ES3048210T3 - Antibodies binding to citrullinated histone 2a and/or 4 - Google Patents

Abstract

La invención proporciona anticuerpos o sus fragmentos de unión dirigidos contra epítopos que contienen citrulina. Los anticuerpos o sus fragmentos de unión de la invención pueden utilizarse en terapia, por ejemplo, en el tratamiento o la prevención de patologías asociadas a la Trampa Extracelular de Neutrófilos (TNE). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0003] Anticuerpos que se unen a histona citrulinada 2A y/o 4

[0005] Campo de la invención

[0007] La invención proporciona anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos dirigidos contra epítopos que contienen citrulina. Los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos de la invención pueden usarse en terapia, por ejemplo, en el tratamiento o la prevención de patologías asociadas a la T rampa extracelular de neutrófilos (NET, por sus siglas en inglés). Los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos de la invención pueden usarse en el tratamiento o la prevención de patologías asociadas a NET tales como lupus eritematoso sistémico (LES), lupus, septicemia, vasculitis, artritis inflamatoria, artritis reumatoide y osteoartritis, psoriasis, enfermedad de Alzheimer, hepatitis autoinmunitaria, artritis idiopática juvenil, enfermedad de Sjogren, síndrome antifosfolipídico, enfermedad de Bechet, espondilitis, espondiloartropatía, atrofia de múltiples sistemas, enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy, asma, asma alérgica exacerbada por rinovirus, asma alérgica, fibrosis quística, fibrosis y fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad del ojo seco, uveítis, uveítis no granulomatosa, uveítis granulomatosa, dermatitis, dermatitis atópica, EPOC, bronquitis u otras patologías asociadas a NET tales como cicatrización de heridas en diabetes, cáncer, metástasis de cáncer y salud de los órganos trasplantadosin vivooex vivo.La invención también proporciona composiciones farmacéuticas y métodos para tratar o impedir patologías asociadas a NET, tales como LES, lupus, septicemia, vasculitis, artritis inflamatoria, artritis reumatoide y osteoartritis, psoriasis, enfermedad de Alzheimer, hepatitis autoinmunitaria, artritis idiopática juvenil, enfermedad de Sjogren, síndrome antifosfolipídico, enfermedad de Bechet, espondilitis, espondiloartropatía, atrofia de múltiples sistemas, enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy, asma, asma alérgica exacerbada por rinovirus, asma alérgica, fibrosis quística, fibrosis y fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad del ojo seco, uveítis, uveítis no granulomatosa, uveítis granulomatosa, dermatitis, dermatitis atópica, EPOC, bronquitis u otras patologías asociadas a NET tales como cicatrización de heridas en diabetes, cáncer, metástasis de cáncer y salud de los órganos trasplantadosin vivooex vivo.

[0009] Antecedentes de la invención

[0011] Las afecciones inflamatorias, ya sean de naturaleza crónica o aguda, representan un problema sustancial en el sector sanitario. Brevemente, la inflamación crónica se considera una inflamación de duración prolongada (semanas o meses) en la que se producen simultáneamente inflamación activa, destrucción de tejido e intentos de curación. Aunque la inflamación crónica puede seguir a un episodio inflamatorio agudo, también puede comenzar como un proceso insidioso que progresa con el tiempo, por ejemplo, como resultado de una infección persistente (por ejemplo, tuberculosis, sífilis, infección fúngica) que provoca una reacción de hipersensibilidad retardada, exposición prolongada a toxinas endógenas (por ejemplo, lípidos plasmáticos elevados) o exógenas (por ejemplo, sílice, amianto, alquitrán de cigarrillos, suturas quirúrgicas), o reacciones autoinmunitarias contra los propios tejidos del cuerpo (por ejemplo, artritis reumatoide o lupus eritematoso sistémico, vasculitis, esclerosis múltiple, psoriasis).

[0013] Una consecuencia de la inflamación es la formación de Trampas extracelulares de neutrófilos (NET). También se sabe que las NET provocan inflamación. Las NET son estructuras que comprenden ADN e histonas producidas por los neutrófilos como parte del mecanismo de defensa del hospedador contra patógenos. Pueden atrapar y matar diversos patógenos bacterianos, fúngicos, víricos y protozoarios, y su liberación es una de las primeras líneas de defensa contra patógenos. Después de la activación por microorganismos o citocinas, las histonas se hipercitrulinan y el núcleo de los neutrófilos experimenta un proceso de descondensación de la cromatina que conduce a la formación de NET por NETosis, una forma de muerte celular de los neutrófilos.

[0015] Las NET desempeñan una función patológica en una diversidad de enfermedades, por ejemplo, provocando una inflamación aberrante. Por lo tanto, las NET están implicadas en la patología de una diversidad de afecciones inflamatorias, tales como lupus eritematoso sistémico (LES), lupus, septicemia, vasculitis, artritis inflamatoria, artritis reumatoide y osteoartritis, psoriasis, enfermedad de Alzheimer, hepatitis autoinmunitaria, artritis idiopática juvenil, enfermedad de Bechet, espondilitis, espondiloartropatía, atrofia de múltiples sistemas, enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy, asma, asma alérgica exacerbada por rinovirus, fibrosis quística y fibrosis pulmonar idiopática.

[0017] Por ejemplo, las NET pueden provocar la exposición de autoantígenos al espacio extracelular y la posterior producción de autoanticuerpos patológicos por parte del sujeto. Además, las NET y los restos de NET albergan histonas tóxicas, que inducen daño vascular y posterior daño y fallo orgánico. Por lo tanto, en dichas enfermedades, interferir en la formación de NET e inducir el aclaramiento de NET y restos de NET de la circulación y los tejidos, tendrían beneficios terapéuticos.

[0019] También se reconoce cada vez más que los neutrófilos son un elemento importante en la progresión tumoral. Se ha demostrado que ejercen efectos importantes en casi todas las fases de la progresión tumoral, y varios estudios demuestran que su presencia es fundamental para el desarrollo tumoral. Los estudios también han implicado a las NET como facilitadoras de la progresión tumoral y la metástasis. También se ha demostrado que los neutrófilos, a través de la generación de NET, proporcionan un armazón y un estímulo para la adhesión plaquetaria, la formación de trombos y la coagulación en tumores.

[0020] Además, se ha implicado a las NET en la reducción de la salud de los órganos después de un trasplante. Las NET contribuyen a la disfunción primaria del injerto, contribuyendo a la mortalidad precoz después del trasplante de pulmón. Se ha demostrado que las NET desempeñan una función patogénica en el trasplante de órganos sólidos.

[0021] Por lo tanto, identificar agentes terapéuticos que puedan bloquear la formación de NET, aclarar NET y/o impedir la NETosis tendría beneficios clínicos en enfermedades inflamatorias tales como artritis inflamatoria, artritis reumatoide y osteoartritis, y otras patologías asociadas a NET, tales como lupus eritematoso sistémico (LES), lupus, septicemia, vasculitis, psoriasis, enfermedad de Alzheimer, hepatitis autoinmunitaria, artritis idiopática juvenil, enfermedad de Sjogren, síndrome antifosfolipídico, enfermedad de Bechet, espondilitis, espondiloartropatía, atrofia de múltiples sistemas, enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy, asma, asma alérgica exacerbada por rinovirus, asma alérgica, fibrosis quística, fibrosis y fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad del ojo seco, uveítis, uveítis no granulomatosa, uveítis granulomatosa, dermatitis, dermatitis atópica, EPOC, bronquitis, cicatrización de heridas en diabetes, cáncer, metástasis de cáncer y salud de los órganos trasplantadosin vivooex vivo.

[0022] Sigue habiendo necesidad de compuestos para el tratamiento o la prevención de las patologías asociadas a NET. Se describen anticuerpos que se unen a epítopos citrulinados en la histona 2A y la histona 4 humanas desiminadas en los documentos WO2009147201, WO2011070172 y WO2016092082. Pauthneret al.:(Antibody engineering & therapeutics, reunión anual de la sociedad de anticuerpos del 7 al 10 de diciembre de 2015, San Diego, CA, EE. UU.; mAbs, vol. 8, N.°. 3, 24 de febrero de 2016 (24-02-2016), páginas 617-652) informa del uso de anticuerpos IgG1 humanizados que se unen al extremo N de las histonas citrulinadas 2A y H4, para inhibir la liberación perjudicial de NET en un modelo en ratón de AR.

[0023] Sumario de la invención

[0024] Los presentes inventores han creado anticuerpos mejorados que se unen a epítopos citrulinados en el extremo amino de las histonas 2A y/o la histona 4. Estos anticuerpos pueden usarse para tratar enfermedades o patologías asociadas a la citrulinación, tales como patologías asociadas a NET y afecciones inflamatorias.

[0025] Los presentes inventores han creado anticuerpos que muestran propiedades mejoradas con respecto a los anticuerpos terapéuticos divulgados en los documentos WO2009147201, WO2011070172 y WO2016092082. Los inventores descubrieron, mediante ensayos de estabilidad acelerada y análisis por espectrometría de masas, que la isomerización de determinados restos de aminoácidos en la Región Determinante de la Complementariedad 1 (CDR1) de la cadena ligera de los anticuerpos divulgados en los documentos WO2009147201, WO2011070172 y WO2016092082 dio como resultado una reducción de la afinidad de unión de los anticuerpos para los péptidos derivados de histonas sometidos a ensayo a lo largo del tiempo. Después, los inventores realizaron un análisis exhaustivo de los mutantes de la cadena ligera de CDR1 para resolver el problema de la isomerización, intentando conservar al mismo tiempo las propiedades de unión del anticuerpo. Varios intentos dieron como resultado anticuerpos con una afinidad de unión reducida para los péptidos diana.

[0026] Por último, los inventores lograron identificar un grupo de mutaciones en la CDR1 de la cadena ligera que eliminaron el problema de la isomerización, manteniendo al mismo tiempo las propiedades de unión del anticuerpo original. Sorprendentemente, los anticuerpos mutantes mostraron una mejora con respecto a los anticuerpos originales tantoin vitrocomoin vivo.

[0027] Por lo tanto, la presente invención proporciona:

[0028] - Un anticuerpo o fragmento de unión del mismo que se une específicamente a un epítopo citrulinado en la histona 2A y/o la histona 4 humanas desiminadas, en donde el anticuerpo o fragmento de unión del mismo comprende: a) la CDR 1 de VL de la SEQ ID NO: 9 (QSLLDADGKTY); y

[0029] b) la CDR 1 de VH de la SEQ ID NO: 1 (GYTFTNYG), la CDR 2 de VH de la SEQ ID NO: 2 (INTYSGEA), la CDR 3 de VH de la SEQ ID NO: 3 (LRGYTYQS FDEGGDY), la CDR 2 de VL de la SEQ ID NO: 4 (LVS) y la CDR 3 de VL de la SEQ ID NO: 5 (WQGTHFPYT).

[0030] La invención también proporciona:

[0031] - Un polinucleótido que codifica el anticuerpo o fragmento de unión del mismo, un vector de clonación o expresión que comprende dicho polinucleótido, o una célula hospedadora que comprende dicho vector de clonación o expresión.

[0032] La invención también proporciona:

[0033] - Un proceso para la producción de un anticuerpo o fragmento de unión del mismo que se une específicamente a un epítopo citrulinado en la histona 2A y/o la histona 4 humanas desiminadas, que comprende cultivar la célula hospedadora y aislar el anticuerpo o fragmento de unión del mismo de dicha célula.

[0034] La invención también proporciona:

[0035] - Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión del mismo y al menos un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.

[0036] La invención también proporciona:

[0037] - El anticuerpo o fragmento de unión del mismo, o la composición farmacéutica como se define en el presente documento, para su uso en terapia.

[0038] La invención también proporciona:

[0039] - El anticuerpo o fragmento de unión del mismo, o la composición farmacéutica como se define en el presente documento, para su uso en un método de tratamiento o prevención de una patología asociada a NET.

[0040] Breve descripción del listado de secuencias

[0041] Nomenclatura de anticuerpos

[0042] CDR = región determinante de la complementariedad.

[0043] VH = dominio variable de cadena pesada.

[0044] VL = dominio variable de cadena ligera.

[0045] CH = dominio constante de cadena pesada.

[0046] CL = dominio constante de cadena ligera.

[0047] msVH22.101 = VH de ratón del anticuerpo terapéutico.

[0048] msVL22.101 = VL de ratón del anticuerpo terapéutico.

[0049] hVH22.101x = VH humanizado del anticuerpo terapéutico, "x" se refiere a la cadena pesada.

[0050] hVL22.101y = VL humanizado del anticuerpo terapéutico, "y" se refiere a la cadena ligera.

[0051] hVH22.101(HC)x = VH humanizado optimizado del anticuerpo terapéutico, "(HC)x" se refiere a la cadena pesada. hVL22.101(LC)y = VL humanizado optimizado del anticuerpo terapéutico, "(LC)y" se refiere a la cadena ligera. hMQ22.101x/y = anticuerpo terapéutico humanizado, "x" se refiere a la cadena pesada, "y" se refiere a la cadena ligera.

[0052] hMQ22.101(HC)x/(LC)y = anticuerpo terapéutico humanizado optimizado de la invención, "(HC)x" se refiere a la cadena pesada, "(LC)y" se refiere a la cadena ligera.

[0054]

[0055] (continuación)

[0056]

[0057] (continuación)

[0059]

[0062] Breve descripción de las figuras

[0064] Figura 1 - Ensayos de estabilidad acelerada de hMQ22.101j/e y hMQ22.101f/g

[0065] Se almacenaron alícuotas de 0,75 ml (tubos de vidrio) que contenían hMQ22.101j/e (12,5 mg/ml) o hMQ22.1011f/g (3,31 mg/ml) en Tris-HCl 25 mM, pH 8,0 a 37 °C cada una durante 8 semanas. Cada semana se extrajeron varias muestras de 10 j l y 20 j l de cada tubo de vidrio en condiciones asépticas y se almacenaron a -80 °C hasta su análisis posterior (ELISA y espectrometría de masas). Las muestras de hMQ22.101j/e de las semanas 0, 2, 4, 6 y 8, y las muestras de hMQ22.101f/g de las semanas 0, 3 y 6 se sometieron a un ELISA de CMC validado internamente en el que se evaluó la unión a un péptido derivado de histona (SEQ ID NO: 18).

[0066] La afinidad de unión del anticuerpo de la muestra de estabilidad acelerada de la semana 0 se fijó en el 100 %, y todos los demás valores de afinidad de unión de las muestras de estabilidad acelerada (semanas 2, 3, 4, 6 y 8) se recalcularon como porcentaje de la semana 0 (100 %) y se representaron en forma de un gráfico de barras.Figura 2 - Análisis por espectrometría de masas de los anticuerpos hMQ22.101x/y

[0068] a) Análisis por espectrometría de masas (EM) de muestras de estabilidad acelerada del anticuerpo hMQ22.101j/e.

[0069] Se almacenaron alícuotas de 0,75 ml (tubos de vidrio) que contenían hMQ22.101j/e (12,5 mg/ml) a 37 °C cada una durante 8 semanas. Cada semana se extrajo una muestra de cada tubo de vidrio en condiciones asépticas y se almacenó a -80 °C hasta el análisis por EM.

[0070] El análisis por EM se realizó como se describe en el Ejemplo 2. La tabla muestra los niveles relativos de isomerización de aspartato (D) dentro de la CDR1 y cerca de la CDR2 de hVL22.101e.

[0071] b) Ensayo de unión a antígeno con anticuerpos humanizados, que contienen una CDR1 con mutación de aspartato de hVL22.101y.

[0072] Los anticuerpos de CDR1 con mutación de aspartato generados hMQ22.101j/h, hMQ22.101j/i y hMQ22.101j/j se compararon con el anticuerpo que contenía aspartato hMQ22.101j/e usando un ELISA CMC validado internamente, como se describe en el Ejemplo 1. El gráfico muestra los resultados de densidad óptica de los tres mutantes de CDR1 de hVL22.101y (Cd R1 de hVL22.101h = mutación del sitio DS a AS; CDR1 de hVL22.1011 = mutación del sitio DS a e S; CDR1 de hVL22.101j = mutación del sitio DS a SS).

[0073] c) Análisis por EM de muestras de estabilidad acelerada del anticuerpo hMQ22.101j/i. El análisis por EM se realizó como se describe en el Ejemplo 2. La tabla muestra los niveles relativos de isomerización de aspartato (D) dentro de la CDR1 y cerca de la CDR2 de hVL22.101i.

[0075] Figura 3 - Generación y análisis de afinidad de mutantes de isomerización de hMQ22.101

[0077] a) La tabla muestra diecisiete dominios con CDR1 mutada de hVL22.101(LC)y, que se han creado, así como la CDR1 no mutada de hVL22.101e y hVL22.101g.

[0078] b) Gráfico que muestra las velocidades de disociación (kdis x E-07 (1/s)) de los mutantes de isomerización al péptido derivado de H2A (SEQ ID NO: 18) y al péptido derivado de H4 (Se Q ID NO: 20) citrulinados, medidas con el instrumento Octet RED96. Una velocidad de disociación más baja indica una mayor afinidad del anticuerpo por el antígeno.

[0080] Figura 4 - Ensayo de estabilidad acelerada de mutantes de isomerización de hMQ22.101Se almacenaron alícuotas de 0,4 ml (tubos de vidrio) que contenían los anticuerpos mutados indicados (que variaban entre 2,06­ 4,29 mg/ml) a 37 °C cada una durante 6 semanas. Cada semana se extrajo una muestra de cada tubo de vidrio en condiciones asépticas y se almacenó a -80 °C hasta el análisis adicional. Las muestras de las semanas 0, 3 y 6 se sometieron a un ensayo ELISA CMC validado internamente en el que se evaluó la unión al péptido derivado de H2A citrulinado (SEQ ID NO: 18).

[0081] La afinidad de unión del anticuerpo recalculada de la muestra de estabilidad acelerada de la semana 0 se fijó en el 100 %, y todos los demás valores de afinidad de unión de las muestras de estabilidad acelerada se recalcularon como porcentaje de la semana 0 (100 %) y se representaron en forma de un gráfico de barras.

[0082] Las cadenas pesadas preferidas para su uso en los ensayos de estabilidad acelerada fueron hVH22.101f y hVH22.101HC9. Se sometieron a ensayo nueve combinaciones de cadenas pesadas y cadenas ligeras mutadas en CDR1. hMQ22.101f/LC41, hMQ22.101f/LC42, hMQ22.101HC9/LC21, hMQ22.101HC9/LC27 y hMQ22.101HC9/LC42 mostraron la mayor estabilidad después de 6 semanas.

[0083] Figura 5-Análisis por espectrometría de masas de mutantes de isomerización de hMQ22.101

[0084] Se almacenaron alícuotas de 0,4 ml (tubos de vidrio) que contenían los anticuerpos mutados indicados (en un intervalo de 2,06-4,29 mg/ml) a 37 °C cada una durante 6 semanas. Cada semana se extrajo una muestra de cada tubo de vidrio en condiciones asépticas y se almacenó a -80 °C hasta el análisis adicional. El análisis por espectrometría de masas (EM) de los anticuerpos hMQ22.101 con CDR1 de VL mutada (mutantes de isomerización) se realizó como se describe en el Ejemplo 2, con la diferencia de que se usaron muestras de estabilidad acelerada de las semanas 0 y 6 y se compararon con los niveles de isomerización de hMQ22.101j/e. La tabla muestra los niveles relativos de isomerización de aspartato (D) dentro de la CDR1 de hVL22.101(LC)y. El análisis por EM de los mutantes de isomerización de hMQ22.101 indica que hMQ22.101f/LC41 mostró la menor isomerización a lo largo del tiempo (0,5 %) y, por lo tanto, fue el candidato más preferido. Otros candidatos preferidos fueron hMQ22.101f/LC42 y hMQ22.101HC9/LC42.

[0085] Figura 6 - Ensayos de agregación y degradación de mutantes de isomerización de hMQ22.101 preferidosSe almacenaron alícuotas de 0,4 ml (tubos de vidrio) que contenían los anticuerpos mutados indicados (en un intervalo de 2,06-4,29 mg/ml) a 37 °C cada una durante 6 semanas. Cada semana se extrajo una muestra de cada tubo de vidrio en condiciones asépticas y se almacenó a -80 °C hasta el análisis adicional. Se usaron muestras de estabilidad de las semanas 0 y 6 de los mutantes de isomerización hMQ22.101f/LC41, hMQ22.101f/LC42 y hMQ22.101HC9/LC42 para el análisis de agregación y degradación como se describe en el Ejemplo 10. Las mediciones se realizaron en un sistema Agilent 1200 en combinación con una columna Agilent Zorbax GF-250. Las proteínas se han detectado usando luz ultravioleta de 240 nm. El pico principal de anticuerpos se detectó aproximadamente a los 4,25 minutos. Se cuantificaron los hombros antes y después del pico principal, que son una medida del porcentaje de agregación y de los niveles de degradación, respectivamente. hMQ22.101f/LC41, hMQ22.101f/LC42 y hMQ22.101HC9/LC42 mostraron perfiles de agregación y degradación aceptables, lo que indica que son aceptables para su desarrollo adicional.

[0086] Figura 7 - Experimentos de inhibición de NETosis usando los mutantes de isomerización preferidos hMQ22.101f/LC41 y hMQ22.101f/LC42

[0087] Se estimularon neutrófilos de voluntarios sanos (donantes 154 y 155) durante 4 horas con el ionóforo de calcio A23187. El efecto de los anticuerpos reductores de trampas extracelulares de neutrófilos (NET) se sometió a ensayo añadiendo anticuerpos a una concentración de 25 pg/ml o tampón de ensayo 15 min antes de añadir A23187 a las células. Después de 4 horas de incubación a 37 °C y CO<2>al 5 %, las células se lavaron y posteriormente el ADN extracelular se digirió con nucleasa S7. Se recogieron fragmentos de NET de los pocillos y se cuantificaron mediante la medición de la actividad de MPO en la muestra añadiendo 50 pl de sustrato de 3,3',5,5'-Tetrametilbencidina (TMB) a 50 pl de NET recogidas. Después de una incubación de 10 min a TA, se añadieron 50 pl de H<2>SO<4>y se midió la densidad óptica a 450 nm. Las señales de fondo procedentes de neutrófilos, que no se han sometido a tratamiento con A23187, se restaron, y las señales de los neutrófilos tratados con A23187 anticuerpos no relacionados se establecieron como el 100 %. Las señales de todos los demás grupos tratados se establecieron como porcentaje del tratamiento con anticuerpos no relacionados.

[0088] Figura 8 - Respuesta a la dosis de hMQ22.101f/LC41 hMQ22.101f/LC42 y hMQ22.101f/g en un modelo de AIAC en ratón

[0089] Los anticuerpos candidatos con líderes optimizados impiden el inicio de la inflamación. Se usó un modelo de artritis inducida por anticuerpos contra colágeno (AIAC) para someter a ensayo la eficacia de la respuesta a la dosis de hMQ22.101f/LC41, hMQ22.101f/LC42 o hMQ22.101f/g. Se trataron grupos de 5 ratones el día 0 a través de inyección i.p. con 2,8 mg de anticuerpos anti-colágeno-II. Se inyectó LPS (25 pg/ratón) i.p. el día 3, simultáneamente con hMQ22.101f/LC41, hMQ22.101f/LC42 o hMQ22.101f/g; cada uno a 6,25, 12,5 y 25 mg/kg, anticuerpo de control emparejado por isotipo no relacionado (MQR2.201 a 25 mg/kg) o sin anticuerpo (placebo). Se anotó el grado de hinchazón de las patas durante 2 semanas y se representó en los gráficos como "Puntuación media de artritis/ratón".

[0090] Figura 9 - Inhibición de NET in vitro y unión de NET por hMQ22.101f/LC41Se estimularon neutrófilos de ratón derivados de médula ósea con A23187 para inducir la liberación de NETin vitro.La liberación de NET se inhibió con hMQ22.101f/LC41, pero no con MQR2.201 (Fig. A; Gráfico de barras de la izquierda, cuantificación de la colocalización de Hoechst (ADN) e Histona 3 citrulinada (citH3), y gráfico de barras de la derecha, cuantificación de Hoechst solamente). Además, hMQ22.101f/LC41 se une a<n>E<t>expulsadas (flecha amarillo) así como a pre-NET (flecha blanco), lo que podría ser la primera etapa hacia el aclaramiento de NET por los macrófagos (Fig. B). Se usa Sytox Verde para detectar<a>D<n>, incluyendo NET y pre-NET, y se usa anti-hIgG para detectar hMQ22.101f/LC4 unido a NET y pre-NET. Barras de escala: 25 pm.

[0091] Figura 10 - Inhibición de NET in vivo y unión de NET por hMQ22.101f/LC41

[0092] Con el fin de inducir la formación de NETin vivose usó un modelo en ratón de influjo de células peritoneales inducido por pristano. Se administró MQR2.201 o hMQ22.101f/LC41 50 mg/kg inmediatamente después de la inyección de 500 pl de aceite de pristano, seguido de una segunda inyección de MQR2.201 o hMQ22.101f/LC41 50 mg/kg 12 horas después. Después de 24 horas, las células se recogieron. Se observó inhibición de la liberaciónin vivode NET cuando los ratones se trataron con hMQ22.101f/LC41, pero no con MQR2.201.

[0093] (Fig. A) Imágenes representativas. (Fig. B) Cuantificación de NET por Hoechst (ADN) e Histona 3 citrulinada (citH3) colocalizada. (Fig. C) Unión de hMQ22.101f/LC41 a NET así como a pre-NET, lo que podría ser la primera etapa hacia el aclaramiento de NET por los macrófagos. Se usa Sytox Verde para detectar ADN, incluyendo NET y pre-NET, y se usa anti-hIgG para detectar hMQ22.101f/LC4 unido a NET y pre-NET.

[0094] Barras de escala: 50 pm (A) o 25 pm (C).

[0095] Figura 11 - Las NET enriquecidas con hMQ22.101f/LC41 son fagocitadas por macrófagos de ratón in vivoCon el fin de inducir la formación de NETin vivose usó un modelo en ratón de influjo de células peritoneales inducido por pristano. Se administró MQR2.201 o hMQ22.101f/LC41 50 mg/kg inmediatamente después de la inyección de 500 j l de aceite de pristano, seguido de una segunda inyección de MQR2.201 o hMQ22.101f/LC41 50 mg/kg 12 horas después. Después de 24 horas, las células se recogieron y se tiñeron con Hoechst (ADN: azul), el marcador de macrófagos anti-F4/80 (magenta), anti-NE (verde), anti-citH3 (amarillo) y anti-hIgG (cian). Las partículas de NET que contienen NE (flecha azul), citH3 (flecha roja) y hMQ22.101f/LC4l (flecha blanca) están presentes en los macrófagos (F4/80). Barras de escala: 10 jm .

[0096] Figura 12 - hMQ22.101j/e impide el daño tisular mediado por NET y la progresión de la enfermedad en ratones con AIC crónica.

[0097] (A) Visión general esquemática del modelo de AR en ratón con AIC. Para inducir la artritis crónica, a los ratones se les inyectó CII dos veces (días 0 y 21). El tratamiento terapéutico empezó después del inicio de la enfermedad (entre el día 21-28) cuando las PMA eran > 0,75 y. El tratamiento incluye cuatro inyecciones (intervalo de 4 días) con pautas posológicas cónica de MQR2.201 (50/50/50/50 mg/kg) o hMQ22.101j/e (30/30/30/10, 50/50/50/15 o 50/10/10/10 mg/kg). Los ratones se sacrificaron 14 días después del comienzo del tratamiento. (B) La puntuación media de artritis (PMA) de los ratones con AIC se evaluó durante 14 días (n = 10 ratones por grupo; se usó MQR2.201 para calcular las diferencias estadísticas). (C) El daño óseo de las rodillas y los tobillos de las patas traseras derecha e izquierda se analizó con rayos X el día 14 después de la primera inyección de anticuerpos (n = 10). El análisis histológico, usando tinciones de HyE y SO, de las articulaciones desde los tobillos derecho e izquierdo determinó el influjo de células inflamatorias (D), la erosión ósea (E), la erosión del cartílago (F), el agotamiento de PG del cartílago (G) y la muerte de condrocitos (H) el día 14 después de la primera inyección de anticuerpos (n = 16-20 tobillos de ratón). (I) Imágenes representativas de inmunofluorescencia y HyE de la liberación de NET en las articulaciones de las patas traseras derechas que demuestran histona 3 citrulinada (citH3; rojo), DAPI (azul), el marcador de neutrófilos Ly6G (verde) y mieloperoxidasa (MPO; amarillo). Se usó DAPI como tinción de ADN nuclear y extracelular. Barras de escala: 100 jm . Cuantificación de Ly6G (J) y NET (colocalización de citH3 y MPO) (K) en la articulación tibiotarsiana, la articulación intertarsiana proximal, la articulación intertarsiana distal y la articulación tarsometatarsiana de las patas traseras derechas de ratones (n = 10). (L) Correlación significativa de la puntuación macroscópica (hinchazón de la pata) y NET por articulación. (M) Correlación significativa de la puntuación macroscópica (hinchazón de la pata) y neutrófilos (Ly6G) por articulación. Los resultados se representan como medias ± e Em . *P<0,05, **P<0,01,***P<0,001, ****P<0,0001usando ANOVA bidireccional con el ensayo de comparaciones múltiples de Dunnett (B), ensayotde Student bilateral para datos independientes (C), ensayo estadístico de Mann-Whitney bilateral (D a H, J y K) o ensayo r de Spearman (L y M).

[0098] Figura 13 - hMQ22.101j/e no se une a leucocitos sanos

[0099] Se aislaron PBMC y neutrófilos de sangre de voluntarios sanos. Se usó CD45 para distinguir los leucocitos de los eritrocitos y las plaquetas y se usaron CD3, CD11c, CD14, CD20, CD56 y CD66b para marcar los linfocitos T, DC, monocitos, linfocitos B, linfocitos NK y neutrófilos, respectivamente. No se determinó la unión de hMQ22.101j/e conjugado con HiLyteTMFluor 488 a linfocitos T, linfocitos B, monocitos, linfocitos NK, DC y neutrófilos quiescentes sanos. Se usaron neutrófilos activados (5 jM A23187 durante 45 min) como control positivo y mostraron un aumento de la unión de HiLyteTMFluor 488 conjugado con hMQ22.101j/e. ****P<0,001 usando ANOVA unidireccional ordinario con el ensayo de comparaciones múltiples de Dunnett.

[0101] Descripción detallada de la invención

[0103] Ha de entenderse que las diferentes aplicaciones de la invención divulgada pueden adaptarse a las necesidades específicas de la materia. También ha de entenderse que la terminología utilizada en el presente documento tiene el fin de describir únicamente realizaciones particulares de la invención.

[0105] Además, como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una" y "el/la" incluyen las referencias en plural, a menos que el contenido indique claramente otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un anticuerpo" incluye "anticuerpos" y similares.

[0107] La presente invención se refiere a anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos que se unen específicamente a un epítopo citrulinado en la histona 2A y/o la histona 4 humanas desiminadas. La desiminación de las histonas 2A y 4 humanas puede ser realizada por enzimas tales como la peptidilarginina desiminasa (PAD), por ejemplo, PAD2 y PAD4. Los anticuerpos de la invención también pueden unirse específicamente a un epítopo citrulinado de la histona 3 humana. Los anticuerpos de la invención pueden unirse específicamente a un epítopo citrulinado en la histona 2A y/o la histona 4 y/o la histona 3 humanas. La invención también se refiere a usos para dichos anticuerpos o fragmento de unión de los mismos, tales como usos terapéuticos.

[0109] La presente invención se refiere a anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos que se unen específicamente a un epítopo citrulinado en la histona 2A y/o la histona 4 humanas desiminadas para su uso en el tratamiento o la prevención de patologías asociadas a NET. Los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos de la invención pueden usarse en el tratamiento o la prevención de patologías asociadas a NET tal como LES, lupus, septicemia, vasculitis, artritis inflamatoria, artritis reumatoide y osteoartritis, psoriasis, enfermedad de Alzheimer, hepatitis autoinmunitaria, artritis idiopática juvenil, enfermedad de Sjogren, síndrome antifosfolipídico, enfermedad de Bechet, espondilitis, espondiloartropatía, atrofia de múltiples sistemas, enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy, asma, asma alérgica exacerbada por rinovirus, asma alérgica, fibrosis quística, fibrosis y fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad del ojo seco, uveítis, uveítis no granulomatosa, uveítis granulomatosa, dermatitis, dermatitis atópica, EPOC, bronquitis u otras patologías asociadas a NET tales como cicatrización de heridas en diabetes, cáncer, metástasis de cáncer y salud de los órganos trasplantadosin vivooex vivo.

[0111] Dianas de los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos de la invención

[0113] La citrulina es un aminoácido que no se incorpora en las proteínas durante la traducción normal, sin embargo, puede generarse por modificación postraduccional de un resto arginina por enzimas tales como PAD; (EC 3.5.3.15). En mamíferos (seres humanos, ratones y ratas), hasta ahora se han identificado cinco isotipos PAD (PAD1 - PAD6; "PAD4" y "PAD5" se usan para el mismo isotipo), cada uno codificado por un gen distinto.

[0115] La citrulinación de la histona 2A y/o la histona 4 se asocia a la formación de NET. Los efectos patológicos derivados de la formación de NET pueden ser numerosos. Por ejemplo, puede haber exposición de autoantígenos al espacio extracelular y la posterior producción de autoanticuerpos patológicos por parte del sujeto. Las histonas derivadas de NET pueden ser tóxicas para la pared vascular y los órganos, provocando daños vasculares y fallos orgánicos. Las NET pueden conducir a la formación de complejos inmunitarios autoantígeno/autoanticuerpo, que potencian la inflamación adicional, en, por ejemplo, el riñón de pacientes con LES. Las NET también están implicadas en la metástasis en la progresión del cáncer.

[0117] Los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos de acuerdo con la invención se unen específicamente a un epítopo citrulinado en la histona 2A y/o la histona 4 humanas desiminadas. Los anticuerpos de la invención también pueden unirse específicamente a un epítopo citrulinado de la histona H3 humana desiminada. En una realización específica, los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos de acuerdo con la invención se unen específicamente a un epítopo citrulinado en la histona 2A y/o la histona 4 humanas desiminadas, en donde el epítopo comprende un péptido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21 y 22. Los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos también pueden unirse a epítopos que comprenden los péptidos de la SEQ ID NO: 53 o 54.

[0118] Anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos

[0120] El término "anticuerpos", "anticuerpo" o "fragmento de unión de los mismos", como se usa en el presente documento, se refiere a una estructura, preferentemente una estructura proteica o polipeptídica, capaz de unirse específicamente a una molécula diana, con frecuencia denominada "antígeno".

[0122] La molécula de anticuerpo, como se emplea en el presente documento, se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión del mismo. El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere en general a anticuerpos intactos (enteros), es decir, que comprenden los elementos de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. El anticuerpo puede comprender además dominios de unión adicionales, por ejemplo, según la molécula DVD-Ig como se divulga en el documento WO 2007/024715, o el denominado (FabFv)<2>Fc descrito en el documento WO2011/030107. Por lo tanto, el término "anticuerpo", como se emplea en el presente documento, incluye anticuerpos de longitud completa mono, bi, tri o tetravalentes.

[0124] Los fragmentos de unión de anticuerpos incluyen anticuerpos monocatenarios (es decir, una cadena pesada y una cadena ligera de longitud completa); Fab, Fab modificado, Fab', Fab' modificado, F(ab')2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, scFv, anticuerpos mono, bi, tri o tetravalentes, Bis-scFv, diacuerpos, tricuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores (véase, por ejemplo, Holliger P y Hudson PJ, 2005, Nat. Biotechnol., 23: 1126-1136; Adair JR y Lawson ADG, 2005, Drug Design Reviews - Online, 2, 209-217). Los métodos para crear y fabricar estos fragmentos de anticuerpo son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Verma Ret al.,1998, J. Immunol. Methods, 216, 165-181). El formato Fab-Fv se divulgó por primera vez en el documento WO2009/040562 y las versiones estabilizadas con disulfuro del mismo, el Fab-dsFv se divulgó por primera vez en el documento WO2010/035012. Otros fragmentos de anticuerpos para su uso en la presente invención incluyen fragmentos Fab y Fab'. Los anticuerpos multivalentes pueden comprender múltiples especificidades, por ejemplo, pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.

[0126] Un anticuerpo o fragmento de unión del mismo puede seleccionarse del grupo que consiste en anticuerpos monocatenarios, fragmentos variables monocatenarios (scFv), fragmentos variables (Fv), fragmentos de regiones de unión a antígeno (Fab), anticuerpos recombinantes, anticuerpos monoclonales, proteínas de fusión que comprenden el dominio de unión a antígeno de un anticuerpo nativo, diacuerpos, triacuerpos y componentes activos o fragmentos de los mismos.

[0128] Pueden usarse ventajosamente en la invención anticuerpos IgG1 (por ejemplo, IgG1/kappa) que tienen una cadena pesada y una cadena ligera de IgG1. Sin embargo, la invención también abarca otros isotipos de anticuerpos humanos, incluyendo IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD e IgE en combinación con una cadena ligera kappa o lambda. Igualmente, pueden usarse en la invención todos los anticuerpos derivados de animales de diversos isotipos. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos de tamaño completo o fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos, incluyendo fragmentos Fab, F(ab')2 o Fv monocatenario.

[0129] La expresión: "se une específicamente a citrulina" o "se une específicamente a un epítopo citrulinado" en este contexto significa que el anticuerpo o fragmento de unión del mismo se une a una estructura tal como un péptido que contiene un resto citrulina mientras que el anticuerpo o fragmento de unión del mismo se une con menos fuerza o preferentemente nada en absoluto con la misma estructura que contiene un resto arginina en lugar del resto citrulina. El término péptido debe interpretarse como una estructura capaz de presentar el resto citrulina en el contexto correcto para la inmunorreactividad con los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos como se describe en el presente documento, preferentemente en el mismo contexto en el que aparece en el cuerpo humano o animal, preferentemente en el contexto de un polipéptido nativo.

[0130] Los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos de la invención se unen específicamente a un epítopo citrulinado en la histona 2A y/o la histona 4 humanas desiminadas. La unión de anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos a un epítopo citrulinado en la histona 2A y/o la histona 4 humanas desiminadas bloquea la formación de NET. La citrulinación de las histonas se asocia a la formación de NET.

[0131] El bloqueo de la formación de NET puede ser total o parcial. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la invención puede reducir la formación de NET del 10 al 50 %, al menos el 50 % o al menos el 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 %. El bloqueo de NET puede medirse por cualquier medio adecuado, por ejemplo, mediante la medición de la NETosisin vitro(Kraaij Tet al.,2016, Autoimmun. Rev. 15, 577-584).

[0132] Las expresiones "actividad de unión" y "afinidad de unión" tienen por objeto referirse a la tendencia de una molécula de anticuerpo a unirse o no a una diana. La afinidad de unión puede cuantificarse determinando la constante de disociación (Kd) para un anticuerpo y su diana. De manera similar, la especificidad de unión de un anticuerpo a su diana puede definirse en términos de las constantes de disociación (Kd) comparativas del anticuerpo para su diana en comparación con la constante de disociación con respecto al anticuerpo y otra molécula no diana.

[0133] Normalmente, la Kd para el anticuerpo con respecto a la diana será 2 veces, preferentemente 5 veces, más preferentemente 10 veces inferior a la Kd con respecto a la otra molécula no diana, tal como un material no relacionado o acompañante en el entorno. Más preferentemente, la Kd será 50 veces inferior, incluso más preferentemente 100 veces inferior y aún más preferentemente 200 veces inferior.

[0134] El valor de esta constante de disociación puede determinarse directamente mediante métodos bien conocidos y puede calcularse incluso para mezclas complejas mediante métodos tales como, por ejemplo, los expuestos en Caceci MS y Cacheris WP (1984, Byte, 9, 340-362). Por ejemplo, la Kd puede establecerse usando un ensayo de unión con filtro de nitrocelulosa de doble filtro tal como el divulgado por Wong I y Lohman TM (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5428-5432) o, por ejemplo, usando la resonancia de plasmón superficial Octet.

[0135] Un método para la evaluación de la afinidad de unión para la histona 2A y/o la histona 4 humanas desiminadas es mediante ELISA. En la técnica se conocen otros ensayos convencionales para evaluar la capacidad de unión de ligandos, tales como anticuerpos, hacia sus dianas, que incluye, por ejemplo, transferencias Western, RIA y análisis por citometría de flujo. La cinética de unión (por ejemplo, la afinidad de unión) del anticuerpo también puede evaluarse mediante ensayos convencionales conocidos en la técnica, tales como resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, mediante el análisis por el sistema Biacore™.

[0136] Preferentemente, el anticuerpo de la invención tiene una afinidad de unión por la histona 2A y/o la histona 4 humanas desiminadas de 1 nM o menos. Preferentemente, el anticuerpo de la invención tiene una afinidad de unión por la histona 2A y/o la histona 4 humanas desiminadas, y/o la histona H3 humana desiminada de 0,5 nM o menos, 0,1 nM o menos, 50 pM o menos, 10 pM o menos, 5 pM o menos, 2 pM o menos o 1 pM o menos.

[0137] El anticuerpo o fragmento de unión del mismo también puede ser una proteína de fusión que comprende el dominio de unión a antígeno de un anticuerpo nativo.

[0138] Preferentemente, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la invención es un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales son moléculas de inmunoglobulina que son idénticas entre sí y tienen una única especificidad y afinidad de unión por un epítopo particular. Pueden producirse anticuerpos monoclonales (mAb) de la presente invención mediante una diversidad de técnicas, incluyendo la metodología convencional para anticuerpos monoclonales, por ejemplo, la divulgada en "Monoclonal Antibodies: a manual of techniques" (Zola H, 1987, CRC Press) y en "Monoclonal Hybridoma Antibodies: techniques and applications" (Hurrell JGR, 1982 CRC Press).

[0139] El anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la invención comprende un dominio de unión. Un dominio de unión generalmente comprenderá 6 CDR, tres de una cadena pesada y tres de una cadena ligera. En una realización, las CDR están en un marco y juntas forman una región o dominio variable. Por lo tanto, en una realización, un anticuerpo o fragmento de unión comprende un dominio de unión específico para el antígeno que comprende una región o dominio variable de cadena ligera y una región o dominio variable de cadena pesada.

[0140] Los restos de los dominios variables de los anticuerpos se numeran convencionalmente de acuerdo con IMGT (http://www.imgt.org). Este sistema se expone en Lefranc MP (1997, J, Immunol. Today, 18, 509). Este sistema de numeración se usa en la presente memoria descriptiva, excepto que se indique otra cosa.

[0142] Las designaciones de restos por IMGT no siempre se corresponden directamente con la numeración lineal de los restos de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que en la numeración IMGT estricta, lo que corresponde a un acortamiento de, o inserción en, un componente estructural, ya sea del marco o la CDR, de la estructura básica del dominio variable. La numeración IMGT correcta de los restos puede determinarse para un anticuerpo dado por alineación de restos de homología en la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada por IMGT "patrón".

[0144] Las CDR del dominio variable de cadena pesada se ubican en los restos 27-38 (CDR1 de VH), restos 56-65 (CDR2 de VH) y restos 105-117 (CDR3 de VH) de acuerdo con el sistema de numeración IMGT.

[0146] Las CDR del dominio variable de cadena ligera se ubican en los restos 27-38 (CDR1 de VL), restos 56-65 (CDR2 de VL) y restos 105-117 (CDR3 de VL) de acuerdo con el sistema de numeración IMGT.

[0148] Los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos de la presente invención se divulgan en el presente documento por la secuencia de aminoácidos primaria de sus regiones CDR. Los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos de la presente invención se divulgan en el presente documento por la secuencia de aminoácidos primaria de sus cadenas pesadas y ligeras.

[0150] La presente invención se basa en el descubrimiento de que una CDR1 modificada del VL de un anticuerpo o fragmento de unión del mismo que se une específicamente a un epítopo citrulinado en la histona 2A y/o la histona 4 humanas desiminadas proporciona propiedades mejoradas al anticuerpo o fragmento de unión del mismo con respecto a un anticuerpo o fragmento de unión del mismo que comprende una versión no modificada de la CDR1 del VL. La CDR1 no modificada del VL del anticuerpo utilizado para derivar la invención comprende o consiste en las secuencias de aminoácidos QSLLDSDGKTY (SEQ ID NO: 36) o QSLVDSDGKTY (SEQ ID NO: 37). Diversas CDR1 modificadas de la cadena de VL se identifican en el presente documento como las SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9 o 10. La CDR1 modificada de la cadena de VL del anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la invención comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 (QSLLDADGKTY). La CDR1 modificada de la cadena de VL del anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la invención muestra una isomerización reducida, en comparación con la CDR1 no modificada de la SEQ ID NO: 36 o 37, pero tiene propiedades de unión mejoradas en comparación con la CDR1 no modificada.

[0152] Las secuencias de aminoácidos de las CDR para el VH del anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la invención se muestran en las SEQ ID NO: 1, 2 y 3. Las CDR 2 y 3 para el VL se muestran en las SEQ ID NO: 4 y 5.

[0154] Las secuencias de aminoácidos de VH y VL de un anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la invención se proporcionan en las SEQ ID NO: 11 y 16. Las CDR para la cadena de VH se muestran en las SEQ ID NO: 1, 2 y 3. Las CDR para la cadena de VL se muestran en las SEQ ID NO: 9, 4 y 5.

[0156] Las secuencias de aminoácidos de VH y VL de un anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la invención se proporcionan en las SEQ ID NO: 12 y 16. Las CDR para la cadena de VH se muestran en las SEQ ID NO: 1, 2 y 3. Las CDR para la cadena de VL se muestran en las SEQ ID NO: 9, 4 y 5.

[0158] En una realización de la presente invención, el anticuerpo de la invención comprende la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 11, la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 16, una secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 23 o 56, y la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena ligera de la SEQ ID NO: 24.

[0160] En una realización de la presente invención, el anticuerpo de la invención comprende la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 12, la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 16, la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de la SEQ ID NO: 23 o 56, y la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena ligera de la SEQ ID NO: 24.

[0162] Polinucleótidos, vectores y células hospedadoras

[0164] La presente invención también abarca polinucleótidos, vectores y vectores de expresión que codifican el anticuerpo o fragmentos de unión de los mismos descritos en el presente documento.

[0166] La invención también se refiere a polinucleótidos que codifican anticuerpos de la invención. Por lo tanto, un polinucleótido de la invención puede codificar cualquier anticuerpo o fragmento como se describe en el presente documento. Las expresiones "molécula de ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Los ejemplos no limitantes de polinucleótidos incluyen un gen, un fragmento de gen, ARN mensajero (ARNm), ADNc, ADN genómico, polinucleótidos recombinantes, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Un polinucleótido de la invención puede proporcionarse en forma aislada o purificada.

[0168] Una secuencia de ácido nucleico que "codifica" un polipéptido seleccionado es una molécula de ácido nucleico, que se transcribe (en el caso del ADN) y se traduce (en el caso del ARNm) en un polipéptidoin vivocuando se pone bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan mediante un codón de inicio en el extremo (amino) 5' y un codón de parada de traducción en el extremo (carboxi) 3'. Para los fines de la invención, dichas secuencias de ácido nucleico pueden incluir, pero sin limitación, ADNc de ARNm vírico, procariota o eucariota, secuencias genómicas de ADN o ARN vírico o procariota, e incluso secuencias de ADN sintéticas. Una secuencia de terminación de la transcripción se puede ubicar en 3' con respecto a la secuencia codificante. En una realización, un polinucleótido de la invención comprende una secuencia, que codifica una secuencia de aminoácidos de VH o VL como se ha descrito anteriormente. El polinucleótido puede codificar la secuencia de VH o VL de un anticuerpo específico o fragmento de unión del mismo como se divulga en el presente documento.

[0170] Por lo tanto, un anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la invención, puede producirse a partir de, o suministrarse en forma de, un polinucleótido, que lo codifica y es capaz de expresarlo. Cuando el anticuerpo comprende dos o más cadenas, un polinucleótido de la invención puede codificar una o más cadenas de anticuerpos. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención puede codificar una cadena ligera de anticuerpo, una cadena pesada de anticuerpo o ambas. Pueden proporcionarse dos polinucleótidos, uno de los cuales codifica una cadena ligera de anticuerpo y el otro codifica la cadena pesada de anticuerpo correspondiente. Dicho polinucleótido o par de polinucleótidos puede expresarse en conjunto de manera que se genere un anticuerpo de la invención.

[0172] Los polinucleótidos de la invención pueden sintetizarse de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica, como se describen a modo de ejemplo en Sambrook Jet al.(1989, Molecular cloning: a laboratory manual; Cold Spring Harbor: Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press).

[0174] Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden proporcionarse en forma de un casete de expresión, que incluye secuencias de control unidas operativamente a la secuencia insertada, permitiendo de este modo la expresión del anticuerpo de la invenciónin vivo.Estos casetes de expresión, a su vez, se proporcionan normalmente dentro de vectores (por ejemplo, plásmidos o vectores víricos recombinantes). Dicho casete de expresión puede administrarse directamente a un sujeto hospedador. Como alternativa, un vector que comprende un polinucleótido de la invención puede administrarse a un sujeto hospedador. Preferentemente, el polinucleótido se prepara y/o se administra usando un vector genético. Un vector adecuado puede ser cualquier vector, que sea capaz de portar una cantidad suficiente de información genética y que permita la expresión de un polipéptido de la invención.

[0176] Por lo tanto, la presente invención incluye vectores de expresión que comprenden dichas secuencias de polinucleótidos. Dichos vectores de expresión se construyen de forma rutinaria en la técnica de la biología molecular y pueden implicar, por ejemplo, el uso de ADN plasmídico e iniciadores, promotores, potenciadores y otros elementos apropiados, tales como, por ejemplo, señales de poliadenilación, que puedan ser necesarios, y que estén colocados en la orientación correcta, con el fin de permitir la expresión de un péptido de la invención. Otros vectores adecuados resultarán evidentes para los expertos en la materia. A modo de ejemplo en este sentido se hace referencia a Sambrook Jet al.(1989, Molecular cloning: a laboratory manual; Cold Spring Harbor: Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press).

[0178] Un experto en la materia puede usar las secuencias descritas en el presente documento para clonar o generar ADNc o secuencias genómicas, por ejemplo, tales como se describen en los ejemplos a continuación. La clonación de estas secuencias en un vector de expresión eucariota apropiado, como pcDNA3 (Invitrogen), o derivados del mismo, y la transfección posterior de células de mamífero (como células CHO) con combinaciones de los vectores que contienen cadenas ligeras y pesadas apropiados dará como resultado la expresión y secreción de los anticuerpos descritos en el presente documento.

[0180] El experto en la materia también puede fabricar análogos de los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos como se describe en el presente documento mediante el uso de los dominios de unión específicos de las secuencias de anticuerpos y expresarlos en un contexto diferente, tal como un polipéptido, tal como una proteína de fusión. Esto es bien conocido en la técnica.

[0182] La invención también incluye células que se han modificado para expresar un anticuerpo de la invención. Dichas células incluyen estirpes celulares eucariotas superiores transitorias o preferentemente estables, tales como células de mamíferos o células de insectos, células eucariotas inferiores, tales como levaduras o células procariotas, tal como células bacterianas. Los ejemplos particulares de células, que pueden modificarse mediante la inserción de vectores o casetes de expresión que codifican un anticuerpo de la invención, incluyen células HEK293, CHO, HeLa, NS0 y COS de mamífero. Preferentemente, la estirpe celular seleccionada será una que no sólo sea estable, sino que también permita la glicosilación madura.

[0183] Dichas estirpes celulares de la invención pueden cultivarse usando métodos rutinarios para producir un anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la invención, o pueden usarse terapéutica o profilácticamente para administrar anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos de la invención a un sujeto. Como alternativa, pueden administrarse polinucleótidos, casetes de expresión o vectores de la invención a una célula de un sujetoex vivoy después la célula se devuelve al cuerpo del sujeto.

[0185] La presente invención también abarca un proceso para la producción de un anticuerpo o fragmento de unión del mismo que se une específicamente a un epítopo citrulinado en la histona 2A y/o la histona 4 humanas desiminadas, que comprende cultivar una célula hospedadora como se describe en el presente documento y aislar el anticuerpo o fragmento de unión del mismo de dicha célula.

[0187] Composiciones farmacéuticas

[0189] La invención abarca composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos o fragmentos de unión a los mismos de la invención. La invención abarca composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

[0191] Como se usa en el presente documento, un "portador farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares que sean fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el portador es adecuado para la administración parenteral. por ejemplo, intravenosa, intraocular, intramuscular, subcutánea, intradérmica o intraperitoneal (por ejemplo, mediante inyección o infusión). En determinadas realizaciones, un portador farmacéuticamente aceptable comprende al menos un portador seleccionado del grupo que consiste en una solución de cosolvente, liposomas, micelas, cristales líquidos, nanocristales, nanopartículas, emulsiones, micropartículas, microesferas, nanoesferas, nanocápsulas, polímeros o portadores poliméricos, tensioactivos, agentes de suspensión, agentes complejantes tales como ciclodextrinas o moléculas adsorbentes tales como albúmina, partículas tensioactivas y agentes quelantes. En realizaciones adicionales, un polisacárido comprende ácido hialurónico y derivados del mismo, dextrano y derivados del mismo, celulosa y derivados de la misma (es decir, metilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa, acetato de ftalato de celulosa, succinato de acetato de celulosa, acetato de butirato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa), quitosano y derivados del mismo, [beta]-glucano, arabinoxilanos, carragenanos, pectina, glucógeno, fucoidano, condrotina, dermatano, heparano, heparina, pentosano, keratano, alginato, ciclodextrinas y sales y derivados, incluyendo ésteres y sulfatos, de los mismos.

[0193] Los portadores farmacéuticamente aceptables preferidos comprenden portadores o diluyentes acuosos. Los ejemplos de portadores acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, agua tamponada y solución salina. Los ejemplos de otros portadores incluyen etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Puede mantenerse una fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición.

[0195] Una composición farmacéutica de la invención también puede incluir un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones también pueden contener adyuvantes, tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos puede garantizarse tanto mediante procedimientos de esterilización, citados anteriormente, y mediante la inclusión de diferentes agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol de ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y similares en las composiciones. Además, puede lograrse la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable mediante la inclusión de agentes, que retardan la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

[0197] Normalmente las composiciones terapéuticas deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición farmacéutica puede formularse como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una elevada concentración de fármaco.

[0199] Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el agente activo (por ejemplo, anticuerpo) en la cantidad necesaria en un disolvente adecuado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por microfiltración. En general, las dispersiones se preparan incorporando el agente activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son el secado al vacío y el secado en frío (liofilización) que producen un polvo del agente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir una solución del mismo previamente esterilizada por filtración.

[0200] Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender ingredientes activos adicionales así como un anticuerpo de la invención. Como se ha mencionado anteriormente, las composiciones de la invención pueden comprender uno o más anticuerpos de la invención. También pueden comprender agentes activos terapéuticos o profilácticos adicionales.

[0202] Dependiendo de la vía de administración, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo puede estar recubierto con un material para proteger el anticuerpo de la acción de los ácidos y otras condiciones naturales que puedan inactivar o desnaturalizar el anticuerpo.

[0204] En una realización preferida, la composición farmacéutica de acuerdo con la invención está en una forma seleccionada del grupo que consiste en una solución acuosa, un gel, un hidrogel, una película, una pasta, una crema, una pulverización, una pomada o una envoltura.

[0206] En realizaciones adicionales, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden administrarse por una vía tal como la vía intravenosa, subcutánea, intraocular, intramuscular, intraarticular, intradérmica, intraperitoneal, espinal o por otras vías parenterales de administración, por ejemplo, mediante inyección o infusión. La administración puede ser rectal, oral, ocular, tópica, epidérmica o por vía mucosa. La administración puede ser local, incluyendo peritumoral, yuxtatumoral, intratumoral, en el margen de resección de tumores, intralesional, perilesional, mediante infusión intracavitaria, administración intravesicular o por inhalación. En una realización preferida, la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa o por vía subcutánea.

[0208] También se describen kits que comprenden anticuerpos u otras composiciones de la invención e instrucciones de uso. El kit puede contener además uno o más reactivos adicionales, tales como un agente terapéutico o profiláctico adicional como se ha analizado anteriormente.

[0210] Usos terapéuticos de los anticuerpos y fragmentos de unión de los mismos de la invención

[0212] Los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos de acuerdo con la presente invención pueden usarse en terapia. En aplicaciones terapéuticas, los anticuerpos o composiciones se administran a un sujeto que ya padece un trastorno o afección, en una cantidad suficiente para curar, aliviar o detener parcialmente la afección o uno o más de sus síntomas. Dicho tratamiento terapéutico puede dar como resultado una disminución de la gravedad de los síntomas de la enfermedad o un aumento de la frecuencia o duración de los períodos sin síntomas. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como "cantidad terapéuticamente eficaz". Las cantidades eficaces para un uso dado dependerán de la gravedad de la enfermedad o lesión así como del peso y estado general del sujeto. Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" incluye cualquier humano.

[0214] En realizaciones particulares, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la invención puede unirse (directa o indirectamente) a otro resto. El otro resto puede ser un agente terapéutico tal como un fármaco. El otro resto puede ser un marcador detectable. El otro resto puede ser un resto de unión, tal como un anticuerpo o un dominio de unión de polipéptido específico para una diana terapéutica. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la invención puede ser un anticuerpo biespecífico.

[0216] El agente terapéutico o un marcador detectable puede unirse directamente, por ejemplo, mediante conjugación química, a un anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la invención. Se conocen en la técnica métodos para conjugar agentes o marcadores con un anticuerpo. Por ejemplo, puede usarse conjugación con carbodiimida (Bauminger S y Wilchek M, 1980, Methods Enzymol., 70, 151-159) para conjugar una diversidad de agentes, incluyendo la doxorrubicina, con anticuerpos o péptidos. La carbodiimida soluble en agua, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) es particularmente útil para conjugar un resto funcional con un resto de unión.

[0217] También pueden usarse otros métodos para conjugar un resto con anticuerpos. Por ejemplo, puede usarse oxidación con peryodato de sodio seguida de alquilación reductora de reactivos apropiados, al igual que la reticulación con glutaraldehído. Sin embargo, se reconoce que, independientemente de qué método de producción de un conjugado de la invención se seleccione, debe determinarse que el anticuerpo mantiene su capacidad de direccionamiento y que el resto funcional mantiene su función relevante.

[0219] El agente terapéutico unido al anticuerpo puede comprender un polipéptido o un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene un beneficio terapéutico. Los ejemplos de dichos polipéptidos incluyen citocinas antiproliferativas o antiinflamatorias.

[0221] El anticuerpo puede unirse a un marcador detectable. Por "marcador detectable" se entiende que el anticuerpo está unido a un resto que, cuando se ubica en el sitio diana después de la administración del anticuerpo a un paciente, puede detectarse, normalmente de forma no invasiva desde fuera del cuerpo y del sitio de la diana localizado. Por lo tanto, el anticuerpo puede ser útil para la formación de imágenes y el diagnóstico.

[0223] Normalmente, el marcador es o comprende un átomo radiactivo que es útil en la formación de imágenes. Los átomos radiactivos adecuados incluyen 99mTc y 123I para estudios centellográficos. Otros marcadores incluyen, por ejemplo, marcadores de espín para la formación de imágenes por resonancia magnética (MRI, por sus siglas en inglés) tales como 123I nuevamente, 1311, 111In, 19F, 13C, 15N, 170, gadolinio, manganeso o hierro. Claramente, la cantidad suficiente de los isótopos atómicos apropiados ha de unirse al anticuerpo para que la molécula sea fácilmente detectable.

[0225] Los radiomarcadores u otros marcadores pueden incorporarse de formas conocidas. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento del mismo, puede sintetizarse de manera biológica o puede sintetizarse mediante síntesis química de aminoácidos usando precursores de aminoácidos adecuados que implican, por ejemplo, flúor-19 en lugar de hidrógeno. Los marcadores tales como 99mTc, 123I, 186Rh, 188Rh y 111In pueden, por ejemplo, unirse mediante restos cisteína en polipéptidos. Puede unirse itrio-90 a través de un resto lisina. Preferentemente, el marcador detectable comprende un átomo radiactivo, tal como, por ejemplo, tecnecio-99m o yodo-123. Como alternativa, el marcador detectable puede seleccionarse del grupo que comprende: yodo-123; yodo-131; indio-111; flúor-19; carbono-13; nitrógeno-15; oxígeno-17; gadolinio; manganeso; hierro.

[0227] En una realización, un anticuerpo de la invención es capaz de unirse selectivamente a un resto directa o indirectamente citotóxico o a un marcador detectable. Por lo tanto, en esta realización, el anticuerpo se une a un resto que se une selectivamente a un compuesto o componente adicional que es citotóxico o fácilmente detectable.

[0229] Un anticuerpo o fragmento de unión de la presente invención, o una composición que comprende dicho anticuerpo o fragmento, puede administrarse a través de una o más vías de administración usando uno o más de una diversidad de métodos conocidos en la técnica. Como apreciará el experto en la materia, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Las vías de administración preferidas para los anticuerpos o composiciones de la invención incluyen las vías de administración intravenosa, subcutánea, intraocular, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, espinal u otras vías de administración parenterales, por ejemplo, mediante inyección o infusión. La expresión "administración parenteral", como se usa en el presente documento, significa modos de administración diferentes de la administración entérica y tópica, por lo general por inyección. La administración puede ser rectal, oral, ocular, tópica, epidérmica o por vía mucosa. La administración puede ser local, incluyendo peritumoral, yuxtatumoral, intratumoral, en el margen de resección de tumores, intralesional, perilesional, mediante infusión intracavitaria, administración intravesicular o por inhalación. En una realización preferida, la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa o por vía subcutánea.

[0231] Un médico especialista experto puede determinar una dosificación adecuada de un anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la invención. Los niveles de dosificaciones reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse para obtener una cantidad del principio activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particular, sin que sea tóxico para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una diversidad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad del anticuerpo particular empleado, la vía de administración, el momento de la administración, la tasa de excreción del anticuerpo, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, la afección, la salud general y los antecedentes médicos previos del paciente que se está tratando, y factores similares bien conocidos en la práctica clínica.

[0233] Una dosis adecuada de un anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la invención puede estar, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 0,1 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal del paciente a tratar. Por ejemplo, una dosificación adecuada puede ser de aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal por semana, de aproximadamente 100 pg/kg a aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal por semana o de aproximadamente 10 pg/kg a aproximadamente 12,5 mg/kg de peso corporal por semana.

[0235] Una dosificación adecuada puede ser de aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal por día, de aproximadamente 100 pg/kg a aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal por día o de aproximadamente 10 pg/kg a aproximadamente 12,5 mg/kg de peso corporal por día.

[0237] Las pautas posológicas pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse una sola inyección en embolada, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en una forma farmacéutica unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma farmacéutica unitaria como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente individuales adecuadas como dosis unitarias para los sujetos que han de tratarse; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico necesario.

[0239] Pueden administrarse anticuerpos en una única dosis o en múltiples dosis. Las múltiples dosis pueden administrarse a través de la misma vía o diferentes vías y en las mismas ubicaciones o diferentes ubicaciones. Como alternativa, los anticuerpos pueden administrarse como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia pueden variar dependiendo de la semivida del anticuerpo en el paciente y la duración del tratamiento que se desee. La dosificación y la frecuencia de administración también pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, puede administrarse una dosificación relativamente baja a intervalos relativamente poco frecuentes durante un período de tiempo prolongado. En aplicaciones terapéuticas, puede administrarse una dosificación relativamente alta, por ejemplo hasta que el paciente muestre una mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad.

[0241] La administración combinada de dos o más agentes puede conseguirse de varias maneras diferentes. En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo y el otro agente pueden administrarse juntos en una única composición. En otra realización, el anticuerpo y el otro agente pueden administrarse en composiciones separadas como parte de una terapia combinada. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo puede administrarse antes, después o simultáneamente con el otro agente.

[0243] Enfermedades a tratar

[0245] Los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos de la presente invención, o las composiciones farmacéuticas como se definen en el presente documento, son particularmente adecuados para su uso en el tratamiento o la prevención de patologías asociadas a la citrulinación, tales como patologías asociadas a NET y afecciones inflamatorias.

[0247] La presente invención también abarca un método de tratamiento de un paciente que comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento de unión del mismo como se define en el presente documento o la composición farmacéutica como se define en el presente documento, opcionalmente para tratar o prevenir patologías asociadas a la citrulinación, tales como patologías asociadas a NET y afecciones inflamatorias.

[0249] La presente invención también abarca un anticuerpo o fragmento de unión del mismo como se define en el presente documento o la composición farmacéutica como se define en el presente documento para su uso en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de patologías asociadas a la citrulinación, tales como patologías asociadas a NET y afecciones inflamatorias.

[0251] La presente invención comprende también una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la presente invención para tratar o prevenir patologías asociadas a la citrulinación, tales como patologías asociadas a<n>E<t>y afecciones inflamatorias.

[0253] Una patología asociada a la citrulinación puede definirse como cualquier enfermedad o afección en la que la citrulinación se asocia a la patología de la enfermedad o afección. Un experto en la materia puede determinar fácilmente si la citrulinación desempeña o no una función en la patogenia de la enfermedad, usando ensayos rutinarios disponibles en la técnica. Por ejemplo, estas enfermedades pueden caracterizarse por la presencia de un nivel anormal de proteínas citrulinadas en los tejidos afectados o relacionados con la enfermedad. Esto puede lograrse mediante un ensayo inmmunitario tal como una transferencia Western o un ELISA en el que el tejido afectado se usa como antígeno y la citrulinación de ese antígeno puede detectarse con la ayuda de un anticuerpo anti-citrulina como se describe en el presente documento. Como alternativa, un experto en la materia puede usar aplicaciones proteómicas tales como el análisis por espectrometría de masas para comparar el nivel y el tipo de citrulinación en un tejido enfermo frente a uno sano de pacientes afectados.

[0255] Las patologías asociadas a NET pueden considerarse patologías asociadas a la citrulinación. Las patologías asociadas a NET pueden definirse como una enfermedad o afección en la que la formación de NET y la NETosis se asocian a la patología de la enfermedad o afección. Un experto en la materia puede determinar fácilmente si la formación de NET y la NETosis desempeñan una función en la patogenia de la enfermedad usando ensayos rutinarias disponibles en la técnica. Por ejemplo, estas enfermedades pueden caracterizarse por la presencia de NET en los tejidos pertinentes.

[0257] Por lo tanto, la invención se refiere a anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos para su uso en el tratamiento o la prevención de patologías asociadas a NET.

[0259] Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método de tratamiento de un paciente que lo necesite con una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmentos de unión del mismo de la presente invención, en donde el paciente padece una patología asociada a NET.

[0261] Los ejemplos de patologías asociadas a NET incluyen afecciones o enfermedades inflamatorias, enfermedades inflamatorias oculares, enfermedades autoinmunitarias, cáncer y la salud de los órganos después de un trasplante.

[0262] "Afecciones inflamatorias" o "enfermedades inflamatorias" se refiere a cualquiera de una serie de afecciones o enfermedades, que se caracterizan por cambios vasculares: edema e infiltración de neutrófilos (por ejemplo, reacciones inflamatorias agudas); infiltración de tejidos por células mononucleares; destrucción de tejido por células inflamatorias, células de tejido conjuntivo y sus productos celulares; e intentos de reparación mediante reemplazo de tejido conjuntivo (por ejemplo, reacciones inflamatorias crónicas). Son dichas enfermedades, por ejemplo, artritis inflamatoria, incluyendo artritis reumatoide y artrosis, LES, lupus, septicemia, vasculitis, esclerosis múltiple, artritis psoriásica, psoriasis, enfermedad de Alzheimer, hepatitis autoinmunitaria, artritis idiopática juvenil, espondiloartropatía, atrofia de múltiples sistemas, enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy, fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad del ojo seco, uveítis, uveítis no granulomatosa, uveítis granulomatosa, dermatitis, dermatitis atópica y enfermedades pulmonares tales como EPOC y bronquitis. La uveítis no granulomatosa puede asociarse a una inflamación dominada por neutrófilos, la uveítis granulomatosa puede asociarse a una inflamación dominada por macrófagos.

[0264] Las NET desempeñan una función en la patología de las enfermedades autoinmunitarias, incluyendo AR, LES y vasculitis. La vía por la que el anticuerpo terapéutico o fragmento de unión del mismo mejora la enfermedad es probablemente a través de la inhibición de la NETosis, el aclaramiento de las NET restantes, incluyendo histonas tóxicas y otros autoantígenos de los tejidos y la circulación, el aclaramiento de NET restantes e histonas tóxicas de los tejidos y la circulación. Se ha demostrado que la patología de muchas enfermedades autoinmunitarias mejora en los modelos de inactivación de PAD o en los animales de tipo silvestre tratados con un inhibidor de PAD, lo que significa que existe una fuerte correlación entre la cantidad de NET y la gravedad de la enfermedad.

[0266] Por lo tanto, las afecciones o enfermedades inflamatorias y las enfermedades autoinmunitarias pueden tratarse mediante los anticuerpos y fragmentos de unión de los mismos de la presente invención.

[0268] En una realización preferida, las enfermedades a tratar son patologías asociadas a NET, tales como LES, lupus, septicemia, vasculitis, artritis inflamatoria, artritis reumatoide y osteoartritis, psoriasis, enfermedad de Alzheimer, hepatitis autoinmunitaria, artritis idiopática juvenil, enfermedad de Sjogren, síndrome antifosfolipídico, enfermedad de Bechet, espondilitis, espondiloartropatía, atrofia de múltiples sistemas, enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy, asma, asma alérgica exacerbada por rinovirus, asma alérgica, fibrosis quística, fibrosis y fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad del ojo seco, uveítis, uveítis no granulomatosa, uveítis granulomatosa, dermatitis, dermatitis atópica, EPOC, bronquitis u otras patologías asociadas a NET tales como cicatrización de heridas en diabetes, cáncer, metástasis de cáncer y salud de los órganos trasplantadosin vivooex vivo.

[0270] En una realización preferida, las enfermedades a tratar son afecciones inflamatorias tales como LES, lupus, septicemia, vasculitis, artritis inflamatoria, artritis reumatoide y osteoartritis, psoriasis, enfermedad de Alzheimer, hepatitis autoinmunitaria, artritis idiopática juvenil, enfermedad de Sjogren, síndrome antifosfolipídico, enfermedad de Bechet, espondilitis, espondiloartropatía, atrofia de múltiples sistemas, enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy, asma, asma alérgica exacerbada por rinovirus, asma alérgica, fibrosis quística, fibrosis, fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad del ojo seco, uveítis, uveítis no granulomatosa, uveítis granulomatosa, dermatitis, dermatitis atópica, EPOC, bronquitis.

[0272] Ejemplos

[0274] Ejemplo 1: Ensayos de estabilidad acelerada dehMQ22.101j/e yhMQ22.101f/g.

[0276] Alícuotas de 0,75 ml (tubos de vidrio) que contenían hMQ22.101j/e (12,5mg/ml) o hMQ22.101f/g (3,31mg/ml) en Tris-HCl 25 mM, pH 8,0 se almacenaron a 37 °C cada una durante 8 semanas. Cada semana se extrajeron varias muestras de 10 |jl y 20 j l de cada tubo de vidrio en condiciones asépticas y se almacenaron a -80 °C hasta su posterior análisis (ELISA y espectrometría de masas).

[0278] Las muestras de hMQ22.101j/e de las semanas 0, 2, 4, 6 y 8, y las muestras de hMQ22.101f/g de las semanas 0, 3 y 6 se sometieron a un ensayo ELISA CMC validado internamente. Se recubrieron placas de ELISA de 96 pocillos con neutravidina (0,1 jg/pocillo) mediante incubación durante la noche a 4 °C. Los pocillos se lavaron 5 veces con PBS-Tween20 (PBS-T) y se bloquearon mediante una incubación de 2 horas con PBS-T albúmina sérica bovina (BSA) al 1 % a temperatura ambiente (TA). Después de 5 lavados más con PBS-T, los pocillos se incubaron durante 1 hora a TA con un péptido derivado de histona (SEQ ID NO 18): SGXGKQGGKARA), que contenía citrulina (X) en la posición 3 y biotina C-terminal (40 ng/pocillo) en PBS-T BSA al 0,2 %. Después de otros 5 lavados con PBS-T, una curva de calibración realizada a partir de un lote de referencia de hMQ22.101j/e o hMQ22.101f/g añadiendo a los pocillos comenzando a 1350 ng/pocillo y diluyendo posteriormente en una relación 1:1 hasta alcanzar una concentración de 0,66 ng/ml en PBS-T BSA al 0,2 %. Se diluyeron muestras de control de calidad (QC, por sus siglas en inglés) con adicionales preparadas a partir del mismo lote de referencia hMQ22.101j/e o hMQ22.101f/g a un control de calidad superior (h Qc , por sus siglas en inglés, 250 ng/ml), medio (MQC, por sus siglas en inglés, 50 ng/ml), inferior (LQC, por sus siglas en inglés, 3,75 ng/ml) y límite de control de calidad inferior (LLQC, por sus siglas en inglés, 1,25 ng/ml) en PBS-T BSA al 0,2 % y se añadieron también a la placa. Estas muestras de QC se usaron para validar los resultados del ELISA.

[0280] Por último, se añadieron muestras de estabilidad acelerada que se habían incubado durante 0, 2, 3, 4, 6 y 8 semanas a 37 °C a la misma placa a una concentración de 40 ng/ml en PBS-T BSA al 0,2 % y se incubaron durante 2 horas a TA. Los pocillos se lavaron 5 veces con PBS-T y se incubaron con anticuerpo de conejo anti-HRP humano (1: 12.000 en PBS-T BSA al 0,2 %) durante 1 hora a TA seguido de 3 lavados con p BS-T y 3 lavados con PBS. Los pocillos se incubaron durante 10 min con sustrato de TMB antes de detener la reacción con H<2>SO<4>2 M, después de lo cual se midió la densidad óptica a una longitud de onda de 450 nm. Se trazó y ajustó una curva de calibración sigmoidal usando los valores del anticuerpo de referencia diluido en serie. Las concentraciones de las muestras de QC y de estabilidad acelerada se recalcularon usando la ecuación de la curva sigmoidal ajustada. La concentración de anticuerpos recalculada desde la muestra de estabilidad acelerada de la semana 0 se fijó en el 100 %, y todas las demás concentraciones recalculadas de estabilidad acelerada (semanas 2, 3, 4, 6 y 8) se calcularon como porcentaje de la semana 0 (100 %) y se representaron en un gráfico de barras(Figura 1, panel superior, para hMQ22.101j/e, Figura 1, panel inferior, for hMQ22.101f/g).

[0282] Los ensayos de estabilidad acelerada mostraron que la afinidad de unión de hMQ22. 101j/e y hMQ22.101f/g para el péptido que contenía citrulina derivado de histona disminuyó con el tiempo.

[0284] Ejemplo 2: Análisis por espectrometría de masas de muestras de estabilidad acelerada de hMQ22.101j/e.

[0286] Se investigó la causa de la reducción de la afinidad de unión del anticuerpo hMQ22.101j/e con el tiempo. hMQ22.101j/e tiene varios sitios potenciales de isomerización de aspartato en o cerca de las regiones CDR de VL (CDR1 y CDR2). El objetivo de este Ejemplo era determinar la sensibilidad de los restos de aspartato a la isomerización mediante un mapeo peptídico basado en cromatografía de líquidos (CL) y espectrometría de masas (EM).

[0288] Antes de la digestión, 50 |jg de cada muestra de estabilidad acelerada (semanas 0, 4 y 8) se sometieron a desalación, reducción con ditiotreitol y alquilación usando yodoacetamida. Después de la reducción y la alquilación, las muestras se digirieron durante 18 horas a 37 °C usando tripsina modificada de calidad de secuenciación (Promega) en una relación enzima/proteína de 1/50 (p/p). Las digestiones se almacenaron a -20 °C hasta el análisis por CL-EM. La tripsina es una serina proteasa que escinde específicamente en el extremo C de la arginina o la lisina. El análisis de las digestiones trípticas se realizó usando cromatografía de líquidos en fase inversa (RPLC) junto con detección UV y espectrometría de masas (RPLC-UV-EM). Los datos se obtuvieron usando un sistema UHPLC 1290 de Agilent Technologies conectado a un Q-TOF 6540 de Agilent Technologies equipado con una fuente de ionización por electronebulización (IEN) Jetstream. Las muestras se separaron en una columna de RPLC (AdvanceBio Peptide Map C18, 250 mm de L, 2,1 mm de DI, 2,7 jm dp, Agilent Technologies) usando agua, ácido trifluoroacético y acetonitrilo como componentes de la fase móvil antes de la detección UV 214 nm y EM(/EM). Se cargó en la columna una cantidad aproximada de 4,5 jg . El sistema de EM se operó en el modo de intervalo dinámico ampliado (2 GHz) con una resolución de 20.000 para la masa 922.009798 y con una gran precisión de masa (normalmente < 10 ppm) sin utilizar masas de referencia. Se obtuvieron dos espectros por segundo y el intervalo de obtención fue de 100-3000 uma en modo EM y EM/EM. Los datos de EM/EM se obtuvieron en el modo dependiente de datos. La energía de colisión se optimizó para la fragmentación de péptidos. Todas las mediciones de EM se realizaron en el modo de ionización positiva.

[0290] Las señales medidas se emparejaron con la secuencia usando el algoritmo BioConfirm incorporado en el software Agilent MassHunter. La tolerancia de masa para ajustar los datos experimentales a la secuencia se fijó en 20 ppm. La enzima especificada fue la tripsina (escisión C-terminal en lisina o arginina) y se permitieron 0-2 escisiones erróneas. Para cuantificar las modificaciones se usaron las áreas de los picos de los cromatogramas de iones extraídos obtenidos con una precisión de masa de 20 ppm. Dada la cobertura casi completa de la secuencia, se cubrieron todos los sitios candidatos de isomerización de aspartato en las regiones de hCDR. Se realizó la integración manual de estos péptidos. Cuando está presente, el péptido que contiene isoaspartato eluye justo antes que el péptido que contiene aspartato. Después se calcularon los niveles relativos de isomerización en cada caso.

[0292] Los niveles relativos de isomerización de aspartato (D) de CDR1 de VL de hMQ22.101j/e aumentaron con el tiempo (Figura 2A). En laFigura 2Ase exponen los sitios de isomerización sometidos a ensayo en CDR1 y CDR2 del VL. Se consideró que la isomerización de la CDR1 de VL era la causa de la pérdida de afinidad de unión del anticuerpo con el tiempo.

[0294] Ejemplo 3: Producción de tres anticuerpos hMQ22.101 con mutación de aspartato en CDR1 de VL.

[0296] Después se investigó si la supresión del sitio de isomerización no germinal en CDR1 de VL impedía la isomerización. GeneArt sintetizó ADN de tres dominios hVL22.101y, que incluían una única mutación de aspartato en CDR1 en la posición de aminoácido 31 (L:Asp31) cada uno. L:Asp31 se mutó en una Alanina, Glutamina o Serina basándose en similitudes de aminoácidos tales como 1) tamaño, 2) polaridad y 3) carga. Estos dominios VL con mutación de aspartato se clonaron en un vector de expresión de mamíferos que codificaba una cadena ligera humana de longitud completa. Posteriormente, estas construcciones de cadena ligera (hVL22.101h, hVL22.101i y hVL22.101j) junto con una construcción de cadena pesada humana de longitud completa (hVH22. 101j) se usaron para transfectar transitoriamente células HEK293 para la producción de hMQ22.101j/h, hMQ22.101j/i y hMQ22.101j/j, respectivamente. Los anticuerpos de tamaño completo se purificaron a partir de sobrenadantes de cultivo usando columnas de afinidad MabSelect SuRe y posteriormente se les cambió el tampón a Tris-HCl 25 mM, pH 8,0 usando columnas de desalinización, ambos en un sistema Akta-FPLC. A continuación, los anticuerpos se pulieron con columnas de centrifugación de intercambio iónico para eliminar las proteínas de la célula hospedadora y la resina residual derivada de Proteína A, seguido de una etapa de eliminación de endotoxinas mediante el uso de resina de eliminación de endotoxinas de alta capacidad. Por último, los anticuerpos se concentraron con un dispositivo centrífugo MicroSep Advance (MWCO 10K).

[0298] Ejemplo 4: Ensayo de unión a antígeno con anticuerpos hMQ22.101 con mutación de aspartato de CDR1 de VL.

[0300] Anticuerpos hMQ22.101j/h, hMQ22.101j/i y hMQ22.101j/j, generados con mutación de aspartato de CDR1 de VL, se compararon con el anticuerpo que contenía aspartato hMQ22.101j/e usando un ELISA CMC validado internamente como se describe en el Ejemplo 1. En este caso se usó un lote de referencia hMQ22.101j/e para la curva de calibración a 5, 10, 20, 30, 40, 60, 80 y 100 ng/ml y muestras de QC con adicionales separadas a 10, 20, 60 y 80 ng/ml. hMQ22.101j/h, hMQ22.101j/i, hMQ22.101j/j y hMQ22.101j/e se sometieron a ensayo a 10, 20, 30, 40, 80 y 100 ng/ml, y las curvas dosis-respuesta se representaron en un gráfico(Figura 2B).

[0302] LaFigura 2Bmuestra los resultados de densidad óptica de los tres mutantes de CDR1 de VL (CDR1 de hVL22.101h = mutación del sitio DS a AS; CDR1 de hVL22.101i = mutación del sitio DS a ES; CDR1 de hVL22. 101j = mutación del sitio DS a SS). Los resultados de densidad óptica más mejorados se obtuvieron con el anticuerpo hMQ22.101j/i.

[0304] Ejemplo 5: Ensayo de estabilidad acelerada seguido de análisis por espectrometría de masas de hMQ22.101j/i con mutación aspartato de CDR1 de LV.

[0306] Se almacenaron alícuotas de 0,75 ml (tubos de vidrio) que contenían hMQ22.101j/i (12,5 mg/ml) en Tris-HCl 25 mM, pH 8,0 a 37 °C cada una durante 4 semanas. Cada semana se extrajeron varias muestras de 10 pl y 20 pl de cada tubo de vidrio en condiciones asépticas y se almacenaron a -80 °C hasta su posterior análisis (espectrometría de masas).

[0308] El análisis por espectrometría de masas se realizó de forma idéntica a los métodos descritos en el Ejemplo 2, con la diferencia de que sólo se usaron las muestras de estabilidad acelerada de las semanas 0 y 4. Los porcentajes de isomerización para hMQ22.101j/i se compararon con los del anticuerpo que contenía isomerización hMQ22.101j/e(Figura 2C).

[0310] Los datos de espectrometría de masas para el anticuerpo hMQ22.101j/i (Figura 2C) mostraron que la isomerización en la CDR1 de VL seguía aumentando un poco con el tiempo, sin embargo, la supresión del sitio de isomerización de DS no germinal en la CDR1 del VL resolvió en gran medida el problema de la isomerización.

[0312] Sin embargo, hMQ22.101j/i tenía menos afinidad por la diana (SEQ ID NO: 18) en comparación con hMQ22.101j/e, por lo que no era un candidato a anticuerpo terapéutico adecuado.

[0314] Ejemplo 6: Producción de otros mutantes de isomerización hMQ22.101.

[0316] Después se realizó un análisis exhaustivo de las mutaciones de los sitios de isomerización en CDR1 de VL, para investigar si era posible eliminar la isomerización de la CDR1 manteniendo la afinidad del anticuerpo mutado por su diana. Se crearon diecisiete dominios de CDR1 mutados de hVL22.101. Estas diecisiete secuencias mutadas de CDR1 de VL, y las secuencias de CDR1 no mutadas de hVL22.101e y hVL22.101g se exponen en laFigura 3A.

[0318] El ADN de diecisiete dominios CDR1 de VL mutados de hVL22.101 y cuatro variantes de dominio VH de hVH22.101 fueron sintetizados por GeneArt. Todos los dominios VL y VH mutados se clonaron en vectores de expresión de mamíferos que codificaban cadenas ligeras y pesadas humanas de longitud completa, respectivamente. Las diecisiete cadenas ligeras mutantes (hVL22.101LC16, hVL22.101LC17, hVL22.101LC19, hVL22.101LC20, hVL22.101LC21, hVL22.101LC22, hVL22.101LC23, hVL22.101LC24, hVL22.101LC25, hVL22.101LC26, hVL22.101LC27, hVL22.101LC37, hVL22.101LC38, hVL22.101LC39, hVL22.101LC40, hVL22.101LC41 y hVL22.101LC42) se combinaron con la cadena pesada no variante hVH22.101j o con las cuatro cadenas pesadas variantes (hVH22.101HC7, hVH22.101HC8, hVH22.101HC9, hVH22.101HC10). Por lo tanto, se usaron todas las combinaciones posibles de construcciones de cadena ligera (hVL22.101e, hVL22.101LC16, hVL22.101LC17, hVL22.101LC19, hVL22.101LC20, hVL22.101LC21, hVL22.101LC22, hVL22.101LC23, hVL22.101LC24, hVL22.101LC25, hVL22.101LC26, hVL22.101LC27, hVL22.101LC37, hVL22.101LC38, hVL22.101LC39, hVL22.101LC40, hVL22.101LC41 y hVL22.101LC42) y cadena pesada (hVH22.101j, hVH22.101HC7, hVH22.101HC8, hVH22.101HC9, hVH22.101HC10) para transfectar transitoriamente células HEK293 para la producción de anticuerpos de tamaño completo (mutantes de isomerización). Los anticuerpos se purificaron, de desalaron, se pulieron y se concentraron como se describe en el Ejemplo 3.

[0320] Ejemplo 7: Análisis de la velocidad de disociación de mutantes de isomerización de hMQ22.101.

[0322] El cribado por velocidad de disociación de los anticuerpos mutados por isomerización se realizó en un instrumento Octet RED96 (Pall ForteBio). Todas las mediciones se realizaron a 30 °C. Los biosensores de estreptavidina (SA) se lavaron primero durante 50 segundos con PBS. Se inmovilizaron péptidos N-terminales de histona 2A (SEQ ID NO: 18) e histona 4 (SEQ ID NO: 20) 1 ug/ml, que contenían ambos una citrulina en la posición 3 y una biotina en el extremo C, en biosensores SA durante 200 segundos, se lavaron con PBS durante 50 segundos y el exceso de moléculas reactivas de estreptavidina se bloqueó con biocitina EZ-link durante 200 segundos. Después de dos lavados adicionales de 50 seg en PBS, se permitió a los anticuerpos a una concentración de 72 nM diluidos en PBS unirse a los biosensores durante 200 segundos. Posteriormente, los sensores se introdujeron en PBS durante 4000 segundos con el fin de medir sus velocidades de disociación.

[0324] Las señales de fondo generadas con biosensores sin recubrimiento, que han sido expuestos a los diversos anticuerpos, así como las señales de los biosensores recubiertos que no han sido expuestos a los diversos anticuerpos, se restaron antes de representar las curvas de disociación para cada anticuerpo. Las constantes de velocidad de disociación de la histona 2A y la histona 4 (kdis x E-07 (1/s)) para cada anticuerpo se calcularon aplicando un modelo de interacción 1:1 (ajuste local, completo) usando el software de análisis de datos ForteBio 8.1.

[0326] Los resultados se muestran en laFigura 3B. Las cifras más bajas indican una velocidad de disociación más lenta, lo que significa una liberación más lenta del antígeno. 1xE-07 1/s es el valor mínimo, que es detectado por Octet, lo que significa que casi no puede medirse la velocidad de disociación.

[0328] Varios mutantes de isomerización hMQ22.101 mostraron una velocidad de disociación de 1xE-07 1/s. Cadenas pesadas preferidas: hVH22.101j y hVH22.101HC9. Cadenas ligeras preferidas: hVL22.101LC17, hVL22.101LC21, hVL22.101LC27, hVL22.101LC41 y hVL22.101LC42.

[0330] Ejemplo 8: Ensayos de estabilidad acelerada de los 9 mejores mutantes de isomerización de hMQ22.101.

[0331] Se almacenaron alícuotas de 0,4 ml (tubos de vidrio) de los siguientes anticuerpos mutados seleccionados (intervalo de 2,06-4,29 mg/ml) en Tris-HCl 25 mM, pH 8,0 a 37 °C cada una durante 6 semanas.

[0334]

[0337] Cada semana se extrajeron varias muestras de 10 pl y 20 pl de cada tubo de vidrio en condiciones asépticas y se almacenaron a -80 °C hasta su posterior análisis (análisis por ELISA y EM). Las muestras de anticuerpos de las semanas 0, 3 y 6 se sometieron a un ensayo ELISA CMC validado internamente como se describe en el Ejemplo 1, con la diferencia de que sólo se usó el lote de referencia hMQ22.101f/g para la curva de calibración y las muestras de QC con adiciones de HQC, MQC, LQC y LLQC.

[0339] Los resultados se muestran en laFigura 4. Los 5 mutantes de isomerización con mejores resultados (hMQ22.101f/LC41, hMQ22.101f/LC42, hMQ22.101HC9/LC21, hMQ22.101HC9/LC27, hMQ22.101HC9/LC42, en recuadro) se usaron para evaluar la isomerización en la semana 0 y 6 mediante análisis por EM.

[0341] Ejemplo 9: Análisis por espectrometría de masas de los 5 mejores mutantes de isomerización hMQ22.101.

[0343] Las muestras de estabilidad acelerada a 37 °C de los 5 anticuerpos, que obtuvieron mejores resultados en el ensayo de estabilidad acelerada (Ejemplo 5), se analizaron posteriormente para determinar sus niveles de isomerización en CDR1 de VL mediante análisis por EM.

[0346]

[0347] El análisis por EM se realizó de forma idéntica a los métodos descritos en el Ejemplo 2, con la diferencia de que sólo se usaron las muestras de estabilidad acelerada de las semanas 0 y 6. Los porcentajes de isomerización se compararon con los del anticuerpo hMQ22.101j/e(Figura 5). hMQ22.101f/LC41 casi no mostró isomerización (0,5 %) a lo largo del tiempo y se consideró el candidato preferido. Los segundos mejores anticuerpos fueron hMQ22.101f/LC42 y hMQ22.101HC9/LC42. El segundo mejor anticuerpo preferido fue hMQ22.101f/LC42, ya que la cadena f de HC es más humana que HC9, y la diferencia de isomerización entre la semana 0 y la 6 es menor (1,9 % frente a 2,6 %).

[0348] Ejemplo 10: Análisis de agregación y degradación de los 3 mutantes de isomerización hMQ22.101 con mejores resultados.

[0349] Las muestras de estabilidad acelerada a 37 °C de los 3 anticuerpos, que mostraron menos isomerización en su CDR1 de VL (Ejemplo 6), se analizaron más a fondo en relación con sus niveles de agregación y degradación.

[0352]

[0354] Las mediciones se realizaron en un sistema Agilent 1200, equipado con bomba cuaternaria G1311A, desgasificador G1322A, automuestreador G1329A, termostato G1330B, horno de columna G1316A y detector VWD G1314B (Agilent T echnologies) junto con una columna Agilent Zorbax GF-250, 4 pm, 9,4 X 250 mm. Se inyectaron 10 pl de anticuerpo y se usaron durante 10 min a un caudal de 2 ml/min, usando una fase móvil que consiste en NaH2PO4200 mM en H<2>O, pH 7,0. Las proteínas se han detectado usando luz ultravioleta de 240 nm. El pico principal de anticuerpos se detectó aproximadamente a los 4,25 min. Se cuantificaron los hombros antes y después del pico principal, que son una medida del porcentaje de agregación y de los niveles de degradación, respectivamente. Los resultados se muestran en laFigura 6.

[0355] hMQ22.101f/LC41, hMQ22.101f/LC42 y hMQ22.101HC9/LC42 mostraron perfiles de agregación y degradación aceptables, lo que indicó que son aceptables para su desarrollo adicional.

[0356] Ejemplo 11: Análisis por fragmentación de los mutantes de isomerización hMQ22.101 con mejores resultados.

[0357] El análisis de las muestras de mAb intactas se realizó usando cromatografía de líquidos en fase inversa (RP-HPLC) en combinación con detección UV y espectrometría de masas (EM) (RP-HPLC-UV-EM). Los datos se obtuvieron usando un sistema UHPLC 1290 de Agilent Technologies conectado a un Q-TOF 6540 de Agilent Technologies equipado con una fuente de ionización por electronebulización (IEN) Jetstream. Las muestras se separaron en una columna de RPLC (Zorbax 300 SB-C8, 100 mm de L, 2,1 mm de DI, 1,8 pm dp, Agilent Technologies) usando TFA al 0,1 % en agua como fase móvil A y TFA al 0,1 % en acetonitrilo como fase móvil B. Se aplicó un gradiente del 15 % de B al 80 % de B durante 65 minutos. Se cargaron aproximadamente 5 pg en la columna. El sistema de EM se usó en el modo de alta resolución (4 GHz) con una tensión de fragmentación de 350 V y un ajuste de Quad AMU de 300. Se obtuvo un espectro por segundo con un intervalo de obtención de 300-3200 uma en modo de EM positivo. Los espectros en bruto se desconvolucionaron usando un algoritmo de entropía máxima incorporado en el software MassHunter de Agilent Technologies con el complemento BioConfirm. El PM medido se comparó con el PM teórico determinado por la secuencia completa, teniendo en cuenta el posible truncamiento de la lisina C-terminal y la N-glicosilación.

[0358] Mediante el análisis por RP-HPLC-UV-EM se observó un aumento de la fragmentación de las muestras de hMQ22.101f/LC41 y hMQ22.101j/e incubadas durante 6 semanas a 37 °C en comparación con las muestras no sometidas a estrés. La cantidad de fragmentación fue similar a los perfiles de fragmentación observados para otros anticuerpos terapéuticos utilizados para estudios clínicos y es aceptable.

[0359] Ejemplo 12: Ensayo de trampa extracelular de neutrófilos humanos.

[0360] Se recogió sangre total en tubos de heparina sódica (Beckton Dickinson) de 2 donantes sanos diferentes. Se mezclaron 30 ml de sangre por donante con 15 ml de dextrano al 6 % en NaCl al 0,9 % y se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación se observaron dos capas claras, una capa inferior que contenía la mayoría de los eritrocitos y una capa superior que contenía los neutrófilos. La capa superior se recogió y se centrifugó 10 min a 300 g a TA. El sedimento se resuspendió en 25 ml de PBS y los neutrófilos se aislaron mediante centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare), seguida de una etapa de lisis eritrocitaria de 10 minutos a TA. Las células se contaron usando un citómetro de flujo Guava EasyCyte. Se sembraron 900.000 neutrófilos por pocillo en placas de cultivo tisular de 24 pocillos (Greiner bio-one) en tampón de ensayo de trampa extracelular de neutrófilos (NET) (medio RPMI 1640 con glutamax (Life Technologies)) complementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 1 % y CaCl<2>1 mM. Los neutrófilos se estimularon durante 4 horas con el ionóforo de calcio A23187 (Molecular Probes). El efecto de los anticuerpos reductores de NET se sometió a ensayo añadiendo uno de los siguientes anticuerpos a una concentración de 25 |jg/ml (hMQ22.101f/g, hMQ22.101f/LC41, hMQ22.101f/LC42 y anticuerpo de control de isotipo MQR2.201) o tampón de ensayo 15 min antes de A23187 las células. Después de 4 horas de incubación a 37 °C y CO2 al 5 %, las células se lavaron con mucha delicadeza dos veces usando el tampón de ensayo de NET. Posteriormente se digirió ADN extracelular con nucleasa S7 (7,5 U/0,5 ml) durante 15 min a 37 °C, después de lo cual se añadieron 10 j l de EDTA 500 mM para detener la digestión posterior. Se recogieron las NET de los pocillos y se centrifugaron durante 5 min a 20 g para eliminar las células intactas. La cantidad de NET se cuantificó mediante la medición de la actividad de MPO en la muestra añadiendo 50 j l de sustrato de 3,3',5,5'-Tetrametilbencidina (TMB) a 50 j l de NET recogidas. Después de una incubación de 10 min a TA se añadieron 50 j l de H<2>SO<4>, y se midió la densidad óptica a 450 nm. Las señales de fondo procedentes de neutrófilos, que no se han sometido a tratamiento con A23187, se restaron, y las señales de los neutrófilos tratados con A23187 MQR2.201 se establecieron como el 100 %. Las señales de todos los demás grupos tratados con anticuerpos se compararon con las del grupo tratado con A23187 MQR2.201 (Figura 7).

[0362] Sorprendentemente, el candidato a desarrollo hMQ22.101f/LC41 supera a hMQ22.101f/LC42 y al hMQ22.101f/g a una concentración de 25 jg/m l (n = 2). El anticuerpo mutante de isomerización no sólo mantuvo las propiedades del anticuerpo no mutado, sino que también las mejoró.

[0364] Ejemplo 13: Modelo experimental en ratón para inflamación.

[0366] El objetivo del estudio era someter a ensayo un intervalo de dosis-respuesta con el candidato a desarrollo designado hMQ22.101f/LC41 o hMQ22.101f/LC42 (en donde se eliminaron los problemas de isomerización), en comparación con un candidato anterior hMQ22.101f/g y el anticuerpo de control MQR2.201 emparejado con el isotipo en el modelo en ratón de artritis inducida por anticuerpos contra colágeno (AIAC). Se cuantificó la hinchazón de la pata y el tobillo.

[0367] El modelo en ratón de AIAC comercializado por ModiQuest Research B.V. (n.° de cat: MQ18.101) se usó de acuerdo con las especificaciones del fabricante para inducir artritis en ratones. Para este fin, se inyectaron por vía i.p. 2,8 mg de mezcla de anticuerpos contra el colágeno II en ratones DBA/J1. Tres días más tarde, los ratones recibieron otra inyección i.p. que contenía 25 jg de LPS para sincronizar la inflamación entre los ratones. Simultáneamente con el LPS, los ratones recibieron los tACPA hMQ22.101f/g, hMQ22.101f/LC41 o hMQ22.101f/LC42 (6,25, 12,5 y 25 mg/kg), anticuerpo de control emparejado con el isotipo no relacionado MQR2.201 (25 mg/kg) o placebo (solución salina fisiológica de NaCl al 0,9 %). Normalmente, la inflamación en las patas delanteras y traseras se hizo visible a partir de 2 días después de la inyección de LPS (es decir, el día 5). El grado de hinchazón de las patas se puntuó macroscópicamente desde el día 0, durante un período máximo de 13 días. La puntuación máxima del grado de hinchazón es 8 (dividido entre 4 patas). Para consultar el sistema de puntuación véase la tabla a continuación.

[0370]

[0373] Los resultados se muestran en laFigura 8. Los ratones tratados con un anticuerpo terapéutico mostraron una reducción significativa de la inflamación en sus patas de manera dependiente de la dosis, en comparación con ratones tratados con anticuerpo de control o solución salina fisiológica. Ambos anticuerpos con líderes optimizados hMQ22.101f/LC41 y hMQ22.101f/LC42 (en donde se eliminaron los problemas de isomerización) impidieron la inflamación incluso más que el anterior candidato líder hMQ22101f/g, lo que se demuestra claramente a una dosis de 25 mg/kg(Figura 8, panel superior). No se observaron efectos adversos. A la dosis más baja de 6,25 mg/kg(Figura 8, panel inferior), hMQ22.101f/LC41 superó a todos los demás anticuerpos, con valores p del ensayo t de Student el día 13 de p<0,001, p<0,05 y p=0,46 para hMQ22.101f/LC41, hMQ22.101f/LC42 y hMQ22.101f/g, respectivamente, en comparación con el grupo tratado con placebo.

[0375] Ejemplo 14: Caracterización adicional del candidato a desarrollo hMQ22.101f/LC41 en un ensayo de NET in vitro en ratón

[0377] Para reforzar adicionalmente la noción de que hMQ22.101f/LC41 es un inhibidor potente de la formación de NET, la unión de hMQ22.101f/LC41 a NET y pre-NET de ratón, así como la inhibición de la formación de NET en ratones se han estudiado como se establece a continuación. Las Pre-NET se definen como neutrófilos con una estructura nuclear amorfa descondensada que contiene cromatina citrulinada que aún aparece intracelularmente, que tienen una membrana nuclear colapsada.

[0378] El objetivo de este estudio era someter a ensayo si el candidato a desarrollo designado hMQ22.101f/LC41 es capaz de inhibir la formación de NET en ratones. Los neutrófilos se aislaron de médula ósea de ratones C57BL/6J mediante selección negativa usando el kit de enriquecimiento de neutrófilos de ratón EasySep™ (Stemcell Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La pureza de los neutrófilos aislados se comprobó mediante citometría de flujo usando un anticuerpo contra Ly6G (Biolegend) y fue superior al 90 %. Los neutrófilos de médula ósea aislados se ajustaron a una concentración de 2 * 106 células/ml en HBS<s>que contenía calcio y magnesio. Se añadió un total de 100 |jl de suspensión celular a cada pocillo de un portaobjetos de cámara de 8 pocillos (Thermo Fisher Scientific). Se dejaron incubar 25 jg/m l de hMQ22.101f/LC41, MQR2.201 o ningún anticuerpo con las células durante 15 min antes de añadir 150 j l de HBSS que contenía 1 jg/m l de A23187 o control de vehículo a las células. El portaobjetos se incubó durante 3 h a 37 °C y CO<2>al 5 %. Posteriormente, se añadió paraformaldehído al 2 % (v/v) (Merck) a cada pocillo y las preparaciones se incubaron durante 12 h a 4 °C. Las muestras se bloquearon con suero fetal de ternera al 10 % (FCS; Biochrome) en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Se añadió anticuerpo primario anticitH3 de conejo (Abcam, ab5103; 1:200), o IgG antihumano de cabra conjugado con TRITC (Jackson Immunoresearch, 109­ 025-003; 1:100) en FCS al 10 % en PBS durante 12 h a 4 °C. Los portaobjetos se lavaron tres veces con PBS y el anticuerpo secundario IgG anti-conejo de cabra conjugado con Cy5 (Jackson ImmunoResearch, 111-175-144; 1:400) se añadió durante 1,5 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Los portaobjetos se lavaron de nuevo tres veces con PBS. Se añadió una solución de tinción que contenía Hoechst 2,5 jM en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después del lavado con PBS, las muestras se incluyeron en medio de montaje (BIOZOL). Los portaobjetos se analizaron en un microscopio BZ-X710 (Keyence), y las NET y pre-NET se cuantificaron mediante el software de formación de imágenes Fiji(Figura 9A). En laFigura 9Bse muestran imágenes representativas que muestran la unión de hMQ22.101f/LC41 (hIgG; rojo) a n Et (flecha amarilla) y pre-NET (flecha blanca).

[0380] El tratamientoin vitrode neutrófilos derivados de médula ósea (MO) de ratón con hMQ22.101f/LC41 produjo una reducción de la extrusión de NET inducida por A23187 en comparación con los neutrófilos derivados de M<o>de ratón tratados con MQR2.201 (Fig. 9A). Además, hMQ22.101f/LC41 se une a NET de ratón expulsadas (Fig. 9B; flecha amarilla) y pre-NET (Fig 9B; flecha blanca), lo que podría ser la primera etapa hacia el aclaramiento de NET por los macrófagos.

[0382] Ejemplo 15: Caracterización adicional del candidato a desarrollo hMQ22.101f/LC41 en un ensayo de NET/macrófago in vivo de ratón usando el modelo en ratón de peritonitis inducida por pristano

[0384] La capacidad del candidato a desarrollo hMQ22.101f/LC41 para inhibir la formación de NETin vivose sometió a ensayo usando un modelo en ratón de influjo de células peritoneales inducido por pristano que se ha descrito previamente por Kienhoferet al.(JCI Insight 2017; 2(1): e92920).

[0386] En resumen, se administraron 50 mg/kg de MQR2.201 o hMQ22.101f/LC41 inmediatamente después de la inyección de 500 j l de aceite de pristano (Sigma-Aldrich), seguido de una segunda inyección de MQR2.201 o hMQ22.101f/LC41 50 mg/kg 12 horas después. Después de un total de 24 horas, se aislaron células inflamatorias del peritoneo, se ajustaron a 1 * 106 células/ml y se transfirieron a portaobjetos con cámara de flujo o portaobjetos cytospin para su análisis mediante microscopía de fluorescencia inmunitaria. Los portaobjetos se bloquearon posteriormente con PBS FCS al 10 % y se incubaron con anti-citH3 de conejo (Abcam, ab5103; 1:200), anti-NE de conejo (Abcam, ab21595; 1:200), F4/80 de rata antiratón conjugado con AF488 (Biolegend, 123120; 1:200) o IgG antihumano de cabra conjugado con TRITC (Jackson Immunoresearch, 109-025-003; 1:100). Los portaobjetos se lavaron tres veces con PBS y se añadió anticuerpo secundario IgG anti-conejo de cabra conjugado con Cy5 (Jackson ImmunoResearch, 111­ 175-144; 1:400) durante 1,5 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Los portaobjetos se lavaron de nuevo tres veces con PBS. Se añadió una solución de tinción que contenía Hoechst 2,5 jM en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después del lavado con PBS, las muestras se incluyeron en medio de montaje (BIOZOL). Los portaobjetos se analizaron en un microscopio BZ-X710 (Keyence)(Figura 10AyC), y las NET y pre-NET se cuantificaron mediante el software de formación de imágenes Fiji(Figura 10B). LaFigura 10Cmuestra la unión de hMQ22.101f/LC41 a NET y pre-NET. LaFigura 11muestra la captación de NET enriquecidas con hMQ22.101f/LC41 por macrófagos.

[0388] Se observa la disminución de filamentos de NET, que contienen ADN e Histona 3 citrulinada (citH3), en las células peritoneales de ratones tratados con hMQ22.101f/LC41 en comparación con las células peritoneales de ratones tratados con MQR2.201 (Fig. 10A). La cuantificación de NET (colocalización de citH3 y ADN (Hoechst)) confirmó esta observación (Fig. 10B). La colocalización de ADN y citH3 es un sello distintivo de la formación de NET. Además, hMQ22.101f/LC41 se une a NET de ratón expulsados, así como a pre-NET de ratón (Fig. 10C), lo que podría ser la primera etapa hacia el aclaramiento de NET por los macrófagos. De hecho, se observaron macrófagos positivos para F4/80 entre los infiltrados celulares, que contenían hMQ22.101f/LC41 fagocitado en combinación con citH3 o elastasa de neutrófilos (Fig. 11).

[0390] Ejemplo 16: Modelo de AR en ratón con AIC

[0392] Para investigar la eficacia del tACPA sobre el daño tisular inducido por NET, se usaron diferentes estrategias de tACPA cónico en un modelo en ratón de artritis inducida por colágeno (AIC) crónica.

[0393] Para inducir la artritis crónica, se diluyó Colágeno II bovino hasta una concentración de 2 mg/ml en ácido acético 0,05 M y se emulsionó en volúmenes iguales de adyuvante completo de Freund. El día 0, se inmunizaron ratones machos DBA/J1 de 10-12 semanas de edad por vía intradérmica en la base de la cola con 100 |jg de CII bovino. El día 21, los ratones recibieron inyecciones i.p. de refuerzo de 50 jg de CII bovino disuelto en PBS y la aparición de la artritis se produjo unos días después (Fig. 12A). Se consideró que los ratones tenían artritis cuando se observaron cambios significativos de enrojecimiento y/o hinchazón en los dedos o en otras partes de las patas. La inflamación articular en cada pata se puntuó como se ha descrito anteriormente (modelo en ratón por AIAC de AR). El tratamiento terapéutico se inició precozmente tras el inicio de la enfermedad (entre el día 21-28) cuando la puntuación media de artritis (PMA) era > 0,75 en una escala arbitraria de 0-8 (0-2 por pata). La administración terapéutica con cuatro inyecciones i.v. repetidas con cuatro días de diferencia con las dosis indicadas de hMQ22.101j/e (50/10/10/10, 30/30/30/10 y 50/50/50/15 mg/kg) redujo la PMA el día 14 en un 38 %, 52 % y 81 %, respectivamente, en comparación con 50/50/50/50 mg/kg de MQR2.201(Fig. 12B). Los ratones se sacrificaron el día 14 después del comienzo del tratamiento. Se recogieron las articulaciones del tobillo y la rodilla y se almacenaron en formol para su análisis histológico.

[0394] Cabe destacar que todos los tratamientos con hMQ22.101j/e impidieron el desarrollo de la enfermedad durante los primeros 8 días, después de lo cual la PMA empezó a subir, posiblemente debido al desarrollo de anticuerpos antifármaco en estos ratones. Sólo el tratamiento con hMQ22.101j/e 50/50/50/15 mg/kg estabilizó totalmente la enfermedad durante un total de 14 días, sin superar una PMA de 0,75.

[0396] Para seguir estudiando el efecto de tACPA sobre el daño óseo, se realizaron análisis radiográficos de las rodillas y los tobillos de todas las patas traseras desde las pauras de tratamiento con hMQ22.101j/e y MQR2.201. En línea con la PMA observada, todos los tratamientos con hMQ22.101j/e suprimieron el daño óseo tanto en tobillos como en rodillas (Fig. 12C). Para obtener más información sobre el efecto protector de tACPA, se realizó un análisis histológico de las articulaciones del tobillo, usando tinción con HyE y safranina O (SO). En comparación con los ratones tratados con MQR2.201, hMQ22.101j/e inhibió el influjo de células inflamatorias (Fig. 12D). Además, en comparación con los ratones tratados con MQR2.201, hMQ22.101j/e redujo significativamente la erosión ósea y cartilaginosa, así como el agotamiento de proteoglicanos del cartílago y la muerte de condrocitos (Fig. 12EaH). Estos datos indican que tACPA mitiga en gran medida los síntomas de la artritis, incluyendo el daño articular.

[0398] Después se investigó la presencia de neutrófilos y NET en las patas de ratones con AIC que recibieron 50/50/50/15 mg/kg de hMQ22.101j/e o 50/50/50/50 mg/kg de MQR2.201. El marcador de neutrófilos de ratón Ly6G, la histona citrulinada 3 (citH3) y la mieloperoxidasa (MPO) se demostraron en animales tratados con MQR2.201, mientras que estos marcadores estaban casi ausentes en ratones tratados con hMQ22.101j/e (Fig. 12I). Se usó DAPI como tinción de ADN nuclear y extracelular (Fig. 12I). La cuantificación de neutrófilos (Ly6G) y NET (colocalización de citH3 y MPO) se realizó mediante el análisis de múltiples articulaciones de la pata trasera derecha de cada animal, incluida la articulación tibiotarsiana, la articulación intertarsiana proximal, la articulación intertarsiana distal y la articulación tarsometatarsiana. En comparación con los ratones tratados con MQR2.201, se observó una menor cantidad tanto de neutrófilos (Fig. 12J) como de NET (Fig. 12K) en las articulaciones de ratones tratados con hMQ22. 101j/e. Se descubrió que la cantidad de NET en la articulación estaba significativamente correlacionada con la hinchazón macroscópica de la pata (Fig. 12L;r= 0,6120,P= 0,0041). Análogamente, se observó una correlación significativa entre la hinchazón de la pata y la presencia de neutrófilos en la articulación (Fig. 12M;r= 0,8729,P< 0,0001). Juntos, estos datos indican que el tratamiento con tACPA produce la erradicación de NET en tejido inflamadoin vivo,impidiendo de este modo una destrucción ósea y tisular grave.

[0400] Ejemplo 17: hMQ22.101j/e no se une a los leucocitos sanos

[0402] Se obtuvo sangre de voluntarios sanos (VS), recogida en tubos de litio-heparina, del banco de sangre Sanquin de Nimega, Países Bajos. Todos los donantes de sangre dieron su consentimiento informado. Se realizó una centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll para separar las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y los neutrófilos. Las PBMC se recogieron y se lavaron tres veces con RPMI 1640 complementado con suero fetal de ternera inactivado por calor (FCS) al 10 % (v/v) y penicilina-estreptomicina 50 U/ml (en lo sucesivo en el presente documento, RPMI al 10 %) para eliminar las plaquetas. La suspensión de neutrófilos/eritrocitos se mezcló con dextrano al 6 % (p/v) en NaCl al 0,9 % y se incubó durante 25 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se recogieron los neutrófilos, se expusieron al tampón de amonio-cloruro-potasio (ACK) durante 10 min a temperatura ambiente para la lisis de los eritrocitos sobrantes, y se lavaron dos veces con RPMI al 10 %.

[0404] Las PBMC y los neutrófilos se sembraron en una placa de 96 pocillos con fondo en V a una densidad de 2x105 células/pocillo en tampón de FACS. Las células se incubaron con Trustaína humana FcX (diluida 1:50 en tampón de FACS) durante 20 min a temperatura ambiente para bloquear los receptores de Fc. Posteriormente, las PBMC se incubaron durante 45 min a temperatura ambiente con una mezcla de anticuerpos que contenía HiLyteTMFluor 488 conjugado con hMQ22.101j/e 6,25 jg/ml, anti-CD3 0,17 jg/ml, anti-CD11c 1 jg/ml, anti-CD14 0,33 jg/ml, anti-CD20 0,17 jg/ml, anti-CD4583 ng/ml y anti-CD56 0,17 jg/ml, mientras que los neutrófilos se incubaron con una mezcla de anticuerpos que contenía hMQ22.101j/e conjugado con HiLyteTMFluor 488 6,25 jg/ml, anti-CD45 83 ng/ml y anti-CD66b 83 ng/ml. Como control positivo para la unión de HiLyteTMFluor 488 conjugado con hMQ22.101j/e, los neutrófilos se estimularon durante 45 min con A23187 5 jM antes del bloqueo de receptores de Fc. Después de la

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo o fragmento de unión del mismo que se une específicamente a un epítopo citrulinado en la histona 2A y/o la histona 4 humanas desiminadas, en donde el anticuerpo o fragmento de unión del mismo comprende: a) la CDR 1 de VL de la SEQ ID NO: 9 (QSLLDADGKTY); y

b) la CDR 1 de VH de la SEQ ID NO: 1 (GYTFTNYG), la CDR 2 de VH de la SEQ ID NO: 2 (INTYSGEA), la CDR 3 de VH de la SEQ ID NO: 3 (LRGYTYQS FDEGGDY), la CDR 2 de VL de la SEQ ID NO: 4 (LVS) y la CDR 3 de VL de la SEQ ID NO: 5 (WQGTHFPYT).

2. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión del mismo comprende:

a) CDR1 de VL de la SEQ ID NO: 9;

b) CDR2 de VL de la SEQ ID NO: 4 y CDR3 de VL de la SEQ ID NO: 5; y

c) la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 11 o 12.

3. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo o fragmento de unión del mismo comprende:

a) la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 11 y la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 16;

o

b) la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 12 y la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 16.

4. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos recombinantes, anticuerpos monocatenarios, fragmentos variables monocatenarios (scFv), fragmentos variables (Fv), fragmentos de regiones de unión a antígeno (Fab), diacuerpos y triacuerpos.

5. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es un anticuerpo de longitud completa, que comprende opcionalmente una región de Fc seleccionada de una región de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

6. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende una región constante de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 23 o 56, y/o una región constante de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 24.

7. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la reivindicación 6, en donde el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 11, la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 16, la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de la SEQ ID NO: 23 o 56, y la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena ligera de la SEQ ID NO: 24.

8. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores conjugado con un resto adicional.

9. Un polinucleótido que codifica el anticuerpo o fragmento de unión del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un vector de clonación o expresión que comprende dicho polinucleótido, o una célula hospedadora que comprende dicho vector de clonación o expresión.

10. Un proceso para la producción de un anticuerpo o fragmento de unión del mismo que se une específicamente a un epítopo citrulinado en la histona 2A y/o la histona 4 humanas desiminadas, que comprende cultivar una célula hospedadora de la reivindicación 9 y aislar el anticuerpo o fragmento de unión del mismo de dicha célula.

11. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y al menos un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable, y que comprende además opcionalmente otro principio activo.

12. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11, para su uso en terapia.

13. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11, para su uso en un método de tratamiento o prevención de una patología asociada a NET.

14. El anticuerpo, fragmento de unión o composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la patología asociada a NET es lupus eritematoso sistémico (LES), lupus, septicemia, vasculitis, artritis inflamatoria, artritis reumatoide y osteoartritis, psoriasis, enfermedad de Alzheimer, hepatitis autoinmunitaria, artritis idiopática juvenil, enfermedad de Sjogren, síndrome antifosfolipídico, enfermedad de Bechet, espondilitis, espondiloartropatía, atrofia de múltiples sistemas, enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy, asma, asma alérgica exacerbada por rinovirus, asma alérgica, fibrosis quística, fibrosis y fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad del ojo seco, uveítis, uveítis no granulomatosa, uveítis granulomatosa, dermatitis, dermatitis atópica, EPOC, bronquitis u otra patología asociada a NET, tal como cicatrización de heridas en diabetes, cáncer, metástasis de cáncer y salud de los órganos trasplantadosin vivooex vivo.

15. El anticuerpo, fragmento de unión o composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en donde el anticuerpo, fragmento de unión del mismo o composición farmacéutica se formula para la administración por una vía parenteral de administración tal como una vía intravenosa, subcutánea, intraocular, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, espinal o por inyección o infusión; o por otra vía de administración tal como rectal, oral, ocular, tópica, epidérmica, mucosa, local, peritumoral, yuxtatumoral, intratumoral, en el margen de resección de tumores, intralesional, perilesional, mediante infusión intracavitaria, administración intravesicular o por inhalación.