CN117396221A

CN117396221A - 嗜酸性粒细胞陷阱的抑制

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Publication number: CN117396221A
Application number: CN202280032619.3A
Authority: CN
Inventors: H·H·G·范埃斯; 雷纳托·赫拉尔杜斯·西尔瓦诺·奇里维; D·蒙蒂赞; E·C·梅尔德伦
Original assignee: Chitrell Private Ltd
Current assignee: Chitrell Private Ltd
Priority date: 2021-05-04
Filing date: 2022-05-04
Publication date: 2024-01-12

Abstract

本发明提供了用于抑制嗜酸性粒细胞胞外陷阱(EET)形成的方法。特别地，本发明提供用于在抑制或检测EET形成的方法中使用的针对含瓜氨酸表位的抗体或其结合片段。该方法可以用于诊断、治疗或预防包括EET相关病状的任何疾病或病症。

Description

嗜酸性粒细胞陷阱的抑制

技术领域

本发明提供了用于抑制嗜酸性粒细胞胞外陷阱(Eosinophil ExtracellularTrap，EET)形成的方法。特别地，本发明提供用于在抑制或检测EET形成的方法中使用的针对含瓜氨酸表位的抗体或其结合片段。该方法可以用于诊断、治疗或预防包括EET相关病状的任何疾病或病症。本发明还提供用于在治疗或预防肺部病症、特别是炎症性肺部病症的方法中使用的针对含瓜氨酸表位的抗体或其结合片段。所描述的针对含瓜氨酸表位的抗体或其结合片段也可以用于抑制嗜中性粒细胞胞外陷阱(Neutrophil Extracellular Trap，NET)形成、特别用于肺部病症。在一些实施方式中，嗜酸性粒细胞胞外陷阱(EET)形成和嗜中性粒细胞胞外陷阱(NET)形成都可以被抑制。

背景技术

嗜酸性粒细胞(Eosinophil)是循环白细胞的形式，通常占健康人类白细胞(WBC)的约1％至3％。它们在体内平衡和包括过敏和感染的各种疾病中具有广泛的作用。已经鉴定了活性溶细胞性嗜酸性粒细胞死亡的特殊机制释放嗜酸性粒细胞胞外陷阱(EET)和总细胞内容物。这被称为嗜酸性粒细胞胞外陷阱细胞死亡(eosinophil extracellular trapcell death，EETosis)。还已经表明，夏科-莱登晶体(Charcot-Leyden crystal)(嗜酸性粒细胞炎症的经典病理学标记物)与EETosis相关，并且已经报道EETosis和EET在多种疾病中存在。

特征在于嗜中性粒细胞胞外陷阱(NET)形成的表面类似方法已经在嗜中性粒细胞中被鉴定出，并且被称为NETosis。NET与各种病理学有关，并且在例如WO2009147201、WO2011070172、WO2016092082和WO2020038963中讨论了作为治疗的NET抑制。

尽管EETosis和NETosis具有一些共同的特征(诸如，类似的NADPH氧化酶依赖性过程、以及细胞核的形态学变化和浆/核膜破裂)，但也存在许多差异。例如，嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞在颗粒结构和形成的胞外陷阱方面具有差异。当嗜中性粒细胞经历NETosis时，颗粒在胞内分解，并且由此颗粒蛋白附着至NET。相比之下，在EETosis过程中，嗜酸性粒细胞中的大部分颗粒是完整的，从而产生游离的胞外颗粒和不含颗粒蛋白的EET。NET和EET均保留组蛋白(即染色质结构)，但由于染色质的蛋白酶修饰程度较小，EET的直径比NET大。已知(例如，由酶PAD4介导的)组蛋白瓜氨酸化在NET形成中发挥着关键作用，但是在EET形成中起类似重要作用的证据尚不确定。

鉴于这些差异，需要对EET/EETosis进行进一步研究以给出对在体内平衡和疾病发病机制中所发挥的作用、对EET形成的机制以及这可以如何被抑制的详细理解。换句话说，仍然需要用于治疗或预防EET相关病状的化合物。

鉴于嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞经常在肺部病症的潜在病状中发挥作用，特别是针对它们参与此类病症的方式还存在持续的需求。

发明内容

对于组蛋白的瓜氨酸化在EET形成中的作用存在冲突的证据。出人意料地，本发明人已经发现，与组蛋白2A和/或组蛋白4的氨基末端上的瓜氨酸化表位结合的抗体能够抑制EETosis，并且由此可以用于抑制EET形成的方法中。该方法可以用于治疗或预防EET相关病状。此类病状可以包括：皮肤的嗜酸性粒细胞疾病；呼吸道嗜酸性粒细胞疾病；胃肠嗜酸性粒细胞疾病；过敏性疾病；或蠕虫、真菌、病毒或细菌感染。此外，还可以治疗或预防动脉硬化。在另一实施方式中，还可以治疗血管炎。

鉴于EET和NET之间的差异，本发明人已经进一步出乎意料地发现，可以使用与组蛋白2A和/或组蛋白4的氨基末端上的瓜氨酸化表位结合的相同抗体(包括在相同症状下)抑制EET和NET两者的形成。本发明人还已经发现此类抗体可以用于治疗多种病症，包括肺疾病(lung disorder)、特别是炎性肺疾病(包括哮喘)。本发明人还已经发现此类抗体可以用于治疗涉及增加数量的浸润性嗜中性粒细胞的病症。本发明人进一步发现此类抗体可以用于治疗涉及增加数量的浸润性嗜酸性粒细胞的病症。

本发明人进一步发现与组蛋白2A和/或组蛋白4的氨基末端上的瓜氨酸化表位结合的相同抗体的方法在某些情况下可以提供比皮质类固醇更大的效果和/或不同的效果。因此，本发明还可以用于治疗对皮质类固醇没有显示出足够反应的个体。例如，本发明可以用于治疗具有皮质类固醇抗性病症的个体。还可以的是，该抗体和皮质类固醇组合使用使得两者相互增强，并且这代表了进一步的优选实施方式。在一种实施方式中，皮质类固醇是地塞米松。

结合至脱亚胺基(deiminated)人组蛋白2A和组蛋白4上的瓜氨酸化表位的代表性抗体在例如WO 2009147201、WO 2011070172、WO 2016092082以及WO 2020038963中进行了描述。这些文献中的每一个以及其中公开的抗体(包括重链和轻链两者的所有CDR序列、可变区序列和恒定区序列)通过引用并入本文。特别地，WO2016092082中命名为RhmAb2.102、RhmAb2.108、RhmAb2.109、RhmAb2.110、RhmAb2.111、RhmAb2.112、MQ22.101、MQ22.102和MQ22.101b/d的抗体及其任何抗原结合片段各自通过引用并入。类似地，WO2020038963中公开的具有hMQ22.101x/y格式的标识符的抗体及其任何抗原结合片段各自通过引用并入。WO2020038963中公开的抗体是特别优选的，并且在下文中更详细地讨论。WO2020038963中称为hMQ22.101f/LC41的抗体是最优选的。该抗体在本文中可以被描述为CIT-013。本发明提供了：

一种抑制或检测嗜酸性粒细胞胞外陷阱(EET)形成的方法，该方法包括向样品或受试者施用抗体或其结合片段，该抗体或其结合片段特异性地结合至脱亚胺基的人组蛋白2A和/或组蛋白4上的瓜氨酸化表位。样品或受试者优选是其中存在嗜酸性粒细胞的样品或受试者。

该方法可以用于预防或治疗受试者的疾病或病症，并且由此可以包括以预防或治疗有效量向受试者施用所述抗体或其结合片段。

疾病或病症通常包括EET相关的病状。疾病或病症可以是嗜酸性粒细胞疾病或病症。嗜酸性粒细胞疾病或病症可以包括：皮肤嗜酸性粒细胞疾病或病症；呼吸道嗜酸性粒细胞疾病或病症；胃肠嗜酸性粒细胞疾病或病症；过敏性疾病或病症；或蠕虫、真菌、病毒或细菌感染。

还提供了特异性地结合到脱亚胺基的人组蛋白2A和/或组蛋白4上的瓜氨酸化表位的抗体或其结合片段，该抗体或其结合片段用于在以上方法中使用，特别是用于在预防或治疗受试者的疾病或病症的上述方法中使用。还提供了特异性地结合到脱亚胺基的人组蛋白2A和/或组蛋白4上的瓜氨酸化表位的抗体或其结合片段，该抗体或其结合片段用于制造在以上用于预防或治疗受试者的疾病或病症的方法中使用的药物。在一种实施方式中，治疗动脉硬化。在另一实施方式中，治疗血管炎。

该方法可以替代地用于样品中EET形成的离体抑制或检测。该方法可以用于诊断EET相关病状的存在。

在一些实施方式中，该方法可以抑制嗜酸性粒细胞胞外陷阱(EET)和嗜中性粒细胞胞外陷阱(NET)的形成。

还提供了一种治疗或预防肺疾病的方法，该方法包括向患有所述肺疾病的受试者施用抗体或其结合片段，该抗体或其结合片段特异性地结合至脱亚胺基的人组蛋白2A和/或组蛋白4上的瓜氨酸化表位。

序列表的简要说明

抗体命名法

CDR＝互补决定区。

VH＝重链可变结构域。

VL＝轻链可变结构域。

CH＝重链恒定结构域。

CL＝轻链恒定结构域。

msVH22.101＝治疗性抗体的小鼠VH。

msVL22.101＝治疗性抗体的小鼠VL。

hVH22.101x＝治疗性抗体的人源化VH，‘x’是指重链。

hVL22.101y＝治疗性抗体的人源化VL，‘y’是指轻链。

hVH22.101(HC)x＝治疗性抗体的优化的人源化VH，‘(HC)x’是指重链。

hVL22.101(LC)y＝治疗性抗体的优化的人源化VL，‘(LC)y’是指轻链。

hMQ22.101x/y＝人源化治疗性抗体，‘x’是指重链，‘y’是指轻链。

hMQ22.101(HC)x/(LC)y＝本发明的优化的人源化治疗性抗体，‘(HC)x’指重链，‘(LC)y’指轻链。

附图说明

图1.(a)在无抗体、CIT-013或同种型对照存在的情况下，用A23187或PMA刺激形成EET的嗜酸性粒细胞的代表性图像；(b)在与图块(a)中相同的条件下刺激时，来自不同供体的嗜酸性粒细胞的样品中的EET形成水平的图示。

图2.tACPA抗体和地塞米松对由屋尘螨(house dust mite，HDM)过敏原诱发的气道炎症的小鼠模型的影响。(a)支气管灌洗中的嗜酸性粒细胞的水平；(b)支气管灌洗中的嗜中性粒细胞的水平；(c)作为ET的标记物的瓜氨酸化组蛋白3的水平；(d)血管周围嗜中性粒细胞的水平；(e)血管周围单核细胞的水平；和(f)细支气管嗜中性粒细胞的水平。

图3.用tACPA抗体治疗对气道炎症的小鼠模型的影响。(a)支气管灌洗中的dsDNA的浓度；(b)、(c)、(d)分别为石蜡包埋的肺组织中胞外citH3、胞外MPO、以及NET的水平；(e)、(f)、(g)分别为石蜡包埋的肺组织中嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞的数量；(h)石蜡包埋的肺组织中吞噬性巨噬细胞的百分比。

图4.CIT-013抑制由免疫复合物诱导的EETosis。(a)EETosis在未刺激的嗜酸性粒细胞、用免疫复合物刺激的嗜酸性粒细胞、在CIT-013存在下用免疫复合物刺激的嗜酸性粒细胞、以及在同种型对照抗体存在下用免疫复合物刺激的嗜酸性粒细胞中的代表性图像。(b)在CIT-013或同种型对照抗体存在下的EET的水平(作为细胞计数的％)，连同两种条件之间的差异(Δ)一起示出(n＝8个供体)。

具体实施方式

应当理解，所公开的发明的不同应用可以根据本领域的特定需求而定制。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述本发明的特定实施方式的目的，并不旨在进行限制。

此外，如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数指代物，除非该内容另外清楚地指出。因此，例如，提及“一种抗体”包括“多种抗体”等。

本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论是上文或下文中，均以引用方式全文并入本文。

适用于本发明的方法的抗体或其结合片段的靶标

瓜氨酸是在正常翻译过程中不会结合到蛋白质中的氨基酸，但它可能是通过脱亚胺酶(诸如肽基精氨酸脱亚胺酶)(PAD；EC 3.5.3.15)对精氨酸残基进行翻译后修饰而产生的。在哺乳动物(人、小鼠和大鼠)中，迄今为止已经确定了五种PAD同种型(PAD1-PAD6；‘PAD4’和‘PAD5’用于相同的同种型)，每种由不同基因编码。因此，术语脱亚胺基(demination)和瓜氨酸化可以互换使用。人组蛋白2A和/或组蛋白4的瓜氨酸化可以典型地通过例如PAD2和PAD4进行。这些组蛋白的瓜氨酸化与NET的病理形成相关，但在本发明之前，没有确凿的证据表明与EET的病理形成有类似的联系。

适合用于本发明的方法的抗体或其结合片段特异性地结合至在脱亚胺基的人组蛋白2A和/或组蛋白4上的瓜氨酸化表位。抗体还可以特异性地结合至在脱亚胺基的人组蛋白H3上的瓜氨酸化表位。抗体或其结合片段可以特异性地结合至在脱亚胺基的人组蛋白2A和/或组蛋白4上的瓜氨酸化表位，其中，该表位包含选自由SEQ ID NO:18、19、20、21和22组成的组中的肽。抗体或其结合片段还可以结合至包含SEQ ID NO:53或54的肽的表位。

抗体或其结合片段

如在本文所使用的术语“一种抗体”、“多种抗体”或“其结合片段”是指能够特异性结合至通常被称为“抗原”的靶分子的结构，优选蛋白质或多肽结构。

如在本文所使用的抗体分子是指抗体或其结合片段。如在本文所使用的术语“抗体”通常涉及完整的(全部的)抗体，即包含两条重链和两条轻链的要素。抗体可以还包含另外的结合结构域，例如依照如WO 2007/024715中所公开的DVD-Ig的分子，或在WO 2011/030107中描述的所谓的(FabFv)₂Fc。由此，如本文所用的“抗体”包括单价全长抗体、二价全长抗体、三价全长抗体或四价全长抗体。

抗体的结合片段包括单链抗体(即全长重链和全长轻链)；Fab、修饰的Fab、Fab'、修饰的Fab'、F(ab')2、Fv、Fab-Fv、Fab-dsFv、单结构域抗体(例如，VH或VL或VHH)、scFv、单价抗体、二价抗体、三价抗体或四价抗体、双-scFv、双抗体(diabody)、三体(tribody)、三抗体(triabody)、四体(tetrabody)和上述任何一种的表位结合片段(参见例如Holliger P和Hudson PJ，2005，Nat.Biotechnol.，23，：1126-1136；Adair JR和Lawson ADG，2005，药物设计综述-在线(Drug Design Reviews-Online)，2，209-217)。用于创建和制造这些抗体片段的方法在本领域中是众所周知的(参见例如Verma R等人，1998，J.Immunol.Methods，216，165-181)。Fab-Fv形式首次公开于WO 2009/040562中，其二硫化物稳定化的版本Fab-dsFv首次公开于WO 2010/035012中。用于本发明的其他抗体片段包括Fab和Fab'片段。多价抗体可以包括多种特异性，例如双特异性，或可以是单特异性的。

抗体或其结合片段可以选自由以下各项组成的组：单链抗体、单链可变片段(scFv)、可变片段(Fv)、片段抗原结合区(Fab)、重组抗体、单克隆抗体、包含天然抗体或适配体的抗原结合结构域的融合蛋白、单结构域抗体(sdAb)-也称为VHH抗体、纳米抗体(骆驼科动物衍生的(Camelid-derived)单结构域抗体)、称为VNAR的鲨鱼IgNAR衍生的单结构域抗体片段、双抗体、三抗体、抗运载蛋白(Anticalin)、适配体(DNA或RNA)及其活性组分或片段。

具有IgG1重链和轻链的IgG1(例如IgG1/κ)抗体可以有利地用于本发明中。然而，本发明也涵盖其他人抗体同种型，包括IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD和IgE与κ或λ轻链的组合。而且，各种同种型的所有动物来源的抗体可以用于本发明。抗体可以是全尺寸抗体或抗体的抗原结合片段，包括Fab、F(ab')2、单链Fv片段或单结构域VHH、VH单结构域或VL单结构域。

在上下文中，术语“特异性结合至瓜氨酸”或“特异性结合至瓜氨酸化表位”是指抗体或其结合片段结合至含有瓜氨酸残基的肽等结构，而抗体或其结合片段与含有精氨酸残基而不是瓜氨酸残基的相同结构结合强度较低或优选根本不结合。术语肽应被解释为一种结构，其能够在合适的背景下呈现瓜氨酸残基，从而与如本文所描述的抗体或其结合片段产生免疫反应性，优选在与其在人或动物体中出现的相同背景下，优选在天然多肽的背景中呈现。

适合用于本发明的方法中的抗体或其结合片段特异性地结合到脱亚胺基的人组蛋白2A和/或组蛋白4上的瓜氨酸化表位。抗体或其结合片段与脱亚胺基的人组蛋白2A和/或组蛋白4上的瓜氨酸化表位的结合阻断EET的形成。组蛋白的瓜氨酸化与EET的形成有关。

EET形成的阻断可以是完全的，也可以是部分的。例如，抗体或其结合片段可以将EET的形成减少10％至50％、至少50％、或者至少70％、80％、90％、95％或99％。EET阻断可以通过任何合适的手段进行测量，例如通过体外测量EETosis(Fukuchi等人，“如何检测嗜酸性粒细胞ETosis(EETosis)和胞外陷阱(How to detect eosinophil ETosis(EETosis)and extracellular traps)”；Allergology International，第70卷，2021年第1期，第19-29页)。

术语“结合活性”和“结合亲和力”旨在指抗体分子结合或不结合至靶标的趋势。结合亲和力可以通过确定抗体及其靶标的解离常数(Kd)来定量。类似地，抗体与其靶标结合的特异性可以根据抗体对其靶标的比较解离常数(Kd)与相对于抗体和另一种非靶标分子的解离常数进行比较来定义。

典型地，抗体相对于靶标的Kd将比相对于其他非靶标分子(诸如，环境中的无关材料或伴随材料)的Kd小2倍、优选5倍、更优选10倍。更优选地，Kd将小50倍，甚至更优选小100倍，并且还更优选小200倍。

该解离常数的值可以通过公知的方法直接确定，并且即使对于复杂混合物也可以通过例如Caceci MS和Cacheris WP(1984，Byte，9，340-362)中所描述的方法来计算。例如，Kd可以使用诸如Wong I和Lohman TM(1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，5428-5432)公开的双过滤器硝化纤维过滤器结合测定法、或者例如通过使用Octet表面等离子体共振来建立。

一种评估对脱亚胺基的人组蛋白2A和/或组蛋白4的结合亲和力的方法是通过ELISA。评估配体(诸如，抗体)对靶标的结合能力的其他标准测定是本领域已知的，包括例如蛋白质印迹(Western blot)、RIA和流式细胞术分析。抗体的结合动力学(例如，结合亲和力)也可以通过本领域已知的标准测定，诸如表面等离子体共振评估，例如通过Biacore^TM系统分析来评估。

优选地，抗体对于脱亚胺基的人组蛋白2A和/或组蛋白4具有1nM或更小的结合亲和力。优选地，本发明的抗体对于脱亚胺基的人组蛋白2A和/或组蛋白4和/或脱亚胺基的人组蛋白H3具有0.5nM或更低、0.1nM或更低、50pM或更低、10pM或更低、5pM或更低、2pM或更低或1pM或更低的结合亲和力。

抗体或其结合片段还可以是包含天然抗体或适配体(诸如，呈DNA或RNA形式的适配体)的抗原结合结构域的融合蛋白。

优选地，抗体是单克隆抗体。单克隆抗体是彼此相同的免疫球蛋白分子，并且对特定表位具有单一结合特异性和亲和力。本发明的单克隆抗体(mAb)可以通过多种技术来产生，包括常规的单克隆抗体方法，例如在“单克隆抗体：技术手册(Monoclonal Antibodies:a manual of techniques)”(Zola H，1987，CRC Press)和“单克隆杂交瘤抗体：技术和应用(Monoclonal Hybridoma Antibodies:techniques and applications)”(Hurrell JGR，1982CRC Press)中公开的那些。

在本发明的方法中使用的抗体或其结合片段包含结合结构域。结合结构域将通常包含6个CDR(在VHH的情况下为3个)，3个来自重链并且3个来自轻链。在一种实施方式中，CDR在框架中并且一起形成可变区或可变结构域。因此，在一种实施方式中，抗体或结合片段包含对抗原特异性的结合结构域，该结合结构域包含轻链可变区或可变结构域和重链可变区或可变结构域。

抗体可变结构域中的残基通常根据IMGT进行编号(http://www.imgt.org)。该系统在Lefranc MP(1997，J，Immunol.Today，18，509)中进行了阐述。除非另有说明，否则在本说明书中使用该编号系统。

IMGT残基命名并不总是直接与氨基酸残基的线性编号相对应。实际的线性氨基酸序列可以包含比在严格的IMGT编号中更少或额外的氨基酸，其对应于基本可变结构域结构的结构组分(无论是框架还是CDR)的缩短或插入。对于给定的抗体，可以通过将抗体序列中的同源性残基与“标准”IMGT编号序列进行比对来确定残基的正确IMGT编号。

根据IMGT编号系统，重链可变结构域的CDR位于残基27-38(VH的CDR1)、残基56-65(VH的CDR2)以及残基105-117(VH的CDR3)处。

根据IMGT编号系统，轻链可变结构域的CDR位于残基27-38(VL的CDR1)、残基56-65(VL的CDR2)以及残基105-117(VL的CDR3)处。

合适的抗体或其结合片段可以通过其重链和轻链CDR、其重链或轻链可变区和/或其全长重链和全长轻链的主要氨基酸序列在本文中公开。

用于本发明的方法中的优选抗体或其结合片段包含特异性地结合至脱亚胺基的人组蛋白2A和/或组蛋白4上的瓜氨酸化表位的抗体或其结合片段的修饰的VL CDR1，该修饰的VL CDR1相对于包含未修饰形式的VL的CDR1的抗体或其结合片段为抗体或其结合片段提供改进的特性。未修饰的VL CDR1包含氨基酸序列QSLLDDGKTY(SEQ ID NO:36)或QSLVDSDGKTY(SEQ ID NO:37)或由氨基酸序列QSLLDDGKTY(SEQ ID NO:36)或QSLVDSDGKTY(SEQ ID NO:37)组成。因此，用于本发明方法的抗体或其结合片段优选不包括SEQ ID NO:36或37的VL CDR1，但是包括这样的VL CDR 1的抗体仍然适用于这样的用途。

抗体或其结合片段的VL链的修饰的CDR1可以包含氨基酸序列QSL-X₁-D-X₂-D-X₃-KTY或由氨基酸序列QSL-X₁-D-X₂-D-X₃-KTY组成，其中，X₁是V或L，X₂是T、S、A或N，并且X₃是G或A，条件是该氨基酸序列不是QSLLDDGKTY(SEQ ID NO:36)或QSLVDSDGKTY(SEQ ID NO:37)。与未修饰的SEQ ID NO:36或37的CDR1相比，抗体或其结合片段的VL链的修饰的CDR1显示出降低的异构化，但是保持了未修饰的CDR1的结合性能。

特定抗体或其结合片段的VH的CDR的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、2和3所示。VL的CDR 2和CDR 3显示在SEQ ID NO:4和5中。

特定抗体或其结合片段的VH和VL的氨基酸序列在SEQ ID NO:11和13中给出。VH的CDR如SEQ ID NO:1、2和3所示。VL的CDR如SEQ ID NO:6、4和5所示。

另一抗体或其结合片段的VH和VL的氨基酸序列在SEQ ID NO:11和14中给出。VH的CDR如SEQ ID NO:1、2和3所示。VL的CDR如SEQ ID NO:7、4和5所示。

另一抗体或其结合片段的VH和VL的氨基酸序列在SEQ ID NO:11和15中给出。VH的CDR如SEQ ID NO:1、2和3所示。VL的CDR如SEQ ID NO:8、4和5所示。

另一抗体或其结合片段的VH和VL的氨基酸序列在SEQ ID NO:11和16中给出。VH的CDR如SEQ ID NO:1、2和3所示。VL的CDR如SEQ ID NO:9、4和5所示。

另一抗体或其结合片段的VH和VL的氨基酸序列在SEQ ID NO:11和17中给出。VH的CDR如SEQ ID NO:1、2和3所示。VL的CDR如SEQ ID NO:10、4和5所示。

另一抗体或其结合片段的VH和VL的氨基酸序列在SEQ ID NO:12和13中给出。VH的CDR如SEQ ID NO:1、2和3所示。VL的CDR如SEQ ID NO:6、4和5所示。

另一抗体或其结合片段的VH和VL的氨基酸序列在SEQ ID NO:12和14中给出。VH的CDR如SEQ ID NO:1、2和3所示。VL的CDR如SEQ ID NO:7、4和5所示。

另一抗体或其结合片段的VH和VL的氨基酸序列在SEQ ID NO:12和15中给出。VH的CDR如SEQ ID NO:1、2和3所示。VL链的CDR如SEQ ID NO:8、4和5所示。

另一抗体或其结合片段的VH和VL的氨基酸序列在SEQ ID NO:12和16中给出。VH的CDR如SEQ ID NO:1、2和3所示。VL的CDR如SEQ ID NO:9、4和5所示。

另一抗体或其结合片段的VH和VL的氨基酸序列在SEQ ID NO:12和17中给出。VH的CDR如SEQ ID NO:1、2和3所示。VL的CDR如SEQ ID NO:10、4和5所示。

抗体可以包含SEQ ID NO:11的重链可变结构域氨基酸序列、SEQ ID NO:16的轻链可变结构域氨基酸序列、包含SEQ ID NO:23或56的重链恒定区氨基酸序列、以及SEQ IDNO:24的轻链恒定区氨基酸序列。

抗体可以包含SEQ ID NO:11的重链可变结构域氨基酸序列、SEQ ID NO:16的轻链可变结构域氨基酸序列、SEQ ID NO:23或56的重链恒定区氨基酸序列、以及SEQ ID NO:24的轻链恒定区氨基酸序列。

抗体或其结合片段可以包含如上所描述的任何一种特异性抗体的一个或多个CDR序列，除了VL的CDR1总是以包含氨基酸序列QSL-X₁-D-X₂-D-X₃-KTY或由氨基酸序列QSL-X₁-D-X₂-D-X₃-KTY组成的形式存在(其中X₁是V或L，X₂是T、S、A或N，并且X₃是G或A，条件是氨基酸序列不是QSLLDSDGKTY(SEQ ID NO:36)或QSLVDSDGKTY(SEQ ID NO:37))，或者包含SEQ IDNO:6、7、8、9或10或者由SEQ ID NO:6、7、8、9或10组成。

抗体或其结合片段可以包含所述特异性抗体的一个或多个VH CDR序列，以及替代地或另外地，除VL CDR1之外的一个或多个VL CDR序列。抗体或其结合片段可以包含如上所描述的特异性抗体或其结合片段的VH CDR序列中的一个、两个或所有三个，以及可替代地或另外地，所述特异性抗体或其结合片段的VL链CDR序列中的一个、两个或所有三个，包括VL CDR1。抗体或其结合片段可以包含如上所描述的特异性抗体或结合片段的全部六个CDR序列。例如，抗体可以包含SEQ ID NO:6、7、8、9或10中的一个和SEQ ID NO:1、2、3、4和5中的一个或多个。

抗体或其结合片段的VL链的修饰的CDR1可以包含氨基酸序列QSL-Z₁-Z₂-Z₃-Z₄-Z₅-KTY或由QSL-Z₁-Z₂-Z₃-Z₄-Z₅-KTY组成，其中，Z₁是V或L，Z₂是D或E，Z₃是T、S、A或N，Z₄是D、E、S或A并且Z₅是G或A，其条件是氨基酸序列不是QSLLDSDGKTY(SEQ ID NO:36)或QSLVDSDGKTY(SEQ ID NO:37)。与未修饰的SEQ ID NO:36或37的CDR1相比，抗体或其结合片段的VL链的修饰的CDR1显示出降低的异构化，但是保持了未修饰的CDR1的结合性能。本发明的抗体或其结合片段的VL链的修饰CDR1可以包含SEQ ID NO:6、7、8、9、10、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或52，或由其组成。抗体可以包含SEQ ID NO:6、7、8、9、10、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或52中的一个，以及SEQ ID NO:1、2、3、4和5中的一个或多个。抗体可以包含SEQ ID NO:6、7、8、9、10、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或52中的一个，以及SEQID NO:1、2、3、4和5中的全部。

适合用于本发明的方法的抗体或其结合片段可以可替代地包含这些重链可变结构域中的一种或VL的CDR2或CDR3中的CDR序列的变体。例如，变体可以是任何上述氨基酸序列的取代、缺失或添加变体。

变体抗体可以相对于如上所述的特定序列和片段包含1、2、3、4、5、高达10、高达20、高达30或更多的氨基酸取代和/或缺失，同时保持本文所描述的抗体的活性。“缺失”变体可以包括例如1、2、3、4或5个单独的氨基酸或一个或多个氨基酸小组(如2、3、4或5个氨基酸)的缺失。“氨基酸小组(small groups of amino acids)”可以定义为彼此连续，或者非常接近但不连续的。“取代”变体优选地涉及用相同数量的氨基酸替换一个或多个氨基酸并且进行保守氨基酸取代。例如，氨基酸可以被具有类似性质的替代氨基酸取代，例如，另一碱性氨基酸、另一酸性氨基酸、另一中性氨基酸、另一带电荷的氨基酸、另一亲水性氨基酸、另一疏水性氨基酸、另一极性氨基酸、另一芳香族氨基酸、另一脂肪族氨基酸、另一微小(tiny)氨基酸、另一小氨基酸或另一大氨基酸。可用于选择合适的取代基的20种主要氨基酸的一些性质如下：

Ala	脂肪族、疏水性、中性	Met	疏水性、中性
				Cys	极性、疏水性、中性	Asn	极性、亲水性、中性
Asp	极性、亲水性、带电(-)	Pro	疏水性、中性
				Glu	极性、亲水性、带电(-)	Gln	极性、亲水性、中性
Phe	芳香族、疏水性、中性	Arg	极性、亲水性、带电(+)
				Gly	脂肪族、中性	Ser	极性、亲水性、中性
His	芳香族、极性、亲水性、带电(+)	Thr	极性、亲水性、中性
				Ile	脂肪族、疏水性、中性	Val	脂肪族、疏水性、中性
Lys	极性、亲水性、带电(+)	Trp	芳香族、疏水性、中性
				Leu	脂肪族、疏水性、中性	Tyr	芳香族、极性、疏水性

优选的“衍生物”或“变体”包括其中在序列中出现的氨基酸是其结构类似物而不是天然存在的氨基酸的那些。在序列中使用的氨基酸也可以是衍生的或修饰的，例如标记的，条件是抗体的功能不会显著受到不利影响。

如上所描述的衍生物和变体可以在抗体的合成过程中或通过生产后修饰制备，或当抗体处于重组形式时，使用已知的定点诱变、随机诱变或核酸的酶切和/或连接技术制备。

优选地，变体抗体具有与本文公开的抗体的VL和/或VH或其片段具有超过60％、或超过70％、例如75％或80％、优选超过85％、例如超过90％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸同一性的氨基酸序列。取决于全长多肽的大小，可以跨相关SEQ ID NO序列的全长或序列的一部分，诸如跨20、30、50、75、100、150、200或更多个氨基酸看到这种水平的氨基酸同一性。

优选地，变体抗体包含一个或多个如本文所描述的CDR序列。

关于氨基酸序列，“序列同一性”是指当使用Clustal W(Thompson JD等人，1994，Nucleic Acid Res.，22，4673-4680)利用以下参数评估时具有所述的值的序列：

成对比对参数-方法(Pairwise alignment parameters-Method)：慢速/精确，矩阵：PAM，空位开放罚分：10.00，空位延伸罚分：0.10；

多序列比对参数-矩阵(Multiple alignment parameters-Matrix)：PAM，空位开放罚分：10.00，延迟的同一性％：30，罚分末端空位(Penalize end gaps)：打开(on)，空位间隔距离：0，负矩阵：否，空位延伸罚分：0.20，残基特异性空位罚分：打开，亲水性空位罚分：打开，亲水残基：G、P、S、N、D、Q、E、K、R。在特定残基处的序列同一性旨在包括已经简单衍生化的相同残基。

本发明的方法可以使用具有特异性VH和VL氨基酸序列的抗体及其变体和片段，该变体和片段维持这些VH和VL的功能或活性。

因此，本发明的方法可以使用包含VH变体的抗体或其结合片段，这些变体保留了特异性结合人脱亚胺基的人组蛋白2A和/或组蛋白4上的瓜氨酸化表位的能力。重链的变体可以与未修饰的VH具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性。VH的变体可以包括hVH22.101f或hVH22.101HC9(分别是SEQ ID NO:11和12)的至少7个氨基酸的片段，其中，抗体或其结合片段保留与脱亚胺基的人组蛋白2A和/或组蛋白4上的瓜氨酸化表位特异性反应的能力；或VH的变体可以包括与hVH22.101f或hVH22.101HC9(分别是SEQ ID NO:11和12)的序列具有至少70％氨基酸序列一致性的hVH22.101f或hVH22.101HC9(分别是SEQ ID NO:11和12)的变体，其中，抗体或其结合片段保留与脱亚胺基的人组蛋白2A和/或组蛋白4上的瓜氨酸化表位特异性反应的能力。

结合至脱亚胺基(deiminated)的人组蛋白2A和组蛋白4上的瓜氨酸化表位的代表性抗体在例如WO 2009147201、WO 2011070172、WO 2016092082以及WO 2020038963中进行了描述。这些文献中的每一个以及其中公开的抗体(包括重链和轻链两者的所有CDR序列、可变区序列和恒定区序列)通过引用并入本文。特别地，WO2016092082中命名为RhmAb2.102、RhmAb2.108、RhmAb2.109、RhmAb2.110、RhmAb2.111、RhmAb2.112、MQ22.101、MQ22.102和MQ22.101b/d的抗体及其任何抗原结合片段各自通过引用并入。类似地，WO2020038963中公开的具有hMQ22.101x/y形式的标识符的抗体及其任何抗原结合片段各自通过并入。WO2020038963中公开的抗体是特别优选的，并且在下文中更详细地讨论。WO2020038963中称为hMQ22.101f/LC41的抗体是最优选的。该抗体在本文中可以被描述为CIT-013。

多核苷酸、载体和宿主细胞

本发明还包括编码在本文所描述的抗体或其结合片段的多核苷酸、载体和表达载体。

本发明还涉及编码如在本文所描述的任何抗体或片段的多核苷酸。术语“核酸分子”和“多核苷酸”在本文中可互换地使用，并且是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其类似物的聚合形式。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、信使RNA(mRNA)、cDNA、基因组DNA、重组多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以以分离或纯化的形式提供。

“编码”选择的多肽的核酸序列是核酸分子，当置于适当的调节序列的控制下时，该核酸分子在体内转录(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)成多肽。编码序列的边界由5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端的翻译终止密码子决定。为了本公开的目的，这样的核酸序列可以包括但不限于来自病毒、原核或真核mRNA的cDNA，来自病毒或原核DNA或RNA的基因组序列，甚至合成DNA序列。转录终止序列可以位于编码序列的3'。在一种实施方式中，多核苷酸包含编码如上所描述的VH或VL氨基酸序列的序列。多核苷酸可以编码如在本文所公开的特异性抗体或其结合片段的VH或VL序列。

因此，抗体或其结合片段可以由编码并且能够表达其的多核苷酸产生或以多核苷酸的形式递送。在抗体包含两条或更多条链的情况下，多核苷酸可以编码一条或多条抗体链。例如，多核苷酸可以编码抗体轻链、抗体重链或两者。可以提供两种多核苷酸，其中一种编码抗体轻链，另一种编码相应的抗体重链。这样的多核苷酸或一对多核苷酸可以一起进行表达，从而产生抗体。

多核苷酸可以根据本领域公知的方法合成，例如在Sambrook J等人(1989，Molecular cloning:a laboratory manual；Cold Spring Harbor:New York:Cold SpringHarbor laboratory Press)中所描述。

本发明的核酸分子可以以表达盒的形式提供，该表达盒包括可操作地连接至插入序列的控制序列，从而允许本发明的抗体在体内表达。这些表达盒进而典型地在载体(例如，质粒或重组病毒载体)内提供。此类表达盒可以直接给予宿主受试者。可替代地，可以将包含多核苷酸的载体给予宿主受试者。优选地，使用遗传载体制备和/或施用多核苷酸。适合的载体可以是能够携带足够量的遗传信息并且允许多肽(诸如以上定义的抗体或其结合片段)表达的任何载体。

还公开了包含此类多核苷酸序列的表达载体。此类表达载体在分子生物学领域中是常规构建的，并且可以涉及例如使用质粒DNA和适当的起始子、启动子、增强子和其他元件(例如像聚腺苷酸化信号)，这些可以是必要的，并且定位在正确的方向上，以允许表达本发明的肽。其他合适的载体对于本领域技术人员来说是显而易见的。在此方面，再例如，我们参考Sambrook J等人(1989,Molecular cloning:a laboratory manual；冷泉港：纽约：冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor:New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress))。

本领域技术人员可使用本文所描述的序列来克隆或产生诸如如下文实例中所描述的cDNA或基因组序列。将这些序列克隆到适当的真核表达载体(像pcDNA3(Invitrogen))或其衍生物中，并且随后联合含合适的轻链和重链的载体转染哺乳动物细胞(像CHO细胞)将导致在本文所描述的抗体的表达和分泌。

技术人员还可以通过使用抗体序列的特异性结合域制备如在本文所描述的抗体或其结合片段的类似物并且在不同的环境下表达它们，诸如多肽，诸如融合蛋白。这在本领域中是众所周知的。

还公开了已经被修饰以表达抗体的细胞。此类细胞包括瞬时的、或优选稳定的高等真核细胞系(诸如，哺乳动物细胞或昆虫细胞)、低等真核细胞(诸如酵母)，或原核细胞，诸如细菌细胞。可以通过插入编码本发明的抗体的载体或表达盒来修饰的细胞的具体实例包括哺乳动物HEK293、CHO、HeLa、NS0和COS细胞。优选地，所选择的细胞系将是不仅稳定而且允许成熟糖基化的细胞系。

此类细胞系可以使用常规方法培养以产生抗体或其结合片段，或可以用于治疗或预防以将抗体或其结合片段递送至受试者。可替代地，本发明的多核苷酸、表达盒或载体可以离体给予来自受试者的细胞，并且然后将该细胞返回到受试者的体内。

本文公开了一种用于生产特异性地结合到脱亚胺基的人组蛋白2A和/或组蛋白4上的瓜氨酸化表位的抗体或其结合片段的方法，该方法包括培养如在本文所公开的宿主细胞并且从所述细胞分离抗体或其结合片段。

药物组合物

当用于本发明的方法中时，如以上所定义的抗体或结合片段可以作为包含抗体或其结合片段的药物组合物来提供。本发明因此涵盖用于在本发明的方法中使用的药物组合物，这些药物组合物包含抗体或其结合片段和药学上可接受的载体。

如在本文所使用，“药学上可接受的载体”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适于肠胃外，例如静脉内、眼内、肌内、皮下、皮内或腹膜内施用(例如，通过注射或输注)。在某些实施方式中，药学上可接受的载体包括至少一种选自由以下组成的组中的载体：共溶剂溶液、脂质体、胶束、液晶、纳米晶体、纳米颗粒、乳液、微粒、微球、纳米球、纳米胶囊、聚合物或聚合载体、表面活性剂、悬浮剂、络合剂(诸如，环糊精)或吸附分子(诸如，白蛋白)、表面活性颗粒、以及螯合剂。在进一步实施方式中，多糖包括透明质酸及其衍生物、葡聚糖(dextran)及其衍生物、纤维素及其衍生物(例如，甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素(cellulose acetate phthalate)、乙酸丁二酸纤维素(cellulose acetate succinate)、乙酸丁酸纤维素(cellulose acetate butyrate)、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素(hydroxypropylmethyl-cellulose phthalate))、壳聚糖及其衍生物、[β]-葡聚糖、阿拉伯木聚糖、角叉菜胶、果胶、糖原、褐藻糖胶、软骨素、皮肤素、类肝素(heparan)、肝素(heparin)、戊聚糖、角质素、藻酸盐、环糊精、以及它们的盐和衍生物，包括酯和硫酸盐。

优选的药学上可接受的载体包括水性载体或稀释剂。可以用于本发明的药物组合物中的适合的水性载体的实例包括水、缓冲水和盐水。其他载体的实例包括乙醇、多元醇(诸如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(诸如，橄榄油)和可注射有机酯(诸如，油酸乙酯)。可以例如通过使用包衣材料(诸如，卵磷脂)、在分散体的情况下通过保持所需的颗粒尺寸、以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(诸如，甘露醇、山梨醇)、或氯化钠。

药物组合物可以包括药学上可接受的抗氧化剂。这些组合物还可以含有佐剂，诸如，防腐剂、润湿剂、乳化剂以及分散剂。预防微生物的存在可以通过以上灭菌程序和通过包括各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)来确保。还期望在组合物中包括等渗剂(诸如，糖、氯化钠)等。此外，可注射药物形式的延长吸收可以通过包含延迟吸收的试剂(诸如，单硬脂酸铝和明胶)引起。

治疗组合物通常必须是无菌的并且在制造和储存条件下是稳定的。药物组合物可以配制成溶液、微乳液、脂质体、或适合于高药物浓度的其他有序结构。

无菌可注射溶液可以根据需要将所需量的活性剂(诸如，抗体)与以上列举的一种或多种成分一起掺入适当溶剂中，然后进行灭菌微滤来制备。通常，通过将活性剂掺入无菌载体中来制备分散体，该无菌载体包含基本(basic)分散介质和来自以上列举的那些的所需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性剂粉末以及来自其先前无菌过滤的溶液的任何另外的所期望的成分。

药物组合物可以包含另外的活性成分以及如上定义的抗体。如上所提及，本发明的组合物可以包含一种或多种抗体。它们还可以包含另外的治疗剂或预防活性剂。

取决于施用途径，抗体或其结合片段可以包被在材料中以保护抗体免受酸和其他可能使抗体失活或变性的自然条件的作用。

在优选的实施方式中，本发明的药物组合物是选自由以下组成的组的形式：水溶液、凝胶、水凝胶、膜、糊状物、乳膏、喷雾剂、软膏或包裹物。

在进一步的实施方式中，本文所描述的药物组合物可以通过诸如静脉内、皮下、眼内、肌内、关节内、皮内、腹膜内、脊髓内的途径施用，或者通过其他非肠道途径施用(例如通过注射或输注)。施用可以是直肠、口服、眼部、局部、表皮或通过粘膜途径。施用可以是局部的，包括通过吸入。在优选的实施方式中，药物组合物是静脉内或皮下施用的。在一种实施方式中，药物组合物可以通过吸入来施用。在一种实施方式中，使用包含药物组合物的定量设备。

在本发明的一种实施方式中，受试者用本发明的抗体或结合片段以及皮质类固醇进行治疗。在一种实施方式中，皮质类固醇是地塞米松。在一种实施方式中，抗体或结合片段以及皮质类固醇是同时、分开或顺序施用的。在一种实施方式中，两者在同一组合物中给出。在另一实施方式中，它们不是。在一种实施方式中，通过吸入施用皮质类固醇。

本文还公开了包含本发明的抗体或其他组合物的试剂盒和使用说明书。该试剂盒可以还包含一种或多种另外的试剂，如在本讨论的另外的治疗剂或预防剂。

疾病的预防和治疗方法

本发明提供了一种抑制嗜酸性粒细胞胞外陷阱(EET)形成的方法，该方法包括向其中存在嗜酸性粒细胞的样品或受试者施用抗体或其结合片段，该抗体或其结合片段特异性地结合至脱亚胺基的人组蛋白2A和/或组蛋白4上的瓜氨酸化表位。本发明还提供了用于抑制嗜中性粒细胞胞外陷阱(NET)的形成、特别是用于治疗或预防肺部病症的这种抗体或结合片段。在一种优选的实施方式中，肺部病症的特征在于嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的数量增加。因此，在一种优选的实施方式中，本发明用于抑制EET和NET两者。

该方法可以用于预防或治疗受试者的疾病或病症，在这种情况下，该方法包括向受试者以预防或治疗有效量施用抗体或其结合片段。还提供了用于所述用于预防或治疗受试者的疾病或病症的方法的抗体或其结合片段，该抗体或其结合片段特异性地结合到脱亚胺基的人组蛋白2A和/或组蛋白4上的瓜氨酸化表位。还提供了用于制造在预防或治疗受试者的疾病或病症的方法中使用的药物的抗体或其结合片段，该抗体或其结合片段特异性地结合到脱亚胺基的人组蛋白2A和/或组蛋白4上的瓜氨酸化表位。

在治疗应用中，将抗体或组合物以足以治愈、减轻或部分阻滞病症或其一种或多种症状的量施用给已经患有疾病或病症的受试者。这种治疗处理(therapeutictreatment)可以导致疾病症状的严重程度降低，或者无症状期的频率或持续时间增加。足以实现这个的量被定义为“治疗有效量”。用于给定目的的有效量将取决于疾病或损伤的严重性以及受试者的体重和总体状态。在预防性应用中，多肽或组合物以足以预防或延迟症状发展的量施用给尚未表现出疾病或病症的症状的受试者。这样的量被定义为“预防有效量”。如在本文中所使用的，术语“受试者”包括任何脊椎动物，典型地是任何哺乳动物(诸如，人或马)。受试者优选是人类。

在具体实施方式中，抗体或其结合片段可以(直接或间接地)连接至另一部分。其他部分可以是治疗剂，诸如药物。其他部分可以是可检测标记物。其他部分可以是结合部分，诸如对治疗靶标具有特异性的抗体或多肽结合结构域。本发明的抗体或其结合片段可以是双特异性抗体。

治疗剂或可检测标记可以例如通过化学缀合直接附接至本发明的抗体或其结合片段。将试剂或标记物与抗体缀合的方法是本领域已知的。例如，碳二亚胺缀合(BaumingerS和Wilchek M，1980，Methods Enzymol.，70，151-159)可以用于将多种试剂(包括阿霉素(doxorubicin))缀合到抗体或肽。水溶性碳二亚胺，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)对于将功能部分缀合到结合部分上是特别有用的。

也可以使用将部分缀合至抗体的其他方法。例如，可以使用高碘酸钠氧化，随后还原烷基化合适的反应物，戊二醛交联也可以使用。然而，应认识到，无论选择哪种产生本发明的缀合物的方法，都必须确定抗体维持其靶向能力并且功能部分维持其相关功能。

与抗体连接的治疗剂可以包含多肽或编码具有治疗好处的多肽的多核苷酸。此类多肽的实例包括抗增殖细胞因子或抗炎细胞因子。

抗体可以连接至可检测标记物。“可检测标记物”是指抗体连接至部分，当在将抗体施用至患者后位于靶位点时，该部分可以典型地非侵入性地从体外和靶标所在的位点检测到。因此，抗体可以用于成像和诊断。

典型地，标记物是或包括在成像中有用的放射性原子。合适的放射性原子包括用于闪烁显像研究的99mTc和123I。其他标记物包括例如用于磁共振成像(magneticresonance imaging，MRI)的自旋标记，如123I、131I、111In、19F、13C、15N、17O、钆、锰或铁。显然，为了使分子易于检测，必须将足够量的适当原子同位素连接到抗体。

可以以已知的方式掺入放射性标记物或其他标记物。例如，抗体或其片段可以是生物合成的，或者可以通过使用合适的氨基酸前体的化学氨基酸合成来合成，该氨基酸前体包括例如氟-19代替氢。标记物(诸如，99mTc、123I、186Rh、188Rh和111In)可以例如通过多肽中的半胱氨酸残基附接。钇-90可以经由赖氨酸残基附接。优选地，可检测标记物包含放射性原子，诸如像锝-99m或碘-123。可替代地，可检测标记物可以选自包括以下的组：碘-123；碘-131；铟-111；氟-19；碳-13；氮-15；氧-17；钆；锰；铁。

在一种实施方式中，本发明的抗体能够选择性地结合至直接或间接细胞毒性部分或结合至可检测标记物。因此，在该实施方式中，抗体与选择性结合细胞毒性或容易检测的其他化合物或组分的部分连接。

抗体或结合片段或包含抗体或片段的组合物可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种经由一种或多种施用途径施用。如本领域技术人员将理解的，施用途径和/或模式将取决于所期望的结果而变化。本发明的抗体或组合物的优选施用途径包括静脉内、皮下、眼内、肌内、真皮内、腹膜内、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如在本文所使用的短语“肠胃外施用”意指除了肠内和局部施用之外的施用模式，通常通过注射。施用可以是直肠、口服、眼部、局部、表皮或通过粘膜途径。施用可以是局部的，包括瘤周施用、近瘤施用、瘤内施用、至肿瘤切除边缘施用、病灶内施用、病灶周围施用、通过腔内输注施用、膀胱内(intravesicle)施用、或通过吸入施用。在优选的实施方式中，药物组合物是静脉内或皮下施用。

抗体或其结合片段的合适剂量可以由熟练的医师确定。可以改变本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平以便获得有效实现对于特定患者、组合物、以及施用模式的所期望的治疗反应、而对患者无毒的活性成分的量。所选择的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素，包括所采用的特定抗体的活性、给药途径、给药时间、抗体排泄率、治疗持续时间、与所采用的特定组合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康和既往病史、以及医学领域中熟知的类似因素。

抗体或其结合片段的合适剂量可以是，例如，在待治疗患者的约0.1μg/kg至约100mg/kg体重的范围内。例如，适合的剂量可以是从约1μg/kg至约50mg/kg体重/周、从约100μg/kg至约25mg/kg体重/周或从约10μg/kg至约12.5mg/kg体重/周。

适合的剂量可以是从约1μg/kg至约50mg/kg体重/天、从约100μg/kg至约25mg/kg体重/天或从约10μg/kg至约12.5mg/kg体重/天。

可以调整剂量方案以提供最佳的期望反应(例如治疗反应)。例如，可以给予单次推注，可以随着时间施用若干分剂量，或可以根据治疗情况的紧急情况按比例减少或增加剂量。尤其有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物以便于给药和剂量的均匀性。如在本文使用的剂量单位形式是指适合作为单一剂量用于待治疗的受试者的物理上离散的单位；每个单位含有预定量的活性化合物，该预定量的活性化合物经计算与所需的药物载体结合产生所期望的治疗效果。

抗体可以单剂量或多剂量施用。多个剂量可以经由相同或不同的途径施用并且施用至相同或不同的位置。可替代地，抗体可以作为持续释放制剂来施用，在这种情况下需要较少的施用频率。剂量和频率可以取决于抗体在患者中的半衰期和所需的治疗持续时间而变化。施用的剂量和频率也可以取决于治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，可以在长时间段内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。在治疗应用中，可以施用相对高的剂量，例如直到患者显示出疾病的症状的部分改善或完全改善。

两种或更多种药剂的组合施用可以以许多不同的方式实现。在一种实施方式中，抗体或其结合片段和其他药剂可以一起以单一组合物施用。在另一实施方式中，抗体和该其他药剂可以作为组合疗法的一部分在分开的组分中施用。例如，抗体或其结合片段可以在其他试剂之前、之后或与其他试剂同时施用。

待诊断、治疗或预防的疾病

本文公开的方法可以用于诊断、治疗或预防包括EET相关病状的任何疾病或病症。EET相关病状通常是指完全或部分由EET的形成介导的病状。这种病状通常存在于全部或部分由嗜酸性粒细胞介导或优选主要由嗜酸性粒细胞介导的任何疾病或病症中。此类疾病或病症可以在本文中描述为嗜酸性粒细胞的或嗜酸性粒细胞相关的。因此，换句话说，在本文所公开的方法可以用于嗜酸性粒细胞疾病或病症的诊断、治疗或预防。

嗜酸性粒细胞疾病或病症可以被定义为与健康个体的相同组织或器官相比，受影响的组织或器官中嗜酸性细胞数量增加的疾病或病症。嗜酸性粒细胞疾病或病症可以包括：皮肤嗜酸性粒细胞疾病或病症；呼吸道嗜酸性粒细胞疾病或病症；胃肠嗜酸性粒细胞疾病或病症；过敏性疾病或病症；或蠕虫、真菌、病毒或细菌感染。

皮肤嗜酸性粒细胞疾病或病症包括大疱性类天疱疮(Bullous Pemphigoid，PB)、特应性皮炎(Atopic dermatitis，AD)和慢性自发性荨麻疹(chronic spontaneousurticaria，CSU)、过敏性接触性皮炎、以及嗜酸性粒细胞蜂窝织炎(也称为威尔氏综合征(Well’s syndrome))。

呼吸道嗜酸性粒细胞疾病或病症包括嗜酸性粒细胞哮喘(Eosinophi1icAsthma)、鼻息肉(Nasal Polyp)、慢性鼻窦炎伴鼻息肉病(Chronic RhinoSinusitis withNasal Polyposis，CRSwNP)、过敏性鼻窦炎(Allergic sinusitis)、过敏性鼻炎(Allergicrhinisitis)、过敏性支气管肺曲霉病(真菌感染)、嗜酸性粒细胞慢性鼻窦炎、热带肺嗜酸性粒细胞增多症(典型地是呼吸道蠕虫感染)。

胃肠嗜酸性粒细胞性疾病或病症包括嗜酸性食管炎(EosinophilicEsophagitis，EoE)、嗜酸性胃炎(胃-EG)、嗜酸性胃肠炎(胃和小肠-EGE)、嗜酸性肠炎(小肠)、嗜酸性结肠炎(大肠-EC)以及胃肠蠕虫感染(诸如，蛔虫症(Ascariasis)或旋毛虫病(Trichinosis))。

其他嗜酸性粒细胞疾病或病症包括高嗜酸性粒细胞综合征(HyperEosinophilicSyndrom)(HES-影响血液和各种器官)、嗜酸性肉芽肿性多血管炎(EosinophilicGranulomatosis with PolyAngitis)(EGPA-影响各种器官，包括血管)和嗜酸性粒细胞中耳炎(EOM-影响中耳)、以及伴有嗜酸性粒细胞和系统症状的药物反应(Drug Reactionwith Eosinophilic&Systemic Symptoms，DRESS-影响各种器官)。

在一种优选实施方式中，待治疗或预防的疾病是动脉硬化。在另一实施方式中，治疗血管炎。

本文公开的方法可以用于诊断、治疗或预防任何以上列出的嗜酸性粒细胞疾病或病症。特别优选的嗜酸性粒细胞疾病或病症包括其中已经直接证实了EET的存在的那些。此类疾病和病症包括但不限于：大疱性类天疱疮、特应性皮炎、过敏性接触性皮炎、嗜酸性粒细胞哮喘、慢性鼻窦炎伴鼻息肉病(CRSwNP)、过敏性鼻窦炎、过敏性支气管肺曲霉病、嗜酸性粒细胞慢性鼻窦炎、嗜酸性粒细胞食管炎(EoE)、高嗜酸性粒细胞综合征(HES)、嗜酸性肉芽肿性多血管炎(EGPA)、嗜酸性粒细胞中耳炎(EOM)以及伴有嗜酸性粒细胞和系统症状的药物反应(DRESS)。

最优选的嗜酸性粒细胞疾病或病症是其中已经直接观察到EET与疾病发生率和/或严重性之间的相关性的那些。此类疾病和病症包括但不限于：嗜酸性粒细胞哮喘、慢性鼻窦炎伴鼻息肉病(CRSwNP)、嗜酸性粒细胞慢性鼻窦炎、以及嗜酸性粒细胞中耳炎(EOM)。

EET的存在和/或嗜酸性粒细胞在如以上讨论的那些疾病中的作用在本领域中是众所周知的。参见例如：Williams，T.L等人(2020)，“NETs and EET，a Whole Web ofMess”，Microorganisms，8(12)，1925和Mukherjee，M.，等人(2018)，嗜酸性粒细胞胞外陷阱和炎性病理学-解开网！(Eosinophil Extracellular Traps and InflammatoryPathologies-Untangling the Web！)免疫学前沿，9，2763。本发明适用于治疗、预防或诊断这些文献中记载的任何疾病，这些文献以引用方式并入本文。

本文公开的方法还可以用于诊断、治疗或预防仅由嗜酸性粒细胞部分介导的疾病或病症中的EET相关病变。例如，疾病(诸如，慢性阻塞性肺病(Chronic ObstructivePulmonary Disease，COPD)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、疱疹样皮炎、血栓形成、以及动脉粥样硬化)可以表现出由多种细胞类型引起的多种病状，并且因此可以不被定义为“嗜酸性粒细胞(eosinophilic)”。然而，尽管如此，它们可能展现出EET相关的病状，并且因此通过在本文公开的方法被诊断、治疗或预防。

替代方法

本发明提供了一种抑制或检测嗜酸性粒细胞胞外陷阱(EET)形成的方法，该方法包括向其中存在嗜酸性粒细胞的样品或受试者施用抗体或其结合片段，该抗体或其结合片段特异性地结合至脱亚胺基的人组蛋白2A和/或组蛋白4上的瓜氨酸化表位。该方法可以用于离体抑制或检测样品中的EET形成，在这种情况下，该方法包括向样品施用抗体或其结合片段并且在适合于结合发生的条件下孵育。换句话说，条件允许抗体-靶复合物的形成。该方法可以任选地包括确定所述复合物是否已经形成。

在此类方法中，在适合于结合发生的条件下使样品与适合的抗体或片段接触。合适的条件包括孵育至少1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟或更长时间。孵育优选地在室温下进行，更优选地在约20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或45℃进行，并且最优选地在约37℃进行。上述方法可以在任何合适的pH进行，但通常在约pH6.5至7.5进行。该方法可以在任何适合的缓冲液(诸如，Tris缓冲盐水(TBS)或磷酸盐缓冲盐水(PBS))中进行。

可以通过任何合适的分析方法评估样品的检测或分析以确定是否已经发生结合，该分析方法诸如但不限于质谱法、HPLC、亲和色谱法、凝胶电泳、SDS-PAGE、ELISA、凝集素印迹法、光谱法、毛细管电泳、流式细胞术、显微镜和其他用于分析的标准实验室技术。

该抗体或其结合片段可以结合至固体支持物，或者可以标记或缀合至如上所描述的另一化学基团或分子，以辅助检测。例如，典型的化学基团包括荧光标记物(诸如，异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE))或标签(诸如，生物素)。

样品典型地是从受试者获得的体液样品(诸如，血清或血液)。该方法可以包括在施用抗体或片段之前处理样品，例如通过分离这些嗜酸性粒细胞。样品可以是取自受试者，优选人类受试者的样品，其中可以确认或怀疑EET相关病状的存在。获得的结果可以用于诊断目的，例如用于检测或确认受试者中EET相关病状的存在，包括例如在先前部分中列举的任何疾病中。这样的用途可以涉及从受试者获得的结果与使用从健康对照获得的样品获得的那些结果的比较。由于嗜酸性粒细胞疾病(包括如在本文所描述的任何嗜酸性粒细胞疾病)的一种或多种症状的存在，可以证实或怀疑受试者中EET相关病变的存在。

肺疾病(lung disorder)

在一种优选实施方式中，本发明用于治疗肺疾病。具体地，本发明提供了一种治疗或预防肺疾病的方法，该方法包括向患有肺疾病或处于肺疾病风险的受试者施用抗体或其结合片段，该抗体或其结合片段特异性地结合至脱亚胺基的人组蛋白2A和/或组蛋白4上的瓜氨酸化表位。在一种实施方式中，抗体或结合片段是在本文所描述的那些中的任一种。在优选实施方式中，肺疾病可以是炎性肺疾病。在一种实施方式中，肺疾病的特征在于与没有病的健康受试者相比，炎性细胞流入肺部。例如，在一种实施方式中，该病症可以特征在于白细胞流入肺部。在一种实施方式中，肺疾病的特征在于粒细胞流入肺部，特别是嗜酸性粒细胞和/或中性粒细胞流入肺部。

发明人已经发现，与脱亚胺基的人组蛋白2A和/或组蛋白4上的瓜氨酸化表位特异性结合的抗体或其结合片段可以在治疗肺部病症方面比皮质类固醇更有效。因此，在一种实施方式中，肺部病症的特征在于受试者显示对皮质类固醇的症状反应性差。特别地，在一种实施方式中，所提供的方法用于治疗患有对地塞米松反应性差的肺部病症的受试者。在另一实施方式中，用抗体或其结合片段以及皮质类固醇两者治疗受试者，该抗体或其结合片段特异性地结合到脱亚胺基的人组蛋白2A和/或组蛋白4上的瓜氨酸化表位。在一种实施方式中，用抗体(或结合片段)和地塞米松两者治疗受试者。在一种实施方式中，将这两者结合可以帮助增强皮质类固醇的效果。

在一种实施方式中，治疗或预防肺疾病的方法导致NET存在的减少。在另一实施方式中，该方法导致EET存在的减少。在优选实施方式中，方法可以导致受试者肺部的NET和EET两者的减少。在一种实施方式中，方法导致减少NET和/或EET的形成。

这些方法可以用于治疗任何适合的肺疾病，特别是炎性肺疾病。在一种实施方式中，肺障碍选自COPD、支气管炎、肺气肿、囊性纤维化、纤维化和特发性肺纤维化和哮喘。在优选实施方式中，病症是哮喘。可能是受试者患有严重哮喘。在一种特别优选的实施方式中，肺疾病可以是过敏性哮喘。在一种优选实施方式中，肺疾病是涉及屋尘螨过敏的过敏性哮喘。在一种实施方式中，肺疾病是哮喘，其特征在于存在增加数量的嗜酸性粒细胞和/或嗜中性粒细胞。在一种实施方式中，本发明的方法可以用于治疗具有增加数量的浸润性嗜酸性粒细胞的肺部病症。在另一实施方式中，本发明的方法可以用于治疗具有增加数量的浸润性嗜中性粒细胞的肺部病症。在另一实施方式中，受试者具有增加数量的浸润性嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞。在一种实施方式中，受试者可以患有嗜中性粒细胞哮喘。在另一实施方式中，受试者可以患有嗜酸性粒细胞哮喘。在一种实施方式中，受试者可以患有2型哮喘。在另一实施方式中，受试者可以患有非2型哮喘。

在一种实施方式中，支气管肺泡灌洗(BAL)可以用作评估肺部中的炎性细胞的存在的方式。在一种实施方式中，BAL可以用作测量支气管肺泡空间中总白细胞计数的方法。在一种实施方式中，BAL可以用作测量支气管肺泡空间中嗜中性粒细胞和/或嗜酸性粒细胞数量的方式。在一种实施方式中，与治疗前的计数相比，本发明的方法将导致来自受试者的BAL中的中性粒细胞计数减少。在另一实施方式中，与治疗前或治疗过程中的计数相比，该治疗将导致来自受试者的BAL中嗜酸性粒细胞计数的减少。在一种实施方式中，嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞计数都将减少。在一种实施方式中，BAL中的总粒细胞计数将由于治疗而减少。在一种实施方式中，本发明可以导致血管周浸润性嗜中性粒细胞、血管周单核细胞和/或细支气管浸润性嗜中性粒细胞的减少。用如在本文所描述的抗体或其结合片段治疗还可以导致瓜氨酸化组蛋白的减少，例如在BAL中测量的，特别是BAL中的瓜氨酸化组蛋白3。

通过以下实施例进一步说明本发明，实施例不应被解释为进一步的限制。贯穿本申请引用的所有附图以及所有参考文献、专利以及公开的专利申请的内容明确地通过引用结合在本文。

实施例

实施例1：在用A23187或PMA刺激时，CIT-013抗体抑制来自嗜酸性粒细胞的胞外DNA释放

根据制造商的方案，通过Ficoll梯度离心、然后红细胞的ACK裂解和随后使用带有磁珠的嗜酸性粒细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)进行阴性选择，从健康供体的20ml血液中分离嗜酸性粒细胞。在不存在或存在CIT-013或同种型对照抗体(25μg/ml)的情况下，用2μMA23187或100nM佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)刺激分离的嗜酸性粒细胞(基于通过流式细胞术测量的CD16-Siglec-8⁺表达，约90％纯度)。作为阴性对照，在没有刺激或抗体暴露(未处理)的情况下接种细胞。Sytox Green是细胞不可渗透的染料，存在于所有孔中以使DNA可视化。使用Incucyte活细胞成像和分析系统SX1(Sartorius)，每30分钟为每孔拍摄四张图像进行相位对比和Sytox Green。a)示出了在各种条件下在刺激4小时后拍摄的代表性图像。Sytox Green信号以灰度表示。比例尺：100μm。b)使用Incucyte SX1软件针对胞外陷阱分析数据。由于DNA的扩散(在18和80之间)以及大于平均细胞面积的面积(在315μm²和4000μm²之间的区域-基于从实验中随机选择的实例图像的测量)，这些胞外陷阱被确定为具有相对低的平均强度的Sytox Green信号。在相位对比图像中将实验开始时的细胞数量确定为面积超过70μm²(再次基于特定实验的评估的值)的事件。结果表示为与开始时的细胞数量相比的胞外陷阱的相对数量。在这些图中，对于源自每个供体的嗜酸性粒细胞，随时间推移描绘了每个条件三个孔的平均值和标准偏差(n＝3)。这些图显示了与同种型对照抗体相比，在CIT-013存在下嗜酸性粒细胞胞外陷阱的百分比的明显减少。

实施例2：用tACPA抗体治疗对气道炎症的小鼠模型的影响

雌性Balb/c小鼠(8周龄)在第0天用屋尘螨(HDM)和完全弗氏佐剂(completefreund’sadjuvant)皮下(s.c.)致敏。HDM获自Stallergenes Greer(批次号XPB82D3A2.5)。14天后，小鼠用HDM经鼻内(i.n)攻击或接受溶媒(假性(Sham)小鼠)。在攻击前一小时，小鼠口服(p.o.)地塞米松1mg/kg，以20mg/kg静脉注射(i.v)CIT-013抗体(tACPA；MQ22.101)的鼠前体，或以20mg/kg静脉注射(i.v)同种型对照抗体。未处理的小鼠p.o.或i.v.接受溶媒。在第15天，用0.4ml PBS溶液(不含Mg²⁺和Ca²⁺)灌洗小鼠肺部三次。将支气管肺泡灌洗液(BALF)在400x g和4℃下离心5min，以将细胞与无细胞BALF级分分离。

将细胞沉淀重悬于PBS中之后，进行细胞计数，结果呈现于图2的图块a)和图块b)中。特别地，使用自动细胞计数器DASIT Sysmex XT-2000Iv对支气管肺泡灌洗液(BALF)中的嗜酸性粒细胞(图2中的图块a)和中性粒细胞(表2中的图块b)的数量进行计数。数据示于图2的图块a)和图块b)中，为每只小鼠的细胞计数，以及每组(每组7-8只小鼠)的平均值和标准误差(SEM)。排除如通过Grubb测试确定的异常值。通过单因素方差分析(One WayANOVA)进行统计分析，然后进行邓尼特(Dunnett)多重比较检验，相应给药途径的各组与HDM攻击组进行比较。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。图2的图块a)和图块b)中的结果显示，tACPA抗体和地塞米松均导致施用HDM的小鼠BALF中的嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞数量减少。

然后将BALF的无细胞部分储存在-80℃，直到根据制造商的方案使用瓜氨酸化组蛋白H3(克隆11D3)ELISA试剂盒(Sanbio；501620)进一步用于测定瓜氨酸化组蛋白H3(citH3)的浓度(另参见开曼化学制品瓜氨酸化组蛋白H3-克隆11D3-ELISA试剂盒-项目编号501620(Cayman Chemical Citrullinated Histone H3-Clone llD3-ELISA Kit-ItemNo.501620)，信息可在www.caymanchem.com上获得)。获得的结果如图2的图块c)所示。排除如通过Grubb测试确定的异常值。通过克鲁斯卡尔-沃利斯(Kruskal-Wallis)进行统计分析，随后进行邓尼特(Dunnett)多重比较检验，各组与相应给药途径的HDM攻击组进行比较。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。如从图2的图块c)中可以看出，tACPA抗体和地塞米松均导致施用HDM的小鼠中瓜氨酸化组蛋白H3降低至或接近仅施用溶媒的对照小鼠中看到的水平。

灌洗后，收集肺部组织，用10％磷酸盐缓冲液福尔马林固定并包埋在石蜡中。将两个5μm的纵向切片分开30μm，并且用苏木精和伊红染色。由对治疗组不知情的独立病理学家对这些切片进行评级。使用Olympus BX50显微镜，在x 80或x 160放大倍数下，分别对左肺和右肺评分。首先，在x 80放大倍数下进行总体评估，并且将x160放大倍数用于详细检查以确认严重性等级。获得的结果如图2的图块d)至图块f)所示。图块d)给出了血管周围嗜中性粒细胞增多(neutrophilia)的结果，图块e)给出了血管周围单核细胞浸润的结果，以及图块f)给出了细支气管嗜中性粒细胞增多的结果。结果为正常0分，最小局灶性浸润1分，最小多灶性浸润2分，中度浸润3分，显著浸润4分。数据如图2的图块d)至图块f)所示，为每只小鼠在两个切片上的平均得分，平均值+SEM/组(8只小鼠/组)。通过克鲁斯卡尔-沃利斯(Kruskal-Wallis)进行统计分析，随后进行邓尼特(Dunnett)多重比较检验，各组与相应给药途径的HDM攻击组进行比较。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

更详细地说，用于肺部病理学的评分如下：1.所有切片都进行了质量预筛选。拒绝的常见原因有：切片有刻痕或撕裂；切片被提起(lifting)；染色质量差。2.记录了濒死的变化。3.对以下组织学结果进行评分：血管周围嗜中性粒细胞浸润；血管周围单核细胞浸润(定义：炎症细胞从血管腔浸润到血管壁-包括外部弹性层中的细胞)；细支气管(bronchiolar)嗜中性粒细胞浸润。

图2的图块d)至图块f)中的结果显示，tACPA抗体和地塞米松均导致血管周围嗜中性粒细胞增多(图块d)、血管周围单核细胞(图块e)和细支气管中性粒细胞浸润(图块f)的减少，其中与地塞米松相比，tACPA抗抗体在每种情况下的结果都更明显。

实施例3：用tACPA抗体处理对气道炎症的小鼠模型的影响

雌性Balb/c小鼠(8周龄)在第0天用100μg屋尘螨(HDM)和25μg完全弗氏佐剂(complete freund’s adjuvant)皮下(s.c.)致敏。HDM获自Stallergenes Greer(批次号XPB82D3A2.5)。14天后，小鼠用100μg HDM经鼻内(i.n)攻击或接受溶媒(假性(Sham)小鼠)。在攻击前一小时，小鼠以1mg/kg口服(p.o.)地塞米松(Sigma-Aldrich)，以20mg/kg静脉注射(i.v)CIT-013抗体(tACPA；MQ22.101)的鼠前体，或以20mg/kg i.v同种型对照抗体(Con.Ab；抗鸡卵溶菌酶抗体；CrownBio，项目编号：C0005)。未处理的小鼠接受溶媒，p.o.或i.v.。在第15天，用0.4ml PBS溶液(不含Mg²⁺和Ca²⁺)灌洗小鼠肺部三次。将支气管肺泡灌洗液(BALF)在400xg和4℃下离心5min，以将细胞与无细胞BALF级分分离。BALF的无细胞部分在-80℃储存，直至进一步使用。灌洗后，收集肺部组织，用10％磷酸盐缓冲液福尔马林固定24h并包埋在石蜡中进行组织病理学检查。

根据制造商的方案，使用Quant-iT PicoGreen dsDNA测定试剂盒(ThermoFisherscientific；P11496)，使用储存的BALF测定双链DNA(dsDNA)的浓度(另参见Quant-iT^TMPicoGreen^TMdsDNA检测试剂盒-项目编号P11496，信息可在www.thermofisher.com上获得)。简言之，将样品用TE缓冲液稀释五次，并与200倍稀释度的PicoGreen的TE缓冲液1:1混合。在SpectraMax iD5(分子学设备(Molecular Devices))或CLARIOstar(BMG Labtech)上测量荧光。获得的结果如图3的图块a)所示。

随后使用石蜡包埋的肺部组织来制备厚度为5μm的纵向切片，用于在VentanaDiscovery Ultra自动染色平台(Ventana Medical Systems)上进行染色。将切片脱蜡、水合，并在细胞调节1溶液(Ventana Medical Systems)中在93℃孵育32分钟以修复抗原。切片用20μg/ml兔抗瓜氨酸化组蛋白3抗体(citH3；Abcam，分类号：ab5103)和2μg/ml山羊抗髓系过氧化物酶(myeloid peroxidase)抗体(R&D系统，分类号AF3667)染色60分钟。洗涤后，将切片与第二抗体，即与Alexa Fluor 488缀合的4μg/ml驴抗兔(Abcam，项目编号：ab150073)和与Alexa Fluor 555缀合的4μg/ml驴抗山羊(Abcam、项目编号：150134)，在37℃孵育32分钟。接下来，洗涤切片并在室温下用300nM DAPI孵育30分钟以染色DNA。使用Zeiss Axio Scan Z1(Zeiss)对染色的切片进行数字扫描，并由对处理组不知情的独立病理学家进行评估。切片质量的筛选表明citH3的FITC通道中存在非特异性自发荧光。对瓜氨酸化组蛋白3阳性信号(citH3+)的数量和MPO阳性信号(MPO+)的数目进行计数，并根据形状将其与自发荧光信号区分开。基于形状或当距离最近的细胞核超过3个细胞核半径时，信号被认为是胞外的。嗜中性粒细胞胞外陷阱(NET)被可视化为包含胞外citH3和MPO信号两者的结构，并且NET的发生率为0-3分(阴性、轻度、中度和重度)。按解剖区域进行计数。血管(周围)((peri)vascular)区域由血管壁组成，直到直径小于300μm的血管的外部外膜边缘。当外部外膜的边缘不清楚时，将其设定在最大壁厚的三倍的横切处。细支气管(周围)((peri)bronchiolar)区域包括粘膜直到具有600μm的最大直径的细支气管的外部结缔组织的边缘。当外部结缔组织的边缘不可区分时，将其边缘设定为最大粘膜厚度的两倍。在没有大血管(直径>200μm)和细支气管的视野上进行肺泡面积的评估。对5个血管(周围)区域或细支气管(周围)区域和10个肺泡视野进行计数，并且将其表示为算术平均值。胞外citH3、胞外MPO和NET的获得结果分别如图3的图块b)、图块c)和图块d)所示。

从石蜡包埋的肺部组织切下两个相距10μm的纵向切片，并用苏木精和伊红染色。评估切片的质量，并且如果切片被撕裂、抬起或具有差的染色质量，则拒绝该切片。由对处理组不知情的病理学家对血管(周围)、细支气管(周围)或肺泡区域的嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞和吞噬性巨噬细胞的数量进行计数。

更详细地说：在肺切片的随机坐标上，对每个解剖区域进行计数。当从血管腔浸润到血管壁和直径<300μm的血管外弹性层内时，包括血管(周围)区域内的细胞。当浸润到直径<600μm的细支气管的粘膜、肌层或外弹性层时，包括细支气管(周围)区域的细胞。在没有大细支气管和血管(直径>100μm)存在的肺泡区域的视野中，对肺泡区域内的细胞进行计数。每个肺部面积计算10个视野，并用算术平均值表示。

嗜酸性粒细胞被定义为显示具有清晰的曙红-阳性胞质液泡的典型嗜酸性粒细胞核形态的细胞，细胞计数如图块e)所示。嗜中性粒细胞由其典型的嗜中性粒细胞核形态定义，其中带状细胞被排除，细胞计数如图块f)所示。将具有经典巨噬细胞形态的细胞计数为巨噬细胞，数据如图块g)所示。将具有清晰且丰富的胞质液泡(包括融合至细胞膜的液泡)的巨噬细胞记录为吞噬性巨噬细胞。吞噬性巨噬细胞的百分比是通过吞噬性巨噬细胞的数量除以总巨噬细胞的数量x100％来计算的，并且在图块h)的图表中描绘。

图3中的数据表示为每组平均值的平均值±标准误差(SEM)，除了图块d)中显示每组的中值(每组8只动物)的半定量NET评分之外。通过Kruskal-Wallis对每个施用组进行统计分析，然后使用Prism 9进行Dunn多重比较试验。ns p>0.05，#或*p<0.05，##或**p<0.01，###或***p<0.001，####或***p<0.0001。

图3的图块a)中的图显示了地塞米松以及tACPA抗体在用HDM攻击的小鼠的BALF中导致dsDNA水平降低。图3的图块b)中的结果示出在攻击后作为三个不同的肺部区域血管(周围)、细支气管(周围)和肺泡中的细胞外陷阱标记物的citH3的存在。虽然在所有三个肺部区域中不显著，但地塞米松或小鼠tACPA处理后观察到citH3计数明显减少。对于胞外MPO(NET的组分)和扩散性细胞外NET(示于图3的图块c)和图块d))观察到类似趋势。

图3的图块e)和图块f)显示，尽管在大多数情况下没有统计学意义，但地塞米松或tACPA处理后，嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞数量略有减少，其中与地塞米松处理相比，tACPA处理细支气管(周围)区域和肺泡区域的嗜中性粒细胞数量减少更为明显。图3的图块g)和图块h)中的图表显示，吞噬性巨噬细胞的百分比仅在tACPA处理后增加，而巨噬细胞的总数与攻击和地塞米松处理的动物相似。

实施例4：CIT-013抑制由免疫复合物诱导的EETosis

从健康志愿者的血液中分离出嗜酸性粒细胞。首先，使用Ficoll梯度离心然后使用ACK裂解缓冲液裂解红细胞，从血液中分离粒细胞。随后，根据制造商的方案，使用Miltenyi Biotec的嗜酸性粒细胞分离试剂盒(目录号：130-092-010)，通过磁珠阴性选择从粒细胞部分中分离嗜酸性粒细胞。基于通过流式细胞术确定的Siglec-8和CD16表达检查嗜酸性粒细胞部分的纯度。包括来自嗜酸性粒细胞部分的数据，这些嗜酸性粒细胞部分含有来自单个活CD45+白细胞的>85％嗜酸性粒细胞(Siglec-8+CD16-)并且含有小于10％嗜中性粒细胞(Siglec-8-和CD16+)。

通过用10μg/ml人血清白蛋白(HSA；Seqens IVD)在4℃涂布96孔Nunc MaxiSorp板(Invitrogen)过夜来产生包被的免疫复合物(cIC)。使用洗涤缓冲液(含有0.05％ Tween20的PBS)去除未结合的HSA。洗涤三次后，将板与50μl兔抗白蛋白抗体(Sigma-Aldrich)以每孔10μg/ml的浓度在室温孵育1小时，同时摇动。孔用洗涤缓冲液洗涤三次，用DPBS洗涤三次。随后，将嗜酸性粒细胞以每孔20,000个细胞的浓度接种在含有L-谷氨酰胺并且不含酚红(Gibco)的RPMI1640培养基中，该培养基含有1％青霉素和链霉素、0.1％ BSA、以及10mMHEPES。仅用HSA包被的孔用作无刺激对照。将Sytox Green(Invitrogen)(细胞膜不可渗透的DNA染料)加入孔中至20mM的最终浓度。在存在或不存在25μg/ml CIT-013或同种型对照抗体(同种型；抗鸡卵溶菌酶，CrownBio，项目编号C0001)的情况下刺激细胞。使用IncuCyte活细胞成像系统SX1(Satorius)每60分钟拍摄图像。使用IncuCyte SX1分析软件，基于Sytox Green信号，分析胞外陷阱的形成。面积大于细胞并且由于DNA的去凝聚具有低平均强度的Sytox-Green信号被认为是胞外陷阱。为了评估释放EET的细胞的百分比，使用IncuCyte SX1分析软件在早期时间点拍摄的相位对比图像中确定细胞的数量。在4小时的Sytox Green信号的代表性图像示出在图4的图块a)中，其中比例尺为50μm(n＝8个供体)。对于每个供体，在CIT-013或同种型对照抗体存在下4小时处的EET数量以及两种条件之间的EET差异(Δ)(n＝8个供体)在图4的图块b)中所示。使用Prism通过Friedman检验对配对样本进行统计分析，***p<0.001。与同种型对照抗体相比，图4的两个图块均显示CIT-013对EET释放的抑制作用。

序列表

SEQ ID NO:1-msVH22.101和hVH22.101(HC)x的CDR1

GYTFTNYG

SEQ ID NO:2-msVH22.101和hVH22.101(HC)x的CDR2

INTYSGEA

SEQ ID NO:3-msVH22.101和hVH22.101(HC)x的CDR3

LRGYTYQSFDEGGDY

SEQ ID NO:4-msVL22.101和hVL22.101(LC)y的CDR2

LVS

SEQ ID NO:5-msVL22.101和hVL22.101(LC)y的CDR3

WQGTHFPYT

SEQ ID NO:6-hVL22.101LC17的CDR1

QSLLDTDGKTY

SEQ ID NO:7-hVL22.101LC21的CDR1

QSLLDSDAKTY

SEQ ID NO:8-hVL22.101LC27的CDR1

QSLLDTDAKTY

SEQ ID NO:9-hVL22.101LC41的CDR1

QSLLDADGKTY

SEQ ID NO:10-hVL22.101LC42的CDR1

QSLLDNDGKTY

SEQ ID NO:11-hVH22.101f

RIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMHWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGEATYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCLRGYTYQSFDEGGDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:12-hVH22.101HC9

RIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMHWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGEATYVDDFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCLRGYTYQSFDEGGDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:13-hVL22.101LC17

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLDTDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO:14-hVL22.101LC21

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLDSDAKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO:15-hVL22.101LC27

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLDTDAKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO:16-hVL22.101LC41

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLDADGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO:17-hVL22.101LC42

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLDNDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO:18-来自组蛋白2A的WO2016092082(在实例1/7中使用)的SEQ ID NO 1

SGXGKQGGKARA

其中，X是瓜氨酸

SEQ ID NO:19-来自组蛋白4的来自WO2016092082(在实施例7中使用)的SEQ IDNO 2

SGXGKGGKGLGKGGAKRHRKVLR

其中，X是瓜氨酸

SEQ ID NO:20-来自组蛋白4的来自WO2016092082(在实施例7中使用)的缩短SEQID NO 2

SGXGKGGKGLGK

其中，X是瓜氨酸

SEQ ID NO:21-肽4(人组蛋白2A)(来自WO2011070172的SEQ ID NO 24)

QFPVGXVHRLLR

其中，X是瓜氨酸

SEQ ID NO:22-肽6(人组蛋白2A)(来自WO2011070172的SEQ ID NO 26)

VHRLLXKGNYSE

其中，X是瓜氨酸

SEQ ID NO:23-IgG1的人重链恒定结构域

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

SEQ ID NO:24-人κ链恒定结构域

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:25-msVH22.101

RIQLVQSGPELKKPGEAVKISCKASGYTFTNYGMHWMKQTPGKDFRWMGWINTYSGEATYVDDFKGRFAFSLGTSASTAYLQINNLKNDDTATYFCLRGYTYQSFDEGGDYWGQGTALTVSS

SEQ ID NO:26-hVH22.101j

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMHWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGEATYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCLRGYTYQSFDEGGDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:27-hVH22.101HC7

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYGMHWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGEATYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCLRGYTYQSFDEGGDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:28-hVH22.101HC8

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYGMHWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGEATYVDDFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCLRGYTYQSFDEGGDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:29-hVH22.101HC10

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMHWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGEATYVDDFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCLRGYTYQSFDEGGDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:30-msVL22.101

DVVMTQTPLTLSVTTGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLFQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGTHFPYTFGGGTNLEIK

SEQ ID NO:31-hVL22.101e

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVDSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO:32-hVL22.101g

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLDSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO:33-hVL22.101h

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVASDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO:34-hVL22.101i

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVESDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO:35-hVL22.101j

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVSSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO:36-msVL22.101和hVL22.101g的CDR1

QSLLDSDGKTY

SEQ ID NO:37-hVL22.101e的CDR1

QSLVDSDGKTY

SEQ ID NO:38-hVL22.101h的CDR1

QSLVASDGKTY

SEQ ID NO:39-hVL22.101i的CDR1

QSLVESDGKTY

SEQ ID NO:40-hVL22.101j的CDR1

QSLVSSDGKTY

SEQ ID NO:41-hVL22.101LC16的CDR1

QSLLESDGKTY

SEQ ID NO:42-hVL22.101LC19的CDR1

QSLLDSEGKTY

SEQ ID NO:43-hVL22.101LC20的CDR1

QSLLDSSGKTY

SEQ ID NO:44-hVL22.101LC22的CDR1

QSLLESEGKTY

SEQ ID NO:45-hVL22.101LC23的CDR1

QSLLESSGKTY

SEQ ID NO:46-hVL22.101LC24的CDR1

QSLLESDAKTY

SEQ ID NO:47-hVL22.101LC25的CDR1

QSLLDTEGKTY

SEQ ID NO:48-hVL22.101LC26的CDR1

QSLLDTSGKTY

SEQ ID NO:49-hVL22.101LC37的CDR1

QSLLDSAGKTY

SEQ ID NO:50-hVL22.101LC38的CDR1

QSLLESAGKTY

SEQ ID NO:51-hVL22.101LC39的CDR1

QSLLDAEGKTY

SEQ ID NO:52-hVL22.101LC40的CDR1

QSLLDNEGKTY

SEQ ID NO:53-msFibβXG(来自WO2011070172的SEQ ID NO 37)

EPTDSLDAXGHRPVDRR

其中，X是瓜氨酸

SEQ ID NO:54-msVim XS/XL(来自WO2011070172的SEQ ID NO 38)

YVTXSSAVXLXSSVP

其中，X是瓜氨酸

SEQ ID NO:55-msVL22.101和hVL22.101(LC)y的CDR2周围的区域

LVSKLDS

SEQ ID NO:56-hCH22.101f的重链恒定结构域

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

序列表

<110> 奇特里尔私人有限公司（CITRYLL B.V.）

<120> 胞外陷阱的抑制

<130> N421736WO

<150> EP21172160.0

<151> 2021-05-04

<150> GB2111541.5

<151> 2021-05-11

<160> 56

<170> PatentIn 版本3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> msVH22.101和hVH22.101(HC)x的CDR1

<400> 1

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> msVH22.101和hVH22.101(HC)x的CDR2

<400> 2

Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Glu Ala

1 5

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> msVH22.101和hVH22.101(HC)x的CDR3

<400> 3

Leu Arg Gly Tyr Thr Tyr Gln Ser Phe Asp Glu Gly Gly Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 4

<400> 4

000

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> msVL22.101和hVL22.101(LC)y的CDR3

<400> 5

Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 6

Gln Ser Leu Leu Asp Thr Asp Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 7

Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Ala Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 8

Gln Ser Leu Leu Asp Thr Asp Ala Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 9

Gln Ser Leu Leu Asp Ala Asp Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 10

Gln Ser Leu Leu Asp Asn Asp Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 11

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hVH22.101f

<400> 11

Arg Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Glu Ala Thr Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Leu Arg Gly Tyr Thr Tyr Gln Ser Phe Asp Glu Gly Gly Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 12

<211> 122

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 12

Arg Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Glu Ala Thr Tyr Val Asp Asp Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Leu Arg Gly Tyr Thr Tyr Gln Ser Phe Asp Glu Gly Gly Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 13

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 13

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Thr

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 14

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 14

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Ala Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 15

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 15

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Thr

20 25 30

Asp Ala Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 16

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 16

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ala

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 17

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 17

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Asn

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 18

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 其他特征（MISC_FEATURE）

<222> (3)..(3)

<223> Xaa = 瓜氨酸

<400> 18

Ser Gly Xaa Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala

1 5 10

<210> 19

<211> 23

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 其他特征（MISC_FEATURE）

<222> (3)..(3)

<223> Xaa = 瓜氨酸

<400> 19

Ser Gly Xaa Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala Lys

1 5 10 15

Arg His Arg Lys Val Leu Arg

20

<210> 20

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 其他特征（MISC_FEATURE）

<222> (3)..(3)

<223> Xaa = 瓜氨酸

<400> 20

Ser Gly Xaa Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys

1 5 10

<210> 21

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 其他特征（MISC_FEATURE）

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = 瓜氨酸

<400> 21

Gln Phe Pro Val Gly Xaa Val His Arg Leu Leu Arg

1 5 10

<210> 22

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 其他特征（MISC_FEATURE）

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = 瓜氨酸

<400> 22

Val His Arg Leu Leu Xaa Lys Gly Asn Tyr Ser Glu

1 5 10

<210> 23

<211> 329

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 23

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

325

<210> 24

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 24

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 25

<211> 122

<212> PRT

<213> 家鼠（Mus musculus）

<400> 25

Arg Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ala Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Met Lys Gln Thr Pro Gly Lys Asp Phe Arg Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Glu Ala Thr Tyr Val Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Gly Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Leu Arg Gly Tyr Thr Tyr Gln Ser Phe Asp Glu Gly Gly Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Ala Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 26

<211> 122

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 26

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Glu Ala Thr Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Leu Arg Gly Tyr Thr Tyr Gln Ser Phe Asp Glu Gly Gly Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 27

<211> 122

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 27

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Glu Ala Thr Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Leu Arg Gly Tyr Thr Tyr Gln Ser Phe Asp Glu Gly Gly Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 28

<211> 122

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 28

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Glu Ala Thr Tyr Val Asp Asp Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Leu Arg Gly Tyr Thr Tyr Gln Ser Phe Asp Glu Gly Gly Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 29

<211> 122

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 29

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Glu Ala Thr Tyr Val Asp Asp Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Leu Arg Gly Tyr Thr Tyr Gln Ser Phe Asp Glu Gly Gly Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 30

<211> 112

<212> PRT

<213> 家鼠（Mus musculus）

<400> 30

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Phe Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 31

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 31

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 32

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 32

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 33

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 33

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Ala Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 34

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 34

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Glu Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 35

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 35

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Ser Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 36

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> msVL22.101和hVL22.101g的CDR1

<400> 36

Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 37

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 37

Gln Ser Leu Val Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 38

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 38

Gln Ser Leu Val Ala Ser Asp Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 39

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 39

Gln Ser Leu Val Glu Ser Asp Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 40

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 40

Gln Ser Leu Val Ser Ser Asp Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 41

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 41

Gln Ser Leu Leu Glu Ser Asp Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 42

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 42

Gln Ser Leu Leu Asp Ser Glu Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 43

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 43

Gln Ser Leu Leu Asp Ser Ser Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 44

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 44

Gln Ser Leu Leu Glu Ser Glu Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 45

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 45

Gln Ser Leu Leu Glu Ser Ser Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 46

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 46

Gln Ser Leu Leu Glu Ser Asp Ala Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 47

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 47

Gln Ser Leu Leu Asp Thr Glu Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 48

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 48

Gln Ser Leu Leu Asp Thr Ser Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 49

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 49

Gln Ser Leu Leu Asp Ser Ala Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 50

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 50

Gln Ser Leu Leu Glu Ser Ala Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 51

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 51

Gln Ser Leu Leu Asp Ala Glu Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 52

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 52

Gln Ser Leu Leu Asp Asn Glu Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 53

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 其他特征（MISC_FEATURE）

<222> (9)..(9)

<223> Xaa = 瓜氨酸

<400> 53

Glu Pro Thr Asp Ser Leu Asp Ala Xaa Gly His Arg Pro Val Asp Arg

1 5 10 15

Arg

<210> 54

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 其他特征（MISC_FEATURE）

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = 瓜氨酸

<220>

<221> 其他特征（MISC_FEATURE）

<222> (9)..(9)

<223> Xaa = 瓜氨酸

<220>

<221> 其他特征（MISC_FEATURE）

<222> (11)..(11)

<223> Xaa = 瓜氨酸

<400> 54

Tyr Val Thr Xaa Ser Ser Ala Val Xaa Leu Xaa Ser Ser Val Pro

1 5 10 15

<210> 55

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> msVL22.101和hVL22.101(LC)y的CDR2周围的区域

<400> 55

Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser

1 5

<210> 56

<211> 330

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 56

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

Claims

1.一种抑制嗜酸性粒细胞胞外陷阱(EET)形成的方法，所述方法包括向其中存在嗜酸性粒细胞的样品或受试者施用抗体或其结合片段，所述抗体或其结合片段特异性结合至脱亚胺基的人组蛋白2A和/或组蛋白4上的瓜氨酸化表位。

2.根据权利要求1所述的方法，所述方法用于预防或治疗受试者的疾病或病症，并且所述方法包括以预防或治疗有效量向所述受试者施用所述抗体或其结合片段。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述疾病或病症包括EET相关的病状。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述疾病或病症是嗜酸性粒细胞疾病或病症。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述嗜酸性粒细胞疾病或病症是皮肤的嗜酸性粒细胞疾病或病症；呼吸道嗜酸性粒细胞疾病或病症；胃肠嗜酸性粒细胞疾病或病症；过敏性疾病或病症；或蠕虫、真菌、病毒或细菌感染。

6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中，所述疾病或病症选自：大疱性类天疱疮、特应性皮炎、过敏性接触性皮炎、嗜酸性粒细胞哮喘、慢性鼻窦炎伴鼻息肉病(CRSwNP)、过敏性鼻窦炎、过敏性支气管肺曲霉病、嗜酸性粒细胞慢性鼻窦炎、嗜酸性粒细胞食管炎(EoE)、高嗜酸性粒细胞综合征(HES)、嗜酸性肉芽肿性多血管炎(EGPA)、嗜酸性粒细胞中耳炎(EOM)、以及伴有嗜酸性粒细胞和系统症状的药物反应(DRESS)、动脉硬化和血管炎。

7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其中，所述疾病或病症选自：嗜酸性粒细胞哮喘、慢性鼻窦炎伴鼻息肉病(CRSwNP)、嗜酸性粒细胞慢性鼻窦炎、嗜酸性粒细胞中耳炎(EOM)、动脉硬化和血管炎。

8.根据权利要求1所述的方法，所述方法用于离体抑制或检测样品中的EET形成，并且所述方法包括向所述样品施用所述抗体或其结合片段并且在适于发生结合的条件下孵育，任选地其中，所述样品是从受试者获得的体液，诸如血清或血液，并且任选地，其中所述样品被加工例如以分离嗜酸性粒细胞。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述抗体或其结合片段包含：

a)VL的CDR1，其中，所述CDR包含氨基酸序列QSL-X₁-D-X₂-D-X₃-KTY或由氨基酸序列QSL-X₁-D-X₂-D-X₃-KTY组成，其中，X₁是V或L，X₂是T、S、A或N并且X₃是G或A，优选地其中，所述氨基酸序列不是QSLLDSDGKTY(SEQ ID NO:36)或QSLVDSDGKTY(SEQ ID NO:37)；以及

b)选自SEQ ID NO:1至5的至少一个CDR，任选地至少SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5的CDR，并且优选地SEQ ID NO:1至5的所有五个CDR。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述抗体或其结合片段包含：

a)SEQ ID NO:6、7、8、9或10的VL CDR1；以及

b)SEQ ID NO:1至5的CDR；

或

a)来自SEQ ID NO:13、14、15、16或17中任一个的VL CDR；以及

b)SEQ ID NO:11或12的重链可变结构域氨基酸序列。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其中，所述抗体或其结合片段包含：

(I)轻链可变区，其包括：

a)VL CDR1，其中，所述CDR包含氨基酸序列QSL-X₁-D-X₂-D-X₃-KTY或由氨基酸序列QSL-X₁-D-X₂-D-X₃-KTY组成，其中，X₁是V或L，X₂是T、S、A或N并且X₃是G或A，优选地其中，所述氨基酸序列不是QSLLDSDGKTY(SEQ ID NO:36)或QSLVDSDGKTY(SEQ ID NO:37)，并且任选地其中，所述CDR1选自SEQ ID NO:6、7、8、9或10；以及

b)SEQ ID NO:4的VL CDR2和SEQ ID NO:5的VL CDR3中的至少一个、优选两者；

以及

(II)重链可变区，其包括：

c)SEQ ID NO:11或12的氨基酸序列；或

d)(c)的至少7个氨基酸的片段，其中，所述抗体或其结合片段保留与脱亚胺基的人组蛋白2A和/或组蛋白4上的瓜氨酸化表位特异性反应的能力；或

e)与(c)序列具有至少70％氨基酸序列同一性的(c)变体，其中，所述抗体或其结合片段保留与脱亚胺基的人组蛋白2A和/或组蛋白4上的瓜氨酸化表位特异性反应的能力。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中，所述抗体或其结合片段包含：

a)SEQ ID NO:11的重链可变结构域氨基酸序列和SEQ ID NO:13的轻链可变结构域氨基酸序列；

b)SEQ ID NO:11的重链可变结构域氨基酸序列和SEQ ID NO:14的轻链可变结构域氨基酸序列；

c)SEQ ID NO:11的重链可变结构域氨基酸序列和SEQ ID NO:15的轻链可变结构域氨基酸序列；

d)SEQ ID NO:11的重链可变结构域氨基酸序列和SEQ ID NO:16的轻链可变结构域氨基酸序列；

e)SEQ ID NO:11的重链可变结构域氨基酸序列和SEQ ID NO:17的轻链可变结构域氨基酸序列；

f)SEQ ID NO:12的重链可变结构域氨基酸序列和SEQ ID NO:13的轻链可变结构域氨基酸序列；

g)SEQ ID NO:12的重链可变结构域氨基酸序列和SEQ ID NO:14的轻链可变结构域氨基酸序列；

h)SEQ ID NO:12的重链可变结构域氨基酸序列和SEQ ID NO:15的轻链可变结构域氨基酸序列；

i)SEQ ID NO:12的重链可变结构域氨基酸序列和SEQ ID NO:16的轻链可变结构域氨基酸序列；或

j)SEQ ID NO:12的重链可变结构域氨基酸序列和SEQ ID NO:17的轻链可变结构域氨基酸序列。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述抗体或其结合片段特异性结合到选自由SEQ ID NO:18、19、20、21和22组成的组中的肽，并且优选地以至少1nM或更小的亲和力来结合脱亚胺基的人类组蛋白2A和/或组蛋白4。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，(i)所述抗体或其结合片段选自由重组抗体、单链抗体、单链可变片段(scFv)、可变片段(Fv)、片段抗原结合区(Fab)、单结构域抗体(sdAb)、VHH抗体、纳米抗体、骆驼科动物衍生的单结构域抗体、鲨鱼IgNAR衍生的单结构域抗体片段(VNAR)、双抗体、三抗体、抗运载蛋白以及适配体组成的组，并且优选地是全长抗体，和/或(ii)其中，所述抗体或其结合片段缀合至另外的部分。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述抗体或其结合片段包含Fc区，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4区，任选地其中，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:23或56，和/或所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:24。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述抗体包含SEQ ID NO:11的重链可变结构域氨基酸序列、SEQ ID NO:16的轻链可变结构域氨基酸序列、SEQ ID NO:23或56的重链恒定区氨基酸序列、以及SEQ ID NO:24的轻链恒定区氨基酸序列。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法同时抑制嗜酸性粒细胞胞外陷阱(EET)和嗜中性粒细胞胞外陷阱(NET)的形成。

18.一种治疗或预防肺疾病的方法，包括向患有所述肺疾病的受试者施用抗体或其结合片段，所述抗体或其结合片段特异性结合至脱亚胺基的人组蛋白2A和/或组蛋白4上的瓜氨酸化表位。

19.根据权利要求18所述的方法，其中：

(a)所述病症是炎症性肺疾病；

(b)所述肺疾病的特征在于所述受试者的肺部中的嗜中性粒细胞和/或嗜酸性粒细胞的水平增加；

(c)所述方法还包括施用皮质类固醇；和/或

(d)所述受试者患有对皮质类固醇没有反应的肺疾病。