ES3041504T3 - Immobilization in flow cells - Google Patents

Abstract

En un ejemplo, un material objetivo se inmoviliza en dos superficies de secuenciación opuestas de una celda de flujo mediante dos fluidos. El primer fluido tiene una densidad menor que la del material objetivo y el segundo fluido tiene una densidad mayor; o bien, el segundo fluido tiene una densidad menor que la del material objetivo y el primer fluido tiene una densidad mayor. El primer fluido (que incluye el material objetivo) se introduce en la celda de flujo, de modo que al menos una parte del material objetivo queda inmovilizada por los sitios de captura en una de las superficies de secuenciación. El primer fluido y el material objetivo no inmovilizado se eliminan. El segundo fluido (que incluye el material objetivo) se introduce en la celda de flujo, de modo que al menos una parte del material objetivo queda inmovilizada por los sitios de captura en la otra superficie de secuenciación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Inmovilización en celdas de flujo

Referencia cruzada a solicitud relacionada

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de los EE. UU. con número de serie 62/946,717, presentada el 11 de diciembre de 2019, cuyo contenido se incorpora como referencia en la presente memoria en su totalidad.

Antecedentes

Las celdas de flujo se usan en una variedad de métodos y aplicaciones, tales como secuenciación génica, genotipificación, etc. El documento US 2009/272914 A1 (FENG WENYI [EE. UU.] ET AL), de 5 de noviembre de 2009, describe una celda de flujo que comprende dos superficies opuestas con sustancias inmovilizadas en ambas superficies. En algunos métodos y aplicaciones, se prefiere generar una genoteca de moléculas de ADN fragmentadas y marcadas a partir de moléculas diana de ADN bicatenario (ADNbc). Frecuentemente, el propósito es generar moléculas de ADN más pequeñas (p. ej., fragmentos de ADN) a partir de moléculas de ADNbc más grandes para usar como plantillas en reacciones de secuenciación de ADN. Las plantillas pueden permitir que se obtengan longitudes de lectura cortas. Durante el análisis de datos, las lecturas de secuencias cortas superpuestas pueden alinearse para reconstruir las secuencias de ácidos nucleicos más largas. En algunos casos, pueden usarse etapas de presecuenciación (tales como la de código de barras de moléculas de ácido nucleico particulares) para simplificar el análisis de datos.

Resumen

Los kits y métodos ilustrativos establecidos en la presente memoria son adecuados para inmovilizar uno o más materiales diana en superficies opuestas de una celda de flujo. Algunos ejemplos del método permiten la inmovilización secuencial, y otros ejemplos del método permiten la inmovilización simultánea.

Un primer aspecto descrito en la presente memoria es un método que comprende inmovilizar un material diana en cada una de las dos superficies de secuenciación opuestas de una celda de flujo, en donde la inmovilización implica: introducir un primer fluido, que incluye una primera porción del material diana en el mismo, en la celda de flujo, por el cual al menos parte del material diana se inmoviliza por sitios de captura en una de las dos superficies de secuenciación opuestas; eliminar el primer fluido y cualquier material diana no inmovilizado de la celda de flujo; e introducir un segundo fluido, que incluye una segunda porción del material diana en este, en la celda de flujo, por el cual al menos parte del material diana se inmoviliza por sitios de captura en otra de las dos superficies de secuenciación opuestas; en donde uno de: el primer fluido tiene una densidad menor que una densidad del material diana y el segundo fluido tiene una densidad mayor que la densidad del material diana; o el segundo fluido tiene la densidad menor que la densidad del material diana y el primer fluido tiene la densidad mayor que la densidad del material diana.

Un segundo aspecto descrito en la presente memoria es un kit, que comprende un fluido de preparación que incluye un material diana en este; un primer fluido de introducción que tiene una densidad menor que una densidad del material diana; y un segundo fluido de introducción que tiene una densidad mayor que la densidad del material diana.

Un tercer aspecto descrito en la presente memoria es un método que comprende inmovilizar un material diana en cada una de las dos superficies de secuenciación opuestas de una celda de flujo al: introducir un fluido, que incluye el material diana, en la celda de flujo, en donde: el material diana incluye: un soporte sólido magnético; y fragmentos de ácido nucleico o cadenas plantilla listas para la secuenciación unidas al soporte sólido magnético; y el fluido tiene una densidad al menos aproximadamente equivalente a una densidad del soporte sólido magnético; permitir que parte del material diana se inmovilice por sitios de captura en una de las dos superficies de secuenciación opuestas; y aplicar una fuerza magnética a otra de las dos superficies de secuenciación opuestas, lo que tira de este modo algún otro material diana a la otra de las dos superficies de secuenciación opuestas, donde se inmovilizan por sitios de captura en la otra de las dos superficies de secuenciación opuestas.

Un cuarto aspecto descrito en la presente memoria es un método que comprende inmovilizar simultáneamente los primeros materiales diana en una primera de dos superficies de secuenciación opuestas de una celda de flujo y los segundos materiales diana en una segunda de las dos superficies de secuenciación opuestas al introducir, en la celda de flujo, un fluido diana que incluye los primeros materiales diana y los segundos materiales diana, en donde: un fluido portador del fluido diana tiene una densidad de fluido; el primer material diana tiene una primera densidad menor que la densidad del fluido; y el segundo material diana tiene una segunda densidad mayor que la densidad del fluido.

Un quinto aspecto descrito en la presente memoria es un fluido diana, que comprende un fluido portador que tiene una densidad de fluido; un primer material diana que tiene una primera densidad menor que la densidad del fluido; y un segundo material diana que tiene una segunda densidad mayor que la densidad del fluido.

Un sexto aspecto descrito en la presente memoria es un método que comprende introducir el primer y segundo materiales diana en una celda de flujo que incluye dos superficies de secuenciación opuestas, en donde el primer material diana tiene al menos una propiedad que es diferente del segundo material diana, en donde al menos una propiedad se selecciona del grupo que consiste en densidad, carga, magnetismo, y combinaciones de estos; y exponer el primer y segundo materiales diana a al menos una condición, lo que provoca de este modo que el primer material diana se inmovilice por un sitio de captura en una primera de las dos superficies de secuenciación opuestas y el segundo material diana se inmovilice por un sitio de captura en una segunda de las dos superficies de secuenciación opuestas.

Debe entenderse que cualquier característica de uno cualquiera de los aspectos puede combinarse una con otra de cualquier manera deseable. Además, debe entenderse que cualquier combinación de características del primer aspecto y/o del segundo aspecto y/o del tercer aspecto y/o del cuarto aspecto y/o del quinto aspecto y/o del sexto aspecto puede combinarse con cualquiera de los ejemplos descritos en la presente memoria para obtener los beneficios como se describe en esta descripción, que incluye, por ejemplo, una distribución más uniforme del material diana a través de las superficies de secuenciación en una celda de flujo.

Breve descripción de las figuras

Las características de los ejemplos de la presente descripción resultarán evidentes con la referencia a la descripción detallada y figuras que siguen, en las cuales los números de referencia similares corresponden a componentes similares, aunque quizás no idénticos. En aras de la brevedad, los números de referencia o características que tienen una función descrita anteriormente pueden o no describirse en conexión con otras figuras en las que aparecen. las figuras 1A a 1C son ilustraciones esquemáticas de diferentes ejemplos de los materiales diana descritos en la presente memoria;

la figura 2A es una vista superior de un ejemplo de una celda de flujo;

la figura 2B es una vista en sección transversal ampliada, tomada a lo largo de la línea 2B-2B de la figura 2A, de un ejemplo de un canal de flujo y superficies de secuenciación sin patrones;

la figura 2C es una vista en sección transversal ampliada, tomada a lo largo de la línea 2C-2C de la figura 2A, de un ejemplo de un canal de flujo y superficies de secuenciación con patrones;

la figura 2D es una vista en sección transversal ampliada, tomada a lo largo de la línea 2D-2D de la figura 2A, de otro ejemplo de un canal de flujo y superficies de secuenciación con patrones;

las figuras 3A y 3B juntas representan un ejemplo de un método descrito en la presente memoria;

las figuras 4A y 4B juntas representan otro ejemplo de un método descrito en la presente memoria;

las figuras 5A y 5B juntas representan aún otro ejemplo de un método descrito en la presente memoria;

las figuras 6A y 6B juntas representan aún otro ejemplo de un método descrito en la presente memoria;

las figuras 7A y 7B juntas representan un ejemplo adicional de un método descrito en la presente memoria;

las figuras 8A y 8B juntas representan aún otro ejemplo de un método descrito en la presente memoria;

las figuras 9A a 9C juntas representan un ejemplo de un método para reducir la difusión y convección de las cadenas plantilla durante la amplificación;

las figuras 10A y 10B son imágenes de campo claro de complejos inmovilizados en una superficie de secuenciación superior (figura 10A) y una superficie de secuenciación inferior (figura 10B) de una celda de flujo que incluye superficies de secuenciación con patrones;

la figura 11A es un histograma de cobertura molecular para las superficies de secuenciación superior e inferior de un carril de una celda de flujo después de realizar la secuenciación;

la figura 11B es un gráfico que representa el porcentaje de puntajes Q mayores que Q30 (eje Y) en comparación con la cantidad del ciclo de secuenciación (eje X) para las superficies de secuenciación superior e inferior de un carril después de realizar la secuenciación;

las figuras 12A y 12B son gráficos de barras que representan la carga compleja (cantidad de glóbulos/mm2, eje Y) en las superficies inferiores (figura 12A) y las superficies superiores (figura 12B) de las celdas de flujo tratadas con concentraciones diferentes (j M, eje X) de alquino-biotina, donde la carga compleja se realizó usando dos líquidos de introducción diferentes;

las figuras 13A y 13B son gráficos que representan la carga compleja diana y la carga compleja real (cantidad de glóbulos/mm2, eje Y) en una superficie inferior y una superficie superior a lo largo de la longitud (eje X) de dos canales de celda de flujo diferentes; y

la figura 14 es una gráfica que representa la carga compleja prevista/diana, la carga compleja real (cantidad de glóbulos/mm2, eje Y) en una superficie inferior y una superficie superior a lo largo de la longitud (eje X) de un canal de celda de flujo y el ajuste lineal para cada superficie.

Descripción detallada

Algunas técnicas de secuenciación usan fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación. En algunos ejemplos, cada fragmento de ácido nucleico listo para la secuenciación incluye una porción (fragmento) de material genético, así como adaptadores en los extremos 3' y 5'. Los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación pueden estar unidos a un soporte sólido, que forma un complejo. En estos ejemplos, el uso del soporte sólido puede ser deseable porque puede preservar la información de contigüidad del material genético más largo a partir del cual se generan los fragmentos. Otras técnicas de secuenciación usan un soporte sólido agrupado, que incluye un grupo de cadenas plantillas unidas al soporte sólido. En estos ejemplos, el uso del soporte sólido puede ser deseable debido a que la amplificación (formación de las cadenas plantilla) puede realizarse fuera de la celda de flujo y por lo tanto la química de la celda de flujo se simplifica en que no incluye cebadores de amplificación. Sin embargo, cuando estos materiales diana (p. ej., complejos o soportes sólidos agrupados) se usan en celdas de flujo que tienen dos superficies de secuenciación posicionadas opuestas entre sí (p. ej., una superficie superior/tope y una superficie inferior/de fondo), se ha encontrado que los materiales diana tienen una tendencia a hundirse a la superficie de secuenciación posicionada en el fondo de la celda de flujo. Pueden surgir problemas similares cuando otros materiales diana, tales como biomarcadores proteicos, microbiomas, lisados, etc. en celdas de flujo con superficies opuestas.

Los ejemplos del método descrito en la presente memoria proporcionan una inmovilización más equilibrada de un material diana a través de las dos superficies de secuenciación opuestas. En algunos ejemplos, el mismo tipo de material diana se inmoviliza a través de las dos superficies de secuenciación opuestas. En otros ejemplos, dos materiales diana diferentes (que tienen al menos una propiedad diferente) se inmovilizan respectivamente en las dos superficies de secuenciación opuestas.

Un ejemplo del método descrito en la presente memoria usa una combinación de fluidos que tienen densidades diferentes. Una densidad de fluido permite que el material diana (p. ej., complejos, soportes sólidos agrupados) migre y se inmovilice en una de las superficies de secuenciación, y la otra densidad de fluido permite que el material diana migre y se inmovilice en la otra de las superficies de secuenciación.

Otro ejemplo del método usa una combinación de un fluido, una fuerza magnética sustancialmente uniforme y un material diana magnéticamente sensible (p. ej., un soporte sólido). En este ejemplo, el fluido se selecciona para tener una densidad que es aproximadamente la misma que el material diana magnéticamente sensible. En este fluido, parte del material diana se hunde (y se inmoviliza en una de las superficies de secuenciación), mientras que algún otro material diana flota. Cuando la fuerza magnética sustancialmente uniforme se aplica a la otra de las superficies de secuenciación, el material diana flotante migra y se inmoviliza en la otra de las superficies de secuenciación.

Aún otro ejemplo del método descrito en la presente memoria usa dos materiales diana diferentes que tienen densidades diferentes. Ambos materiales diana están contenidos en el mismo fluido. La densidad de uno de los materiales diana (con respecto al fluido) permite que ese material diana (p. ej., complejos, soportes sólidos agrupados) migre y se inmovilice en una de las superficies de secuenciación, y la densidad del otro de los materiales diana (con respecto al fluido) permite que ese material diana migre y se inmovilice en la otra de las superficies de secuenciación.

Aún otro ejemplo del método descrito en la presente memoria usa dos materiales diana diferentes que tienen al menos una propiedad diferente, tal como densidad, carga, magnetismo, o combinaciones de estos. La exposición a al menos una condición provoca que los diferentes materiales diana migren a una de las superficies de secuenciación opuestas respectivas.

La inmovilización del o los materiales diana (p. ej., complejos, soportes sólidos agrupados) en ambas superficies de secuenciación mejora la utilización general de la celda de flujo.

Una distribución más equilibrada del o los materiales diana inmovilizados a través de las dos superficies de secuenciación puede conducir a una medición mejorada secuencia abajo obtenida usando la celda de flujo. En un ejemplo, la distribución más equilibrada del material diana inmovilizado a través de las dos superficies de secuenciación puede conducir a una medición mejorada de la secuenciación. En un ejemplo, el material diana puede incluir complejos, y cuando los complejos se distribuyen más uniformemente a través de las dos superficies de secuenciación de la celda de flujo, los fragmentos de genoteca liberados de los complejos también se siembran más uniformemente a través de las superficies de secuenciación respectivas. Esto conduce a la formación de grupos individuales que se localizan relativamente con respecto a la posición de los complejos a partir de los cuales se forman los grupos. En otro ejemplo, el material diana puede incluir soportes sólidos agrupados. Cuando los soportes sólidos agrupados se distribuyen más uniformemente a través de las dos superficies de secuenciación de la celda de flujo, las cadenas plantillas agrupadas también se distribuyen más uniformemente. Durante la secuenciación, los grupos individuales generan “ nubes espaciales” de señales de fluorescencia a medida que los nucleótidos se incorporan en las cadenas de plantilla respectivas de los grupos. La distribución uniforme puede mejorar la legibilidad de las nubes espaciales.

Además, la carga de ambas superficies de secuenciación genera más área para generar estas nubes espaciales.

Definiciones

Se entenderá que los términos usados en la presente memoria asumen su significado ordinario en la técnica relevante a menos que se especifique de cualquier otro modo. Varios términos usados en la presente memoria y sus significados se establecen más abajo.

Como se usa en la presente memoria, los términos singulares “ un” , “ una” y “ el/la” se refieren tanto al singular como al plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. El término “ que comprende” , como se usa en la presente memoria, es sinónimo de “ que incluye” , “ que contiene” o “ caracterizado por” , y es inclusivo o abierto y no excluye etapas del método o elementos no enumerados adicionales.

La referencia a lo largo de toda la especificación a “ un ejemplo” , “ otro ejemplo” , y así sucesivamente, significa que un elemento particular (p. ej., característica, estructura, composición y/o configuración) descrito en conexión con el ejemplo se incluye en al menos un ejemplo descrito en la presente memoria, y puede estar presente o no en otros ejemplos. Además, se entenderá que los elementos descritos para cualquier ejemplo pueden combinarse de cualquier manera adecuada en los diversos ejemplos a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.

Los términos “ sustancialmente” y “ aproximadamente” usados a lo largo de esta especificación, incluidas las reivindicaciones, se usan para describir y dar cuenta de pequeñas fluctuaciones, tales como las debidas a las variaciones en el procesamiento. Por ejemplo, estos términos pueden referirse a menos o igual que ± 10 % de un valor establecido, menos o igual que ± 5 % de un valor establecido, tal como menos o igual que ± 2 % de un valor establecido, tal como menos o igual que ± 1 % de un valor establecido, tal como menos o igual que ± 0,5 % de un valor establecido, tal como menos o igual que ± 0,2 % de un valor establecido, tal como menos o igual que ± 0,1 % de un valor establecido, tal como menos o igual que ± 0,05 % de un valor establecido.

Adaptador.Una secuencia de oligonucleótidos lineal que puede fusionarse con una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, mediante ligación o tagmentación. Las longitudes de adaptador adecuadas pueden variar de aproximadamente 10 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos, o de aproximadamente 12 nucleótidos a aproximadamente 60 nucleótidos, o de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 50 nucleótidos. El adaptador puede incluir cualquier combinación de nucleótidos y/o ácidos nucleicos. En algunos ejemplos, el adaptador puede incluir una secuencia que es complementaria a al menos una porción de un cebador, por ejemplo, un cebador que incluye una secuencia de nucleótidos universal (tal como una secuencia P5 o P7). Como un ejemplo, el adaptador en un extremo de un fragmento incluye una secuencia que es complementaria a al menos una porción de un primer cebador de celda de flujo o soporte sólido, y el adaptador en el otro extremo del fragmento incluye una secuencia que es idéntica a al menos una porción de un segundo cebador de celda de flujo o soporte sólido. El adaptador complementario puede hibridarse al primer cebador de celda de flujo o soporte sólido, y el adaptador idéntico es una plantilla para su copia complementaria, que puede hibridarse al segundo cebador de celda de flujo o soporte sólido durante el agrupamiento. En algunos ejemplos, el adaptador puede incluir una secuencia de cebador de secuenciación o un sitio de unión de secuenciación. Las combinaciones de adaptadores diferentes pueden incorporarse en una molécula de ácido nucleico, tal como un fragmento de ADN.

Aproximadamente equivalente:Al menos aproximadamente equivalente significa que la densidad de un componente (p. ej., fluido) está dentro de 0,08 g/cm3 de la densidad de otro componente (p. ej., un soporte sólido). En algunos casos, las densidades de dos componentes son equivalentes.

Sitio de captura o sitio químico de captura.Una porción de una superficie de celda de flujo que se ha modificado con una propiedad química que permite la localización de un material diana (p. ej., complejos, soportes sólidos agrupados, biomarcadores proteicos, etc.). En un ejemplo, el sitio de captura puede incluir un agente de captura químico (es decir, un material, molécula o entidad que es capaz de unirse, retener o acoplarse a una molécula diana (p. ej., un complejo, un soporte sólido agrupado, un biomarcador proteico, etc.). Un ejemplo de agente químico de captura incluye un miembro de un par de unión receptor-ligando (p. ej., avidina, estreptavidina, biotina, lectina, carbohidrato, proteína de unión a ácido nucleico, epítopo, anticuerpo, etc.) que es capaz de unirse al material diana (o a una entidad de enlace unida al material diana). Aún otro ejemplo del agente químico de captura es un reactivo químico capaz de formar una interacción electrostática, un enlace de hidrógeno o un enlace covalente (p. ej., intercambio de tiol-disulfuro, química clic, Diels-Alder, etc.) con el material diana.

Complejo: Un portador, tal como un soporte sólido, y fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación acoplados al portador. El portador también puede incluir un miembro de un par de unión cuyo otro miembro es parte del sitio de captura.

Soporte sólido agrupado:Un portador, tal como un soporte sólido, que tiene una pluralidad de cadenas plantillas amplificadas unidas a este. La pluralidad de cadenas plantillas amplificadas puede denominarse un “ grupo” .

Depósito:Cualquier técnica de aplicación adecuada, que pueda ser manual o automatizada y, en algunos casos, resulta en la modificación de las propiedades de la superficie. Generalmente, el depósito puede realizarse usando técnicas de depósito de vapor, técnicas de revestimiento, técnicas de injerto, o lo similar. Algunos ejemplos específicos incluyen depósito químico de vapor (CVD, por sus siglas en inglés), recubrimiento por rociado (p. ej., recubrimiento por rociado ultrasónico), recubrimiento por rotación, recubrimiento por inmersión o mate, recubrimiento con cuchilla raspadora, despacho del charco, recubrimiento por flujo pasante, impresión por aerosol, serigrafía, impresión por microcontacto, impresión por chorro de tinta, o lo similar.

Depresión:Una característica cóncava distinta en un sustrato o una resina con patrones que tiene una abertura de superficie que está al menos parcialmente rodeada por una o más regiones intersticiales del sustrato o la resina con patrones. Las depresiones pueden tener cualquiera de una variedad de formas en su abertura en una superficie que incluyen, por ejemplo, redonda, elíptica, cuadrada, poligonal, en forma de estrella (con cualquier cantidad de vértices), etc. La sección transversal de una depresión tomada ortogonalmente con la superficie puede ser curva, cuadrada, poligonal, hiperbólica, cónica, angular, etc. Como ejemplos, la depresión puede ser un pozo o dos pozos interconectados. La depresión también puede tener arquitecturas más complejas, tales como crestas, características escalonadas, etc.

Cada uno:Cuando se usa en referencia a una colección de artículos, cada uno identifica un artículo individual en la colección, pero no necesariamente se refiere a todos los artículos de la colección. Pueden ocurrir excepciones si la divulgación explícita o el contexto dictan claramente lo contrario.

Agente inmovilizante externo:Un medio gaseoso, líquido o viscoso que no es miscible con un complejo que se ha introducido en la celda de flujo. El agente inmovilizante externo gaseoso puede usarse para crear una gotita alrededor de un complejo o muestra. Un ejemplo de un agente inmovilizante externo gaseoso es el aire dirigido a una velocidad de flujo adecuada a través de la celda de flujo. Por ejemplo, puede usarse aire para aspirar un fluido desde la celda de flujo, lo que forma gotitas del líquido alrededor de complejos inmovilizados dentro de la celda de flujo. La gotita formada actúa como una barrera de difusión. El medio líquido o viscoso se usa para minimizar la difusión de una genoteca de secuenciación liberada de un complejo. El agente inmovilizante externo puede formar una barrera de difusión, ya que las genotecas de secuenciación o cualquier otro polinucleótido tienen poca o ninguna solvatación en el agente inmovilizante externo. Los agentes inmovilizantes externos en forma líquida ilustrativos incluyen aceites hidrófobos, tales como aceite mineral, aceite de silicona, aceite perfluorado, un aceite de carbono fluorado (p. ej., FC40), o una combinación de estos. Los ejemplos de agentes inmovilizantes externos en forma de medio viscoso incluyen reguladores que contienen polímeros (p. ej., polietilenglicol, polivinilpirrolidona, etc.), dextrano, sacarosa, glicerol, y lo similar. En algunos ejemplos, el medio viscoso es un gel sensible a la temperatura. El gel sensible a la temperatura no es viscoso a temperaturas que no son de siembra y se convierte en un medio viscoso a temperaturas de siembra. Los ejemplos de geles sensibles a la temperatura incluyen compuestos de nanopartículas de poli(W-isopropilacrilamida) y óxido de polietileno-óxido de polipropileno-óxido de polietileno (PEO-PPO-PEO)/laponita.

Celda de flujo:Un recipiente que tiene una cámara (p. ej., un canal de flujo) donde puede llevarse a cabo una reacción, una entrada para suministrar uno o más reactivos a la cámara, y una salida para retirar uno o más reactivos de la cámara. En algunos ejemplos, la cámara permite la detección de la reacción que se produce en la cámara. Por ejemplo, la cámara puede incluir una o más superficies transparentes que permiten la detección óptica de matrices, moléculas marcadas ópticamente, o lo similar.

Canal de flujo:Un área definida entre dos componentes unidos o adheridos de cualquier otro modo, que puede recibir selectivamente una muestra líquida. En algunos ejemplos, el canal de flujo puede definirse entre dos superficies de secuenciación con patrones o sin patrones y por lo tanto puede estar en comunicación fluida con uno o más componentes de las superficies de secuenciación.

Fragmento:Una porción o pieza de material genético (p. ej., ADN, ARN, etc.). Los fragmentos de la genoteca conservados de manera contigua son piezas más pequeñas de la muestra de ácido nucleico más larga que se ha fragmentado, donde la información de la contigüidad de la muestra de ácido nucleico más larga se ha conservado en los fragmentos.

Molécula de ácido nucleico o muestra:Una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, y puede incluir ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, análogos de estos, o mezclas de estos. El término puede referirse a polinucleótidos monocatenarios o bicatenarios.

Una molécula de ácido nucleico “ molde” (o cadena) puede referirse a una secuencia a analizar. Un grupo de cadenas plantillas incluye amplicones de un fragmento de genoteca.

Los nucleótidos de una muestra de ácido nucleico pueden incluir ácidos nucleicos de origen natural y análogos funcionales de estos. Los análogos funcionales particularmente útiles son capaces de hibridarse a un ácido nucleico de una manera específica de secuencia o capaces de usarse como un molde para la replicación de una secuencia de nucleótidos particular. Los nucleótidos de origen natural tienen generalmente una cadena principal que contiene enlaces fosfodiéster. Una estructura análoga puede tener un enlace de cadena principal alterna que incluye cualquiera de una variedad de los conocidos en la técnica. Los nucleótidos de origen natural tienen generalmente un azúcar desoxirribosa (p. ej., encontrada en el ADN) o un azúcar ribosa (p. ej., encontrada en el ARN). Una estructura análoga puede tener una entidad de azúcar alterna que incluye cualquiera de una variedad conocida en la técnica. Los nucleótidos pueden incluir bases nativas o no nativas. Un ADN nativo puede incluir uno o más de adenina, timina, citosina y/o guanina, y un ARN nativo puede incluir uno o más de adenina, uracilo, citosina y/o guanina. Puede usarse cualquier base no nativa, tal como un ácido nucleico bloqueado (LNA, por sus siglas en inglés) y un ácido nucleico puenteado (BNA, por sus siglas en inglés).

Cebador.Una molécula de ácido nucleico que puede hibridarse a una secuencia diana, tal como un adaptador unido a un fragmento de genoteca. Como un ejemplo, un cebador de amplificación puede servir como punto de partida para la amplificación de moldes y la generación de grupos. Como otro ejemplo, una cadena de ácido nucleico sintetizada (plantilla) puede incluir un sitio con el cual puede hibridarse un cebador (p. ej., un cebador de secuenciación) para cebar la síntesis de una nueva cadena que es complementaria a la cadena de ácido nucleico sintetizada. Cualquier cebador puede incluir cualquier combinación de nucleótidos o análogos de estos. En algunos ejemplos, el cebador es un oligonucleótido o polinucleótido monocatenario. La longitud del cebador puede tener cualquier número de bases y puede incluir una variedad de nucleótidos no naturales. En un ejemplo, el cebador de secuenciación es una cadena corta, que varía de 10 a 60 bases, o de 20 a 40 bases.

Fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación'.Una porción de material genético que tiene adaptadores en los extremos 3' y 5'. En el fragmento de ácido nucleico listo para la secuenciación, cada adaptador incluye una secuencia universal conocida (p. ej., que es complementaria o idéntica a al menos una porción de un cebador en una celda de flujo) y una secuencia de cebador de secuenciación. Ambos adaptadores también pueden incluir una secuencia de índice (código de barras o etiqueta). En un ejemplo, un lado (p. ej., que incluye una secuencia P5' o P5) puede contener un índice de glóbulo y el otro lado (que incluye una secuencia P7 o P7') puede contener un índice de muestra. Un fragmento de ácido nucleico listo para la secuenciación puede unirse a un soporte sólido a través de la inserción de transposones, donde las moléculas de ADN insertadas se inmovilizan a la superficie de un soporte sólido (p. ej., glóbulo); o inmovilizarse directamente a través de un par de unión u otro enlazador escindible; o unirse por hibridación, donde las secuencias adaptadoras complementarias están presentes en la superficie del soporte sólido.

Superficie de secuenciación:Una superficie de una celda de flujo donde puede tener lugar la secuenciación. En algunos ejemplos, la superficie de secuenciación incluye un hidrogel polimérico que tiene uno o más tipos de cebadores de amplificación injertados en este. En estos ejemplos, la superficie de secuenciación también puede incluir un sitio de captura para inmovilizar complejos en o cerca de los cebadores de amplificación. En otros ejemplos, la superficie de secuenciación incluye sitios de captura para inmovilizar soportes sólidos agrupados.

Soporte sólido.El cuerpo pequeño está hecho de un material rígido o semirrígido que tiene una forma caracterizada, por ejemplo, como una esfera, óvalo, microesfera u otra forma de partícula reconocida, ya sea que tenga dimensiones regulares o irregulares. En algunos ejemplos, el soporte sólido puede tener una genoteca de secuenciación unida a este. En otros ejemplos, el soporte sólido puede tener un grupo de cadenas plantillas unidas a este.

Material diana:Cualquier sustancia que debe inmovilizarse en una superficie de celda de flujo.

Transposoma.Un complejo formado entre una enzima de integración (p. ej., una integrasa o una transposasa) y un ácido nucleico que incluye un sitio de reconocimiento de integración (p. ej., un sitio de reconocimiento de transposasa).

En los ejemplos descritos en la presente memoria, los materiales diana se introducen en una celda de flujo que incluye dos superficies de secuenciación opuestas. Los materiales diana y la celda de flujo se describirán a continuación, seguidos por diferentes ejemplos de los métodos para inmovilizar los materiales diana en cada una de las dos superficies de secuenciación opuestas.

Materiales diana

Los ejemplos de materiales diana 11 se muestran en las figuras 1A a 1C. En los ejemplos descritos en la presente memoria, puede usarse cualquier material diana 11 que debe inmovilizarse en una superficie de una celda de flujo. Como ejemplos, el material diana 11 puede ser un complejo 10A, 10B como se define en la presente memoria (ver figura 1A y figura 1B), un soporte sólido agrupado 13 como se define en la presente memoria (ver figura 1C), otras genotecas de ADN de una muestra específica, células, proteínas conjugadas de oligonucleótidos unidas a soportes sólidos, un biomarcador de proteínas, un microbioma, o lo similar. La siguiente descripción proporciona algunos ejemplos de los complejos 10A, 10B y del soporte sólido agrupado 13.

Complejos

Algunos complejos ilustrativos 10A y 10B se muestran, respectivamente, en la figura 1A y figura 1B. En los ejemplos del método descrito en la presente memoria, los complejos 10A, 10B incluyen un soporte sólido 12, 12' y fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14', 14" unidos al soporte sólido 12, 12'.

En los ejemplos del método que usan la combinación de fluidos que tienen diferentes densidades, o materiales diana 11 con diferentes densidades, o materiales diana sin carga 11, el soporte sólido 12 puede ser, sin limitarse a, hidrogeles; vidrio (p. ej., glóbulos de vidrio de poro controlado); plástico, tal como acrílico, poliestireno o un copolímero de estireno y otro material, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretano o politetrafluoroetileno (TEFLON® de The Chemours Co); polisacáridos o polisacáridos reticulados tales como agarosa, glóbulos SEPHAROSE® (forma reticulada granulada de agarosa, disponible de Cytivia), o glóbulos SEPHADEX® (forma reticulada granulada de dextrano, disponible de Cytivia); nailon; nitrocelulosa; resina; sílice o materiales a base de sílice que incluyen silicio y silicio modificado; fibra de carbono; metal; vidrio inorgánico; un haz de fibras ópticas; o una variedad de otros polímeros. Algunos ejemplos del soporte sólido 12 pueden tener la forma de glóbulos sólidos, glóbulos porosos o glóbulos huecos.

En ejemplos del método que usa la combinación del fluido y la fuerza magnética, el soporte sólido 12' es un material magnéticamente sensible. Un material “ magnéticamente sensible” es sensible a un campo magnético. Los ejemplos de soportes sólidos magnéticamente sensibles incluyen o están compuestos de materiales magnéticamente sensibles. Los ejemplos de materiales magnéticamente sensibles incluyen materiales paramagnéticos, materiales ferromagnéticos, materiales ferrimagnéticos y materiales metamagnéticos. Los ejemplos de materiales paramagnéticos adecuados incluyen hierro, níquel y cobalto, así como óxidos metálicos, tales como Fe3O4, BaFe-^O-ig, CoO, NiO, Mn2O3, Cr2O3y CoMnP. Un ejemplo comercialmente disponible incluye DYNABEADS™ M-280 Streptavidin (glóbulos superparamagnéticos recubiertos con estreptavidina) de ThermoFisher Scientific. En algunos ejemplos, el material magnéticamente sensible se incorpora en la cubierta de un glóbulo de polímero. En otros ejemplos, el material magnéticamente sensible está en forma de glóbulo y está recubierto con un material de pasivado, tal como óxido de silicio o nitrito de silicio. En métodos ilustrativos que usan dos materiales diana diferentes 11, uno de los materiales diana 11 puede incluir cualquiera de los soportes sólidos magnéticamente sensibles 12' descritos en la presente memoria.

En los ejemplos del método que usan un campo eléctrico para la inmovilización, el soporte sólido 12 del material diana 11 puede cargarse positiva o negativamente. En estos ejemplos, puede usarse cualquiera de los ejemplos establecidos para el soporte sólido 12, y puede recubrirse o funcionalizarse para impartir la carga deseada. Pueden usarse moléculas pequeñas o polímeros para impartir carga al soporte sólido 12. Por ejemplo, cualquiera de los soportes sólidos 12 (p. ej., poliestireno, sílice, etc.) puede funcionalizarse con aminas para volverlos positivamente cargados. Puede usarse cualquier amina primaria, secundaria o terciaria. Los ejemplos de aminas adecuadas incluyen aminosilano, polilisina o quitosana. Para otro ejemplo, cualquiera de los soportes sólidos 12 (p. ej., poliestireno, sílice, SEPHADEX®, etc.) puede funcionalizarse con grupos carboxilo o grupos sulfato para volverlos negativamente cargados. Para dar aún otro ejemplo, cualquiera de los soportes sólidos 12 (p. ej., poliestireno, sílice, SEPHADEX®, etc.) puede recubrirse con ácido poliglutámico para volverlos negativamente cargados.

Si bien no se ilustra en la figura 1A y la figura 1B, el soporte sólido 12, 12' puede funcionalizarse con un miembro de un par de unión. Un “ par de unión” se refiere a dos agentes (p. ej., materiales, moléculas, entidades) que son capaces de unirse entre sí. En este ejemplo, el miembro en el soporte sólido 12, 12' es un par de unión con otro miembro que se ubica en la superficie de secuenciación de la celda de flujo. En otros ejemplos, el soporte sólido 12, 12' puede ser capaz de conjugarse químicamente con la superficie de secuenciación de la celda de flujo.

La funcionalización del soporte sólido 12, 12' puede implicar recubrir el soporte sólido 12, 12' con el miembro de par de unión, o formar un enlace entre el miembro de par de unión y un grupo funcional en la superficie del soporte sólido 12, 12'. Un miembro de par de unión ilustrativo incluye un miembro de un par de unión receptor-ligando (p. ej., avidina, estreptavidina, biotina, lectina, carbohidrato, proteína de unión a ácido nucleico, epítopo, anticuerpo, etc.) que es capaz de unirse al otro miembro de par de unión que está ubicado en la superficie de secuenciación de la celda de flujo. Los miembros de par de unión también pueden ser reactivos químicos que son capaces de formar una interacción electrostática, un enlace de hidrógeno o un enlace covalente (p. ej., intercambio de tiol-disulfuro, química clic, Diels-Alder, etc.). Cualquier forma de acoplamiento químico también puede unir el soporte sólido 12, 12' a la superficie de secuenciación de la celda de flujo. En muchos casos, es deseable una interacción reversible o escindible de tal modo que el soporte sólido 12, 12' pueda eliminarse antes de la secuenciación.

En ejemplos de los complejos 10A, 10B, los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14', 14” se acoplan al soporte sólido 12, 12'. Cada fragmento de ácido nucleico listo para la secuenciación 14, 14', 14” incluye una porción (p. ej., fragmento 16, 16', 16") de una pieza más larga de material genético que tiene adaptadores (p. ej., 18, 18', 18", 22, 22', 22") en los extremos 3' y 5'. Los fragmentos listos para la secuenciación 14, 14', 14” pueden prepararse usando cualquier técnica de preparación de genoteca que fragmenta una pieza más larga de material genético e incorpora los adaptadores deseados 18, 18', 18", 22, 22', 22” a los extremos de los fragmentos 16, 16', 16". Algunas técnicas de preparación de genotecas adecuadas se describen con referencia a las figuras 1A y figura 1B. Debe entenderse, sin embargo, que también pueden usarse otras técnicas de preparación de genotecas.

La figura 1A representa un ejemplo de un complejo 10A que incluye fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14' que incluyen fragmentos 16, 16' de la muestra de ácido nucleico más grande, cuya contigüidad se conserva en el soporte sólido 12, 12'. Un método ilustrativo para preparar el complejo 10A se describe en la presente memoria, pero debe entenderse que pueden usarse otros métodos siempre que los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14' se unan al soporte sólido 12, 12'.

En un método ilustrativo para formar el complejo 10A mostrado en la figura 1A, una secuencia de adaptador 18, 18' se une al soporte sólido 12, 12' a través de un miembro 20 de un par de unión. En un ejemplo, esta secuencia de adaptador 18, 18' puede incluir una primera secuencia de cebador de secuenciación (p. ej., una secuencia de cebador de secuenciación de lectura 1) y una primera secuencia (P5') que es complementaria de al menos una parte de uno de los cebadores de amplificación (p. ej., P5) en la celda de flujo (que se muestra en la figura 2A, figura 2B y figura 2C). La secuencia de adaptador 18, 18' también puede incluir una secuencia de índice o código de barras. La secuencia de adaptador 18, 18' se une al miembro 20 (p. ej., biotina) del par de unión de tal modo que puede unirse a la superficie del soporte sólido 12, 12' que incluye el otro miembro (p. ej., avidina, estreptavidina, etc.) del par de unión. En este ejemplo, el miembro del par de unión en el soporte sólido 12, 12' puede ser multifuncional ya que puede i) unirse al miembro 20 usado para unir los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14' y ii) unirse a la superficie de secuenciación de la celda de flujo. En otros ejemplos, el soporte sólido 12, 12' puede funcionalizarse con dos miembros de par de unión diferentes, p. ej., i) uno de los cuales puede unirse al miembro 20 usado para unir los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14' y ii) otro de los cuales puede unirse a la superficie de secuenciación de la celda de flujo.

En este ejemplo, un complejo de transposoma (no se muestra) también puede unirse al soporte sólido 12, 12' en la salida del método de preparación de la genoteca. Antes de cargar el complejo de transposoma en el soporte sólido 12, 12', un adaptador-Y parcial puede mezclarse con una enzima transposasa (p. ej. dos moléculas Tn5) para formar un complejo de transposoma. El adaptador-Y parcial puede incluir dos secuencias de extremo de mosaico que se hibridan entre sí. Una de las secuencias del extremo de mosaico se denomina secuencia del extremo de mosaico libre porque tiene dos extremos libres, p. ej., uno que es capaz de unirse al adaptador 18, 18' y otro que es capaz de unirse a las cadenas de ADN fragmentadas 16, 16' durante el etiquetado. La otra de las secuencias de extremo de mosaico puede unirse a otro adaptador (p. ej. 22, 22'), que incluye una segunda secuencia de cebador de secuenciación (p. ej., una secuencia de cebador de secuenciación de lectura 2) y una segunda secuencia (P7) que es idéntica a al menos una porción de otro de los cebadores de amplificación (P7) en la celda de flujo. Durante la amplificación, la secuencia idéntica permite la formación de una copia que es complementaria a al menos una porción del otro de los cebadores de amplificación (P7) en la celda de flujo. Las secuencias de adaptadores 22, 22' no están unidas a las cadenas de ADN fragmentadas 16, 16' durante el etiquetado.

Cargar el complejo de transposoma en el soporte sólido 12, 12' puede implicar mezclar el complejo de transposoma con el soporte sólido 12, 12' y exponer la mezcla a condiciones adecuadas para ligar uno de los extremos libres del extremo de mosaico libre al extremo 3' de la secuencia de adaptador 18, 18'. Los complejos de transposoma individual pueden estar unidos a cada una de las secuencias de adaptador 18, 18' en el soporte sólido 12, 12'.

En este método ilustrativo para formar el complejo 10A, después puede realizarse un proceso de etiquetado. Un fluido (p. ej., un regulador de etiquetado) que incluye la muestra de ácido nucleico más larga (p. ej., ADN) puede agregarse al soporte sólido 12, 12' que tiene la secuencia de adaptador 18, 18' y los complejos de transposomas unidos a este. A medida que la muestra entra en contacto con los complejos de transposomas, se etiqueta la muestra de ácido nucleico más larga. La muestra de ácido nucleico más larga se fragmenta en fragmentos 16, 16' y cada uno se etiqueta, en su extremo 5', al adaptador-Y parcial (p. ej., a través de la ligación del otro extremo libre de la secuencia del extremo de mosaico libre). El etiquetado sucesivo de la muestra de ácido nucleico más larga resulta en una pluralidad de moléculas puenteadas entre los complejos de transposomas. Las moléculas puenteadas se envuelven alrededor del soporte sólido 12, 12'. Los complejos de transposomas mantienen la contigüidad de la muestra de ácido nucleico más larga como moléculas puenteadas.

Después, la enzima transposasa puede eliminarse mediante el tratamiento con sulfato de dodecilo de sodio (SDS) o digestión con calor o proteinasa K. La eliminación de las enzimas transposasa deja los fragmentos conservados de manera contigua 16, 16' acoplados al soporte sólido 12, 12'.

Para completar los fragmentos 14, 14' listos para la secuenciación, se lleva a cabo una extensión y ligación adicionales para asegurar que los fragmentos de muestra 16, 16' se unan a las secuencias 22 y 22'. El complejo resultante 10A se muestra en la figura 1A.

Cada fragmento de ácido nucleico listo para la secuenciación 14, 14' incluye un fragmento de genoteca conservado de manera contigua 16, 16' que tiene las respectivas secuencias de adaptadores 18 y 22 o 18' y 22' unidas a cada extremo. Las secuencias de adaptador 18, 18' son aquellas que se unen inicialmente al soporte sólido 12, 12' e incluyen la primera secuencia de cebador de secuenciación y la primera secuencia complementaria a uno de los cebadores de celda de flujo. Las secuencias de adaptador 18, 18' se acoplan al miembro 20 de un par de unión. Las secuencias de adaptador 22, 22' son del adaptador-Y parcial, e incluyen la segunda secuencia idéntica a otro cebador de celda de flujo y la segunda secuencia de cebador de secuenciación. Dado que cada fragmento de ácido nucleico listo para la secuenciación 14, 14' incluye adaptadores adecuados para la amplificación (p. ej., amplificación en puente) y secuenciación, no se realiza la amplificación por PCR. Por lo tanto, estos fragmentos 14, 14' están listos para la secuenciación. Además, debido a que los fragmentos de genoteca conservados de manera contigua 16, 16' son de la misma muestra de ácido nucleico más larga, la contigüidad de la muestra original se preserva y los fragmentos de genoteca 14, 14' pueden ser adecuados para las aplicaciones de lectura larga enlazadas.

La figura 1B ilustra otro complejo 10B que incluye un soporte sólido 12, 12' y fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14'' unidos al soporte sólido 12, 12'. En un ejemplo, se crea una genoteca de nucleótidos libre de PCR en un tubo y, después, la genoteca se hibrida en el soporte sólido 12, 12' en el tubo. En el ejemplo mostrado en la figura 1B, los adaptadores 18'', 22" se agregan a los fragmentos de la genoteca 16'' en el tubo, los cebadores que tienen un miembro 20 de un par de unión se hibridan a los adaptadores 18'' en el tubo, y después los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14'' se unen al soporte sólido 12, 12' a través del miembro 20 de un par de unión. En otro ejemplo, el soporte sólido 12, 12' puede tener cebadores unidos a este mediante un par de unión (p. ej., avidina sobre el soporte 12, 12' y biotina unida al cebador). Estos cebadores se hibridan con adaptadores 18” unidos a los fragmentos de genoteca 16" (y, por lo tanto, el cebador y el miembro de par de unión están en un extremo de los fragmentos y no en el otro). En aún otro ejemplo, la extensión puede realizarse usando una enzima de desplazamiento de cadena. Esto resultará en una genoteca completamente bicatenaria (p. ej., sin horquilla ni adaptador-Y, como se muestra en la figura 1B).

Como se mencionó, también pueden usarse otras técnicas de preparación de genotecas. Por ejemplo, las técnicas de preparación de genotecas basadas en ligación pueden usarse cuando la secuencia de adaptadores complementaria se inmoviliza en la celda de flujo. En otro ejemplo, el ARNm puede inmovilizarse en el soporte sólido 12, 12' por medio de hibridación de cola poliA.

Soportes sólidos agrupados

Un soporte sólido agrupado ilustrativo 13 se muestra en la figura 1C. El soporte sólido agrupado 13 incluye un soporte sólido 12, 12' y cadenas plantilla 64 unidas al soporte sólido 12, 12' a través de un cebador 42 o 42'.

Cualquier ejemplo del soporte sólido 12, 12' puede usarse como el núcleo del soporte sólido agrupado 13. El tipo de soporte sólido 12, 12', y su propiedad/propiedades (p. ej., densidad, carga, magnetismo, etc.), pueden depender del método de inmovilización que se usará.

Si bien no se muestra en la figura 1C y similar a los complejos 10A y 10B ilustrados en la figura 1A y figura 1B, el soporte sólido 12, 12' puede funcionalizarse con un miembro de un par de unión para unirse a un sitio de captura de una celda de flujo.

Como se muestra en la figura 1C, este ejemplo del soporte sólido 12, 12' se funcionaliza con los cebadores 42, 42'. Los cebadores 42, 42' pueden ser los cebadores de amplificación 42, 42' que pueden inmovilizarse al soporte sólido 12, 12' mediante unión covalente de un solo punto o una interacción no covalente fuerte en o cerca del extremo 5' de los cebadores 42, 42'. La unión deja i) una porción específica de adaptador de los cebadores 42, 42' libre para hibridarse con su fragmento de ácido nucleico listo para la secuenciación cognada y ii) el grupo hidroxilo 3' libre para la extensión del cebador. En o cerca del extremo 5', el cebador 42, 42' incluye un grupo funcional químicamente modificable que es capaz de una unión covalente o una interacción no covalente fuerte. Los ejemplos de grupos funcionales químicamente modificables incluyen tiol, azido, alquino, amino, biotina, etc.

Los ejemplos específicos de cebadores adecuados 42, 42' incluyen los cebadores P5 y P7 usados en la superficie de las celdas de flujo comerciales a la venta por Illumina Inc. para la secuenciación en HISEQ™, HISEQX™, MISEQ™, MISEQDX™, MINISEQ™, NEXTSEQ™, NEXTSEQDX™, NOVASEQ™, GENOME ANALYZER™, ISEQ™ y otras plataformas de instrumentos. Ambos cebadores P5 y P7 pueden injertarse en cada uno de los soportes sólidos 12, 12'.

En un ejemplo, el injerto de los cebadores 42, 42' en el soporte sólido 12, 12' puede incluir el recubrimiento por inmersión, que implica sumergir el soporte sólido 12, 12' en una solución o mezcla de cebador, que puede incluir los cebadores 42, 42', agua, un regulador y un catalizador. Otras técnicas de injerto pueden involucrar recubrimiento por rociado, dispensación de charco, u otro método adecuado que una el o los cebadores 42, 42' al soporte sólido 12, 12'. Con cualquiera de los métodos de injerto, los cebadores 42, 42' reaccionan con los grupos reactivos del soporte sólido 12, 12'.

Durante el injerto, el grupo funcional químicamente modificable del cebador 42, 42' reacciona o interactúa con los grupos reactivos del soporte sólido 12, 12'. Los siguientes son ejemplos de reacciones o interacciones que pueden tener lugar durante el injerto: hacer reaccionar un cebador terminado en azido (p. ej., succinimidil (NHS) éster) con una hidrazina en la superficie del soporte sólido 12, 12', o hacer reaccionar un cebador terminado en alquino con una azida en la superficie del soporte sólido 12, 12', o hacer reaccionar un cebador terminado en amino en un grupo carboxilato activado o éster NHS en la superficie del soporte sólido 12, 12', o hacer reaccionar un cebador terminado en tiol con un reactivo alquilante (p. ej., yodoacetamina o maleimida) en la superficie del soporte sólido 12, 12', o hacer reaccionar un cebador terminado en fosforamidita con un tioéter en la superficie del soporte sólido 12, 12', o interactuar un cebador modificado con biotina con estreptavidina en la superficie del soporte sólido 12, 12'. Algunos cebadores de ácidos nucleicos 42, 42' pueden capturarse sobre glóbulos de sílice en presencia de un agente caotrópico (KI, NI o NaSCN). Como un ejemplo específico, puede usarse un cebador terminado en dibenzociclooctino (DBCO, que incluye un alquino) para el injerto por encaje libre de cobre.

Para generar las cadenas plantilla 64 en el soporte sólido 12, 12', primero pueden prepararse plantillas de genoteca a partir de cualquier muestra de ácido nucleico (p. ej., una muestra de ADN o una muestra de ARN). Cuando se usa una muestra de ARN, esta se convierte primero en una muestra de ácido desoxirribonucleico complementario (ADNc). Esto puede realizarse usando retrotranscripción que usa una enzima retrotranscriptasa. En algunos ejemplos, se usa un kit para retrotranscripción y síntesis de segunda cadena. En estos ejemplos puede usarse el kit de retrotranscripción de ADNc de alta capacidad, de ThermoFisher Scientific. En otros ejemplos, se usa un kit para retrotranscripción e interrupción de plantillas (para la segunda cadena). En estos ejemplos, puede usarse la mezcla enzimática RT de interrupción de plantillas, de New England Biolabs.

Después, la muestra de ADN o ADNc puede fragmentarse en fragmentos monocatenarios, de tamaños similares (p. ej., < 1000 pb). Durante la preparación, pueden agregarse adaptadores a los extremos de estos fragmentos. A través de la amplificación de ciclo reducido, pueden introducirse diferentes motivos en los adaptadores, tales como sitios de unión, índices y regiones de secuenciación que son complementarios o idénticos a los cebadores 42, 42' en el soporte sólido 12, 12'. Las plantillas de genoteca finales incluyen el fragmento de ADN o ADNc y adaptadores en ambos extremos. En algunos ejemplos, los fragmentos de una sola muestra de ácido nucleico tienen los mismos adaptadores agregados a estos.

Una pluralidad de plantillas de genoteca puede introducirse en una pluralidad de los soportes sólidos 12, 12'. Una plantilla de genoteca se hibrida con uno de los dos tipos de cebadores 42, 42' inmovilizados en un soporte sólido respectivo 12, 12'. Después, puede realizarse la generación del grupo. En un ejemplo de generación de grupos, la plantilla de genoteca en el soporte sólido 12, 12' se copia a partir del cebador hibridado mediante la extensión 3' usando un ADN polimerasa de alta fidelidad. La plantilla de genoteca original se desnaturaliza, dejando inmovilizada la copia (p. ej., cadena de plantilla 64) en el soporte sólido 12, 12', p. ej., a través del cebador 42 como se muestra en la figura 1<c>. Puede usarse la amplificación isotérmica de puente o alguna otra forma de amplificación para amplificar las copias inmovilizadas. Por ejemplo, las plantillas copiadas se enrollan para hibridarse con un cebador complementario adyacente (p. ej., cebador 42'), y una polimerasa copia las plantillas copiadas para formar un puente bicatenario, que se desnaturaliza para formar dos cadenas monocatenarias. Estas dos cadenas se enrollan y se hibridan con los cebadores complementarios adyacentes 42, 42' y se extienden nuevamente para formar dos bucles bicatenarios nuevos. El proceso se repite en cada copia de la plantilla en ciclos de desnaturalización y amplificación isotérmicas para crear grupos clonales densos. Cada grupo de puentes bicatenarios se desnaturaliza. En un ejemplo, la cadena inversa se elimina mediante la escisión de base específica, lo que deja cadenas directas de polinucleótidos de plantilla. El agrupamiento resulta en la formación de varias cadenas de polinucleótidos plantilla 64 en el soporte sólido 12, 12'. Este ejemplo de agrupamiento es la amplificación de puentes, y es un ejemplo de la amplificación que puede realizarse.

Celda de flujo

Una vista superior de un ejemplo de la celda de flujo 24 se muestra en la figura 2A. Como se mencionó en la presente memoria, la celda de flujo 24 incluye dos superficies de secuenciación opuestas. Un ejemplo de superficies de secuenciación sin patrones 30, 30' se muestra en la figura 2B, un ejemplo de superficies de secuenciación con patrones 32, 32' se muestra en la figura 2C, y otro ejemplo de superficies de secuenciación con patrones 31, 31' se muestra en la figura 2D. Las superficies de secuenciación sin patrones 30, 30' y las superficies de secuenciación con patrones 32, 32' incluyen los cebadores 42, 42', y por lo tanto pueden usarse con los materiales diana 11 que introducen fragmentos de genoteca que se amplificarán en la celda de flujo 24. Otras superficies de secuenciación, tales como las superficies de secuenciación con patrones 31, 31', no incluyen los cebadores 42, 42', y por lo tanto pueden usarse con soportes sólidos agrupados 13.

Cada superficie de secuenciación 30, 30' o 32, 32' o 31, 31' está soportada por un sustrato (ilustrado generalmente como 26 en la figura 2A), y un canal de flujo (ilustrado generalmente como 28 en la figura 2A) se define entre las superficies de secuenciación 30, 30' o 32, 32' o 31, 31'.

El sustrato 26 puede ser una sola capa/material. Los ejemplos del sustrato de una sola capa se ilustran con los números de referencia 26A y 26A' en la figura 2B. Los ejemplos de sustratos de una sola capa 26A, 26A' adecuados incluyen epoxisiloxano, vidrio, vidrio modificado o funcionalizado, plásticos (que incluye acrílicos, poliestireno y copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, politetrafluoroetileno (tales como como TEFLON® de Chemours), polímeros de olefinas/cicloolefinas cíclicas (COP, por sus siglas en inglés) (tal como ZEONOR® de Zeon), poliimidas, etc.), nailon (poliamidas), cerámica/óxidos de cerámica, sílice, sílice fundida o materiales a base de sílice, silicato de aluminio, silicio y silicio modificado (p. ej., silicio p+ dopado con boro), nitruro de silicio (Si3N4), óxido de silicio (SO2), pentóxido de tantalio (Ta2Os) u otro u otros óxidos de tantalio (TaOx), óxido de hafnio (HfO2), carbono, metales, vidrios inorgánicos o lo similar.

El sustrato 26 puede ser también una estructura multicapa. Los ejemplos del sustrato de múltiples capas se muestran con los números de referencia 26B y 26B' en la figura 2C y en la figura 2D. Algunos ejemplos de la estructura de múltiples capas 26B, 26B' incluyen vidrio o silicio, con una capa de recubrimiento de óxido de tántalo u otro óxido cerámico en la superficie. Con referencia específica a la figura 2C y la figura 2D, otros ejemplos de la estructura de múltiples capas 26<b>, 26B' incluyen un soporte subyacente 34, 34' que tiene una resina con patrones 36, 36' sobre este. Aún otros ejemplos del sustrato de múltiples capas 26B, 26B' pueden incluir un sustrato de silicio sobre aislante (SOI, por sus siglas en inglés).

En un ejemplo, el sustrato 26 (ya sea de una sola o varias capas) puede tener un diámetro que varía de aproximadamente 2 mm a aproximadamente 300 mm, o una lámina o panel rectangular que tiene su dimensión más grande hasta aproximadamente 10 pies (~ 3 metros). En un ejemplo, el sustrato 26 es una oblea que tiene un diámetro que varía de aproximadamente 200 mm a aproximadamente 300 mm. En otro ejemplo, el sustrato 26 es un molde que tiene un ancho que varía de aproximadamente 0,1 mm a aproximadamente 10 mm. Si bien se han proporcionado dimensiones ilustrativas, debe entenderse que puede usarse un sustrato 26 de cualesquiera dimensiones adecuadas. Para otro ejemplo, puede usarse un panel que es un soporte rectangular, que tiene un área de superficie mayor que una oblea redonda de 300 mm.

En el ejemplo ilustrado en la figura 2A, la celda de flujo 24 incluye canales de flujo 28. Aunque se muestran varios canales de flujo 28, debe entenderse que cualquier cantidad de canales 28 puede incluirse en la celda de flujo 24 (p. ej., un único canal 28, cuatro canales 28, etc.). En los ejemplos descritos en la presente memoria, cada canal de flujo 28 es un área definida entre dos superficies de secuenciación (p. ej., 30 y 30' o 32 y 32' o 31 y 31') y mediante dos sustratos unidos (p. ej., 26A y 26A' o 26B y 26B'). Los fluidos descritos en la presente memoria pueden introducirse y retirarse del uno o varias canales de flujo 28 a través de una o varias entradas y salidas, respectivamente. Cada canal de flujo 28 puede aislarse del otro canal de flujo 28 en una celda de flujo 24 de tal modo que el fluido introducido dentro de cualquier canal de flujo 28 particular no fluya dentro de ningún canal de flujo 28 adyacente.

Una porción del canal de flujo 28 puede definirse en el sustrato 26 usando cualquier técnica adecuada que depende, en parte, del material o materiales del sustrato 26. En un ejemplo, una porción del canal de flujo 28 se graba en un sustrato de vidrio 26. En otro ejemplo, una porción del canal de flujo 28 puede tener un patrón en una resina 36, 36' de un sustrato de varias capas 26B, 26B' usando fotolitografía, litografía de nanoimpresión, etc. Aún en otro ejemplo, un material separado (p. ej., el material 50 en la figura 2B y figura 2C y figura 2D) puede aplicarse al sustrato 26 de tal modo que el material separado defina al menos una porción de las paredes del canal de flujo 28.

En un ejemplo, el canal de flujo 28 tiene una configuración rectangular. La longitud y el ancho del canal de flujo 28 pueden ser más pequeños, respectivamente, que la longitud y el ancho del sustrato 26 de tal modo que la porción de la superficie de sustrato que rodea el canal de flujo 28 está disponible para unirse a otro sustrato 26. En algunos casos, el ancho de cada canal de flujo 28 puede ser de al menos aproximadamente 1 mm, al menos aproximadamente 2,5 mm, al menos aproximadamente 5 mm, al menos aproximadamente 7 mm, al menos aproximadamente 10 mm, o mayor. En algunos casos, la longitud de cada canal de flujo 28 puede ser de al menos aproximadamente 10 mm, al menos aproximadamente 25 mm, al menos aproximadamente 50 mm, al menos aproximadamente 100 mm, o mayor. El ancho y/o la longitud de cada canal de flujo 28 pueden ser mayores que, menores que o entre los valores especificados anteriormente. En otro ejemplo, el canal de flujo 28 es cuadrado (p. ej., de 10 mm x 10 mm).

La profundidad de cada canal de flujo 28 puede ser tan pequeña como un grosor de una monocapa, por ejemplo, cuando se usa impresión por microcontacto, aerosol o chorro de tinte para depositar un material separado (p. ej., material 50) que define las paredes del canal de flujo. Como otros ejemplos, la profundidad de cada canal de flujo 28 puede ser de aproximadamente 1 pm, aproximadamente 10 pm, aproximadamente 50 pm, aproximadamente 100 pm, o mayor. En un ejemplo, la profundidad puede variar de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 100 pm. En otro ejemplo, la profundidad es de aproximadamente 5 pm o menor. Debe entenderse que la profundidad de cada canal de flujo 28 es mayor que, menor que o entre los valores especificados anteriormente. La profundidad del canal de flujo 28 también puede variar a lo largo de la longitud y el ancho de la celda de flujo 24, p. ej., cuando se usa una superficie de secuenciación con patrones 32, 32' o 31, 31'.

La figura 2B ilustra una vista en sección transversal de la celda de flujo 24 que incluye superficies de secuenciación opuestas sin patrones 30, 30'. En un ejemplo, cada una de estas superficies 30, 30' puede prepararse en el sustrato 26A, 26A' y después los sustratos 26A, 26A' pueden unirse entre sí para formar un ejemplo de la celda de flujo 24. Puede usarse cualquier material de unión adecuado 50, tal como un adhesivo, un material absorbente de radiación que ayude a unir, etc., para unir los sustratos 26A, 26B entre sí.

En el ejemplo mostrado en la figura 2B, una porción del canal de flujo 28 se define en cada uno de los sustratos de una sola capa 26A, 26A'. Por ejemplo, cada sustrato 26A, 26A' puede tener una región cóncava 38, 38' definida en esta, donde pueden introducirse los componentes de la superficie de secuenciación 30, 30'. Debe entenderse que cualquier espacio dentro de la región cóncava 38, 38' no ocupado por los componentes de la superficie de secuenciación 30, 30' puede considerarse parte del canal de flujo 28.

Las superficies de secuenciación 30, 30' incluyen un hidrogel polimérico 40, 40', cebadores de amplificación 42, 42' unidos al hidrogel polimérico 40, 40', y sitios químicos de captura 44, 44'.

Un ejemplo del hidrogel polimérico 40, 40' incluye un copolímero de acrilamida, tal como poli(N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamida-co-acrilamida, PAZAM. PAZAM y algunas otras formas del copolímero de acrilamida están representadas por la siguiente estructura (I):

en donde:

RA se selecciona del grupo que consiste en azido, amino opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquino opcionalmente sustituido, halógeno, hidrazona opcionalmente sustituida, hidrazina opcionalmente sustituida, carboxilo, hidroxi, tetrazol opcionalmente sustituido, tetracina opcionalmente sustituida, óxido de nitrilo, nitrona, sulfato y tiol;

RB es H o alquilo opcionalmente sustituido;

RC, RD y RE se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H y alquilo opcionalmente sustituido; cada uno de los -(CH2)p- puede sustituirse opcionalmente;

p es un entero en el rango de 1 a 50;

n es un entero en el rango de 1 a 50.000; y

m es un entero en el rango de 1 a 100.000.

Un experto en la técnica reconocerá que el arreglo de las características “ n” y “ m” recurrentes en la estructura (I) es representativo, y las subunidades monoméricas pueden estar presentes en cualquier orden en la estructura del polímero (p. e., aleatorio, bloque, estampado o una combinación de estos).

El peso molecular de PAZAM y otras formas del copolímero de acrilamida pueden variar de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 1500 kDa o de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 1000 kDa, o pueden ser, en un ejemplo específico, de aproximadamente 312 kDa.

En algunos ejemplos, PAZAM y otras formas del copolímero de acrilamida son polímeros lineales. En algunos otros ejemplos, PAZAM y otras formas del copolímero de acrilamida son polímeros ligeramente reticulados.

En otros ejemplos, el hidrogel polimérico 40, 40' puede ser una variación de la estructura (I). En un ejemplo, la unidad de acrilamida puede reemplazarse por N,N-dimetilacrilamida

En este ejemplo, la unidad de acrilamida en la estructura (I) puede reemplazarse con

en donde RD, RE y RF son cada uno h o un alquilo C1-C6, y RG y RH son cada uno un alquilo C1-C6 (en lugar de H, como es el caso con la acrilamida). En este ejemplo, q puede ser un entero en el rango de 1 a 100.000. En otro ejemplo, la N,N-dimetilacrilamida puede usarse además de la unidad de acrilamida. En este ejemplo, la estructura (I) puede incluir

además de las características recurrentes de “ n” y “ m” , en donde RD, RE y RF son cada uno H o un alquilo C1-C6, y RG y RH son cada uno un alquilo C1-C6. En este ejemplo, q puede ser un entero en el rango de 1 a 100.000.

Como otro ejemplo del hidrogel polimérico 40, 40', la característica “ n” recurrente en la estructura (I) puede reemplazarse por un monómero que incluye un grupo azido heterocíclico que tiene la estructura (II):

en donde R1 es H o un alquilo C1-C6; R2 es H o un alquilo C1-C6; L es un enlazador que incluye una cadena lineal con 2 a 20 átomos seleccionados del grupo que consiste en carbono, oxígeno y nitrógeno, y 10 sustituyentes opcionales en el carbono y cualquier átomo de nitrógeno en la cadena; E es una cadena lineal que incluye 1 a 4 átomos seleccionados del grupo que consiste en carbono, oxígeno y nitrógeno, y sustituyentes opcionales en el carbono y cualquier átomo de nitrógeno en la cadena; A es una amida N sustituida con un H o un alquilo C1-C4 acoplado a N; y Z es un heterociclo que contiene nitrógeno. Los ejemplos de Z incluyen 5 a 10 miembros de anillo presentes como una sola estructura cíclica o una estructura condensada. Algunos ejemplos específicos de Z incluyen pirrolidinilo, piridinilo o pirimidinilo.

Aún como otro ejemplo, el hidrogel polimérico 40, 40' puede incluir una unidad recurrente de cada una de las estructuras (III) y (IV):

sustituido o fenilo opcionalmente sustituido; cada uno de R3a y R3b se selecciona independientemente de hidrógeno, un alquilo opcionalmente sustituido, un fenilo opcionalmente sustituido o un aralquilo C7-C14 opcionalmente sustituido; y cada uno de L1 y L2 se selecciona independientemente de un enlazador alquileno opcionalmente sustituido o un enlazador heteroalquileno opcionalmente sustituido.

Debe entenderse que pueden usarse otras moléculas para formar el hidrogel polimérico 40, 40' siempre que estén funcionalizadas para injertar cebadores oligonucleotídicos 42, 42' a este. Otros ejemplos de capas poliméricas adecuadas incluyen las que tienen una estructura coloidal, tal como agarosa; o una estructura de malla polimérica, tal como gelatina; o una estructura polimérica reticulada, tal como polímeros y copolímeros de poliacrilamida, acrilamida libre de silano (SFA, por sus siglas en inglés), o una versión azolificada de SFA. Los ejemplos de polímeros de poliacrilamida adecuados pueden sintetizarse a partir de acrilamida y un ácido acrílico o un ácido acrílico que contiene un grupo vinilo, o a partir de monómeros que forman reacciones de fotocicloadición [2+2]. Aun otros ejemplos de hidrogeles poliméricos 42 adecuados incluyen copolímeros mezclados de acrilamidas y acrilatos. En los ejemplos descritos en la presente memoria puede usarse una variedad de arquitecturas poliméricas que contienen monómeros acrílicos (p. ej., acrilamidas, acrilatos, etc.), tales como polímeros ramificados, que incluyen polímeros de estrella, polímeros en forma de estrella o de bloque de estrella, dendrímeros, y lo similar. Por ejemplo, los monómeros (p. ej., acrilamida, etc.) pueden incorporarse, ya sea aleatoriamente o en bloque, en las ramificaciones (brazos) de un polímero con forma de estrella.

Para introducir el hidrogel polimérico 40, 40' en las regiones cóncavas 38, 38', puede generarse una mezcla del hidrogel polimérico 40, 40' y aplicarse después a los sustratos respectivos 26A, 26A' (que tienen las regiones cóncavas 38, 38' definidas en estos). En un ejemplo, el hidrogel polimérico 40, 40' puede estar presente en una mezcla (p. ej., con agua o con etanol y agua). La mezcla puede aplicarse después a las superficies de sustrato respectivas (incluido en las regiones cóncavas 38, 38') usando revestimiento por centrifugación, o revestimiento por inmersión o inmersión, o flujo del material en presión positiva o negativa, u otra técnica adecuada. Estos tipos de técnicas depositan el hidrogel polimérico 40, 40' en los sustratos respectivos 26A, 26A' del sustrato (p. ej., en las regiones cóncavas 38, 38' y en las regiones intersticiales 46, 46' adyacentes a estos). Otras técnicas de depósito selectivo (p. ej., que implican una máscara, técnicas de impresión controlada, etc.) pueden usarse para depositar específicamente el hidrogel polimérico en las regiones cóncavas 38, 38' y no en las regiones intersticiales 46, 46'.

En algunos ejemplos, la superficie de sustrato (incluidas las regiones cóncavas 38, 38') puede activarse, y después la mezcla (incluido el hidrogel polimérico 40, 40' puede aplicarse a esta. En un ejemplo, puede depositarse un silano o derivado de silano (p. ej., norborneno silano) sobre la superficie de sustrato usando la deposición de vapor, revestimiento por centrifugación u otros métodos de deposición. En otro ejemplo, la superficie de sustrato puede exponerse a una incineración de plasma para generar el o los agentes activadores de superficie (p. ej., grupos -OH) que pueden adherirse al hidrogel polimérico 40, 40'.

Dependiendo de la química del hidrogel polimérico 40, 40', la mezcla aplicada puede exponerse a un proceso de curado. En un ejemplo, el curado puede tener lugar a una temperatura que varía de la temperatura ambiente (p. ej., aproximadamente 25 °C) a aproximadamente 95 °C durante un tiempo que varía de aproximadamente 1 milisegundo a aproximadamente varios días.

Después, puede realizarse el pulido para eliminar el hidrogel polimérico 40, 40' de las regiones intersticiales 46, 46' en el perímetro de las regiones cóncavas 38, 38' mientras se deja el hidrogel polimérico 40, 40' en la superficie de las regiones cóncavas 38, 38' al menos sustancialmente intacto.

Las superficies de secuenciación 30, 30' también incluyen los cebadores de amplificación 42, 42' unidos al hidrogel polimérico 40, 40'.

Puede realizarse un proceso de injerto para injertar los cebadores de amplificación 42, 42' en el hidrogel polimérico 40, 40' en las regiones cóncavas 38, 38'. En un ejemplo, los cebadores de amplificación 42, 42' pueden inmovilizarse en el hidrogel polimérico 40, 40' mediante la unión covalente de punto único o la interacción no covalente fuerte en o cerca del extremo 5' de los cebadores 42, 42'. La unión deja i) una porción específica de adaptador de los cebadores 42, 42' libre para hibridarse con su fragmento de ácido nucleico listo para la secuenciación cognada y ii) el grupo hidroxilo 3' libre para la extensión del cebador. Cualquier unión covalente o interacción no covalente fuerte adecuada conocida en la técnica puede usarse para este propósito. Los ejemplos de cebadores terminados que pueden usarse incluyen cebadores terminados en alquino (p. ej., que pueden unirse a una entidad de superficie azida del hidrogel polimérico 40, 40'), o cebadores terminados en azida (p. ej., que pueden unirse a una entidad de superficie en alquino del hidrogel polimérico 40, 40'), o cualquiera de los otros cebadores terminados descritos con referencia al soporte sólido agrupado 13.

Los ejemplos específicos de cebadores adecuados 42, 42' incluyen cebadores P5 y P7. Ambos cebadores P5 y P7 pueden injertarse en cada uno de los hidrogeles poliméricos 40, 40'.

En un ejemplo, el injerto puede implicar el flujo a través del depósito (p. ej., usando una tapa unida temporalmente), el revestimiento por inmersión, el revestimiento por rociado, la dispensación de charco, o mediante otro método adecuado que unirá el o los cebadores 42, 42' al hidrogel polimérico 40, 40'. Cada una de estas técnicas ilustrativas puede usar una solución o mezcla de cebador, que puede incluir el o los cebadores 42, 42', agua, un regulador y un catalizador. Con cualquiera de los métodos de injerto, los cebadores 42, 42' reaccionan con grupos reactivos del hidrogel polimérico 40, 40' en la región cóncava 38, 38' y no tienen afinidad por el sustrato circundante 26A, 26A'. Como tales, los cebadores 42, 42' se injertan selectivamente en el hidrogel polimérico 40, 40'.

En el ejemplo mostrado en la figura 2B, el sitio químico de captura 44, 44' incluye un agente químico de captura que se une a o se aplica en al menos una porción del hidrogel polimérico 40, 40'. Puede usarse cualquier ejemplo del agente químico de captura descrito en la presente memoria. Por ejemplo, el agente químico de captura puede ser un miembro de un par de unión, donde el otro miembro del par de unión se une al soporte sólido 12, 12'.

En algunos ejemplos, los grupos funcionales libres (p. ej., aquellos no unidos a los cebadores 42, 42') del hidrogel polimérico 40, 40' pueden funcionalizarse con el agente químico de captura de tal modo que varios sitios químicos de captura 44, 44' se forman a través de la superficie del hidrogel polimérico 40, 40'. En un ejemplo, los enlazadores de alquino-PEG-biotina o los grupos azida libres de alquino-biotina pueden unirse covalentemente a azidas libres en el hidrogel polimérico 40, 40' usando química clic. En otro ejemplo, los cebadores que son complementarios a los cebadores de amplificación 42, 42' pueden tener el agente químico de captura unido a estos. Estos cebadores complementarios pueden hibridarse a algunos de los cebadores de amplificación 42, 42' para formar el sitio químico de captura 44, 44'.

En otro ejemplo, el agente químico de captura puede depositarse en una ubicación deseable usando impresión por microcontacto, impresión en aerosol, etc. para formar el o los sitios químicos de captura 44, 44'. Aún en otro ejemplo, puede usarse una máscara (p. ej., un fotorresistor) para definir el espacio/ubicación donde se depositará el agente químico de captura y, por lo tanto, donde se formará el sitio químico de captura 44, 44'. Después, el agente químico de captura puede depositarse y la máscara puede eliminarse (p. ej., a través del levantamiento, disolución u otra técnica adecuada). En este ejemplo, el sitio químico de captura 44, 44’ puede incluir una monocapa o capa delgada del agente químico de captura.

La figura 2C ilustra una vista en sección transversal de la celda de flujo 24 que incluye superficies de secuenciación opuestas con patrones 32, 32'. En un ejemplo, cada una de estas superficies 32, 32' puede prepararse en el sustrato 26B, 26B' y después los sustratos 26B, 26B' pueden unirse entre sí (p. ej. mediante el material 50) para formar un ejemplo de la celda de flujo 24.

En el ejemplo mostrado en la figura 2C, la celda de flujo 24 incluye el sustrato de múltiples capas 26B, 26B’, cada uno que incluye el soporte 34, 34’ y el material con patrones 36, 36’ posicionado en el soporte 34, 34’. El material con patrones 36, 36’ define las depresiones 48, 48’ separadas por regiones intersticiales 46, 46’.

En el ejemplo mostrado en la figura 2C, el material con patrones 36, 36’ se ubica en el soporte 34, 34’. Debe entenderse que cualquier material que pueda depositarse selectivamente, o depositarse y realizar un patrón para formar las depresiones 48, 48’ y las regiones intersticiales 46, 46’ puede usarse para el material con patrones 36, 36’.

Como un ejemplo, un óxido inorgánico puede aplicarse selectivamente al soporte 34, 34’ por medio de deposición de vapor, impresión en aerosol o impresión por chorro de tinta. Los ejemplos de óxidos inorgánicos adecuados incluyen óxido de tántalo (p. ej., Ta2Os), óxido de aluminio (p. ej., Al2O3), óxido de silicio (p. ej., SiO2), óxido de hafnio (p. ej., HfO2), etc.

Como otro ejemplo, una resina puede aplicarse al soporte 34, 34’ y después realizarse un patrón. Las técnicas de deposición adecuadas incluyen deposición química de vapor, recubrimiento por inmersión, recubrimiento por inmersión, recubrimiento por inmersión, recubrimiento por inmersión, recubrimiento por aspersión, despacho por paleta, recubrimiento por aspersión ultrasónica, recubrimiento por cuchilla raspadora, impresión por aerosol, serigrafía, impresión por microcontacto, etc. Las técnicas de modelado adecuadas incluyen fotolitografía, litografía de nanoimpresión (NIL, por sus siglas en inglés), técnicas de estampado, técnicas de grabado en relieve, técnicas de moldeo, técnicas de micrograbado en relieve, técnicas de impresión, etc. Algunos ejemplos de resinas adecuadas incluyen una resina a base de resina de silsesquioxano oligomérica poliédrica (POSS, por sus siglas en inglés), una resina epoxi no POSS, una resina de poli(etilenglicol), una resina poliéter (p. ej., epoxis de anillo abierto), una resina acrílica, una resina de acrilato, una resina de metacrilato, una resina de fluoropolímero amorfa (p. ej., CYTOP® de Bellex) y combinaciones de estas.

Como se usa en la presente memoria, el término “ silsesquioxano oligomérico poliédrico” (comercialmente disponible como POSS® de Hybrid Plastics) se refiere a una composición química que es un intermedio híbrido (p. ej., RSiO15) entre el de sílice (SiO2) y silicona (R2SiO). Un ejemplo de silsesquioxano oligomérico poliédrico puede ser el descrito en Kehagias et al., Microelectronics Engineering 86 (2009), págs. 776-778. En un ejemplo, la composición es un compuesto de organosilicio con la fórmula química [RSiO3/2]n, donde los grupos R pueden ser iguales o diferentes. Los grupos R ilustrativos para silsesquioxano oligomérico poliédrico incluyen epoxi, azida/azido, un tiol, un poli(etilenglicol), un norborneno, una tetrazina, acrilatos y/o metacrilatos o también, por ejemplo, grupos alquilo, arilo, alcoxi y/o haloalquilo. La composición de resina descrita en la presente memoria puede comprender una o más estructuras de jaula o núcleo diferentes como unidades monoméricas. La estructura poliédrica puede ser una estructura Ts, tal como:

y representada por:

Esta unidad monomérica típicamente tiene ocho brazos de grupos funcionales Ri a R8.

La unidad monomérica puede tener una estructura tipo jaula con 10 átomos de silicio y 10 grupos R, denominados T10, tal como:

o puede tener una estructura tipo jaula con 12 átomos de silicio y 12 grupos R, denominados T12, tal como:

El material a base de silsesquioxano oligomérico poliédrico puede incluir, alternativamente, estructuras de jaula Te, T14 o T16. El contenido de la jaula promedio puede ajustarse durante la síntesis y/o controlarse mediante métodos de purificación, y una distribución de tamaños de jaula de la unidad o las unidades monoméricas puede usarse en los ejemplos descritos en la presente memoria.

En algunos de los ejemplos de silsesquioxano oligomérico poliédrico descritos en la presente memoria, al menos uno de R1 a R8 o R10 o R12 comprende un epoxi. R1 a R8 o R10 o R12 pueden ser o no ser iguales y, en algunos ejemplos, al menos uno de R1 a R8 o R10 o R12 comprende epoxi y al menos otro de R1 a R8 o R10 o R12 es un grupo funcional no epoxi. El grupo funcional no epoxi puede ser (a) un grupo reactivo que es ortogonalmente reactivo a un grupo epoxi (es decir, reacciona en condiciones diferentes de un grupo epoxi), que sirve como mango para acoplar la resina a un cebador de amplificación, un polímero o un agente de polimerización; o (b) un grupo que ajusta las propiedades mecánicas o funcionales de la resina, p. ej., ajustes de energía superficial. En algunos ejemplos, el grupo funcional no epoxi se selecciona del grupo que consiste en una azida/azido, un tiol, un poli(etilenglicol), un norborneno, una tetrazina, un amino, un hidroxilo, un alquinilo, una cetona, un aldehído, un grupo éster, un alquilo, un arilo, un alcoxi y un haloalquilo.

Como se muestra en la figura 2C, el material con patrones 36, 36' incluye las depresiones 48, 48' definidas respectivamente en este, y las regiones intersticiales 46, 46' que separan las depresiones adyacentes 48, 48'. Pueden contemplarse muchas disposiciones diferentes de las depresiones 48, 48' que incluyen patrones regulares, repetitivos y no regulares. En un ejemplo, las depresiones 48, 48' se disponen en una cuadrícula hexagonal para un empaquetamiento compacto y densidad mejorada. Otras disposiciones pueden incluir, por ejemplo, disposiciones rectilíneas (rectangulares), disposiciones triangulares, etc. En algunos ejemplos, la disposición o patrón pueden ser un formato x-y de las depresiones 48, 48' que están en filas y columnas. En algunos otros ejemplos, la disposición o patrón puede ser un arreglo repetido de las depresiones 48, 48' y/o regiones intersticiales 46, 46'. En aún otros ejemplos, la disposición o patrón puede ser un arreglo aleatorio de las depresiones 48, 48' y/o regiones intersticiales 46, 46'. El patrón puede incluir puntos, rayas, remolinos, líneas, triángulos, rectángulos, círculos, arcos, chalecos, planos, diagonales, flechas, cuadrados y/o tramas cruzadas.

La disposición o patrón de las depresiones 48, 48' puede caracterizarse con respecto a la densidad de las depresiones 48, 48' (p. ej. cantidad de depresiones 48, 48') en un área definida. Por ejemplo, las depresiones 48, 48' pueden estar presentes a una densidad de aproximadamente 2 millones por mm2. La densidad puede ajustarse a densidades diferentes que incluyen, por ejemplo, una densidad de aproximadamente 100 por mm2, aproximadamente 1000 por mm2, aproximadamente 0,1 millón por mm2, aproximadamente 1 millón por mm2, aproximadamente 2 millones por mm2, aproximadamente 5 millones por mm2, aproximadamente 10 millones por mm2, aproximadamente 50 millones por mm2, o más, o menos. Debe entenderse además que la densidad de las depresiones 48, 48' en el material con patrón 36, 36' puede estar entre uno de los valores inferiores y uno de los valores superiores seleccionados de los rangos anteriores. Como ejemplos, un arreglo de alta densidad puede caracterizarse por tener depresiones 48, 48' separadas por menos de aproximadamente 100 nm, un arreglo de densidad media puede caracterizarse por tener depresiones 48, 48' separadas por aproximadamente 400 nm a aproximadamente 1 pm, y un arreglo de baja densidad puede caracterizarse por tener depresiones 48, 48' separadas por más de aproximadamente 1 pm. Si bien se han proporcionado densidades ilustrativas, debe entenderse que puede usarse cualquier densidad adecuada. La densidad de las depresiones 48, 48' puede depender, en parte, de la profundidad de las depresiones 48, 48'. En algunos casos, puede ser deseable que la separación entre las depresiones 48, 48' sea aún mayor que los ejemplos enumerados en la presente memoria.

La disposición o patrón de las depresiones 48, 48' puede también o alternativamente caracterizarse en términos del paso promedio, o el espaciado desde el centro de la depresión 48, 48' hasta el centro de una depresión adyacente 48, 48' (espaciamiento de centro a centro) o desde el borde izquierdo de una depresión 48, 48' hasta el borde derecho de una depresión adyacente 48, 48' (separación de borde a borde). El patrón puede ser regular, de tal modo que el coeficiente de variación alrededor del paso promedio es pequeño, o el patrón puede ser no regular, en cuyo caso el coeficiente de variación puede ser relativamente grande. En cualquier caso, el paso promedio puede ser, por ejemplo, aproximadamente 50 nm, aproximadamente 0,1 pm, aproximadamente 0,5 pm, aproximadamente 1 pm, aproximadamente 5 pm, aproximadamente 10 pm, aproximadamente 100 pm, o más o menos. El paso promedio para un patrón particular de depresiones 48, 48' puede estar entre uno de los valores inferiores y uno de los valores superiores seleccionados de los rangos anteriores. En un ejemplo, las depresiones 48, 48' tienen un paso (espaciado centro a centro) de aproximadamente 1,5 pm. Si bien se han provisto valores ilustrativos de paso promedio, debe entenderse que pueden usarse otros valores promedio de paso.

El tamaño de cada depresión 48, 48' puede caracterizarse por su volumen, área de abertura, profundidad y/o diámetro.

Cada depresión 48, 48' puede tener cualquier volumen que sea capaz de confinar al menos parte del fluido que se introduce en la celda de flujo 24. El volumen mínimo o máximo puede seleccionarse, por ejemplo, para acomodar la productividad (p. ej., multiplexación), resolución, nucleótidos o reactividad de analitos esperada para usos secuencia abajo de la celda de flujo 24. Por ejemplo, el volumen puede ser al menos aproximadamente 1*10-3pm3, al menos aproximadamente 1*10-2pm3, al menos aproximadamente 0,1 pm3, al menos aproximadamente 1 pm3, al menos aproximadamente 10 pm3, al menos aproximadamente 100 pm3, o más. Alternativa o adicionalmente, el volumen puede ser como máximo aproximadamente 1*104 pm3, como máximo aproximadamente 1*103 pm3, como máximo aproximadamente 100 pm3, como máximo aproximadamente 10 pm3, como máximo aproximadamente 1 pm3, como máximo aproximadamente 0,1 pm3, o menor.

El área ocupada por cada abertura de depresión puede seleccionarse en función de criterios similares a los expuestos anteriormente para el volumen. Por ejemplo, el área para cada abertura de depresión puede ser al menos aproximadamente 1*10-3 pm2, al menos aproximadamente 1*10-2 pm2, al menos aproximadamente 0,1 pm2, al menos aproximadamente 1 pm2, al menos aproximadamente 10 pm2, al menos aproximadamente 100 pm2, o más. Alternativa o adicionalmente, el área puede ser como máximo aproximadamente 1*103 pm2, como máximo aproximadamente 100 pm2, como máximo aproximadamente 10 pm2, como máximo aproximadamente 1 pm2, como máximo aproximadamente 0,1 pm2, como máximo aproximadamente 1*10-2 pm2, o menor. El área ocupada por cada abertura de depresión puede ser mayor, menor o encontrarse entre los valores especificados anteriormente.

La profundidad de cada depresión 48, 48' puede ser lo suficientemente grande para alojar parte del hidrogel polimérico 40, 40'. En un ejemplo, la profundidad puede ser al menos aproximadamente 0,1 pm, al menos aproximadamente 0,5 pm, al menos aproximadamente 1 pm, al menos aproximadamente 10 pm, al menos aproximadamente 100 pm, o mayor. Alternativa o adicionalmente, la profundidad puede ser como máximo aproximadamente 1*103 pm, como máximo aproximadamente 100 pm, como máximo aproximadamente 10 pm, o menor. En otros ejemplos, la profundidad es de aproximadamente 0,4 pm. La profundidad de cada depresión 48, 48' puede ser mayor, menor o encontrarse entre los valores especificados anteriormente.

En algunos casos, el diámetro o longitud y ancho de cada depresión 48, 48' puede ser al menos aproximadamente 50 pm, al menos aproximadamente 0,1 pm, al menos aproximadamente 0,5 pm, al menos aproximadamente 1 pm, al menos aproximadamente 10 pm, al menos aproximadamente 100 pm, o más. Alternativa o adicionalmente, el diámetro o la longitud y el ancho pueden ser como máximo aproximadamente 1*103 pm, como máximo aproximadamente 100 pm, como máximo aproximadamente 10 pm, como máximo aproximadamente 1 pm, como máximo aproximadamente 0,5 pm, como máximo aproximadamente 0,1 pm, o menos (p. ej., aproximadamente 50 nm). En algunos ejemplos, el diámetro o la longitud y el ancho son aproximadamente 0,4 pm. El diámetro o longitud y ancho de cada depresión 48, 48' pueden ser mayores, menores o encontrarse entre los valores especificados anteriormente.

En este ejemplo, al menos algunos de los componentes de la superficie de secuenciación 32, 32' pueden introducirse en las depresiones 48, 48'. Debe entenderse que cualquier espacio dentro de las depresiones 48, 48' no ocupado por los componentes de la superficie de secuenciación 32, 32' puede considerarse parte del canal de flujo 28.

En el ejemplo mostrado en la figura 2C, el hidrogel polimérico 40, 40' se ubica dentro de cada una de las depresiones 48, 48'. El hidrogel polimérico 40, 40' puede aplicarse como se describe en referencia a la figura 2B, de tal modo que el hidrogel polimérico 40, 40' está presente en las depresiones 48, 48' y no está presente en las regiones intersticiales circundantes 46, 46'.

En el ejemplo mostrado en la figura 2C, los cebadores 42, 42' pueden injertarse al hidrogel polimérico 40, 40' dentro de cada una de las depresiones 48, 48'. Los cebadores 42, 42' pueden aplicarse como se describe con referencia a la figura 2B, y por lo tanto se injertarán al hidrogel polimérico 40, 40' y no a las regiones intersticiales circundantes 46, 46'.

En el ejemplo mostrado en la figura 2C, el sitio químico de captura 44, 44' incluye un agente químico de captura que se aplica en al menos algunas de las regiones intersticiales 46, 46'. Por ejemplo, el agente químico de captura puede depositarse en al menos algunas de las regiones intersticiales 46, 46' usando impresión por microcontacto, impresión en aerosol, etc. para formar el o los sitios químicos de captura 44, 44'. Aún en otro ejemplo, puede usarse una máscara (p. ej., un fotorresistor) para definir el espacio/ubicación donde se depositará el agente químico de captura y, por lo tanto, donde se formará el sitio químico de captura 44, 44'. Después, el agente químico de captura puede depositarse y la máscara puede eliminarse (p. ej., a través del levantamiento, disolución u otra técnica adecuada).

En otros ejemplos, el sitio químico de captura 44, 44' incluye un agente químico de captura que se une a grupos funcionales libres (p. ej., los que no se unen a los cebadores 42, 42') del hidrogel polimérico 40, 40'. En aún otros ejemplos, el sitio químico de captura 44, 44' incluye un agente químico de captura que se une a los cebadores que se hibridan a algunos de los cebadores de amplificación 42, 42'. En estos ejemplos, el sitio químico de captura 44, 44' estará presente en las depresiones 48, 48' y no en las regiones intersticiales 46, 46'.

Puede usarse cualquier ejemplo del agente químico de captura descrito en la presente memoria en el ejemplo mostrado en la figura 2C.

La figura 2D ilustra una vista en sección transversal de la celda de flujo 24 que incluye superficies de secuenciación opuestas con patrones 31, 31'. En un ejemplo, cada una de estas superficies 31, 31' puede prepararse en el sustrato 26B, 26B' y después los sustratos 26B, 26B' pueden unirse entre sí (p. ej. mediante el material 50) para formar un ejemplo de la celda de flujo 24. Cada uno de los sustratos de varias capas 26B, 26B' incluye el soporte 34, 34' y el material con patrones 36, 36' ubicado en el soporte 34, 34'. El material con patrones 36, 36' define las depresiones 48, 48' separadas por regiones intersticiales 46, 46'.

Las superficies de secuenciación opuestas 31, 31' no incluyen el hidrogel polimérico 40, 40' o los cebadores 42, 42'. Por el contrario, las superficies de secuenciación opuestas 31, 31' incluyen el sitio químico de captura 44, 44' ubicado en cada una de las depresiones 48, 48'. Los sitios químicos de captura respectivos 44, 44' son capaces de inmovilizar los soportes sólidos agrupados respectivos 13. Cada uno de los soportes sólidos agrupados introduce un grupo respectivo de cadenas plantilla 64 en cada una de las depresiones 48, 48'.

El sitio químico de captura 44, 44' en la figura 2D incluye cualquier ejemplo del agente químico de captura establecido en la presente memoria. En este ejemplo, el agente químico de captura química puede depositarse en las depresiones 48, 48' usando impresión por microcontacto, impresión en aerosol, etc. para formar el o los sitios químicos de captura 44, 44'. Aún en otro ejemplo, puede usarse una máscara (p. ej., un fotorresistor) para bloquear las regiones intersticiales 46, 46', de tal modo que el agente químico de captura se deposite en las depresiones 48, 48' y no en las regiones intersticiales 46, 46'. En este ejemplo, el agente químico de captura puede depositarse después y la máscara puede eliminarse (p. ej., a través del levantamiento, disolución u otra técnica adecuada).

Si bien no se muestra, otro ejemplo de la celda de flujo 24 combina la superficie sin patrones de la figura 2B con el sitio de captura 44, 44' de la figura 2D. En este ejemplo, las regiones cóncavas 38, 38' (similares a las mostradas en la figura 2B) pueden recubrirse con el agente químico de captura en lugar de recubrirse con el hidrogel polimérico 40, 40' y los cebadores 42, 42'. Como tal, los sitios químicos de captura 44, 44' pueden formarse a lo largo de todo el canal 28 en las regiones cóncavas 38, 38'. En este ejemplo, los sitios químicos de captura respectivos 44, 44' son capaces de inmovilizar soportes sólidos agrupados 13 en una distribución aleatoria a lo largo de las superficies de secuenciación opuestas.

Como se muestra en la figura 2B a la figura 2D, los sustratos 26A y 26A' o 26B y 26B' se unen entre sí de tal modo que las superficies de secuenciación 30 y 30' o 32 y 32' o 31 y 31' se orientan entre sí con el canal de flujo 28 definido entre estos.

Los sustratos 26A y 26A' o 26B y 26B' pueden unirse entre sí en algunas o todas las regiones intersticiales 46, 46'. El enlace que se forma entre los sustratos 26A y 26A' o 26B y 26B' puede ser un enlace químico, o un enlace mecánico (p. ej. usando un sujetador, etc.).

Cualquier técnica adecuada, tal como unión láser, unión por difusión, unión anódica, unión eutéctica, unión por activación de plasma, unión por frita de vidrio u otros métodos conocidos en la técnica puede usarse para unir los sustratos 26A y 26A' o 26B y 26B' entre sí. En un ejemplo, puede usarse una capa separadora (p. ej., material 50) para unir los sustratos 26A y 26A' o 26B y 26B'. La capa separadora puede ser cualquier material 50 que sellará al menos alguna porción de los sustratos 26A y 26A' o 26B y 26B' entre sí. En algunos ejemplos, la capa separadora puede ser un material que absorbe la radiación que ayuda a unir.

Método y kit con múltiples fluidos

Un ejemplo del método que usa una combinación de fluidos que tienen densidades diferentes se muestra en la figura 3A y la figura 3B.

El método generalmente incluye inmovilizar un material diana 11 (tal como los complejos 10A, 10B, soportes sólidos agrupados 13) en cada una de las dos superficies de secuenciación opuestas 30, 30' o 32, 32' o 31, 31' de una celda de flujo 24 al introducir un primer fluido 52 (figura 3A), que incluye una primera porción del material diana 11 en esta, en la celda de flujo 24, por el cual al menos parte del material diana 11 se inmoviliza por los sitios de captura 44, 44' en un 30 o 30', o 32 o 32', o 31 o 31' de las dos superficies de secuenciación opuestas 30, 32 o 30', 32', o 31, 31'; eliminar el primer fluido y cualquier material diana no inmovilizado de la celda de flujo 24; e introducir un segundo fluido 54 (figura 3b ), que incluye una segunda porción del material diana 11 en este, en la celda de flujo 24, por el cual al menos parte del material diana 11 se inmoviliza por sitios de captura 44, 44' en otra 30' o 30, o 32' o 32, o 31' o 31 de las dos superficies de secuenciación opuestas 30, 32 o 30', 32', o 31, 31'; en donde uno de: el primer fluido 52 tiene una densidad menor que una densidad del material diana 11 y el segundo fluido 54 tiene una densidad mayor que la densidad del material diana 11; o el segundo fluido 54 tiene la densidad menor que la densidad del material diana 11 y el primer fluido 52 tiene la densidad mayor que la densidad del material diana 11.

Antes de realizar el método mostrado en la figura 3A y la figura 3B, el material diana 11 puede prepararse u obtenerse.

En un ejemplo, los complejos 10A o 10B pueden prepararse usando una muestra de ácido nucleico y un fluido de preparación de genoteca que incluye una pluralidad de soportes sólidos 12, 12' en estos. En algunos ejemplos, cada uno de los soportes sólidos 12, 12' en el fluido de preparación de genoteca puede tener, por ejemplo, adaptadores (tales como adaptadores 18) y complejos de transposoma unidos a estos, como se describe con referencia a la figura 1A. El etiquetado y la preparación de genotecas pueden realizarse como se define en la figura 1A para formar los complejos 10A. La muestra de ácido nucleico, los soportes sólidos 12, 12', los adaptadores-Y parciales y la enzima transposasa pueden estar contenidos en fluidos separados hasta que sea preferible formar los complejos 10A. En otros ejemplos, cada uno de los soportes sólidos 12, 12' en el fluido de preparación de la genoteca puede tener, por ejemplo, oligonucleótidos unidos a estos. En algunos ejemplos, la preparación de la genoteca de nucleótidos libre de PCR puede tener lugar separadamente de los soportes sólidos 12, 12' y después los fragmentos de la genoteca preparados pueden hibridarse a los oligonucleótidos en la superficie de los soportes sólidos 12, 12', como se describe con referencia a la figura 1B. Pueden usarse otros ejemplos de preparación de genotecas (p. ej., que incluyen PCR), siempre que los fragmentos se desnaturalicen en fragmentos monocatenarios antes de hibridizarse con los oligos de los soportes sólidos 12, 12'.

En otro ejemplo, los soportes sólidos agrupados 13 pueden prepararse al amplificar un fragmento de genoteca en presencia de una pluralidad de soportes sólidos 12, 12' funcionalizados con los cebadores 42, 42'.

El material diana 11 (p. ej., complejos 10A o 10B, o cualquier otro soporte sólido 12, 12' que tenga fragmentos listos para la secuenciación 14, 14' unidos a este, o soportes sólidos agrupados 13) puede dividirse en primera y segunda porciones. La primera porción del material diana 11 puede incorporarse en el primer fluido 52 y la segunda porción del material diana 11 puede introducirse en el segundo fluido 54.

El primer y segundo fluido 52, 54 tiene densidades diferentes. En un ejemplo, el primer fluido 52 tiene una densidad menor que una densidad del material diana 11 y el segundo fluido 54 tiene una densidad mayor que la densidad del material diana 11. En un ejemplo específico, el primer fluido 52 tiene una densidad menor que una densidad del soporte sólido 12, 12' de los complejos 10A o 10B o soporte sólido agrupado 13 y el segundo fluido 54 tiene una densidad mayor que la densidad del soporte sólido 12, 12' de los complejos 10A o 10B o soporte sólido agrupado 13. En otro ejemplo, el segundo fluido 54 tiene la densidad menor que la densidad del material diana 11 y el primer fluido 52 tiene la densidad mayor que la densidad del material diana 11. En otro ejemplo específico, el segundo fluido 54 tiene una densidad menor que la densidad del soporte sólido 12, 12' de los complejos 10A o 10B o soporte sólido agrupado 13 y el primer fluido 52 tiene una densidad mayor que la densidad del soporte sólido 12, 12' de los complejos 10A o 10B o soporte sólido agrupado 13. Como tal, la densidad de cada uno de los fluidos 52, 54 depende del material diana 11 que se usa. En algunos ejemplos, la densidad de los complejos 10A o 10B o soporte sólido agrupado 13 es aproximadamente igual a la densidad del soporte sólido 12, 12' usado en el complejo 10A o 10B o el soporte sólido agrupado 13 y por lo tanto en los ejemplos específicos que se proporcionan, la densidad de cada uno de los fluidos 52, 54 depende del soporte sólido 12, 12' que se usa en el material diana 11.

Las densidades del fluido 52, 54 pueden medirse a una temperatura de captura del material diana 11 (p. ej., complejo 10A, 10B o soporte sólido agrupado 13) que se introduce en la celda de flujo 24. En un ejemplo, la temperatura de captura varía de aproximadamente 18 °C a aproximadamente 40 °C.

En un ejemplo, la densidad de uno de los fluidos 52 o 54 en la temperatura de captura es al menos 0,1 g/cm3 menor que la densidad del material diana 11 (p. ej., el soporte sólido 12, 12' de los complejos 10A o 10B o soporte sólido agrupado 13) en la temperatura de captura, y la densidad del otro de los fluidos 54 o 52 en la temperatura de captura es al menos 0,1 g/cm3 mayor que la densidad del material diana 11 (p. ej., el soporte sólido 12, 12' de los complejos 10A o 10B o soporte sólido agrupado 13) en la temperatura de captura. En un ejemplo específico, cuando la densidad del material diana (p. ej., soporte sólido 12, 12') es X g/cm3,la densidad de uno de los fluidos 52 o 54 en la temperatura de captura es X g/cm3 - 0,1 g/cm3, y la densidad del otro de los fluidos 54 o 52 en la temperatura de captura es X g/cm3 0,1 g/cm3.

Además de tener las densidades respectivas, los fluidos 52, 54 también deben ser compatibles con el material diana 11. Cuando se usan los complejos 10A, 10B, los fluidos 52, 54 deben ser compatibles con los complejos 10A, 10B y las superficies de secuenciación 30, 30' o 32, 32' o 31,31' de tal modo que los fragmentos 14, 14', 14” y los cebadores 42, 42' no se vean afectados perjudicialmente. Cuando se usan soportes sólidos agrupados 13, los fluidos 52, 54 deben ser compatibles con el soporte sólido agrupado 13 de tal modo que las cadenas plantilla 64 no se vean perjudicialmente afectadas.

El fluido de menor densidad 52 o 54 puede ser cualquier solución reguladora acuosa (p. ej., un ácido débil y una de sus sales (base conjugada) o una base débil y una de sus sales (ácido conjugado). La concentración de sal en la solución reguladora acuosa puede ajustarse de tal modo que la densidad del fluido de menor densidad 52 o 54 sea menor que la densidad del material diana 11 (p. ej., la densidad del soporte sólido 12, 12' de los complejos 10A, 10B 0 soportes sólidos agrupados 13). Cuanto mayor es la diferencia de densidad entre el material diana 11 y el fluido de menor densidad 52 o 54, más rápido es el tiempo de asentamiento del material diana 11 (p. ej., complejos 10A, 10B o soportes sólidos agrupados 13) en el fluido de menor densidad 52 o 54. Como ejemplos, el fluido de menor densidad 52 o 54 puede ser un regulador Tris-HCl o un regulador de citrato de sodio de solución salina (SSC) 0,5x. En un ejemplo, el fluido de menor densidad 52 o 54 es una solución reguladora acuosa que tiene una densidad de aproximadamente 1 g/cm3. Este fluido de menor densidad 52 o 54 puede ser particularmente adecuado para usar con un material diana 11 que tiene una densidad de aproximadamente 1,18 g/cm3.

El fluido de mayor densidad 54 o 52 puede ser una solución salina acuosa. La sal seleccionada debe volver el fluido 52 o 54 “ pesado” y tampoco debe afectar perjudicialmente el material diana. Cuando se usan los complejos 10A, 10B, la sal no debe afectar perjudicialmente los complejos 10A, 10B o los cebadores 42, 42'. Cuando se usan soportes sólidos agrupados 13, la sal no debe afectar perjudicialmente las cadenas plantilla 64. La concentración de sal en la solución reguladora acuosa puede ajustarse de tal modo que la densidad del fluido de mayor densidad 54 o 52 sea mayor que la densidad del material diana 11. Los ejemplos del fluido de mayor densidad 54 o 52 incluyen soluciones de politungstato sódico y soluciones de cloruro de sodio. En un ejemplo, el fluido de mayor densidad 54 o 52 es una solución de politungstato de sodio que tiene una densidad que varía de aproximadamente 2 g/cm3 a aproximadamente 3 g/cm3. Estos fluidos de mayor densidad 54 o 52 pueden ser particularmente adecuados para usar con un material diana 11 que tiene una densidad de aproximadamente 1,18 g/cm3. En estos ejemplos, la solución de politungstato de sodio tiene una concentración que varía de aproximadamente 1 gramo de politungstato sódico por 1 mililitro de agua a aproximadamente 2,52 gramos de politungstato sódico por 1 mililitro de agua. En otro ejemplo, una solución de cloruro de sodio al 25 % (p/v) tiene una densidad de aproximadamente 1,2 g/cm3.

En un ejemplo, el primer o segundo fluido 52 o 54 que tiene la densidad menor que la densidad del material diana es una solución reguladora acuosa, y el segundo o primer fluido 54 o 52 que tiene la densidad mayor que la densidad del material diana es una solución de politungstato de sodio o una solución de cloruro de sodio. En otro ejemplo, la densidad del primer o segundo fluido 52 o 54 que es menor que la densidad del material diana es aproximadamente 1 g/cm3 en una temperatura de captura, y en donde la densidad del segundo o primer fluido 54 o 52 que es mayor que la densidad del material diana es aproximadamente 2 g/cm3 en la temperatura de captura.

Como se muestra en la figura 3A, un ejemplo del método implica introducir el primer fluido 52 que incluye parte del material diana 11 (p. ej., complejos 10A en la figura 3A) en la celda de flujo 24. En este ejemplo, el primer fluido 52 tiene una densidad menor que la densidad del soporte sólido 12, 12' de los complejos 10A y por lo tanto los complejos 10A migran o se asientan en la superficie de secuenciación inferior 30'. Los sitios de captura 44' (no se muestran en la figura 3A) inmovilizan al menos algunos de los complejos 10A en la superficie inferior de secuenciación 30'.

Debe entenderse que algunos complejos 10A (u otro material diana 11) en el primer fluido 52 pueden no asentarse, y estos complejos 10A (u otro material diana) se retirarán de la celda de flujo 24 antes del procesamiento posterior. Puede dejarse pasar un tiempo predeterminado antes de retirar el primer fluido 52 y cualquier material diana no inmovilizado (p. ej., complejos 10A) de la celda de flujo 24. En un ejemplo, el tiempo predeterminado puede variar de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 30 minutos para obtener una cantidad deseable de complejos inmovilizados 10A u otro material diana 11. También pueden usarse tiempos de incubación más largos.

Después, este método ilustrativo incluye eliminar por lavado el primer fluido 52 y el material diana no inmovilizado 11 (p. ej., complejos 10A) de la celda de flujo 24. El lavado puede implicar introducir un fluido de lavado en la celda de flujo 24. El flujo puede empujar cualquier complejo 10A (u otros materiales diana 11) que no se haya asentado y se haya inmovilizado en la superficie de secuenciación 30' hacia afuera a través de un puerto de salida de la celda de flujo 24. El mecanismo de inmovilización (p. ej., par de unión, hibridación, enlace covalente, etc.) entre los complejos 10A (u otros materiales diana 11) y los sitios de captura 44' de la superficie de secuenciación 30' puede evitar que cualquier complejo 10A asentado e inmovilizado (u otros materiales diana inmovilizados 11) se convierta en parte del flujo de salida. Además, el material diana 11 (p. ej., complejos 10A en la figura 3A) inmovilizado en una de las dos superficies de secuenciación opuestas (p. ej., superficie de secuenciación 30' en la figura 3A) permanece inmovilizado en esa superficie de secuenciación cuando se introduce el segundo fluido 54.

Como se muestra en la figura 3B, este ejemplo del método implica introducir el segundo fluido 54 que incluye algún otro material diana 11 (p. ej., complejos 10A) en la celda de flujo 24. En este ejemplo, el segundo fluido 54 tiene una densidad mayor que la densidad del soporte sólido 12, 12' de los complejos 10A (u otro material diana 11) y por lo tanto los complejos 10A migran hacia la superficie superior de secuenciación 30. Los sitios de captura 44 (no se muestran en la figura 3B) inmovilizan al menos algunos de los complejos 10A en la superficie de secuenciación 30.

Antes de realizar la siembra, amplificación, y secuenciación o secuenciación (como se describe a continuación), este método ilustrativo puede incluir adicionalmente eliminar el segundo líquido 54 y el material diana no inmovilizado 11 de la celda de flujo 24. Como tal, este método ilustrativo después puede incluir eliminar por lavado el segundo fluido 54 y el material diana no atrapado 11 (p. ej., complejos 10A no inmovilizados) de la celda de flujo 24. El lavado puede realizarse como se describe en la presente memoria. El flujo puede empujar cualquier complejo 10A (u otros materiales diana 11) que no se haya inmovilizado en la superficie superior de secuenciación 30 hacia afuera a través de un puerto de salida de la celda de flujo 24. Debe entenderse que el mecanismo de inmovilización (p. ej., par de unión, hibridación, enlace covalente, etc.) entre los complejos 10A (u otros materiales diana 11) y los sitios de captura 44, 44' respectivos de las superficies de secuenciación 30, 30' pueden evitar que cualquier complejo 10A inmovilizado (u otros materiales diana inmovilizados 11) se convierta en parte del flujo de salida.

Cuando se usan los complejos 10A o 10B, esta etapa de lavado puede estar seguida por la liberación y amplificación de fragmentos de genoteca (p. ej., un ejemplo de los que se describen con referencia a las figuras 9A a la figura 9C). Cuando se usan soportes sólidos agrupados 13, esta etapa de lavado puede estar seguida de secuenciación.

Si bien el ejemplo mostrado en la figura 3A y la figura 3B ilustra la introducción del fluido de menor densidad y después del fluido de mayor densidad, debe entenderse que el fluido de mayor densidad puede introducirse primero para inmovilizar el material diana 11 en la superficie superior de secuenciación 30, y después el fluido de menor densidad puede introducirse para inmovilizar el material diana 11 en la superficie inferior/de fondo de secuenciación 30'. Además, debe entenderse que este método puede realizarse con cualquier ejemplo de la celda de flujo 24 descrito en la presente memoria, que incluye aquellos con las superficies con patrones 32, 32'. Cuando se usan los soportes sólidos agrupados 13, puede usarse una celda de flujo 24 sin los cebadores de amplificación 42, 42', tal como la ilustrada y descrita con referencia a la figura 2D.

Un kit para realizar el método descrito con referencia a las figuras 3A y 3B puede incluir un fluido de preparación que incluye un material diana 11 en este; un primer fluido de introducción (p. ej., fluido 52 o 54) que tiene una densidad menor que una densidad del material diana 11; y un segundo fluido de introducción (fluido 54 o 52) que tiene una densidad mayor que la densidad del material diana 11. En un kit ilustrativo, el primer fluido de introducción es una solución reguladora acuosa, y el segundo fluido de introducción es una solución de politungstato de sodio o una solución de cloruro de sodio. En un ejemplo, cuando el segundo fluido de introducción es la solución de politungstato de sodio, la solución de politungstato de sodio tiene una concentración de aproximadamente 1 gramo de politungstato sódico por 1 mililitro de agua. En otro kit ilustrativo, la densidad del primer fluido de introducción en una temperatura de captura es al menos 0,1 g/cm3 menor que la densidad del material diana 11 en la temperatura de captura, y la densidad del segundo fluido de introducción en la temperatura de captura es al menos 0,1 g/cm3 mayor que la densidad del material diana 11 en la temperatura de captura. Aún en otro ejemplo, la densidad del primer fluido de introducción es de aproximadamente 1 g/cm3 en una temperatura de captura, y en donde la densidad del segundo fluido de introducción es de aproximadamente 2 g/cm3 en la temperatura de captura.

En algunos ejemplos, el fluido de preparación que incluye el material diana 11 incluye los soportes sólidos 12, 12', y el kit también puede incluir otros componentes de preparación de genoteca, tales como una muestra de ácido nucleico, adaptadores-Y parciales, enzimas transposasas, etc.; cada uno de los cuales puede estar contenido en un fluido separado hasta que sea deseable formar el material diana 11, tal como el complejo 10A, 10B, el soporte sólido agrupado 13, etc. Algunos ejemplos del kit también pueden incluir la celda de flujo 24. Otros ejemplos del kit pueden incluir fluidos de preparación que incluyen cualquier ejemplo del material diana 11 descrito en la presente memoria.

Métodos y kits con un fluido

Otros ejemplos del método descrito en la presente memoria usan un fluido durante la inmovilización del material diana 11. Algunos métodos usan un material diana 11 y diferentes modalidades para lograr la inmovilización a través de las superficies de secuenciación opuestas 30, 30' o 32, 32' o 31,31'. Otros métodos usan dos materiales diana diferentes 11 (cada uno con al menos una propiedad que es diferente entre sí) y las mismas o diferentes modalidades para lograr la inmovilización a través de las superficies de secuenciación opuestas 30, 30' o 32, 32' o 31, 31'. En la presente memoria se describen diferentes ejemplos con referencia a la figura 4A y figura 4B a la figura 8A y figura 8B.

Antes de realizar cualquiera de los métodos ilustrados en la figura 4A y figura 4B a la figura 8A y figura 8B, los complejos 10A o 10B o soportes sólidos agrupados 13 pueden prepararse como se describe en la presente memoria.

Los complejos 10A o 10B pueden prepararse usando una muestra de ácido nucleico y un fluido de preparación de genoteca que incluye una pluralidad de soportes sólidos magnéticos 12' en este. En algunos ejemplos, cada uno de los soportes sólidos magnéticos 12' en el fluido de preparación de genoteca puede tener, por ejemplo, adaptadores (tales como adaptadores 18) y complejos de transposoma unidos a estos, como se describe con referencia a la figura 1A. El etiquetado y la preparación de genotecas pueden realizarse como se define en la figura 1A para formar los complejos 10A. La muestra de ácido nucleico, los soportes sólidos magnéticos 12', los adaptadores-Y parciales y la enzima transposasa pueden estar contenidos en fluidos separados hasta que sea preferible formar los complejos 10A. En otros ejemplos, cada uno de los soportes sólidos magnéticos 12' en el fluido de preparación de la genoteca puede tener, por ejemplo, oligonucleótidos unidos a estos. En algunos ejemplos, la preparación de la genoteca de nucleótidos libre de PCR puede tener lugar separadamente de los soportes sólidos magnéticos 12' y después los fragmentos de la genoteca preparados pueden hibridarse a los oligonucleótidos en la superficie de los soportes sólidos magnéticos 12', como se describe con referencia a la figura 1B. Pueden usarse otros ejemplos de preparación de genotecas (p. ej., que incluyen PCR), siempre que los fragmentos se desnaturalicen en fragmentos monocatenarios antes de hibridizarse con los oligos de los soportes sólidos magnéticos 12'.

Los soportes sólidos agrupados 13 pueden prepararse al amplificar un fragmento de genoteca en presencia de una pluralidad de soportes sólidos 12, 12' funcionalizados con los cebadores 42, 42'.

Un ejemplo del método que usa un fluido, una fuerza magnética prácticamente uniforme y un material diana magnéticamente sensible, tal como el soporte sólido 12', se muestra en la figura 4A y la figura 4B. El método generalmente incluye inmovilizar un material diana 11 en cada una de las dos superficies de secuenciación opuestas 30, 30' o 32, 32' de una celda de flujo 24 al introducir un fluido 56, que incluye el material diana 11, en la celda de flujo 24, en donde el fluido 56 tiene una densidad aproximadamente equivalente a una densidad del soporte sólido magnético 12'; permitir que parte del material diana 11 se inmovilice por los sitios de captura 44 o 44' (no se muestran en la figura 4A) en un 30 o 30', o 32 o 32', o 31 o 31', de las dos superficies de secuenciación opuestas 30, 30' o 32, 32' o 31, 31'; y aplicar una fuerza magnética a otra 30' o 30, o 32' o 32, o 31' o 31 de las dos superficies de secuenciación opuestas 30, 30' o 32, 32' o 31, 31', lo que tira de este modo algún otro material diana 11 a la otra 30' o 30, o 32' o 32, o 31' o 31 de las dos superficies de secuenciación opuestas 30, 30' o 32, 32' o 31, 31' donde se inmovilizan por sitios de captura 44' o 44 (no se muestra en la figura 4B) en la otra de las dos superficies de secuenciación opuestas 30, 30' o 32, 32' o 31, 31'. Cuando los complejos 10A, 10B se usan y antes de realizar la siembra y amplificación (como se describe a continuación), este método ilustrativo puede incluir detener adicionalmente la aplicación de la fuerza magnética y eliminar el fluido y el material diana no inmovilizado de la celda de flujo 24. Estas etapas puede estar seguida por la liberación y amplificación de fragmentos de genoteca (p. ej., se describen con referencia a las figuras 9A a la figura 9C).

El material diana 11 (p. ej., complejos 10A, 10B, o cualquier otro soporte sólido magnético 12' que tenga fragmentos listos para la secuenciación 14, 14', 14", o soportes sólidos agrupados 13) unidos a este, puede incorporarse en el fluido 56. Como un ejemplo, de aproximadamente 25.000 materiales diana 11 (p. ej., complejos 10A, 10B o soportes sólidos agrupados 13) a aproximadamente 500.000 materiales diana 11 pueden incluirse en un microlitro de fluido. Como otro ejemplo, de aproximadamente 100.000 materiales diana 11 a aproximadamente 500.000 materiales diana 11 pueden incluirse en un microlitro de fluido. Pueden usarse otras concentraciones dependiendo del tamaño de la celda de flujo 24.

La densidad del fluido 56 puede medirse a una temperatura de captura de los materiales diana 11 que se introduce en la celda de flujo 24. En un ejemplo, la temperatura de captura varía de aproximadamente 18 °C a aproximadamente 40 °C.

El fluido 56 se selecciona para tener una densidad que es al menos aproximadamente equivalente a la densidad del soporte sólido magnético 12' del material diana 11. En estos ejemplos, “ al menos aproximadamente equivalente” significa que la densidad del fluido 56 está dentro de 0,08 g/cm3 de la densidad del soporte sólido magnético 12'. En algunos casos, las densidades del fluido 56 y los soportes sólidos magnéticos 12' son iguales. Al tener una densidad al menos aproximadamente equivalente con el soporte sólido magnético 12', el fluido 56 funciona como un agente flotante suave. Como se usa en la presente memoria, el término “ agente flotante suave” se refiere a un fluido en el cual el material diana 11 (p. ej., complejos 10A, 10B, soportes sólidos agrupados 13, etc.) es capaz de flotar por al menos algún período de tiempo antes de hundirse o asentarse. En el fluido 56, parte del material diana 11 comienza a hundirse y se inmoviliza a la superficie de secuenciación inferior/de fondo 30', 32', 31' en la celda de flujo 24, mientras que otro material diana 11 se mantiene a flote (al menos durante algún período de tiempo).

El fluido 56 puede ser cualquier solución reguladora acuosa. La concentración de sal en la solución reguladora acuosa puede ajustarse de tal modo que la densidad del fluido 56 sea al menos aproximadamente igual a la densidad del soporte sólido magnético 12'. En otras palabras, la concentración de sal en la solución reguladora acuosa puede ajustarse de tal modo que la densidad del fluido 56 esté dentro de /- 0,08 g/cm3 de la densidad del soporte sólido magnético 12'. Como ejemplos, el fluido 56 puede ser un regulador Tris-HCl o un regulador 0,5x de solución salina de citrato de sodio (SSC) o una solución de citrato de sodio de 75 mM (pH=7) que contiene aproximadamente 750 mM de NaCl. En un ejemplo, la densidad de cada soporte sólido magnético 12' y el fluido 56 es aproximadamente 1,1 g/cm3

Después de que el fluido 56 y el material diana 11 se introducen en la celda de flujo 24, el material diana 11 flota inicialmente en el fluido 56. A medida que pasa el tiempo, parte del material diana 11 se asentará en la superficie de secuenciación inferior/de fondo 30', 32', 31' donde se inmovilizará en el o los sitios de captura 44'. En la figura 4A se muestra un ejemplo, donde algunos de los complejos 10A se han asentado en la superficie de secuenciación inferior/de fondo 30'. El fluido 56 ayuda a evitar el asentamiento de todo el material diana 11 en la superficie de secuenciación inferior/de fondo 30', 32', 31' demasiado rápido.

Como tal, después de la introducción del fluido 56 y de la inmovilización de parte del material diana 11, hay tiempo para que una fuerza magnética aplicada externamente se aplique a las otras superficies de secuenciación 30, 32, 31 en la celda de flujo 24. La fuerza magnética atrae el material diana flotante 11 a la superficie de secuenciación superior/tope 30, 32, 31 en la celda de flujo 24. Un ejemplo se muestra en la figura 4B, donde algunos de los complejos 10A han migrado a la superficie de secuenciación superior/tope 30.

En este método ilustrativo, puede permitirse que un período de tiempo predeterminado pase entre la introducción del fluido 56 y la aplicación de la fuerza magnética. Esto puede ser deseable de tal modo que parte del material diana 11 se asiente y se inmovilice en una superficie de secuenciación 30', 32', 31' mientras que el material diana restante 11 se mantiene a flote en el fluido 56. En un ejemplo, este tiempo predeterminado puede variar de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 30 minutos. En algunos ejemplos, el período de tiempo predeterminado pasa entre la introducción del fluido 56 y la aplicación de la fuerza magnética, y el tiempo predeterminado varía de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 2 minutos.

Como se muestra en la figura 4B, la fuerza magnética se aplica después colocando un imán 58 en una superficie exterior 60 de la celda de flujo 24 que está adyacente a la superficie de secuenciación 30, 32. El imán 58 debe tener una fuerza de campo magnético que sea suficiente para atraer el material diana flotante 11 (p. ej., complejos 10A, 10B, soportes sólidos agrupados 13, etc.) sin atraer el material diana 11 que ya se inmoviliza en la superficie de secuenciación inferior/de fondo 30', 32', 31'. La fuerza del campo magnético es relativamente débil, pero se aplica al menos sustancialmente uniformemente a lo largo de toda la longitud y ancho del canal de flujo 28. Una fuerza de campo magnético relativamente débil puede variar de aproximadamente 1 mT (miliTesla) a aproximadamente 100 mT. En algunos ejemplos, la fuerza del campo magnético relativamente débil varía de aproximadamente 1 mT a aproximadamente 10 mT, o de aproximadamente 10 mT a aproximadamente 100 mT. Esto permite que el material diana flotante 11 se inmovilice para capturar los sitios 44 a través de la superficie superior/de tope de secuenciación 30, 32, 31. Los imanes más fuertes, tales como los imanes de neodimio, pueden usarse en algunos casos, y estos imanes tienen una intensidad de campo de aproximadamente 1 T (Tesla).

En un ejemplo, el imán 58 tiene la misma longitud y ancho que el canal de flujo 28 y/o la celda de flujo 24. En un ejemplo, el imán 58 es similar a un imán de refrigerador y tiene una fuerza de campo magnético de aproximadamente 5 mT. En otro ejemplo, el imán 58 es una tira elastomérica que tiene pequeñas partículas magnéticas incrustadas en esta. Estos tipos de imanes flexibles están comercialmente disponibles, por ejemplo, de Uline, Arnold Magnetic Technologies (FLEXMAG™), etc. En un ejemplo, la aplicación de la fuerza magnética implica colocar una tira elastomérica incrustada con partículas magnéticas en una superficie externa 60 de la celda de flujo 24 adyacente a la otra de las dos superficies de secuenciación opuestas (es decir, la superficie de secuenciación 30 que no tiene el material diana 11 inmovilizado en esta). En algunos ejemplos, el imán puede aplicarse manualmente. En otros ejemplos, la aplicación de la fuerza magnética puede automatizarse, p. ej., cuando se integra en el sistema de secuenciación.

El periodo de tiempo para la aplicación del imán 58 (y, por lo tanto, la fuerza magnética) depende, en parte, de la fuerza del imán y la concentración de los complejos 10A, 10B en el fluido 56. Como un ejemplo, el imán 58 puede aplicarse durante 5 segundos a aproximadamente 2 minutos. Entonces, los ejemplos del método incluyen detener la aplicación de la fuerza magnética. Esto puede lograrse al retirar el imán 58.

Debe entenderse que algunos materiales diana 11 (p. ej., complejos 10A, 10B, soportes sólidos agrupados 13) en el fluido 56 pueden no inmovilizarse en ninguna de las superficies de secuenciación 30, 30' o 32, 32' o 31, 31', y este material diana 11 puede eliminarse de la celda de flujo 24 antes del procesamiento posterior. Como tal, este método ilustrativo puede incluir eliminar por lavado el fluido 56 y el material diana no atrapado 11 de la celda de flujo 24. El lavado puede implicar introducir un fluido de lavado en la celda de flujo 24. El flujo puede empujar cualquier material diana 11 que no se haya inmovilizado en las superficies de secuenciación 30, 30' o 32, 32' o 31, 31' hacia afuera a través de un orificio de salida de la celda de flujo 24. El mecanismo de inmovilización (p. ej., par de unión, hibridación, enlace covalente, etc.) entre el material diana 11 y los sitios de captura 44, 44' de las superficies de secuenciación 30, 30' o 32, 32' o 31, 31' puede evitar que cualquier material diana inmovilizado 11 se convierta en parte del flujo de salida.

Si bien el ejemplo mostrado en la figura 4A y la figura 4B ilustra la celda de flujo 24 con superficies de secuenciación 30 y 30', debe entenderse que este método puede realizarse con cualquier ejemplo de la celda de flujo 24 descrito en la presente memoria, que incluye aquellos con la superficie de secuenciación con patrón 32, 32'. Cuando se usan los soportes sólidos agrupados 13 que incluyen soportes sólidos magnéticamente sensibles 12', puede usarse una celda de flujo 24 sin cebadores de amplificación 42, 42', tal como la ilustrada y descrita con referencia a la figura 2D. Además, cualquier otro material diana magnéticamente sensible puede usarse en este ejemplo del método.

Un kit para realizar el método descrito con referencia a las figuras 4A y 4B puede incluir un fluido de preparación que incluye una pluralidad de soportes sólidos magnéticos 12' en este; y un fluido de introducción (p. ej., fluido 56) que tiene una densidad aproximadamente equivalente a una densidad del soporte sólido magnético 12'. El kit también puede incluir otros componentes de preparación de genoteca, tales como una muestra de ácido nucleico, adaptadores-Y parciales, enzimas transposasas, etc.; cada uno de los cuales puede estar contenido en un fluido separado hasta que sea deseable formar el material diana 11, tal como el complejo 10A, 10B, soporte sólido agrupado 13, etc. Algunos ejemplos del kit también pueden incluir la celda de flujo 24. Aún otros ejemplos del kit pueden incluir una mezcla de amplificación que incluye una forma líquida de un material sensible a la temperatura.

Los métodos mostrados en la figura 5A y figura 5B, figura 6A y figura 6B, figura 7A y figura 7B, y figura 8A y figura 8B se describirán a continuación. Cada uno de estos métodos usa una combinación de materiales diana (p. ej., 11A y 11B, o 11C y 11D, etc.), y diferentes combinaciones de materiales diana se describen en mayor detalle con respecto a cada conjunto de figuras. Cada conjunto de figuras representa el método que se realiza con la celda de flujo 24 que tiene superficies de secuenciación sin patrones 30, 30'. Sin embargo, debe entenderse que cualquiera de estos métodos puede realizarse con cualquier ejemplo de la celda de flujo 24 descrita en la presente memoria, que incluye aquellos con las superficies con patrones 32, 32'. Adicionalmente, cuando los soportes sólidos agrupados 13 se usan como los materiales diana (p. ej., 11A y 11B, etc.), puede usarse una celda de flujo 24 sin cebadores de amplificación 42, 42', tal como la que se muestra y describe con referencia a la figura 2D.

Un ejemplo del método que usa una combinación de materiales diana 11A, 11B se muestra en la figura 5A y la figura 5B. En este ejemplo, los materiales diana 11A, 11B tienen densidades que son diferentes entre sí y diferentes de un fluido portador.

Este método ilustrativo generalmente incluye inmovilizar simultáneamente un primer material diana 11A en una primera 30 o 32 o 31 de dos superficies de secuenciación opuestas 30, 30', o 32, 32', o 31, 31' de una celda de flujo 24 y un segundo material diana 11B en una segunda 30' o 32' o 31' de las dos superficies de secuenciación opuestas 30, 30', o 32, 32', o 31, 31' al introducir, en la celda de flujo 24, de un fluido diana 56' que incluye el primer material diana 11A y el segundo material diana 11B, en donde el fluido portador del fluido diana 56' tiene una densidad de fluido; el primer material diana 11A tiene una primera densidad menor que la densidad del fluido; y el segundo material diana 11B tiene una segunda densidad mayor que la densidad del fluido.

La densidad del fluido portador del fluido diana 56' puede medirse en una temperatura de captura de los materiales diana 11A, 11B que se introducen en la celda de flujo 24. En un ejemplo, la temperatura de captura varía de aproximadamente 18 °C a aproximadamente 40 °C.

En un ejemplo, la densidad de uno de los materiales diana 11A es al menos 0,1 g/cm3 menor que la densidad del fluido portador en la temperatura de captura, y la densidad del otro de los materiales diana 11B es al menos 0,1 g/cm3 mayor que la densidad del fluido portador en la temperatura de captura. En un ejemplo específico, cuando la densidad del fluido portador es X g/cm3 en la temperatura de captura, la densidad de uno de los materiales diana 11A o 11B es X g/cm3 - 0,1 g/cm3, y la densidad del otro de los materiales diana 11B o 11A es X g/cm3 0,1 g/cm3.

El fluido portador del fluido diana 56' puede ser cualquiera de las soluciones reguladoras acuosas o soluciones salinas acuosas que se establecen en la presente memoria. La concentración de sal en la solución reguladora acuosa o solución salina acuosa puede ajustarse de tal modo que la densidad del fluido portador en la temperatura de captura esté entre las densidades respectivas de los materiales diana 11A, 11B. En otro ejemplo, el fluido portador del fluido diana 56' es un líquido iónico.

Los materiales diana 11A, 11B pueden ser complejos 10A, 10B o soportes sólidos agrupados 13. El soporte 12 para los materiales diana 11A, 11B puede ser cualquiera de los ejemplo establecidos en la presente memoria siempre que las densidades de los materiales respectivos 11A, 11B sean diferentes con respecto al fluido portador, como se describe en este método ilustrativo. La densidad del soporte sólido 12 en cada uno de los materiales diana 11A, 11B es al menos aproximadamente igual a la densidad del material diana respectivo 11A, 11B. Como tal, el soporte sólido 12 del material diana 11A se selecciona para tener una densidad menor que la densidad del fluido portador del fluido diana 56' a la temperatura de captura, y el soporte sólido 12 del material diana 11B se selecciona para tener una densidad mayor que la densidad del fluido portador del fluido diana 56' a la temperatura de captura.

Como se muestra en la figura 5A, este método implica introducir el fluido de destino 56' que incluye los materiales diana 11A, 11B en la celda de flujo 24. El fluido diana 56' puede dejarse incubar en la celda de flujo 24 durante un tiempo predeterminado. En un ejemplo, el tiempo predeterminado puede variar de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 30 minutos para obtener una cantidad deseable de materiales diana 11A, 11B en las superficies de secuenciación 30, 30'. También pueden usarse tiempos de incubación más largos.

Como se mencionó, el soporte sólido 12 del material diana 11A tiene una densidad menor que la densidad del fluido portador en la temperatura de captura y, por lo tanto, el material diana 11A migra o flota hacia la superficie superior de secuenciación 30, como se muestra en la figura 5B. Los sitios de captura 44 (que no se muestran en la figura 5B) inmovilizan al menos parte del material diana 11A en la superficie superior de secuenciación 30. Además, como también se mencionó, el soporte sólido 12 del material diana 11B tiene una densidad mayor que la densidad del fluido portador en la temperatura de captura y, por lo tanto, el material diana 11B migra o se asienta en la superficie inferior de secuenciación 30', como se muestra en la figura 5B. Los sitios de captura 44' (que tampoco se muestran en la figura 5B) inmovilizan al menos parte del material diana 11B en la superficie de secuenciación inferior/de fondo 30'.

La inmovilización de los materiales diana 11A, 11B ocurre simultáneamente después de la introducción del fluido diana 56' a la celda de flujo 24 debido a las diferentes densidades de los materiales diana 11A, 11B con respecto al fluido portador. Como tal, en el método de la figura 5A y la figura 5B, al menos parte del primer material diana 11A se inmoviliza por los sitios de captura respectivos 44 en la primera de las dos superficies de secuenciación opuestas 30, y al menos parte del segundo material diana 11B se inmoviliza por los sitios de captura respectivos 44' en la segunda de las dos superficies de secuenciación opuestas 30'.

Debe entenderse que algunos materiales diana 11A, 11B pueden no inmovilizarse, y estos materiales diana 11A, 11B se eliminarán de la celda de flujo 24 antes de otros procesos. Como tal, este método ilustrativo después incluye eliminar por lavado el fluido portador del fluido diana 56' y los materiales diana no inmovilizados 11A, 11B de la celda de flujo 24. El lavado puede implicar introducir un fluido de lavado en la celda de flujo 24. El flujo puede empujar cualquier material diana 11A, 11B que no se haya inmovilizado en las superficies de secuenciación 30, 30' hacia afuera a través de un puerto de salida de la celda de flujo 24. El mecanismo de inmovilización (p. ej., par de unión, hibridación, enlace covalente, etc.) entre los materiales diana respectivos 11A y 11B y los sitios de captura 44, 44' de las superficies de secuenciación 30, 30' pueden evitar que cualquier material diana inmovilizado 11A, 11B se convierta en parte del flujo de salida.

Cuando se usan los complejos 10A o 10B como los materiales diana 11A, 11B, esta etapa de lavado puede estar seguida por la liberación y amplificación de fragmentos de genoteca (p. ej., un ejemplo de los que se describen con referencia a las figuras 9A a la figura 9C). Cuando se usan soportes sólidos agrupados 13, esta etapa de lavado puede estar seguida de secuenciación.

Un kit para realizar el método descrito con referencia a las figuras 5A y 5B puede incluir el fluido diana 56', que incluye el fluido portador que tiene una densidad de fluido; un primer material diana 11A que tiene una primera densidad menor que la densidad del fluido; y un segundo material diana 11B que tiene una segunda densidad mayor que la densidad del fluido.

En algunos ejemplos, el primer y segundo materiales diana 11A, 11B son complejos 10A o 10B. En estos ejemplos, el primer material diana 11a incluye un primer soporte sólido 12 que tiene una densidad del primer soporte sólido aproximadamente igual a la primera densidad (es decir, menor que la densidad de fluido), y fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14', 14” unidos al primer soporte sólido 12; y el segundo material diana 11B incluye un segundo soporte sólido 12 que tiene una densidad del segundo soporte sólido aproximadamente igual a la segunda densidad (es decir, menor que la densidad de fluido), y fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14', 14” unidos al segundo soporte sólido 12;

En otros ejemplos, el primer y el segundo material diana 11A, 11B son soportes sólidos agrupados 13. En estos ejemplos, el primer material diana 11A incluye un primer soporte sólido 12 que tiene una densidad del primer soporte sólido aproximadamente igual a la primera densidad (es decir, menor que la densidad de fluido), y un primer grupo de cadenas plantilla 64 unido al primer soporte sólido 12; y el segundo material diana 11B incluye un segundo soporte sólido 12 que tiene una densidad del segundo soporte sólido aproximadamente igual a la segunda densidad (es decir, menor que la densidad de fluido), y un segundo grupo de cadenas plantilla 64 unido al segundo soporte sólido 12;

El kit puede incluir alternativamente el fluido portador, reactivos y materiales para preparar el material diana 11A, y reactivos y materiales para preparar el material diana 11B. En este ejemplo, los respectivos materiales diana 11A, 11B pueden prepararse usando los respectivos reactivos y materiales y como se describe en la presente memoria, y después pueden agregarse al fluido portador para formar el fluido diana 56'.

Otros ejemplos del método usan diferentes materiales diana y diferentes modalidades para inmovilizar los materiales diana. Estos ejemplos generalmente incluyen introducir el primer y segundo materiales diana a una celda de flujo 24 que incluye dos superficies de secuenciación opuestas 30, 30' o 32, 32' o 31, 31', en donde el primer material diana tiene al menos una propiedad que es diferente del segundo material diana, en donde al menos una propiedad se selecciona del grupo que consiste en densidad, carga, magnetismo, y combinaciones de estos; y exponer el primer y segundo materiales diana a al menos una condición, que provoca de este modo que el primer material diana se inmovilice por un sitio de captura 44 en una primera de las dos superficies de secuenciación opuestas 30, 32, o 31 y el segundo material diana se inmoviliza por un sitio de captura 44' en una segunda de las dos superficies de secuenciación opuestas 30', 32', 31'.

Un método ilustrativo se muestra en la figura 6A y la figura 6B. En este ejemplo, los materiales diana 11C, 11D tienen cargas opuestas.

Como se representa en la figura 6A, el primer material diana 11C tiene una carga negativa y el segundo material diana 11D tiene una carga positiva. En este ejemplo puede usarse cualquier ejemplo de los soportes sólidos con carga 12 descritos en la presente memoria. En un ejemplo, el primer material diana con carga negativa 11C se selecciona del grupo que consiste en un soporte sólido carboxilado, un soporte sólido recubierto con ácido poliglutámico y un soporte sólido funcionalizado con sulfato; y el segundo material diana con carga positiva 11D se selecciona del grupo que consiste en un soporte sólido funcionalizado con amina, tal como un soporte sólido funcionalizado con quitosana y un soporte sólido funcionalizado con polilisina.

Los materiales diana 11C, 11D pueden ser parte de un fluido 56” que se introduce en la celda de flujo 24. En este ejemplo, el fluido 56” usado para introducir los materiales diana cargados 11C, 11D a la celda de flujo 24 puede ser un electrolito. Como un ejemplo, el fluido 56” puede ser una combinación de tris(hidroximetil aminometano y ácido bórico presente en la misma molaridad (p. ej., 4,5 mM de cada uno). Cuando los complejos 10A, 10B se usan como los materiales diana 11C, 11D, puede usarse un regulador con bajo contenido de sal, tal como un regulador de solución salina-citrato de sodio (SSC) (p. ej., aproximadamente 45 mM) con aproximadamente 4 mM de Mg2+). Este tipo de fluido 56” puede maximizar cargas en los materiales diana cargados 11C, 11D, mientras que también permite la hibridación cuando se liberan los fragmentos de la genoteca 14, 14', 14'. Cuando los soportes sólidos agrupados 13 se usan como los materiales diana 11C, 11D, puede usarse agua como el fluido 56".

Además, la densidad del fluido 56" y los materiales diana 11C, 11D pueden ser aproximadamente iguales de tal modo que la densidad de los materiales diana 11C, 11D no interfiera con la migración inducida electrostáticamente de los materiales diana 11C, 11D. En otro ejemplo, la densidad del fluido 56” y los materiales diana 11C, 11D pueden no ser iguales. En este ejemplo, la resistencia de la fuerza debida al campo eléctrico aplicado 62 es mayor que cualquier fuerza debida a la diferencia de densidad.

En este método ilustrativo, la condición a la cual los materiales diana cargados 11C, 11D se exponen para iniciar la migración e inmovilización simultánea es un campo eléctrico 62 aplicado entre las dos superficies de secuenciación opuestas 30 y 30', 32 y 32', o 31 y 31' para generar cargas positivas 66 en la primera de las dos superficies de secuenciación opuestas 30, 32, 31 y cargas negativas 68 en la segunda de las dos superficies de secuenciación opuestas 30', 32', 31'.

Para generar el campo eléctrico 62 a través de la celda de flujo 24, cada superficie de secuenciación 30, 30' o 32, 32' o 31, 31' puede acoplarse eléctricamente a una fuente de energía para producir las cargas eléctricas respectivas 66, 68 que atraen los respectivos materiales diana 11C, 11D. En el ejemplo mostrado en la figura 6A y la figura 6B, el campo eléctrico 62 se aplica en la dirección hacia la superficie de secuenciación inferior/de fondo 30', lo que da como resultado que la superficie superior de secuenciación 30 se cargue positivamente y la superficie de secuenciación inferior/de fondo 30' se cargue negativamente.

La inmovilización de los materiales diana 11C, 11D ocurre simultáneamente después de la exposición del fluido 56” en la celda de flujo 24 al campo eléctrico 62. Esto se debe a las cargas positivas y negativas de los materiales diana 11C, 11D y sus respuestas respectivas al campo eléctrico aplicado 62. El material diana con carga negativa 11C migra hacia la superficie de secuenciación con carga positiva 30, donde se inmoviliza por los sitios de captura 44 (que no se muestran en la figura 6B) de la superficie superior de secuenciación 30. El material diana con carga positiva 11D migra hacia la superficie de secuenciación con carga negativa 30, donde se inmoviliza por los sitios de captura 44 (que no se muestran en la figura 6B) de la superficie de secuenciación inferior/de fondo 30.

El campo eléctrico 62 puede aplicarse durante un tiempo predeterminado. En un ejemplo, el tiempo predeterminado puede variar de aproximadamente 1 minutos a aproximadamente 30 minutos para obtener una cantidad deseable de materiales diana 11C, 11D en las respectivas superficies de secuenciación 30, 30'. En otros ejemplos, el campo eléctrico 62 puede aplicarse durante un tiempo que varía de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 2 minutos, o de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 5 minutos, o de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 30 minutos, etc.

Debe entenderse que algunos materiales diana 11C, 11D pueden no inmovilizarse, y estos materiales diana 11C, 11D se eliminarán de la celda de flujo 24 antes de otros procesos. El campo eléctrico 62 puede interrumpirse antes de retirar los materiales diana no inmovilizados 11C, 11D. Como tal, este método ilustrativo puede incluir retirar el campo eléctrico 62 y después eliminar por lavado el fluido 56” y el material diana no inmovilizado 11C, 11D de la celda de flujo 24. El lavado puede implicar introducir un fluido de lavado en la celda de flujo 24. El flujo puede empujar cualquier material diana 11C, 11D que no se haya inmovilizado en las superficies de secuenciación 30, 30' hacia afuera a través de un puerto de salida de la celda de flujo 24. El mecanismo de inmovilización (p. ej., par de unión, hibridación, enlace covalente, etc.) entre los materiales diana respectivos 11C y 11D y los sitios de captura 44, 44' de las superficies de secuenciación 30, 30' pueden evitar que cualquier material diana inmovilizado 11C, 11D se convierta en parte del flujo de salida.

Cuando se usan los complejos 10A o 10B como los materiales diana 11C, 11D, esta etapa de lavado puede estar seguida por la liberación y amplificación de fragmentos de genoteca (p. ej., un ejemplo de los que se describen con referencia a las figuras 9A a la figura 9C). Cuando se usan soportes sólidos agrupados 13, esta etapa de lavado puede estar seguida de secuenciación.

Otro método ilustrativo se muestra en la figura 7A y la figura 7B. En este ejemplo, los materiales diana 11E, 11F son diferentes en términos de magnetismo y densidad.

En este ejemplo (como se muestra en la figura 7A), los materiales diana 11E, 11F se introducen en la celda de flujo 24 en un fluido 56”' que tiene una primera densidad. Como se describe en mayor detalle a continuación, la densidad de cada uno de los materiales diana 11E, 11F se selecciona con respecto a esta primera densidad, es decir, la densidad del fluido 56"' en la temperatura de captura de los materiales diana 11E, 11f . La temperatura de captura varía de aproximadamente 18 °C a aproximadamente 40 °C.

En el ejemplo mostrado en la figura 7A y la figura 7B, el primer material diana 11E es magnético, y el segundo material diana 11F no es magnético y tiene una densidad mayor que la primera densidad (es decir, la densidad del fluido 56”' en la temperatura de captura).

En este ejemplo, el primer material diana 11E incluye cualquiera de los soportes sólidos magnéticamente sensibles 12' descritos en la presente memoria. Adicionalmente, la densidad del fluido 56"y el material diana 11E pueden ser aproximadamente iguales de tal modo que la densidad del material diana 11E no interfiera con la migración inducida magnéticamente del material diana 11E. En otro ejemplo, la densidad del fluido 56” y el material diana 11C, 11E pueden no ser iguales. En este ejemplo, la resistencia de la fuerza debida al campo magnético aplicado 70 es mayor que cualquier fuerza debida a la diferencia de densidad.

También en este ejemplo, el segundo material diana 11F incluye cualquiera de los soportes sólidos 12 descritos en la presente memoria que son magnéticamente sensibles. La densidad del soporte sólido 12 y, por lo tanto, del material diana 11F, es mayor que la densidad del fluido 56"' en la temperatura de captura. Como tal, el material diana 11F no es sensible al campo magnético aplicado y es capaz de migrar o asentarse en la superficie inferior de secuenciación 30' debido a que es más pesado que el fluido 56"'.

En este método ilustrativo, el fluido 56"' que incluye los materiales diana 11E, 11F se introduce en la celda de flujo 24 (figura 7A), y la condición a la cual se exponen los materiales diana 11E, 11F para iniciar la migración e inmovilización simultánea es la aplicación de una fuerza magnética 70 (figura 7B). La densidad del fluido 56"' también puede considerarse una condición que afecta la migración e inmovilización.

La fuerza magnética (o campo magnético 70 como se ilustra en la figura 7B) puede aplicarse como se describe con referencia a la figura 4A y la figura 4B. En el ejemplo mostrado en la figura 7B, la fuerza/campo magnético 70 se aplica en la dirección de la superficie superior de secuenciación 30 de tal modo que el (primer) material diana magnéticamente sensible 11E migra en esa misma dirección hacia la superficie superior de secuenciación 30. Los sitios de captura 44 (que no se muestran en la figura 7A o figura 7B) inmovilizan al menos parte del material diana 11E en la superficie superior de secuenciación 30. Al mismo tiempo, el soporte sólido 12 del material diana 11F no es magnéticamente sensible y es más pesado que el fluido 56"' en la temperatura de captura. Como tal, el material diana 11F migra a o se asienta en la superficie de secuenciación del fondo 30', como se muestra en la figura 7B. Los sitios de captura 44 (que tampoco se muestran en la figura 7A o figura 7B) inmovilizan al menos parte del material diana 11F en la superficie de secuenciación inferior/de fondo 30'.

El campo/fuerza magnética 70 puede aplicarse durante un tiempo predeterminado. En un ejemplo, el tiempo predeterminado puede variar de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 30 minutos para obtener una cantidad deseable de materiales diana 11E en las superficies de secuenciación 30.

La inmovilización de los materiales diana 11E, 11F se produce simultáneamente después de la introducción del fluido diana 56"' a la celda de flujo 24 y después de la exposición al campo magnético 70 debido a las propiedades (tanto la densidad como el magnetismo) de los materiales diana 11E, 11F. en el método de la figura 7A y la figura 7B, al menos parte del primer material diana 11E se inmoviliza por los sitios de captura respectivos 44 en la primera de las dos superficies de secuenciación opuestas 30, y al menos parte del segundo material diana 11F se inmoviliza por los sitios de captura respectivos 44' en la segunda de las dos superficies de secuenciación opuestas 30'.

Debe entenderse que algunos materiales diana 11E, 11F pueden no inmovilizarse, y estos materiales diana 11E, 11F se eliminarán de la celda de flujo 24 antes de otros procesos. El campo/ fuerza magnética 70 puede interrumpirse antes de retirar los materiales diana no inmovilizados 11E, 11F. Como tal, este método ilustrativo puede incluir retirar el campo/fuerza magnética 70 y después eliminar por lavado el fluido 56”' y el material diana no inmovilizado 11E, 11F de la celda de flujo 24. El lavado puede implicar introducir un fluido de lavado en la celda de flujo 24. El flujo puede empujar cualquier material diana 11E, 11F que no se haya inmovilizado en las superficies de secuenciación 30, 30' hacia afuera a través de un puerto de salida de la celda de flujo 24. El mecanismo de inmovilización (p. ej., par de unión, hibridación, enlace covalente, etc.) entre los materiales diana respectivos 11E y 11F y los sitios de captura 44, 44' de las superficies de secuenciación 30, 30' pueden evitar que cualquier material diana inmovilizado 11E, 11F se convierta en parte del flujo de salida.

Cuando se usan los complejos 10A o 10B como los materiales diana 11E, 11F, esta etapa de lavado puede estar seguida por la liberación y amplificación de fragmentos de genoteca (p. ej., un ejemplo de los que se describen con referencia a las figuras 9A a la figura 9C). Cuando se usan soportes sólidos agrupados 13 como los materiales diana 11E, 11F, esta etapa de lavado puede estar seguida de secuenciación.

El método ilustrativo mostrado en la figura 7A y la figura 7B también puede realizarse de tal modo que el material diana 11E que es magnéticamente sensible se inmoviliza en la superficie de secuenciación inferior/de fondo 30' y el material diana 11F que no es magnéticamente sensible se inmoviliza en la superficie de secuenciación superior 30. En este ejemplo, el material diana que no es magnéticamente sensible 11F incluye el soporte sólido 12 que se selecciona para tener una densidad menor que la densidad del fluido 56"' en la temperatura de captura. En este ejemplo, el material diana 11E es sensible al campo/fuerza magnética (aplicado en la dirección de la superficie inferior de secuenciación 30') y se atrae hacia la superficie inferior de secuenciación 30', mientras que el material diana 11F no es sensible al campo magnético aplicado y es capaz de flotar o migrar hacia la superficie superior de secuenciación 30 debido a que es más ligero que el fluido 56"'.

Otro método ilustrativo se muestra en la figura 8A y la figura 8B. En este ejemplo, los materiales diana 11G, 11H son diferentes en términos de carga y densidad.

En este ejemplo, los materiales diana 11G, 11H se introducen en la celda de flujo 24 en un fluido 56”' que tiene una primera densidad. Como se describe en mayor detalle a continuación, la densidad de cada uno de los materiales diana 11G, 11H se selecciona con respecto a esta primera densidad, es decir, la densidad del fluido 56”” en la temperatura de captura de los materiales diana 11G, 11H. La temperatura de captura varía de aproximadamente 18 °C a aproximadamente 40 °C.

En estos ejemplos, el fluido 56”” es un electrolito.

En el ejemplo mostrado en la figura 8A y la figura 8B, el primer material diana 11G tiene carga negativa, y el segundo material diana 11H es neutral (no está cargado) y tiene una densidad mayor que la primera densidad (es decir, la densidad del fluido 56”” en la temperatura de captura). En este ejemplo, el primer material diana 11G incluye cualquiera de los soportes sólidos con carga negativa descritos en la presente memoria, tales como un soporte sólido carboxilado, un soporte sólido recubierto con ácido poliglutámico, o un soporte sólido funcionalizado con sulfato. Adicionalmente, la densidad del fluido 56”” y la densidad del material diana 11G pueden ser aproximadamente iguales de tal modo que la densidad del material diana 11G no interfiera con la migración inducida electrostáticamente del material diana 11G con carga negativa. Alternativamente, la densidad del material diana 11G puede ser menor que la densidad del fluido 56"", y la densidad y la carga pueden ayudar ambas en la migración del material diana 11G.

En otros ejemplos del método representado por la figura 8A y la figura 8B, el primer material diana 11G tiene carga positiva, y el segundo material diana 11H es neutral (no está cargado) y tiene una densidad mayor que la primera densidad (es decir, la densidad del fluido 56'” en la temperatura de captura). En este ejemplo, el primer material diana 11G incluye cualquiera de los soportes sólidos con carga positiva descritos en la presente memoria, tal como un soporte sólido funcionalizado con amina (p. ej., una quitosana o un soporte sólido funcionalizado con polilisina). Adicionalmente, la densidad del fluido 56”” y la densidad del material diana 11G pueden ser aproximadamente iguales de tal modo que la densidad del material diana 11G no interfiera con la migración inducida electrostáticamente del material diana 11G con carga positiva. Alternativamente, la densidad del material diana 11G puede ser menor que la densidad del fluido 56"", y la densidad y la carga pueden ayudar ambas en la migración del material diana 11G.

En los métodos ilustrativos representados en la figura 8A y la figura 8B, el segundo material diana 11H incluye cualquiera de los soportes sólidos 12 descritos en la presente memoria que no están cargados. La densidad del soporte sólido 12 y, por lo tanto, del material diana 11H, es mayor que la densidad del fluido 56”” en la temperatura de captura. Como tal, el material diana 11H no es sensible al campo eléctrico aplicado 62 y es capaz de migrar o asentarse en la superficie inferior de secuenciación 30' debido a que es más pesado que el fluido 56””.

El fluido 56”” que incluye los materiales diana 11G, 11H se introduce en la celda de flujo 24, y la condición a la cual se exponen los materiales diana 11G, 11H para iniciar la migración e inmovilización simultánea es la aplicación de un campo eléctrico 62. La densidad del fluido 56”” también puede considerarse una condición que afecta la migración e inmovilización.

El campo eléctrico 62 puede aplicarse como se describe con referencia a la figura 6A y la figura 6B. En el ejemplo mostrado en la figura 8a (cuando el material diana 11G tiene carga negativa), el campo eléctrico 62 se aplica en la dirección hacia la superficie de secuenciación inferior/de fondo 30'. Esto resulta en que la superficie superior de secuenciación 30 se cargue positivamente y que la superficie inferior/de fondo de secuenciación 30' se cargue negativamente. En este ejemplo, el material diana con carga negativa 11G migra hacia la superficie de secuenciación con carga positiva 30, donde se inmoviliza por los sitios de captura 44 (que no se muestran en la figura 8A o figura 8B) de la superficie superior de secuenciación 30. Al mismo tiempo, el soporte sólido 12 del material diana 11H no está cargado y es más pesado que el fluido 56"' en la temperatura de captura. Como tal, el material diana 11H migra a o se asienta en la superficie de secuenciación del fondo 30', como se muestra en la figura 8B. Los sitios de captura 44' (que tampoco se muestran en la figura 8A o figura 8B) inmovilizan al menos parte del material diana 11H en la superficie de secuenciación inferior/de fondo 30'.

Como se mencionó anteriormente, en otros ejemplos del método representado por la figura 8A y figura 8B, el material diana 11G tiene carga positiva. En este ejemplo, el campo eléctrico 62 se aplica en la dirección hacia la superficie superior de secuenciación 30 (es decir, en la dirección opuesta a la ilustrada en la figura 8A y la figura 8B). Esto resulta en que la superficie de secuenciación inferior 30 se cargue positivamente y que la superficie de secuenciación superior 30 se cargue negativamente. En este ejemplo, el material diana cargado positivamente 11G migra hacia la superficie superior de secuenciación 30 ahora con carga negativa, donde se inmoviliza por los sitios de captura 44 de la superficie superior de secuenciación 30. Al mismo tiempo, el soporte sólido 12 del material diana 11H no está cargado y es más pesado que el fluido 56"' en la temperatura de captura. Como tal, el material diana 11H migra a o se asienta en la superficie de secuenciación del fondo 30', similar a la figura 8B. Los sitios de captura 44' (que tampoco se muestran en la figura 8B) inmovilizan al menos parte del material diana 11H en la superficie de secuenciación inferior/de fondo 30'.

En cualquiera de los ejemplos representados por la figura 8A y la figura 8B, el campo eléctrico 62 puede aplicarse durante un tiempo predeterminado. En un ejemplo, el tiempo predeterminado puede variar de aproximadamente 1 minutos a aproximadamente 30 minutos para obtener una cantidad deseable de materiales diana con carga inmovilizada 11G en las superficies de secuenciación con carga opuesta 30 o 30'.

La inmovilización de los materiales diana 11G, 11H se produce simultáneamente después de la introducción del fluido diana 56”” a la celda de flujo 24 y después de la exposición al campo eléctrico 62 debido a las propiedades (tanto la densidad como la carga) de los materiales diana 11G, 11H. En el método de la figura 8A y la figura 8b , al menos parte del primer material diana 11G se inmoviliza por los sitios de captura respectivos 44 en la primera de las dos superficies de secuenciación opuestas 30, y al menos parte del segundo material diana 11H se inmoviliza por los sitios de captura respectivos 44' en la segunda de las dos superficies de secuenciación opuestas 30'.

Debe entenderse que algunos materiales diana 11G, 11H pueden no inmovilizarse, y estos materiales diana 11G, 11H se eliminarán de la celda de flujo 24 antes de otros procesos. El campo eléctrico 62 puede interrumpirse antes de retirar los materiales diana no inmovilizados 11G, 11H. Como tal, este método ilustrativo puede incluir retirar el campo eléctrico 62 y después eliminar por lavado el fluido 56”” y el material diana no inmovilizado 11G, 11H de la celda de flujo 24. El lavado puede implicar introducir un fluido de lavado en la celda de flujo 24. El flujo puede empujar cualquier material diana 11G, 11H que no se haya inmovilizado en las superficies de secuenciación 30, 30' hacia afuera a través de un puerto de salida de la celda de flujo 24. El mecanismo de inmovilización (p. ej., par de unión, hibridación, enlace covalente, etc.) entre los materiales diana respectivos 11G y 11H y los sitios de captura 44, 44' de las superficies de secuenciación 30, 30' pueden evitar que cualquier material diana inmovilizado 11G, 11H se convierta en parte del flujo de salida.

Cuando se usan los complejos 10A o 10B como los materiales diana 11G, 11H, esta etapa de lavado puede estar seguida por la liberación y amplificación de fragmentos de genoteca (p. ej., un ejemplo de los que se describen con referencia a las figuras 9A a la figura 9C). Cuando se usan soportes sólidos agrupados 13 como los materiales diana 11G, 11H, esta etapa de lavado puede estar seguida de secuenciación.

El método ilustrativo mostrado en la figura 8A y la figura 8B también puede realizarse de tal modo que el material diana 11G no se carga y tiene una densidad que es menor que la densidad del fluido diana 56"". En este ejemplo, el material diana 11H tiene carga positiva. En este ejemplo, el material diana con carga positiva 11H responde al campo eléctrico 62 (aplicado en la dirección de la superficie de secuenciación inferior 30') y es atraído a la superficie de secuenciación inferior 30'. También en este ejemplo, el material diana 11G no responde al campo magnético aplicado y es capaz de flotar o migrar hacia la superficie de secuenciación superior 30 debido a que es más liviano que el fluido 56'”.

Debe entenderse que pueden combinarse otras modalidades ortogonales para inmovilizar dos materiales diana diferentes 11. Cada material diana 11 puede responder a una de las modalidades ortogonales pero no a la otra, lo que permite que las modalidades afecten independientemente uno de los materiales diana 11. Por ejemplo, un material diana magnéticamente sensible sin carga 11 puede combinarse con un material diana no magnético cargado 11. En este ejemplo, un campo magnético 70 puede aplicarse en una dirección para guiar la migración del material diana magnéticamente sensible sin carga 11 a una 30, 32, 31, de las superficies de secuencias opuestas 30, 30' o 32, 32', o 31, 31', y un campo eléctrico 62 puede aplicarse en la dirección opuesta para guiar la migración del material diana no magnético cargado a la otra 30', 32', 31' de las superficies de secuencias opuestas 30, 30' o 32, 32', o 31, 31'. Si bien se han proporcionado varios ejemplos, se contempla que pueden usarse otras combinaciones y modalidades de materiales diana.

Liberación de fragmentos de genoteca a partir de complejos y secuenciación

Con el material diana 11 inmovilizado en ambas superficies opuestas 30 y 30' o 32 y 32' o 31 y 31' de la celda de flujo 24, la celda de flujo 24 está lista para el análisis secuencia abajo.

En los ejemplos que usan los complejos 10A, 10B inmovilizados en ambas superficies de secuencias opuestas 30 y 30' o 32 y 32', la celda de flujo 24 está lista para la liberación, amplificación y secuenciación de fragmentos de genoteca.

Después de la inmovilización y eliminación del material diana no inmovilizado (p. ej., los complejos 10A, 10B), los ejemplos del método incluyen iniciar la liberación de los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14', 14'' del soporte sólido 12 o 12' de los complejos inmovilizados 10A, 10B sembrando, de este modo, al menos algunos de los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14', 14" a los respectivos cebadores 42, 42' de las dos superficies de secuenciación opuestas 30, 30' o 32, 32'; y eliminar el soporte sólido 12 o 12' y los fragmentos de ácido nucleico no sembrados listos para la secuenciación 14, 14', 14''. Estas etapas pueden estar seguidas por cualquiera de las técnicas de amplificación descritas en la presente memoria, que incluyen las descritas con referencia a la figura 9A a la figura 9C.

Antes de la liberación del fragmento 14, 14', 14'', un agente de inmovilización externo puede introducirse en la celda de flujo 24. En un ejemplo, el agente de inmovilización externo es aire, o un medio líquido o un medio viscoso que no es miscible con el material diana 11 (específicamente, los complejos 10A, 10B) que se han introducido en la celda de flujo 24. Puede usarse aire para aspirar el fluido de lavado fuera de la celda de flujo 24, que puede crear una gotita de líquido que rodea los complejos 10a , 10B y forma una barrera de difusión alrededor de cada uno de los complejos 10<a>, 10B. El agente de inmovilización externo líquido o viscoso rodea al menos parcialmente los complejos 10A, 10B que se inmovilizan dentro de la celda de flujo 24. El agente de inmovilización externo puede ayudar a minimizar la difusión de los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14', 14'' cuando los fragmentos 14, 14', 14'' se liberan de los soportes sólidos 12 o 12'. Cuando el agente de inmovilización externo es un material sensible a la temperatura, elevar la temperatura hasta la temperatura de siembra puede hacer que el agente sea más viscoso y en una forma que pueda minimizar aún más la difusión de la genoteca.

Después puede iniciarse la liberación de los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14', 14'' desde el soporte sólido 12 o 12'. En un ejemplo, un agente de escisión puede introducirse en la celda de flujo 24, y puede aplicarse un estímulo para activar el agente de escisión para liberar los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14', 14'' del soporte sólido 12 o 12'. En otros ejemplos, la liberación de los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14', 14'' puede implicar calentar la celda de flujo 24 por encima de una temperatura de fusión de un cebador que se hibrida a los fragmentos 14, 14', 14''.

Después de la liberación, el transporte y la siembra de los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14', o 14'' pueden restringirse por el agente de inmovilización externo. Como tales, los fragmentos 14, 14', o 14'' de cualquier complejo particular 10<a>, 10B, pueden confinarse a un área de la superficie de secuenciación 30, 30' o 32, 32' cercana al complejo particular 10A, 10B del cual se liberan los fragmentos 14, 14', o 14''.

Los cebadores 42, 42' de las respectivas superficies de secuenciación 30, 30' o 32, 32' de la celda de flujo 24 pueden sembrar los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14', o 14'' liberados. La siembra se logra a través de la hibridación entre la primera o segunda secuencia del fragmento 14, 14' o 14'' y uno complementario de los cebadores 42, 42' de las respectivas superficies de secuenciación 30, 30' o 32, 32'. La siembra puede realizarse a una temperatura de hibridación adecuada para el fragmento 14, 14' o 14” y el o los cebadores 42, 42'. En un ejemplo, la siembra tiene lugar a aproximadamente 80 °C, seguido por una reducción de la temperatura hasta la temperatura ambiente (p. ej., 25 °C).

La ubicación en la cual los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14', o 14'' se siembran dentro de la celda de flujo 24 depende, en parte, de cómo se unen los cebadores 42, 42'. En los ejemplos de la celda de flujo 24 que tiene las superficies de secuenciación sin patrones 30, 30', los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14', o 14'' liberados se sembrarán a través de hidrogeles poliméricos 40, 40' en las regiones cóncavas 38, 38'. En los ejemplos de la celda de flujo 24 que tiene las superficies de secuenciación con patrones 32, 32', los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14', o 14'' liberados se sembrarán a través de hidrogeles poliméricos 40, 40' dentro de cada una de las depresiones 48, 48'.

Un ejemplo de los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14', o 14'' sembrados en diferentes depresiones 48, 48' a lo largo de las superficies de secuenciación estampadas 32, 32' de la celda de flujo 24 se ilustra en la figura 9A.

Después, los soportes sólidos 12, 12' pueden retirarse de la celda de flujo 24. La eliminación de los soportes sólidos 12, 12' puede implicar cualquier técnica adecuada que depende del mecanismo que une el soporte sólido 12, 12' al sitio de captura 44, 44'. Como ejemplos, puede usarse la desnaturalización, escisión de enlaces, etc. La eliminación de los soportes sólidos 12, 12' también pueden eliminar los fragmentos de ácido nucleico no sembrados listos para la secuenciación 14, 14', 14''. La eliminación de los soportes sólidos 12, 12' también puede eliminar las formas líquidas o viscosas del agente de inmovilización externa.

Después, los fragmentos sembrados de la genoteca de secuenciación 14, 14', 14'' pueden amplificarse usando generación de grupos.

En un ejemplo de generación de grupos, los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14' o 14” se copian a partir de los cebadores hibridados 42, 42' mediante la extensión 3' usando una ADN polimerasa de alta fidelidad. La ADN polimerasa de alta fidelidad puede ser parte de una mezcla de amplificación que se introduce en la celda de flujo 24. La mezcla de amplificación también puede incluir otros reactivos adecuados de reacción en cadena de la polimerasa. Los fragmentos originales de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14' o 14” se desnaturalizan, lo que deja las copias inmovilizadas a las superficies de secuenciación 30, 30' o 32, 32'. Puede usarse la amplificación isotérmica de puente u otra forma de amplificación para amplificar las copias inmovilizadas. Por ejemplo, los moldes copiados se enrollan para hibridarse con un cebador complementario adyacente 42, 42', y una polimerasa copia los moldes copiados para formar puentes bicatenarios, que se desnaturalizan para formar dos cadenas monocatenarias. Estas dos cadenas se enrollan y se hibridan con los cebadores complementarios adyacentes 42, 42' y se extienden nuevamente para formar dos bucles bicatenarios nuevos. El proceso se repite en cada copia de la plantilla en ciclos de desnaturalización y amplificación isotérmicas para crear grupos clonales densos. Cada grupo de puentes bicatenarios se desnaturaliza. En un ejemplo, la cadena inversa se elimina mediante la escisión de base específica, lo que deja cadenas directas de polinucleótidos de plantilla. El agrupamiento resulta en la formación de varias cadenas de polinucleótidos plantilla a lo largo de las superficies de secuenciación 30, 30' o 32, 32'. Este ejemplo de agrupamiento es la amplificación de puentes, y es un ejemplo de la amplificación que puede realizarse. Debe entenderse que pueden usarse otras técnicas de amplificación, tales como el flujo de trabajo de amplificación de exclusión (Examp) (Illumina Inc.).

Otro ejemplo de amplificación y, por lo tanto, la generación de grupos, implica el uso de un material sensible a la temperatura. Este ejemplo se muestra esquemáticamente en las figuras 9<a>a 9C. Este método ilustrativo incluye introducir una mezcla de amplificación que incluye una forma líquida 63 de un material sensible a la temperatura a la celda de flujo 24; hacer que la forma líquida 63 del material sensible a la temperatura se gelifique (lo que genera la forma de gel 63' del material sensible a la temperatura); iniciar la amplificación de los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14', 14'' sembrada para generar cadenas plantilla 64, por el cual la forma de gel 63' del material sensible a la temperatura reduce la difusión de las cadenas plantilla 64; hacer que la forma de gel 63' del material sensible a la temperatura se licue (lo que genera la forma líquida 63 del material sensible a la temperatura); y eliminar la forma líquida 63 del material sensible a la temperatura de la celda de flujo 24.

Como se muestra en la figura 9A, la mezcla de amplificación, incluyendo la forma líquida 63 del material sensible a la temperatura, ha sido introducida en el canal de flujo 28, p. ej., a través de una entrada. Además de la forma líquida 63 del material sensible a la temperatura, este ejemplo de la mezcla de amplificación también incluye la ADN polimerasa de alta fidelidad y cualquier otro reactivo adecuado de reacción en cadena de la polimerasa.

El material sensible a la temperatura es capaz de pasar de la forma líquida 63 a la forma de gel 63' al cambiar las condiciones de temperatura a las que se expone el material. En la forma líquida 63, las moléculas del material sensible a la temperatura no están reticuladas y, por lo tanto, pueden fluir. En la forma de gel 63', las moléculas del material sensible a la temperatura están reticuladas y, por lo tanto, no pueden fluir. La forma de gel 63' incluye poros, canales u otras aberturas que pueden i) facilitar el intercambio de difusión de moléculas pequeñas, proteínas y reactivos para acceder a los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14', 14'' sembrados para amplificación y también ii) impiden o evitan el movimiento de los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14', 14'' sembrados o cadenas plantilla 64 debido a difusión o convección. Como tal, cualquier material sensible a la temperatura que i) facilita la amplificación en gel, ii) limita la difusión, convección u otro movimiento de los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14', 14'' sembrados y las cadenas plantilla 64, iii) pueden bombearse o fluir de cualquier otro modo como un líquido antes de la reticulación, iv) pueden reticularse y gelificarse de manera controlada, y v) pueden no enlazarse y licuarse de manera controlada.

Los ejemplos del material sensible a la temperatura incluyen poliacrilamida reticulada con disulfuro, agarosa, alginato y un copolímero de poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAAm) y polietilenglicol (PEG). Para cada uno de estos materiales, la amplificación puede realizarse a temperaturas que no fundirán la forma de gel 63'.

El copolímero de PNIPAAm y PEG es un líquido a temperaturas más bajas y un gel a temperaturas más altas. Un ejemplo del copolímero de PNIPAAm y PEG es un líquido a temperaturas menores que 29 °C y un gel a temperaturas mayores que 32 °C La temperatura gelificante del copolímero de PNIPAAm y<p>E<g>puede ajustarse alterando la relación de poli(N-isopropilacrilamida) y polietilenglicol en el copolímero.

La mezcla de amplificación se carga en la celda de flujo 24 en condiciones donde no se produce la reacción de amplificación. Por ejemplo, la amplificación no ocurre a 4 °C y, por lo tanto, la mezcla de amplificación (que incluye la forma líquida 63 del material sensible a la temperatura) puede introducirse a esta temperatura.

Hacer que la forma líquida 63 del material sensible a la temperatura gelifique, y de este modo generar la forma de gel 63', puede realizarse ajustando la temperatura de la celda de flujo 24, y el material sensible a la temperatura contenido en esta, a una temperatura de gelación del material sensible a la temperatura. La forma de gel 63' se muestra en la figura 9B. La temperatura a la que se ajusta la celda de flujo 24 dependerá del material sensible a la temperatura que se use.

Iniciar la amplificación de los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14', 14'' sembrados genera las cadenas plantilla 64, como se ilustra en la figura 9B. La amplificación puede iniciarse al ajustar la temperatura de la celda de flujo 24 y la mezcla de amplificación contenida en esta, a una temperatura donde los reactivos de PCR están activos. Durante la amplificación, la forma de gel 63' del material sensible a la temperatura reduce el movimiento de los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14', 14'' sembrados y las cadenas plantilla 64.

Hacer que la forma de gel 63' del material sensible a la temperatura se licue, y de este modo generar la forma líquida 63, puede realizarse ajustando la temperatura de la celda de flujo 24, y el material sensible a la temperatura contenido en esta, a una temperatura de licuefacción del material sensible a la temperatura. Nuevamente, la temperatura a la que se ajusta la celda de flujo 24 dependerá del material sensible a la temperatura que se use.

La forma líquida 63 puede bombearse después fuera de la celda de flujo 24, preparando la celda de flujo 24 para la secuenciación posterior. La celda de flujo 24 después de retirar la forma líquida 63 del material sensible a la temperatura se muestra en la figura 9C.

En un ejemplo específico, el copolímero de PNIPAAm y PEG se usa en la mezcla de amplificación y se usa en conjunto con la reacción en cadena de la polimerasa mediada por recombinasa (PCR). Puede usarse un programa de temperatura para controlar la amplificación ya que una PCR isotérmica mediada por recombinasa típica está inactiva a 4 °C y activa a 37 °C u otras temperaturas altas, y el copolímero de PNIPAAm y PEG es un líquido a temperaturas menores que 29 °C y un gel a temperaturas mayores que 32 °C. En este ejemplo, la mezcla de amplificación puede introducirse en la celda de flujo 24 a aproximadamente 4 °C como una mezcla líquida. Después, la temperatura puede elevarse a aproximadamente 37 °C para gelificar el copolímero y comenzar la amplificación por PCR. Una vez completada, la forma de gel 63' del copolímero puede licuarse reduciendo la temperatura a menos de 29 °C, p. ej., a aproximadamente 8 °C (que es una temperatura de secuenciación adecuada). La forma líquida 63 puede bombearse después fuera de la celda de flujo 24, preparando la celda de flujo 24 para la secuenciación posterior.

El uso del material sensible a la temperatura 63, 63' puede minimizar la difusión de los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14', o 14'' sembrados y las cadenas plantilla amplificadas 64 del movimiento (p. ej., como resultado de difusión o convección libre) a una depresión cercana 48, 48' de las superficies de secuenciación con patrón 32, 32' o lejos de un lugar de siembra inicial en las superficies de secuenciación sin patrón 30, 30'. Al limitar o evitar este movimiento, las agrupaciones permanecen en áreas relativamente aisladas de la celda de flujo 24, lo que permite que cada grupo se lea individualmente, sin redundancia. El movimiento también puede generar moléculas híbridas que no están presentes en los fragmentos originales de la genoteca de secuenciación 14, 14', 14'', lo que resulta en datos de secuenciación inexacta. Al limitar o evitar este movimiento, estas moléculas híbridas no se generan, mejorando, por lo tanto, la precisión de los datos de secuenciación resultantes.

Si bien las figuras 9A a 9C representan la celda de flujo 24 con las superficies de secuenciación con patrón 32, 32', debe entenderse que el método puede realizarse, además, usando las superficies de secuenciación sin patrón 30, 30'.

Además, el método ilustrado en las figuras 9A a 9C puede realizarse con cualquier fragmento de ácido nucleico listo para la secuenciación 14, 14', 14'', que incluye aquellos que no están atados a un soporte sólido 12, 12'. En este ejemplo puede usarse cualquier técnica de preparación de genotecas adecuada que agregue los adaptadores deseados a la muestra de<a>D<n>fragmentada. Los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación 14, 14', 14'' pueden introducirse y sembrarse en la o las superficies de secuenciación de celdas de flujo 30, 30' o 32, 32'. Una vez que los fragmentos de la genoteca se siembran, puede realizarse el método descrito en las figuras 9A a 9C.

Debe entenderse además que el método ilustrado en las figuras 9A a 9C puede no realizarse con los soportes sólidos agrupados 13, ya que estos materiales diana 11 no están expuestos a la amplificación en la celda de flujo 24.

Después, puede introducirse un cebador de secuenciación que se hibrida a una secuencia complementaria en las cadenas plantilla de polinucleótido. Este cebador de secuenciación produce las cadenas plantilla de polinucleótido 64 listas para la secuenciación Los extremos 3' de las plantillas 64 y cualquier cebador unido a la celda de flujo 42, 42' (no acoplado a la copia) pueden bloquearse para evitar la interferencia con la reacción de secuenciación y, en particular, para evitar el cebado no deseado.

Para iniciar la secuenciación, puede agregarse una mezcla de incorporación a la celda de flujo 24. En un ejemplo, la mezcla de incorporación incluye un portador líquido, una polimerasa y nucleótidos marcados con fluorescencia. Los nucleótidos marcados con fluorescencia pueden incluir un grupo de bloqueo OH de 3'. Cuando la mezcla de incorporación se introduce en la celda de flujo 24, el fluido entra en el canal de flujo 28 y en algunos ejemplos, en las depresiones 48, 48' (donde las cadenas plantilla de polinucleótidos están presentes).

Los nucleótidos marcados con fluorescencia se agregan a un cebador de secuenciación (extendiendo de este modo el cebador de secuenciación) de una manera dependiente de la plantilla, de tal modo que la detección del orden y tipo de nucleótidos agregados al cebador de secuenciación puede usarse para determinar la secuencia de la plantilla. Más particularmente, uno de los nucleótidos se incorpora, por medio de una polimerasa respectiva, en una cadena incipiente que extiende el cebador de secuenciación y que es complementario a la cadena de polinucleótidos plantilla. En otras palabras, en al menos algunas de las cadenas de polinucleótidos plantilla a través de la celda de flujo 24, las polimerasas respectivas extienden el cebador de secuenciación hibridado por uno de los nucleótidos en la mezcla de incorporación.

La incorporación de los nucleótidos puede detectarse a través de un evento de formación de imágenes. Durante un evento de formación de imágenes, un sistema de iluminación (no se muestra) puede proporcionar una luz de excitación a las superficies de secuenciación respectivas 30, 30' o 32, 32'.

En algunos ejemplos, los nucleótidos pueden incluir además una propiedad de terminación reversible (p. ej., el grupo de bloqueo OH de 3') que termina la extensión adicional de cebador una vez que se ha agregado un nucleótido al cebador de secuenciación. Por ejemplo, un análogo de nucleótido que tiene un resto terminador reversible puede agregarse al cebador de secuenciación de tal modo que no pueda producirse una extensión posterior hasta que se administre un agente de desbloqueo para eliminar el resto. Por lo tanto, para ejemplos que usan la terminación reversible, puede suministrarse un reactivo de desbloqueo a la celda de flujo 24 después de que ocurre la detección.

El(los) lavado(es) puede(n) tener lugar entre las diversas etapas de suministro de fluido. Después, el ciclo de SBS puede repetirse n veces para extender el cebador de secuenciación en n nucleótidos, lo que detecta de este modo una secuencia de longitud n.

En algunos ejemplos, las cadenas delanteras pueden secuenciarse y eliminarse, y después las cadenas invertidas se construyen y secuencian como se describe en la presente memoria.

Aunque la SBS se ha descrito en detalle, debe entenderse que las celdas de flujo 24 descritas en la presente memoria pueden usarse con otro protocolo de secuenciación, para genotipar, o en otras aplicaciones químicas y/o biológicas. En algunos casos, los cebadores 42, 42' de la celda de flujo 24 pueden seleccionarse para permitir la secuenciación simultánea de extremos apareados, donde están presentes tanto las cadenas directa e inversa en el hidrogel polimérico 40, 40', lo que permite la designación simultánea de bases de cada lectura. La secuenciación de extremos emparejados de forma simultánea y secuencial facilita la detección de reordenamientos genómicos y elementos de secuencia repetitivos, así como fusiones de genes y transcripciones novedosas.

Soportes sólidos agrupados y secuenciación

Como se indicó anteriormente, en el material diana 11 inmovilizado en ambas superficies opuestas 30 y 30' o 32 y 32' o 31 y 31' de la celda de flujo 24, la celda de flujo 24 está lista para el análisis secuencia abajo. Cuando los soportes sólidos agrupados 13 se inmovilizan en ambas superficies opuestas 31 y 31' de la celda de flujo 24, la celda de flujo 24 está lista para la secuenciación. En estos ejemplos, la celda de flujo 24 está lista para la secuenciación porque la amplificación y la generación de agrupaciones han tenido lugar en el soporte sólido 12 o 12' fuera de la celda de flujo 24.

La secuenciación puede realizarse como se describe en la presente memoria al introducir el cebador de secuenciación y la mezcla de incorporación, y realizar ciclos de secuenciación secuenciales.

Para ilustrar aún más la presente descripción, se proporcionan ejemplos en la presente memoria. Se entiende que estos ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la presente descripción.

Ejemplos prácticos no limitantes

Ejemplo 1

Se prepararon complejos similares a los ilustrados en la figura 1A con un diámetro promedio de 3 pm. Los soportes sólidos de los complejos fueron glóbulos de estreptavidina DYNABEADS™ M-280 de ThermoFisher Scientific. Cada sólido soporta una densidad de aproximadamente 1,18 g/cm3. Los fragmentos en un glóbulo particular eran de la misma molécula larga de ADN (del genoma PhiX). Los fragmentos de la genoteca se unieron al soporte sólido por medio de un oligo de destiobiotina, que tiene una afinidad más débil que la biotina con estreptavidina en la superficie del glóbulo. Los fragmentos de la genoteca incluyeron secuencias P5' y P7, junto con secuencias de índice, y secuencias de lectura 1 y lectura 2.

Los complejos se cargaron en una celda de flujo que incluye superficies de secuenciación opuestas con patrón (que incluyen cebadores P5 y P7) usando un ejemplo del método similar al descrito en las figuras 3A y 3B.

Más específicamente, los complejos se dividieron primero entre dos fluidos, el primero de los cuales tenía una densidad de aproximadamente 2 g/cm3 y el segundo tenía una densidad de aproximadamente 1 g/cm3 El primer fluido fue una solución de politungstato de sodio de 1 g/ml (500 mg de politungstato de sodio por 500 pL de amortiguador de solución salina de citrato de sodio con dodecilsulfato de sodio) e incluyó los complejos en una concentración de 600.000 complejos por 1 pL. El segundo fluido fue un amortiguador de solución salina de citrato de sodio con dodecilsulfato de sodio e incluyó los complejos en una concentración de 600.000 complejos por 1 pL.

El primer fluido se introdujo en la celda de flujo y se dejó que los complejos se inmovilizaran a la superficie superior de la celda de flujo. Después, la celda de flujo se lavó con una solución de lavado. El segundo fluido se introdujo en la celda de flujo y se dejó que los complejos se inmovilizaran a la superficie inferior de la celda de flujo. La unión de los complejos a las superficies respectivas se realizó con un anclaje (p. ej., los cebadores complementarios con biotina se hibridaron a los cebadores P5 unidos al material de gel o los enlazadores de alquino-PEG-biotina se unieron covalentemente a azidas libres en el material de gel usando química clic).

La figura 10A ilustra una imagen de campo brillante de la superficie superior después de la inmovilización compleja y la figura 10B ilustra una imagen de campo brillante de la superficie inferior después de la inmovilización compleja. Las áreas más oscuras de cada imagen representan los complejos inmovilizados.

Se introdujo biotina libre en el regulador de solución salina de citrato de sodio con dodecil sulfato de sodio y la celda de flujo se calentó a aproximadamente 80 °C para liberar las genotecas de los complejos respectivos. Se realizó el agrupamiento usando amplificación isotérmica. Las agrupaciones se tiñeron con verde Sytox y las imágenes resultantes (no reproducidas en la presente memoria) confirmaron que se formaron agrupaciones de cadenas plantilla en cada una de las superficies de secuenciación de la celda de flujo.

Después, se realizó la secuenciación en la celda de flujo. Algunos de los datos de secuenciación recolectados para las superficies superior e inferior de la celda de flujo se ilustran en las figuras 11A y 11B.

La figura 11A representa un histograma de cobertura molecular para un carril de la celda de flujo en las superficies superior e inferior. Estos datos muestran el rango y uniformidad de la cobertura de secuenciación para el carril.

La figura 11B representa el porcentaje de puntajes Q mayores que Q30 para varios ciclos de secuenciación en un carril de la celda de flujo en las superficies superior e inferior. Un puntaje Q de 30 (Q30) es equivalente a la probabilidad de una asignación de base incorrecta 1 en 1000 veces. Esto significa que la precisión de la asignación de base (es decir, la probabilidad de una asignación de base correcta) es 99,9 %. Una precisión de asignación de base inferior de 99 % (Q20) tendrá una probabilidad de asignación de base incorrecta de 1 en 100, lo que significa que cada lectura de la secuencia de 100 pares de bases probablemente contendrá un error. Cuando la calidad de la secuenciación alcanza Q30, virtualmente todas las lecturas serán perfectas, con cero errores y ambigüedades. Como se representa en la figura 11B, el porcentaje de puntajes Q mayores que Q30 generalmente se encuentra en el rango de 60 % a 99 % para todos los ciclos de secuenciación.

Todos los datos recolectados confirmaron que el fluido más denso (en este ejemplo, el primer fluido) era compatible con la superficie de secuenciación de la celda de flujo.

Ejemplo 2

Se prepararon complejos similares a los ilustrados en la figura 1A con un diámetro promedio de 3 pm. Los soportes sólidos de los complejos fueron glóbulos de estreptavidina DYNABEADS™ M-280 de ThermoFisher Scientific. Cada sólido soporta una densidad de aproximadamente 1,18 g/cm3. Los fragmentos en un glóbulo particular eran de la misma molécula larga de ADN (del genoma PhiX).

En este ejemplo, los carriles de celdas de flujo (que tienen superficies opuestas recubiertas con un material de gel) se prepararon con diferentes concentraciones de sitios de captura (a saber, enlazadores de alquino-PEG-biotina). Estos enlazadores se unieron de manera covalente a azidas libres en el material de gel en los carriles de celda de flujo usando química clic. Los carriles de celda de flujo se lavaron y se expusieron respectivamente a una solución de alquino-PEG-biotina que tenía concentraciones de aproximadamente 0,5 pM, aproximadamente 5 pM, o aproximadamente 25 pM. Las soluciones se dejaron incubar durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 60 °C. Después, los carriles de celda de flujo se lavaron nuevamente.

Los complejos se dividieron primero entre dos fluidos, el primero de los cuales tenía una densidad de aproximadamente 1 g/cm3 y el segundo tenía una densidad de aproximadamente 2 g/cm3. El primer fluido fue un amortiguador de solución salina de citrato de sodio con cloruro de sodio e incluyó los complejos en una concentración de 25.000 complejos por pL. El segundo fluido fue una solución de politungstato de sodio de 2 g/ml e incluyó los complejos en una concentración de 25.000 por pL.

El primer fluido se introdujo en los carriles de celda de flujo respectivos y se dejó que los complejos se inmovilizaran a las superficies inferiores de los carriles de celda de flujo. La velocidad de aspiración fue 100 pL/min, y el primer fluido permaneció en las células de flujo durante 180 segundos. Después, las celdas de flujo se lavaron con una solución de lavado. El segundo fluido se introdujo en los carriles de celda de flujo respectivos y se dejó que los complejos se inmovilizaran a las superficies superiores de los carriles de celda de flujo. La velocidad de aspiración fue 100 pL/ms, y el segundo fluido permaneció en los carriles de células de flujo durante 450 segundos. Después, los carriles de celdas de flujo se lavaron con una solución de lavado.

Se tomaron imágenes de las superficies inferior y superior de cada uno de los carriles de celda de flujo y se contaron los complejos inmovilizados (glóbulos) en cada superficie usando imágenes de microscopio.

La cantidad de glóbulos por mm2 para las superficies inferiores se ilustra en la figura 12A y la cantidad de glóbulos por mm2 para las superficies superiores se ilustra en la figura 12B. Las concentraciones para cada barra en la figura 12A y la figura 12B representan la concentración de alquino-PEG-biotina (aproximadamente 0,5 pM, aproximadamente 5 pM o aproximadamente 25 pM) usada para preparar las celdas de flujo antes de la inmovilización del complejo. Como se ilustra, la concentración de alquino-PEG-biotina no afectó la inmovilización en las superficies inferiores, ya que cada una de estas tenía de aproximadamente 2.100 glóbulos/mm2 a aproximadamente 2.300 glóbulos/mm2 La cantidad de complejos inmovilizados en las superficies superiores no fue tan alta como las superficies inferiores, ya que variaron de aproximadamente 550 glóbulos/mm2 a aproximadamente 1.150 glóbulos/mm2. Para las superficies superiores, los carriles tratados con concentraciones más altas de enlazadores de alquino-PEG-biotina tuvieron una cantidad mayor de complejos/glóbulos inmovilizadas en estos.

Estos resultados ilustran que el fluido más pesado ayuda a inmovilizar complejos en las superficies superiores, y que aumentar la concentración del tamaño de captura en la superficie superior también puede ayudar con la inmovilización.

Ejemplo 3

Se prepararon complejos similares a los ilustrados en la figura 1A con un diámetro promedio de 3 pm. Los soportes sólidos de los complejos fueron glóbulos de estreptavidina DYNABEADS™ M-280 de ThermoFisher Scientific. Cada sólido soporta una densidad de aproximadamente 1,18 g/cm3. Los fragmentos en un glóbulo particular eran de la misma molécula larga de ADN (del genoma PhiX).

En este ejemplo, ocho carriles de celdas de flujo (que tienen superficies opuestas recubiertas con un material de gel) se prepararon con sitios de captura (a saber, enlazadores de alquino-PEG-biotina). Estos enlazadores se unieron de manera covalente a azidas libres en el material de gel en los carriles de celda de flujo usando química clic. Los carriles de celda de flujo se lavaron y se expusieron respectivamente a una solución de alquino-PEG-biotina que tenía concentraciones de aproximadamente 5 pM. La solución se dejó incubar durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 60 °C. Después, los carriles de celda de flujo se lavaron nuevamente.

Los complejos se dividieron primero entre dos fluidos, el primero de los cuales tenía una densidad de aproximadamente 1 g/cm3 y el segundo tenía una densidad de aproximadamente 2 g/cm3. El primer fluido fue un regulador de citrato de sodio e incluyó los complejos a una concentración de 40.000 por pL. El segundo fluido fue una solución de politungstato de sodio de 2 g/ml e incluyó los complejos en una concentración de 40.000 por pL.

El primer fluido se introdujo en siete de los carriles de celda de flujo y se dejó que los complejos se inmovilizaran a las superficies inferiores. La velocidad de aspiración fue 100 pL/min, y el primer fluido permaneció en cada uno de los carriles durante 240 segundos. Después, los carriles de celdas de flujo se lavaron con una solución de lavado. El segundo fluido se introdujo en cada uno de los siete carriles de celda de flujo y se dejó que los complejos se inmovilizaran a las superficies superiores. La velocidad de aspiración varió de 80 pL/ms a 100 pL/ms, y el segundo fluido permaneció en las celdas de flujo durante 300 segundos. Después, los carriles de celdas de flujo se lavaron con una solución de lavado.

En el octavo carril, los fluidos se diluyeron a 100 pL cada uno, y la introducción del fluido respectivo se realizó dos veces. Por lo tanto, el carril 8 tuvo una carga doble.

Se tomaron imágenes de las superficies inferior y superior de cada uno de los carriles de celda de flujo y se contaron los complejos inmovilizados (glóbulos) en cada superficie. La Tabla 1 proporciona la cantidad promedio de glóbulos por mm2 para cada uno de los carriles de la celda de flujo.

Tabla 1

La cantidad diana de complejos (glóbulos) para cada una de las superficies fue de 4000 glóbulos/mm2. Si bien los carriles 1-7 estaban ligeramente debajo de la diana, la cantidad de complejos en las superficies superior e inferior para estos carriles fue relativamente consistente. El carril 8 (expuesto a una carga doble) excedió la cantidad diana de complejos en ambas superficies.

La figura 13A ilustra la cantidad diana de glóbulos y la cantidad de cuentas por mm2 medido a lo largo de la longitud del carril de celda de flujo 1 desde la entrada (1) hasta la salida (5). La figura 13B ilustra la cantidad diana de glóbulos y la cantidad de cuentas por mm2 medido a lo largo de la longitud del carril de celda de flujo 7 desde la entrada (1) hasta la salida (5). Las mediciones se tomaron a distancias iguales a lo largo de la longitud. Estos resultados ilustran que la inmovilización es relativamente consistente a lo largo de la longitud de los carriles del canal de flujo en las superficies superior e inferior.

Ejemplo 4

Se prepararon complejos similares a los ilustrados en la figura 1A con un diámetro promedio de 3 pm. Los soportes sólidos de los complejos fueron glóbulos de estreptavidina DYNABEADS™ M-280 de ThermoFisher Scientific. Cada sólido soporta una densidad de aproximadamente 1,18 g/cm3. Los fragmentos en un glóbulo particular eran de la misma molécula larga de ADN (del genoma PhiX).

En este ejemplo, diez carriles de celdas de flujo (que tienen superficies opuestas recubiertas con un material de gel) se prepararon con sitios de captura (a saber, enlazadores de alquino-PEG-biotina). Estos enlazadores se unieron de manera covalente a azidas libres en el material de gel en los carriles de celda de flujo usando química clic. Los carriles de celda de flujo se lavaron y se expusieron respectivamente a una solución de alquino-PEG-biotina que tenía concentraciones de aproximadamente 5 pM. La solución se dejó incubar durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 60 °C. Después, los carriles de celda de flujo se lavaron nuevamente.

Los complejos se dividieron primero entre dos fluidos, el primero de los cuales tenía una densidad de aproximadamente 1 g/cm3 y el segundo tenía una densidad de aproximadamente 2 g/cm3. El primer fluido fue un regulador de citrato de sodio e incluyó los complejos a una concentración de 10 pg por 50 pL. El segundo fluido fue una solución de politungstato de sodio de 2 g/ml e incluyó los complejos en una concentración de 12,5 pg por 50 pL.

El primer fluido se introdujo en los diez de los carriles de celda de flujo y se dejó que los complejos se inmovilizaran a las superficies inferiores. La velocidad de aspiración fue 100 pL/min, y el primer fluido permaneció en cada uno de los carriles durante 300 segundos. Después, los carriles de celdas de flujo se lavaron con una solución de lavado. El segundo fluido se introdujo en cada uno de los diez carriles de celda de flujo y se dejó que los complejos se inmovilizaran a las superficies superiores. La velocidad de aspiración fue 80 pL/ms, y el segundo fluido permaneció en las células de flujo durante 360 segundos. Después, los carriles de celdas de flujo se lavaron con una solución de lavado.

Se tomaron imágenes de las superficies inferior y superior de cada uno de los carriles de celda de flujo y se contaron los complejos inmovilizados (glóbulos) en cada superficie.

La figura 14 ilustra la cantidad diana de glóbulos y la cantidad de glóbulos por mm2 medidas a lo largo de la longitud de un carril de la celda de flujo desde la entrada (1) hasta la salida (10). La figura 14 también ilustra el ajuste lineal para los datos de la superficie superior y la superficie inferior. Estos resultados ilustran que la inmovilización es relativamente consistente a lo largo de las longitudes de las superficies superior e inferior del canal de flujo cuando los complejos se introducen según un ejemplo del método descrito en la presente memoria.

Ejemplo 5

Se prepararon complejos similares a los ilustrados en la figura 1A con un diámetro promedio de 3 pm. Los soportes sólidos de los complejos fueron glóbulos de estreptavidina DYNABEADS™ M-280 de ThermoFisher Scientific. Cada sólido soporta una densidad de aproximadamente 1,18 g/cm3. Los fragmentos en un glóbulo particular eran de la misma molécula larga de ADN (del genoma PhiX). Los fragmentos de la genoteca se unieron al soporte sólido por medio de un oligo de destiobiotina, que tiene una afinidad más débil que la biotina con estreptavidina en la superficie del glóbulo.

En este ejemplo, ocho carriles de celdas de flujo (que tienen superficies opuestas recubiertas con un material de gel) se prepararon con sitios de captura (a saber, enlazadores de alquino-PEG-biotina). Estos enlazadores se unieron de manera covalente a azidas libres en el material de gel en los carriles de celda de flujo usando química clic. Los carriles de celda de flujo se lavaron y se expusieron respectivamente a una solución de alquino-PEG-biotina que tenía concentraciones de aproximadamente 5 pM. La solución se dejó incubar durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 60 °C. Después, los carriles de celda de flujo se lavaron nuevamente.

Los complejos se dividieron primero entre dos fluidos, el primero de los cuales tenía una densidad de aproximadamente 1 g/cm3 y el segundo tenía una densidad de aproximadamente 2 g/cm3. El primer fluido fue un regulador de citrato de sodio e incluyó los complejos a una concentración de 10 pg por 50 pL. El segundo fluido fue una solución de politungstato de sodio de 2 g/ml e incluyó los complejos en una concentración de 12,5 pg por 50 pL.

El primer fluido se introdujo en ocho de los carriles de celda de flujo y se dejó que los complejos se inmovilizaran a las superficies inferiores. La velocidad de aspiración fue 100 pL/min, y el primer fluido permaneció en cada uno de los carriles durante 240 segundos. Después, los carriles de celdas de flujo se lavaron con una solución de lavado. El segundo fluido se introdujo en cada uno de los ocho carriles de celda de flujo y se dejó que los complejos se inmovilizaran a las superficies superiores. La velocidad de aspiración varió de 80 pL/ms a 100 pL/ms, y el segundo fluido permaneció en las celdas de flujo durante 300 segundos. Después, los carriles de celdas de flujo se lavaron con una solución de lavado.

Se tomaron imágenes de las superficies inferior y superior de cada uno de los carriles de celda de flujo y se contaron los complejos inmovilizados (glóbulos) en cada superficie.

Se introdujo biotina libre en el regulador de citrato de sodio y la celda de flujo se calentó a aproximadamente 80 °C para liberar las genotecas de los complejos respectivos. Se realizó el agrupamiento usando amplificación de puente. Después, se realizó la secuenciación en la celda de flujo. Los datos de secuenciación recolectados incluyeron pasar el filtro (% PF) (porcentaje). El filtro de paso (PF, por sus siglas en inglés) es la métrica usada para describir grupos que pasan un umbral de estructura y se usan para el procesamiento y análisis posterior de los datos de secuenciación. Un resultado de % de filtro de paso mayor indica un mayor rendimiento de grupos únicos usados para los datos de secuenciación.

La Tabla 2 proporciona la cantidad promedio de glóbulos por mm2 para cada uno de los carriles de la celda de flujo, así como los datos PF para cada carril.

Tabla 2

La cantidad diana de complejos (glóbulos) para cada una de las superficies de carriles 1-7 fue de 4000 glóbulos/mm2 (total de 8000 glóbulos/mm2). La cantidad diana de complejos (glóbulos) para cada una de las superficies del carril 8 fue de 5500 glóbulos/mm2 (total de 11.000 glóbulos/mm2). Si bien los carriles 1-8 estaban ligeramente debajo del diana, la cantidad total de complejos en las superficies superior e inferior para estos carriles fue relativamente consistente. Los datos del filtro de paso indicaron que la mayoría de los nanopocillos estaban ocupados por grupos monoclonales.

Notas adicionales

Además, debe entenderse que los rangos proporcionados en la presente memoria incluyen el rango establecido y cualquier valor o subrango dentro del rango establecido, como si se mencionaran explícitamente. Por ejemplo, debe entenderse que un rango representado por aproximadamente 2 mm a aproximadamente 300 mm incluye no solo los límites explícitamente mencionados de aproximadamente 2 mm a aproximadamente 300 mm, sino también incluye valores individuales, tales como aproximadamente 15 mm, 22,5 mm, 245 mm, etc., y los subrangos, tales como de aproximadamente 20 mm a aproximadamente 225 mm, etc.

Debe apreciarse que todas las combinaciones de los conceptos anteriores y conceptos adicionales descritos en mayor detalle más adelante (siempre que tales conceptos no sean inconsistentes mutuamente) se contemplan como parte de la materia de la invención descrita en la presente memoria, en la medida en que se caracterizan por las características técnicas según las reivindicaciones adjuntas. Particularmente, todas las combinaciones de la materia reivindicada que aparecen al final de esta descripción se contemplan como parte de la materia de la invención descrita en la presente memoria, en la medida en que se caracterizan por las características técnicas según las reivindicaciones adjuntas. También debe apreciarse que la terminología usada explícitamente en la presente memoria que también puede aparecer en cualquier descripción incorporada como referencia deberá tener un significado más consistente con los conceptos particulares descritos en la presente memoria.

Si bien se han descrito en detalle varios ejemplos, se entenderá que los ejemplos descritos pueden modificarse. Por lo tanto, la descripción anterior se considerará no limitante. Las únicas limitaciones son las reivindicaciones adjuntas que definen la invención.

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Un método, que comprende:

inmovilizar un material diana en cada una de dos superficies de secuenciación opuestas de una celda de flujo, en donde la inmovilización implica:

introducir un primer fluido, que incluye una primera porción del material diana en el mismo, en la celda de flujo, por el cual al menos parte del material diana se inmoviliza por sitios de captura en una de las dos superficies de secuenciación opuestas;

eliminar el primer fluido y cualquier material diana no inmovilizado de la celda de flujo; e introducir un segundo fluido, que incluye una segunda porción del material diana en el mismo, en la celda de flujo, por el cual al menos parte del material diana se inmoviliza por sitios de captura en otra de las dos superficies de secuenciación opuestas;

en donde uno de:

el primer fluido tiene una densidad menor que una densidad del material diana y el segundo fluido tiene una densidad mayor que la densidad del material diana; o

el segundo fluido tiene la densidad menor que la densidad del material diana y el primer fluido tiene la densidad mayor que la densidad del material diana.

2. El método como se define en la reivindicación 1, en donde el primer o segundo fluido que tiene la densidad menor que la densidad del material diana es una solución reguladora acuosa, y en donde el segundo o primer fluido que tiene la densidad mayor que la densidad del material diana es una solución de politungstato de sodio o una solución de cloruro de sodio.

3. El método como se define en una de las reivindicaciones 1 o 2, en donde:

la densidad del primer o segundo fluido en una temperatura de captura es al menos 0,1 g/cm3 menor que la densidad del material diana en la temperatura de captura, y en donde la densidad del segundo o primer fluido en la temperatura de captura es al menos 0,1 g/cm3 mayor que la densidad del material diana en la temperatura de captura; o la densidad del primer o segundo fluido que es menor que la densidad del material diana es aproximadamente 1 g/cm3 en una temperatura de captura, y en donde la densidad del segundo o primer fluido que es mayor que la densidad del material diana es aproximadamente 2 g/cm3 en la temperatura de captura.

4. El método como se define en una de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además permitir que pase un tiempo predeterminado antes de eliminar el primer fluido y cualquier material diana no inmovilizado de la celda de flujo.

5. El método como se define en una de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el material diana inmovilizado en la una de las dos superficies de secuenciación opuestas permanece inmovilizado en la una de las dos superficies de secuenciación opuestas cuando se introduce el segundo fluido.

6. El método como se define en una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el material diana es uno de:

(a) un complejo que incluye:

un soporte sólido; y

fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación unidos al soporte sólido; o (b) un soporte sólido agrupado que incluye:

un soporte sólido; y

un grupo de cadenas moldeadas unidas al soporte sólido.

7. El método como se define en la reivindicación 6, en donde el material diana es el complejo y el método que comprende además:

eliminar el segundo líquido y complejos no inmovilizados de la celda de flujo;

iniciar liberación de los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación del soporte sólido de complejos inmovilizados, sembrando de este modo al menos algunos los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación a cebadores respectivos de las dos superficies de secuenciación opuestas;

eliminar el soporte sólido y los fragmentos de ácido nucleico no sembrados listos para la secuenciación;

introducir una mezcla de amplificación que incluye una forma líquida de un material sensible a la temperatura a la celda de flujo;

hacer que la forma líquida del material sensible a la temperatura se gelifique;

iniciar amplificación de los fragmentos de ácido nucleico sembrados listos para la secuenciación para generar cadenas plantilla, por el cual la forma de gel del material sensible a la temperatura reduce la difusión de las cadenas plantilla;

hacer que la forma de gel del material sensible a la temperatura se licue; y

eliminar la forma líquida del material sensible a la temperatura de la celda de flujo; en donde el material sensible a la temperatura es opcionalmente un copolímero de poli(N-isopropilacrilamida) y polietilenglicol.

8. Un kit, que comprende:

un fluido de preparación que incluye un material diana en el mismo; el material diana incluye uno de:

(a) un complejo que incluye:

un soporte sólido; y

fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación unidos al soporte sólido; o

(b) un soporte sólido agrupado que incluye:

un soporte sólido; y

un grupo de cadenas moldeadas unidas al soporte sólido;

un primer fluido de introducción para introducir una primera porción del material diana en una celda de flujo, el primer fluido de introducción tiene una densidad menor que la densidad del material diana; y un segundo fluido de introducción para introducir una segunda porción del material diana en una celda de flujo, el segundo fluido de introducción tiene una densidad mayor que la densidad del material diana.

9. El kit como se define en la reivindicación 8, en donde el primer fluido de introducción es una solución reguladora acuosa, y en donde el segundo fluido de introducción es una solución de politungstato de sodio o una solución de cloruro de sodio, en donde el segundo fluido de introducción es la solución de politungstato de sodio, y la solución de politungstato de sodio tiene una concentración de aproximadamente 1 gramo de politungstato sódico por 1 mililitro de agua.

10. El kit como se define en una de las reivindicaciones 8 a 9, en donde:

la densidad del primer fluido de introducción en una temperatura de captura es al menos 0,1 g/cm3 menor que la densidad del material diana en la temperatura de captura, y en donde la densidad del segundo fluido de introducción en la temperatura de captura es al menos 0,1 g/cm3 mayor que la densidad del material diana en la temperatura de captura; o la densidad del primer fluido de introducción es de aproximadamente 1 g/cm3 en una temperatura de captura, y en donde la densidad del segundo fluido de introducción es aproximadamente 2 g/cm3 en la temperatura de captura.

11. El kit como se define en una de las reivindicaciones 8 a 10, que comprende además una celda de flujo que tiene dos superficies de secuenciación opuestas,

preferentemente en donde cada una de las superficies de secuenciación opuestas incluye:

un hidrogel polimérico;

cebadores de amplificación unidos al hidrogel polimérico; y

sitios químicos de captura;

y opcionalmente en donde:

los sitios químicos de captura son un miembro de un par de unión; y

el material diana es un soporte sólido revestido con otro miembro del par de unión.

12. El kit como se define en una de las reivindicaciones 8 a 11 que comprende además una mezcla de amplificación que incluye una forma líquida de un material sensible a la temperatura.

13. Un método, que comprende:

inmovilizar un material diana en cada una de dos superficies de secuenciación opuestas de una celda de flujo al:

introducir un fluido, que incluye el material diana, en la celda de flujo, en donde:

el material diana incluye:

un soporte sólido magnético; y

fragmentos de ácido nucleico o cadenas plantilla listas para la secuenciación unidas al soporte sólido magnético; y

el fluido tiene una densidad al menos aproximadamente equivalente a una densidad del soporte sólido magnético;

permitir que parte del material diana se asiente y quede inmovilizado por sitios de captura en una de las dos superficies de secuenciación opuestas; y

aplicar una fuerza magnética a otra de las dos superficies de secuenciación opuestas, tirando de este modo algún otro material diana a la otra de las dos superficies de secuenciación opuestas donde dicho otro material diana queda inmovilizado por sitios de captura en la otra de las dos superficies de secuenciación opuestas, en donde pasa un período de tiempo predeterminado entre la introducción del fluido y la aplicación de la fuerza magnética, y en donde el tiempo predeterminado varía de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 2 minutos.

14. El método como se define en la reivindicación 13, en donde la densidad del fluido está dentro de 0,08 g/cm3 de la densidad del soporte sólido magnético.

15. El método como se define en una de las reivindicaciones 13 o 14, en donde el fluido es una solución reguladora acuosa.

16. El método como se define en una de las reivindicaciones 13 a 15, en donde la aplicación de la fuerza magnética implica colocar una tira elastomérica incrustada con partículas magnéticas en una superficie externa de la celda de flujo adyacente a la otra de las dos superficies de secuenciación opuestas.

17. El método como se define en una de las reivindicaciones 13 a 16, que comprende además:

interrumpir la aplicación de la fuerza magnética;

eliminar el fluido y complejos no inmovilizados de la celda de flujo;

iniciar la liberación de los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación del soporte sólido de los complejos inmovilizados, sembrando de este modo al menos algunos de los fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación a cebadores respectivos de las dos superficies de secuenciación opuestas;

eliminar el soporte sólido y los fragmentos de ácido nucleico no sembrados listos para la secuenciación;

introducir una mezcla de amplificación que incluye una forma líquida de un material sensible a la temperatura a la celda de flujo;

hacer que la forma líquida del material sensible a la temperatura se gelifique;

iniciar la amplificación de los fragmentos de ácido nucleico sembrados listos para la secuenciación para generar cadenas plantilla, por el cual la forma de gel del material sensible a la temperatura reduce la difusión de las cadenas plantilla;

hacer que la forma de gel del material sensible a la temperatura se licue; y

eliminar la forma líquida del material sensible a la temperatura de la celda de flujo, en donde el material sensible a la temperatura es opcionalmente un copolímero de poli(N-isopropilacrilamida) y polietilenglicol.

18. Un método, que comprende:

inmovilizar simultáneamente un primer material diana en una primera de dos superficies de secuenciación opuestas de una celda de flujo y un segundo material diana en una segunda de las dos superficies de secuenciación opuestas al introducir, en la celda de flujo, un fluido diana que incluye el primer material diana y el segundo material diana, en donde:

un fluido portador del fluido diana tiene una densidad de fluido;

el primer material diana tiene una primera densidad menor que la densidad del fluido; y el segundo material diana tiene una segunda densidad mayor que la densidad del fluido.

19. El método como se define en la reivindicación 18 en donde:

al menos parte del primer material diana se inmoviliza por los sitios de captura respectivos en la primera de las dos superficies de secuenciación opuestas; y

al menos parte del segundo material diana se inmoviliza por los sitios de captura respectivos en la segunda de las dos superficies de secuenciación opuestas.

Un fluido diana, que comprende:

un fluido portador que tiene una densidad de fluido;

un primer material diana que tiene una primera densidad menor que la densidad del fluido; y un segundo material diana que tiene una segunda densidad mayor que la densidad del fluido, en donde:

(a) el primer material diana incluye:

un primer soporte sólido que tiene una primera densidad de soporte sólido aproximadamente igual a la primera densidad; y

fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación unidos al primer soporte sólido; y

el segundo material diana incluye:

un segundo soporte sólido que tiene una segunda densidad de soporte sólido aproximadamente igual a la segunda densidad; y

fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación unidos al segundo soporte sólido; o

(b) el primer material diana incluye:

un primer soporte sólido que tiene una primera densidad de soporte sólido aproximadamente igual a la primera densidad; y

un primer grupo de cadenas plantilla unidas al primer soporte sólido; y el segundo material diana incluye:

un segundo soporte sólido que tiene una segunda densidad de soporte sólido aproximadamente igual a la segunda densidad; y

un segundo grupo de cadenas plantilla unidas al segundo soporte sólido.

Un método, que comprende:

introducir el primer y segundo materiales diana en una celda de flujo que incluye dos superficies de secuenciación opuestas, en donde el primer material diana tiene al menos una propiedad que es diferente del segundo material diana, en donde al menos una propiedad se selecciona del grupo que consiste en densidad, carga, magnetismo, y combinaciones de estos; y

exponer el primer y segundo materiales diana a al menos una condición, que provoca de este modo que el primer material diana se inmovilice por un sitio de captura en una primera de las dos superficies de secuenciación opuestas y el segundo material diana se inmoviliza por un sitio de captura en una segunda de las dos superficies de secuenciación opuestas, en donde:

i) el primer y segundo materiales diana se introducen en la celda de flujo en un fluido que tiene una primera densidad;

el primer material diana es magnético;

el segundo material diana no es magnético y tiene una densidad mayor que la primera densidad; y

la al menos una condición es un campo magnético aplicado para atraer el primer material diana a la primera de las dos superficies de secuenciación opuestas; o ii) el primer y segundo materiales diana se introducen en la celda de flujo en un fluido que tiene una primera densidad;

el primer material diana no es magnético y tiene una densidad menor que la primera densidad;

el segundo material diana es magnético; y

la al menos una condición es un campo magnético aplicado para atraer el segundo material diana a la segunda de las dos superficies de secuenciación opuestas; o iii) el primer y segundo materiales diana se introducen en la celda de flujo en un fluido que tiene una primera densidad;

el primer material diana está cargado negativamente;

el segundo material diana no está cargado y tiene una densidad mayor que la primera densidad; y

la al menos una condición es un campo eléctrico aplicado entre las dos superficies de secuenciación opuestas para generar cargas positivas en la primera de las dos superficies de secuenciación opuestas y cargas negativas en la segunda de las dos superficies de secuenciación opuestas; o

iv) el primer y segundo materiales diana se introducen en la celda de flujo en un fluido que tiene una primera densidad;

el primer material diana está cargado positivamente;

el segundo material diana no está cargado y tiene una densidad mayor que la primera densidad; y

la al menos una condición es un campo eléctrico aplicado entre las dos superficies de secuenciación opuestas para generar cargas negativas en la primera de las dos superficies de secuenciación opuestas y cargas positivas en la segunda de las dos superficies de secuenciación opuestas; o

v) el primer y segundo materiales diana se introducen en la celda de flujo en un fluido que tiene una primera densidad;

el primer material diana no está cargado y tiene una densidad menor que la primera densidad;

el segundo material diana está cargado positivamente; y

la al menos una condición es un campo eléctrico aplicado entre las dos superficies de secuenciación opuestas para generar cargas positivas en la primera de las dos superficies de secuenciación opuestas y cargas negativas en la segunda de las dos superficies de secuenciación opuestas.