KR20210070331A - 생물막 제거를 위한 hmgb1 단백질 유도체 - Google Patents

Abstract

본원에는 동일한 효과적인 생물막 방지 활성을 갖도록 조작되었지만 더 작고 염증을 유도하지 않는 HMGB1의 유도체가 제공된다.

Description

생물막 제거를 위한 HMGB1 단백질 유도체

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2018년 10월 5일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/742,102에 대한 35 U.S.C. § 119(e) 하의 우선권을 주장하며, 상기 출원은 그 전문이 참조로 본원에 포함된다.

연방 지원의 진술

본 발명은 미국 국립 보건원 (NIH)에 의해 수여된 허가 번호 DC011818 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 발명에 특정 권리를 가진다.

개시 분야

본 발명은 일반적으로 임상 또는 산업용 박테리아 생물막(bacterial biofilm)의 감소 및/또는 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

배경

인체의 생물막에서 거주하는 박테리아는 모든 만성/재발성 질환의 약 2/3을 유발한다. 이들 생물막은 자주 주로 선천성 및 적응성 면역 체계, 항생물질 및 기타 항박테리아제가 생물막 내부의 박테리아에 접근하게 되는 것을 방지하는 DNA로 구성되는 외부 "슬라임(slime)"에 의해 보호된 박테리아로 구성된다. 생물막은 신체로부터 감염을 제거하는 것을 매우 어렵게 만든다. 나아가, 생물막은 종종 치명적인 결과로 미래의 급성 감염에 대한 저장소로서 작용할 수 있다.

단백질의 DNABII 패밀리로부터의 적어도 하나의 단백질이 모든 알려져 있는 진정세균(eubacteria)에서 발견되며 박테리아 세포의 외부에서 자연적으로 발견된다. 그것은 강력한 선천성 면역 반응을 유도하지만, 숙주 대상체는 감염의 결과로서 패밀리 구성원에 대한 특정 항체를 자연적으로 생성하지 못한다. 박테리아 생물막으로 인한 주요 문제점은 숙주 면역 체계 및/또는 항생물질 및 다른 항미생물제가 생물막 내에서 보호되는 박테리아에 접근할 수 없는 무능력이다.

생물막은 또한 산업적 환경에서도 존재한다. 예를 들어, 생물막은 생산 현장에서 주유소 저장 탱크까지, 광범위한 석유 공정 문제에 연루된다. 현장에서, 황산염 환원 생물막 박테리아는 황화수소 (시어진 오일)를 생성한다. 공정 파이프라인에서, 생물막 활성은 필터 및 오리피스를 방해하는 슬라임을 발생시킨다. 생물막 및 생물막 유기체는 또한 파이프라인 및 석유 공정 장비의 부식을 유발한다. 이들 문제는 파울링 및 부식성 생물막 유기체가 심지어 최종 제품 저장 탱크 표면에서 발견되는 정도로까지 오일 또는 가스 생산 설비 전체에서 나타날 수 있다.

가정에서, 생물막은 미생물 성장을 지지하는 임의의 표면에서 또는 위에서, 예컨대, 배수구에서, 식품 준비 표면에서, 화장실에서 및 수용장 및 스파에서 발견된다.

생물막은 가정 및 산업에서의 광범위한 수처리 과정에 연루된다. 그것은 처리 장비 표면에서 성장할 수 있고 열 전달의 저하 또는 필터 및 막의 막힘과 같이, 장비의 성능을 방해할 수 있다. 냉각탑 필터 충전물 상에서 성장하는 생물막은 충전물의 붕괴를 유발하기에 충분한 무게를 부가할 수 있다. 생물막은 고도로 특수화된 스테인레스 강의 부식도 유발한다. 수처리 공정에서 생물막은 최종 생성물의 가치를 저하시킬 수 있다. 식수 분배 시스템에서 성장하는 생물막은 잠재적인 병원성 유기체, 부식성 유기체 또는 물의 미적 품질을 저하시키는 박테리아를 보유할 수 있다.

그러므로, 관련된 박테리아 감염을 치료하거나 사멸시키고 그것을 표면으로부터 및 물 시스템에서 정화시키기 위해 생물막의 보호 장벽을 타개하기 위한 필요성이 존재한다. 본 개시는 이러한 필요성을 만족시키며 관련된 장점 또한 제공한다.

요약

박테리아 생물막은 기존의 치료 방식에 대해 다루기 힘든 것으로 악명이 높다 (예를 들어 그것은 플랑크톤 대응물보다 항미생물제에 대해 >1000배 더 내성이다). 생물막-매개 감염이 원인인 사망률 및 경제적 부담의 관점에서 높은 유병률 및 엄청난 결과를 고려하면, 새로운 치료 접근법이 시급하게 필요하다. 생물막을 정의하는 특징 중 하나는 세포외 중합체 물질로, 그 안에 생물막 세포가 내장되어 있다. 세포외 중합체 물질의 핵심 구성요소는 생물막의 구조적 통합성에 중요한 세포외 DNA 및 단백질의 박테리아 DNABII 패밀리이다. DNABII 단백질의 표적화 및 격리는 생물막을 파괴할 수 있다. 고이동성 그룹 B1 (HMGB1) 단백질은 DNABII 단백질과 동일한 DNA 구조에 결합하여 박테리아 생물막의 파괴를 유발하는 DNA-결합 진핵 단백질이다. HMGB1의 유도체는 동일한 효력이 있는 생물막 방지 활성을 갖지만 더 작고 염증을 유도하지 않도록 조작될 수 있다.

본 출원인은 본원에서 선천성 면역 이펙터의 유도체를 용도변경함으로써 박테리아 생물막-매개 감염의 치료에 새로운 개념을 개시한다. HMGB1 도메인은 기능적으로 상이하다. 생물막 방지 활성을 가지며 전염증 결과가 없는 도메인 변이체는 과도한 염증의 결과 없이 생물막-매개 감염을 치료하는 HMGB1의 한 구체예를 나타낸다. 생체내 및 생체외 실험은 박테리아 뉴클레오이드-관련 단백질의 DNABII 패밀리 (IHF 및 HU)에 대한 항체가 다양한 다루기 어려운 인간 감염을 유발하는 많은 상이한 박테리아 생물막에 대해 매우 효과적인 것을 보였다. 대조적으로, 본 개시는 과도한 염증의 결과 없이 생물막-매개 질환을 치효가 위해 면역 반응 구성요소인 HMGB1을 활용한다. 시험관내에서 박테리아 생물막은 HMGB1 및 그것의 다양한 절단된 도메인 (A 박스, B 박스, B 박스 링커, 돌연변이된 B 박스 C106S, AB 박스 및 링커를 포함한 전부)의 생물막 방지 특성에 노출되었다.

단백질 유도체를 함유하는 조성물 및 제제는 다루기 어려운 또는 만성 또는 재발성 생물막-매개 감염의 치료에 유용하다. 조성물은 내성 병원내 감염 (카테터- 또는 보철 장치-관련 감염과 같은 내재 의료기-관련 감염, 및 낭포성 섬유증 환자에서 귀 감염 및 호흡기 감염과 같은 만성/재발성 감염을 포함함)을 치료하기에 유용하다. 추가적으로, 그것들은 생물막으로부터 방출된 많은 박테리아가 숙주 방어 및 항미생물제 둘 다에 보다 더 민감한 것으로 나타났기 때문에 확립된 치료 (즉 항생물질)와 조합하여 사용될 수 있다.

그러므로, 한 측면으로, 본 개시는 K12, C23 및 C45 (예컨대 세린, 글리신, 알라닌, 발린, 아이소류신 또는 트레오닌으로부터 선택된 군으로부터의 아미노산에 대해 변형된 천연 K 또는 C)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 선택적으로 포함하는, 또는 대안적으로 본질적으로 그것으로 이루어지는, 또는 또한 그것으로 이루어지는 분리된 A 박스 폴리펩타이드 또는 그것의 동등물을 제공하며, 동등물은 K12, C23 및 C45, 예컨대 세린, 글리신, 알라닌, 발린, 아이소류신 또는 트레오닌으로부터 선택된 군으로부터의 아미노산에 대해 변형된 천연 K 또는 C로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 한 측면으로, 돌연변이는 C45S 돌연변이이다. A 박스 폴리펩타이드는 한 쪽 또는 양 말단에 위치한 링커 또는 펩타이드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 비제한적인 예는 서열 PPKGETKKKF의 폴리펩타이드 링커이다. 재조합에 의해 제조될 때, B 박스 폴리펩타이드는 부분적으로 또는 전체적으로 아세틸화, 산화 또는 인산화될 수 있다. 한 측면으로, A 박스 폴리펩타이드는 상기에서 확인된 하나 이상의 돌연변이를 선택적으로 함유하는 야생형 HMGB1 폴리펩타이드의 아미노산 1 내지 70을 포함하거나, 또는 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다.

또한 본원에는 아미노산 C106 (예컨대 세린, 글리신, 알라닌, 발린, 아이소류신 또는 트레오닌으로부터 선택된 군으로부터의 아미노산에 대한 천연 시스테인)에서의 돌연변이를 선택적으로 포함하거나, 또는 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는 분리된 B 박스 폴리펩타이드, 또는 아미노산 C106 (예컨대 세린, 글리신, 알라닌, 발린, 아이소류신 또는 트레오닌으로부터 선택된 군으로부터의 아미노산에 대한 천연 시스테인)에서의 돌연변이를 포함하는 그것의 동등물이 제공된다. 한 측면으로, B 박스 폴리펩타이드는 HMGB1 폴리펩타이드의 아미노산 약 80 내지 약 176, 또는 약 88 내지 약 164, 또는 약 89 내지 약 162, 또는 또한 추가로 약 80 내지 약 164를 포함하거나, 또는 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 야생형 HMGB1 B 박스 폴리펩타이드의 돌연변이에 대한 추가적인 위치는 도 1C에 제시된다.

B 박스 폴리펩타이드는 한 쪽 또는 양 말단에 위치한 링커 또는 펩타이드 서열를 추가로 포함할 수 있다. 비제한적인 예는 서열 PPKGETKKKF의 폴리펩타이드 링커이다. 재조합에 의해 제조될 때, 개시된 B 박스 폴리펩타이드는 부분적으로 또는 전체적으로 아세틸화, 산화 또는 인산화될 수 있다.

추가의 측면으로, 본원에는 K12, C23, C45, 또는 C106 (예컨대 세린, 글리신, 알라닌, 발린, 아이소류신 또는 트레오닌으로부터 선택된 군으로부터의 아미노산에 대해 변형된 천연 K 또는 C)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 선택적으로 포함하는, 또는 대안적으로 본질적으로 그것으로 이루어지는, 또는 또한 그것으로 이루어지는 분리된 AB 박스 폴리펩타이드 또는 K12, C23 및 C45 (예컨대 세린, 글리신, 알라닌, 발린, 아이소류신 또는 트레오닌으로부터 선택된 군으로부터의 아미노산에 대해 변형된 천연 K 또는 C)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 그것의 동등물이 제공된다. 한 측면으로, 돌연변이는 C45S 돌연변이이다. 또 다른 측면으로, 폴리펩타이드는 아미노산 C106 (예컨대 세린, 글리신, 알라닌, 발린, 아이소류신 또는 트레오닌으로부터 선택된 군으로부터의 아미노산에 대한 천연 시스테인)에서의 돌연변이, 또는 K12, C23, C45로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 돌연변이 및 아미노산 C106 (예컨대 세린, 글리신, 알라닌, 발린, 아이소류신 또는 트레오닌으로부터 선택된 군으로부터의 아미노산에 대한 천연 시스테인)에서의 돌연변이를 포함하는 그것의 동등물을 포함한다. 한 측면으로 AB 박스 폴리펩타이드 및 동등물은 C45S 및 C106S 돌연변이를 포함한다. 한 측면으로, AB 박스 폴리펩타이드 또는 그것의 동등물은 주지된 아미노산 돌연변이를 가진, 야생형 HMGB1 폴리펩타이드의 아미노산 1 내지 176, 또는 1 내지 162, 또는 또한 추가로 1 내지 164를 포함하거나, 또는 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다.

또한 추가의 측면으로, 분리된 AB 박스 폴리펩타이드는 A 박스 폴리펩타이드와 B 박스 폴리펩타이드를 연결시키도록 위치한 링커 폴리펩타이드 및, 한 측면으로, B 박스와 C 박스 폴리펩타이드를 연결시키는 제2 링커를 추가로 포함한다. 비제한적인 예는 서열 PPKGETKKKF의 폴리펩타이드 링커이다. 재조합에 의해 제조될 때, AB 또는 A, B 및 C 박스 폴리펩타이드는 부분적으로 또는 전체적으로 아세틸화, 산화 또는 인산화될 수 있다. 한 측면으로, 분리된 돌연변이된 HMGB1 폴리펩타이드는, 선택적으로 부분적으로 또는 전체적으로 아세틸화, 산화 또는 인산화될 수 있는 A 및/또는 B 박스 도메인에서, 본원에 기술된 것과 같이 1개 이상의 아미노산 치환과 함께 제공된다.

한 측면으로, 분리된 폴리펩타이드는 검출 가능한 표지를 추가로 포함한다.

또한 본원에는 어느 한 말단 또는 양 말단에 위치한 적어도 하나의 추가적인 아미노산을 추가로 포함하는, 본원에 기술된 하나 이상의 분리된 폴리펩타이드를 포함하는, 또는 대안적으로 본질적으로 그것으로 이루어지는, 또는 또한 그것으로 이루어지는 재조합 폴리펩타이드가 제공된다.

본 개시는 또한 본원에 기술된 돌연변이된 폴리펩타이드에 결합하는, 또는 돌연변이된 폴리펩타이드에 대해 유발된 항체를 제공한다. 항체는 진단 및 예측제로서 유용하다. 추가로 본원에 기술된 하나 이상의 분리된 폴리펩타이드 및/또는 항체 및 담체, 예컨대 제약학적으로 허용되는 담체가 제공된다.

본 개시는 또한 본원에 기술된 분리된 폴리펩타이드 또는 항체뿐만 아니라 그것들의 보체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 한 측면으로, 폴리뉴클레오타이드는 검출 가능하게 표지된다. 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 위해 프로모터 및/또는 인핸서에 선택적으로 작동 가능하게 연결될 수 있다. 추가로 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포와 같은 적절한 발현 시스템에서 발현시킨 후, 재조합적으로 생성된 폴리펩타이드를 생성하고 분리하는 단계에 의해 폴리펩타이드를 재조합적으로 제조하는 방법이 제공된다.

또한 추가로 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 또는 대안적으로 본질적으로 그것으로 이루어지는, 또는 또한 그것으로 이루어지는 벡터가 제공된다.

또 다른 측면으로, 본원에는 본원에 기술된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 또는 벡터 중 하나 이상을 포함하는 분리된 숙주 세포가 제공된다. 담체 및 본원에 기술된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 또는 벡터 중 하나 이상을 포함하는 조성물이 추가로 제공된다. 한 측면으로, 담체는 제약학적으로 허용되는 담체이다.

폴리펩타이드 및 그것을 포함하는 조성물은 다중 용도를 가진다. 예를 들어, 그것들은 DNABII 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 미생물 DNA를 본원에 기술된 폴리펩타이드 또는 조성물과 접촉시킴으로써 DNABII 폴리펩타이드 또는 단백질의 미생물 DNA에의 결합을 억제, 경합 또는 적정하는 방법에 사용될 수 있다. 그것들은 또한 생물막을 본원에 기술된 폴리펩타이드 또는 조성물과 접촉시킴으로써 미생물 생물막을 억제, 방지 또는 분해하는 방법에 사용될 수 있다.

폴리펩타이드 및 조성물은 또한 대상체에게 유효량의 본원에 기술된 조성물 또는 폴리펩타이드를 투여함으로써, 대상체에서 생물막을 억제, 방지 또는 분해하는 방법 또는 생물막과 관련된 감염 또는 질환을 치료하는 방법에 사용될 수 있다.

폴리펩타이드 및 조성물은 추가로 대상체에게 유효량의 본원에 기술된 조성물 또는 폴리펩타이드를 투여함으로써, 대상체에서 생물막을 생성하는 미생물 감염을 억제, 방지 또는 치료하는 방법에 사용될 수 있다.

방법은 기저 감염을 치료하기 위하여 유효량의 추가 작용제, 예컨대 항미생물제를 접촉시키거나 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

이들 방법에 의해 치료될 수 있는 생물막 및 감염은 박테리아 감염, 예컨대 ESKAPE 병원체, 요로병원성 대장균 (UPEC), 클레브시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia), 버크홀데리아 세노세파시아(Burkholderia cenocepacia), 스타필로코커스 에피더미디스(S. epidermidis), 스트렙토코커스 아갈락티아(Streptococcus agalactiae), 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 트레포네메스 덴티콜라, 팔리듐(Treponemes, denticola, pallidum), 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia), 버크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) (비피막형)(NTHI), 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 또는 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 의한 감염에 의해 유발될 수 있다. 생물막에 의해 유발된 장치 관련 감염으로는, 예를 들어, 심실 유도, 콘택트 렌즈, 기관내 튜브, 인공 심장 판막, 심박 조율기, 및 혈관 생착, 조직 필러 및 유방 임플란트, 말초 혈관 카테터, 요로 카테트, 정형외과 임플란트 및 인공 관절 상의 감염을 들 수 있다. 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 조직 관련 감염으로는, 예를 들어, 만성 중이염, 만성 부비동염, 만성 편도선염, 치석, 만성 후두염, 심내막염, 폐 감염 (상부, 중간, 하부 기도 감염 (이염, 부비동염, 기관지염, 뿐만 아니라 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)의 악화, 만성 기침, 낭성 섬유증 (CF) 및 지역 사회 후천성 폐렴 (CAP)의 합병증 및/또는 일차 원인)), 신장 결석, 담도 감염, 요로 감염, 버크홀데리아 감염, 골수염, 표피의 상처 및 만성 상처를 들 수 있다.

대상체는 인간, 또는 유아 또는 유소년과 같은 포유류일 수 있다.

또한 본원에 기술된 분리된 폴리펩타이드, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 숙주 세포, 또는 조성물 및 사용 설명서를 포함하는, 또는 대안적으로 본질적으로 그것들로 이루어지는, 또는 또한 추가로 그것들로 이루어지는 키트가 추가로 제공된다.

도 1A-1D: HMGB1, DNABII/HMGB1-DNA 복합체의 구조. (도 1A) HMGB1은 3개의 도메인으로 구성된다: A 박스, B 박스, 및 산성 C 꼬리. A + B 박스는 주로 DNA 결합 도메인 (괄호)인 한편, C 꼬리는 핵의 기능, 전사 자극, 및 항박테리아 활성을 매개한다. 각각의 도메인에 대한 AA가 표시된다 (좌측). C23 및 C45는 이황화 결합을 형성할 수 있어서, 감소된 DNA 결합 친화성 및 증가된 전염증 활성을 초래한다. C106은 RLR4-MD2 결합을 통해 전염증 활성을 매개한다. C106S 돌연변이는 결합의 손실 없이 전염증 반응을 감소시키는 것으로 나타났다. (도 1B) 좌측: DNA에 결합된 IHF 다이머. IHF의 β-리본 팔은 마이너 그루브를 관통하여 DNA를 구부려서, 분자를 오목한 쪽으로부터 N-말단 α-나선 주위로 감싼다. 우측: DNA에 결합된 2개의 HMGB1 A 박스 도메인; 천연 HMGB1의 A 박스 및 B 박스 결합을 모방한다. α-나선은 마이너 그루브에 결합하여, DNA 분자를 오목한 쪽으로부터 구부린다. PDB 4QR9로부터 변형됨. HMGB1 폴리펩타이드, 절단물, 융합물 및 돌연변이 버전의 아미노산 서열이 하기 서열 목록에 제공된다. (도 1C) HMGB1 B 박스 구성물은 N- 및 C-말단 링커뿐만 아니라 그 사이에 가요성 링커가 있는 2개의 예측된 α-나선형 영역으로 구성된다. B 박스의 다중 아미노산 (AA)은 번역 후에 변형될 수 있다 (PTM, Lys의 아세틸화/메틸화, Asn의 글리코실화, Tyr의 인산화, Cys의 산화). 그러나, B 박스 PTM은 LC-MS/MS 분석으로부터 관찰된 rHMGB1 또는 nHM 펩타이드의 >20%에서 존재하지 않았다. (도 1D) 절단은 N- 및 C-말단부로부터뿐만 아니라 2개의 α-나선형 영역 중 어느 하나로부터 가요성 링커를 제거한다. 2개의 최소 나선 영역 절단 (AA 99-133, 138-164)은 생물막 방지 활성을 유지하는 것으로 여겨진다.
도 2: HMGB1-매개 생물막 붕괴 모델. DNABII 단백질은 홀리데이 접합 (HJ)을 닮은 정점 구조(vertex structure)에 대한 결합을 통해 eDNA 스캐폴드를 안정화한다. 항체 (Y)는 DNABII 단백질을 격리시킬 수 있고 동적 평형을 이동시킬 수 있어서, 붕괴를 유발한다. HMGB1은 또한 DNA 결합을 통해 eDNA 구조를 탈안정화시켜서 일시적인, 불안정한 중간체를 형성할 수 있다 (괄호).
도 3: HMGB1 및 구성된 변이체의 구조. 대장균에서 발현된 전장 재조합 HMGB1 (rHMGB1)은 A 박스, B 박스, 및 C 꼬리로 구성된 3개의 도메인을 함유한다. HMGB1 AB 박스 구성물은 A 및 B 도메인 및 B 박스와 C 꼬리 사이의 C 말단 링커로 구성되지만, 꼬리가 없다. A 박스 구성물은 A 박스 및 A 박스와 B 박스 사이의 C-말단 링커를 함유하지만, B-박스 및 C 꼬리가 없다. B 박스 구성물은 N- 및 C-말단 링커를 함유하지만 A 박스 및 C 꼬리가 없다. rHMGB1의 C45S 돌연변이 (mHMGB1) 및 B 박스의 C106S 돌연변이 (mB 박스)는 HMGB1의 전염증 활성을 감소시키기 위해 생성되었다. 또한 도 1 참조.
도 4: HMGB1 변이체는 DNA 결합 능력을 유지한다. 증가하는 농도 (100 & 250 nM)의 상업적으로 이용 가능한 소 HMGB1 (bHMGB1), B 박스 C106S (mB 박스), rHMGB1, HMGB1 C45S (mHMGB1), A 박스, B 박스, 및 A+B 박스가 5' 단부 표지된 6-카르복시플루오레세인 표지된 홀리데이 접합 (HJ) DNA (20 nM)와 함께 인큐베이션된 후 6% 비변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분해되었다. HMGB1 및 HMGB1 변이체는 차등 HJ 이동에 의해 예시되는 것과 같이 DNA 결합 활성을 보유한다.
도 5A-5E: 우선순위가 높은 박테리아 병원체에 미치는 HMGB1 변이체의 생물막 방지 효과. DNABII 단백질에 대한 표시된 HMGB1 변이체 또는 항체 (α-IHF_Ec IgG, 1 μM)가, 시험관내에서 각각의 사전형성된 박테리아 생물막에 24시간째에 첨가되었다. 16시간의 인큐베이션 후에, 생물막은 LIVE/DEAD®로 염색된 후, 공초점 레이저 주사 현미경을 통해 시각화되었다. 이미지는 COMSTAT에 의해 분석되어 평균 두께가 계산되었고 대조군에 대한 비교가 도표화되었다. (도 5A) 전장 HMGB1 동형(isoform) (다르게 표시되지 않는 한 200 nM)이 UPEC, 버크홀데리아 세노세파시아, NTHI, 또는 ESKAPE 병원체에 첨가되었다. 800 nM rHMGB1 및 200 nM mHMGB1이 스타필로코커스 아우레우스 (ESKAPE)에 첨가되었다. 800 nM rHMGB1, 800 nM mHMGB1, 또는 3.3 μM의 α-IHF_Ec lgG가 엔테로코커스 패시움(E. faecium) (ESKAPE)에 대해 첨가되었고 엔테로코커스 패시움 프로테아제에 의한 잠재적 분해를 피하기 위해 16시간이 아닌 1시간 동안 인큐베이션되었다. (도 5B) 증가하는 농도의 rHMGB1과 함께 인큐베이션된 UPEC 생물막의 대표적인 이미지. (도 5C) HMGB1의 개별 도메인 (200 nM)이 상기와 같이 생물막 방지 활성에 대해 테스트되었다 (점선은 대조군 값을 나타냄). 막대는 SEM을 나타낸다. 대조군과 비교한 통계학적 유의성은 독립표본 t-검정으로 평가되었다, *P<0.05. A 박스가 아닌 HMGB1 및 그것의 변이체가 우선 순위가 높은 인간 병원체에 의해 형성된 확립된 생물막을 상당히 파괴할 수 있었다. (도 5D - 5E) HMGB1 및 변이체는 사전형성된 클레브시엘라 뉴모니아 생물막을 파괴한다. rHMGB1, HMGB1 C45S (mHMGB1), 소 HMGB1 (bHMGB1), B 박스, B 박스 C106S (mB 박스), A 박스, 및 A+B 박스가 24시간째에 사전형성된 클레브시엘라 뉴모니아 생물막에 첨가되었다 (200 nM). 16시간의 인큐베이션 후에, 생물막은 LIVE/DEAD®로 염색된 후, 공초점 레이저 주사 현미경을 통해 시각화되었다. 이미지는 Comstat에 의해 분석되어 평균 두께 및 총 바이오매스가 계산되었다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. ***P<0.0001; ns=유의하지 않음. A 박스가 아닌, HMGB1 및 그것의 변이체가 확립된 클레브시엘란 뉴모니아 생물막을 상당히 파괴하였다.
도 6: HMGB1 변이체는 병원성 생물막을 파괴한다. HMGB1의 개별 도메인 (200 nM)이 상기와 같이 생물막 방지 활성에 대해 테스트되었다 (점선은 대조군 값을 나타냄). 막대는 SEM을 나타낸다. *P<0.05. A 박스가 아니라 HMGB1 및 그것의 변이체가 우선 순위가 높은 인간 병원체에 의해 형성된 확립된 생물막을 상당히 파괴할 수 있었다.
도 7A-7G: HMGB1은 패혈증을 유도하지 않으면서 마우스로부터 S. 세노세파카(S. cenocepaca)의 제거를 촉진한다. C57BL/6 마우스가 10⁷ CFU로 기관내로 도전되었고, 동시에 (예방) 또는 24시간 후에 (치료) 0.2 nmol의 HMGB1 변이체를 받았다. (도 7A) 버크홀데리아 세노세파시아의 응집체는 α-버크홀데리아 세노세파시아 항체로 프로빙된 폐 섹션에서 형광 현미경에 의해 시각화되었다. 예방의 경우, (도 7B) 접종 후 (hpi) 18시간 째에 수집된 기관지폐포 세척물 (BAL)이 CFU에 대해 분석되었다. (도 7C) BAL 중의 호중구가 차등 세포 계수에 의해 정량화되었다. (도 7D) 72 hpi에 수집된 폐 조직이 고정되고, 내장되고, 섹션화되고, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색되었다 (10X 배율). 치료의 경우, 72 hpi (도 7E) CFU가 BAL에서 정량화되었다. (도 7F) 호중구 충원이 HMGB1 변이체의 복강내 (i.p.) 투여 후 24시간 후에 α-CD45, α-CD11b, 및 αLy-6G로 염새색된 복강 세척물의 형광-활성화 세포 분류에 의하여분석되었다. (도 7G) 혈청 TNF-α가 0.2 nmol의 HMGB1 변이체, 5 mg/kg LPS, 또는 둘 다로 복강내 주사된 마우스에서 ELISA에 의해 측정되었다. LoD: 검출 한계. 막대는 SD를 나타낸다. *P<0.05. HMGB1 치료는 폐에서 버크홀데리아 세노세파시아 CFU를 상당히 감소시켰고, HMGB1 Cys에서 Ser로의 돌연변이는 전염증 활성을 제거하였으며 HMGB1 변이체 중 어느 것도 패혈증을 유도하지 않았다.
도 8A-8F: rHMGB1 및 mHMGB1은 실험 중이염 모델에서 생물막 분해를 촉진한다. 희석된, 0.2 nmol의 rHMGB1, 또는 0.2 nmol의 mHMGB1이 NTHI로 도전된 후 4일 및 5일째에 친칠라의 중이에 직접 전달되었다. 동물은 24시간 후에 희생되었고, 중이가 이미지화되었으며 (도 8C, 대표 이미지), (도 8A, 생물막) 및 (도 8B, 염증)에서 기술된 기준을 토대로, 생물막의 존재 (도 8D) 및 염증 (도 8F)에 대해 맹검식으로 채점되었다. 점막 바이오매스에 존재하는 NTHI의 CFU가 정량화되었다 (도 8E). 평균 및 SEM이 도표화된다. **P<0.01, ****P<0.0001. 이미지 채점 및 CFU 정량화는 rHMGB1 및 mHMGB1이 둘 다 생체내에서 확립된 NTHI 생물막의 제거를 촉진하였음을 입증한다. 특히 mHMGB1은 과도한 염증을 유도하지 않았다.
도 9: HMGB1은 항생물질-매개 사멸을 강화한다. 버크홀데리아 세노세파시아 생물막이 추가로 16시간 동안 미노싸이클린(minocycline) (1 μg/ml), rHMGB1 (200 nM), 또는 rHMGB1 (200 nM) + 미노싸이클린 (1 μg/ml)의 첨가 전 24시간 동안 형성되었다. 생물막은 LIVE/DEAD®로 염색되고 CLSM을 통해 이미지화되었다. 살아있는 세포는 녹색으로 표시되고 죽은 세포는 적색으로 표시된다. 죽은 세포의 증가는 HMGB1 및 미노싸이클린 둘 다의 존재 하에서만 주지된다.
도 10A-10B: 생물막-관련 질환으로부터의 시편 중의 HMGB1. (도 10A) NTHI-감염된 친칠라 중이로부터의 OCT-내장된 점막 바이오매스의 섹션이 면역형광 현미경을 위해 HMGB1 및 DNABII 단백질에 대해 공동표지되었다. 이중 가닥 eDNA는 DAPI로 표지되었다 (백색). (도 10B) CF 가래는 생물막 방지 치료 (PBS, 1:10 토끼 a-IHF_Ec, 혈청, 100 U/ml Pulmozyme® (DNase), 1 mM rHMGB1)와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션되었고 주변 배지의 광학 밀도가 0시간 및 2시간째에 측정되었다. DNABII 단백질 및 HMGB1은 생체내에서 부추겨진(fanned) 점막 생물막에 존재하지만 eDNA 상에 공동 국지화되지 않는다. 외인성 HMGB1이 CF 가래에 존재하는 생물막을 파괴할 수 있다.

다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적이고 과학적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 사람이 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 비록 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 또는 물질이 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 물질이 이제 기술된다. 본원에서 인용된 모든 기술 및 특허 출판물은 본원에 그 전문이 참조로 포함된다. 본원의 어떠한 것도 개시가 선행 개시에 의해 그러한 개시를 선행할 자격이 있는 것으로 인정되는 해석되지 않아야 한다.

본 개시의 실시는 다르게 표시되지 않는 한, 기술분야의 숙련도 내에 있는, 조직 배양, 면역학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학 및 재조합 DNA의 종래 기법들을 사용할 것이다. 예컨대, Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^rd edition; the series Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5^th edition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; 미국 특허 제 4,683,195; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); 및 Herzenberg et al. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology 참조.

모든 수치 표시, 예컨대, 범위를 포함한 pH, 온도, 시간, 농도 및 분자량은 필요에 따라 1.0 또는 0.1의 증분씩 (+) 또는 (-)로 달라지거나, 또는 +/- 15%, 또는 대안으로 10%, 또는 대안으로 5% 또는 대안으로 2%의 편차로 달라지는 근사치이다. 비록 언제나 분명하게 진술되는 것은 아니지만, 모든 수치 표시는 용어 "약"이 선행되는 것이 이해되어야 한다. 또한 비록 언제나 분명하게 진술되는 것은 아니지만, 본원에 기술된 시약은 단지 예시적인 것이며 그것의 동등물이 기술분야에 알려져 있는 것이 이해되어야 한다.

명세서 및 청구범위에서 사용되는 바, 단수 형태의 용어들은 맥락이 분명하게 다른 것을 나타내지 않는 한 복수의 대상물을 포함한다. 예를 들어, 용어 "폴리펩타이드"는 그것의 혼합물을 포함한, 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 인용된 요소를 포함하지만, 다른 것을 배제하지 않는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용될 때 "본질적으로 이루어지는"은 의도된 용도를 위한 조합에 대해 중요한 임의의 본질 외의 다른 요소를 배제하는 것을 의미할 것이다. 그러므로, 본질적으로 본원에서 정의된 요소로 이루어지는 조성물은 분리 및 정제 방법 및 제약학적으로 허용되는 담체, 예컨대 인산염 완충 식염수, 보존제 등으로부터의 미량의 오염물을 배제하지 않을 것이다. "이루어지는"은 본 개시의 조성물을 투여하기 위한 다른 성분 및 실질적인 방법 단계의 미량 요소 이상을 배제하는 것을 의미할 것이다. 이들 이행 용어(transition term)의 각각에 의해 정의된 구체예는 본 개시의 범주 내에 있다.

"생물막"은 때때로 구조물의 표면에 부착할 수 있고, 그것들이 분비하거나 및/또는 방출하는 중합체 - 예컨대 DNA -와 함께, 유기이거나 무기일 수 있는, 미생물의 얇은 층 또는 조직화된 공동체를 의미한다. 생물막은 마이크로바이오틱(microbiotics) 및 항미생물제에 대해 매우 내성이다. 그것은 치은 조직(gingival tissue), 치아 및 복원물에 살면서, 충치 및, 또한 치주 플라크 질환으로도 알려져 있는 치주 질환을 유발한다. 그것은 또한 만성 중이 감염을 유발한다. 생물막은 또한 치과 임플란트, 스텐트, 카테터 선 및 콘택트 렌즈 표면에서도 형성된다. 그것은 심박 조율기, 심장 판막 대체물, 인공 관절 및 기타 수술 임플란트 상에서 성장한다. 미국 질병 통제 센터는 병원내 (병원-획득) 감염의 65% 이상이 생물막에 의해 유발된다고 추정한다. 진균성 생물막은 또한 빈번하게 의료 장치를 오염시킨다. 그것은 만성 질 감염을 유발하고 불안정한 면역 체계를 가진 사람들에게서 생명을 위협하는 전신성 감염으로 이어진다. 생물막은 또한 수많은 질환에 관여한다. 예를 들어, 낭포성 섬유증 환자는 자주 항생물질 내성 생물막을 초래하는 슈모모나스 감염을 가지고 있다.

"DNABII 폴리펩타이드 또는 단백질"은 DNA-결합 도메인으로 구성되고, 그러므로 DNA에 대한 특정 또는 일반적인 친화성을 가지는 DNA 결합 단백질 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 한 측면으로, 그것은 DNA에 마이너 그루브에서 결합한다. DNABII 단백질의 비제한적인 예는 대장균 균주 U93 (HU)으로부터의 통합 숙주 인자 (IHF) 단백질 및 히스톤-유사 단백질이다. 생물막과 관련될 수 있는 다른 DNA 결합 단백질로는 DPS (Genbank 등록 번호: CAA49169), H-NS (Genbank 등록 번호: CAA47740), Hfq (Genbank 등록 번호: ACE63256), CbpA (Genbank 등록 번호: BAA03950) 및 CbpB (Genbank 등록 번호: NP_418813)를 들 수 있다.

"통합 숙주 인자" 또는 "IHF" 단백질은 박테리오파지에 의해 숙주 박테리아에 그것의 DNA를 통합시키기 위해 사용되는 박테리아 단백질이다. 이것들은 유전자 재조합에서뿐 아니라 전사 및 번역 조절에서 기능하는 DNA 결합 단백질이다. 그것들은 또한 세포외 미생물 DNA에 결합한다. 대장균에서 IHF 단백질 하위유닛을 암호화하는 유전자는 himA (Genbank 등록 번호: POA6X7.1) 및 himD (POA6Y1.1) 유전자이다. 이들 유전자에 대한 상동체는 다른 유기체에서 발견되며, 다른 유기체로부터의 이들 유전자에 상응하는 펩타이드는 표 1에서 찾아볼 수 있다.

"HMGB1"은 DNA의 마이너 그루브에 결합하여 그것을 비틀며 간섭제의 예가 되는 고이동성 그룹 박스 (HMGB) 1 단백질이다. 재조합체 또는 분리된 단백질 및 폴리펩타이드는 Atgenglobal, ProSpecBio, Protein 1 및 Abnova로부터 상업적으로 입수 가능하다.

"A 박스" 폴리펩타이드는 HMGB1 단백질의 A 박스 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. A 박스 폴리펩타이드는 돌연변이되거나 링커 서열, 신호 서열 또는 분비 서열과 같은 추가 서열을 함유할 수 있다. 비제한적인 예가 도면 및 서열 목록에서 제시된다. 아미노산 K12, C23 및 C45의 하나 이상의 점 돌연변이가 도입될 수 있다.

"B 박스" 폴리펩타이드는 HMGB1 단백질의 B 박스 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. B 박스 폴리펩타이드는 돌연변이되거나 링커 서열, 신호 서열 또는 분비 서열과 같은 추가 서열을 함유할 수 있다. 아미노산 K114 또는 C106의 점 돌연변이가 DNA 결합, 염증 특성, 및 생물막 방지 활성을 이루기 위하여 도입될 수 있다. 비제한적인 예가 도면 및 서열 목록에서 제시된다.

"AB 박스" 폴리펩타이드는 함께 융합되지만 전장 야생형 단백질에 상응하는 아미노산이 없는, HMGB1 단백질의 A 및 B 박스 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. AB 박스 폴리펩타이드는 돌연변이되거나 링커 서열, 신호 서열 또는 분비 서열과 같은 추가 서열을 함유할 수 있다. 본원에 기술된 아미노산의 (예컨대, 아미노산 K12, C23, C45, C106, 및/또는 K114에서의) 하나 이상의 점 돌연변이가 DNA 결합, 염증 특성, 및 생물막 방지 활성을 이루기 위하여 도입될 수 있다. 비제한적인 예가 도면 및 서열 목록에서 제시된다.

"HU" 또는 "대장균 균주 U93으로부터의 히스톤-유사 단백질"은 대장균과 전형적으로 관련된 헤테로다이머 단백질의 부류를 나타낸다. HU 단백질은 DNA 접합부에 결합하는 것으로 알려져 있다. 관련된 단백질은 다른 미생물로부터 분리되었다. 대장균 HU의 완전한 아미노산 서열은 Laine 등에 의해 보고되었다: Laine et al. (1980) Eur. J. Biochem. 103(3):447-481. HU 단백질에 대한 항체는 Abcam사로부터 상업적으로 입수 가능하다.

"링커" 또는 "펩타이드 링커"는 폴리펩타이드 서열의 N-말단 또는 C-말단 중 어느 하나에 연결된 펩타이드 서열을 나타낸다. 한 측면으로, 링커는 약 1 내지 약 20개 아미노산 잔기의 길이이거나 또는 대안으로 2 내지 약 10개, 약 3 내지 약 5개 아미노산 잔기 길이이다. 펩타이드 링커의 예는 Gly-Pro-Ser-Leu-Lys-Leu 또는 PPKGETKKKF이다.

"미생물 DNA"는 생물막을 생성하는 미생물로부터의 단일 또는 이중 가닥 DNA를 의미한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "검출 가능한 표지"는 검출될 조성물에 직접적으로 또는 간접적으로 콘쥬게이션된 직접 또는 간접적으로 검출 가능한 화합물, 예컨대, "표지된" 조성물을 생성하기 위한 N-말단 히스티딘 태그 (N-His), 자기 활성 동위원소, 예컨대,　¹¹⁵Sn,　¹¹⁷Sn 및　¹¹⁹Sn, ¹³C 및　¹⁵N과 같은 비-방사성 동위원소, 폴리뉴클레오타이드 또는 항체와 같은 단백질을 의미한다. 용어는 또한 삽입된 서열의 발현 시에 신호, 예컨대 녹색 형광 단백질 (GFP) 등을 제공할 폴리뉴클레오타이드에 콘쥬게이션된 서열을 포함한다. 표지는 자체적으로 검출 가능하거나 (예컨대, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지) 또는, 효소 표지의 경우, 검출 가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다. 표지는 소규모 검출에 적합하거나 또는 고처리량 스크리닝에 보다 더 적합할 수 있다. 그와 같은, 적합한 표지로는, 한정하는 것은 아니지만 자기 활성 동위원소, 비-방사성 동위원소, 방사성 동위원소, 형광색소(fluorochromes), 화학발광 화합물, 염료, 및 효소를 포함한 단백질을 들 수 있다. 표지는 간단하게 검출되거나 또는 정량화될 수 있다. 간단하게 검출되는 반응은 일반적으로 그것의 존재가 단순히 확인되는 반응을 포함하는 반면, 정량화되는 반응은 일반적으로 세기, 편광, 및/또는 다른 특성과 같이 정량화 가능한 (예컨대, 숫자로 기록 가능한) 값을 가지는 반응을 포함한다. 발광 또는 형광 검정에서, 검출 가능한 반응은 결합에 실제로 관여하는 검정 구성요소와 관련된 발광단 또는 형광단을 사용하여 직접적으로, 또는 다른 (예컨대, 리포터 또는 지표) 구성요소와 관련된 발광단 또는 형광단을 사용하여 간접적으로 생성될 수 있다. 신호를 생성하는 발광 표지의 예로는, 한정하는 것은 아니지만 생물발광 및 화학발광을 들 수 있다. 검출 가능한 발광 반응은 일반적으로 발광 신호의 변화, 또는 그것의 발생을 포함한다. 발광에 의해 표지화하는 검정 구성요소에 대한 적합한 방법 및 발광단은 기술분야에 알려져 있고 예를 들어 다음 문헌에서 기술되어 있다: Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6^thed). 발광 프로브의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 에쿼린(aequorin) 및 루시페라제를 들 수 있다.

"유전자 전달 비히클"은 삽입된 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 전달할 수 있는 임의의 분자로서 정의된다. 유전자 전달 비히클의 예는 리포좀, 천연 중합체 및 합성 중합체를 포함한 미셸 생체부합성 중합체; 리포단백질; 폴리펩타이드; 다당류; 리포다당류; 인공 바이러스 엔벨로프; 금속 입자; 및 박테리아, 또는 바이러스, 예컨대 배큘로바이러스, 아데노바이러스 및 레트로바이러스, 박테리오파지, 코스미드, 플라스미드, 진균 벡터 및 다양한 진핵 및 원핵 숙주에서의 발현에 대해 기술되었고, 유전자 요법에 대해서뿐만 아니라 간단한 단백질 발현에 대해서도 사용될 수 있는, 기술분야에서 전형적으로 사용되는 다른 재조합 비히클이다.

본 개시의 폴리뉴클레오타이드는 유전자 전달 비히클을 사용하여 세포 또는 조직으로 전달될 수 있다. 본원에서 사용되는 "유전자 전달", "유전자 전달", "형질도입", 등은 도입에 사용된 방법과 관계 없이, 외인성 폴리뉴클레오타이드 (때로 "도입유전자"로도 언급됨)의 숙주 세포에의 도입을 나타내는 용어이다. 그러한 방법은 벡터-매개 유전자 전달 (예컨대, 바이러스 감염/트랜스펙션, 또는 다양한 다른 단백질-기반 또는 지질-기반 유전자 전달 복합체에 의한)뿐만 아니라 "네이키드" 폴리뉴클레오타이드의 전달을 용이하게 하는 기법 (예컨대 전기천공법, "유전자 총" 전달 및 폴리뉴클레오타이드의 도입을 위해 사용되는 다양한 다른 기법들)과 같이 다양한 잘 알려져 있는 기법을 포함한다. 도입된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포에서 안정적으로 또는 일시적으로 유지될 수 있다. 적합한 유지는 전형적으로 도입된 폴리뉴클레오타이드가 숙주 세포와 부합하는 복제 기원을 함유하거나 또는 염색체외 레플리콘 (예컨대, 플라스미드)과 같은 숙주 세포의 레플리콘 또는 핵 또는 미토콘드리아 염색체에 통합되는 것을 필요로 한다. 많은 벡터가 기술분야에 알려져 있고 본원에서 기술된 것과 같이, 포유류 세포에 유전자의 전달을 매개할 수 있는 것으로 알려져 있다.

본원에서 사용되는 용어 "eDNA"는 병원성 생물막에 대한 구성요소로서 발견된 세포외 DNA를 나타낸다.

본원에서 사용되는 바, ESKAPE 병원체는 엔테로코커스 패시움, 스타필로코커스 아우레우스, 클레브시엘라 뉴모니아,　아시네박터 바우만니이(Acinetobacter baumannii), 슈도모나스 아에루기노사, 및 엔테로박터 종을 포함한다. 이들 병원체는 전 세계적으로 병원내 감염의 주된 요인이다.

"플라스미드"는 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있는, 염색체 DNA와 별도의 염색체외 DNA 분자이다. 많은 경우에, 그것은 원형이며 이중 가닥이다. 플라스미드는 미생물 집단 내에서 수평적인 유전자 전달을 위한 메커니즘을 제공하며 전형적으로 주어진 환경 상태 하에서 선택적인 장점을 제공한다. 플라스미드는 경쟁적인 환경 틈새시장에서 자연적으로 발생하는 항생물질에 대한 내성을 제공하는 유전자를 운반할 수 있거나, 또는 대안으로 생성된 단백질은 유사한 환경 하에서 독소로서 작용할 수 있다.

유전자 조작에 사용된 "플라스미드"는 "플라스미드 벡터"로서 불린다. 많은 플라스미드가 그러한 용도를 위해 상업적으로 입수 가능하다. 복제될 유전자는 세포를 특정 항생물질 및 그 위치에서 DNA 단편의 쉬운 삽입을 가능하게 하는 여러 개의 통상적으로 사용되는 제한 부위를 함유하는 짧은 영역인 다중 클로닝 부위 (MCS, 또는 폴리링커)에 대해 내성으로 만드는 유전자를 함유하는 플라스미드의 복사물에 삽입된다. 플라스미드의 또 다른 주요 용도는 대량의 단백질을 만드는 것이다. 이 경우, 연구자는 관심 있는 유전자를 은닉한 플라스미드를 포함하고 있는 박테리아를 성장시킨다. 박테리아가 그것의 항생물질 내성을 부여하는 단백질을 생성하는 것과 같이, 그것은 또한 삽입된 유전자로부터 다량의 단백질을 생성하도록 유도될 수 있다. 이것은 유전자 또는 나중에 그것이 코딩하는 단백질을 대량 생산하는 값싸고 용이한 방법이다.

"효모 인공 염색체" 또는 "YAC"는 큰 DNA 단편 (100 kb보다 크고 최대 3000 kb)을 클로닝하기 위해 사용되는 벡터를 나타낸다. 그것은 인공적으로 구성된 염색체이고 효모 세포에서 복제 및 보존에 필요한 텔로머, 센트로머, 및 복제 기원 서열을 함유한다. 초기 원형 플라스미드를 사용하여 구성되면, 그것은 제한 효소를 사용함으로써 선형화된 후, DNA 결찰효소가 관심의 서열 또는 유전자를 코헤시브(cohesive) 단부를 사용함으로써 선형 분자 내에 첨가할 수 있다. 효모 발현 벡터, 예컨대 YAC, YIp (효모 통합 플라스미드), 및 YEp (효모 에피솜 플라스미드)는 효모 자체가 진핵 세포이기 때문에 당업자가 번역후 변형을 포함한 진핵 단백질 생성물을 얻을 수 있기 때문에 매우 유용하지만, YAC는 BAC보다 더 불안정하여 키메릭 효과(chimeric effect)를 유발하는 것으로 나타났다.

"바이러스 벡터"는 생체내에서, 생체 외에서 또는 시험관내에서, 숙주 세포에 전달될 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합에 의해 제조된 바이러스 또는 바이러스 입자로서 정의된다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터 등을 들 수 있다. 감염성 담배 모자이크 바이러스 (TMV)-기반 벡터가 단백질을 제조하기 위해 사용될 수 있고 담배 잎에서 그리피스신(Griffithsin)을 발현하는 것으로 보고되었다 (O'Keefe et al. (2009) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 106(15):6099-6104). 알파바이러스 벡터, 예컨대 셈리키 포리스트(Semliki Forest) 바이러스-기반 벡터 및 신드비스(Sindbis) 바이러스-기반 벡터가 또한 유전자 요법 및 면역요법에 사용하기 위해 개발되었다. Schlesinger & Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439 및 Ying et al. (1999) Nat. Med. 5(7):823-827 참조. 유전자 전달이 레트로바이러스 벡터에 의해 매개되는 측면에서, 벡터 구성물은 레트로바이러스 게놈 또는 그것의 일부, 및 치료 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다.

본원에서 사용되는 바, "레트로바이러스 매개된 유전자 전달" 또는 "레트로바이러스 형질도입"은 유전자 또는 핵산 서열이 세포에 진입하고 숙주 세포 게놈에 그것의 게놈을 통합시키는 바이러스에 의해 안정적으로 숙주 세포에 전달되는 과정과 동일한 의미를 포함하며 나타낸다. 바이러스는 숙주 세포에 그것의 정상적인 감염 메커니즘을 통해 진입할 수 있거나 또는 세포에 진입하기 위하여 상이한 숙주 세포 표면 수용체 또는 리간드에 결합하도록 변형될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 레트로바이러스 벡터는 외인성 핵산을 바이러스 또는 바이러스-유사 진입 메커니즘을 통해 세포에 도입시킬 수 있는 바이러스 입자를 나타낸다.

레트로바이러스는 그것의 유전자 정보를 RNA의 형태로 보유한다; 그러나, 바이러스가 세포를 감염시킨 후에, RNA는 DNA 형태로 역전사되고, 그것은 감염된 세포의 게놈 DNA에 통합된다. 통합된 DNA 형태는 프로바이러스로 불린다.

유전자 전달이 DNA 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스 (Ad) 또는 아데노-관련 바이러스 (AAV)에 의해 매개되는 측면에서, 벡터 구성물은 바이러스 게놈 또는 그것이 일부, 및 도입유전자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다. 아데노바이러스 (Ad)는 상대적으로 잘 특성화된, 바이러스의 균일한 그룹이며, 50개를 넘는 혈청형을 포함한다. 예컨대, 국제 PCT 출원 번호 WO 95/27071 참조. Ad는 숙주 세포 게놈에 통합될 필요가 없다. 재조합 Ad 유래 벡터, 특히 야생형 바이러스의 재조합 및 생성의 가능성이 감소된 것들이 또한 구성되었다. 국제 PCT 출원 번호 WO 95/00655 및 WO 95/11984. 야생형 AAV는 숙주 세포의 게놈에 통합되는 높은 감염성 및 특이성을 가진다. Hermonat & Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470 및 Lebkowski et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996 참조.

프로모터 및 그 안으로 폴리뉴클레오타이드가 작동 가능하게 연결될 수 있는 클로닝 부위 두 가지를 모두 함유하는 벡터는 기술분야에 잘 알려져 있다. 그러한 벡터는 시험관내에서 또는 생체내에서 RNA를 전사할 수 있고, Stratagene (La Jolla, CA) 및 Promega Biotech (Madison, WI)와 같은 공급처로부터 상업적으로 입수 가능하다. 발현 및/또는 시험관내 전사를 최적화하기 위하여, 가외의, 잠재적인 부적절한 대체 번역 개시 코돈 또는 발현을 간섭하거나 감소시킬 수 있는 다른 서열을 제거하기 위하여, 전사 또는 번역 수준에서, 클론의 5' 및/또는 3' 미번역 부분을 제거, 첨가 또는 변경시키는 것이 필요할 수 있다. 대안으로, 공통 리보솜 결합 부위가 발현을 증강시키기 위하여 시작 코돈의 바로 5'에 삽입될 수 있다.

유전자 전달 비히클은 또한 DNA/리포좀 복합체, 미셸 및 표적화된 바이러스 단백질-DNA 복합체를 포함한다. 표적화 항체 또는 그것의 단편을 또한 포함하는 리포좀이 본 개시의 방법에 사용될 수 있다. 세포 또는 세포 집단에 폴리뉴클레오타이드의 전달 외에, 본원에 기술된 단백질의 세포 또는 세포 집단에의 직접 도입은 단백질 트랜스펙션의 비제한적인 기법에 의해 이루어질 수 있고, 대안으로 발현을 향상시키거나 및/또는 본 개시의 단백질의 활성을 촉진할 수 있는 조건을 배양하는 것이 다른 비제한적인 기법이다.

생물막을 "억제하는, 방지하는 또는 분해하는"은 생물막 구조의 예방적 또는 치료적 감소를 의미한다. 한 측면으로, 용어 "억제하는, 경쟁하는 또는 적정하는"은 미생물 생물막의 구성요소인 DNA/단백질 기질 (예를 들어 도 6에 도시됨)의 형성의 감소를 의미한다. 한 측면으로, 방지는 치료로부터 배제된다.

"구부러진 폴리뉴클레오타이드"는 다른 가닥과 쌍을 이루지 않는 한 가닥 상의 작은 루프를 함유하는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 및 단부에서 단부의 거리가 자연적인 열 변동을 초과하여 감소된, 즉 천연 B-형태 이중 가닥 DNA의 경우 150 bp의 지속 길이를 초과하여 구부러져 있는 임의의 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 일부 구체예에서, 루프는 1 염기 내지 약 20 염기 길이, 또는 대안으로 2 염기 내지 약 15개 염기 길이, 또는 대안으로 약 3 염기 내지 약 12 염기 길이, 또는 대안으로 약 4 염기 내지 약 10 염기 길이이거나, 또는 대안으로 약 4, 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9 또는 10개 염기를 가진다.

진단 또는 치료의 "대상체"는 세포 또는 포유류 또는 인간과 같은 동물이다. 진단 또는 치료에 대한 비인간 대상체는 감염에 대한 대상체 또는 동물 모델, 예를 들어, 유인원, 쥐과, 예컨대, 래트, 마우스, 친칠라, 개과, 예컨대 개, 토끼과, 예컨대 토끼, 가축, 스포츠 동물 및 애완동물이다.

용어 "단백질", "펩타이드" 및 "폴리펩타이드"는 상호교환적으로 사용되며 가장 넓은 의미로 둘 이상의 하위단위 아미노산, 아미노산 유사체 또는 펩타이드 모방물의 화합물을 나타낸다. 하위단위는 펩타이드 결합에 의해 연결될 수 있다. 다른 구체예에서, 하위단위는 다른 결합, 예컨대, 에스테르, 에테르, 등에 의해 연결될 수 있다. 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 함유하여야 하며 단백질의 서열 또는 펩타이드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에 대한 제한은 없다. 본원에서 사용되는 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 및 L 광학 이성질체, 아미노산 유사체 및 펩타이드 모방물을 포함하여, 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 나타낸다.

본원에서 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA와 관련하여 사용되는 용어 "분리된" 또는 "재조합"은 각각 폴리펩타이드뿐만 아니라 거대분자의 자연적인 표면에 존재하는, 다른 DNA 또는 RNA와 별도의 분자를 나타낸다. 용어 "분리된 또는 재조합 핵산"은 단편으로서 자연적으로 발생하지 않고 자연 상태에서 발견되지 않을 핵산 단편을 포함하는 것을 의미한다. 용어 "분리된"은 또한 본원에서 다른 세포 단백질과 별개인 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 단백질을 나타내기 위해 사용되며 정제된 폴리펩타이드와 재조합 폴리펩타이드 둘 다를 포함하는 것을 의미한다. 다른 구체예에서, 용어 "분리된 또는 재조합"은 정상적으로 자연적으로 회합되는 세포, 조직, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 항체 또는 그것들의 단편(들)이 있는 구성성분, 세포 및 다른 것과 분리되는 것을 의미한다. 예를 들어, 분리된 세포는 유사한 표현형 또는 유전자형의 조직 또는 세포로부터 분리된 세포이다. 분리된 폴리뉴클레오타이드는 그것의 천연 또는 자연적인 환경에서, 예컨대, 염색체 상에서 정상적으로 회합되는 3' 및 5' 연속 뉴클레오타이드로부터 분리된다. 기술분야에 숙련된 사람들에게 분명한 것과 같이, 자연적으로 발생하지 않는 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 항체 또는 그것들의 단편(들)은 그것을 그것의 자연적으로 발생하는 대응물과 구별하기 위하여 "분리"를 필요로 하지 않는다.

분명한 설명이 없어도, 그리고 다르게 의도되지 않는 한, 본 개시가 폴리펩타이드, 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 항체와 관련될 때, 그러한 것의 동등물 또는 생물학적 동등물은 본 개시의 범주 내에 있는 것으로 의도되는 것으로 추론되어야 한다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "그것의 생물학적 동등물"은 참조 단백질, 항체, 폴리펩타이드 또는 핵산에 대해 언급될 때, 원하는 구조 또는 기능성을 여전히 유지하면서 최소한의 상동성을 가지는 것들을 의미하는 "그것의 동등물"과 동의적인 것으로 의도된다. 본원에서 구체적으로 설명되지 않는 한, 본원에서 언급된 임의의 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 또한 그것의 동등물을 포함하는 것으로 고려된다. 예를 들어, 동등물은 적어도 약 70% 상동성 또는 동일성, 또는 대안으로 약 80% 상동성 또는 동일성 및 대안으로, 적어도 약 85%, 또는 대안으로 적어도 약 90%, 또는 대안으로 적어도 약 95% 또는 대안으로 98% 상동성 또는 동일성을 의미하며 참조 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산에 대해 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 나타낸다. 또 다른 측면으로, 용어는 높은 엄격성의 조건 하에서 참조 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다.

다른 서열에 대해 특정 백분율 (예를 들어, 80%, 85%, 90% 또는 95%)의 "서열 동일성"을 가지는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역 (또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 영역)은, 정렬될 때, 염기 (또는 아미노산)의 백분율이 두 서열을 비교하여 동일한 것을 의미한다. 정렬 및 퍼센트 상동성 또는 서열 동일성은 기술분야에 알려져 있는 소프트웨어, 예를 들어 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1에서 기술된 것들을 사용하여 측정될 수 있다. 바람직하게, 정렬을 위해 디폴트 파라미터가 사용된다. 바람직한 정렬 프로그램은 디폴트 파라미터를 사용하는 BLAST이다. 특히, 바람직한 프로그램은 다음의 디폭트 파라미터를 사용하는 BLASTN 및 BLASTP이다: 유전자 코드 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 양 가닥; 컷오프 = 60; 기대값 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50개 서열; 분류 = 고득점(HIGH SCORE); 데이터베이스 = 비-반복적, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + SwissProtein + SPupdate + PIR. 이들 프로그램의 상세한 설명은 다음의 인터넷 주소에서 찾아볼 수 있다: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST.

"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 두 펩타이드 사이 또는 두 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 나타낸다. 상동성은 비교 목적으로 정렬될 수 있는 각 서열의 위치를 비교함으로써 측정될 수 있다. 비교된 서열의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 차지된다면, 분자는 그 위치에서 상동한다. 서열 사이의 상동성 정도는 서열에 의해 공유된 매칭되는 또는 상동하는 위치의 수의 함수이다. "무관련" 또는 "비상동성" 서열은 본 개시의 서열 중 하나와 30% 미만의 동일성 또는 대안으로 25% 미만의 동일성, 20% 미만의 동일성, 또는 대안으로 10% 미만의 동일성을 공유한다.

"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 또한 엄격한 조건 하에서 참조 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체에 혼성화하는 2개의 핵산 분자를 나타낼 수 있다.

"혼성화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 반응하여 뉴클레오타이드 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 안정화되는 복합체를 형성하는 반응을 나타낸다. 수소 결합은 왓슨-크릭 염기 쌍형성, 후그스타인 결합에 의해, 또는 임의의 다른 서열-특이적 방식으로 일어날 수 있다. 복합체는 듀플렉스 구조를 형성하는 2개의 가닥, 다중-가닥 복합체를 형성하는 3개 이상의 가닥, 단일한 자체-혼성화 가닥, 또는 이것들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 혼성화 반응은 보다 광범위한 과정의 단계, 예컨대 PCR 반응의 개시, 또는 리보자임에 의한 폴리뉴클레오타이드의 효소적 절단을 구성할 수 있다.

엄격한 혼성화 조건의 예는 다음을 포함한다: 약 25℃ 내지 약 37℃의 인큐베이션 온도; 약 6x SSC 내지 약 10x SSC의 혼성화 완충제 농도; 약 0% 내지 약 25%의 포름아미드 농도; 및 4x SSC 내지 약 8x SSC의 세척 용액. 중간 혼성화 조건의 예는 다음을 포함한다: 약 40℃ 내지 약 50℃의 인큐베이션 온도; 약 9x SSC 내지 약 2x SSC의 완충제 농도; 약 30% 내지 약 50%의 포름아미드 농도; 및 약 5x SSC 내지 약 2x SSC의 세척 용액. 높은 엄격성 조건의 예는 다음을 포함한다: 약 55℃ 내지 약 68℃의 인큐베이션 온도; 약 1x SSC 내지 약 0.1x SSC의 완충제 농도; 약 55% 내지 약 75%의 포름아미드 농도; 및 약 1x SSC, 0.1x SSC의 세척 용액, 또는 탈이온수. 일반적으로, 혼성화 인큐베이션 시간은 5분 내지 24시간이며, 1, 2회, 또는 그 이상의 세척 단계가 있고, 세척 인큐베이션 시간은 약 1, 2, 또는 15분이다. SSC는 0.15 M NaCl 및 15 mM 시트레이트 완충제이다. 다른 완충제 시스템을 사용하는 SSC의 동등물이 사용될 수 있는 것으로 이해된다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "치료하는", "치료" 등은 본원에서 원하는 약물학적 및/또는 생리적 효과를 얻는 것을 의미하기 위해 사용된다. 효과는 완전히 또는 부분적으로 장애 또는 그것의 신호 또는 증상을 방지하는 관점에서 예방적일 수 있고 및/또는 장애 및/또는 장애에 기인한 부작용에 대한 부분적인 또는 완전한 치유의 관점에서 치료적일 수 있다. 한 측면으로, "치료"는 예방을 배제한다.

"방지"하는 것은 시험관내에서 또는 장애 또는 효과에 취약한 시스템 또는 대상체에서 생체내에서 장애 또는 효과를 방지하는 것을 의미한다. 그러한 것의 예는 생물막을 생성하는 것으로 알려져 있는 미생물로 감염된 시스템에서 생물막의 형성을 방지하는 것이다.

"제약학적으로 허용되는 담체"는 개시의 조성물에 사용될 수 있는 임의의 희석제, 부형제 또는 담체를 나타낸다. 제약학적으로 허용되는 담체로는 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 완충 물질, 예컨대 포스페이트, 글리신, 소르브산, 소르브산 칼륨, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예컨대 프로타민 설페이트, 인산 수소 이나트륨, 인산 수소 칼륨, 염화 나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 3규산 마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스-기반 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 소디움 카르복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모 지방을 들 수 있다. 적합한 제약학적 담체는 이 분야의 표준 참조 텍스트인 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company에 기술되어 있다. 그것은 바람직하게는 의도된 투여 형태, 즉 경구용 정제, 캡슐, 엘릭시르, 시럽 등과 관련하여 선택되고 종래의 제약학적 실싱와 일치한다.

"투여"는 치료의 전 과정을 통해 한 용량으로, 연속적으로 또는 간헐적으로 실시될 수 있다. 가장 효과적인 투여 수단 및 투여량을 결정하는 방법은 기술분야에 숙련된 사람들에게 알려져 있고 치료법, 치료법의 목적, 치료되는 표적 세포 및 치료되는 대상체에 대해 사용된 조성물에 따라 달라질 것이다. 단일 또는 다중 투여는 치료하는 의사에 의해 선택되는 용량 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다. 적합한 투여 제제 및 작용제의 투여 방법은 기술분야에 알려져 있다. 투여 경로는 또한 결정될 수 있고 가장 효과적인 투여 경로를 결정하는 방법은 기술분야에 숙련된 사람들에게 알려져 있으며 치료를 위해 사용된 조성물, 치료 목적, 치료되는 대상체의 건강 상태 또는 질환 단계 및 표적 세포 또는 조직에 따라 달라질 것이다. 투여 경로의 비제한적인 예로는 경구 투여, 비강 투여, 주사 및 국소 적용을 들 수 있다.

용어 "유효량"은 유익한 또는 원하는 결과 또는 효과를 이루기에 충분한 양을 나타낸다. 치료용 또는 예방용 적용의 맥락에서, 유효량은 문제되는 상태의 유형 및 중증도 및 개별 대상체의 특징, 예컨대 일반적인 건강, 연령, 성별, 체중, 및 제약학적 조성물에 대한 허용성에 따라 좌우될 것이다. 면역원성 조성물의 맥락에서, 일부 구체예에서 유효량은 병원체에 대해 보호 반응을 초래하기에 충분한 양이다. 다른 구체예에서, 면역원성 조성물의 유효량은 항원에 대해 항체 생성을 초래하기에 충분한 양이다. 일부 구체예에서, 유효량은 그것을 필요로 하는 대상체에서 수동 면역을 부여하기 위해 필요한 양이다. 면역원성 조성물과 관련하여, 일부 구체예에서 유효량은 상기에서 기술된 요인들 외에, 의도된 용도, 특정 항원성 화합물의 면역원성의 정도, 및 대상체의 면역 체계의 건강/반응성에 따라 좌우될 것이다. 숙련된 전문가는 이들 및 다른 요인에 따라 적절한 양을 결정할 수 있을 것이다.

시험관내 적용의 경우에, 일부 구체예에서 유효량은 문제의 적용의 크기 및 본질에 따라 좌우될 것이다. 또한 그것은 시험관내 표적의 본질 및 민감성 및 사용 중인 방법에 따라 좌우될 것이다. 숙련된 전문가는 이들 및 다른 고려사항을 토대로 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 유효량은 구체예에 따라 조성물의 하나 이상의 투여를 포함할 수 있다.

작용제 및 조성물은 의약의 제조에 및 인간 및 다른 동물의 치료를 위해 종래 과정에 따른 투여에 의해, 예컨대 제약학적 조성물에 활성 성분으로서 사용될 수 있다.

본 개시의 작용제는 임의의 적합한 투여 경로에 의해 치료법을 위해 투여될 수 있다. 또한 바람직한 경로는 수령체의 상태 및 연령 및 치료되는 질환에 따라 달라질 것이 인지될 것이다.

고체 상 지지체의 예로는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 천연 및 변형 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 반려암(gabbros) 및 자철광(magnetite)을 들 수 있다. 담체의 본질은 어느 정도 가용성이거나 불용성일 수 있다. 지지체 물질은 결합된 분자가 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 항체에 결합할 수 있는 한 실제로 임의의 가능한 구조적 형태를 가질 수 있다. 그러므로, 지지체 형태는 비드 또는 원통형에서와 같이, 시험관의 내부 표면 또는 막대의 외부 표면에서와 같이, 구형일 수 있다. 대안으로, 표면은 시트, 테스트 스트립, 등과 같이 평평할 수 있고 또는 대안으로 폴리스티렌 비드일 수 있다. 기술분야에 숙련된 사람들은 결합 항체 또는 항원에 대한 많은 다른 적합한 담체를 알고 있거나 일상적인 실험을 사용함으로써 그것을 확인할 수 있을 것이다.

본원에서 사용되는 바, "항체"는 전체 항체 및 그것의 임의의 항원 결합 단편 또는 단일 사슬을 포함한다. 그러므로 용어 "항체"는 면역글로불린 분자의 적어도 일부를 포함하는 분자를 함유하고 있는 임의의 단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 그러한 것의 예로는, 한정하는 것은 아니지만 중쇄 또는 경쇄의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 그것의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 (FR) 영역 또는 그것의 임의의 부분 또는 결합 단백질의 적어도 한 부분을 들 수 있다.

항체는 다클론성 또는 단클론성일 수 있고 임의의 적합한 생물학적 공급원, 예컨대, 쥐과, 래트, 양 또는 개과로부터 분리될 수 있다.

"면역 반응"은 광범위하게 외래 물질에 대한 림프구의 항원-특이적 반응을 나타낸다. 면역 반응을 유도할 수 있는 임의의 물질은 "면역원성"인 것으로 말하며 "면역원"으로서 언급된다. 모든 면역원은 항원이지만, 모든 항원이 면역원성은 아니다. 본 개시의 면역 반응은 체액성 (항체 활성을 통한 것) 또는 세포-매개 (T 세포 활성화를 통한 것)일 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "대상체에서 면역 반응을 유도하는 것"은 기술 분야에서 잘 이해되는 용어이며 대상체에 항원 (또는 에피토프)를 도입한 후 항원 (또는 에피토프)에 대한 면역 반응에서, 항원 (또는 에피토프)가 대상체에 도입되기 전 면역 반응 (만약 있다면)에 비하여 적어도 약 2배, 보다 바람직하게는 적어도 약 5배, 보다 바람직하게는 적어도 약 10배, 보다 바람직하게는 적어도 약 100배, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 500배, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 1000배 또는 그 이상의 증가가 검출되거나 측정될 수 있는 것을 의미한다. 항원 (또는 에피토프)에 대한 면역 반응으로는, 한정하는 것은 아니지만, 항원-특이적 (또는 에피토프-특이적) 항체의 생성 및 그것의 표면에서 항원 (또는 에피토프)에 특이적으로 결합하는 분자를 발현하는 면역 세포의 생성을 들 수 있다. 주어진 항원 (또는 에피토프)에 대한 면역 반응이 유도되었는지의 여부를 측정하는 방법은 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 항원-특이적 항체는 한정하는 것은 아니지만 ELISA를 포함한 다양한 면역검정 중 임의의 검정을 사용하여 검출될 수 있고, 검정에서, 예를 들어, 샘플 중의 항체의 고정된 항원 (또는 에피토프)에 대한 결합은 검출 가능하게 표지된 제2 항체 (예컨대, 효소-표지된 마우스 항-인간 Ig 항체)로 검출된다.

용어 "면역 반응을 조절한다"는 면역 반응을 유도하는 것 (증가, 유도); 및 면역 반응을 감소시키는 것 (억제)을 포함한다. 면역조절 방법 (또는 프로토콜)은 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법이다.

"HMG 도메인" 또는 "고이동성 그룹 (HMG) 박스 도메인"은 결합 DNA에 관여하는 아미노산 서열을 나타낸다 (Stros et al., Cell Mol Life Sci. 64(19-20):2590-606 (2007)). 한 구체예에서, HMG-박스 도메인의 구조는 불규칙적인 배열의 3개의 나선으로 이루어진다. 다른 구체예에서, HMG-박스 도메인은 단백질이 비-B 타입 DNA 형태 (꼬여 있거나 풀림)에 높은 친화성으로 결합하는 것을 가능하게 한다. HMG-박스 도메인은, 전부 크로마틴의 형태 변화를 필요로 하는 전사, 복제 및 DNA 수복과 같은 DNA-의존성 과정의 조절에 관여하는 고이동성 그룹 단백질에서 찾아볼 수 있다 (Thomas (2001) Biochem. Soc. Trans. 29(Pt 4):395-401).

개시를 수행하기 위한 방식

폴리펩타이드 조성물

본원에는 본원에 기술된 HMG-박스 도메인 절단물 및/또는 돌연변이를 포함하는 폴리펩타이드, 뿐만 아니라 단백질, HMG-박스 도메인, 절단물, 이들 단백질의 돌연변이 또는 동등물 또는 개시된 아미노산 치환을 가지는 단편 중 하나 이상을 함유하는 이들 단백질의 단편이 제공된다.

그러므로, 한 측면으로, 본 개시는 K12, C23 및 C45 (예컨대 세린, 글리신, 알라닌, 발린, 아이소류신 또는 트레오닌으로부터 선택된 군으로부터의 아미노산에 대해 변형된 천연 K 또는 C)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 선택적으로 포함하는, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지는, 또는 또한 그것으로 이루어지는 분리된 A 박스 폴리펩타이드 또는 그것의 동등물을 제공하며, 동등물은 K12, C23 및 C45, 예컨대 세린, 글리신, 알라닌, 발린, 아이소류신 또는 트레오닌으로부터 선택된 군으로부터의 아미노산에 대해 변형된 천연 K 또는 C로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 한 측면으로, 돌연변이는 C45S 돌연변이이다. A 박스 폴리펩타이드는 한 쪽 또는 양 말단에 위치한 링커 또는 펩타이드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 펩타이드 링커의 예는 PPKGETKKKF이다.

재조합에 의해 제조될 때, A 박스 폴리펩타이드는 기술분야, 예컨대 다음과 같은 문헌에 알려져 있는 방법을 사용하여, 부분적으로 또는 전체적으로 아세틸화, 산화 또는 인산화될 수 있다: Olia AS, et al. (2015) ACS chemical biology. 10(9):2034-47. doi: 10.1021/acschembio.5b00342, PubMed PMID: 26083674; PubMed Central PMCID: PMC4610810; Ugrinova I, et al. (2102) Molecular Biology Reports, 2012;39(11):9947-53. Epub 2012/06/29. doi: 10.1007/s11033-012-1863-x. PubMed PMID: 22740141; 및 Ito T, et al. (2007) JTH, 5(1):109-16. doi: 10.1111/j.1538-7836.2006.02255.x. PubMed PMID: 17239166. 한 측면으로, A 박스 폴리펩타이드는 상기 언급된 돌연변이를 가진, 야생형 HMGB1 폴리펩타이드의 아미노산 1 내지 70을 포함하거나, 또는 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다.

A 박스 폴리펩타이드의 예는 다음을 포함하거나, 또는 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다:

MGKGDPKKPR RKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE FSKKCSERWK TMSAKEKGKF

EDMAKADKAR YEREMKTYIP PKGETKKKF (쥐과)

MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE FSKKCSERWK TMSAKEKGKF

EDMAKADKAR YEREMKTYIP PKGETKKKF (인간)

본원에서 사용되는 바, 폴리펩타이드의 동등물은 한 측면으로, 돌연변이된 아미노산(들)을 보유한 참조 폴리펩타이드에 대해 적어도 약 70%, 또는 대안으로 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 서열을 나타낸다. 일부 측면으로, 폴리펩타이드의 동등물은 예컨대 HMG-박스 도메인을 함유하는 폴리펩타이드의 의도된 기능 및/또는 구조적 특징을 보유한다. 한 측면으로, 동등한 폴리펩타이드는 한 측면으로, 돌연변이된 아미노산(들)을 보유한 HMG-박스 도메인에 대해 적어도 약 70%, 또는 대안으로 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 도메인을 포함한다. 일부 측면으로, 그러한 동등한 도메인은 HMB-박스 도메인의 기능 및/또는 구조적 특징, 예컨대 HMB-박스 결합 표적에 대한 결합을 보유한다. 한 측면으로, 동등한 폴리펩타이드는 엄격한 조건 하에서 HMB-박스 도메인 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된다.

또한 본원에는 아미노산 C106 또는 K114 (예컨대 세린, 글리신, 알라닌, 발린, 아이소류신 또는 트레오닌으로부터 선택된 군으로부터의 아미노산에 대한 천연 시스테인)에서의 돌연변이를 선택적으로 포함하는, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지는, 또는 또한 그것으로 이루어지는 분리된 B 박스 폴리펩타이드, 또는 아미노산 C106 또는 K114 (예컨대 세린, 글리신, 알라닌, 발린, 아이소류신 또는 트레오닌으로부터 선택된 군으로부터의 아미노산에 대한 천연 시스테인)에서의 아미노산 돌연변이를 포함하는 그것의 동등물이 제공된다. 한 측면으로, B 박스 폴리펩타이드는 상기 언급된 돌연변이를 가진, wt HMGB1 폴리펩타이드의 아미노산 약 80 내지 약 176, 또는 약 88 내지 약 164, 또는 약 89 내지 약 162, 또는 또한 추가로 약 80 내지 약 164를 포함하거나, 또는 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 야생형 HMGB1 B 박스 폴리펩타이드의 변형에 대한 추가적인 위치는 도 1C에 도시된다. B 박스 폴리펩타이드의 예는 다음을 포함하거나, 또는 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다:

KDPNAPKRPPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAEKLKEKYEKDIA

AYRAKGKPDAAKKGVV (쥐과)

KDPNAPKRPPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIA

AYRAKGKPDAAKKGVV (인간)

B 박스 폴리펩타이드는 하나 또는 양 말단에 위치한 링커 또는 펩타이드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 펩타이드 링커의 예는 PPKGETKKKF이다. 재조합에 의해 제조될 때, 개시된 B 박스 폴리펩타이드는 기술분야, 예컨대 다음과 같은 문헌에 알려져 있는 방법을 사용하여, 부분적으로 또는 전체적으로 아세틸화, 산화 또는 인산화될 수 있다: Olia AS, et al. (2015) ACS chemical biology. 10(9):2034-47. doi: 10.1021/acschembio.5b00342, PubMed PMID: 26083674; PubMed Central PMCID: PMC4610810; Ugrinova I, et al. (2102) Molecular Biology Reports, 2012;39(11):9947-53. Epub 2012/06/29. doi: 10.1007/s11033-012-1863-x. PubMed PMID: 22740141; 및 Ito T, et al. (2007) JTH, 5(1):109-16. doi: 10.1111/j.1538-7836.2006.02255.x. PubMed PMID: 17239166.

본원에서 사용되는 바, 폴리펩타이드의 동등물은 한 측면으로, 돌연변이된 아미노산(들)을 보유한 참조 폴리펩타이드에 대해 적어도 약 70%, 또는 대안으로 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 서열을 나타낸다. 일부 측면으로, 폴리펩타이드의 동등물은 예컨대 HMG-박스 도메인을 함유하는 폴리펩타이드의 의도된 기능 및/또는 구조적 특징을 보유한다. 한 측면으로, 동등한 폴리펩타이드는 한 측면으로, 돌연변이된 아미노산(들)을 보유한 HMG-박스 도메인에 대해 적어도 약 70%, 또는 대안으로 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 도메인을 포함한다. 일부 측면으로, 그러한 동등한 도메인은 HMB-박스 도메인의 기능 및/또는 구조적 특징, 예컨대 HMB-박스 결합 표적에 대한 결합 및 선택적으로 그것의 전염증 반응의 상실을 보유한다. 한 측면으로, 동등한 폴리펩타이드는 엄격한 조건 하에서, HMB-박스 도메인 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된다.

추가의 측면으로, 본원에는 K12, C23, C45; 및 C106 또는 K114 (예컨대 세린, 글리신, 알라닌, 발린, 아이소류신 또는 트레오닌으로부터 선택된 군으로부터의 아미노산에 대해 변형된 천연 K 또는 C)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 선택적으로 포함하는, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지는, 또는 또한 그것으로 이루어지는 분리된 AB 박스 폴리펩타이드 또는 K12, C23 및 C45; 및 C106 또는 K114 (예컨대 세린, 글리신, 알라닌, 발린, 아이소류신 또는 트레오닌으로부터 선택된 군으로부터의 아미노산에 대해 변형된 천연 K 또는 C)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 그것의 동등물이 제공된다. 한 측면으로, 돌연변이는 C45S 돌연변이이다. 다른 측면으로, 폴리펩타이드는 아미노산 C106 (예컨대 세린, 글리신, 알라닌, 발린, 아이소류신 또는 트레오닌으로부터 선택된 군으로부터의 아미노산에 대한 천연 시스테인)에서의 돌연변이, 또는 K12, C23, C45로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 돌연변이 및 아미노산 C106 (예컨대 세린, 글리신, 알라닌, 발린, 아이소류신 또는 트레오닌으로부터 선택된 군으로부터의 아미노산에 대한 천연 시스테인)에서의 돌연변이를 포함하는 그것의 동등물을 포함한다. 한 측면으로 AB 박스 폴리펩타이드는 C45S 및 C106S 돌연변이 및 이들 돌연변이를 보유하는 동등물을 포함한다. 한 측면으로, AB 박스 폴리펩타이드는 상기 언급한 돌연변이를 가진, 야생형 HMGB1 폴리펩타이드의 아미노산 1 내지 176, 또는 1 내지 162, 또는 또한 추가로 1 내지 164를 포함하거나, 또는 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다.

또한 추가의 측면으로, 분리된 AB 박스 폴리펩타이드는 A 박스 폴리펩타이드와 B 박스 폴리펩타이드를 연결시키도록 위치한 링커 폴리펩타이드 및 한 측면으로, B 박스와 C 박스 폴리펩타이드를 연결시키는 제2 링커를 추가로 포함한다. 재조합에 의해 제조될 때, AB 또는 A, B 및 C 박스 폴리펩타이드는 부분적으로 또는 전체적으로 아세틸화, 산화 또는 인산화될 수 있다. 펩타이드 링커의 예는 PPKGETKKKF이다. 한 측면으로, 기술분야, 예컨대 다음과 같은 문헌에 알려져 있는 방법을 사용하여, 선택적으로 부분적으로 또는 전체적으로 아세틸화, 산화 또는 인산화될 수 있는 A 및/또는 B 박스 도메인에 본원에 기술된 하나 이상의 아미노산 치환을 가진 분리된 돌연변이된 HMGB1 폴리펩타이드가 제공된다: Olia AS, et al. (2015) ACS chemical biology. 10(9):2034-47. doi: 10.1021/acschembio.5b00342, PubMed PMID: 26083674; PubMed Central PMCID: PMC4610810; Ugrinova I, et al. (2102) Molecular Biology Reports, 2012;39(11):9947-53. Epub 2012/06/29. doi: 10.1007/s11033-012-1863-x. PubMed PMID: 22740141; 및 Ito T, et al. (2007) JTH, 5(1):109-16. doi: 10.1111/j.1538-7836.2006.02255.x. PubMed PMID: 17239166.

상기 언급된 돌연변이를 가진 AB 박스 폴리펩타이드의 예는 다음을 포함하거나, 또는 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다:

MGKGDPKKPRRKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARY

\EREMKTYIPPKGETKKKFKDPNAPKRPPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDK

QPYEKKAEKLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVV (쥐과)

MGKGDPKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARY

EREMKTYIPPKGETKKKFKDPNAPKRPPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQ

PYEKKAAKLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVV (인간)

본원에서 사용되는 바, 폴리펩타이드의 동등물은 한 측면으로, 돌연변이된 아미노산(들)을 보유한 참조 폴리펩타이드에 대해 적어도 약 70%, 또는 대안으로 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 서열을 나타낸다. 일부 측면으로, 폴리펩타이드의 동등물은 예컨대, HMG-박스 도메인을 함유하는 폴리펩타이드의 의도된 기능 및/또는 구조적 특징을 보유한다. 한 측면으로, 동등한 폴리펩타이드는 한 측면으로, 돌연변이된 아미노산(들)을 보유한 HMG-박스 도메인에 대해 적어도 약 70%, 또는 대안으로 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 도메인을 포함한다. 일부 측면으로, 그러한 동등한 도메인은 HMB-박스 도메인의 기능 및/또는 구조적 특징, 예컨대, HMB-박스 결합 표적에 대한 결합을 보유하지만 전염증성 반응을 유도하지 못한다. 한 측면으로, 동등한 폴리펩타이드는 엄격한 조건 하에서 HMB-박스 도메인 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된다.

추가의 측면으로, 분리된 AB 박스 폴리펩타이드는 A 박스 폴리펩타이드와 B 박스 폴리펩타이드를 연결시키도록 위치한 링커 폴리펩타이드를 추가로 포함한다.

또한 A, B 및 C 도메인을 포함하는 분리된 HMGB1 폴리펩타이드가 제공되며, 폴리펩타이드는 K12, C23, C45, C106, 또는 K114로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 또는 그것의 동등물을 포함하거나, 또는 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지며, 그것의 동등물은 K12, C23, C45, C106 또는 K114로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, 폴리펩타이드의 동등물은 한 측면으로, 돌연변이된 아미노산(들)을 보유하는 참조 폴리펩타이드에 대해 적어도 약 70%, 또는 대안으로 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 서열을 나타낸다. 일부 측면으로, 폴리펩타이드의 동등물은 예컨대, HMG-박스 도메인을 함유하는 폴리펩타이드의 의도된 기능 및/또는 구조적 특징을 보유하지만 전염증성 반응을 유도하지 못한다. 한 측면으로, 동등한 폴리펩타이드는 한 측면으로, 돌연변이된 아미노산(들)을 보유하는 HMG-박스 도메인에 대해 적어도 약 70% 또는 대안으로 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 도메인을 포함한다. 일부 측면으로, 그러한 동등한 도메인은 HMB-박스 도메인의 기능 및/또는 구조적 특징, 예컨대, HMB-박스 결합 표적에 대한 결합을 보유하지만 전염증성 반응을 유도하지 못한다. 한 측면으로, 동등한 폴리펩타이드는 엄격한 조건 하에서 HMB-박스 도메인 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된다.

추가의 측면으로, 분리된 HMGB1 박스 폴리펩타이드는 A 박스 폴리펩타이드와 B 박스 폴리펩타이드를 연결시키도록 위치한 링커 폴리펩타이드 및 B 박스 폴리펩타이드와 C 박스 폴리펩타이드를 연결시키는 제2 링커 폴리펩타이드를 추가로 포함한다. 펩타이드 링커의 예는 PPKGETKKKF이다.

폴리펩타이드는 검출 가능하게 표지될 수 있고 및/또는 담체, 예컨대, 제약학적으로 허용되는 담체와 조합될 수 있다.

항체 및 그것의 유도체

본 개시는 또한 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 분리된 폴리펩타이드에 결합하고 및/또는 그것을 특이적으로 인식하며 결합하는 항체를 제공한다. 항체는 본원에 기술된 다양한 항체 중 임의의 것일 수 있고, 그것의 비제한적인 예로는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 베니어드된(veneered) 항체, 디아바디, 인간화된 항체, 항체 유도체, 재조합 인간화된 항체, 또는 그것들의 각각의 유도체 또는 단편을 들 수 있다. 한 측면으로, 단편은 항체의 CDR을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 한 측면으로, 항체는 검출 가능하게 표지되거나 또는 그것에 콘쥬게이션된 검출 가능한 표지를 추가로 포함한다. 또한 본원에 개시된 단클론성 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주가 제공된다. 하나 이상의 상기 구체예를 포함하는 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지는 또는 또한 추가로, 그것으로 이루어지는 조성물이 추가로 본원에 제공된다. 추가로 항체 및 단편의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 뿐만 아니라 항체 폴리펩타이드 및 그것의 단편을 재조합에 의해 제조하거나 또는 화학적으로 합성하는 방법이 제공된다. 항체 폴리펩타이드는 진핵 또는 원핵 세포에서, 또는 기술분야에 알려져 있고 본원에서 기술된 다른 방법에 의해 제조될 수 있다.

항체는 기술분야에 알려져 있고 문헌에 잘 기술되어 있는 종래 기법을 사용하여 생성될 수 있다. 다클론성 항체의 제조를 위한 여러 방법이 존재한다. 예를 들어, 다클론성 항체는 전형적으로, 한정하는 것은 아니지만, 닭, 염소, 기니아 피그, 햄스터, 말, 마우스, 래트, 및 토끼와 같은 적합한 포유류의 면역화에 의해 제조된다. 항원이 포유류에 주입되어 항원에 특이적인 면역글로불린을 생성하는 B-림프구를 유도한다. 면역글로불린은 포유류의 혈청으로부터 정제될 수 있다.

단클론성 항체는 기술분야에 알려져 있고 문헌에 잘 기술되어 있는 종래의 하이브리도마 기법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 하이브리도마는 적합한 불멸 세포주 (예컨대, 골수종 세포주, 예컨대 한정하는 것은 아니지만, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, P3X63Ag8,653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U397, MIA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 313, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A, CHO, PerC.6, YB2/O) 등, 또는 이종골수종, 그것의 융합 생성물, 또는 그것으로부터 유래된 임의의 세포 또는 융합 세포, 또는 기술분야에 알려져 있는 다른 적합한 세포주 (다음의 웹 주소, 예컨대, atcc.org,lifetech.com (2007년 11월 26일에 마지막 접속)에 있는 것들 참조)를, 항체 생성 세포, 예컨대, 한정하는 것은 아니지만 분리된 또는 클로닝된 비장, 말초혈, 림프, 편도, 또는 다른 면역 또는 B 세포 함유 세포, 또는 중쇄 또는 경쇄 불변 또는 가변 또는 프레임워크 또는 CDR 서열을 내인성 또는 이종성 핵산으로서, 재조합 또는 내인성, 바이러스, 박테리아, 조류, 원핵, 양서류, 곤충, 파충류, 어류, 포유류, 설치류, 말과, 양과, 염소, 양, 영장류, 진핵, 게놈 DNA, cDNA, rDNA, 미토콘드리아 DNA 또는 RNA, 엽록체 DNA 또는 RNA, hnRNA, mRNA, tRNA, 단일, 이중 또는 삼중 가닥의, 혼성화된, 등의 또는 이것들의 임의의 조합으로서 발현하는 임의의 다른 세포와 융합시킴으로써 제조된다. 항체 생성 세포는 또한 관심의 항원으로 면역화된 후 관심의 활성에 대해 스크리닝된 인간 또는 다른 적합한 동물의 말초혈 또는, 특정 구체예에서, 비장 또는 림프절로부터 얻어질 수 있다. 임의의 다른 적합한 숙주 세포는 또한 본 개시의 항체, 그것의 명시된 단편 또는 변이체를 암호화하는 이종성 또는 내인성 핵산을 발현하기 위해 사용될 수 있다. 융합된 세포 (하이브리도마) 또는 재조합 세포는 선택적 배양 조건 또는 다른 적합한 공지된 방법을 사용하여 분리될 수 있고, 제한 희석 또는 세포 분류, 또는 다른 공지된 방법에 의해 클로닝될 수 있다.

필요한 특이성의 항체를 제조 또는 분리하는 다른 적합한 방법, 이를테면, 한정하는 것은 아니지만, 재조합 항체를 펩타이드 또는 단백질 라이브러리 (예컨대, 한정하는 것은 아니지만, 박테리오파지, 리보좀, 올리고뉴클레오타이드, cDNA, 등, 디스플레이 라이브러리; 예컨대, MorphoSys (Martinsreid/Planegg, Del.), BioInvent (Lund, Sweden), Affitech (Oslo, Norway)와 같은 다양한 상업적 공급처로부터 입수 가능함)로부터 기술분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 선택하는 방법이 사용될 수 있다. 기술분야에 공지된 방법은 특허 문헌에서 기술되며 그것들 중 일부로 미국 특허 제 4,704,692호; 제 5,723,323호; 제 5,763,192호; 제 5,814,476호; 제 5,817,483호; 제 5,824,514호; 및 제 5,976,862호를 들 수 있다. 대안 방법은, 기술분야에 알려져 있고 및/또는 본원에 기술된 것과 같이, 인간 항체의 레퍼토리를 생성할 수 있는 유전자도입 동물 (예컨대, SCID 마우스, Nguyen et al. (1977) Microbiol. Immunol. 41:901-907 (1997); Sandhu et al. (1996) Crit, Rev. Biotechnol. 16:95-118; Eren et al. (1998) Mumma 93:154-161)의 면역화에 의존한다. 그러한 기법으로는, 한정하는 것은 아니지만, 리보좀 디스플레이 (Wanes et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937-4942; Hanes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14130-14135); 단일 세포 항체 생성 기술 (예컨대, 선택된 림프구 항체 방법 ("SLAM") (미국 특허 제 5,627,052호; Wen et al. (1987) J. Immunol 17:887-892; Babcook et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848); 젤 미세방울(gel microdroplet) 및 유동 세포분석 (Powell et al. (1990) Biotechnol. 8:333-337; One Cell Systems, (Cambridge, Mass.); Gray et al. (1995) J. Imm. Meth. 182:155-163; 및 Kenny et al. (1995) Bio. Technol. 13:787-790); B-세포 선택 (Steenbakkers et al. (1994) Molec. Biol. Reports 19:125-134)을 들 수 있다.

본 개시의 항체 유도체는 또한 본원에 개시된 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를, 예컨대 그러한 항체를 그들의 젖에 생산하는 유전자 도입 동물 또는 포유류, 예컨대 염소, 소, 말, 양, 등을 제공하기 위한 적합한 숙주에 전달함으로써 제조될 수 있다. 이들 방법은 기술분야에 알려져 있고 예를 들어 미국 특허 제 5,827,690호; 제 5,849,992호; 제 4,873,316호; 제 5,849,992호; 제 5,994,616호; 제 5,565,362호; 및 제 5,304,489호에 기술되어 있다.

용어 "항체 유도체"는 항체 또는 단편의 선형 폴리펩타이드 서열에 대한 번역후 변형을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제 6,602,684 B1은 전체 항체 분자, 항체 단편, 또는 증강된 Fe-매개 세포 독성을 가지는 면역글로불린의 Fc 영역에 동등한 영역을 포함하는 융합 단백질, 및 그렇게 생성된 당단백질을 포함하여, 항체의 변형된 글리콜 형태의 생성을 위한 방법을 기술한다.

본원에 개시된 항체는 또한 공유 부착이 항체가 항-이디오타입 반응을 생성하는 것을 방해하지 못하도록 항체에 대한 임의의 유형의 분자의 공유 부착에 의해 변형되는 유도체를 포함한다. 항체 유도체로는, 한정하는 것은 아니지만, 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질 가수분해성 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에의 연결, 등에 의해 변형된 항체를 들 수 있다. 추가적으로, 유도체는 하나 이상의 비고전적 아미노산을 함유할 수 있다.

항체 유도체는 또한 식물 부분 또는 그것으로부터 배양된 세포에서 그러한 항체, 명시된 부분 또는 변이체를 생성하는 유전자도입 식물 및 배양된 식물 세포 (예컨대, 한정하는 것은 아니지만 담배, 옥수수, 및 개구리밥)를 제공하기 위하여 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드를 전달함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, Cramer et al. (1999) Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 및 여기에서 인용된 참고문헌은, 예컨대, 유도성 프로모터를 사용하여 다량의 재조합 단백질을 발현하는 유전자도입 담배 잎의 생성을 기술한다. 유전자도입 옥수수는 다른 재조합 시스템에서 제조되었거나 자연적인 공급원으로부터 정제된 것과 동등한 생물학적 활성을 가지는 포유류 단백질을 상업적 생산 수준으로 발현하기 위해 사용되었다. 예컨대, Hood et al. (1999) Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147 및 여기에서 인용된 참고문헌 참조. 항체 유도체는 또한 항체 단편, 예컨대 단일 사슬 항체 (scFv')를 포함하는 유전자도입 식물 종자, 이를테면 담배 종자 및 담배 괴경(tuber)으로부터 다량으로 제조되었다. 예컨대, Conrad et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38:101-109 및 여기에서 인용된 참고문헌 참조. 그러므로, 항체는 또한 알려진 방법에 따라, 유전자도입 식물을 사용하여 제조될 수 있다.

항체 유도체는 또한 면역원성을 변형시키거나, 결합, 친화도, 온-레이트(on-rate), 오프-레이트(off-rate), 결합력, 특이성, 반감기, 또는 임의의 다른 적합한 특징을 감소, 향상 또는 변형시키기 위하여, 예를 들어, 외인성 서열을 첨가함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로 비인간 또는 인간 CDR 서열의 일부 또는 전부가 유지되는 한편 가변 및 불변 영역의 비인간 서열은 인간 또는 다른 아미노산 또는 다른 아이소타입으로부터의 가변 또는 불변 영역으로 대체된다.

일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는 데 직접적으로 및 가장 실질적으로 관여한다. 항체의 인간화 또는 조작은 임의의 공지된 방법, 예컨대, 한정하는 것은 아니지만, 미국 특허 제 5,723,323호; 제 5,976,862호; 제 5,824,514호; 제 5,817,483호; 제 5,814,476호; 제 5,763,192호; 제 5,723,323호; 제 5,766,886호; 제 5,714,352호; 제 6,204,023호; 제 6,180,370호; 제 5,693,762호; 제 5,530,101호; 제 5,585,089호; 제 5,225,539호; 및 제 4,816,567호에 기술된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.

본 개시의 키메라, 인간화된 또는 영장류화된 항체는 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 제조된 참조 단클론성 항체의 서열을 토대로 하여 제조될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 암호화하는 DNA는 관심의 하이브리도마로부터 얻어지고 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 비참조 (예컨대, 인간) 면역글로불린 서열을 함유하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 생성하기 위하여, 쥐과 가변 영역이 기술분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 인간 불변 영역에 결합될 수 있다 (미국 특허 제 4,816,567). 인간화된 항체를 생성하기 위하여, 쥐과 CDR 영역이 기술분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 인간 프레임워크에 삽입될 수 있다 (미국 특허 제 5,225,539호 및 미국 특허 제 5,530,101호; 제 5,585,089호; 제 5,693,762호; 및 제 6,180,370호). 유사하게, 영장류화된 항체를 생성하기 위하여, 쥐과 CDR 영역이 기술분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 영장류 프레임워크에 삽입될 수 있다 (WO 93/02108 및 WO 99/55369).

전체 인간 항체를 부분적으로 제조하는 기법은 기술분야에 알려져 있고 임의의 그러한 기법이 사용될 수 있다. 한 구체예에 따르면, 전체 인간 항체 서열은 인간 중쇄 및 경쇄 항체 유전자를 발현하도록 조작된 유전자도입 마우스에서 만들어진다. 그러한 유전자도입 마우스의 다중 스트레인이 만들어졌고 상이한 부류의 항체를 생성할 수 있다. 바람직한 항체를 생성할 수 있는 유전자도입 마우스로부터의 B 세포는 원하는 항체의 연속적인 생성을 위해 하이브리도마 세포주를 만들기 위해 융합될 수 있다. (예를 들어, Russel et al. (2000) Infection and Immunity April 2000:1820-1826; Gallo et al. (2000) European J. of Immun. 30:534-540; Green (1999) J. of Immun. Methods 231:11-23; Yang et al. (1999A) J. of Leukocyte Biology 66:401-410; Yang (1999B) Cancer Research 59(6):1236-1243; Jakobovits (1998) Advanced Drug Reviews 31:33-42; Green and Jakobovits (1998) J. Exp. Med. 188(3):483-495; Jakobovits (1998) Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4):607-614; Tsuda et al. (1997) Genomics 42:413-421; Sherman-Gold (1997) Genetic Engineering News 17(14); Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; Jakobovits (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology, The Integrated Immune System Vol. IV, 194.1-194.7; Jakobovits (1995) Current Opinion in Biotechnology 6:561-566; Mendez et al. (1995) Genomics 26:294-307; Jakobovits (1994) Current Biology 4(8):761-763; Arbones et al. (1994) Immunity 1(4):247-260; Jakobovits (1993) Nature 362(6417):255-258; Jakobovits et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(6):2551-2555; 및 미국 특허 제 6,075,181호 참조).

본원에 개시된 항체는 또한 키메라 항체를 생성하기 위해 변형될 수 있다. 키메라 항체는 항체의 중쇄 및 경쇄의 다양한 도메인이 하나 이상의 종으로부터의 DNA에 의해 암호화된 것이다. 예컨대, 미국 특허 제 4,816,567호 참조.

대안으로, 본원에 개시된 항체는 또한 베니어드된 항체를 생성하기 위해 변형될 수 있다. 베니어드된 항체는 한 종의 항체의 외부 아미노산 잔기가 제2 종의 그것으로 저적하게 대체되거나 "베니어드"되어서 제1 종의 항체가 제2 종에서는 면역원성이 아니어서 항체의 면역원성을 감소시킬 수 있게 되는 것이다. 단백질의 항원성이 주로 그것의 표면의 성질에 좌우되기 때문에, 항체의 면역원성은 또 다른 포유류 종 항체에서 보통 발견되는 것과 상이한 노출된 잔기를 대체함으로써 감소될 수 있을 것이다. 외부 잔기의 이런 적절한 대체는 내부 도메인에, 또는 도메인간 접촉에 거의, 또는 전혀 영향을 미치지 않아야 한다. 그러므로, 리간드 결합 특성은 가변 영역 프레임워크 잔기에 제한된 변경의 결과로서 영향을 미치지 않아야 한다. 과정은 항체의 외부 표면 또는 겉면만이 변경되고, 지지하는 잔기는 방해받지 않고 유지되기 때문에 "베니어링(veneering)"으로 언급된다.

"베니어링"에 대한 과정은 Kabat et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological interest, 4th ed., Bethesda, Md., National Institutes of Health에 의해 편집된 인간 항체 가변 도메인에 대한 이용 가능한 서열 데이터, 이 데이터베이스에 대한 업데이트, 및 다른 접근 가능한 미국 및 외국 데이터베이스 (핵산 및 단백질 둘 다)를 사용한다. 베니어드된 항체를 생성하기 위해 사용된 방법의 비제한적인 예로는 EP 519596; 미국 특허 제 6,797,492호; 및 Padlan et al. (1991) Mol. Immunol. 28(4-5):489-498에 기술된 것을 들 수 있다.

용어 "항체 유도체"는 또한 두 항원-결합 부위를 가진 작은 항체 단편인 "디아바디"를 포함하며, 디아바디에서 단편은 동일한 폴리펩타이드 사슬에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. (예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 참조). 동일한 사슬 상의 두 도메인 간의 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 사슬의 상보하는 도메인과 쌍을 형성하여 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 강요된다. (또한, 모 항체의 초가변 영역에 삽입된 하나 이상의 아미노산을 가지며 항원에 대한 모 항체의 결합 친화도보다 적어도 약 2배 더 강력한 표적 항원에 대한 결합 친화도를 가지는 항체 변이체를 개시하는 Chen 등의 미국 특허 제 6,632,926호 참조).

용어 "항체 유도체"는 추가로 조작된 항체 분자, 단편 및 단일 도메인, 예컨대 scFv, dAb, 나노바디(nanobodies), 미니바디(minibodies), 유니바디(Unibodies), 및 아피바디(Affibodies)를 포함한다 (& Hudson (2005) Nature Biotech 23(9):1126-36; 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0211088; PCT 국제 출원 공개 번호 WO 2007/059782; 미국 특허 제 5,831,012호).

용어 "항체 유도체"는 추가로 "선형 항체"를 포함한다. 선형 항체의 제조 과정은 기술분야에 알려져 있으며 Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062에 기술되어 있다. 간단하게 설명하면, 이들 항체는 항원 결합 영역의 쌍을 형성하는 탠덤 Ed 분절의 쌍 (V_H-C_H1-VH-C_H1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적이거나 단일특이적일 수 있다.

본원에 개시된 항체는 재조합 세포 배양으로부터, 한정하는 것은 아니지만, 단백질 A 정제, 암모늄 설페이트 도는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 인셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 및 레시틴 크로마토그래피를 포함한 공지된 방법에 의해 회수되고 정제될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피 ("HPLC")가 또한 정제에 사용될 수 있다.

본 개시의 항체는 자연적으로 정제된 생성물, 화학적 합성 과정의 생성물, 및 예를 들어, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유류 세포를 포함하는 진핵 숙주로부터, 또는 대안으로 상기 기술된 것과 같은 원핵 숙주로부터 재조합 기법에 의해 제조된 생성물을 포함한다. 많은 항체 제조 시스템이 Birch & Radner (2006) Adv. Drug Delivery Rev. 58: 671-685에서 기술된다.

만약 테스트되는 항체가 단백질 또는 폴리펩타이드와 결합한다면, 본 개시에 의해 테스트되고 제공되는 항체는 동등하다. 또한 과도한 실험 없이, 테스트되는 항체가, 항체가 정상적으로 반응하게 되는 단백질 또는 폴리펩타이드에 본원에 개시된 항체가 결합하는 것을 방해하는지를 측정함으로써, 항체가 본원에 개시된 항체와 동일한 특이성을 가지는 것을 측정하는 것이 가능하다. 만약 테스트되는 항체가 본원에 개시된 단클론성 항체에 의한 결합의 감소로 나타나는 바 본원에 개시된 항체와 경합한다면, 두 항체는 동일한 또는 밀접하게 관련된 에피토프에 결합할 가능성이 있다. 대안으로, 당업자는 본원에 개시된 항체를 그것이 정상적으로 반응하는 단백질과 함께 사전 인큐베이션하고, 테스트되는 항체가 항원에 대한 결합 능력에 있어 억제되는지를 측정할 수 있다. 만약 테스트되는 항체가 억제된다면, 모든 가능성에서, 그것은 본원에 개시된 항체와 동일한, 또는 밀접하게 관련된, 에피토프 특이성을 가진다.

용어 "항체"는 또한 모든 면역글로불린 아이소타입 및 하위부류의 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 단클론성 항체의 특정 아이소타입은 초기 융합으로부터 선택됨으로써 직접적으로 제조되거나, 또는 상이한 아이소타입의 단클론성 항체를 분비하는 모 하이브리도마로부터 문헌에 기술된 과정을 사용하여 부류 전환 변이체를 분리하기 위한 sib 선택 기법을 사용함으로써 이차적으로 제조될 수 있다: Steplewski et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8653 또는 Spira et al. (1984) J. Immunol. Methods 74:307. 대안으로, 재조합 DNA 기법이 사용될 수 있다.

본원에 기술된 단클론성 항체의 특이성을 가진 다른 단클론성 항체의 분리는 또한 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에 의해 항-이디오타입 항체를 제조함으로써 이루어질 수 있다. Herlyn et al. (1986) Science 232:100. 항-이디오타입 항체는 관심의 단클론성 항체 상에 존재하는 특유한 결정기를 인식하는 항체이다.

본원에 개시된 일부 측면으로, 항체를 검출 가능하게 또는 치료적으로 표지하는 것이 유용할 것이다. 적합한 표지는 상기에서 기술된다. 이들 작용제에 항체를 콘쥬게이션하는 방법은 기술분야에 알려져 있다. 단기 예시의 목적으로, 항체는 방사성 원자, 발색단, 형광단, 등과 같은 검출 가능한 모이어티로 표지화될 수 있다. 그러한 표지된 항체는 생체내에서, 또는 분리된 테스트 샘플로, 진단 기법에 사용될 수 있다.

저분자량 합텐에 대한 항체의 결합은 검정에서 항체의 민감성을 증가시킬 수 있다. 합텐은 그런 후 제2 반응에 의해 특이적으로 검출될 수 있다. 예를 들어, 특이적 항-합텐 항체와 반응할 수 있는, 아비딘과 반응하는 비오틴, 또는 다이니트로페놀, 피리독살, 및 플루오레세인과 같은 합텐을 사용하는 것이 일반적이다. Harlow and Lane (1988) (상기 동일) 참조.

본 개시의 항체의 가변 영역은 항체의 하나 이상의 결합 특성 (예컨대, 친화성)을 개선하기 위하여 VH 및/또는 VL CDR 1, CDR 2 및/또는 CDR 3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시킴으로써 변형될 수 있다. 돌연변이는 부위 지정 돌연변이생성 또는 PCR-매개 돌연변이생성에 의해 도입될 수 있고 항체 결합에 미치는 효과, 또는 관심의 다른 기능적 특성은 적절한 시험관내 또는 생체내 검정으로 평가될 수 있다. 특정 구체예에서, 보존성 변형이 도입되고 전형적으로 CDR 영역 내의 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 잔기가 변경된다. 돌연변이는 아미노산 치환, 첨가 또는 결실일 수 있다.

프레임워크 변형은 예를 들어, 하나 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 생식선 서열로 "복귀 돌연변이"시킴으로써, 면역원성을 감소시키도록 항체에 대해 이루어질 수 있다.

더불어, 본원에 개시된 항체는 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존성 세포의 세포독성을 변경시키기 위해 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 그러한 변형으로는, 한정하는 것은 아니지만, 경쇄 및 중쇄의 조립을 용이하게 하기 위한 또는 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키기 위한 힌지 영역의 시스테인 잔기의 수의 변경 (미국 특허 제 5,677,425호) 및 항체의 생물학적 반감기를 감소시키기 위한 Fc 힌지 영역의 아미노산 돌연변이 (미국 특허 제 6,165,745호)를 들 수 있다.

추가적으로, 본원에 개시된 항체는 화학적으로 변형될 수 있다. 항체의 글리코실화는, 예를 들어, 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시키기 위해 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변형시킴으로써 변경될 수 있다 (미국 특허 제 5,714,350호 및 제 6,350,861호). 대안으로, 항체-의존성 세포-매개 세포독성을 증가시키기 위하여, 감소된 양의 푸코실 잔기를 가지는 하이포푸코실화된 항체 또는 증가된 이등분 GlcNac 구조를 가지는 항체가 변경된 글리코실화 메커니즘을 가진 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써 얻어질 수 있다 (Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180).

본원에 개시된 항체는 생물학적 반감기를 증가시키기 위하여 항체 또는 그것의 단편을 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데하이드 유도체와, 하나 이상의 PEG 기가 항체 또는 항체 단편에 부착하게 되는 조건 하에서 반응시킴으로써 페길화될 수 있다. 항체 페길화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응에 의해 수행될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화하기 위해 사용된 PEG의 임의의 형태, 예컨대 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포함하는 것으로 의도된다. 페길화될 항체는 아글리코실화된 항체일 수 있다. 단백질을 페길화하는 방법은 기술분야에 알려져 있고 본원에 개시된 항체에 적용될 수 있다 (EP 0154316 및 EP 0401384).

추가적으로, 항체는 항체의 항원-결합 영역을 결과적으로 얻어지는 분자의 반감기를 증가시키기 위하여 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민에 콘쥬게이션하거나 융합시킴으로써 화학적으로 변형될 수 있다. 그러한 접근법은 예를 들어 EP 0322094 및 EP 0486525에서 기술된다.

본 개시의 항체 또는 그것의 단편은 진단제에 콘쥬게이션될 수 있고, 예를 들어, 질환의 발생 또는 진행을 모니터링하고 주어진 치료 양생법의 효능을 측정하기 위해 진단적으로 사용될 수 있다. 진단제의 예로는 효소, 보철 그룹, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 방사성 물질, 다양한 양전자 방출 단층촬영을 사용하는 양전자 방출 금속, 및 비방사성 상자성 금속 이온을 들 수 있다. 검출 가능한 물질은 항체 또는 그것의 단편에 직접적으로, 또는 기술분야에 알려져 있는 기법을 사용하여 링커를 통해 간접적으로 결합되거나 콘쥬게이션될 수 있다. 적합한 효소의 예로는 양고추냉이 과산화효소, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제를 들 수 있다. 적합한 보철 그룹 복합체의 예로는 스트렙트아비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 들 수 있다. 적합한 형광 물질의 예로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 다이클로로트라이아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 들 수 있다. 발광 물질의 예로는 루미놀을 들 수 있다. 생물발광 물질의 예로는 루시페라제, 푸시페린, 및 에쿼린을 들 수 있다. 비방사성 물질의 예로는　¹²⁵I,¹³¹I, 인듐-111, 루테튬-171, 비스무스-212, 비스무스-213, 아스타틴-211, 구리-62, 구리-64, 구리-67, 이트륨-90, 요오드-125, 요오드-131, 인-32, 인-33, 스칸듐-47, 은-111, 갈륨-67, 프라세오디뮴-142, 사마륨-153, 테르븀-161, 디스프로슘-166, 홀뮴-166, 레늄-186, 레늄-188, 레늄-189, 납-212, 라듐-223, 악티늄-225, 철-59, 셀레늄-75, 비소-77, 스트론튬-89, 몰리브데늄-99, 로듐-1105, 팔라듐-109, 프라세오디뮴-143, 프로메튬-149, 에르븀-169, 이리듐-194, 금-198, 금-199, 및 납-211을 들 수 있다. 단클론성 항체는 항체에 공유 결합되는 이중기능성 킬레이트화제의 사용을 통해 방사성 금속 이온으로 간접적으로 콘쥬게이션될 수 있다. 킬레이트화제는 아미티(amities)를 통해 (Meares et al. (1984) Anal. Biochem. 142:68-78); 아미노산 잔기의 설프하이드랄 기를 통해 (Koyama (1994) Chem. Abstr. 120:217-262) 및 탄수화물 기를 통해 (Rodwell et al. (1986) PNAS USA 83:2632-2636; Quadri et al. (1993) Nucl. Med. Biol. 20:559-570) 부착될 수 있다.

추가로, 본 개시의 항체 또는 그것의 단편은 치료제에 콘쥬게이션될 수 있다. 적합한 치료제로는 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 다이하이드록시 안트라신 다이온, 미토크산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 푸로마이신, 항대사산물 (예컨대 메토트렉세이트, 6-머캡토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 플루다라빈, 5-플루오로우라실, 데카르바진, 하이드록시우레아, 아스파라기나제, 겜시타빈, 클라드리빈), 알킬화제 (예컨대 메클로레타민, 티오에파, 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU), 로무스틴 (CCNU), 사이클로포스파미드, 부술판, 다이브로모만니톨, 스트렙토조토신, 다카르바진 (DTIC), 프로카르바진, 미토마이신 C, 시스플라틴 및 기타 백금 유도체, 예컨대 카르보플라틴), 항생물질 (예컨대 닥티노마이신 (구 악티노마이신), 블레오마이신, 다우노루비신 (구 다우노마이신), 독소루비신, 이다루비신, 미트라마이신, 미토마이신, 미토크산트론, 플리카마이신, 안트라마이신 (AMC)), 디프테리아 독소 및 관련된 분자 (예컨대 디프테리아 A 사슬 및 그것의 활성 단편 및 하이브리드 분자), 리신 독소 (예컨대 리신 A 또는 탈글리코실화된 리신 A 사슬 독소), 콜레라 독소, 시가-유사 독소 (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), LT 독소, C3 독소, 시가 독소, 백일해 독소, 파상풍 독소, 대두 보우만-버크(Bowman-Birk) 프로테아제 억제제, 슈도모나스 외독소, 알로린, 사포린, 모데신, 젤라닌, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 다이안틴(dianthin) 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolacca americana)단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신(curcin), 크로틴(crotin), 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌(gelonin), 미토겔린(mitogellin), 레스트리에토신(restrietocin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin) 독소 및 혼합 독소를 들 수 있다.

추가적인 적합한 콘쥬게이션된 분자로는 리보뉴클레아제 (RNase), DNase I, 안티센스 핵산, siRNA 분자와 같은 억제 RNA 분자, 면역자극성 핵산, 압타머, 리보자임, 트리플렉스 형성 분자, 및 외부 가이드 서열을 들 수 있다. 압타머는 한정된 이차 및 삼차 구조로 접혀지는, 길이가 15-50개 염기 범위의 작은 핵산, 예컨대 스템 루프 또는 G-콰르텟이고, 작은 분자, 예컨대 ATP (미국 특허 제 5,631,146호) 및 테오필린 (미국 특허 제 5,580,737호)뿐만 아니라, 큰 분자, 예컨대 역 전사효소 (미국 특허 제 5,786,462호) 및 트롬빈 (미국 특허 제 5,543,293호)에 결합할 수 있다. 리보자임은 화학적 반응을 분자내적으로 또는 분자 사이에서 촉매할 수 있는 핵산 분자이다. 리보자임은 전형적으로 표적 기질의 인식 및 결합과 후속 절단을 통해 핵산 기질을 절단한다. 트리플렉스 형성 기능 핵산 분자는 이중 가닥 또는 단일 가닥 핵산과 트리플렉스를 형성함으로써 상호작용할 수 있고, 이때 DNA의 3 가닥은 왓슨-크릭 및 후그스타인 염기 쌍형성에 따라 복합체를 형성한다. 트리플렉스 분자는 높은 친화성 및 특이성으로 표적 영역에 결합할 수 있다.

기능성 핵산 분자는 표적 분자가 가진 특정 활성의 이펙터, 억제제, 조절제, 및 자극제로서 작용할 수 있거나, 또는 기능성 핵산 분자는 임의의 다른 분자와 관계없이 드노보 활성을 가질 수 있다.

치료제는 다수의 이용 가능한 방법 중 임의의 방법을 사용하여 항체에 직접 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 예를 들어, 작용제는 N-석시닐 3-(2-피리딜다이티오)프로프리오네이트 (SPDP)와 같은 교차 링커를 사용하여 이황화 결합 형성을 통해, 또는 항체의 Fc 영역의 탄수화물 모이어티를 통해 환원된 항체 구성요소의 힌지 영역에 부착될 수 있다 (Yu et al. 1994 Int. J. Cancer 56: 244; Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods", in Monoclonal antibodies: principles and applications, Birch et al. (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies", in Monoclonal antibodies: Production, engineering and clinical application, Ritter et al. (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995)).

치료제를 항체에 콘쥬게이션하는 기법은 잘 알려져 있다 (Amon et al. "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy; Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al. "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.); Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 및 Thorpe et al. "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", (1982) Immunol. Rev. 62:119-58).

본원에 개시된 항체 또는 그것의 항원-결합 영역은 적어도 둘 또는 그 이상의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 생성하기 위해 또 다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드와 같은 또 다른 기능성 분자에 결합될 수 있다. 항체의 하나 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 또 다른 항체, 항체 단편, 펩타이드 또는 결합 모방물에 대한 결합은, 예를 들어 화학적 커플링, 유전자 융합, 또는 비공유 회합에 의해 이루어질 수 있다. 다중특이적 분자는 제1 및 제2 표적 에피토프 외에, 추가로 제3 결합 특이성을 포함할 수 있다.

이중특이적 및 다중특이적 분자는 기술분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 고-특이적 분자의 각각의 결합 단위는 별도로 생성된 후 서로에게 콘쥬게이션될 수 있다. 결합 분자가 단백질 또는 펩타이드인 경우, 다양한 커플링 또는 교차결합제가 공유 콘쥬게이션을 위해 사용될 수 있다. 교차결합제의 예로는 단백질 A, 카르보다이이미드, N-석신이미딜-S-아세틸티오아세테이트 (SATA), 5,5'-다이티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌다이말레이미드 (oPDM), N-석신이미딜-3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트 (SPDP), 및 설포석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-I-카르복실레이트 (설포-SMCC)를 들 수 있다 (Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). 결합 분자가 항체인 경우, 그것은 두 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 설프하이드릴 결합에 의해 콘쥬게이션될 수 있다.

본 개시의 항체 또는 그것의 단편은 항체가 결합하여 "고갈시키는" 항체를 형성하게 되는 세포에 독성인 모이어티에 결합될 수 있다. 이들 항체는 특히 NK 세포를 고갈시키는 것이 바람직한 응용에 유용하다.

본원에 개시된 항체는 또한 표적 항원의 면역검정 또는 정제에 특히 유용한 고체 지지체에 부착될 수 있다. 그러한 고체 지지체로는, 한정하는 것은 아니지만, 유리, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌을 들 수 있다.

항체는 또한 많은 상이한 담체에 결합될 수 있다. 그러므로, 본 개시는 또한 항체 및 활성 또는 비활성인 또 다른 물질을 함유하는 조성물을 제공한다. 잘 알려져 있는 담체의 예로는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 천연 및 변형 셀룰로스, 폴라아크릴아미드, 아가로스, 및 자철광을 들 수 있다. 담체의 본질은 본원에 개시된 목적에 대해 가용성이거나 불용성일 수 있다. 기술분야에 숙련된 사람들은 단클론성 항체를 결합시키기에 적합한 다른 담체를 알고 있을 것이고, 또는 일상적인 실험을 사용하여 그러한 사실을 확인할 수 있을 것이다.

본원에 제공된 항체의 측면의 일부에서, 항체는 전장 항체이다.

본원에 제공된 항체의 측면의 일부에서, 항체는 단클론성 항체이다.

본원에 제공된 항체의 측면의 일부에서, 항체는 키메라이거나 인간화된다.

본원에 제공된 항체의 측면의 일부에서, 항체는 Fab, F(ab)'2, Fab', scF_v, 및 F_v로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

본원에 제공된 항체의 측면의 일부에서, 항체는 Fc 도메인을 포함한다. 본원에 제공된 항체의 측면의 일부에서, 항체는 래트, 양, 소, 개, 고양이 또는 토끼 항체와 같은 비인간 동물이다. 본원에 제공된 항체의 측면의 일부에서, 항체는 인간 또는 인간화된 항체이거나 또는 인간에서 비-면역원성이다.

본원에 제공된 항체의 측면의 일부에서, 항체는 인간 항체 프레임워크 영역을 포함한다.

다른 측면으로, 본원에 제공된 항체의 CDR의 하나 이상의 아미노산 잔기는 또 다른 아미노산으로 치환된다. 치환은 아미노산의 동일한 패밀리 내에서의 치환이라는 의미에서 "보존성"일 수 있다. 자연적으로 발생하는 아미노산은 다음의 4가지 패밀리로 나누어질 수 잇고 보존성 치환은 그런 패밀리 내에서 일어날 것이다.

1) 염기성 측쇄를 가진 아미노산: 리신, 아르기닌, 히스티딘.

2) 산성 측쇄를 가진 아미노산: 아스파르트산, 글루탐산

3) 대전되지 않은 극성 측쇄를 가진 아미노산: 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신.

4) 비극성 측쇄를 가진 아미노산: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 시스테인.

다른 측면으로, 하나 이상의 아미노산 잔기는 항체의 하나 이상의 CDR에 첨가되거나 그것으로부터 결실된다. 그러한 첨가 또는 결실은 CDR의 N 또는 C 말단에서 또는 CDR 내의 위치에서 일어난다.

아미노산의 첨가, 결실 또는 치환에 의해 항체의 CDR의 아미노산 서열을 변경시킴으로써, 표적 항원에 대한 증가된 결합 친화성과 같은 다양한 효과가 얻어질 수 있다.

폴리뉴클레오타이드, 벡터 및 숙주 세포

본 개시는 또한 상기 확인된 폴리펩타이드 또는 항체 및 그것의 각각의 상보하는 가닥 중 하나 이상을 암호화하는 분리된 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 분리된 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 추가로 제공되며 그것의 예는 기술분야에 알려져 있고 본원에서 기술된다. 한 측면으로 하나 이상의 분리된 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드가 단일 유닛으로서 발현되어야 할 경우에, 분리된 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드는 다중시스트론성 벡터 내에 함유될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 DNA, RNA, mRNA 또는 간섭 RNA, 예컨대 siRNA, miRNA 또는 dsRNA일 수 있다.

개시는 추가로 RNA 전사의 프로모터, 뿐만 아니라 DNA 또는 RNA의 복제 및/또는 일시적인 또는 안정적인 발현을 위한 다른 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 분리된 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 프로모터가 DNA 분자 외에서 RNA의 전사를 지시할 그러한 방식으로 배치된 것을 의미한다. 그러한 프로머터의 예는 SP6, T4 및 T7이다. 특정 구체예에서, 세포-특이적 프로모터는 삽입된 폴리뉴클레오타이드의 세포-특이적 발현을 위해 사용된다. 종결 코돈 및 선택 가능한 마커 서열, 뿐만 아니라 DNA의 삽입된 조각이 그 프로모터와 작동 가능하게 연결될 수 있는 클로닝 부위와 함께, 프로모터 또는 프로모터/인핸서를 함유하는 벡터는 기술 분야에 알려져 있고 상업적으로 이용할 수 있다. 일반적인 방법 및 클로닝 전략에 대해, Gene Expression Technology (Goeddel ed., Academic Press, Inc. (1991)) 및 그 안에서 인용된 참고문헌 및 지도, 기능적 특성, 상업적 공급처 및 다양한 적합한 벡터에 대한 GenEMBL 등록 번호에 대한 참조를 함유한 Vectors: Essential Data Series (Gacesa and Ramji, eds., John Wiley & Sons, N.Y. (1994))를 참조한다.

한 구체예에서, 개시의 폴리뉴클레오타이드로부터 유래된 폴리뉴클레오타이드는 본원에 기술된 진단 및 치료 유용성을 가진 폴리펩타이드, 단백질, 항체 또는 그것의 단편뿐만 아니라 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 단백질의 전사물을 확인하기 위한 프로브를 암호화한다. 이들 핵산 단편은, 예를 들어, 더 큰 폴리뉴클레오타이드의 제한 효소 소화에 의해 제조될 수 있고 그런 후 검출 가능한 마커로 표지화될 수 있다. 대안으로, 무작위 단편이 분자의 닉 번역을 사용하여 생성될 수 있다. 그러한 단편의 제조 및 표지화를 위한 방법에 대해, Sambrook,　et　al. (1989) (상기 동일)을 참조한다.

이들 핵산을 함유하는 발현 벡터는 단백질 및 폴리펩타이드를 생성하기 위한 숙주 벡터 시스템을 얻기에 유용하다. 이들 발현 벡터는 숙주 유기체에서 에피솜으로서 또는 염색체 DNA의 통합 일부로서 복제될 수 있어야 한다는 것이 암시된다. 적합한 발현 벡터의 비제한적인 예로는 플라스미드, 효모 벡터, 바이러스 벡터 및 리포좀을 들 수 있다. 아데노바이러스 벡터가 시험관내 및 생체내 둘 다에서 그것의 세포의 고수준의 발현 및 효율적인 형질전환으로 인해 생체내에서 유전자를 조직으로 도입하는데 특히 유용하다. 핵산이 적합한 숙주 세포, 예컨대 원핵 및 진핵 세포 및 숙주 세포 복제물에 삽입될 때, 단백질이 재조합적으로 생성될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 벡터에 좌우될 것이고 원핵 및 진핵 세포, 예컨대 공지된 방법을 사용하여 구성된 포유류 세포, 동물 세포, 인간 세포, 유인원 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 및 박테리아 세포를 포함할 수 있다. Sambrook, et　al. (1989) (상기 동일) 참조. 외인성 핵산의 세포에의 삽입을 위해 바이러스 벡터를 사용하는 것에 더불어, 핵산은 박테리아 세포의 경우 형질전환; 포유류 세포의 경우 칼슘 포스페이트 침전을 사용하는 트랜스펙션; 또는 DEAE-덱스트란; 전기천공; 또는 미세주입과 같은 기술분야에 알려져 있는 방법에 의해 숙주 세포에 삽입될 수 있다. 방법에 대해 Sambrook et　al. (1989) (상기 동일) 참조. 그러므로, 본 개시는 또한 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 항체 또는 그것의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유한 숙주 세포, 예컨대 포유류 세포, 동물 세포 (래트 또는 마우스), 인간 세포, 또는 원핵 세포, 예컨대 박테리아 세포를 제공한다.

폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 존재한다면, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 폴리뉴클레오타이드의 조립 전 또는 후에 제공될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 구성요소에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 중합화 후에, 예컨대 표지화 구성요소와의 콘쥬게이션에 의해 추가로 변형될 수 있다. 용어는 또한 이중- 및 단일-가닥의 분자 둘 다를 나타낸다. 다르게 명시되거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오타이드인 본 개시의 모든 구체예는 이중 가닥 형태 및 이중 가닥 형태를 구성하는 것으로 알려져 있는 또는 예측되는 두 개의 상보하는 단일 가악 형태의 각각을 모두 포함한다.

벡터가 생체내에서 또는 생체외에서 유전자 요법을 위해 사용될 때, 제약학적으로 허용되는 벡터, 예컨대 복제-무능 레트로바이러스 또는 아데노바이러스 벡터가 바람직하다. 본 개시의 핵산을 함유한 제약학적으로 허용되는 벡터는 삽입된 폴리뉴클레오타이드의 일시적인 또는 안정적인 발현을 위해 추가로 변형될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "제약학적으로 허용되는 벡터"는, 한정하는 것은 아니지만, 핵산을 선택적으로 표적화하고 그것을 분할 세포로 도입하는 능력을 가지고 있는 벡터 또는 전달 비히클을 포함한다. 그러한 벡터의 예는 바이러스 단백질을 생성하지 못하는 무능력에 의해 규정된 "복제-무능" 벡터로, 그것은 감염된 숙주 세포에서 벡터의 확산을 불가능하게 한다. 복제-무능 레트로바이러스 벡터의 예는 LNL6이다 (Miller et　al. (1989) BioTechniques 7:980-990). 유전자 마커의 레트로바이러스-매개 유전자 전달을 위해 복제-무능 레트로바이러스를 사용하는 방법은 확립되어 있다. (Bordignon (1989) PNAS USA 86:8912-8952; Culver (1991) PNAS USA 88:3155; 및 Rill (1991) Blood 79(10):2694-2700).

본 개시는 또한 본 개시의 폴리뉴클레오타이드를 함유하거나 및/또는 발현하는 유전자 변형 세포를 제공한다. 유전자 변형 세포는 프로모터 또는 유전자 활성자와 같은 상류 조절 서열의 삽입에 의해 제조될 수 있다 (미국 특허 제 5,733,761호 참조).

폴리뉴클레오타이드는 검출 가능한 마커, 예컨대, 효소적 표지 또는 세포에서 핵산의 검출 및/또는 유전자의 발현을 위한 방사성 동위원소에 콘쥬게이션될 수 있다. 검출 가능한 신호를 제공할 수 있는 형광, 방사성, 효소적 또는 다른 리간드, 예컨대 아비딘/비오틴을 포함한 광범위한 적절한 검출 가능한 마커가 기술분야에 알려져 있다. 한 측면으로, 당업자는 방사성 또는 다른 환경적으로 바람직하지 않은 시약 대신에, 형광 표지 또는 효소 태그, 예컨대 우레아제, 알칼리성 포스파타제 또는 과산화효소를 사용하기를 원할 수 있을 것이다. 효소 태그의 경우에, 상보하는 핵산-함유 샘플과의 특이적인 혼성화를 확인하기 위해, 열량 측정 지표 기질이 인간의 눈에 또는 분광광도계에 대해 시각적인 수단을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 그러므로, 본 개시는 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드를 본 개시의 폴리뉴클레오타이드의 일부분인 표지화된, 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 (프로브)와, 상보하는 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 혼성화를 허용하는 조건 (바람직하게는 적당히 엄격한 혼성화 조건) 하에서, 보다 바람직하게는 매우 엄격한 혼성화 조건 하에서 접촉시킴으로써 단일 가닥의 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체를 검출하는 방법을 추가로 제공한다. 혼성화된 폴리뉴클레오타이드 쌍은 혼성화되지 않은, 단일 가닥의 폴리뉴클레오타이드로부터 분리된다. 혼성화된 폴리뉴클레오타이드 쌍은 기술분야에 숙련된 지식을 가진 사람들에게 알려져 있고 예를 들어 Sambrook et　al. (1989) (상기 동일)에 제시된 방법을 사용하여 검출된다.

본 개시에서 구현된 폴리뉴클레오타이드는 화학적 합성, 재조합 클로닝 방법, PCR, 또는 이것들의 임의의 조합을 사용하여 얻어질 수 있다. 화학적 폴리뉴클레오타이드 합성 방법은 기술분야에 알려져 있고 본원에서 상세하게 기술될 필요가 없다. 기술분야에 숙련된 사람은 DNA 합성기를 사용함으로써 또는 상업적 서비스로부터 주문함으로써 원하는 폴리뉴클레오타이드를 얻기 위해 본원에 제공된 서열 데이터를 사용할 수 있다.

본 개시의 폴리뉴클레오타이드는 PCR을 사용하여 분리되거나 복제될 수 있다. PCR 기술은 미국 특허 제　4,683,195호; 제　4,800,159호; 제　4,754,065호; 및 제　4,683,202호의 주제이며 PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et　al. eds., Birkhauser Press, Boston (1994)) 또는 MacPherson et　al. (1991) 및 (1995), 그 안에서 인용된 참고문헌에서 기술된다. 대안으로, 기술분야에 숙련된 사람은 DNA를 복제하기 위하여 본원에 제공된 서열 및 상업적 DNA 합성기를 사용할 수 있다. 따라서, 본 개시는 또한 폴리뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드, 적절한 프라이머 분자, 효소와 같은 화학물질의 선형 서열 및 이것들의 복제를 위한 설명서를 제공하고 폴리뉴클레오타이드를 얻기 위해 뉴클레오타이드를 화학적으로 복제하거나 또는 적절한 방향으로 연결시킴에 의한 본 개시의 폴리뉴클레오타이드를 얻는 방법을 제공한다. 별도의 구체예에서, 이들 폴리뉴클레오타이드는 추가로 분리된다. 또한 추가로, 기술분야에 숙련된 사람은 복제 및 증폭을 위해 폴리뉴클레오타이드를 적합한 복제 벡터에 삽입하고 벡터를 적합한 숙주 세포 (원핵 또는 진핵)에 삽입할 수 있다. 그렇게 증폭된 DNA는 기술분야에 숙련된 사람들에게 알려져 있는 방법에 의해 세포로부터 분리될 수 있다. 이런 방법에 의해 폴리뉴클레오타이드를 얻기 위한 과정뿐만 아니라 그렇게 얻어진 폴리뉴클레오타이드가 추가로 본원에 제공된다.

RNA는 DNA 폴리뉴클레오타이드를 적합한 숙주 세포에 먼저 삽입함으로써 얻어질 수 있다. DNA는 임의의 적절한 방법에 의해, 예컨대, 적절한 유전자 전달 비히클 (예컨대, 리포좀, 플라스미드 또는 벡터)을 사용함으로써 또는 전기천공에 의해 전달될 수 있다. 세포가 복제하고 DNA가 RNA로 전사될 때; RNA는 그런 후에 기술분야에 숙련된 사람들에게 알려져 있는, 예컨대 Sambrook et　al. (1989) (상기 동일)에 제시된 방법을 사용하여 분리될 수 있다. 예를 들어, mRNA는 Sambrook et　al. (1989) (상기 동일)에 제시된 과정에 따라 다양한 용해 효소 또는 화학적 용액을 사용하여 분리되거나, 또는 제조사에 의해 제공된 수반된 설명서를 따라서 핵산-결합 수지에 의해 추출될 수 있다.

본 개시의 폴리뉴클레오타이드에 상보하는 또는 상동하는 서열을 나타내는 폴리뉴클레오타이드는 혼성화 프로브로서 또는 본원에서 확인된 특정 폴리뉴클레오타이드의 동등물로서 유용하다. 전사물의 전체 코딩 서열이 알려져 있기 때문에, 이 서열 또는 상동하는 서열의 임의의 부분이 본 개시의 방법에 사용될 수 있다.

기술분야에는 "완벽하게 매칭된" 프로브가 특정 혼성화에 필요하지 않는 것으로 알려져 있다. 적은 수의 염기의 치환, 결실 또는 삽입에 의해 이루어진 프로브 서열의 미미한 변화는 혼성화 특이성에 영향을 주지 않는다. 일반적으로, 20% 정도로 많은 염기쌍 미스매치 (최적으로 정렬된 경우)가 허용될 수 있다. 바람직하게, 상기 언급된 mRNA를 검출하는 데 유용한 프로브는 상동성 영역에 적어도 약 80% 동일한다. 보다 바람직하게, 프로브는 상동성 영역의 정렬 후에 상응하는 유전자 서열에 85% 동일하다; 보다 더 바람직하게, 그것은 90% 동일성을 나타낸다.

이들 프로브는 다양한 세포 이들 세포를 함유하는 조직을 검출, 예측, 진단 또는 모니터링하기 위한 방사성 검정 (예컨대 서던 및 노던 블롯 분석)에 사용될 수 있다. 프로브는 또한 본 개시의 폴리뉴클레오타이드에 상응하는 유전자의 발현의 검출을 위해 고처리량 스크리닝 검정에 사용하기 위한 고체 지지체에 또는 칩과 같은 어레이에 부착될 수 있다. 따라서, 본 개시는 또한 고처리량 스크리닝에 사용하기 위해 고체 지지체에 부착된 본 개시의 폴리뉴클레오타이드, 또는 그것의 동등물, 또는 그것의 보체, 또는 그것의 단편을 포함하는 또는 상응하는 프로브를 제공한다.

단편의 총 크기, 뿐만 아니라 상호하는 구간의 크기는 특정 핵산 분절의 의도된 용도 또는 응용에 따라 좌우될 것이다. 보다 작은 단편은 일반적으로 혼성화 구체예에서 사용될 것인데, 이때 상보하는 영역의 길이는 당업자가 검출하고자 하는 상보하는 서열에 따라, 예컨대 적어도 5 내지 10 내지 약 100개 뉴클레오타이드로 달라지거나, 또는 심지어 전장일 수 있다.

하이브리드의 안정성 및 선택성을 증가시키고, 그로써 얻어진 특정 하이브리드 분자의 특이성을 개선시키기 위하여, 길이가 5 내지 10개 뉴클레오타이드 이상인 구간에 걸쳐 상보하는 서열을 가진 뉴클레오타이드 프로브가 일반적으로 바람직하다. 보다 바람직하게는, 당업자는 길이가 10개 이상 또는 50개 이상의 뉴클레오타이드, 또는 심지어 필요에 따라 더 긴 유전자-상보성 구간을 가지는 폴리뉴클레오타이드를 설계할 수 있다. 그러한 단편은 예를 들어, 화학적 수단에 의해 단편을 직접적으로 합성함으로써, 핵산 재생산 기술, 예컨대 미국 특허 제　4,603,102호에 기술된 것과 같이 2개의 프라이머 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 PCR 기술의 적용에 의해 또는 재조합 제조를 위해 선택된 서열을 재조합 벡터에 도입시킴으로써, 쉽게 제조될 수 있다. 한 측면으로, 프로브는 약 50-75개 또는 그 이상, 대안으로, 50-100개의 뉴클레오타이드의 길이이다.

본 개시의 폴리뉴클레오타이드는 본원에 기술된 세포에서 발현되는 유전자 또는 유전자 전사물의 검출을 위한 프라이머로서 작용할 수 있다. 이런 맥락에서, 증폭은 타당한 신뢰성으로 표적 서열을 복제할 수 있는 프라이머-의존성 중합효소를 사용하는 임의의 방법을 의미한다. 증폭은 T7 DNA 중합효소, 대장균 DNA 중합효소의 클레노우(Klenow) 단편, 및 역 전사효소와 같은 천연 또는 재조합 DNA-중합효소에 의해 수행될 수 있다. 예시의 목적만으로, 프라이머는 프로브에 대해 확인된 것과 동일한 길이이다.

폴리뉴클레오타이드를 증폭시키는 한 가지 방법은 PCR이고 PCR 증폭을 위한 키트가 상업적으로 이용 가능하다. 증폭 후에, 결과적으로 얻어진 DNA 단편은 기술분야에 알려져 있는 임의의 적절한 방법에 의해, 예컨대 아가로스 겔 전기영동 및 이어서 에티듐 브로마이드 염색 및 자외선 발광을 사용한 시각화에 의해 검출될 수 있다.

유효량의 유전자 전달 벡터 또는 비히클을 세포에 투여하는 방법이 개발되어 있고 기술분야에 숙련된 사람들에게 알려져 있으며 본원에서 기술된다. 세포에서 유전자 발현을 검출하는 방법은 기술분야에 알려져 있고 DNA 마이크로어레이에 대한 혼성화, 인시튜 혼성화, PCR, RNase 보호 검정 및 노던 블롯 분석에서와 같은 기법을 포함한다. 그러한 방법은 세포에서 유전자의 발현을 검출하고 정량화하는 데 유용하다. 대안으로 암호화된 폴리펩타이드의 발현은 다양한 방법에 의해 검출될 수 있다. 특히 표적 폴리펩타이드와 특이적으로 반응할 수 있는 다클론성 또는 단클론성 항체를 제조하는 것이 유용하다. 그러한 항체는 면역조직학, ELISA, 및 웨스턴 블롯팅과 같은 기법을 사용하여 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 시각화하는 데 유용하다. 이들 기법은 발현된 폴리뉴클레오타이드의 발현 수준을 측정하기 위해 사용될 수 있다.

한 측면으로, HMG-박스 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는 야생형 및 재조합적으로 제조된 폴리펩타이드 및 원핵 및 진핵 숙주 세포로부터의 단백질을 포함한다.

단백질 및 폴리펩타이드는 정제, 화학적 합성 및 재조합 방법을 포함한, 기술분야에 숙련된 사람들에게 알려져 있는 많은 과정에 의해 얻어질 수 있다. 폴리펩타이드는 숙주 세포 시스템과 같은 조제물로부터 항체를 사용한 면역침전법 및 겔 여과, 이온 교환, 상의 역상 및 친화성 크로마토그래피와 같은 표준 기법과 같은 방법에 의해 분리될 수 있다. 그러한 방법에 대해, 예를 들어 Deutscher et al. (1999) Guide To Protein Purification: Methods In Enzymology (Vol. 182, Academic Press)를 참조한다. 따라서, 본 개시는 또한 이들 폴리펩타이드를 얻기 위한 과정뿐만 아니라 이들 과정에 의해 얻어질 수 있고, 얻어진 생성물을 제공한다.

폴리펩타이드는 또한 상업적으로 이용 가능한 자동 펩타이드 합성기, 예컨대 Perkin/Elmer/Applied Biosystems, Inc.사에서 제조된 것들, Model 430A 또는 43lA (Foster City, CA, USA)를 사용하여 화학적 합성에 의해 얻어질 수 있다. 합성된 폴리펩타이드는 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 침전되고 추가로 정제될 수 있다. 따라서, 본 개시는 또한 단백질 및 시약, 예컨대 아미노산 및 효소의 서열을 제공하고 아미노산을 적절한 방향으로 및 선형 서열과 함께 연결시킴으로써 본 개시의 단백질을 화학적으로 합성하는 방법을 제공한다.

대안으로, 단백질 및 폴리펩타이드는, 예를 들어, Sambrook et al. (1989) (상기 동일)에 기술되어 있는 잘 알려져 있는 재조합 방법에 의해, 본원에 기술된 숙주 세포 및 벡터 시스템을 사용하여 얻어질 수 있다.

본 개시의 폴리펩타이드는 또한 다양한 고체 상 담체, 예컨대 임플란트, 스텐트, 페이스트, 겔, 치과용 임플란트 또는 의료용 임플란트 또는 액체 상 담체, 예컨대 비드, 멸균 또는 수성 용액, 제약학적으로 허용되는 담체, 현탁액 또는 에멀션과 조합될 수 있다. 비수성 용매의 예로는 프로필 에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 식물성 오일을 들 수 있다. 항체를 제조하기 위해 또는 생체내에서 면역 반응을 유도하기 위해 사용될 때, 담체는 또한 특정 면역 반응을 비특이적으로 증대시키기에 유용한 보조제를 포함할 수 있다. 숙련된 전문가는 보조제가 필요한지 쉽게 결정하고 그것을 선택할 수 있다. 그러나, 단지 예시의 목적으로, 적합한 보조제로는 한정하는 것은 아니지만 프로인트 완전 및 불완전, 미네랄 염 및 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있다. 다른 적합한 보조제로는 모노포스포릴 지질 A (MPL), 대장균의 열 가변성 장독소의 돌연변이 유도체, 콜레라 독소의 돌연변이 유도체, CPG 올리고뉴클레오타이드 및 스쿠알렌으로부터 유래된 보조제를 들 수 있다.

치료 방법

본 개시의 한 구체예는 DNABII 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 미생물 DNA를 본원에 기술된 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계, 그로써 DNABII 단백질 또는 폴리펩타이드의 미생물 DNA에의 결합을 억제, 경합 또는 적정하는 단계를 포함하는, DNABII 폴리펩타이드 또는 단백질의 미생물 DNA에의 결합을 억제하는, 경합하는 또는 적정하는 방법을 제공한다. 일부 측면으로, 접촉은 시험관내에서 또는 생체내에서 이루어진다.

본 개시의 또 다른 구체예는 생물막을 본원에 기술된 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계, 그로써 미생물 생물막을 억제, 방지 또는 분해하는 단계를 포함하는, 미생물 생물막을 억제, 방지 또는 분해하는 방법을 제공한다. 일부 측면으로, 접촉은 시험관내에서 또는 생체내에서 이루어진다.

본 개시의 또 다른 구체예는 생물막을 본원에 기술된 B 박스 폴리펩타이드를 포함하는, 또는 본질적으로 그것으로 이루어지는, 또는 그것으로 이루어지는 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계, 그로써 생물막을 파괴하고 염증성 반응을 증강시키거나 유도하지 않도록 제거하는 단계를 포함하는, 생물막을 파괴하고 염증성 반응을 증강시키거나 유도하지 않도록 제거하는 방법을 제공한다. 일부 측면으로, 접촉은 시험관내에서 또는 생체내에서 이루어진다.

본 개시의 또 다른 구체예는 유효량의 본원에 기술된 폴리펩타이드를 대상체에 투여하는 단계, 그로써 미생물 생물막을 억제, 방지 또는 분해하는 단계를 포함하는, 대상체에서 생물막을 억제, 방지 또는 분해하는 방법을 제공한다. 한 측면으로, 방법은 본원에 개시된 B 박스 폴리펩타이드를 포함하는, 또는 본질적으로 그것으로 이루어지는, 또는 그것으로 이루어지는 폴리펩타이드의 유효량을 투여하는 단계를 포함하거나, 또는 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다.

또한 또 다른 구체예에서, 유효량의 본원에 기술된 폴리펩타이드를 대상체에 투여하는 단계, 그로써 대상체에서 생물막을 생성하는 미생물 감염을 억제, 방지 또는 치료하는 단계를 포함하는, 대상체에서 생물막을 생성하는 미생물 감염을 억제, 방지 또는 치료하는 방법이 제공된다. 한 측면으로, 방법은 본원에 개시된 B 박스 폴리펩타이드를 포함하는, 또는 본질적으로 그것으로 이루어지는, 또는 그것으로 이루어지는 폴리펩타이드의 유효량을 투여하는 단계를 포함하거나, 또는 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다.

상기 구체예 중 임의의 구체예의 측면으로, HMG-박스 도메인을 포함하는, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지는, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는 폴리펩타이드는 AB 박스, A 박스, 및 B 박스, 뿐만 아니라 본원에 기술된 돌연변이, 절단물 및 융합 단백질 (도 3 참조) 뿐만 아니라 그것들의 동등물로서 기술된다.

그것들의 동등물은 AB 박스, A 박스, 및 B 박스, 뿐만 아니라 본원에 기술된 돌연변이, 절단물 및 융합 단백질 (도 3 참조)에 대해 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 폴리펩타이드를 포함하거나 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 일부 측면으로, 동등물은 폴리펩타이드에 변경된 아미노산을 보유하며, 모 또는 참조 단백질, 펩타이드, 융합 또는 돌연변이된 버전의 능력을 보유한다. 일부 측면으로, HMG-박스 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는 상기 열거된 임의의 폴리펩타이드에 대한 생물학적 동등물을 포함하거나 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다.

일부 측면으로, 분리된 또는 재조합 단백질은 포유류 단백질이다. 특정 측면으로, 포유류 단백질은 쥐과 또는 인간 단백질이다. 추가의 측면으로, 단백질은 진핵 또는 원핵 세포에서 제조된 포유류 단백질이다. 그것들은 기술분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 번역 후에 변형될 수 있다.

상기 방법 중 어느 것이든지 유효량의 하나 이상의 항미생물, 항원성 펩타이드 또는 보조제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하거나 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어질 수 있다. 대상체는, 한 측면으로, 비인간 동물 또는 인간 환자이다. 한 측면으로, 환자는 유소년 또는 유아 인간이다.

폴리펩타이드는 국소적으로, 경피로, 혀밑으로, 직장으로, 질로, 눈으로, 피하, 근육내로, 복강내로, 요도로, 비강내로, 흡입에 의해 또는 경구를 포함하는 방법에 의해 투여된다.

일부 측면으로, 대상체는 소아 환자이고 폴리펩타이드는 소아 환자를 위한 제제로 투여된다.

상기 구체예 중 어느 것에서든, 생물막은 표 1에서 확인된 미생물로부터의 미생물 DNA를 포함할 수 있다.

한 구체예에서, 폴리펩타이드는 미생물 감염에 대해 국소적으로 투여되고 생물막을 분해한다.

한 구체예에서, 본 개시는 유효량의 본원에 기술된 폴리펩타이드를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지는, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는, 그것을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유도하거나 제공하는 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 투여는 면역 반응이 바람직한 경우에 국소적이다. 한 측면으로, 방법은 본원에 개시된 B 박스 폴리펩타이드를 포함하는, 또는 본질적으로 그것으로 이루어지는, 또는 그것으로 이루어지는 폴리펩타이드의 유효량을 투여하는 단계를 포함하거나, 또는 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. MG-박스 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 예는 본원에 기술된다. 한 측면으로, 방법은 본원에 개시된 B 박스 폴리펩타이드를 포함하는, 또는 본질적으로 그것으로 이루어지는, 또는 그것으로 이루어지는 폴리펩타이드의 유효량을 투여하는 단계를 포함하거나, 또는 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다.

분리된 또는 재조합 단백질은 포유류 단백질이거나 또는 특정 측면으로 인간 단백질일 수 있다. 대상체는, 일부 측면으로, 비인간 동물 또는 인간 환자이다.

본 개시의 작용제 및 조성물은 다른 항미생물제 및/또는 표면 항원과 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 한 특정 측면으로, 투여는 감염 부위에 국소적이다. 투여의 다른 비제한적인 예로는 경피적으로, 혀밑으로, 직장으로, 질로, 눈으로, 피하로, 근육내로, 복강내로, 비강내로, 흡입에 의해 또는 경구를 포함하는 하나 이상의 방법을 들 수 있다.

또한 한 구체예에서, 생물막을 분해하거나 또는 생물막을 생성하는 미생물 감염을 억제, 방지 또는 치료하고 본워에 기술된 의학적 유익을 제공하는 데에 사용되는 의약의 제조를 위한 상기 기술된 임의의 폴리펩타이드의 용도가 제공된다.

이들 방법 중 일부 방법에 대해 접촉은 시험관내에서 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 접촉이 시험관내에서 있을 때, 방법은 동물 또는 임상 연구 전에 본 개시의 작용제의 효능을 측정하기 위한 수단을 제공하고 본 개시의 작용제가 추가적인 항미생물제와 상조적으로 작업하는지를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 동물 모델에서 생체내에서 수행될 때, 방법은 인간 환자에서의 연구 전에 본 개시의 작용제의 효능을 측정하기 위한 수단을 제공하고 본 개시의 작용제가 추가적인 항미생물제와 상조적으로 작업하는지를 측정하기 위해 사용될 수 있다.

본 개시의 방법에 의해 치료될 수 있는 미생물 감염 및 질환은 표 1에서 확인된 유기체, 예컨대, 스트렙토코커스 아갈락티에, 네이세리아 메닝기티디스, 트레포네메스, 덴티콜라, 팔라듐, 버크홀데리아 세파시아 또는 버크홀데리아 슈도말레이에 의한 감염을 포함한다. 한 측면으로, 미생물 감염은 헤모필루스 인플루엔자 (비피막형), 모락셀라 카타랄리스, 스트렙토코커스 뉴모니아, 스트렙토코커스 피오게네스, 슈노모나스 아에루기노사, 미코박테리움 투베르쿨로시스 및 ESKAPE 병원체 중 하나 이상이다. 이들 미생물 감염은 상부, 중간 또는 하부 기도에 존재할 수 있을뿐 아니라 (이염, 부비동염 또는 기관지염) 또한 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 만성 기침, 낭포성 섬유증 (CF) 및 지역사회 획득 폐렴 (CAP)의 합병증 및/또는 일차 원인의 악화에도 존재할 수 있다.

감염은 또한 구강에서도 발생할 것이고 (충치, 치주염) 스트렙토코커스 뮤탄스, 포르피로모나스 긴기발리스, 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스에 의해 유발된다. 감염은 또한 피부에 국한될 수 있을 것이고 (농양, '포도상 구균' 감염, 농가진, 화상의 이차 감염, 라임 병) 스타필로코커스 아우레우스, 타필로코커스 에피더미디스, 슈도모나스 아에루기노사 및 보렐리아 부르도르페리에 의해 유발된다. 요로의 감염 (UTI)이 또한 치료될 수 있고 전형적으로 대장균에 의해 유발된다. 위장관 (GI)의 감염 (설사, 콜레라, 담석, 위궤양)은 전형적으로 살모넬라 엔테리카 세로바르, 비브리오 콜레라 및 헬리코박터 파일로리에 의해 유발된다. 생식기의 감염은 네이세리아 고노로에아를 포함하고 전형적으로 그것에 의해 유발된다. 감염은 방광의 감염이거나 엔테로코커스 파에칼리스에 의해 유발된 내재 장치의 감염일 수 있다. 이식된 보철 장치, 예컨대 인공 엉덩이 또는 무릎 대체물 또는 치과 임플란트 또는 펌프 또는 모니터링 시스템과 같은 의료 장치와 관련된 감염은 전형적으로 다양한 박테리아에 의해 유발되고, 본 개시의 방법에 의해 치료될 수 있다. 이들 장치는 본원에 기술된 작용제에 코팅되거나 콘쥬게이션될 수 있다.

스트렙토코커스 아갈락티에에 의해 유발된 감염은 신생아에서 박테리아성 패혈증의 주요 원인이다. 그러한 감염은 또한 본 개시의 방법에 의해 치료될 수 있다. 마찬가지로, 수막염을 유발할 수 있는 네이세리아 메닝기티디스에 의해 유발된 감염 또한 치료될 수 있다.

그러므로, 개시의 방법에 적용할 수 있는 투여 경로로는 비강내, 근육내, 기관내, 피하, 피내, 국소 적용, 정맥내, 직장, 비강, 경구 및 기타 장 및 비경구 투여 경로를 들 수 있다. 투여 경로는 필요에 따라 조합될 수 있거나, 또는 작용제 및/또는 원하는 효과에 따라 조정될 수 있다. 활성제는 단일 용량으로 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 전달에 적합한 이들 방법 및 경로의 구체예는 전신적 도는 국한된 경로를 포함한다. 일반적으로, 개시의 방법에 적합한 투여 경로로, 한정하는 것은 아니지만, 장, 비경구 또는 흡입 경로를 들 수 있다.

흡입 투여 이외의 비경구 투여 경로로는, 한정하는 것은 아니지만, 국소, 경피, 피하, 근육내, 안와내, 캡슐내, 척수내, 흉골내 및 정맥내 경로, 즉, 소화관(alimentary canal)을 통하는 것 이외의 임의의 투여 경로를 들 수 있다. 비경구 투여는 억제제의 전신성 또는 국소적 전달을 이루기 위해 수행될 수 있다. 전신성 전달이 바람직한 경우, 투여는 전형적으로 제약학적 조제물의 침습성 또는 전신적으로 흡수된 국소적 또는 점막 투여를 포함한다.

개시의 화합물은 또한 장 투여에 의해 대상체에게 전달될 수 있다. 장 투여 경로로는, 한정하는 것은 아니지만, 경구 및 직장 (예컨대, 좌제를 사용함) 전달을 들 수 있다.

피부 또는 점막을 통한 활성물질의 투여 방법으로는, 한정하는 것은 아니지만, 적합한 제약학적 조제물의 국소 적용, 피부 경유 전달, 경피 전달, 주사 및 표피 투여를 들 수 있다. 경피 전달의 경우, 흡수 프로모터 또는 이온삼투법(iontophoresis)이 적합한 방법이다. 이온삼투성 전달은 전기 펄스를 통해 손상되지 않은 피부를 통하여 여러 날 이상의 기간 동안 지속적으로 생성물을 전달하는, 상업적으로 이용 가능한 "패치"를 사용하여 이루어질 수 있다.

개시의 방법의 다양한 구체예에서, 활성 물질은 연속적인, 매일 기준으로, 1일당 적어도 1회 (QD) 및 다양한 구체예에서 1일에 2회 (BID), 3회 (TID) 또는 심지어 4회 경구로 투여될 것이다. 전형적으로, 치료적으로 효과적인 일일 용량은 적어도 약 1 mg, 또는 적어도 약 10 mg, 또는 적어도 약 100 mg 또는 약 200 - 약 500 mg일 것이고, 때로 화합물에 따라 최대 약 1 g 내지 약 2.5 g까지 많을 수 있다.

개시의 방법에 따라 투약은 캡슐, 정제, 경구용 현탁액, 근육내 주사를 위한 현탁액, 정맥내 주입을 위한 현탁액, 국소 적용을 위한 젤 또는 크림 또는 관절내 주사를 위한 현탁액을 사용하여 이루어질 수 있다.

본원에 기술된 조성물의 투여량, 독성 및 치료 효능은, 예를 들어, LD50 (집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50 (집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 측정하기 위한 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 제약학적 과정에 의해 측정될 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 용량 비율은 치료 지수이며 비율 LD50/ED50으로서 표시될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 조성물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수 있지만, 감염되지 않은 세포에 대한 잠재적 손상을 최소화하고, 그로써 부작용을 감소시키기 위해 그러한 화합물을 영향을 받은 조직 부위로 가져가는 전달 시스템을 설계하기 위해서는 주의가 필요하다.

세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 얻어진 데이터는 인간에게 사용하기 위한 투여량 범위를 공식화하는 데 사용될 수 있다. 그러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없이 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다. 방법에 사용된 임의의 화합물의 경우, 치료적 유효 용량은 초기에는 세포 배양 검정으로부터 추정될 수 있다. 용량은 세포 배양에서 측정된 바 IC50 (즉, 증상의 절반-최대 억제를 이루는 테스트 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 이루기 위해 동물 모델에서 공식화될 수 있다. 그러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 측정하기 위해 사용될 수 있다. 혈장의 수준은, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.

일부 구체예에서, 치료적 또는 예방적 효과를 이루기에 충분한 조성물의 유효량은 투여당 킬로그램 체중당 약 0.000001 내지 투여당 킬로그램 체중당 약 10,000 mg의 범위이다. 적합하게, 투여량 범위는 투여당 킬로그램 체중당 약 0.0001 mg 내지 투여당 킬로그램 체중당 약 100 mg이다. 투여는 초기 용량으로서 제공된 후, 하나 이상의 "부스터" 용량으로서 제공될 수 있다. 부스터 용량은 초기 용량 후 1일, 2일, 3일, 1주, 2주, 3주, 1, 2, 3, 6 또는 12개월 후에 제공될 수 있다. 일부 구체예에서, 부스터 용량은 투여 전 대상체의 반응의 평가 후에 투여된다.

숙련된 전문가는 한정하는 것은 아니지만, 질환 또는 장애의 중증도, 이전의 치료, 일반적인 건강 및/또는 대상체의 연령, 및 기타 존재하는 질환을 포함하여, 특정 요인이 를 효과적으로 치료하기 위해 필요한 투여량 및 타이밍에 영향을 미칠 수 있는 것을 인정할 것이다. 더욱이, 치료적 유효량의 본원에 기술된 치료 조성물로의 대상체의 치료는 단일 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 한 측면으로, 용어 "치료"는 예방을 배제한다.

본 개시의 조성물 및 관련된 방법은 다른 치료법의 투여와 함께, 또는 그러한 치료법의 부재 하에 사용될 수 있다. 이것들로는, 한정하는 것은 아니지만, DNase 효소, 항생물질, 항미생물제, 또는 다른 항체의 투여를 들 수 있다. 한 측면으로, 폴리펩타이드는 낭포성 섬유증에 발생하는 미생물 감염 및 생물막을 치료하기 위해 DNase 효소와 함께 투여된다.

일부 구체예에서, 방법 및 조성물은 본 개시의 조성물과 상조적으로 작용하는 데옥시리보뉴클레아제 (DNase), 예컨대, DNase를 포함한다. DNase는 DNA 골격의 포스포다이에스테르 결합의 절단을 촉매하는 임의의 효소이다. 십자형 구조뿐 아니라 DNA의 다양한 이차 구조를 표적으로 하는 것으로 알려져 있는 DNase 효소의 3가지 비제한적인 예로 DNAse I, T4 EndoVII 및 T7 Endo I를 들 수 있다. 특정 구체예에서, 생물막을 탈안정화하기 위해 필요한 항-DNABII 항체의 유효량은 DNase와 조합될 때 감소된다. 시험관내에서 투여될 때, DNase는 직접적으로 검정에 또는 효소를 안정화시키는 것으로 알려져 있는 적합한 완충액에 첨가될 수 있다. DNase의 유효 단위 용량 및 검정 조건은 달라질 수 있고, 기술분야에 알려져 있는 과정에 따라 최적화될 수 있다.

다른 구체예에서, 방법 및 조성물은 항생물질 및/또는 항미생물제와 조합될 수 있다. 항미생물제는 박테리아, 진균, 또는 원생동물과 같은 미생물을 사멸시키거나 성장을 억제하는 물질이다. 비록 생물막이 일반적으로는 항생물질의 작용에 내성이지만, 본원에 기술된 조성물 및 방법은 감염을 치료하기 위한 전통적인 치료 방법에 대해 생물막을 포함하는 감염을 민감하게 만들기 위해 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 본원에 기술된 방법 및 조성물과 조합된 항생물질 또는 항미생물제의 사용은 항미생물제 및/또는 생물막 감소제의 유효량의 감소를 허용한다. 본 개시의 방법과 조합하여 유용한 항미생물제 및 항생물질의 일부 비제한적인 예로는 미노싸이클린, 아목시실린, 아목시실린-클라불라나트(clavulanate), 세프디니어(cefdinir), 아지트로마이신(azithromycin), 및 설파메톡사졸-트라이메토프림(sulfamethoxazole-trimethoprim)을 들 수 있다. 생물막 감소제와 조합된 항미생물제 및/또는 항생물질의 치료적 유효 용량은 전통적인 방법에 의해 쉽게 측정될 수 있다. 일부 구체예에서 생물막 감소제와 조합된 항미생물제의 용량은 다른 박테리아 감염, 예를 들어, 감염의 병인이 생물막을 포함하지 않는 박테리아 감염에서 효과적인 것으로 나타난 평균 유효 용량이다. 다른 구체예에서, 용량은 평균 유효 용량의 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.45, 0.50, 0.55, 0.60, 0.65, 0.70, 0.75, 0.8, 0.85, 0.9, 0.95, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3.0 또는 5배이다. 항생물질 또는 항미생물제는 항-DNABII 항체의 첨가 전에, 함께, 또는 후속하여 첨가될 수 있다.

다른 구체예에서, 방법 및 조성물은 박테리아 감염을 치료하는 항체와 조합될 수 있다. 본원에 기술된 방법 및 조성물과 조합하여 유용한 항체의 한 예는 비관련 외막 단백질에 대해 지시된 항체 (예컨대, OMP P5)이다. 이 항체 단독으로의 치료는 시험관내에서 생물막의 부피를 감소시키지 못한다. 이 항체와 생물막 감소제의 병용 요법은 동일한 농도에서 단독으로 사용된 어느 하나의 시약에 의해 이루어질 수 있는 것보다 더 큰 효과를 초래한다. 생물막 감소제 또는 생물막을 감소시키기 위한 방법과 조합될 때 시너지 효과를 유발할 수 있는 다른 항체로는 항-rsPilA, 항-OMP26, 항-OMP P2, 및 항-전체 OMP 조제물을 들 수 있다.

본원에 기술된 조성물 및 방법은 및 방법은 생물막을 포함하는 박테리아 감염을 생물막이 없는 박테리아 감염을 치료하는 데 효과적이지만 다르게는 생물막을 포함하는 박테리아 감염에서 비효과적인 일반적인 치료 양식에 대해 민감하게 만들기 위해 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 본원에 기술된 조성물 및 방법은 생물막을 포함하는 박테리아 감염을 치료하는 데 효과적인 치료 양식과 조합되어 사용될 수 있지만, 그러한 추가적인 치료법 및 생물막 감소제 또는 방법의 조합은 생물막 감소제 또는 추가적인 치료제의 유효 용량이 감소될 수 있게 하는 시너지 효과를 생성한다. 다른 경우에, 그러한 추가적인 치료법 및 생물막 감소제 또는 방법의 조합은 치료가 향상되게 하는 시너지 효과를 생성한다. 치료의 향상은 감염을 치료하기 위해 필요한 시간의 더 짧은 양에 의해 증명될 수 있다.

추가적인 치료적 치료는 생물막을 감소시키기 위해 사용된 방법 또는 조성물 전에, 동시에 또는 후속하여 첨가될 수 있고, 동일한 제제 내에 또는 별도의 제제로서 함유될 수 있다.

키트

본원에 기술된 시험관내 및 생체내 방법을 수행하기 위해 필요한 작용제 및 설명서를 함유한 키트가 또한 청구된다. 따라서, 개시는 본 개시의 생물학적 작용제뿐만 아니라 조직을 수집하고 및/또는 스크리닝 및/또는 결과의 분석을 수행하며 및/또는 본원에 규정된 유효량의 생물학적 작용제의 투여와 같은 본 개시의 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함할 수 있는 이들 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 이것들은 단독으로 또는 다른 적합한 항미생물제와 조합하여 사용될 수 있다.

한 구체예에서, 본 개시는 본원에 기술된 폴리펩타이드 및 생물막을 분해하거나 또는 생물막을 생성하는 미생물 감염을 억제, 방지 또는 치료하는 데 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 한 구체예에서, 키트는 보조제, 항원성 펩타이드 또는 항미생물제 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 키트는 액체 담체, 제약학적으로 허용되는 담체, 고체상 담체, 제약학적으로 허용되는 담체, 임플란트, 스텐트, 페이스트, 젤, 치과용 임플란트 또는 의료용 임플란트의 군으로부터 선택된 담체를 추가로 포함한다.

다음의 실시예는 개시를 제한하는 것이 아니라 예시하기 위해 의도된다.

박테리아 생물막-매개 감염은 모든 만성/재발성 인간 감염의 약 80%를 나타낸다. 생물막은 미생물 성장의 보호된 방식을 구성한다. 즉, 그것은 표면에 부착되고 그것들의 자체 합성의 수화된 중합체 기질에 내장된 미생물 군집으로 구성된다. 이들 고착성 군집의 형성은 적대적인 환경에서 박테리아가 생존 할 수 있게 하여, 항미생물제 및 숙주 방어를 포함한 종래의 치료 방식에 본질적으로 내성이 되게 한다. 생물막 관련 감염은 매우 만연되어 있고 원인이 되는 사망률 및 경제적 부담의 관점에서 악명 높은 결과와 관련이 있으므로, 새로운 치료 접근법의 필요성이 긴급하다. 이런 견지에서, 본 출원인은 다루기 어려운 박테리아 생물막-매개 감염의 치료를 위한 새로운 면역치료 접근법을 개발하였다. 이런 새로운 접근법은 생물막 세포외 기질에서 일어나는 핵단백질 상호작용을 토대로 한다. 생물막 세포외 기질은 단백질, 지질, 다당류 및 세포외 DNA (eDNA)의 가변적인 혼합물로 구성되는 것으로 알려져 있다. 박테리아 생물막 구조적 통합성에 중요한 세포외 기질의 핵심 구성요소는 eDNA 및 단백질의 박테리아 DNABII 패밀리 (IHF 및 HU)이다. DNABII 단백질은 구부리기 전 DNA에 대한 높은 친화도로 이중 가닥 DNS (dsDNA)에 결합하여 그것을 구부린다 (도 1). 생체내에서, eDNA의 교차 가닥의 정점에 위치한 DNABII 단백질에 의해 안정화되는 형성된 생물막에 인터레이스된 eDNA 가닥의 거대한 네트워크가 있는 것으로 나타났다. 본 출원인은 여기서 하나 이상의 HMG-박스 도메인(들)을 가지는 진핵 기원의 폴리펩타이드, 예컨대 HMGB1이 생물막 내부에서 세포외 DNA 스캐폴드의 구조를 간섭할 수 있음을 개시한다. 생물막에서 DNA 스캐폴드에 결합하는 미생물 단백질과의 경합에 의해, 이들 폴리펩타이드는 생물막을 탈안정화시키고, 이것은 숙주 면역 체계에 의한 생물막의 파괴 및 제거로 이어진다 (도 2).

이런 새로운 치료 접근법은 이것이 HMGB1 및 그것의 변이체가 그것들의 항-생물막 치료 잠재력에 대해 테스트된 첫 번째이기 때문에 혁신적이다. 또한, 상이한 항-생물막 및 항염증 특성을 내포한 HMGB1 도메인 및 돌연변이 변이체, A 박스, B 박스, C 꼬리, 및 A+B 박스 (도 3)가 최상의 항-생물막, 더 적은 항염증 활성, 및 최소 단백질 단편 크기를 가진 최적의 단백질 단편을 결정하기 위해 테스트되었다. 이런 견지에서, 이 단백질 단편은 과도한 염증의 결과 없이 박테리아 생물막 질환을 치료할 수 있을 것이다. 더불어, 생물막으로부터의 박테리아의 방출이 이들 박테리아를 항생물질-매개 사멸에 대해 더 민감하게 만들기 때문에, 이것은 HMGB1 치료가 잠재적으로 항생물질과 같은 종래의 치료와 함께 사용될 수 있어서 항-생물막 효능을 증가시키고 항미생물 내성의 발생을 감소시킬 수 있음을 나타낼 것이다.

시험관내 생물막 검정은 확립된 박테리아 생물막에 대한 HMGB1 및 그것의 변이체의 영향을 테스트하기 위해 사용되었다. 본 출원인은 (대장균에서) 인간 재조합 전장 HMGB1 (rHMGB1; 1-215), C45S 돌연변이된 변이체 (mHMGB1) 및 HMGB1 도메인 A 박스 (1-89), A+B 박스 (1-176), B 박스 (80-179), 및 B 박스 C106S (mB 박스)를 발현시켰고, >95%로 정제하였다 (도 3). 모든 전장 및 HMGB1 변이체는 DNA 결합 활성을 보유하였고, 이것은 이들 도메인이 적절하게 접혀지고 기능적인 것을 나타냈다 (도 4). HMGB1 및 그것의 변이체뿐만 아니라 상업적으로 이용 가능한 소 HMGB1 (대조군으로서 사용됨)이 확립된 박테리아 생물막에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 각각의 단백질이 사전 형성된 클레브시엘라 뉴모니아 생물막에 24시간 성장 후 첨가되었다 (200 nM에서). 16시간 동안 인큐베이션 (총 40시간의 생물막 성장)한 후, 생물막은 LIVE/DEAD®로 염색되고 공초점 레이저 주사 현미경 (CLSM) 및 COMSTAT 분석을 사용하여 분석되어 생물막의 평균 두께 및 총 바이오매스가 계산되었다. 전장 재조합 HMGB1은 확립된 클레브시엘라 뉴모니아 생물막을 유의하게 파괴할 수 있었을뿐만 아니라 B 박스 도메인을 함유한 HMGB1 형태를 전부 절단하였다 (도 5). 이 연구의 결과는 단일 용량의 이들 비-항미생물 화합물이 다루기 어려운 생물막을 파괴할 수 있었다는 가치있는 관찰로 이어졌다. 더불어, HMGB1 변이체는 요로병원성 대장균, 버크홀데리아 세노세파시아, 비피막형 헤모필루스 인플루엔자를 포함한, 지금까지 테스트된 모든 박테리아 종을 파괴하였다 (도 6). 박테리아를 그것들의 보호막으로부터 방출시키는 이 농도에서의 단일 용량은 항생물질 및 면역 체계에 의한 정화에 박테리아를 취약하게 만든다.

생물막 관련 감염의 치료를 위해 HMGB1 단백질 및 그것의 변이체와 같은 비-항미생물제를 사용하는 본 출원인의 신규한 접근법은 고전적 치료 개념으로부터 급진적인 이탈을 전형적으로 보여준다. 시험관내에서 발견된 가장 큰 파괴 활성을 가진 지금까지 테스트된 전장 HMGB1 및 최소 변이체, 위치 106에 있는 시스테인이 세린으로 돌연변이되어 그것의 염증 유도 활성이 없어진 B 박스 및 변형된 B 박스 (mB 박스)가 생체내에서 생물막 파괴 및 염증 활성에 대해 테스트되었다 (도 7). 응집체 생물막 감염 폐 모델을 이용하여, 출원인은 HMGB1, B 박스 및 각각의 변형된 버전이 생체내에서 생물막 형성을 방지할 수 있었고 변형된 단백질은 염증 반응을 유도하지 않았음을 보여준다 (도 7B 및 도 7C). 추가로 출원인은 HMGB1 변이체 중 어떤 것도 생물막을 파괴할 수 있는 주어진 용량에서 패혈증을 유도하지 않았음을 입증하였다 (도 7D).

방법

실험 번호 1

병원내 감염의 흔한 원인인 클레브시엘라 뉴모니아　(KP)를 모든 BB 파괴 검정에 사용하였다. 인간 재조합 전장 HMGB1 (rHMGB1; 1-215), C45S 돌연변이 변이체 (mHMGB1) 및 HMGB1 도메인 A 박스 (1-89), B 박스 (90-176), AB 박스 (1-176), B-링커 박스 (80-179), 및 B-링커 박스 C106S를 발현시켰고 (대장균에서) >95%로 정제하였다. 확립된 BB에 미치는 rHMGB1 및 다양한 도메인의 영향을 평가하기 위하여, 각각의 단백질 종 (200 nM)을 24시간 째의 사전 형성된 BB에 첨가하였다. 40시간 째에 BB를 세척하였고, LIVE/DEAD®로 염색하였고, 공초점 레이저 주사 현미경을 통해 시각화하였고 이미지가 COMSTAT에 의해 분석되어 평균 두께 및 바이오매스가 계산하였다.

A 박스를 제외한 외인성 rHMGB1 및 그것의 개별 도메인을 미처리 KP 생물막과 비교하여 KP 생물막의 평균 두께 (AT) 및 바이오매스 (BM)에서 유의한 감소 (p<0.05)를 유발하였다 (각각 rHMGB1, mHMGB1, B-박스, B-링커 박스, AB 박스, 및 B-링커 박스 C106S에 의해 유도된 AT의 % 감소 평균 ± SE: 44%±0.33, 75%±0.04, 63%±0.1, 77%±0.03, 64%±0.08, 54%±0.15 및 BM의 % 감소 평균 ± SE: 61%± 0.01, 80%± 0.01, 68%± 0.02, 67%± 0.01, 73%± 0.02, 56%±0.02).

실험 번호 2

HMGB1은 병원성 생물막을 파괴한다: 박테리아 생물막에 미치는 HMGB1의 영향을 테스트하기 위하여 (도 5), 출원인은 태그없는 인간 재조합 HMGB1 (rHMGB1) 및 HMGB1의 환원 형태를 모방하는 조작된 C45S 변이체 (mHMGB1)를 클로닝하고 (IMPACT®, NEB Ipswich, MA), 발현시키고 (대장균에서), 정제하였다 (헤파린 세파로스 크로마토그래피로 >95% 순도). rHMGB1은 C23과 C45 사이에서 쉽게 분자간 이황화 결합을 형성하여 전염증 활성에 기여하는 반면 mHMGB1은 그렇지 못하다. 이들 HMGB1 동형을 확립된 생물막 (첨가하기 24시간 전에 형성됨)을 파괴하는 능력에 대해 평가하였다. 단일 용량의 rHMGB1 (200 nM; 전형적인 패혈증 혈청 농도보다 약 25배 더 크지만, 직접적으로 패혈증을 유도할 수 없음)에 16시간 노출한 후, 광범위한 우선순위 종에 의해 형성된 생물막을 LIVE/DEAD®로 염색하고, 공초점 레이저 주사 현미경 (CLSM) 및 COMSTAT 분석을 사용하여 분석하고 대조군 생물막과 비교하였다. 출원인은 각 생물막의 평균 두께 및 바이오매스 (제시되지 않음)에서 유의한 감소 (P<0.05)를 관찰하였다 (도 5A). 단지 엔테로코커스 패시움 및 스타필로코커스 아우레우스만이 유사한 결과를 이루기 위하여 더 높은 (비록 비-박테리아성이었지만) 농도를 필요로 하였다. 또한 소 흉선으로부터 정제된 천연 HMGB1 (nHMGB1; Chondrex, Inc, Redmond, WA)이 rHMGB1과 비교하여 선택된 생물막을 동등하게 파괴한 것으로 나타났고 (도 5A), 이것은 nHMGB1과 rHMGB1 사이의 번역후 변형 (PTM)의 임의의 잠재적인 차이가 이런 항-생물막 기능에 유의하게 영향을 미치지 못하였음을 나타냈다. LC-MS/ MS 분석 (MS Bioworks, LLC Ann Arbor, MI)에 의한 PTM의 예비 분석은 rHMGB1 및 nHMGB1 둘 다의 최소 변형을 나타냈다 (관찰된 펩타이드의 <20%가 임의의 주어진 PTM을 나타냄, 도 1C). 점진적으로 더 높은 농도의 rHMGB1 (최대 400 nM)은 단층까지 용량 의존 방식으로 UPEC 생물막을 파괴하였고 (~1 μm 평균 두께; 도 5B), 즉, 3D 생물막 구조가 완전히 제거되었고, 이것은 숙주 면역 이펙터 또는 다른 항미생물 화합물이 근절을 완성할 수 있도록 사람이 생물부담을 감소시킬 수 있음을 암시한다. 그러므로, 병원체 간에 민감성의 고유한 차이가 있지만, 테스트된 고우선 순위 병원체 전부에 의해 형성된 생물막은 단일 용량의 이들 비-항미생물 화합물에 대해 민감하였다.

실험 번호 3

HMGB1 도메인 구조 및 생물막 방지 활성: 출원인은 다음으로 1) A 박스, 자체-함유 DNA-결합 도메인 (잔기 1-89); 2) A-B 박스 구성물 (C 꼬리 결핍; 잔기 1-185); 및 3) B 박스 (잔기 80 내지 176)의 재조합 HMGB1 절단 변이체를 생성하였다 (도 1A 및 1C). 확립된 생물막 (UPEC, Bc, NTHI, 및 클레브시엘라 뉴모니아)에의 A 박스의 첨가는 측정된 생물막 파라미터에 유의한 영향을 나타내지 않았다 (도 5C). 이에 반해, A-B 박스 및 97 아미노산 (AA) B 박스는 전체 생물막 방지 활성을 보유하였다 (도 5C). B 박스만이 DNA 굽힘을 조절할 수 있기 때문에, 이론에 얽매이지 않기를 바라지만, HMGB1은 DNA-결합/굽힘을 통해 적어도 부분적으로 생물막을 파괴한다고 가설을 세웠다. B 박스는 주로 잔기 C106에 의존적인 TLR4-MD2와의 상호작용을 통해 매개된 전염증 활성을 함유하는 것으로 보고되기 때문에, 출원인은 C106S 돌연변이를 가진 B 박스 변이체 (mB 박스)를 생성하였다 (도 1A 및 1C). mB 박스 변이체는 B 박스와 비교하여 시험관내에서 박테리아 생물막을 동등하게 파괴하였다 (UPEC, NTHI, Bc, K. pneumoniae)(도 5C).

실험 번호 4

rHMGB1 및 mHMGB1은 2개의 구별되는 동물 모델에서 생물막을 파괴하지만 염증 반응은 Cys의 Ser 돌연변이로 강력하게 감쇠한다: 출원인은 rHMGB1 및 mHMGB1 둘 다를, 부착된 점막 생물막 형성이 발병에 핵심 역할을 하는 NTHI49,67,68로 인한 실험 OM의 잘 확립된 친칠라 모델을 사용하여 중이 감염 및 상응하는 염증 반응을 치료하는 능력에 대해 테스트하였다 (도 8A). 혼합된 성별의, 이종교배된 성인 친칠라의 중이를 경소낭 주사(transbullar injection)에 의해 1000 CFU NTHI로 접종하였다. 중이 공간에 풍부한 생물막이 존재하는 시간인 도전 후 제4 및 제5일에, 5 μg (0.2 nmol)의 rHMGB1, mHMGB1, 또는 희석물을 중이에 직접 전달하였다 (총 2회 치료). 제6일에, 동물을 희생시키고 중이를 시각화하고 유지된 생물막 (도 8A) 및 점막 염증 (도 8B)에 대해 맹검으로 채점하였다. 희석물로 치료된 동물은 뼈 중격을 마스킹한 두꺼운 점막 생물막을 가졌다 (도 8C 및 8D). 완전히 대조적으로, 잔류하는 점막 생물막은 rHMGB1 또는 mHMGB1로 치료된 동물에서 극적으로 감소하였는데, CFU에 약 1000배의 감소가 있었다 (도 8E). 이들 결과는 시험관내에서 NTHI에 의해 형성된 생물막이 테스트된 다른 박테리아 종과 같이 HMGB1 첨가에 대해 반응하지 않았기 때문에 특히 가치있다 (도 5). rHMGB1-치료된 동물로부터 수집된 중이 유체 (MEF)는 mHMGB1 및 희석물 둘 다로 치료된 동물 (데이터 미제시)에 비교하여 증가된 전염증 사이토카인을 가졌고 [IL-1β (3배), IL-17A (2배)], 이것은 rHMGB1과 일치하게 중이 점막의 시각적 염증을 향상시켰다 (도 8C 및 8F). 대조적으로, mHMGB1-치료된 동물로부터의 MEF는 증가된 항염증 사이토카인을 가졌고 [IL-4 (2배), IL-10 (5배)] (데이터 미제시), 이것은 감소된 점막 염증과 상응한다 (도 8C 및 8F). 그러므로, mHMGB1은 생체내에서 NTHI 생물막의 제거를 효율적으로 용이하게 하였고 전염증 신호를 촉발시키지 않으면서 그렇게 하였다. 다음으로, 출원인은 rHMGB1 또는 mHMGB1이 생물막 발생을 방지 또는 응집시킬 수 있는지를 측정하였다. 방지의 경우, 성인 C57BL/6 마우스가 10⁷ CFU의 Bc로 기관내로 (i.t.) 도전하였고, 0.2 nmol의 rHMGB1 또는 mHMGB1이 동시에 첨가하였다. 18시간 후, 마우스를 안락사하였고, 기관지폐포 세척물 (BAL) 및 폐를 수집하였다. Bc는 Bc 항체로 프로빙된 폐 단면에서 쉽게 볼 수 있는 응집체를 형성하였다 (도 7A). 조직을 균등화하였고 CFI를 계수하였다. rHMGB1 또는 mHMGB1이 투여된 마우스는 대조군 마우스와 비교하여 BAL에서 (도 7B) 및 폐 조직에서 (데이터 미제시) 상당히 더 적은 Bc를 함유하였고 ( P<0.05), 이것은 HMGB1이 쥐과 기도에서 생물막 형성을 억제하였고 이 과정은 박테리아 제거를 용이하게 하였음을 시사하였다. B 박스 및 mB 박스 유도체로의 치료의 예비 결과는 이들 97 AA 폴리펩타이드가 생체내에서 생물막 발생을 억제하고 (BAL에서 감소된 CFU, 도 7B) C106S 돌연변이가 전염증 활성을 없애서 B 박스와 비교하여 2배 감소된 것 (도 7C)을 나타냈다. 다음에 이것과 동일한 동물 모델을 사용하여 Bc로의 도전 및 rHMGB1 또는 mHMGB1의 투여 후 72시간 후의 폐 손상을 조사하였다. 폐를 수집하였고 조직을 파라핀에 고정하고, 내장하였고, 섹션화하고, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색하였다. mHMGB1로 치료된 마우스로부터의 폐는 미감염 마우스 폐를 밀접하게 닮았던 반면, rHMGB1-치료된 마우스에서는 중증의 염증 및 증가된 호중구 반응이 발생하였고 (도 7D), 이것은 mHMGB1이 rHMGB1의 전염증 활성 없이 항-생물막 활성을 보유하였음을 나타낸다. 다음에, 출원인은 확립된 Bc 감염을 치료하는 rHMGB1 및 mHMGB1의 능력을 평가하였다. 마우스는 상기와 같이 도전되었고 0.2 nmol의 rHMGB1 또는 mHMGB1을 24시간 후에 투여하였다. 치료 후 48시간 후에, 마우스를 안락사하였고 BAL 및 폐를 수집하고 상기와 같이 처리하였다. rHMGB1 또는 mHMGB1로 치료된 마우스는 그들의 폐에 유의하게 더 적은 Bc를 가진 한편 (도 7E), mHMGB1 치료는 폐에 대해 더 적은 호중구 및 염증성 단핵세포 충원을 유도하였다 (P<0.05, 데이터 미제시). 종합적으로, 이들 데이터는 mHMGB1 및 mB 박스가 염증 반응을 향상시키지 않았고, 오히려 응집성 생물막 형성, 박테리아 흡수, 및 제거를 억제했음을 보여준다. mHMGB1의 감소된 전염증 활성을 추가로 확인하기 위하여, 출원인은 호중구를 충원하는 상대적 능력을 측정하기 위해 화학주성의 생체내 모델을 사용하였다70,71. C57BL/6 마우스가 0.2 nmol의 mHMGB1 또는 rHMGB1 중 어느 하나로 또는 1 ml의 4% 티오글리콜레이트 (양성 대조군; 호중구 충원의 유도제)로 복강내로 (i.p.) 주사하였다. 4시간 후, 마우스를 안락사하였고 복강 세척을 수행하였다. 세포를 항-CD45, 항-CD11b, 및 항-Ly6G 항체로 염색하였고, 총 호중구를 형광-활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 정량화하였다. rHMGB1은 복강에 대해 호중구 충원을 유도한 반면, mHMGB1은 그렇지 않았다 (도 7F).

실험 번호: 5

HMGB1 변이체는 생물막 질환을 치료하기 위해 필요한 용량에서 패혈증을 유도하지 않는다: Cys에서 Ser로의 돌연변이를 가진 HMGB1 변이체 (mHMGB1, mB 박스)가 HMGB1 및 B 박스의 단일 용량으로 전염증 후유증을 유도하지 않았지만, 여전히 강력한 생물막 방지 활성을 보였다는 사실에도 불구하고, 출원인은 그럼에도 본 발명자들의 HMGB1 변이체의 투여가 LPS의 존재 또는 부재 하에 패혈증을 유도할 수 있을수 있는지를 엄격하게 조사하였다. 출원인은 나이브 마우스 또는 비-치사 용량의 LPS (5 mg/kg) i.p.로 프라이밍된 마우스에게 0.2 nmol (생체내 생물막의 치료에 치료적 이익을 나타낸 것과 동일한 양)의 내독소-없는 rHMGB1, B 박스, 또는 mB 박스 [고용량 내독소 제거 수지 (Pierce, Inc)로 정제되고 내독소 정량화 (Genscript)에 의해 <300 ng의 내독소/μg 단백질을 함유하는 것으로 확인됨]를 주사하였다. 마우스를 24시간 동안 패혈증의 신호에 대해 모니터링한 후, 혈청 TNF-알파 (TNF-α) 수준을 ELISA에 의해 패혈증 유도에 대한 대리물로서 측정하였다. 마우스는 연구 종료점 전에 안락사를 필요로 하는 패혈증의 신호를 나타내지 않았다. LPS 단독은 100 pg/ml을 넘는 TNF를 유도한 한편, rHMGB1, B 박스, 또는 mB 박스는 어느 것도 그 자신에게서 검출 가능한 TNF를 유도하지 않았고, LPS-프라이밍된 마우스와 비교했을 때 어느 것도 추가적인 전염증 신호전달을 유도하지 않았다 (도 7G). 본 발명자들의 용량과 비교하여, 리포다당 (LPS)-프라이밍된 마우스20로 40시간째에 B 박스 단독의 경우 >450배, 또는 rHMGB1의 4 용량의 2배 더 큰 양이 패혈증을 유도하기 위해 필요한 것으로 보고하였다. 더불어, 이들 내독소-없는 폴리펩타이드가 상기 기술된 것과 같이 시험관내에서 생물막 방지 활성에 대해 테스트하였고 UPEC 및 Bc 생물막에 대해 전체 기능을 유지하는 것으로 나타났다 (데이터 미제시). 그러므로, 여기서 테스트된 변이체는 강력한 치료 용량에서 패혈증을 유도하지 않는다.

실험 번호 6

HMGB1에 의한 생물막 파괴는 방출된 박테리아를 항생물질에 민감하게 한다: 200 nM의 HMGB1, 1 μg/ml의 미노싸이클린, 또는 둘 다가 상기와 같이 Bc 생물막에 첨가하였다. LIVE/DEAD® 염색의 사용은 상조적 박테리아 사멸을 나타냈고 (도 9), 그것은 HMGB1 치료가 항미생물 효능을 증가시키고 항미생물 내성의 발생을 감소시키는 두 가지 작용을 하는 병용 요법에 사용될 수 있음을 나타낸다.

실험 번호 7

HMGB1 및 DNABII 단백질(들)은 생체내에서 형성된 생물막 내에 존재한다: 출원인은 앞서 OM의 실험 모델에서 NTHI에 의해 형성된 생물막에서, 박테리아 DNABII 단백질이 eDNA의 교차된 가닥의 정점에 위치한 것을 입증하였다. 생체내에서 형성된 NTHI 생물막 내에서 HMGB1의 상대적인 존재 및 공간적 파괴를 측정하기 위하여, 친칠라 중이로부터 회수된 비고정 생물막이 HMGB1뿐만 아니라 DNABII 항체 둘 다로 프로빙하였다. eDNA를 DAPI로 염색하였다 (백색). HMGB1은 dsDNA 가닥의 길이를 따라 및 eDNA의 교차된 가닥에서 (예상대로) 검출된 표지된 DNAII 단백질과 공동 국지화되지는 않았지만 매우 가깝게 뚜렷하게 주기적으로 표지되었다 (도 10A). 특히, HMGB1은 정점에서 관찰되지 않았다. 이들 데이터는 HMGB1이 EPS 내에 통합될 수 있지만 동시에 DNABII 단백질과 동일한 eDNA 부위 (정점)을 공동으로 차지하지 않는 것을 시사하며, 이것은 HMGB1이 EPS를 탈안정화하기 위하여 eDNA 정점에서 DNABII 단백질과 경합한다는 가설을 지지한다. 이들 데이터는 또한 DNABII 및 HMGB1 단백질이 그것들이 공동 국지화하지 않기 때문에 생산적으로 상호작용하지 않는 것을 시사하고, 추가로 HMGB1이 마찬가지로 DNA-결합/굽힘을 통해 단독으로 기능하는 것을 보여준다.

실험 번호 8

HMGB1은 임상 시편에 존재하는 생물막을 파괴한다: 만성 질환 부위 (예컨대 CF 폐)에서의 생물막은 다중 패혈증으로 이루어지며 본질상 근절하기 어렵다. 항-DNABII 항체는 CF 가래에 존재하는 생물막을 파괴하는 것으로 나타났다. 1 M B 박스를 함유하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션된 PBS 중의 CF 가래의 현탁액은 효과적으로 그리고 고농도의 Pulmozyme® (CF 환자에서 점액용해제로서 사용된 치료용 DNase) 또는 항-DNABII (도 10B)를 첨가한 것과 동일한 정도로 가래를 파괴하였다. 이들 데이터는 만성 감염 부위에서 형성된 생물막이 HMGB1에 민감한 보존된 eDNA-의존성 아키텍처를 가지는 것을 나타내며 생물막에 대한 숙주 방어로서 HMGB1을 검증한다.

실험 번호 9

많은 구강 박테리아 (예컨대, 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스, 포르피로모나스 긴기발리스)는 치조골과 치은을 차괴하는 치주염 및 임플란트 주위염과 같은 염증성 질환의 발병에 연루되어 있다. 이들 박테리아의 발병의 조사는 효과적인 동물 모델의 결핍에 의해 방해를 받는다. 특정 박테리아의 병원성을 조사하는 것에 대한 문제 중 하나는 외인성 박테리아가 동물에 구강에 도입될 때 생물막을 확립하는 어려움이다. 치주염의 동물 모델이 개발되었지만, 접종된 동물의 구강으로부터 회수된 배양할 수 있는 박테리아는 드물다. 특정 박테리아의 병원성을 평가할 수 있는 효과적인 동물 모델을 개발하는 것이 그것의 병원성 메커니즘을 유도하는 데 크게 도움이 될 것이다. 이 실시예는 개시된 폴리펩타이드 및 조성물 및 구강 질환을 치료하는 데 있어 그것의 에페키니스(effechinis)를 테스트하기 위한 모델을 제공한다.

가공된 티타늄 치과 임클란트 (1.2 x 4.5mm) 의 표면을 AlO3 (100 μm) 및 HCl 에칭 (pH 7.8, 20분 동안 80℃에서)으로의 그릿 블라스팅(grit blasting)에 의해 변형한다. 가공되고 나노-텍스춰의 임플란트를 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스 (Aa)의 D7S 임상 균주로 접종된 TSB 배지에서 1 내지 3일 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 임플란트 상의 박테리아 생물막을 SEM에 의해, 또한 LIVE/DEAD® BacLight^TM로의 염색 후에 공초점 레이저 주사 현미경에 의해 분석한다. 확립된 Aa 생물막이 있거나 없는 임플란트를 암컷 래트의 상악의 소구치와 앞니 사이의 치조골안에 점막을 가로질러 배치한다. 생체내에 배치된 임플란트 상의 Aa 생물막의 존재를 검출하기 위하여, 박테리아 샘플을 2일 후에 타액 및 임플란트의 구강 표면으로부터 수집한다. Aa는 배양에 의해, 뿐만 아니라 PCR 분석에 의해 검출할 수 있다. 임플란트 주위 뼈 및 점막 조직의 마이크로-CT 및 조직학적 분석을 이식 후 62N 후에 수행할 수 있다. 본원에 기술된 것과 같이 표면 및 생물막에 부착된 폴리펩타이드 및 조성물 및 박테리아 성장을 검정한다.

실험 번호 10

이 실험은 라임병을 치료하기 위한 간섭제의 전임상 테스트를 위한 마우스 모델을 제공한다. Dresser et al. Pathogens 5(12)e1000680, Epub 2009 Dec. 4 참조. 라임병은 미국에서 가장 흔한 진드기-맥 질환이다. 정의에 의하면, 인구가 도시에서 교외 및 농촌 지역으로 계속 이동하고 흰 꼬리 사슴 (진드기 종 익소데스(Ixodes)를 운반함)이 점점 이 지역을 배회함에 따라 이러한 고유 지역이 확대되고 있다. 라임병은 미생물 보렐리아 부르그도르페리, 스피로헤타(spirochete)에 의해 유발된다. 보렐리아 부르그도르페리는 익소데스 진드기에 의한 물림을 통해 전파되고 계속해서 혈류를 통해 다른 조직 및 장기로 전파된다.

이 동물 모델에서, C3H/HeN 마우스를 복부 피하 및 복강내 주사를 통해, 또는 정맥내 주사를 통해 스피로헤타로 주사한다. 미생물 부담의 평가 및 조직 및 장기에서 병리의 평가를 위해 감염 후 대략 7일 후에 혈액 및 생검 시편을 회수한다. 본 발명의 방법 및 조성물은 도전에 후속하여 형성되고 발병 및 만성 성질의 질환 둘 다에 기여하는 것으로 여겨지는, 결과적으로 형성된 보렐리아 부르그도르페리 생물막의 감소 및/또는 제거를 위한 치료제뿐만 아니라 예방 전략 둘 다를 개발하기 위해 고려된다.

실험 번호 11

이 실험은 낭포성 섬유증을 치료하기 위한 데스도네스 폴리펩타이드 및 조성물의 전임상 테스트를 위한 돼지 모델을 제공한다. Stoltz et al. (2010) Science Translational Medicine 2(29): 29ra31 참조. 낭포성 섬유증은 CF 경막 전도도 조절자 (CFTR로 불림)를 암호화하는 유전자의 돌연변이로 인한 상염색체 열성 질환이다. 이 모델에서, "CFTR"로 불리는 유전자에 결함을 포함하도록 특별하게 교배되었고 CF 돼지로 불리는 돼지는 자발적으로 다중 박테리아성 패혈증에 의해 하부 기도의 감염을 포함하는 CF 폐 질환의 특징적인 특징을 나타낸다. 돼지는 질환 및 관련된 병리의 신호의 개선을 평가하기 위하여 흡입에 의해 이들 동물의 폐에 폴리펩타이드를 전달하기 위한 조성물로 투여될 수 있다.

실험 번호 12

출원인은 또한 결핵 (TB)에 대한 전임상 모델을 제공한다. Ordway et al. (2010) Anti. Agents and Chemotherapy 54:1820 참조. 이 동물 모델에서, SPF 기니아 피그를 장벽이 있는 거주지에서 유지시키고 약 20 cfu의 미코박테리움 투베르쿨로시스 균주 Erdman K01 바실러스를 기니아 피그의 폐에 전달하기 위해 에어로졸 스프레이를 통해 감염시킨다. 동물을 박테리아 로드의 측정 및 조직병리학적 평가를 위한 조직의 회수로 도전 후 제25, 50, 75, 100, 125 및 150일에 희생시킨다. 고전적인 TB 신호를 나타내지 않은 마우스와 달리, 이 방식으로 도전받은 기니아 피그는 인간 질환의 특징인, 중심에 괴사가 있는, 잘 조직화된 과립종을 발생시킨다. 추가로, 인간과 같이, 기니아 피그는 일차 병변 복합체의 일부로서 배출 림프절의 중증의 화농성 및 괴사성 림프절염을 발생시킨다. 이 모델의 사용은 도전에 이어 이들 동물의 폐에서 형성되는 것으로 관찰되었고 질환의 병인 및 만성 둘 다에 기여하는 것으로 여겨지는, 결과적으로 형성된 미코박테리움 투베르쿨로시스 생물막의 감소 및/또는 제거를 위한 치료제뿐만 아니라 예방 전략을 확인 및 식별하기 위한 전임상 스크린을 제공할 것이다.

실험 번호 13

카테터/내재 장치 생물막 감염의 다중 동물 모델은 알려져 있다. Otto (2009) Nature Reviews Microbiology, 7:555 참조. 전형적으로 정상적인 피부 식물총으로 간주된 한편으로, 미생물 스타필로코커스 에피더미디스는 병원내 감염의 원인이 되는 요인들 중에서도 첫 번째로 손꼽히는, 많은 사람들이 핵심 기회성 병원체로서 간주한 것이 되었다. 주로, 이 박테리아는 장치의 삽입 중에 이런 일반적인 피부 콜로나이저(skin colonizer)에 의해 오염되는 내재 의료기 상에 발생하는 대부분의 감염의 원인이 된다. 전형적으로 생명을 위협하지는 않지만, 이들 생물막 감염의 처리와 관련된 어려움은 그것의 빈도와 조합되어, 그것을 심각한 공중 보건 부담이 되게 한다. 토끼, 마우스, 기니아 피그 및 래트를 포함하여, 카테터-관련된 스타필로코커스 에피더미디스 감염의 여러 동물 모델이 있고, 이들은 전부 발명의 분자 메커니즘을 연구하기 위해 사용되며 예방 및/또는 치료의 연구에 적합하다. 래트 경정맥 카테터는 엔테로코커스 파에칼리스, 스타필로코커스 아우레우스 및 스타필로코커스 에피더미디스 생물막 형성을 간섭하는 치료제를 평가하기 위해 사용되어 왔다. 생물막 감소는 자주 세 가지 방법으로 측정된다 - (i) 카테터를 초음파처리하고 CFU를 계산하거나, (ii) 카테터의 슬라이스를 자르거나 단순히 플레이트 상에 놓고 채점하거나, 또는 (iii) 생물막을 결정 바이올렛 또는 또 다른 염료로 염색하고, 용출하고, OD를 CFU에 대한 근사값으로서 측정한다.

결론

전장 재조합 HMGB1은 확립된 생물막을 유의하게 파괴할 수 있었을뿐만 아니라 B 박스 도메인을 함유한 HMGB1 형태를 절단할 수 있었다.

동등물

다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어들은 본 기술이 속하는 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본원에서 예시적으로 기술된 본 기술은 본원에서 명시적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에서도 적합하게 실시될 수 있다. 그러므로, 예를 들어, 용어 "포함하는", "함유하는" 등은 광범위하게 그리고 제한 없이 판독되어야 한다. 추가적으로, 본원에서 사용된 용어 및 표현은 기술의 용어로서 제한 없이 사용되었고, 그러한 용어 및 표현의 사용에서 제시되고 기술된 특징의 임의의 동등물 및 그것의 일부분을 배제하려는 의도가 없지만, 다양한 변형이 청구된 본 기술의 범주 내에서 가능한 것이 인식된다.

그러므로, 본원에 제공된 물질, 방법, 및 예는 바람직한 측면을 나타내는 것이고, 예시적인 것이며, 본 기술의 범주에 대한 제한으로서 의도되지 않은 것이 이해되어야 한다.

본 기술은 본원에서 광범위하고 일반적으로 기술되었다. 일반적인 개시 내에 속하는 보다 좁은 종 및 하위 일반 그룹의 각각은 또한 본 기술의 일부를 형성한다. 이것은 절제된 물질이 본원에서 구체적으로 언급되는지의 여부와 관계없이, 속으로부터의 임의의 주제를 제거하는 단서 또는 부정적 제한과 함께 본 기술의 일반적인 설명을 포함한다.

더불어, 본 기술의 특징 또는 측면이 Markush 기의 관점에서 기술되는 경우에, 기술분야에 숙련된 사람들은 본 기술이 또한 Markush 기의 임의의 개별적인 구성원 또는 구성원의 하위그룹의 관점에서 기술되는 것을 인지할 것이다.

본원에서 언급된 모든 출판물, 특허 출원, 특허, 및 기타 참고문헌은 그것의 전문이, 각각이 개별적으로 참조로 포함되는 것과 같은 정도로 참조로 분명하게 포함된다. 충돌하는 경우에, 정의를 포함한, 본 명세서가 제어할 것이다.

다른 측면은 다음의 청구범위 내에서 제시된다.

서열 목록

SEQ ID NO: 1 및 2 - 야생형 HMGB1 (쥐과 및 인간)

1 MGKGDPKKPR RKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE FSKKCSERWK

TMSAKEKGKF

61 EDMAKADKAR YEREMKTYIP PKGETKKKFK DPNAPKRPPS AFFLFCSEYR

PKIKGEHPGL

121 SIGDVAKKLG EMWNNTAADD KQPYEKKAEK LKEKYEKDIA AYRAKGKPDA AKKGVV KAEK

181 SKKKKEEEEG EEDEEDEEEE EDEEDEDEEE DDDDE (쥐과)

1 mgkgdpkkpr gkmssyaffv qtcreehkkk hpdasvnfse fskkcserwk tmsakekgkf

61 edmakadkar yeremktyip pkgetkkkfk dpnapkrpps afflfcseyr pkikgehpgl

121 sigdvakklg emwnntaadd kqpyekkaak lkekyekdia ayrakgkpda akkgvvkaek

181 skkkkeeeed eedeedeeee edeededeee dddde

(인간, GenBank 등록 번호 CAE48262.1로부터 재생됨)

HMGB1은 3개의 도메인으로 구성된 215개 아미노산 단백질 (대략 30 Kda)의 작은 단백질이다: 2개의 양전하의 도메인인 A 및 B 박스는 각각 80개 아미노산으로 구성되며 하나의 음전하의 카르보실 말단인 산성 C 꼬리는 대략 30개의 연속적인 아스파테이트 및 글루타민 잔기로 구성된다.

진한 아미노산 (아미노산 1-70)은 A 박스 도메인을 나타낸다.

이탤릭체의 아미노산 (약 아미노산 88-164)은 B 박스 도메인을 나타낸다.

밑줄친 아미노산 (아미노산 186-215)은 C-꼬리 도메인을 나타낸다.

HMGB1의 돌연변이 버전은 아미노산 치환을 포함하여 도 1 및 도 3에 도시된다.

SEQ ID NO: 3 및 4

야생형 쥐과 HMGB1 B 박스: MW=9735.2; 87 aa

KDPNAPKRPPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAEKLKEKYEKDIA

AYRAKGKPDAAKKGVV

야생형 인간 HMGB1 B 박스: 87 aa

KDPNAPKRPPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIA

AYRAKGKPDAAKKGVV

SEQ ID NO: 5 및 6

쥐과 돌연변이 HMGB1 B 박스: MW=9735.2; 87 aa

KDPNAPKRPPSAFFLFSSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAEKLKEKYEKDIA

AYRAKGKPDAAKKGVV

인간 돌연변이 HMGB1 B 박스: 87 aa

KDPNAPKRPPSAFFLFSSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIA

AYRAKGKPDAAKKGVV

시스테인 (C)은 세린 (S)으로 돌연변이되었다 (굵은 문자).

SEQ ID NO: 7 및 8

야생형 쥐과 HMGB1 A+B 박스: MW=20261.42; 176 aa

MGKGDPKKPRRKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARY

EREMKTYIPPKGETKKKFKDPNAPKRPPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQ

PYEKKAEKLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVV

야생형 인간 HMGB1 A+B 박스: 176 aa

MGKGDPKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARY

EREMKTYIPPKGETKKKFKDPNAPKRPPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQ

PYEKKAAKLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVV

시스테인 (C)은 세린 (S)으로 돌연변이되었다 (굵은 문자).

SEQ ID NO: 9 및 10

야생형 쥐과 HMGB1 B 박스 + N-링커 (밑줄): MW=10876.6; 97 aa

PPKGETKKKFKDPNAPKRPPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAEK

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야생형 인다 HMGB1 B 박스 + N-링커 (밑줄): 97 aa

PPKGETKKKFKDPNAPKRPPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAAK

LKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVV

SEQ ID NO: 11 및 12

돌연변이된 HMGB1 B 박스 + N-링커 (밑줄): MW=10876.6; 97 aa

PPKGETKKKFKDPNAPKRPPSAFFLFSSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAEK

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인간 HMGB1 B 박스 + N-링커 (밑줄): 97 aa

PPKGETKKKFKDPNAPKRPPSAFFLFSSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAAK

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SEQUENCE LISTING <110> RESEARCH INSTITUTE AT NATIONWIDE CHILDREN'S HOSPITAL <120> HMGB1 PROTEIN DERIVATIVES FOR THE REMOVAL OF BIOFILMS <130> 106887-7910 <140> PCT/US2019/054851 <141> 2019-10-04 <150> 62/742,102 <151> 2018-10-05 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 215 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 1 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Arg Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys 115 120 125 Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr 130 135 140 Glu Lys Lys Ala Glu Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 145 150 155 160 Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val 165 170 175 Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Gly Glu Glu 180 185 190 Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Asp Glu 195 200 205 Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu 210 215 <210> 2 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys 115 120 125 Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr 130 135 140 Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 145 150 155 160 Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val 165 170 175 Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu 180 185 190 Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Asp Glu 195 200 205 Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu 210 215 <210> 3 <211> 87 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 3 Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe 1 5 10 15 Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser 20 25 30 Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala 35 40 45 Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Glu Lys Leu Lys Glu 50 55 60 Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp 65 70 75 80 Ala Ala Lys Lys Gly Val Val 85 <210> 4 <211> 87 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe 1 5 10 15 Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser 20 25 30 Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala 35 40 45 Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu 50 55 60 Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp 65 70 75 80 Ala Ala Lys Lys Gly Val Val 85 <210> 5 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 5 Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe 1 5 10 15 Ser Ser Glu Tyr Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser 20 25 30 Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala 35 40 45 Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Glu Lys Leu Lys Glu 50 55 60 Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp 65 70 75 80 Ala Ala Lys Lys Gly Val Val 85 <210> 6 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 6 Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe 1 5 10 15 Ser Ser Glu Tyr Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser 20 25 30 Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala 35 40 45 Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu 50 55 60 Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp 65 70 75 80 Ala Ala Lys Lys Gly Val Val 85 <210> 7 <211> 176 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 7 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Arg Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys 115 120 125 Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr 130 135 140 Glu Lys Lys Ala Glu Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 145 150 155 160 Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val 165 170 175 <210> 8 <211> 176 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 8 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys 115 120 125 Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr 130 135 140 Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 145 150 155 160 Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val 165 170 175 <210> 9 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 9 Pro Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro 1 5 10 15 Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro 20 25 30 Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys 35 40 45 Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro 50 55 60 Tyr Glu Lys Lys Ala Glu Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile 65 70 75 80 Ala Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val 85 90 95 Val <210> 10 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 10 Pro Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro 1 5 10 15 Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro 20 25 30 Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys 35 40 45 Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro 50 55 60 Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile 65 70 75 80 Ala Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val 85 90 95 Val <210> 11 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 11 Pro Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro 1 5 10 15 Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Ser Ser Glu Tyr Arg Pro 20 25 30 Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys 35 40 45 Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro 50 55 60 Tyr Glu Lys Lys Ala Glu Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile 65 70 75 80 Ala Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val 85 90 95 Val <210> 12 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 12 Pro Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro 1 5 10 15 Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Ser Ser Glu Tyr Arg Pro 20 25 30 Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys 35 40 45 Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro 50 55 60 Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile 65 70 75 80 Ala Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val 85 90 95 Val <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 13 Pro Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe 1 5 10 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 14 Gly Pro Ser Leu Lys Leu 1 5 <210> 15 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 15 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Arg Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe 85 <210> 16 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 16 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe 85

Claims (35)

1. C106 또는 K114에서 아미노산 돌연변이를 선택적으로 포함하는 분리된 B 박스 폴리펩타이드, 또는 C106 또는 K114에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 그것의 동등물.
2. 제1항에 있어서, C106에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 B 박스 폴리펩타이드, 또는 C106에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 그것의 동등물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아미노산 돌연변이 C106S를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 B 박스 폴리펩타이드, 또는 아미노산 돌연변이 C106S를 포함하는 그것의 동등물.
4. K12, C23 또는 C45로부터 선택된 아미노산 위치에서 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 선택적으로 포함하는 분리된 A 박스 폴리펩타이드, 또는 K12, C23 또는 C45로부터 선택된 아미노산 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 그것의 동등물.
5. K12, C23, C45, K114 또는 C106으로부터 선택된 아미노산 위치에서 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 선택적으로 포함하는 분리된 AB 박스 폴리펩타이드, 또는 K12, C23, C45, K114, 또는 C106으로부터 선택된 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 그것의 동등물.
6. 제5항에 있어서, 아미노산 C106에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 AB 박스 폴리펩타이드, 또는 아미노산 C106에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 그것의 동등물.
7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 아미노산 돌연변이 C106S를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 AB 박스 폴리펩타이드, 또는 아미노산 돌연변이 C106S를 포함하는 그것의 동등물.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드의 N- 또는 C-말단에 위치한 링커 폴리펩타이드 또는 N- 또는 C-말단에 위치한 링커 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩타이드.
9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, A 박스 폴리펩타이드와 B 박스 폴리펩타이드를 연결시키는 링커 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩타이드.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 가능한 표지를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩타이드.
11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 분리된 폴리펩타이드를 인식하고 결합하는 항체 또는 항체의 항원 결합 단편.
12. 담체 및 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 하나 이상의 분리된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물.
13. 담체 및 제11항의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 조성물.
14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 담체는 제약학적으로 허용되는 담체인 것을 특징으로 하는 조성물.
15. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 분리된 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 보체.
16. 제11항의 항체 또는 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 폴리뉴클레오타이드의 보체.
17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 프로모터 및/또는 인핸서에 작동 가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 검출 가능한 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
19. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
20. 제19항에 있어서, 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
21. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 제11항의 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 또는 제19항 또는 제20항의 벡터 중 하나 이상을 포함하는 분리된 숙주 세포.
22. 제21항의 숙주 세포 및 담체를 포함하는 조성물.
23. 제22항에 있어서, 담체는 제약학적으로 허용되는 담체인 것을 특징으로 하는 조성물.
24. 미생물 DNA에 대한 DNABII 폴리펩타이드 또는 단백질의 결합을 억제, 경합 또는 적정하는 방법으로서, DNABII 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 미생물 DNA를 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계, 그로써 미생물 DNA에 대한 DNABII 단백질 또는 폴리펩타이드의 결합을 억제, 경합 또는 적정하는 단계를 포함하는 방법.
25. 미생물 생물막을 억제, 방지 또는 분해하는 방법으로서, 생물막을 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계, 그로써 미생물 생물막을 억제, 방지 또는 분해하는 단계를 포함하는 방법.
26. 대상체에서 생물막을 억제, 방지 또는 분해하는 방법으로서, 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 투여하는 단계, 그로써 미생물 생물막을 억제, 방지 또는 분해하는 단계를 포함하는 방법.
27. 대상체에서 생물막을 생성하는 미생물 감염을 억제, 방지 또는 치료하는 방법으로서, 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 투여하는 단계, 그로써 생물막을 생성하는 미생물 감염을 억제, 방지 또는 치료하는 단계를 포함하는 방법.
28. 염증 반응을 향상시키거나 유도하지 않는 생물막 및 제거를 파괴하는 방법으로서, 그것을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제3항 또는 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 투여하는 단계, 그로써 염증 반응을 향상시키거나 유도하지 않는 생물막 및 제거를 파괴하는 단계를 포함하는 방법.
29. 그것을 필요로 하는 대상체에서 생물막의 존재로 인해 발생하는 감염 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 그것을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 투여하는 단계, 그로써 생물막의 존재로 인해 발생하는 감염 또는 장애를 치료하는 단계를 포함하는 방법.
30. 제4항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 생물막은 요로병원성 대장균 (UPEC), 클레브시엘라 뉴모니아, 버크홀데리아 세노세파시아, 스타필로코커스 에피더미디스, 스트렙토코커스 아갈락티아, 네이세리아 메닝기티디스, 트레포네메스, 덴티콜라, 팔리듐, 버크홀데리아 세파시아, 버크홀데리아 슈도말레이, 헤모필루스 인플루엔자 (비피막형)(NTHI), 모락셀라 카타랄리스, 스트렙토코커스 뉴모니아, 스트렙토코커스 피오게네스, 슈도모나스 아에루기노사, 미코박테리움 투베르쿨로시스 또는 ESKAPE 병원체의 군으로부터 선택된 유기체에 의해 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 포유류인 것을 특징으로 하는 방법.
32. 제31항에 있어서, 포유류는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
33. 제32항에 있어서, 인간은 유아 또는 유소년인 것을 특징으로 하는 방법.
34. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 추가적인 작용제, 선택적으로 항미생물제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
35. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 분리된 폴리펩타이드, 제11항의 항체 또는 제15항 내지 제18항의 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상 및 사용 설명서를 포함하는 키트.

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