la meganucleasa también puede presentar funcionalidad de unión a ADN. Se puede usar cualquier TALEN en combinación con TALEN adicionales (por ejemplo, una o más TALEN (cTALEN o FokI-TALEN) con uno o más megaTAL) y/o ZFN.

[0261] Además, los dominios de escisión pueden incluir una o más alteraciones en comparación con el tipo natural, por ejemplo, para la formación de heterodímeros estrictos que reducen o eliminan los efectos de escisión inespecíficos. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.º 7.914.796; 8.034.598; y 8.623.618.

[0262] Las nucleasas como se describe en el presente documento pueden generar cortes bicatenarios o monocatenarios en una diana bicatenaria (por ejemplo, gen). La generación de cortes monocatenarias ("mellas") se describe, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.º 8.703.489 y 9.200.266, que describen cómo la mutación del dominio catalítico de uno de los dominios de nucleasas da como resultado una nucleasa monocatenaria.

[0263] Por tanto, un dominio de nucleasa (escisión) o semidominio de escisión puede ser cualquier porción de una proteína que conserve la actividad de escisión, o que conserve la capacidad de multimerizarse (por ejemplo, dimerizarse) para formar un dominio de escisión funcional.

[0264] De forma alternativa, las nucleasas se pueden ensamblarin vivoen el sitio diana de ácido nucleico usando la llamada tecnología de "enzima dividida" (split-enzyme) (véase, por ejemplo, la publicación de patente de EE. UU. n.º 2009/0068164). Los componentes de dichas enzimas divididas se pueden expresar en construcciones de expresión separadas o bien se pueden enlazar en un marco de lectura abierto donde los componentes individuales están separados, por ejemplo, por un péptido 2A de autoescisión (por ejemplo, T2A) o secuencia IRES. Los componentes pueden ser dominios de unión con dedos de cinc individuales o dominios de un dominio de unión a ácido nucleico de meganucleasa.

[0265] Las nucleasas se pueden cribar para detectar la actividad antes de su uso, por ejemplo, en un sistema cromosómico basado en levaduras como se describe en la publicación de patente de EE. UU. n.º 2009/0111119. Se pueden diseñar fácilmente construcciones de expresión de nucleasas usando procedimientos conocidos en la técnica.

[0266] La expresión de las proteínas de fusión (o componente de las mismas) puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o un promotor inducible, por ejemplo, el promotor de galactocinasa que se activa (desreprime) en presencia de rafinosa y/o galactosa y se reprime en presencia de glucosa. Los ejemplos no limitantes de promotores preferentes incluyen los promotores neuronales específicos NSE, sinapsina, CAMKiia y MECP. Los ejemplos no limitantes de promotores ubicuos incluyen CAS y Ubc. Otro modo de realización incluyen el uso de promotores autorreguladores (por medio de la inclusión de sitios de unión de alta afinidad por el dominio de unión a ADN de tau), como se describe en la publicación de patente de EE. UU. n.º 2015/0267205).

[0267] En determinados modos de realización, los moduladores de tau para su uso en un sujeto comprenden ZFP designados como 57890, 65918 y/o 57930. En determinados modos de realización, se proporcionan al sujeto dos más de dichos moduladores de tau que proporcionan efectos sinérgicos en comparación con un represor de tau ZFP individual (por ejemplo, represores de ZFP 57890 y 65918; represores de ZFP 57890 y 57930; 65918 y 57930; 57890, 65918 y 57930) para la represión de tau y el tratamiento y/o prevención de una tauopatía tal como EA, incluyendo la mejora de los síntomas de la tauopatía.

[0268] Administración

[0269] Las proteínas y/o polinucleótidos (por ejemplo, moduladores de tau) y composiciones que comprenden las proteínas y/o polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden administrar a una célula diana por cualquier medio adecuado, incluyendo, por ejemplo, por inyección de proteínas, por medio de ARNm y/o usando una construcción de expresión (por ejemplo, plásmido, vector lentivírico, vector AAV, vector Ad, etc.). En modos de realización preferentes, el represor se administra usando un vector AAV, incluyendo, pero sin limitarse a, AAV9 (véase la patente de EE. UU. n.º 7.198.951), un vector AAV como se describe en la patente de EE. UU. n.º 9.585.971.

[0270] Se describen procedimientos de administración de proteínas que comprenden proteínas con dedos de cinc como se describe en el presente documento, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.º 6.453.242; 6.503.717; 6.534.261; 6.599.692; 6.607.882; 6.689.558; 6.824.978; 6.933.113; 6.979.539; 7.013.219; y 7.163.824, Se puede usar cualquier sistema de vectores incluyendo, pero sin limitarse a, vectores plasmídicos, vectores retrovíricos, vectores lentivíricos, vectores de adenovirus, vectores de poxvirus; vectores de herpesvirus y vectores víricos adenoasociados, etc. Véanse, también, las patentes de EE. UU n.º 8.586.526; 6.534.261; 6.607.882; 6.824.978; 6.933.113; 6.979.539; 7.013.219; y 7.163.824. Además, será evidente que cualquiera de estos vectores puede comprender una o más secuencias que codifican proteínas de unión a ADN. Por tanto, cuando se introducen uno o más moduladores (por ejemplo, represores) de tau en la célula, las secuencias que codifican los componentes proteicos y/o componentes polinucleotídicos se pueden transportar en el mismo vector o en diferentes vectores. Cuando se usan múltiples vectores, cada vector puede comprender una secuencia que codifica uno o múltiples moduladores (por ejemplo, represores) de tau o componentes de los mismos. En modos de realización preferentes, el sistema de vector es un vector AAV, por ejemplo, AAV9 o una variante AAV descrita en la patente de EE. UU. n.º 9.585.971 o la publicación de patente de EE. UU. n.º 2017/0119906.

[0271] Se pueden usar procedimientos convencionales de transferencia génica basados y no basados en virus para introducir ácidos nucleicos que codifican moduladores de tau genomanipulados en células (por ejemplo, células de mamífero) y tejidos diana. Dichos procedimientos también se pueden usar para administrar ácidos nucleicos que codifican dichos represores (o componentes de los mismos) a célulasin vitro. En determinados modos de realización, los ácidos nucleicos que codifican los represores se administran para usos en genoterapiain vivooex vivo. Los sistemas de administración con vectores no víricos incluyen plásmidos de ADN, ácido nucleico no marcado y ácido nucleico complejado con un vehículo de liberación tal como un liposoma o poloxámero. Los sistemas de administración con vectores víricos incluyen virus de ADN y ARN, que tienen genomas episómicos o bien integrados después de la administración a la célula. Para una revisión de los procedimientos de genoterapia, véanse Anderson (1992) Science 256:808-813; Nabel & Felgner (1993) TIBTECH 11:211-217; Mitani & Caskey (1993) TIBTECH 11:162-166; Dillon (1993) TIBTECH 11:167-175; Miller (1992) Nature 357:455-460; Van Brunt (1988) Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne (1995) Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36; Kremer & Perricaudet (1.995) British Medical Bulletin 51(1):31-44; Haddadaet al., en Current Topics in Microbiology and Immunology, Doerfler y Böhm (eds.) (1995); y Yuet al.(1994) Gene Therapy 1:13-26.

[0272] Los procedimientos de administración sin virus de ácidos nucleicos incluyen electroporación, lipofección, microinyección, biolística, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, conjugados de policationes o lípidos con ácidos nucleicos, ADN no marcado, ARN no marcado, viriones artificiales y captación de ADN potenciada por agente. También se puede usar sonoporación usando, por ejemplo, el sistema Sonitron 2000 (Rich-Mar) para la administración de ácidos nucleicos. En un modo de realización preferente, uno o más ácidos nucleicos se administran como ARNm. También es preferente el uso de ARNm con caperuza para incrementar la eficiencia de la traducción y/o la estabilidad del ARNm. Son especialmente preferentes las caperuzas ARCA (análogo de caperuza anti-reverso) o variantes de las mismas. Véanse las patentes de EE. UU. n.º 7.074.596 y 8.153.773. Los sistemas de administración de ácidos nucleicos ejemplares adicionales incluyen los proporcionados por Amaxa Biosystems (Colonia, Alemania), Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA) y Copernicus Therapeutics Inc., (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.º 6.008.336). La lipofección se describe, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.º 5.049.386; 4.946.787; y 4.897.355) y los reactivos de lipofección se venden comercialmente (por ejemplo, Transfectam™ y Lipofectin™ y Lipofectamine™ RNAiMAX). Los lípidos catiónicos y neutros que son adecuados para lipofección de reconocimiento de receptores eficiente de polinucleótidos incluyen los de Felgner, publicaciones de patente internacional n.º WO 91/17424 y WO 91/16024. La administración puede ser a células (administraciónex vivo) o a tejidos diana (administraciónin vivo).

[0273] La preparación de complejos lípido:ácido nucleico, incluyendo liposomas dirigidos tales como complejos de inmunolípidos, es bien conocida por un experto en la técnica (véanse, por ejemplo, Crystal (1995) Science 270:404-410 (1995); Blaeseet al.(1995) Cancer Gene Ther.2:291-297; Behret al.(1994) Bioconjugate Chem.

[0274] 5:382-389; Remyet al.(1994) Bioconjugate Chem. 5:647-654; Gaoet al.(1995) Gene Therapy 2:710-722; Alunadet al.(1992) Cancer Res. 52:4817-4820; patentes de EE. UU. n.º 4.186.183; 4.217.344; 4.235.871; 4.261.975; 4.485.054; 4.501.728; 4.774.085; 4.837.028; y 4.946.787).

[0276] Los procedimientos de administración adicionales incluyen el uso de empaquetamiento de los ácidos nucleicos que se van a administrar en vehículos de liberación EtiGeneIC (EDV). Estos EDV se administran específicamente a tejidos diana usando anticuerpos biespecíficos en los que un brazo del anticuerpo tiene especificidad por el tejido diana y el otro tiene especificidad por el EDV. El anticuerpo lleva los EDV hasta la superficie de la célula diana y, a continuación, el EDV se introduce en la célula por endocitosis. Una vez en la célula, se liberan los contenidos (véase MacDiarmidet al.(2009)Nature Biotechnology27(7):643).

[0278] El uso de sistemas basados en virus de ARN o ADN para la administración de ácidos nucleicos que codifican ZFP, TALE o sistemas CRISPR/Cas genomanipulados aprovecha procedimientos altamente evolucionados para dirigir un virus a células específicas en el organismo y transportar la carga vírica hasta el núcleo. Los vectores víricos se pueden administrar directamente a los pacientes (in vivo) o se pueden usar para tratar célulasin vitroy que las células modificadas se administren a los pacientes (ex vivo). Los sistemas convencionales basados en virus para la administración de ZFP, TALE o sistemas CRISPR/Cas incluyen, pero no se limitan a, vectores retrovíricos, lentivíricos, adenovíricos, de virus adenoasociados, de vaccinia y de herpes simple para transferencia génica. La integración en el genoma del huésped es posible con los procedimientos de transferencia génica de retrovirus, lentivirus y virus adenoasociados, lo que a menudo da como resultado la expresión a largo plazo del transgén insertado. Además, se han observado altas eficacias de transducción en muchos tipos de células y tejidos diana diferentes.

[0280] El tropismo de un retrovirus se puede alterar incorporando proteínas de envoltura exógenas, expandiendo la población diana potencial de células diana. Los vectores lentivíricos son vectores retrovíricos que pueden transducir o infectar células que no se dividen y, típicamente, producen valores víricos altos. La selección de un sistema retrovírico de transferencia génica depende del tejido diana. Los vectores retrovíricos se componen de repeticiones terminales largas (LTR) que actúan enciscon capacidad de empaquetamiento de hasta 6-10 kb de secuencia exógena. Las LTR que actúan encismínimas son suficientes para la replicación y el empaquetamiento de los vectores, que a continuación se usan para integrar el gen terapéutico en la célula diana para proporcionar expresión transgénica permanente. Los vectores retrovíricos ampliamente usados incluyen los basados en virus de la leucemia de ratón (MuLV), virus de la leucemia del simio gibón (GaLV), virus de la inmunodeficiencia del simio (SIV), virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) y combinaciones de los mismos (véanse, por ejemplo, Buchscheret al.(1992) J. Virol.66:2731-2739; Johannet al.(1992) J. Virol.

[0281] 66:1635-1640; Sommerfeltet al.(1990) Virol.1.76:58 -59; Wilsonet al.(1989) J. Virol.63:2374-2378; Milleret al.(1991) J. Virol.65:2220-2224; publicación de patente internacional n.º WO 1994/026877).

[0283] En aplicaciones en las que sea preferente la expresión transitoria, se pueden usar sistemas basados en adenovirus. Los vectores basados en adenovirus pueden proporcionar una eficacia de transducción muy alta en muchos tipos de células y no requieren división celular. Con dichos vectores se han obtenido altos valores y altos niveles de expresión. Este vector se puede producir en grandes cantidades en un sistema relativamente simple. También se usan vectores víricos adenoasociados ("AAV") para transducir células con ácidos nucleicos diana, por ejemplo, en la producciónin vitrode ácidos nucleicos y péptidos, y para procedimientos de genoterapiain vivoyex vivo(véanse, por ejemplo, Westet al.(1987) Virology 160:38-47; patente de EE. UU. n.º 4.797.368; publicación de patente internacional n.º WO 93/24641; Kotin (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Muzyczka (1994) J. Clin. Invest.94:1351. La construcción de vectores AAV recombinantes se describe en una serie de publicaciones, incluyendo la patente de EE. UU. n.º 5.173.414; Tratschinet al.(1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260; Tratschinet al.(1984) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081; Hermonat & Muzyczka (1984) PNAS 81:6466-6470; y Samulskiet al.(1989) J. Virol.63:03822-3828.

[0285] Actualmente están disponibles al menos seis enfoques de vectores víricos para transferencia génica en ensayos clínicos, que utilizan enfoques que implican complementación de vectores defectuosos por genes insertados en líneas celulares auxiliares para generar el agente transductor.

[0287] pLASN y MFG-S son ejemplos de vectores retrovíricos que se han usado en ensayos clínicos (Dunbaret al.(1995) Blood 85:3048-305; Kohnet al.(1995) Nat. Med.1:1017-102; Malechet al.(1997) PNAS 94(22):12133-12138). PA317/pLASN fue el primer vector terapéutico usado en un ensayo de genoterapia. (Blaeseet al.(1995) Science 270:475-480). Se han observado eficiencias de transducción de un 50 % o mayores para los vectores empaquetados MFG-S. (Ellemet al.(1997) Immunol Immunother.44(1):10-20; Dranoffet al.(1997) Hum. Gene Ther.1:111-2.

[0289] Los vectores víricos adenoasociados recombinantes (rAAV) son sistemas de administración de genes alternativos prometedores basados en el virus adenoasociado de tipo 2 de parvovirus defectuoso y no patógeno. Todos los vectores se derivan de un plásmido que conserva solo las repeticiones terminales invertidas de 145 pb de AAV que flanquean el casete de expresión del transgén. Una transferencia génica eficiente y una administración estable del transgén debido a la integración en los genomas de la célula transducida son rasgos característicos clave para este sistema de vector. (Wagneret al.(1998) Lancet 351(9117):1702-3, Kearnset al.(1996) Gene Ther.9:748-55). De acuerdo con la presente divulgación, también se pueden usar otros serotipos de AAV, incluyendo AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV 8.2, AAV9 y AAV rh10 y AAV pseudotipados tales como AAV2/8, AAV2/5, AAV2/9 y AAV2/6. De acuerdo con la presente invención, también se pueden usar serotipos de AAV novedosos que pueden atravesar la barrera hematoencefálica (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.º 9.585.971). En modos de realización preferentes, se usa un vector AAV9 (que incluye variantes y pseudotipos de AAV9).

[0291] Se pueden producir vectores adenovíricos (Ad) recombinantes con replicación deficiente a un alto valor e infectar fácilmente una serie de tipos de células diferentes. La mayoría de los vectores de adenovirus se genomanipulan de modo que un transgén reemplace los genes AdE1a,E1by/oE3; posteriormente, se propaga el vector con replicación deficiente en células 293 humanas que suministran la función génica delecionada entrans. Los vectores Ad pueden transducir múltiples tipos de tejidosin vivo, incluyendo células diferenciadas que no se dividen, tales como las que se encuentran en el hígado, el riñón y el músculo. Los vectores Ad convencionales tienen una gran capacidad de transporte. Un ejemplo del uso de un vector Ad en un ensayo clínico implicó la tratamiento con polinucleótidos para inmunización antitumoral con inyección intramuscular (Stermanet al.(1998) Hum. Gene Ther. 7:1083-9). Ejemplos adicionales del uso de vectores de adenovirus para transferencia génica en ensayos clínicos incluyen Roseneckeret al.(1996) Infection 24(1):5-10; Stermanet al.(1998) Hum. Gene Ther. 9(7):1083-1089; Welshet al.(1995) Hum. Gene Ther. 2:205-18; Alvarezet al.(1997) Hum. Gene Ther.5:597-613; Topfet al.(1998) Gene Ther.5:507-513; Stermanet al.(1998) Hum. Gene Ther.7:1083-1089.

[0293] Se usan células de empaquetamiento para formar partículas de virus que pueden infectar una célula huésped. Dichas células incluyen células 293, que empaquetan adenovirus, y células ψ2 o células PA317, que empaquetan retrovirus. Los vectores víricos usados en genoterapia se generan normalmente por una línea celular productora que empaqueta un vector de ácido nucleico en una partícula vírica. Típicamente, los vectores contienen las secuencias víricas mínimas requeridas para el empaquetamiento y la posterior integración en un huésped (si es aplicable), reemplazándose otras secuencias víricas por un casete de expresión que codifica la proteína que se va a expresar. Las funciones víricas que faltan se suministran entranspor la línea celular de empaquetamiento. Por ejemplo, los vectores AAV usados en genoterapia típicamente solo poseen secuencias de repeticiones terminales invertidas (ITR) del genoma de AAV que se requieren para el empaquetamiento y la integración en el genoma del huésped. El ADN vírico se empaqueta en una línea celular que contiene un plásmido auxiliar que codifica los otros genes de AAV, a saber,repycap, pero que carece de secuencias de ITR. La línea celular también se infecta con adenovirus como un auxiliar. El virus auxiliar promueve la replicación del vector AAV y la expresión de genes de AAV a partir del plásmido auxiliar. El plásmido auxiliar no se empaqueta en cantidades significativas debido a la carencia de secuencias de ITR. Se puede reducir la contaminación con adenovirus, por ejemplo, por tratamiento térmico al que el adenovirus es más sensible que el AAV.

[0295] En muchas aplicaciones de genoterapia, es deseable que el vector de genoterapia se administre con un alto grado de especificidad a un tipo de tejido particular. En consecuencia, se puede modificar un vector vírico para que tenga especificidad por un tipo de célula dado mediante la expresión de un ligando como una proteína de fusión con una proteína de la cubierta vírica en la superficie externa del virus. El ligando se elige para que tenga afinidad por un receptor que se sabe que está presente en el tipo de célula de interés. Por ejemplo, Hanet al.(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. usa 92:9747-9751, informaron de que el virus de la leucemia de ratón Moloney se puede modificar para expresar herregulina humana fusionada a gp70, y el virus recombinante infecta determinadas células de cáncer de mama humano que expresan el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano. Este principio se puede extender a otros pares virus-célula diana en los que la célula diana expresa un receptor y el virus expresa una proteína de fusión que comprende un ligando para el receptor de la superficie celular. Por ejemplo, se puede genomanipular un fago filamentoso para presentar fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, FAB o Fv) que tienen afinidad de unión específica por prácticamente cualquier receptor celular elegido. Aunque la descripción anterior se aplica principalmente a vectores víricos, se pueden aplicar los mismos principios a vectores no víricos. Dichos vectores se pueden genomanipular para que contengan secuencias de captación específicas que favorezcan la captación por células diana específicas.

[0297] Los vectores de genoterapia se pueden administrarin vivopor administración a un paciente individual, típicamente por administración sistémica (por ejemplo, infusión intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subdérmica, intratecal, suboccipital, intracerebroventricular o intracraneal, incluyendo inyección directa en el cerebro, incluyendo en cualquier región del cerebro tal como el hipocampo, corteza, cuerpo estriado, etc.) o aplicación tópica, como se describe a continuación. De forma alternativa, los vectores se pueden administrar a célulasex vivo, tales como células explantadas de un paciente individual (por ejemplo, linfocitos, aspirados de médula ósea, biopsia de tejido) o células madre hematopoyéticas de donante universal, seguido de reimplantación de las células en un paciente, normalmente después de la selección de las células que han incorporado el vector.

[0298] En determinados modos de realización, las composiciones como se describe en el presente documento (por ejemplo, polinucleótidos y/o proteínas) se administran directamentein vivo. Las composiciones (células, polinucleótidos y/o proteínas) se pueden administrar directamente en el sistema nervioso central (SNC), incluyendo, pero sin limitarse a, inyección directa en el cerebro o la médula espinal. Se pueden dirigir a una o más áreas del cerebro, incluyendo, pero sin limitarse a, el hipocampo, la sustancia negra, el núcleo basal de Meynert (NBM), el cuerpo estriado y/o la corteza. De forma alternativa o además de la administración al SNC, las composiciones se pueden administrar por vía sistémica (por ejemplo, infusión intravenosa, intraperitoneal, intracardíaca, intramuscular, subdérmica, intratecal, suboccipital, intracerebroventricular y/o intracraneal). Los procedimientos y composiciones para la administración de composiciones como se describe en el presente documento directamente a un sujeto (incluyendo directamente en el SNC) incluyen, pero no se limitan a, inyección directa (por ejemplo, inyección estereotáctica) por medio de ensamblajes de aguja. Dichos procedimientos se describen, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.º 7.837.668 y 8.092.429, relativas a la administración de composiciones (incluyendo vectores de expresión) al cerebro, y en la publicación de patente de EE. UU. n.º 2006/0239966.

[0300] La cantidad eficaz que se va a administrar variará de un paciente a otro y será de acuerdo con el modo de administración y el sitio de administración. En consecuencia, las cantidades eficaces se determinan mejor por el médico que administra las composiciones y las dosificaciones apropiadas se pueden determinar fácilmente por un experto en la técnica. Después de dejar suficiente tiempo para la integración y expresión (típicamente 4-15 días, por ejemplo), el análisis de los niveles séricos u otros niveles tisulares del polipéptido terapéutico y la comparación con el nivel inicial antes de la administración determinarán si la cantidad que se administra es demasiado baja, está dentro del intervalo correcto o es demasiado alta. Los regímenes adecuados para administraciones iniciales y posteriores también son variables, pero se caracterizan por una administración inicial seguida de administraciones posteriores si es necesario. Las administraciones posteriores se pueden administrar a intervalos variables, que varían desde diarias hasta anuales hasta cada varios años. En determinados modos de realización,

[0302] Para administrar ZFP usando vectores víricos adenoasociados (AAV) directamente al cerebro humano, se puede aplicar un intervalo de dosis de aproximadamente 1x10<10>-5x10<15>(o cualquier valor comprendido entre los mismos) del genoma del vector por cuerpo estriado. Como se indica, se pueden variar las dosificaciones para otras estructuras cerebrales y para diferentes protocolos de administración. En la técnica se conocen procedimientos de administración de vectores AAV directamente al cerebro. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.º 9.089.667; 9.050.299; 8.337.458; 8.309.355; 7.182.944; 6.953.575; y 6.309.634.

[0304] La transfección de célulasex vivopara diagnóstico, investigación o para genoterapia (por ejemplo, por medio de reinfusión de las células transfectadas en el organismo huésped) es bien conocida para los expertos en la técnica. En un modo de realización preferente, se aíslan las células del organismo en cuestión, se transfectan con al menos un modulador (por ejemplo, represor) de tau o un componente del mismo y se reinfundir al organismo en cuestión (por ejemplo, paciente). En un modo de realización preferente, se administran uno o más ácidos nucleicos del modulador (por ejemplo, represor) de tau usando AAV9. En otros modos de realización, se administran uno o más ácidos nucleicos del modulador (por ejemplo, represor) de tau como ARNm. También es preferente el uso de ARNm con caperuza para incrementar la eficiencia de la traducción y/o la estabilidad del ARNm. Son especialmente preferentes las caperuzas ARCA (análogo de caperuza anti-reverso) o variantes de las mismas. Véanse las patentes de EE. UU. n.º 7.074.596 y 8.153.773.

[0306] Son bien conocidos por los expertos en la técnica diversos tipos de células adecuados para transfecciónex vivo(véase, por ejemplo, Freshneyet al., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (3ª ed. 1994)) y las referencias citadas en el mismo para un análisis de cómo aislar y cultivar células de pacientes).

[0308] En un modo de realización, se usan las células madre en procedimientosex vivopara transfección celular y genoterapia. La ventaja de usar células madre es que se pueden diferenciar en otros tipos de célulasin vitro, o se pueden introducir en un mamífero (tal como el donante de las células) donde se injertarán en la médula ósea. Se conocen procedimientos para diferenciar células CD34+in vitroen tipos de células inmunitarias clínicamente importantes usando citocinas tales como GM-CSF, IFN-γ y TNF-α (véase Inabaet al.(1992) J. Exp. Med.176:1693-1702).

[0310] Las células madre se aíslan para transducción y diferenciación usando procedimientos conocidos. Por ejemplo, se aíslan células madre de células de médula ósea mediante selección por afinidad (panning) de las células de médula ósea con anticuerpos que se unen a células no deseadas, tales como CD4+ y CD8+ (linfocitos T), CD45+ (linfocitos panB), GR-1 (granulocitos) e Iad (células presentadoras de antígeno diferenciadas) (véase Inabaet al.(1992) J. Exp. Med.176:1693-1702).

[0312] En algunos modos de realización también se pueden usar células madre que se han modificado. Por ejemplo, se pueden usar células madre neuronales que se han hecho resistentes a la apoptosis como composiciones terapéuticas donde las células madre también contienen los ZFP-TF de la divulgación. La resistencia a la apoptosis se puede lograr, por ejemplo, inactivando BAX y/o BAK usando TALEN o ZFN específicas de BAX o BAK (véase la patente de EE. UU. n.º 8.597.912) en las células madre, o aquellas que están alteradas en una caspasa, usando de nuevo ZFN específicas de caspasa-6, por ejemplo. Estas células se pueden transfectar con los ZFP-TF o TALE-TF que son conocidos por regular un gentau.

[0313] También se pueden administrar vectores (por ejemplo, retrovirus, adenovirus, liposomas, etc.) que contienen ácidos nucleicos de ZFP terapéuticos directamente a un organismo para la transducción de célulasin vivo. De forma alternativa, se puede administrar ADN no marcado. La administración se realiza por cualquiera de las vías normalmente usadas para introducir una molécula en contacto esencial con células sanguíneas o tisulares, incluyendo, pero sin limitarse a, inyección, infusión, aplicación tópica y electroporación. Los procedimientos adecuados para administrar dichos ácidos nucleicos están disponibles y son bien conocidos por los expertos en la técnica y, aunque se puede usar más de una vía para administrar una composición particular, una vía particular a menudo puede proporcionar una reacción más inmediata y más eficaz que otra vía.

[0314] Se divulgan procedimientos para la introducción de ADN en células madre hematopoyéticas, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.º 5.928.638. Los vectores útiles para la introducción de transgenes en células madre hematopoyéticas, por ejemplo, células CD34<+>, incluyen adenovirus de tipo 35.

[0315] Los vectores adecuados para la introducción de transgenes en células inmunitarias (por ejemplo, linfocitos T) incluyen vectores de lentivirus no integrantes. Véanse, por ejemplo, Oryet al.(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388; Dullet al.(1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zufferyet al.(1998) J. Virol.72:9873-9880; Follenziet al.(2000) Nature Genetics 25:217-222.

[0316] Los vehículos farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se administra, así como por el procedimiento particular usado para administrar la composición. En consecuencia, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas disponibles, como se describe a continuación (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17.ª ed., 1989). Como se indica anteriormente, los procedimientos y composiciones divulgados se pueden usar en cualquier tipo de célula incluyendo, pero sin limitarse a, células procariotas, células fúngicas, células arqueales, células vegetales, células de insecto, células animales, células de vertebrado, células de mamífero y células humanas. Las líneas celulares adecuadas para la expresión de proteínas son conocidas por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, COS, CHO (por ejemplo, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (por ejemplo, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), perC6, células de insecto tales comoSpodoptera fugiperda(Sf) y células fúngicas tales comoSaccharomyces,PischiaySchizosaccharomyces. También se puede usar la progenie, variantes y derivados de estas líneas celulares. En un modo de realización preferente, los procedimientos y la composición se administran directamente a una célula cerebral, por ejemplo, en el cuerpo estriado.

[0317] Modelos de trastornos del SNC

[0318] Se pueden llevar a cabo estudios de trastornos del SNC en sistemas de modelos animales tales como primates no humanos (por ejemplo, enfermedad de Parkinson (Johnston y Fox (2015) Curr Top Behav Neurosci 22: 221-35); esclerosis lateral amiotrófica (Jacksonet al.(2015) J. Med. Primatol: 44(2):66-75), enfermedad de Huntington (Yanget al.(2008) Nature 453(7197):921-4); enfermedad de Alzheimer (Parket al.(2015) Int J Mol Sci 16(2):2386-402); convulsiones (Hsiaoet al.(2016) E Bio Med 9:257-77), perros (por ejemplo, MPS VII (Gurdaet al.(2016) Mol Ther 24(2):206-216); enfermedad de Alzheimer (Schuttet al.(2016) J Alzheimers Dis 52(2):433-49); convulsiones (Varatharajahet al.(2017) Int J Neural Syst 27(1):1650046) y ratones (por ejemplo, convulsiones (Kadiyalaet al.(2015) Epilepsy Res 109:183-96); enfermedad de Alzheimer (Liet al.(2015) J Alzheimers Park Disin 5(3): doi 10:4172/2161-0460), (revisión: Websteret al.(2014) Front Genet 5(99):1-23, doi:10.3389f/gene.2014.00088). Estos modelos se pueden usar incluso cuando no existe un modelo animal que recapitule completamente una enfermedad del SNC, ya que pueden ser útiles para investigar conjuntos de síntomas específicos de una enfermedad. Los modelos pueden ser útiles para determinar los perfiles de eficacia y seguridad de los procedimientos y composiciones terapéuticos (represores génicos) descritos en el presente documento.

[0319] Aplicaciones

[0320] Los moduladores de tau (por ejemplo, represores de tau) como se describe en el presente documento que comprenden moléculas de unión a MAPT (por ejemplo, ZFP, TALE, sistemas CRISPR/Cas, Ttago, etc.) como se describe en el presente documento, y los ácidos nucleicos que los codifican, se pueden usar para una variedad de aplicaciones. Estas aplicaciones incluyen procedimientos terapéuticos en los que se administra una molécula de unión a MAPT (que incluye un ácido nucleico que codifica una proteína de unión a ADN) a un sujeto usando un vector vírico (por ejemplo, AAV) o no vírico y se usa para modular la expresión de un gen diana dentro del sujeto. La modulación puede ser en forma de represión, por ejemplo, represión de la expresión de tau que está contribuyendo a un estado de enfermedad de EA. De forma alternativa, la modulación puede ser en forma de activación cuando la activación de la expresión o el incremento de la expresión de un gen celular endógeno puede mejorar un estado de enfermedad. Todavía en otros modos de realización, la modulación puede ser represión por medio de escisión (por ejemplo, por una o más nucleasas), por ejemplo, para inactivación de un genMAPT. Como se indica anteriormente, para dichas aplicaciones, las moléculas de unión a MAPT o, más típicamente, los ácidos nucleicos que las codifican, se formulan con un vehículo farmacéuticamente aceptable como una composición farmacéutica.

[0322] Las moléculas de unión a MAPT, o vectores que las codifican, solos o en combinación con otros componentes adecuados (por ejemplo, liposomas, nanopartículas u otros componentes conocidos en la técnica), se pueden preparar en formulaciones en aerosol (es decir, se pueden "nebulizar") para su administración por medio de inhalación. Las formulaciones en aerosol se pueden colocar en propelentes aceptables presurizados, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral , tales como, por ejemplo, por vías intravenosa, intramuscular, intradérmica y subcutánea, incluyen soluciones inyectables estériles acuosas y no acuosas isotónicas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor pretendido; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes. Las composiciones se pueden administrar, por ejemplo, por infusión intravenosa, por vía oral, por vía tópica, por vía intraperitoneal, por vía intravesical, por vía retroorbital (RO), por vía intracraneal (por ejemplo, a cualquier área del cerebro, incluyendo, pero sin limitarse a, el hipocampo y/o la corteza), por vía suboccipital o por vía intratecal. Las formulaciones de compuestos se pueden presentar en recipientes sellados de dosis unitaria o dosis múltiples, tales como ampollas y viales. Las soluciones inyectables se pueden preparar a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles de la clase descrita previamente.

[0324] La dosis administrada a un paciente debe ser suficiente para producir una respuesta terapéutica beneficiosa en el paciente a lo largo del tiempo. La dosis se determina por la eficacia y K<d>de la molécula de unión a MAPT particular empleada, la célula diana y la afección del paciente, así como el peso corporal o área de superficie del paciente al que se va a tratar. El tamaño de la dosis también se determina por la existencia, naturaleza y alcance de cualquier efecto secundario adverso que acompañe a la administración de un compuesto o vector particular en un paciente particular

[0326] Los siguientes ejemplos se refieren a modos de realización ejemplares de la presente divulgación en los que el modulador de MAPT comprende una proteína con dedos de cinc. Se apreciará que esto es solo con propósitos de ejemplificación y que se pueden usar otros moduladores (por ejemplo, represores) de MAPT, incluyendo, pero sin limitarse a, TALE-TF, un sistema CRISPR/Cas, ZFP adicionales, ZFN, TALEN, sistemas CRISPR/Cas adicionales, endonucleasas de asentamiento (meganucleasas) con dominios de unión a ADN genomanipulados. Será evidente que estos moduladores se pueden obtener fácilmente usando procedimientos conocidos por el experto en la técnica para unirse a los sitios diana como se ejemplifica a continuación. De forma similar, los siguientes ejemplos se refieren a modos de realización ejemplares en los que el vehículo de liberación es cualquier vector AAV, pero será evidente que se puede usar cualquier vehículo vírico (Ad, LV, etc.) o no vírico (plásmido, ARNm, etc.) para administrar los represores de tau descritos en el presente documento.

[0327] Ejemplos

[0328] Ejemplo 1: represión de MAPT in vivo

[0329] Se usaron proteínas con dedos de cinc específicas para los sitios diana de MAPT (tau) como se describe en la publicación de EE. UU. n.º 2018/0153921 como sigue:

[0330] Tabla 1: diseños específicos de MAPT

[0332]

[0334] Todas las ZFP descritas en la presente se enlazaron de forma funcional a un dominio de represión de KRAB para formar ZFP-TF y toda la expresión de MAPT reprimida.

[0335] Los ZFP-TF específicos de tau de primates se someten a prueba en macacos cangrejeros (M. fascicularis) para observar la represión de la expresión de tau en un primate (modelo de primate no humano (NHP)). Los macacos cangrejeros se alojan en jaulas de acero inoxidable equipadas con un sistema de abrevadero automático. El estudio cumple todas las secciones aplicables de la versión actual de las Normas Definitivas del Reglamento de la Ley de Bienestar Animal (Código de Reglamentos Federales, Título 9) y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, Instituto de Recursos de Animales de Laboratorio, Comisión de Ciencias de la Vida, Consejo Nacional de Investigación, 8.ª edición.

[0336] Los represores de ZFP-TF de la tabla 1 se clonaron en un vector AAV (AAV2/9 o variantes del mismo) con el promotor de SYN1 o el promotor de CMV, esencialmente como se describe en la publicación de EE. UU. n.º 20180153921. Los vectores AAV que se usaron incluyeron: un vector con un promotor de SYN1 que dirige la expresión de represores que comprenden 65918 y 57890 enlazados por un péptido T2A (SYN918-890); un vector con un promotor de CMV que dirige la expresión de represores que comprenden 65918 y 57890 enlazados por un péptido T2A (CMV918-890); un vector con un promotor de SYN1 que dirige la expresión de un represor que comprende 57930 (SYN930); un vector con un promotor de SYN 1 que dirige la expresión de un represor que comprende 57890 (SYN890); y un vector con un promotor de SYN1 que dirige la expresión de un represor que comprende 65918 (SYN918).

[0337] Se trató a quince sujetos NHP como se muestra en la tabla siguiente:

[0338] Tabla 2

[0341]

[0342]

[0344] En el experimento, se administran vectores AAV9 que comprenden un ZFP-TF dirigido por hSYN1 o CMV a 6E11 vg/hemisferio para el hemisferio izquierdo y 6E11 vg/hemisferio para el hemisferio derecho. Los animales recibieron una dosis individual del artículo de prueba a un volumen de 60 µl en el hemisferio izquierdo y una dosis individual de 60 µl en el hemisferio derecho. Para todos los artículos de prueba, la concentración de dosis fue de 1E13 vg/ml.

[0345] Después de 28 días, se sacrificó a los animales, y se extrajeron los cerebros y se colocaron en una matriz cerebral frontal en PBS enfriado con hielo. Se cortaron los cerebros a un grosor de corte frontal de 3 mm (dividido en aproximadamente 17 cortes). Algunos cortes cerebrales (hemisferio derecho e izquierdo) se almacenaron en formol tamponado neutra al 10 % para análisis histopatológicos y de hibridaciónin situ. Todos los demás cortes cerebrales (hemisferio derecho e izquierdo) se colocaron en RNAlater (Qiagen) y se refrigeraron durante aproximadamente 24 horas, después de lo cual se recogieron punzones de 2-3 mm de diámetro de acuerdo con un molde cerebral predefinido. Se procesaron los punzones para qRT-PCR y análisis de biodistribución. Adicionalmente, se recogió LCR para el análisis de proteína tau.

[0346] Se usaron cortes que comprendían las regiones del hipocampo y la corteza entorrinal para analizar los niveles de expresión de ARNm de tau, ZFP, marcadores de células gliales y neuronales y genes constitutivos por medio de qRT-PCR. Los resultados muestran que los ZFP-TF fueron administrados mediante AAV a la región del hipocampo, lo que da lugar a la reducción de la expresión de tau.

[0347] La FIG.1 y la FIG.2 muestran resultados ejemplares de represión de tau y niveles de ARNm de ZFP (copias/ng de ARNm) de los punzones del hipocampo 088 y 035 usando los vectores indicados en los sujetos indicados. La FIG. 3A a la FIG. 3C muestra los resultados de las muestras de punzón indicadas y tres procedimientos evaluados para establecer los niveles de tau de referencia para un punzón dado, incluyendo resultados sin ajuste a escala (gráficas superiores), ajuste a escala para el promedio de los tres animales tratados con vehículo (gráficas centrales) o ajuste a escala para la expresión de tau promedio de los animales tratados con vehículo y los animales tratados con ZFP sin expresión de ZFP detectable (gráficas inferiores). Como se muestra, el ajuste a escala por cualquiera de los procedimientos se aproxima mejor a los niveles de referencia en los 15 animales, siendo el tercer procedimiento (ajuste a escala para NHP sin expresión de ZFP) un representante algo mejor del valor de referencia de tau en los 15 animales del estudio en algunos casos (por ejemplo, punzón 037).

[0348] La FIG. 4 muestra la modulación de tau y los niveles de ZFP en el sujeto NHP07, al que se trató con AAV CMV918-890. Para este análisis, la expresión de tau normalizada se ajustó a escala para el promedio de los niveles de tau medidos en animales tratados con vehículo y animales tratados con ZFP sin expresión de ZFP detectable para cada punzón. A continuación, se extrajeron datos de cada punzón para NHP07 y se agruparon de acuerdo con la sección del cerebro analizada. Como se muestra, NHP07 mostró represión de tau en determinadas muestras de cerebro.

[0349] La FIG.5A y la FIG.5B muestran una comparación de una expresión de tau y niveles de ZFP en un sujeto de control (vehículo, NHP01) y un sujeto tratado con AAV SYN918-890 (NHP04) y la FIG. 5C muestra los resultados de RMN del corte 7. Para este análisis, la expresión de tau normalizada se ajustó a escala para el promedio de los niveles de tau medidos en animales tratados con vehículo y animales tratados con ZFP sin expresión de ZFP detectable para cada punzón.

[0350] Como se muestra, el NHP tratado con vehículo no tuvo reducción de tau ni expresión de ZFP detectables. Por el contrario, NHP04 mostró una expresión de ZFP detectable en el corte 7 en el hemisferio derecho, que también se correlacionó con dos punciones del hipocampo medial. Se observó una incrementada cobertura de ZFP y reducción de tau para las secciones 8 y 9 en el hemisferio derecho, lo que se correlacionó bien con los datos de RMN de esos niveles del cerebro.

[0351] La FIG.6A a la FIG.6O muestran resultados de expresión de tau y niveles de ZFP en sujetos de control (FIG.

[0352] 6A a FIG.6C; NHP01, NHP02, NHP03); sujetos tratados con AAV SYN1.918-890 (FIG.6D a FIG.6F; NHP04, NHP05, NHP06); sujetos tratados con AAV CMV.918-890 (FIG.6G a FIG.6J; NHP07, NHP08); sujetos tratados con AAV SYN1.930 (FIG. 6G a FIG. 6J; NHP09, NHP10); sujetos tratados con AAV SYN1.890 (FIG.6K a FIG.

[0353] 6M; NHP11, NHP12, NHP13); y sujetos tratados con SYN1.918 (FIG.6N y FIG.6O; NHP14; NHP15).

[0355] La FIG.7A a FIG.7F muestran un análisis compuesto para todos los punzones en todos los animales evaluando tres procedimientos para establecer los niveles de tau de referencia para un punzón dado, incluyendo resultados sin ajuste a escala (FIG.7A y FIG.7D), ajuste a escala para el promedio de los tres animales tratados con vehículo (FIG.7B y FIG.7E), o ajuste a escala para la expresión de tau promedio de los animales tratados con vehículo y los animales tratados con ZFP sin expresión de ZFP (FIG.7C y FIG.7F). Se muestran resultados de los sujetos indicados (sujetos NHP tratados con vehículo mostrados en la FIG.7A a la FIG.7C) y todos los sujetos tratados con AAV (FIG. 7D a FIG. 7F). Como se muestra, el ajuste a escala por cualquiera de los procedimientos se aproxima mejor a los niveles de referencia en los 15 animales, siendo el tercer procedimiento (ajuste a escala para NHP tratados con vehículo y tratados con ZFP sin expresión de ZFP) un representante algo mejor del valor de referencia de tau en los 3 animales tratados con vehículo y los 12 tratados con ZFP en el estudio.

[0357] Para este análisis, la expresión de tau normalizada se ajustó a escala para el promedio de los niveles de tau medidos en animales tratados con vehículo y animales tratados con ZFP sin expresión de ZFP detectable para cada punzón. La FIG.8A a la FIG.8D muestran resultados de los sujetos indicados (sujetos NHP tratados con vehículo mostrados en la FIG. 8A y FIG. 8B) y todos los sujetos tratados con AAV (FIG. 8C y FIG. 8D), tanto para los niveles de expresión de tau ajustados a escala (FIG. 8A y FIG. 8C) como para los niveles absolutos de transcritos de ZFP (copias/ng de ARNm). La FIG.9A y la FIG.9B muestran resultados de expresión de tau de los hemisferios izquierdo y derecho de los sujetos indicados. La FIG. 10A a la FIG. 10F y la FIG. 11A a la FIG. 11D muestran resultados de los animales indicados, donde estaban presentes menos de 1E4 transcritos de ZFP (FIG.10A y FIG.10B, FIG.11B); entre 1E4 y 1E5 transcritos de ZFP (FIG.10C y FIG.10D, FIG.11C); donde estaban presentes más de 1E5 transcritos de ZFP (FIG. 10E y FIG. 10F, FIG. 11D) y para todos los niveles de transcritos de ZFP (FIG.11A). Como se muestra, la gran mayoría de los punzones con bajos niveles de expresión de ZFP no tienen una reducción de tau significativa. Sin embargo, los punzones entre 1E4 y 1E5 transcritos de ZFP/ng de ARNm tienen una reducción de tau intermedia para algunos tratamientos, y aquellos con 1E5 o más transcritos/ng de ARNm tienen una reducción de tau incluso mayor.

[0359] La FIG. 13A a la FIG. 13E, la FIG. 15A a la FIG. 15E y la FIG. 17A a la FIG. 17E muestran el porcentaje de expresión de tau normalizada en función de los niveles de ZFP (transcritos/ng de ARNm) en sujetos tratados como se indica. La FIG. 13A a la FIG. 13E muestran resultados donde la expresión de tau se ajusta a escala para el promedio de los animales tratados con vehículo y los animales tratados con ZFP sin expresión de ZFP detectable; la FIG.15A a la FIG.15E muestran resultados donde la expresión de tau se ajusta a escala para el promedio de los animales tratados solo con vehículo; y la FIG. 17A a la FIG. 17E muestran resultados donde la expresión de tau no se ajustó a escala para ajustar a un nivel de tau de referencia. Independientemente del procedimiento de ajuste a escala, los datos indican que existe una correlación significativa entre el nivel de expresión de ZFP y la reducción de tau para 4 de los 5 tratamientos con ZFP, a saber, AAV SYN1.65918-57890, AAV CMV. 65918-57890, AAV SYN1.57890, AAV SYN1.65918. El mayor grado de reducción de tau se logró con los tratamientos AAV SYN1.65918-57890 y AAV CMV.65918-57890, con algunos punzones superando >80 % de reducción de tau.

[0361] La FIG.12, la FIG.14 y la FIG.16 muestran gráficos de correlación de expresión de tau frente al nivel de ZFP para sujetos NHP tratados con vehículo (panel izquierdo) o vectores AAV que codifican los represores ZFP-TF 57890 y 65918, cuya expresión está dirigida por el promotor de sinapsina 1 (panel derecho). El límite del ensayo de qRT-PCR de ZFP para la cuantificación absoluta es de aproximadamente 1E2 transcritos/ng de ARNm, que se indica como por debajo del límite de cuantificación (DLdC). La FIG.12 muestra resultados donde la expresión de tau se ajusta a escala para el promedio de los animales tratados con vehículo y los animales tratados con ZFP sin expresión de ZFP detectable. La FIG.14 muestra un análisis donde los niveles de expresión de tau se ajustan a escala para el promedio de los tres animales tratados con vehículo. La FIG. 16 muestra un análisis donde los niveles de expresión de tau no se ajustaron a escala para corregir los niveles de referencia de tau. Como se muestra, la represión de tau se correlacionó con la cantidad de ZFP-TF presente.

[0363] Ejemplo 2: represión de tau en modelo de ratón Tau humanizado

[0365] También se evaluó la reducción de tau en el modelo de ratón transgénico tau humano mutante P301L (P301L) de tauopatía (rTg4510, Jackson Labs) y el modelo de ratón hTau (B6.Cg-Mapt<tm1(EGFP)Klt>Tg(MAPT)8cPdav/J, Jackson Labs) después de la administración de represores génicos como se describe en el presente documento. Los ratones hTau expresan el genMAPThumano WT y, además, el genMaptendógeno (de ratón) inactivado y reemplazado con una construcción que expresa GFP. Los grupos de tratamiento fueron como se muestra en la tabla siguiente:

[0366]

[0369] Los criterios de valoración fueron como sigue: niveles de expresión de ARNm de ZFP y Tau por RT-qPCR; niveles de expresión de ARNm de GFAP, Iba1, NeuN por RT-qPCR; niveles de expresión de ARNm de Saitohin (STH) por RT-qPCR (STH es un gen que codifica proteínas en simios y humanos que está anidado en el intrón entre los exones 9 y 10 del gentauhumano, véase, por ejemplo, Conradet al.(2002) Proc Natl Acad Sci USA 99(11): 7751-7756.); y niveles de proteína tau.

[0371] Como se muestra en la FIG. 18A a la FIG. 18D, el emparejamiento sinérgico de 57890 y 65918 (AAV9.hSYN.65918-T2a-57890) dio como resultado niveles de expresión de ZFP que eran al menos 2 veces mayores que los de 57890 (AAV9.hSY1.57890) solo. Véase la FIG.18A. Además, en ratones tau humanizados a los que se administró la construcción que codifica 57890 y 65918, el ARNm de tau humana se reprimió en aproximadamente un 90 % de represión en comparación con ~60 % de represión en ratones a los que se administró la construcción que codifica solo 57890 (la expresión de ARNm de tau de ratón se reprimió en un ~87 % por la combinación de 57890 y 65918 y en un ~81 % por 57890). Véase la FIG. 18B. Se obtuvieron resultados similares después del análisis por RT-qPCR de Saitohin humana (hSTH), con una represión por la combinación sinérgica de 57890 y 65918 de un ~88 % en comparación con un ~68 % usando 57890 solo. Véase la FIG.18C. Los niveles de IBA1 y GFAP eran elevados en ambos grupos de tratamiento en comparación con el control, pero los niveles de NeuN no fueron significativamente diferentes entre los grupos. Véase la FIG.

[0372] 18D.

[0374] Además, se evalúa adicionalmente la eficacia clínica y terapéutica de los represores en este y otros modelos de ratón de EA (por ejemplo, APPswe/PS1d9, Jackson Labs) para determinar si existe una reducción de los biomarcadores y los síntomas de tauopatías, incluyendo uno o más de los siguientes: análisis por hibridaciónin situRNAscope (análisis de células individuales de ZFP, tau humana y tau de ratón, véase, por ejemplo, Carstenset al.(2016) J Neurosci. 36(23):6312-6320); análisis inmunohistoquímico de ZFP/tau (véase, por ejemplo, Zeitleret al.(2019) Nature Medicine 25:1131-1142); neurotoxicidad, gliosis, neuritas distróficas, pérdida de espinas dendríticas, excitotoxicidad, contracción cortical e hipocampal, acumulación de tau dendrítica, déficits cognitivos (por ejemplo, el laberinto del brazo radial y el laberinto acuático de Morris, acondicionamiento del miedo, etc.) y motores. Véase, por ejemplo, Bryanet al., (2009) capítulo 1: Transgenic Mouse Models of Alzheimer’s Disease: Behavioral Testing and Considerations in Methods of Behavior Analysis in Neuroscience.2.ª edición, ed. Buccafusco, Boca Raton (FL): CRC Press/Taylor & Francis. Además, también se evalúan modelos de convulsiones inducidas químicamente, por ejemplo, ratones normales tratados con compuestos excitotóxicos tales como pentilentetrazol (PTZ, véase, por ejemplo, Myerset al.(1975) Epilepsia 16(2):257-67) o cainato (Ferraroet al.(1997) Mamm Genome 8:200-208, 4-8 semanas después de la administración de represores génicos como se describe en el presente documento para determinar si la reducción de tau confiere un efecto protector contra las convulsiones, incluyendo mortalidad relacionada con convulsiones, latencia prolongada a las convulsiones y/o la reducción de la gravedad de las convulsiones.

[0375] Ejemplo 3: respuestas neuroinflamatorias

[0377] También se evaluaron primates tratadosin vivocon ZFP-TF represores de MAPT para determinar los niveles de expresión de marcadores microgliales y astrocíticos. En particular, se evaluaron punzones como se describe en el ejemplo 1 usando reactivos de RT-qPCR para la expresión de IBA1 y GFAP. Además, también se evaluaron los niveles del gen constitutivoE1F4Aen primates tratados. En resumen, se transfirieron punzones cerebrales a tubos Eppendorf de 1,5 ml que contenían 0,6 ml de reactivo TRI (Thermo Fisher) y dos microesferas de acero de 3,2 mm (BioSpec Products) en hielo.

[0379] Se lisó el tejido usando un Qiagen TissueLyser a 4 °C usando los siguientes parámetros: 5 ciclos, duración de 90 s, frecuencia de 25,1. Después de una breve centrifugación, se añadieron 70 µl de 1-bromo-3-cloropropano a cada muestra a TA. Se agitaron en vórtex las muestras durante 10 s, se centrifugaron a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C, y se transfirieron 120 µl de la fase acuosa de cada muestra a pocillos de una placa de 96 pocillos. Se añadieron sesenta microlitros de alcohol isopropílico y 12 µl de microesferas magnéticas MagMax (Thermo Scientific) a cada pocillo de muestra que contenía las muestras de fase acuosa. Se usaron un robot Kingfisher 96 (Thermo Scientific) y el kit MagMax (Thermo Fisher) para aislar PNA del lisado tisular siguiendo las instrucciones del fabricante. Se separaron cien microlitros del ARN eluido de las microesferas magnéticas usando un soporte magnético.

[0380] Se evaluaron el rendimiento y la calidad de ARN usando un instrumento Nanodrop 8000 (Thermo Scientific). Se preparó ADNc usando el High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems), con 10 µl de ARN y 10 µl de RT Master Mix (tampón RT 10x, cebador aleatorio 10x, mezcla de dNTP 25x, enzima Multiscribe y agua sin RNasa) para todas las muestras. Se realizó la retrotranscripción en un termociclador C1000 Touch de Biorad usando el siguiente programa: 25 °C durante 10 min, 37 °C durante 120 min, 85 °C durante 5 min y se mantuvo a 4 °C. Se realizó la qRT-PCR usando termocicladores Biorad CFX384. Se diluyó el ADNc 1:10 en agua sin nucleasas y se añadieron 4 µl de ADNc diluido a cada reacción de PCR de 10 µl. Cada muestra se sometió a ensayo por cuadruplicado técnico. En este estudio se usaron ensayos personalizados de cebador:sonda Taqman. Se usó la mezcla maestra 2x Fast Multiplex PCR (Qiagen) para el ensayo triple taw/EIF4a2/ATP5b, y se usó SsoAdvanced Universal Probes Supermix (Biorad) para los otros ensayos. Las condiciones de ciclado de qPCR fueron como sigue: mezcla maestra Qiagen Fast Multiplex → 95 °C durante 5 min, 95 °C durante 45 s, 60 °C durante 45 s, lectura de placas, 40 ciclos; mezcla maestra Biorad SsoAdvanced → 95 °C durante 90 s, 95 °C durante 12 s, 60 °C durante 40 s, lectura de placas, 42 ciclos.

[0381] Como se muestra en la FIG.19A a la FIG.19K, el análisis de IBA1 y GFAP no mostró una elevación dependiente de ZFP en los niveles de marcadores microgliales o astrocíticos en ninguno de los primates tratados con construcciones AAV, incluyendo el promotor de sinapsina. Sin embargo, los primates tratados con construcción AAV que incluye el promotor de CMV mostraron niveles elevados de marcadores astrocíticos. Por tanto, no se observaron respuestas neuroinflamatorias dependientes de ZFP cuando se administraron a los primates construcciones que comprendían el promotor de sinapsina específico neuronal.

[0382] Además, como se muestra en la FIG. 20A a la FIG. 20D, no se observó ningún efecto global importante para IBA1 (FIG.19A a FIG.19F) o GFAP (FIG.19G a FIG.19K) para ningún grupo de tratamiento.

[0383] Además, como se muestra en la FIG. 21A a la FIG. 21E, no existió correlación entre los niveles de un gen constitutivo (EIF4A2) y la expresión de ZFP en primates tratados con represores de MAPT ZFP. Cualquier toxicidad debida a la expresión de ZFP o a la reducción de tau iría acompañada de una disminución en los niveles deEIF4A2a medida que incrementan los niveles de ZFP.

[0384] Por tanto, los represores de tau sinérgicos como se describe en el presente documento reprimen tau eficazmente (hasta un 90 % o más en comparación con los controles)in vivosin provocar respuestas neuroinflamatorias.

[0385] Ejemplo 4: niveles de proteína tau

[0386] También se analizan los niveles de proteína tau en células y sujetos que reciben los represores descritos en el presente documento.

[0387] En resumen, se administraron neuronas (derivadas de células madre pluripotentes inducidas) mediante vectores AAV como se describe anteriormente y se evaluaron los niveles de proteína tau en las células o punzones tomados de los sujetos tratados mediante ELISA usando técnicas estándar. En resumen, se administraron neuronas derivadas de CMPi humanas por medio de vectores AAV6 que codifican ZFP individuales o de la combinación sinérgica 65918/57890 a una dosis de 1E5 VG por célula (n= 4 réplicas). Se cultivaron las células durante 32 días y se evaluaron para determinar los niveles de proteína tau mediante ELISA usando técnicas estándar.

[0388] Como se muestra en la figura 22, la proporción de tau con respecto a proteína total en neuronas derivadas de CMPi humanas se redujo significativamente en células tratadas con represores de tau como se describe en el presente documento. En particular, el represor 57930 solo redujo la expresión de proteína tau en más de 5 veces en comparación con el control; el represor 57890 solo redujo la expresión de proteína tau en 2 veces; el represor 65918 solo redujo la expresión de tau en más de 2 veces; y la combinación sinérgica 65918-57890 redujo la expresión de proteína tau en más de 10 veces en comparación con el control. También se evaluaron los niveles de proteína tau en homogeneizados de LCR y/o cerebro de modelos de ratones tau humanizados tratados como se describe en el ejemplo 2 anterior usando ELISA estándar (Thermo). Se observó una reducción de un 50 % de la proteína tau humana a las 6 semanas con el par sinérgico 65918-57890 en comparación con el control (vehículo). El par 65918-57890 también redujo los niveles de proteína tau humana en comparación con los animales a los que se les administró 57890 solo. Además, los niveles de proteína tau se reducen aún más en puntos temporales posteriores en animales, incluyendo 8-12 semanas o más después del tratamiento. Por tanto, los represores de tau como se describe en el presente documento reducen los niveles de proteína tauin vitroein vivo.

[0389] Los estudios demuestran que los reactivos ZFP-TF tau reprimen la expresión de tau (incluyendo a niveles terapéuticos) en un cerebro de primate.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

1. Una composición para su uso en un procedimiento para la prevención y/o tratamiento de tauopatía en un sujeto que lo necesita, comprendiendo la composición un primer y un segundo factores de transcripción de proteínas con dedos de cinc (ZFP-TF) artificiales que reprimen la expresión deMAPT, en la que el primer ZFP-TF se une a los nucleótidos en mayúscula en (SEQ ID NO:1) y el segundo ZFP-TF se une a los nucleótidos en mayúscula en que

(a) el dominio de unión a ADN del primer ZFP-TF comprende seis regiones de dedos de cinc F1 a F6 que comprenden las SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 5 y 7, respectivamente; y

(b) el dominio de unión a ADN del segundo ZFP-TF comprende seis regiones de dedos de cinc F1 a F6 que comprenden (i) las SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12 y 13, respectivamente, y (ii) una sustitución de R a Q en la posición -5 de F1 y F5.

2. Una composición para su uso en un procedimiento para la prevención y/o tratamiento de tauopatía en un sujeto que lo necesita, comprendiendo la composición un primer y un segundo factores de transcripción de proteínas con dedos de cinc (ZFP-TF) artificiales que reprimen la expresión deMAPT, en la que el primer ZFP-TF se une a los nucleótidos en mayúscula en (SEQ ID NO:1) y el segundo ZFP-TF se une a los nucleótidos en mayúscula en que

(a) el dominio de unión a ADN del primer ZFP-TF comprende seis regiones de dedos de cinc F1 a F6 que comprenden las SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 5 y 7, respectivamente; y

(b) el dominio de unión a ADN del segundo ZFP-TF comprende seis regiones de dedos de cinc F1 a F6 que comprenden las SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13, respectivamente.

3. La composición para su uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que los primer y segundo ZFP-TF se codifican por polinucleótidos transportados por uno o más vectores víricos.

4. La composición para su uso de la reivindicación 3, en la que los uno o más vectores víricos son vectores AAV.

5. La composición para su uso de la reivindicación 4, en la que un vector AAV comprende los polinucleótidos que codifican los primer y segundo ZFP-TF.

6. La composición para su uso de la reivindicación 5, en la que el vector AAV es un vector AAV9.

7. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en la que los uno o más vectores víricos o AAV comprenden un promotor de CMV o sinapsina (SYN).

8. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la composición previene y/o trata la enfermedad de Alzheimer (EA), demencia frontotemporal, parálisis supranuclear progresiva, traumatismo craneoencefálico (TCE), trastornos convulsivos y/o degeneración corticobasal.

9. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el procedimiento comprende administrar la composición que comprende los primer y segundo ZFP-TF al SNC del sujeto usando uno o más vectores AAV que comprenden uno o más polinucleótidos que codifican los primer y segundo ZFP-TF.

10. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en la que el procedimiento comprende administrar el vector AAV por vía intravenosa o al SNC, opcionalmente en la que el procedimiento comprende administrar el vector AAV en el cuerpo estriado o hipocampo en uno o ambos hemisferios del cerebro del sujeto.

11. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la expresión de los primer y segundo ZFP-TF de la composición reduce la expresión del genMAPTy/o los niveles de tau en el cerebro del sujeto primate en un 50 % o más, opcionalmente un 70 % o más y hasta un 99 % en comparación con los sujetos no tratados.

12. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que los factores de transcripción artificiales de la composición se transportan por uno o más vectores AAV que comprenden un promotor de CMV o SYN a entre de 1E10 a 6E11 genomas de vector rAAV por hemisferio.