ES3040593T3 - Stable hydrolysis-resistant synthetic polyribosylribitolphosphate derivatives as vaccines against haemophilus influenzae type b - Google Patents

Stable hydrolysis-resistant synthetic polyribosylribitolphosphate derivatives as vaccines against haemophilus influenzae type b

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ES3040593T3
ES3040593T3 ES17742787T ES17742787T ES3040593T3 ES 3040593 T3 ES3040593 T3 ES 3040593T3 ES 17742787 T ES17742787 T ES 17742787T ES 17742787 T ES17742787 T ES 17742787T ES 3040593 T3 ES3040593 T3 ES 3040593T3
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Abstract

La presente invención proporciona un sacárido sintético estable derivado del polirribosilribitol-fosfato (PRP) de Hib y su conjugado. Dicho sacárido, dicho conjugado y las composiciones farmacéuticas derivadas del mismo son resistentes a la hidrólisis, estables a largo plazo y útiles para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades asociadas con Haemophilus influenzae, y más específicamente de enfermedades asociadas con Haemophilus influenzae tipo b, preferiblemente enfermedades seleccionadas entre meningitis, neumonía y epiglotitis. Su fórmula general es (I): donde A es la fórmula (II) o la fórmula (III); B es la fórmula (IV); C es la fórmula (V); D es la fórmula (VI); E es la fórmula (VII); F es la fórmula (VIII) o la fórmula (IX). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Derivados sintéticos estables de poliribosilribitolfosfato resistentes a la hidrólisis como vacunas contraHaemophilus influenzaetipo b
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La presente invención proporciona un sacárido sintético estable de un derivado de poliribosilribitol-fosfato (PRP) de Hib y el conjugado del mismo. Dicho sacárido, dicho conjugado y las composiciones farmacéuticas del mismo son resistentes a la hidrólisis, son estables a largo plazo y son útiles para la prevención y/o tratamiento de enfermedades asociadas conHaemophilus influenzae,y más específicamente de enfermedades asociadas conHaemophilus influenzaetipo b.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0002] ElHaemophilus influenzaetipo b (Hib) es un grave problema de salud humana en todo el mundo, y es responsable de una variedad de enfermedades que incluyen meningitis, neumonía, epiglotitis y otras enfermedades del tracto respiratorio, especialmente en niños menores de 5 años. El 30% de los sobrevivientes de las enfermedadestá presentean secuelas que van desde problemas auditivos hasta retraso mental.
[0003] El polisacárido capsular purificado deHaemophilus influenzaees capaz de inducir inmunidad protectora en adultos. Sin embargo, la respuesta inmune en los niños es muy deficiente y está prácticamente ausente en los bebés menores de 2 años. El polisacárido capsular aislado de la bacteria Hib presenta una unidad de repetición de ribosilribitolfosfato:
[0004] Se desarrollaron una variedad de vacunas para la prevención de la infección por Hib y consisten en poliribosilribitolfosfato sintético (PRP) o mezclas de PRP sintético de diferentes longitudes conjugadas a la proteína portadora (WO 9210936 A1, EP 0276516 A2, EP 0320942 A2, WO 0116146 A1). Varias vacunas han sido recientemente autorizadas en los EE. UU. y en otros lugares para uso pediátrico.
[0005] Se reportó que la síntesis de oligosacáridos de Hib es una alternativa útil al aislamiento costoso y engorroso de PRP de Hib a partir de bacterias (IN 2013/DEL/02989, US 6,765,091, WO2016044164 A1 and EP 0320942A). En elJournal of Carbohydrate Chemistry1992, 11, 265 se describe una síntesis en fase sólida de oligosacáridos de Hib. Los disacáridos de Hib, acetilados y metilados, se investigaron mediante espectrometría de masas enCarbohydrate Research1979, 73, 59.
[0006] IN 2013/DEL/02989 informa de una síntesis química de oligosacáridos de Hib con un conector. Se obtuvieron dos unidades diferentes de ribosilribitiol protegidas selectivamente como unidad de iniciación y una unidad de propagación a partir de unidades de ribitol protegidas con bencilo y alilo y ribosa acetilada como materiales de partida. Además, se utilizó aminopentil ribosa protegida como unidad conectora. En primer lugar se acoplaron la unidad de iniciación y la unidad de propagación y el oligómero resultante se acopló además con la unidad conectora. Los oligosacáridos Hib naturales con un conector se obtuvieron por desprotección de todos los grupos protectores. Como se mencionó anteriormente, el poliribosilribitolfosfato (PRP) es el ingrediente activo en una variedad de vacunas que han demostrado ser exitosas en la prevención de enfermedades causadas porHaemophilus influenzaetipo b (Hib).
[0007] La estabilidad a largo plazo de la vacuna contra Hib es necesaria para mantener la inmunogenicidad de dicha vacuna y esto puede ser un desafío para las vacunas conjugadas con Hib dada la susceptibilidad potencial del enlace fosfodiéster en el polímero PRP a la ruptura hidrolítica. Normalmente, el efecto del metabolismo sobre el polisacárido capsular de la vacuna reduce la inmunogenicidad de la vacuna. Se sabe que el óxido de aluminio utilizado como adyuvante acelera la hidrólisis de PRP y la despolimerización de PRP causa la inestabilidad de la vacuna contra Hib y reduce la inmunogenicidad de la vacuna contra Hib(Vaccine19, 1999, p1169-1178).
[0008] Con la consecuencia de que las vacunas contra Hib autorizadas disponibles comercialmente deben almacenarse entre 2° C y 8° C y, por lo general, son estables en estas condiciones durante solo 24 a 36 meses. Además, las formulaciones líquidas de vacunas contra Hib son propensas a dañarse por congelación, lo que se asume es causado por la sal de aluminio presente en la formulación líquida. La sensibilidad al daño por congelación impide el almacenamiento y transporte de las vacunas líquidas contra Hib que deben enfriarse, ya que debe evitarse el uso de hielo para evitar la congelación.
[0009] También se reporta que el componente de polisacárido natural purificado de la pared celular bacteriana contenido en las vacunas comercialmente disponibles puede ser responsable de la inhibición de los receptores b que conducen a un aumento de la broncoconstricción. Además, es bien sabido que las vacunas contra Hib aumentan el riesgo de síntomas de convulsiones en bebés menores de 3 años. Por lo tanto, se requiere de una nueva vacuna contra Hib con inmunogenicidad mejorada mediante la administración de una menor cantidad de dosis y una reducción de los efectos adversos.
[0010] El objetivo de la presente invención es proporcionar un sacárido sintético del derivado de polribosilribitolfosfato (PRP) de Hib y el conjugado del mismo debe ser metabólicamente estable, resistente a la hidrólisis y estable en almacenamiento en formulaciones líquidas. Dicho sacárido, dicho conjugado y las composiciones farmacéuticas del mismo tienen inmunogenicidad mejorada y, por lo tanto, deberían ser particularmente útiles para la prevención y/o tratamiento de enfermedades asociadas conHaemophilus influenzae,y más específicamente de enfermedades asociadas conHaemophilus influenzaetipo b.
[0011] El objetivo de la presente invención se resuelve mediante la enseñanza de las reivindicaciones independientes. Otras características, aspectos y detalles ventajosos de la invención son evidentes a partir de las reivindicaciones dependientes, la descripción, las figuras y los ejemplos de la presente solicitud.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
[0012] El objetivo de la presente invención es proporcionar un sacárido de fórmula general (I)
T1 y T2 representan -H, -L-NH2; en donde si T1 es -L-NH2, entonces T2 es -H y si T1 es -H, entonces T2 es -L-NH2 Xi, X2, X3, X4, X5, y X6 representan — OCH<3>;
n es un número entero seleccionado de 1, 2, 3, o 4;
n i, n2, n3 y n4 son independientemente el uno del otro seleccionados de 0 y 1; y n1+n2+n3+n4 s 1;
con la condición de que si n i+n2+n3+n4 = 1 y si n = 1 y si
y
con la condición de que si n i+n2+n3+n4 = 1 y si n = 1 y si
O que
F es — , o
y
L se selecciona de :-La- , - L a- L e- , - L a- L b- L e-, - L a- L d- L e-,
en donde - L a- se selecciona de: -(C H2)a-, -(C H2-C H2-O )a-C2H4- , -(C H2-C H2-O )a-CH2- ,
- L b- representa -O -, o -O P(O)(OH)-O -;
- L d- representa -(C H2)d-, -(C F2)d-, -(CH2-CH2-O)d-C2H4-, -(C H2-C H2-O )d-CH2- ,
- L e- se selecciona de: -(C H2)ei-, - ( c F2)ei-, -C2H4-(O -C H2- c H2)e2- , -C H2-(O -C H2-C H2)e2- ,
a, d, e l y e2 son independientemente el uno del otro un número entero seleccionado de 1, 2, 3, 4, 5, y 6;
o enantiómeros, diastereómeros, mezclas de enantiómeros, mezclas de diastereómeros, anómeros, hidratos, solvatos de los compuestos mencionados anteriormente y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
[0013] Los sacáridos más pequeños reivindicados por la fórmula (I) son disacáridos, por lo que la disposición de con la condición de que si n1+n2+n3+n4 = 1 y si n = 1 y si
y con la condición de que si n1+n2+n3+n4 = 1 y si n = 1 y si
podría ser reemplazado por la condición de que “el sacárido de fórmula general (I) es al menos un disacárido” [0014] Alternativamente, la disposición anterior podría ser reemplazada por la condición de que si n1+n2+n3+n4 = 1 que n t 1 (n diferente de 1) y si
n = 1 que n1+n2+n3+n4 t 1 (n1+n2+n3+n4 diferente de 1).
[0015] Así, alternativamente, se prefiere el sacárido de fórmula general (I).
T1 y T2 representan -H , -L -N H<2>; en donde si T1 es -L -N H<2>, entonces T2 es -H y si T1 es -H , entonces T2 es -L -N H2;Xi , X2, X3, X4, X5, y X6 representan —OCH<3>;
n es un número entero seleccionado de 1, 2, 3, o 4;
n1, n2, n3 y n4 son independientemente el uno del otro seleccionados de 0 y 1; y n1+n2+n3+n4 s 2;
L se selecciona de: - L a-, - L a- L e- , - L a- L b- L e- , - L a- L d- L e- ,
en donde -L<a>- se selecciona de: -(C H<2>)<a>- , -(C H<2>-C H<2>-O )<a>-C<2>H<4>- , -(C H<2>-C H<2>-O )<a>-C H<2>- ,
- L b- representa -O -,
- L d- representa -(C H<2>)<d>- , -(C F<2>)<d>- , -(C H<2>-C H<2>-O )<d>-C<2>H<4>- , -(C H<2>-C H<2>-O )<d>-C H<2>- ,
- L e- se selecciona de: -(C H<2>)<e i>- , -(C F<2>)<e i>- , -C<2>H<4>-(O -C H<2>-C H<2>)<e2>- , -C H<2>-(O -C H<2>-C H<2>)<e2>- , y -(C H<2>)<e i>-O -(C H<2>)<e 2>, a, d, e l y e2 son independientemente el uno del otro un número entero seleccionado de 1, 2, 3, 4, 5, y 6;
o enantiómeros, diastereómeros, mezclas de enantiómeros, mezclas de diastereómeros, anómeros, hidratos, solvatos de los compuestos mencionados anteriormente y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
[0016] Los sacáridos de fórmula (I) son al menos disacáridos, mientras que al menos los trisacáridos son preferidos y más preferido es que el sacárido de fórmula general (I) es al menos un tetrasacárido.
[0017] Los sacáridos de la presente invención llevan grupos ácidos y/o básicos y pueden formar sales con ácidos o bases orgánicos o inorgánicos. Ejemplos de ácidos adecuados para dicha formación de sales de adición de ácido son ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido cítrico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido salicílico, ácido p-aminosalicílico, ácido málico, ácido fumárico, ácido succínico, ácido ascórbico, ácido maleico, ácido sulfónico, ácido fosfónico, ácido perclórico, ácido nítrico, ácido fórmico, ácido propiónico, ácido glucónico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido hidroximaleico, ácido pirúvico, ácido fenilacético, ácido benzoico, ácido p-aminobenzoico, ácido phidroxibenzoico, ácido metansulfónico, ácido etansulfónico, ácido nitroso, ácido hidroxietansulfónico, ácido etilensulfónico, ácido p-toluensulfónico, ácido naftilsulfónico, ácido sulfanílico, ácido canfosulfónico, ácido china, ácido mandélico, ácido ometilmandélico, ácido hidrógeno-bencenosulfónico, ácido pícrico, ácido adípico, ácido d-o-toliltartárico, ácido tartrónico, ácido (o,m, p)-tolúico, ácido naftilamin sulfónico, y otros minerales o ácidos carboxílicos bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. Las sales se preparan poniendo en contacto la forma de base libre con una cantidad suficiente del ácido deseado para producir una sal de la manera convencional.
[0018] Ejemplos de bases inorgánicas o orgánicas adecuadas son, por ejemplo, NaOH, KOH, NH<4>OH, trialquilamina, trietilamina, hidróxido de tetraalquilamonio, lisina o arginina y similares. Las sales se pueden preparar de manera convencional usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el tratamiento de una solución del sacárido de la fórmula general (I) con una solución de base, seleccionada del grupo mencionado anteriormente.
[0019] Más preferiblemente, los grupos fosfato del sacárido de la fórmula general (I) forman sales o formas zwitterionicas con sodio o con cationes trietilamonio.
[0020] Se prefieren las sales con un catión inorgánico y más preferidas son las sales con un catión inorgánico que tiene una carga positiva única, como Li+, Na+, y K+. Las más preferidas son las sales de Na+.
[0021] Se encontró sorprendentemente que los sacáridos de fórmula general (I) son estables en medios acuosos básicos, así como suspensiones que contienen fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio, tal como el adyuvante comúnmente usado Alhydrogel. Mientras que el PRP natural de Hib se hidroliza en un día en medios acuosos básicos o en presencia de sales de aluminio, los sacáridos de fórmula general (I), así como los conjugados de los mismos, son estables durante varios días incluso a temperaturas elevadas. La mayor estabilidad es particularmente ventajosa para su uso en vacunas contraHaemophilus influenzae.Por lo tanto, los sacáridos de fórmula general (I), así como los conjugados de los mismos, son particularmente útiles para las vacunas líquidas, estables en almacenamiento, contraHaemophilus influenzae,que pueden almacenarse a temperatura ambiente y que no son propensas a sufrir daños por congelación, lo que puede ocurrir, por ejemplo, durante el transporte.
[0022] Sorprendentemente, también se encontró que los sacáridos de fórmula general (I) conjugados con un vehículo inmunogénico son capaces de proporcionar una respuesta inmune protectora contra la bacteriaHaemophilus influenzaeen un huésped animal y/o humano. Además, los sacáridos de fórmula general (I) conjugados a un vehículo inmunogénico son capaces de provocar respuestas sustanciales de IgM e IgG en conejos que son comparables en términos de cinética y producción de IgG a las vacunas conjugadas de PRP de Hib correspondientes disponibles comercialmente. Los anticuerpos provocados por los sacáridos de fórmula general (I) conjugados con un vehículo inmunogénico reaccionan de forma cruzada con el PRP natural de Hib, lo que indica la capacidad de estos anticuerpos para unirse a las bacterias deHaemophilus influenzaey para conferir protección contra las infecciones porHaemophilus influenzae.
[0023] Se prefiere un sacárido de la fórmula (II-1)
(II-1)
en donde
B, C, D, E, L, n1, n2, n3 y n4 tienen los significados como se definió anteriormente;
n es 1 o 2; y
X2- X6 son -O C H<3>;
o enantiómeros, diastereómeros, mezclas de enantiómeros, mezclas de diastereómeros, anómeros, hidratos, solvatos de los compuestos mencionados anteriormente y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
[0024] También se prefiere un sacárido de la fórmula (11-2)
(II-2)
en donde
A es F es
— o — -
B, C, D, E, L, n1, n2, n3 y n4 tienen los significados como se definió Anteriormente;
n es 1 o 2; y
Xi - X5son-OCH3;
o enantiómeros, diastereómeros, mezclas de enantiómeros, mezclas de diastereómeros, anómeros, hidratos, solvatos de los compuestos mencionados anteriormente y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
[0025] Más preferido es un sacárido de la fórmula (III-1)
(III-1) en donde
L tiene el significado como se define anteriormente;
m es un número entero seleccionado de 1 a 9; y
Xa es -O C H3.
[0026] Aún más preferido es un sacárido de la fórmula (III-2)
en donde
L tiene el significado como se define anteriormente;
m es un número entero seleccionado de 1 a 9; y
Xb es —OCH3.
[0027] Más preferido es un sacárido de la fórmula. (IV-1)
m es un número entero seleccionado de 1 a 9; y
Xa es -O C H<3>.
[0028] Aún más preferido es un sacárido de la fórmula (IV-2)
(IV-2)
en donde
m es un número entero seleccionado de 1 a 9; y
Xb es -O CH<3>.
[0029] Más preferido es un sacárido seleccionado del grupo que consiste de:
Compuesto 2b:
Compuesto 4b:
Compuesto 6b:
Compuesto 8b:
A proxim ación S intética
1. S íntesis por etapas del sacárido de la invención.
[0030] Unidades de repetición de disacáridos que tienen estructura de ribosilribitol protegido por grupos protectores apropiados A1*-3 - A1*-5, B1*-1 - B1*-6, C*1-3, unidades de repetición media que tienen estructura de ribosa o ribitol A1*-1, A1*-2, C1*-1, C1*-2, y las unidades terminales que comprenden un conector L, o T1*- T3* se pueden aplicar para varias rutas sintéticas del sacárido de la invención. A1*-1 - A1*-5, B1*-1 - B1*-6, C1*-1 - C1*-3 y T1* - T3* tienen las siguientes estructuras:
A1*-1 A1*-2 A1*-3
en donde Xi y Xj representan independientemente el uno del otro Xi, X2, X3, X4, X5o X6;
P1, P2, P3, P4 y P5 representan grupos protectores que cuando están enlazados a - O - no pueden ser idénticos a Xi y/o Xj;
L tiene el significado como se define anteriormente; y
M+ representa Na+, K+, NH4+, H+ o Et3NH+.
[0031] Una persona experta en la técnica puede imaginar que los grupos protectores P1 a P5 empleados en la síntesis de los sacáridos de la invención de las fórmulas generales (I), (II-1), (II-2), (III-1), (III-2), (IV-1) y (IV-2), así como los conjugados con sus vehículos inmunogénicos, no pueden ser idénticos a Xi y/o Xj, cuando se enlazan a un átomo de oxígeno.
[0032] Algunas de las rutas sintéticas útiles están disponibles por las combinaciones de los bloques de construcción mencionados anteriormente.
[0033] En una modalidad de la presente invención, los siguientes bloques de construcción A1*-3, B1*-1 y T1* o T3* se pueden usar para la síntesis del sacárido de la invención (Esquema 1).
[0034] Se puede usar como bloque de construcción de inicio A1*-3.
[0035] El método sintético A comprende las siguientes etapas:
Proporcionar un bloque de construcción de inicio A1*-3
en donde Xi representa X1, X2, X3, X4, P3 son grup idénticos a Xi;
) Eliminar el grupo P3 de A1*-3;
i) Introducir el grupo fosfonato de hidrógeno en la posición C-3 de una ribosa de un compuesto resultante después de la etapa ii);
iii) Acoplar un bloque de construcción B1*-1 con un compuesto resultante después de la etapa iii)
en donde X<i>representa X<i>, X<2>, X<3>, X<4>, X<5>o X<6>; P<1>y P<3>son grupos protectores que cuando se enlazan a -O- no son idénticos a Xi;
iv) Opcionalmente, repetir las etapas i) - iv) para t veces por medio del uso de un compuesto resultante después de la etapa iv) en lugar del bloque de construcción de inicio A1*-3 en la etapa i), en donde t es un número entero de 0 a 20; v) Eliminar el grupo protector P<2>de un compuesto resultante después de la etapa v);
vi) Acoplar el compuesto T1* con un compuesto resultante después de la etapa vi);
vii) Eliminar los grupos protectores P<1>y P<3>y transformar un grupo azido en un grupo amino para obtener el compuesto de la fórmula (I).
[0036] En el método sintético A mencionado anteriormente, el compuesto T3* también se puede usar en lugar de T1* en la etapa vii). En la etapa viii), la eliminación de los grupos protectores P1 y P3 y la transformación de un grupo azido en un grupo amino se puede realizar por etapas, pero se prefiere al mismo tiempo en las mismas condiciones de reacción.
[0037] Cuando la mitad de la unidad de repetición A1*-1 se usa como bloque de construcción de inicio en lugar del bloque de construcción de inicio A1*-3 en el método sintético A mencionado anteriormente, luego de la etapa v), las siguientes etapas vi') y vii') pueden realizarse en lugar de las etapas vi) - viii):
vi') Acoplar un compuesto resultante después de la etapa v) con T2*;
vii') Eliminar los grupos protectores P1 y P3 y transformar un grupo azido en un grupo amino para obtener el compuesto de la fórmula (I).
[0038] La mitad de la unidad de repetición C1*-1 se puede usar como bloque de construcción de terminación después de la etapa v) en el método sintético A mencionado anteriormente y entonces se pueden realizar las siguientes etapas v i'') x i'') en lugar de las etapas vi): viii):
v i'') Eliminar el grupo protector P3 de un compuesto resultante después de la etapa v);
v ii'') Introducir el grupo fosfonato de hidrógeno en la posición C-3 de una ribosa de un compuesto resultante después de la etapa vi');
v iii'') Acoplar un compuesto resultante después de la etapa v ii'') con C1*-1;
en donde P1 y P5 son grupos protectores;
ix '') Eliminar el grupo protector P2 de un compuesto resultante después de la etapa viii'');
x '') Acoplar el compuesto T1* con un compuesto resultante después de la etapa ix'');
x i'') Eliminar los grupos protectores P1 y P5 y transformar un grupo azido en un grupo amino para obtener el compuesto de la fórmula (I).
[0039] En la etapa iii) y v ii'') del método sintético A, también se puede introducir un grupo fosforamidita en lugar de un grupo fosfonato de hidrógeno en la posición C-3 de una ribosa de un compuesto resultante después de la etapa ii) o etapa v i''). T1* se reemplaza entonces por bis (diisopropilamin) benciloxifosfina y Ho - L - N3.
[0040] En otra modalidad de la presente invención, los siguientes bloques de construcción A1*-4 o A1*-5, y B1*-1 se pueden usar para la síntesis del sacárido de la invención (Esquema 2).
A1*-4 A1*-5 B1*-1
[0041] Se pueden usar como bloques de construcción de inicio A1*-4 o A1*-5.
[0042] El método sintético B comprende las siguientes etapas.:
i) Proporcionar un bloque de construcción de inicio A1*-4 o A1*-5
en donde L es un conector y tiene el mismo significado que el definido anteriormente;
X<i>representa X<i>, X<2>, X<3>, X<4>, X<5>o X<6>; P<1>y P<3>son grupos protectores que cuando se enlazan a ■-O - no son idénticos a X¡;
A1*-5
en donde L es un conector y tiene el mismo significado que el definido anteriormente;
X<i>representa X<i>, X<2>, X<3>, X<4>, X<5>o X<6>; P<1>y P<3>son grupos protectores que cuando se enlazan a - O - no son idénticos a X¡; ii) Eliminar el grupo P<3>de A1*-4 o A1*-5
iii) Introducir el grupo fosfonato de hidrógeno en la posición C-3 de una ribosa de un compuesto resultante después de la etapa ii);
iv) Acoplar un bloque de construcción B1*-1 con un compuesto resultante después de la etapa iii)
en donde X<i>representa X<i>, X<2>, X<3>, X<4>, X<5>o X<6>; P<1>y P<3>son grupos protectores que cuando se enlazan a -O- no son idénticos a X¡;
v) Opcionalmente, repitir las etapas i) - iv) para t veces utilizando un compuesto resultante después de la etapa iv) en lugar del bloque de construcción de inicio A1*-4 o A1*-5 en la etapa i), en donde t es un número de entero de 0 a 20;; vi) Eliminar los grupos protectores P<1>y P<3>y transformar un grupo azido en un grupo amino para obtener el compuesto de la fórmula (I).
[0043] En la etapa vi), la eliminación de los grupos protectores P1 y P3 y la transformación de un grupo azido en un grupo amino se puede realizar por etapas, pero se prefiere al mismo tiempo en las mismas condiciones de reacción.
[0044] La mitad de la unidad de repetición C1*-1 se puede usar como bloque de construcción de terminación después de la etapa v) en el método sintético B mencionado anteriormente y entonces se pueden realizar las siguientes etapas v i") ix ") en lugar de la etapa vi):
v i" ) Eliminar el grupo protector P3 de un compuesto resultante después de la etapa v);
v ii" ) Introducir el grupo fosfonato de hidrógeno en la posición C-3 de una ribosa de un compuesto resultante después de la etapa v i");
v iii") Acoplar un compuesto resultante después de la etapa v ii" ) con C1*-1;
en donde P1 y P5 son grupos protectores;
ix ") Eliminar los grupos protectores P1 y P5 y transformar un grupo azido en un grupo amino para obtener el compuesto de la fórmula (I).
[0045] En la etapa iii) y v ii" ) del método sintético B, también se puede introducir un grupo fosforamidita en lugar de un grupo fosfonato de hidrógeno en la posición C-3 de una ribosa de un compuesto resultante después de la etapa ii) o etapa v i"). El bloque de construcción de inicio A1*-5 se reemplaza entonces por A1*-5' o A1*-5"
Esquema 1. Síntesis de los derivados de oligosacáridos capsulares de Hib por el método sintético A
Esquema 2. Síntesis de los derivados de oligosacáridos capsulares de Hib por el método sintético B
[0046] En una modalidad de la presente invención, los siguientes bloques de construcción A1*-3, B1*-1 y T1* o T3* se pueden usar para la síntesis del sacárido de la invención (Esquema 1).
[0047] Se puede usar como bloque de construcción de inicio A1*-3.
[0048] El método sintético C comprende las siguientes etapas:
i) Proporcionar un bloque de construcción de inicio A1*-3
en donde X<i>representa X<1>, X<2>, X<3>, X<4>, X<5>oX<6>; P<1>, P<2>y P<3>son grupos protectores que cuando se enlazan a -O- no son idénticos a X¡;
ii) Eliminar el grupo P3 de A1*-3;
iii) Introducir el grupo fosfonato de hidrógeno en la posición C-3 de una ribosa de un compuesto resultante después de la etapa ii);
iv) Acoplar un bloque de construcción B1*-1 con un compuesto resultante después de la etapa iii)
B1*-1
en donde X<i>representa X<i>, X<2>, X<3>, X<4>, X<5>o X<6>; P<1>y P<3>son grupos protectores que cuando se enlazan a -O- no son idénticos a X¡;
v) Opcionalmente, repetir las etapas i) - iv) para t veces utilizando un compuesto resultante después de la etapa iv) en lugar del bloque de construcción de inicio A1*-3 en la etapa i), en donde t es un número entero de 0 a 20;
vi) Eliminar el grupo protector P<3>de un compuesto resultante después de la etapa v);
vii) Acoplar el compuesto T1* o T3* con un compuesto resultante después de la etapa vi);
viii) Eliminar los grupos protectores P<1>y P<2>y transformar un grupo azido en un grupo amino para obtener el compuesto de la fórmula (I).
[0049] En la etapa viii), la eliminación de los grupos protectores P1y P3y la transformación de un grupo azido en un grupo amino se puede realizar por etapas, pero se prefiere al mismo tiempo en las mismas condiciones de reacción.
[0050] La mitad de la unidad de repetición A1*-1 se puede usar como bloque de construcción de inicio
A1*-1
en lugar de A1*-3 en la etapa i) en el método sintético C mencionado anteriormente y entonces se agrega a la etapa viii) una etapa para eliminar el grupo protector P4.
[0051] La mitad de la unidad de repetición C1*-1 se puede usar como bloque de construcción de terminación después de la etapa v) n el método sintético C mencionado anteriormente y entonces se pueden realizar las siguientes etapas v i") - x i" ) en lugar de las etapas vi) - viii):
v i" ) Eliminar el grupo protector P3de un compuesto resultante después de la etapa v);
v ii" ) Introducir el grupo fosfonato de hidrógeno en la posición C-3 de una ribosa de un compuesto resultante después de la etapa v i");
v iii") Acoplar un compuesto resultante después de la etapa v ii" ) con C1*-1;
en donde P1y P5son grupos protectores;
ix " ) Eliminar el grupo protector P5de un compuesto resultante después de la etapa viii");
x " ) Acoplar el compuesto T1* o T3* con un compuesto resultante después de la etapa ix");
x i" ) Eliminar los grupos protectores P1y transformar un grupo azido en un grupo amino para obtener el compuesto de la fórmula (I)
[0052] En la etapa iii) y v ii" ) del método sintético C, también se puede introducir un grupo fosforamidita en lugar de un grupo fosfonato de hidrógeno en la posición C-3 de una ribosa de un compuesto resultante después de la etapa ii) o etapa v i"). T1* se reemplaza entonces por bis (diisopropilamin) benciloxifosfina y HO - L - N3.
Esquema 3. Síntesis de los derivados de oligosacáridos capsulares de Hib por el método sintético C
[0053] En otra modalidad de la presente invención, los siguientes bloques de construcción A1*-3 B1*-1, y C1*-2 o C1*-3 se pueden usar para la síntesis del sacárido de la invención.
A1*-3 B1*-1 C1*-2 C1*-3
[0054] Se puede usar como bloque de construcción de inicio A1*-3.
[0055] El método sintético D comprende las siguientes etapas:
i) Proporcionar un bloque de construcción de inicio A1*-3
en donde L es un conector y tiene el mismo significado que el definido anteriormente;
X<i>representa X<1>, X<2>, X<3>, X<4>, X<5>o X<6>; P<1>, P<2>y P<3>son grupos protectores que cuando se enlazan a -O- no son idénticos a X¡;
ii) Eliminar el grupo P<3>de A1*-3;
iii) Introducir el grupo fosfonato de hidrógeno en la posición C-3 de una ribosa de un compuesto resultante después de la etapa ii);
iv) Acoplar un bloque de construcción B1*-1 con un compuesto resultante después de la etapa iii)
en donde X<i>representa X<1>, P<3>son grupos protectores que cuando se enl a X¡;
v) Opcionalmente, repetir las etapas i) - iv) para t veces por medio del uso de un compuesto resultante después de la etapa iv) en lugar del bloque de construcción de inicio A1*-3 en la etapa i), en donde t es un número entero de 0 a 20;
vi) Eliminar el grupo P<3>de un compuesto resultante después de la etapa v);
vii) Acoplar un bloque de construcción C1*-2 o C1*-3 con un compuesto resultante después de la etapa vi)
en donde P1 es un grupo protector;
en donde X<j>representa X<1>, X<2>, X<3>, X<4>, X<5>o X<6>; P<1>es un grupo protector que cuando se enlaza a -O- no es idéntico a X j; viii) Eliminar los grupos protectores P<1>y P<2>y transformar un grupo azido en un grupo amino para obtener el compuesto de la fórmula (I).
[0056] En la etapa viii), la eliminación de los grupos protectores P<1>y P<2>y la transformación de un grupo azido en un grupo amino se puede realizar por etapas, pero se prefiere al mismo tiempo en las mismas condiciones de reacción.
[0057] En la etapa iii), también se puede introducir un grupo fosforamidita en lugar de un grupo fosfonato de hidrógeno en la posición C-3 de una ribosa de un compuesto resultante después de la etapa ii. El bloque de construcción de inicio C1*-3 se
[0058] En una modalidad de la presente invención, los siguientes bloques de construcción consisten en dos unidades de repetición útiles para la síntesis del sacárido de la invención mediante un enfoque sintético [2 2]:
[0059] Un método sintético E-1 comprende las siguientes etapas (Esquema 4):
i) Proporcionar un bloque de construcción de inicio seleccionado de A2*-2, A2*-3, o A2*-4
en donde L es un conector y tiene el mismo significado que el definido anteriormente;
X<i>y X<j>representan independientemente el uno del otro X<i>, X<2>, X<3>, X<4>, X<5>o X<6>; P<1>representa un grupo protector que cuando se enlaza a - O - no es idéntico a Xi y Xj; y
ii) Acoplar un bloque de construcción B2*-3 con un bloque de construcción de inicio seleccionado de A2*-2, A2*-3, o A2*-4
en donde X<i>y X<j>representan independientemente el uno del otro X<1>, X<2>, X<3>, X<4>, X<5>o X<a>; P<1>y P<3>son grupos protectores que cuando se enlazan a -O- no son idénticos a X¡ y X¡;
iii) Eliminar el grupo P<3>de un compuesto resultante después de la etapa ii);
iv) Introducir el grupo fosfonato de hidrógeno en la posición C-3 de una ribosa de un compuesto resultante después de la etapa iii);
v) Opcionalmente, repetir las etapas i) - iv) para t veces por medio del uso de un compuesto resultante después de la etapa iv) en lugar del bloque de construcción de inicio en la etapa i), en donde t es un número entero de 0 a 10;
vi) Eliminar los grupos protectores P<1>y P<3>de un compuesto resultante después de la etapa v) y transformar un grupo azido en un grupo amino para obtener el compuesto de la fórmula (I).
[0060] En la etapa vi), la eliminación de los grupos protectores P1 y P3 y la transformación de un grupo azido en un grupo amino se puede realizar por etapas, pero se prefiere al mismo tiempo en las mismas condiciones de reacción.
[0061] Después de la etapa v) del método sintético E-1, un bloque de construcción adicional B2*-4 se puede acoplar alternativamente con el compuesto resultante después de la etapa v). En este caso, el método sintético E-1 comprende las siguientes etapas en lugar del paso vi):
vi') Acoplar un bloque de construcción B2*-4 con un compuesto resultante después de la etapa v);
en donde X<j>representa X<1>, X<2>, X<3>, X<4>, X<5>o X<a>; P<1>y P<5>son grupos protectores que cuando se enlazan a -O- no son idénticos a X¡;
vii ) Eliminar los grupos protectores P1 y P5 de un compuesto resultante después de la etapa vi') y transformar un grupo azido en un grupo amino para obtener el compuesto de la fórmula (I).
Esquema 4. Síntesis de los derivados de oligosacáridos capsulares de Hib por el método E-1
[0062] Por supuesto, B2*-3 o B2*-4 pueden usarse como bloques de construcción de inicio. En este caso, un método sintético alternativo E-2 comprende las siguientes etapas:
i) Proporcionar un bloque de construcción de inicio seleccionado de B2*-3, o B2*-4
en donde X<i>y X<j>representan independientemente el uno del otro X<1>, X<2>, X<3>, X<4>, X<5>o X<6>; P<1>y P<3>son grupos protectores que cuando se enlazan a -O- no son idénticos a X¡ y Xj;
en donde X<j>representa X<1>, X<2>, X<3>, X<4>, X<5>o X<6>; P<1>y P<5>son grupos protectores que cuando se enlazan a -O- no son idénticos a X;
ii) Acoplar un bloque de construcción B2*-1 con el bloque de construcción de inicio seleccionado de B2*-3, o B2*-4
en donde X<i>y X<j>representan independientemente el uno del otro X<1>, o X<6>; cuando se enlazan a -O- no son idénticos a X¡ y Xj;
iii) Eliminar el grupo protector P<2>de un compuesto resultante después de la etapa ii);
iv) Opcionalmente, repetir las etapas i) - iii) para t veces por medio del uso de un compuesto resultante después de la etapa iii) en lugar del bloque de construcción de inicio en la etapa i), en donde t es un número entero de 0 a 10;
v) Acoplar el compuesto resultante después de la etapa iv) con un bloque de construcción seleccionado de A2*-2, A2*-3, o A2*-4
en donde L es un conector y tiene el mismo significado que el definido anteriormente;
X<i>y X representan independientemente el uno del otro X<1>, X<2>, X<3>, X<4>, X<5>o X<6>; P<1>representa un grupo protector que cuando se unen a -O- no es idéntico a Xi y/o Xj;
vi) Eliminar los grupos protectores P1, P3 y P5 de un compuesto resultante después de la etapa v) y transformar un grupo azido en un grupo amino para obtener el compuesto de la fórmula (I).
[0063] En la etapa vi), la eliminación de los grupos protectores P1, P3 y P5 y la transformación de un grupo azido en un grupo amino se puede realizar por etapas, pero se prefiere al mismo tiempo en las mismas condiciones de reacción.
[0064] Un método sintético alternativo E-3 difiere del método sintético E-1 en que la fosforamidita es empleada en lugar de la química del fosfonato. Así, el método sintético E-3 comprende las siguientes etapas:
i) Proporcionar un bloque de construcción de inicio seleccionado de A2*-2'', A2*-3'', o A2*-4''
en donde L es un conector y tiene el mismo significado que el definido anteriormente;
X<i>y X representan independientemente el uno del otro X<1>, X<2>, X<3>, X<4>, X<5>o X<6>; P<1>representa un grupo protector que cuando se enlaza a - O - no es idéntico a X y Xj; y
iiAcoplar un bloque de construcción B2*-3" con un bloque de construcción de inicio seleccionado de A2*-2'', A2*-
en donde X<i>y X<j>representan independientemente el uno del otro X<5>o X<6>; P<1>y P<3>cuando se enlazan a -O- no son idénticos a X¡ y X¡;
iii) Eliminar el grupo P3 de un compuesto resultante después de la etapa ii);
iv) Introducir el grupo fosforamidita en la posición C-3 de una ribosa de un compuesto resultante después de la etapa iii);
v) Opcionalmente, repetir las etapas i) - iv) para t veces por medio del uso de un compuesto resultante después de la etapa iv) en lugar del bloque de construcción de inicio en la etapa i), en donde t es un número entero de 0 a 10;
vi) Eliminar los grupos protectores P<1>y P<3>de un compuesto resultante después de la etapa v) y transformar un grupo azido en un grupo amino para obtener el compuesto de la fórmula (I).
[0065] En la etapa vi), la eliminación de los grupos protectores P1 y P3 y la transformación de un grupo azido en un grupo amino se puede realizar por etapas, pero se prefiere al mismo tiempo en las mismas condiciones de reacción.
[0066] Después de la etapa v) del método sintético E-3, un bloque de construcción adicional B2*-4'' se puede acoplar alternativamente con el compuesto resultante después de la etapa v). En este caso, el método sintético E-3 comprende las siguientes etapas en lugar del paso vi):
vi') Acoplar un bloque de construcción B2*-4" con un compuesto resultante después de la etapa v);
en donde X<j>representa X<1>, X<2>, X<3>, X<4>, X<5>o X<6>; P<1>y P<5>son grupos protectores que cuando se enlazan a -O- no son idénticos a X¡;
vii') Eliminar los grupos protectores P<1>y P<5>de un compuesto resultante después de la etapa vi') y transformar un grupo azido en un grupo amino para obtener el compuesto de la fórmula (I).
[0067] Un método sintético F-1 comprende las siguientes etapas (Esquema 5):
i) Proporcionar un bloque de construcción de inicio seleccionado de A2*-1 o B2*-1
en donde Xi y Xj representan independientemente el uno del otro X5o X6; protectores que cuando se enlazan a - O - no son idénticos a X¡ y Xj;
ii) Acoplar un bloque de construcción B2*-3 con un bloque de construcción de inicio seleccionado de A2*-1 o B2*-1
B2*-3
en donde Xi y Xj representan independientemente el uno del otro Xi, X2, X3, X4, X5o X6; P1y P3cuando se enlazan a -O- no son idénticos a X¡ y X¡;
iii) Eliminar el grupo P3de un compuesto resultante después de la etapa ii);
iv) Introducir el fosfonato de hidrógeno en la posición C-3 de una ribosa de un compuesto resultante después de la etapa iii);
v) Opcionalmente, repetir las etapas i) - iv) para t veces por medio del uso de un compuesto resultante después de la etapa iii) en lugar del bloque de construcción de inicio en la etapa i), en donde t es un número entero de0a10;
vi) Acoplar un bloque de construcción seleccionado de C2*-1, C2*-2, C2*-3 o C2*-4
en donde Xi y Xj representan independientemente el uno del otro X1, X2, X3, X4, X5o X6; P1 y P3 son grupos protectores que cuando se enlazan a -O- no son idénticos a X¡ y X¡;
vii) Eliminar los grupos protectores P1, P2, P3 y P4 de un compuesto resultante después de la etapa vi) y transformar un grupo azido en un grupo amino para obtener el compuesto de la fórmula (I).
[0068] En la etapa vii), la eliminación de los grupos protectores P1, P2, P3 y P4 y la transformación de un grupo azido en un grupo amino se puede realizar por etapas, pero se prefiere al mismo tiempo en las mismas condiciones de reacción.
[0069] Por supuesto, C2*-1, C2*-2, C2*-3, o C2*-4 pueden usarse como bloques de construcción de inicio. En este caso, un método sintético alternativo F-2 comprende las siguientes etapas:
i) Proporcionar un bloque de construcción de inicio seleccionado de C2*-1, C2*-2, C2*-3, o C2*-4
en donde X<i>y X<j>representan independientemente el uno del otro X<1>, X<2>, X<3>, X<4>, X<5>o X<6>; P<1>y P<3>son grupos protectores que cuando se enlazan a -O- no son idénticos a X¡ y X¡;
ii) Acoplar un bloque de construcción B2*-1 con un bloque de construcción de inicio seleccionado de C2*-1, C2*-2, C2*-3, o C2*-4
en donde Xi y Xj representan independientemente el uno del otro X1, X2, X3, X4, X5o X6; P1y P2son grupos protectores que cuando se enlazan a -O- no son idénticos a X¡ y X¡;
iii) Eliminar el grupo protector P2 de un compuesto resultante después de la etapa ii);
iv) Opcionalmente, repetir las etapas i) - iii) para t veces por medio del uso de un compuesto resultante después de la etapa iii) en lugar del bloque de construcción de inicio en la etapa i), en donde t es un número entero de 0 a 10;
v) Acoplar el bloque de construcción de inicio seleccionado de A2*-1 o B2*-1
en donde Xi y Xj representan independientemente el uno del otro X6; P1, protector que cuando se enlazan a - O - no son idénticos a X¡ y Xj;
vi) Eliminar los grupos protectores P1, P2, P3 y P4 de un compuesto resultante después de la etapa v) y transformar un grupo azido en un grupo amino para obtener el compuesto de la fórmula (I).
[0070] En la etapa vi), la eliminación de los grupos protectores P1, P2, P3 y P4 y la transformación de un grupo azido en un grupo amino se puede realizar por etapas, pero se prefiere al mismo tiempo en las mismas condiciones de reacción.
Esquema 5. Síntesis de los derivados de oligosacáridos capsulares de Hib por el método F-1
[0071] Además, los siguientes bloques de construcción consisten en dos unidades de repetición que son útiles para la síntesis del sacárido de la invención mediante un enfoque sintético [2 2]:
[0072] Un método sintético G-1 comprende las siguientes etapas:
i) Proporcionar un bloque de construcción de inicio seleccionado de A2*-2', A2*-3', o A2*-4'
en donde L es un conector y tiene el mismo significado que el definido anteriormente;
Xi y Xj representan independientemente el uno del otro Xi, X2, X3, X4, X5o X6; P1representa un grupo protector que cuando se enlaza a - O - no es idéntico a Xi y Xj;
ii) Acoplar un bloque de construcción B2*-3' con un bloque de construcción de inicio seleccionado de A2*-2', A2*-3', o A2*-4'
en donde Xi y Xj representan independientemente el uno del otro Xi, X2, X3, X4, X5o X6; P1y P3son grupos protectores que cuando se enlazan a -O- no son idénticos a Xi y Xj;
iii) Eliminar el grupo P3 de un compuesto resultante después de la etapa ii);
iv) Opcionalmente, repetir las etapas i) - iii) para t veces por medio del uso de un compuesto resultante después de la etapa iii) en lugar del bloque de construcción de inicio en la etapa i), en donde t es un número entero de 0 a 10;
v) Eliminar los grupos protectores P1 y P3 de un compuesto resultante después de la etapa iv) y transformar un grupo azido en un grupo amino para obtener el compuesto de la fórmula (I).
[0073] En la etapa v), la eliminación de los grupos protectores P1 y P3 y la transformación de un grupo azido en un grupo amino se puede realizar por etapas, pero se prefiere al mismo tiempo en las mismas condiciones de reacción.
[0074] Después de la etapa iv) del método sintético G -1 , se puede acoplar alternativamente un bloque de construcción adicional B 2*-4 ' con el compuesto resultante después de la etapa v). En este caso, el método sintético G-1 comprende los siguientes pasos en lugar del paso vi):
v ') Acoplar un bloque de construcción B2*-4 ' con un compuesto resultante después de la etapa vi);
en donde Xj representa Xi, X2, X3, X4, X5o X6; P1 y P5 son grupos protectores que cuando se enlazan a -O- no son idénticos a Xj;
v i') Eliminar los grupos protectores P1 y P5 de un compuesto resultante después de la etapa v ') y transformar un grupo azido en un grupo amino para obtener el compuesto de la fórmula (I).
[0075] Por supuesto, B 2*-3 'o B2*-4 ' pueden usarse como bloques de construcción de inicio. En este caso, una metodología sintética alternativa G-2 comprende las siguientes etapas:
i) Proporcionar un bloque de construcción de inicio seleccionado de B 2*-3 ', o B2*-4 '
en donde Xi y Xj representan independientemente el uno del otro X1, X2, X3, X4, X5o X6; P1 y P3 son grupos protectores que cuando se enlazan a -O- no son idénticos a X ¡ y Xj;
en donde Xj representa X1, X2, X3, X4, X5o X6; P1 y P5 son grupos protectores que cuando se enlazan a -O- no son idénticos a Xj ;
ii) Acoplar un bloque de construcción B 2*-1 ' con un bloque de construcción de inicio seleccionado de B2*-3 , o B2*-4
en donde Xiy Xjrepresentan independientemente el uno del otro Xi, X2, X3, X4, X5 o X6; P1y P2son grupos protectores que cuando se enlazan a -O- no son idénticos aX¡ yXj;
iii) Eliminar el grupo protector P2de un compuesto resultante después de la etapa ii);
iv) Introducir el grupo fosfonato de hidrógeno en la posición C-5 de ribitol de un compuesto resultante después de la etapa iii);
v) Opcionalmente, repetir las etapas i) - iv) paratveces por medio del uso de un compuesto resultante después de la etapa iv) en lugar del bloque de construcción de inicio en la etapa i), en dondetes un número entero de 0 a 10;
vi) Acoplar el compuesto resultante después de la etapa v) con un bloque de construcción seleccionado deA2*-2 ', A 2 * -3 ', oA 2*-4 '
en donde L es un conector y tiene el mismo significado que el definido anteriormente;
Xiy Xjrepresentan independientemente el uno del otro Xi, X2, X3, X4, X5 o X6; P1representa un grupo protector que cuando se enlaza a -O - no es idéntico aX¡ yX¡;
vii) Eliminar los grupos protectores P1, P3y P5de un compuesto resultante después de la etapa vi) y transformar un grupo azido en un grupo amino para obtener el compuesto de la fórmula (I).
[0076]En la etapa vii), la eliminación de los grupos protectores P1, P3y P5y la transformación de un grupo azido en un grupo amino se puede realizar por etapas, pero se prefiere al mismo tiempo en las mismas condiciones de reacción.
[0077]Un método sintéticoH-1comprende las siguientes etapas:
i) Proporcionar un bloque de construcción de inicio seleccionado deA 2*-1 'oB2*-1 '
en donde Xi y X representa independientemente el uno del otro X1, o X6; protectores;
ii) Acoplar un bloque de construcción B 2*-3 ' con un bloque de construcción de inicio seleccionado de A 2 *-1 ' o B2*-1 '
en donde Xi y Xj representa independientemente el uno del otro X1, X2, X3, X4, X5o X6; P1 y P3 son grupos protectores;
iii) Eliminar el grupo P3 de un compuesto resultante después de la etapa ii);
iv) Opcionalmente, repetir las etapas i) - iii) para t veces por medio del uso de un compuesto resultante después de la etapa iii) en lugar del bloque de construcción de inicio en la etapa i), en donde t es un número entero de 0 a 10;
v) Acoplar el compuesto resultante después de la etapa iv) con un bloque de construcción seleccionado de C 2 *-1 ',
en donde Xi y Xj representan independientemente el uno del otro X1, X2, X3, X4, X5o X6; P1 y P3 son grupos protectores;
vi) Eliminar los grupos protectores P1, P2, P3 y P4 de un compuesto resultante después de la etapa v) y transformar un grupo azido en un grupo amino para obtener el compuesto de la fórmula (I).
[0078] En la etapa vi), la eliminación de los grupos protectores P1, P2, P3 y P4 y la transformación de un grupo azido en un grupo amino se puede realizar por etapas, pero se prefiere al mismo tiempo en las mismas condiciones de reacción.
[0079] Por supuesto, C 2*-1 ', C 2*-2 ', C 2*-3 ', o C2*-4 ' pueden usarse como bloques de construcción de inicio. En este caso, una metodología sintética alternativa H-2 comprende las siguientes etapas:
i) Proporcionar un bloque de construcción de inicio seleccionado de C 2*-1 ', C 2*-2 ', C 2*-3 ', o C2*-4 '
en donde Xi y Xj representan independientemente el uno del otro X1, X2, X3, X4, X5o X6; P1 y P3 son grupos protectores que cuando se enlazan a -O- no son idénticos a X ¡ y Xj;
ii) Acoplar un bloque de construcción B 2*-1 ' con un bloque de construcción de inicio seleccionado de C 2*-1 ', C 2 *-2 ', C 2 *-3 ', o C2*-4 '
en donde Xi y Xj representan independientemente el uno del otro X1, X2, X5o X6; P1 y P2 son g cuando se enlazan a -O- no son idénticos a X ¡ y Xj;
iii) Eliminar el grupo protector P2 de un compuesto resultante después de la etapa ii);
iv) Introducir el grupo fosfonato de hidrógeno en la posición C-5 de ribitol de un compuesto resultante después de la etapa iii);
v) Opcionalmente, repetir las etapas i) - iv) para t veces por medio del uso de un compuesto resultante después de la etapa iii) en lugar del bloque de construcción de inicio en la etapa i), en donde t es un número entero de 0 a 10;
vi) Acoplar un compuesto resultante después de la etapa v) con un bloque de construcción seleccionado de A 2*-1 ' o B2*-1 '
en donde Xi y Xj representan independientemente el uno del otro Xi X2, X3, X4, X5o X6; P1, P2 y P4 representan grupos protectores que cuando se enlazan a - O - no son idénticos a Xi y Xj;
vii) Eliminar los grupos protectores P1, P2, P3 y P4 de un compuesto resultante después de la etapa vi) y transformar un grupo azido en un grupo amino para obtener el compuesto de la fórmula (I).
[0080] En la etapa vii), la eliminación de los grupos protectores P1, P2, P3 y P4 y la transformación de un grupo azido en un grupo amino se puede realizar por etapas, pero se prefiere al mismo tiempo en las mismas condiciones de reacción.
[0081] Un método sintético J-1 comprende las siguientes etapas:
i) Proporcionar un bloque de construcción de inicio B2*-1
en donde Xi y Xj representan independientemente el uno del otro X1, P2 que cuando se enlazan a -O- no son idénticos a X i y Xj;
ii) Introducir el grupo fosforamidita en la posición C-3 de una ribosa de un bloque de construcción B 2 *-1 " ;
iii) Acoplar un bloque de construcción B2*-3" con un compuesto resultante después de la etapa ii);
en donde Xi y Xj representan independientemente el uno del otro X1, X2, X3, X4, X5o X6; P1 y P3 son grupos protectores que cuando se enlazan a -O- no son idénticos a X i y Xj;
iv) Eliminar el grupo protector P3 de un compuesto resultante después de la etapa iii);
v) Opcionalmente, repetir las etapas i) - iv) para t veces por medio del uso de un compuesto resultante después de la etapa iv) en lugar del bloque de construcción B2*-3" en la etapa iii), en donde t es un número entero de 0 a 10;
vi) Acoplar un compuesto H O -L-N3con un compuesto resultante después de la etapa v);
vii) Eliminar los grupos protectores P1, P2, y P3 y transformar un grupo azido en un grupo amino para obtener el compuesto de la fórmula (I).
[0082] En la etapa vii), la eliminación de los grupos protectores P1, P2, y P3 y la transformación de un grupo azido en un grupo amino se puede realizar por etapas, pero se prefiere al mismo tiempo en las mismas condiciones de reacción.
[0083] Un método sintético J-2 comprende las siguientes etapas:
i) Proporcionar un bloque de construcción de inicio B2*-1
B2*-1 '
en donde Xi y Xj representan independientemente el uno del otro Xi, X2, o X6; protectores que cuando se enlazan a -O- no son idénticos a X i y Xj;
ii) Introducir el grupo fosforamidita en la posición C-3 de una ribosa de un bloque de inicio B 2 * -1 '" ;
iii) Acoplar el bloque de construcción B 2 * -3 " ' con un compuesto resultante después de la etapa ii);
B2*-3 "
en donde Xi y Xj representan independientemente el uno del otro X1, X2, X3, X4, X5o X6; P1 y P3 son grupos protectores que cuando se enlazan a -O- no son idénticos a X i y Xj;
iv) Eliminar el grupo P3 de un compuesto resultante después de la etapa iii);
v) Opcionalmente, repetir las etapas i) - iv) para t veces por medio del uso de un compuesto resultante después de la etapa iv) en lugar del bloque de construcción B 2 * -3 " en la etapa iii), en donde t es un número entero de 0 a 10;
vi) Acoplar un compuesto H O -L-N3con un compuesto resultante después de la etapa v);
vii) Eliminar los grupos protectores P1, P2, y P3 y transformar un grupo azido en un grupo amino para obtener el compuesto de la fórmula (I).
[0084] En la etapa vii), la eliminación de los grupos protectores P1, P2, y P3 y la transformación de un grupo azido en un grupo amino se puede realizar por etapas, pero se prefiere al mismo tiempo en las mismas condiciones de reacción.
[0085] Además, los derivados de oligosacáridos capsulares de Hib de la presente invención pueden sintetizarse mediante el método de policondensación I. Los siguientes bloques de construcción son adecuados para el método de policondensación. I:
T2*
HO—L —N3
en donde Xi, Xj, P1, P2, P3, y L tienen el mismo significado que el definido anteriormente.
[0086] Una unidad de repetición que tiene dos grupos funcionales, por ejemplo, fosfonato de hidrógeno o grupos fosforamidita e hidroxi es adecuada para la reacción de policondensación. Para inactivar la reacción de policondensación, se puede usar un bloque de construcción de inactivación que tiene un grupo hidroxilo. Como unidad de repetición, los disacáridos B1*-5 , B1*-6 y los tetrasacáridos B2*-2 , B2*-3 ' son adecuados para la policondensación. Como bloque de construcción de inactivación, se pueden usar T2*, A 1*-6 , A 1*-7 , A 1*-8 , B1*-1 , B1*-4 , C1*-1 , C1*-2 , y C1*-3.
[0087] Cuando se usa B1*-5 o B2*-2 como unidad de repetición, T2*, C1*-1 , C1*-2 , y C1*-3 pueden usarse como bloque de construcción de inactivación. Cuando se usa B1*-6 o B2*-2 ' como unidad de repetición, T2*, A 1*-6 , A1*-7 y A1*-8 se pueden usar como bloque de construcción de inactivación.
[0088] Método sintético I por policondensación que comprende los siguientes pasos:
) Proporcionar al menos una unidad de repetición adecuada para la reacción de policondensación;
i) Realizar la reacción de policondensación de al menos una unidad de repetición;
ii) Inactivar la reacción de policondensación de la al menos una unidad de repetición por medio de un bloque de construcción de inactivación;
iv) Eliminar el grupo protector P y transformar un grupo azido en un grupo amino para obtener el compuesto de la fórmula (I) o a mezcla de los compuestos de la fórmula (I);
en donde cuando B1*-5 o B2*-2 se usan como unidad de repetición, T2* C1*-1 , C1*-2 o C1*-3 se usan como bloque de construcción de inactivación; y
cuando B1*-6 o B 2*-2 ' se usan como unidad de repetición, T2*, A 1*-6 , A1*-7 o A1*-8 se usan como bloque de construcción de inactivación.
[0089] Alternativamente, al menos una unidad de repetición y un bloque de construcción de inactivación se pueden proporcionar al mismo tiempo y la reacción de policondensación de la al menos una unidad de repetición y la inactivación de la reacción de policondensación se realiza automáticamente en un sistema de un solo recipiente.
[0090] Una relación molar entre la suma de al menos una unidad de repetición y un bloque de construcción de inactivación juega un papel crítico para la longitud y diversidad de oligosacáridos.
[0091] Al menos una unidad de repetición y un bloque de construcción de inactivación se proporcionan en un rango de relación molar entre la unidad de repetición y el bloque de construcción de inactivación de 20:1 a 1:1, preferido de 20:1 a 3:1, más preferido de 15:1 a 4:1, aún más preferido de 10:1 a 5:1.
[0092] Por lo tanto, una modalidad de la presente invención es un compuesto intermedio para la síntesis del sacárido de la fórmula (I) seleccionado del grupo que consiste de:
A 1*-2 , A 1*-3 , A 1*-4 , A 1*-5 , A 1*-5 ', A 1*-5 '', A 1*-6 , A 1*-7 , A 1*-8 , B1*-1 , B1*-2 , B1*-3 , B1*-4 , B1*-5 , B1*-6 , C1*-2 , C1*-3 , C1*-3', C 1*-3 '', A 2*-1 , A 2*-2 , A 2*-3 , A 2*-4 , B2*-1 , B2*-2 , B2*-3 , B2*-4 , C2*-1 , C2*-2 , C2*-3 , C2*-4 , A 2 *-1 ', A 2 *-2 ', A 2 *-3 ', A 2 *-4 ', A 2 *-2 " , A 2 *-3 " , A 2*-4 " , B 2*-1 ', B 2 * -1 ', B 2 M " , B 2*-2 ', B 2*-3 ', B 2 *-3 " , B2*-3 " , B 2*-4 ', C 2*-1 ',C 2*-2 ', C2*-3 ' y C 2 *-4 ':
A1*-2 A1*-3 A1*-4
en donde P1, P2, P3, P4, y P5representan grupos protectores que cuando se enlazan a - O - no son idénticos a X¡ y Xj; X¡ y Xj representan independientemente el —OCH3
L tiene el mismo significado que el definido anteriormente;
M+ representa Na+, K+, NH4+, o HNEt3+, y
en donde los grupos protectores P1, P2, P3, P4, P5y P6se seleccionan independientemente de acetilo, bencilo, benzoílo, pmetoxibencilo, p-metoxifenilo, para-bromobencilo, o-nitrofenilo, p-nitrofenilo, alilo, metilo, isopropilo, levulinilo, dimetoxitritilo (DMTr), tritilo, 2-naftilmetil (Nap), pivaloilo, triisopropilsililo, terc-butildimetilsililo, terc-butildifenilsililo, terc-butilmetoxifenilsililo, trietilsililo, trimetilsililo, y2-trimetilsililetoximetilo.
[0093] Alternativamente, una modalidad de la presente invención es un compuesto intermedio para la síntesis del sacárido de la fórmula (I) seleccionado del grupo que consiste en:
A1*-4, A1*-5, A1*-6, A1*-7, A1*-8, B1*-1, B1*-2, B1*-3, B1*-4, B1*-5, B1*-6, C1*-2, C1*-3, A2*-1, A2*-2, A2*-3, A2*-4, B2*-1, B2*-2, B2*-3, B2*-4, C2*-1, C2*-2, C2*-3, C2*-4, A2*-1', A2*-2', A2*-3', A2*-4', B2*-1', B2*-2', B2*-3', B2*-4', B 2 *-1 ", B2*-3 " , C2*-1',C2*-2', C2*-3' y C2*-4':
A1*-4A1*-5
C2*-3 C2*-4
en donde P1, P2, P3, P4, y P5 representan grupos protectores;
X¡ y Xj representan — OCH3
L tiene el mismo significado que el definido anteriormente;
M+ representa Na+, K+, NH4+, o HNEt3+, y
en donde los grupos protectores P1, P2, P3, P4, P5 y P6 se seleccionan independientemente de acetilo, bencilo, benzoílo, pmetoxibencilo, p-metoxifenilo, para-bromobencilo, o-nitrofenilo, p-nitrofenilo, alilo, metilo, isopropilo, levulinilo, dimetoxitritilo (DMTr), tritilo, 2-naftilmetil (Nap), pivaloilo, triisopropilsililo, terc-butildimetilsililo, terc-butildifenilsililo, terc-butilmetoxifenilsililo, trietilsililo, trimetilsililo, y 2-trimetilsililetoximetilo.
[0094] El térm ino "grupos protectores", como se usa en el presente documento, se refiere a grupos de protección comúnmente usados en síntesis orgánica, preferiblemente para grupos hidroxilo.
[0095] Más específicamente, P1, P2, P3, P4, P5 y P6 son preferiblemente grupos protectores adecuados para grupos hidroxilo, más preferiblemente diferentes grupos protectores adecuados para grupos hidroxilo que pueden elim inarse posteriormente uno tras otro mediante una secuencia adecuada de reacciones de desprotección. Más específicamente, en una modalidad preferida de la presente invención, P1, P5 y P6 pueden ser bencilo o p-metoxibencilo, P2 puede ser alilo, dimetoxitritilo (DMTr), 2-naftilmetilo (Nap) o tritilo, P3 puede ser levulinilo (Lev) o 2-naftilmetilo (Nap), P4 puede ser metilo o acetilo.
[0096] En una modalidad particularmente preferida, P1 puede ser bencilo, P2 puede ser 2-naftilmetilo y P3 puede ser levulinilo.
[0097] La eliminación de un grupo DMTr como el grupo protector P2 mediante el tratam iento con ácido tricloroacético conduce a un alcohol primario en la posición C-5 de ribitol, que se acopla con un fosfonato de hidrógeno o fosforam idita en la posición C-3 de ribosa de un bloque de construcción asociado. La ruptura de un grupo levulinilo como el grupo protector P3 por tratam iento con acetato de hidrazina conduce a un alcohol secundario en la posición C-3 de ribosa, que también reacciona con fosfonato de hidrógeno o fosforam idita en la posición C-5 de un ribitol de un bloque de construcción asociado.
[0098] La desprotección de un grupo bencilo como el grupo protector P1 se lleva a cabo preferiblemente por reacción de hidrogenación catalizada por Pd. La misma condición de reacción puede aplicarse a la transformación de un grupo azido en un grupo amina.
[0099] Para introducir un grupo fosfonato de hidrógeno en la posición C-3 de ribosa o en la posición C-5 de un bloque de construcción o un compuesto resultante después de la desprotección del grupo protector P3 o P2, se prefiere la reacción de un grupo hidroxilo en la posición C-3 de ribosa o en la posición C-5 de ribitol con triclorofosfina y trietilamina en presencia de imidazol.
[0100] Para introducir un grupo fosforamidita en la posición C-3 de ribosa o en la posición C-5 de ribitol de un bloque de construcción o un compuesto resultante después de la desprotección de un grupo protector P3 o P2, se prefiere la reacción de un grupo hidroxilo en la posición C-3 de ribosa o en la posición C- 5 de ribitol con bis (diisopropilamin)benciloxifosfina en presencia de tetrazolida de diisopropilamonio.
[0101] El cloruro de pivaloilo se utiliza como reactivo de condensación o acoplamiento para acoplar un par de bloques de construcción. Como se describió anteriormente, para la reacción de acoplamiento, un compañero de acoplamiento tiene un grupo hidroxilo y el otro compañero de acoplamiento tiene un grupo fosfonato de hidrógeno.
[0102] Para la reacción de policondensación, un bloque de construcción tiene dos grupos funcionales, por ejemplo, un grupo hidroxilo y un grupo fosfonato de hidrógeno.
C o ne c to r
[0103] Por lo tanto, la presente invención está relacionada con un sacárido de cualquiera de las fórmulas generales (I), (II-1), (11-2), (II-4), (III-1), (III-2), (IV -1) y (IV-2) que contienen un grupo - O - L-N H2que es adecuado para la conjugación con un vehículo inmunogénico a través del átomo de nitrógeno del grupo -O -L -N H2. El conector L puede ser cualquier residuo no inmunogénico como se define anteriormente. De este modo, el conector L , aunque forma parte del sacárido de cualquiera de las fórmulas generales (I), (11-1), (11-2), (11-4), (MI-1), (MI-2), (IV-1) y (IV-2), así como de cualquier conjugado de un sacárido de cualquiera de las fórmulas generales (I), (II-1), (II-2 ), (III-1), (III-2), (IV-1) y (IV-2) con un vehículo inmunogénico, no afecta las propiedades inmunogénicas del sacárido de cualquiera de las fórmulas generales (I), (II-1), (II-2), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) y (IV-2), así como de cualquier conjugado de sacárido de cualquiera de las fórmulas generales (I), (II-1), (II-2 ), (II-4 ), (III-1), (III-2 ), (IV-1) y (IV-2) con un vehículo inmunogénico.
[0104] Cualquier conector bifuncional de la fórmula H O -L-N H2se puede usar en los sacáridos de la invención de cualquiera de las fórmulas generales (I), (II-1), (II-2), (II-4), (III-1) y (III-2), así como sus conjugados con un vehículo inmunogénico. En una modalidad de la presente invención, el sacárido de cualquiera de las fórmulas generales (I), (II-1), (II-2), (II-4), (III-1), y (III-2) el conector - L- se selecciona de: - L a-, - L a-L e-, -L a- L b-L e-, -L a-L d-L e-; en donde
-L a- se selecciona de: -(C H2)o-, -(C H2-C H2-O )o-C2H - , -(C H2-C H2-O )o-CH2- ; - L b- representa -O -, o -O P(O)(OH)-O-;
-L d-se selecciona de -(C H2)q-, -(C F2)q-, -(C H2-C H2-O )q-C2H4- , y -(C H2-C H2-O )q-CH2- ;
-L e- se selecciona de: -(C H2)pi-, -(C F2)pi-, -C2H4-(O-CH2-CH2)pi-,-CH2-(O-CH2-CH2)pi- y -(C H2)p i-O -(C H2)p2- ; y o, q, p i y p2 son independientemente el uno del otro un número entero seleccionado de i, 2, 3, 4, 5, y 6.
[0105] Así, la presente invención también está dirigida a un sacárido de fórmula general. (I)
(I)
en donde
5i
T 1 y T2 representan -H , - L-N H2; en donde si T1 es - L-N H2, entonces T2 es -H y si T 1 es -H , entonces T2 es - L-N H2; X i, X2, X3, X4, X5, y X6 representan — OCH3;
n es un número entero seleccionado de 1, 2, 3, o 4;
n i , n2 , n3 y n4 son inde Tpend °ientemente el uno del otro seleccionado de 0 y 1
y n1+n2+n3+n4 >1;
o '
con la condición de que si n1+n2+n3+n4 = 1 y si n = 1 y si
A es
que
y
c
L es un conector y se selecciona de: -L a- -L a-L e-,<—La—Lb—Le— —La—Ld—Le—'>en donde -L a- se selecciona de: -(C H2)o-, -(C H2-C H2-O )o-C2H4- , -(C H2-C H2-O )o-CH2-;
-L b- representa -O -, o -O -P (O )(O H )-O -;
-L d- se selecciona de -(C H2)q-, -(C F2)q-, -(C H2-C H2-O )q-C2H4- , y -(C H2-C H2-O )q-CH2- ;
-L e- se selecciona de: -(C H2)pi-, -(C F2)pi-, -C2H4-(O -C H2-C H2)pi-, -C H2-(O -C H2-C H2)p i- y -(C H2)p i-O -(C H2)p2-
y o, q, p i y p2 son independientemente el uno del otro un número entero seleccionado de i, 2, 3, 4, 5, y 6;
o enantiómeros, diastereómeros, mezclas de enantiómeros, mezclas de diastereómeros, anómeros, hidratos, solvatos de los compuestos mencionados anteriormente y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
[0106] También se prefiere que el sacárido de la presente invención de cualquiera de las fórmulas generales (I), (II-1), (II-2), (11-4), (III-1), y (III-2) tenga un conecto r-L- que es -L a-L e- ; y en donde
-L a- se selecciona de: -(C H2)o-, -(CH2-CH2-O)o-C2H4-, -(C H2-C H2-O )o-CH2- ;
-L e- se selecciona de: -C2H4-(O -C H2-C H2)pi-, -C H2-(O -C H2-C H2)pi-, -(C H2)pi-, y -(C H2)p i-O -(C H2)p2- ; y
o, p i, p2, son independientemente el uno del otro un número entero seleccionado de i, 2, 3, 4, 5, y 6.
[0107] En una modalidad, el sacárido de cualquiera de las fórmulas generales. (I), (II-1), (II-2), (II-4), (III-1), y (III-2) el conector - L- es -L a-, en donde
-L a- representa: -(C H2)oi-, -(CH2-CH2-O)o2-C2H4-, -(CH2-C H2-O)o2-C H2-;
o i es un número entero seleccionado de 2, 3, 4, 5 y 6;
o 2 es un número entero seleccionado de i, 2, 3, 4, 5 y 6.
G lico co n ju g a d o s
[0108] Otro aspecto de la presente invención se refiere a un sacárido de cualquiera de las fórmulas generales (I), (II-1), (II-2 ), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) y (IV-2) conjugado con un vehículo inmunogénico a través del átomo de nitrógeno del grupo-O-L-NH2. Dicho sacárido también se define como un glicoconjugado obtenido por reacción de un sacárido de cualquiera de las fórmulas generales (I), (II-1), (II-2), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) y (IV-2) con un vehículo inmunogénico. Así, dicho sacárido de cualquiera de las fórmulas generales (I), (II-1), (II-2), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) y (IV-2) conjugado con un vehículo inmunogénico a través del átomo de nitrógeno del grupo -O-L-NH2y dicho glicoconjugado obtenido haciendo reaccionar un sacárido de cualquiera de las fórmulas generales (I), (II-1), (II-2), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) y (IV-2) con un vehículo inmunogénico tienen el mismo significado.
[0109] Dicho glicoconjugado probó ser eficiente como una vacuna para la inmunización contra enfermedades asociadas con bacterias.
[0110] Los sacáridos son conocidos por la persona experta en la técnica, generalmente como antígenos TI-2 (independientes-2 de célula T) e inmunógenos pobres. Los antígenos TI-2 son antígenos, que son reconocidos solamente por las células B maduras a través de entrecruzamiento de receptores de inmunoglobulina expuestos en la superficie. Sin ayuda de células T, no se genera ninguna memoria inmunológica ni cambia de isotipo de IgM a otras subclases de IgG ni se produce la maduración por afinidad de las células B. Además, los sacáridos son inmunógenos deficientes conocidos en humanos debido a la homología estructural a los glicolípidos y glicoproteínas humanos. Debido a sus pobres propiedades inmunogénicas, los sacáridos manifiestan mala capacidad para producir tanto la producción de anticuerpos por las células B así como la formación de células de memoria, características que son esenciales para la producción de vacunas potentes.
[0111] Por lo tanto, para producir una vacuna potente basada en sacáridos, los sacáridos de fórmulas generales (I), (II-1), (II-2 ), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) y (IV-2) se conjugan a un vehículo inmunogénico para proporcionar glicoconjugados, que presentan inmunogenicidad incrementada en comparación con los sacáridos.
[0112] Un conjugado de sacárido-proteína que consiste de al menos un sacárido sintético de la fórmula general (I) y un vehículo inmunogénico al que se une covalentemente al menos un sacárido (I).
[0113] En este contexto, el término "vehículo inmunogénico" se define como una estructura que se conjuga al sacárido para formar un glicoconjugado que presenta una inmunidad incrementada en comparación con el sacáridoper se.Así, la conjugación de los sacáridos de las fórmulas generales (I), (II-1 ), (II-2), (II-4), (III-1), (III-2), (IV -1) y (IV-2) en el que el vehículo inmunogénico tiene como efecto la estimulación de la respuesta inmune contra el sacárido de las fórmulas generales (I), (II-1), (II-2), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) y (IV-2) sin inducir una respuesta inmune contra el vehículo inmunogénico.
[0114] Los portadores inmunogénicos preferidos son proteínas portadoras. Para el experto en la materia una proteína transportadora es una proteína seleccionada del grupo que comprende o consiste de: un toxoide de difteria, un toxoide de difteria mutado, un toxoide de difteria modificado, un toxoide de difteria mutado y modificado, un toxoide de tétanos un toxoide de tétanos modificado, un toxoide de tétanos mutado, una proteína de membrana externa (OMP), albúmina de suero bovino (BSA), hemocianina de lapa californiana (KLH) o toxoide de cólera (CT). El término "toxoide", como se utiliza en la presente, se refiere a una toxina bacteriana (usualmente una exotoxina), cuya toxicidad ha sido inactivada o suprimida ya sea por tratamiento químico (formalina) o térmico, mientras que se mantienen otras propiedades, típicamente inmunogenicidad. Un toxoide mutado tal como se utiliza en la presente es una toxina bacteriana recombinante que se ha modificado para ser menos tóxica o incluso no tóxica al enmendar la secuencia de aminoácidos del tipo silvestre. Dicha mutación podría ser una sustitución de uno o más aminoácidos. Dicho toxoide mutado presenta en su superficie una funcionalidad que puede reaccionar con el grupo funcional Y de la molécula de interconexión para proporcionar un toxoide modificado.
[0115] Una modalidad de la presente invención es un sacárido (I) unido covalentemente a un vehículo inmunogénico a través del átomo de nitrógeno del grupo-O-L-NH2-. -L-del grupo-O-L-NH2- es el enlace al vehículo inmunogénico en forma de un enlace covalente (átomo de oxígeno de O-L-NH2- unido directa o indirectamente al vehículo inmunogénico) o en forma de L-NH-, en donde el átomo de nitrógeno se enlaza directa o indirectamente a la proteína transportadora.
[0116] Enlazado directamente significa a un grupo funcional o cadena lateral del vehículo inmunogénico e indirectamente enlazado se refiere a un enlace a través de un grupo funcional adicional con el cual el vehículo inmunogénico y/o el nitrógeno del grupo-O-L-NH2.
[0117] Si se usa una proteína transportadora como vehículo inmunogénico, para el acoplamiento de sacárido a una proteína transportadora, la activación química del sacárido y algunas veces de la proteína es necesaria. La elección del método de conjugación del sacárido a las proteínas se restringe debido al pH y a la sensibilidad a la temperatura de las proteínas y su solubilidad limitada en la mayoría de los disolventes orgánicos. El procedimiento tiene que llevarse a cabo bajo condiciones suaves para evitar la desnaturalización de la proteína y la degradación del sacárido. Como tal, las reacciones de conjugación se llevan a cabo en tampones a pH neutro o casi neutro. Hasta la fecha, se han reportado numerosos protocolos para la unión covalente de carbohidratos a proteínas. Los siguientes métodos de enlace se pueden utilizar para enlazar sacárido sintético (I) a la proteína transportadora:
La aminación reductiva es uno de los métodos de glicoconjugación más populares para la unión de oligosacáridos libres vía el extremo reductor al grupo £-amino de los residuos de lisina en proteínas. En la presente invención, el grupo amino del sacárido sintético (I) puede funcionalizarse adicionalmente con una función aldehído, por ejemplo, usando glutaraldehído y glicoconjugación entre sacáridos sintéticos funcionalizados con aldehído y una proteína transportadora que tiene residuos de lisina puede formarse por aminación reductiva.
[0118] La conjugación de maleimida-tiol como la reacción irreversible de maleimida con tioles para proporcionar enlaces estables también se ha empleado frecuentemente para la preparación de glicoconjugados. Por ejemplo, se puede preparar maleimida a partir de un sacárido sintético (I) que lleva un enlazador de amina en el extremo reductor. El constructo sacáridomaleimida puede entonces reaccionar con cadenas laterales de tiol en cisteínas de una proteína transportadora, dando como resultado el glicoconjugado estable. De manera inversa, una proteína transportadora se puede activar con maleimida y un sacárido sintético (I) y puede adicionalmente funcionalizarse con una función tiol.
[0119] Se puede aplicar un método de glicoconjugación utilizando éster de escuarato. En primer lugar, un éster de amida de ácido escuárico de sacárido sintético (I) se puede preparar mediante el acoplamiento del grupo amina con el éster de escuarato. El ester de amida de ácido escuárico de sacárido sintético (I) se pueden acoplar adicionalmente con el grupo £ -amino de los residuos de lisina de una proteína transportadora y se forman diamidas de ácido escuárico.
[0120] Ésteres activados incluyendo adipato de di(N-succinimidilo), glutarato di(N-succinimidilo) (DSG), éster de sulfosuccinimida N-(Y-maleimidobutiriloxi), succinimidil (4-yodoacetil) (sulfo-GMBS), aminobenzoato (sulfo-SlAB), succinimidil-3-(bromoacetamido) propionato (SBAP), 2-piridilditiol-tetraoxatetradecano-N-hidroxisuccinimida (PEG-4-SPDP) pueden usarse. (Véase Figura 1). El adipato, di(N-succinimidilo) es el preferido y puede usarse para la preparación de glicoconjugado.
[0121] Método de entrecruzamiento de Longitud Cero con carbodiimidas; la mayoría de todas las EDC (1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida) pueden usarse. Las carbodiimidas N-sustituidas pueden reaccionar con ácidos carboxílicos de una proteína transportadora para formar derivados de O-acilisourea altamente reactivos. Estas especies activas entonces pueden reaccionar con una amina primaria de sacárido sintético (I) para formar un enlace amida.
[0122] Como método de conjugación adicional puede utilizarse la química de click. La química de click es la cicloadición [3 2] de alquino y azida. Preferiblemente, la cicloadición de azida-alquino promovida (SPAAC) se puede aplicar para la glicoconjugación. Los alquinos deformados tales como ciclooctino son ventajosos para una bioconjugación debido a la condición de reacción no tóxica. Una proteína transportadora puede marcarse simplemente con un aminoácido que contiene azida y conjugarse con sacárido sintético (I) funcionalizado con un alquino. De manera inversa, el sacárido sintético (I) funcionalizado con una azida puede conjugarse con una proteína transportadora marcada con un alquino.
[0123] La ligación química nativa (NCL) se puede utilizar para la glicoconjugación. Para aplicar este método a la glicoconjugación, un sacárido sintético (I) se puede funcionalizar adicionalmente con un tioéster, por ejemplo, benciltioéster, etiltioéster o feniltioéster. En la ligación química nativa, el grupo tiolato de un residuo de cisteína N-terminal de una proteína transportadora ataca el tioéster del sacárido sintético funcionalizado (I). Esta etapa reversible de transtioesterificación es quimioselectiva y regioselectiva y conduce a formar un compuesto intermedio de tioéster y este intermedio se reorganiza por un cambio intramolecular S,N-acilo que da como resultado la formación de un enlace amida nativo en el sitio de ligadura. En consecuencia, el sacárido sintético (I) y una proteína transportadora se conjugan con un enlace amida.
[0124] También se puede usar la ligación de Staudinger sin residuo para la glicoconjugación. En esta reacción, la fosfina lleva un tioéster electrófilo; después de la reacción con una azida, los productos son una amida y el óxido de fosfina saliente. Se ha demostrado que la ligación de Staudinger es ideal para marcar proteínas portadoras de azida tanto in vitro como en células vivas y en animales vivos, debido a la no-toxicidad demostrada de ambas azidas y fosfinas a concentraciones relevantes. Para aplicaciones de glicoconjugación, el sacárido sintético (I) se funcionaliza con un tioéster que lleva una fosfina y un grupo azida se introduce en una proteína transportadora de interés de varias maneras para la subsecuente introducción de la sonda de fosfina. Usualmente, se puede incorporar azidohomoalanina en lugar de metionina de una proteína. Una proteína transportadora modificada con azidohomoalanina puede conjugarse eficazmente y específicamente con sacárido sintético (I) mediante la ligadura de Staudinger.
[0125] El foto-entrecruzamiento es un método químico importante en el campo de la biología molecular. Recientemente, se ha dedicado mucha atención a la aplicación de este método a la identificación de regiones de unión a ligando. Métodos de foto-entrecruzamiento pueden ser aplicados para glicoconjugación. El marcaje por fotoafinidad requiere grupos funcionales que pueden ser activados fotoquímicamente para generar intermedios altamente reactivos, normalmente nitrenos o carbenos. Como grupos funcionales, se aplican benzofenona, arilazida, aril-, o alquildiazirina. Recientemente, se prefiere la alquil-, o arildiazirina para el marcaje de fotoafinidad (M R Bondet al. Nature Protocols2009, 4 (7), 1044 -1063; M R bondet al. Bioconjugate Chemistry2011, 22 (9), 1811 -1823). Para la conjugación de un sacárido sintético (I) con una proteína transportadora, el sacárido sintético (I) puede ser funcionalizado con una alquil-, o arildiazirina, por ejemplo, 3-trifluorometil-3-fenildiazirina. Después de la irritación con UV, se produce un carbeno reactivo a partir de un sacárido sintético (I) funcionalizado con arildiazirina y este carbeno es acoplado con una proteína transportadora mediante un enlace covalente C C.
[0126] Se prefiere especialmente que el sacárido de la fórmula general (I) y/o preferiblemente sacáridos 2a 2b, 2c, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 6a 6b, 6c, 8a, 8b y 8c se conjuguen a la toxina mutada de difteria CRM197no tóxica, presentando como funcionalidad una función de amina primaria de un residuo de lisina.
[0127] La toxina de la difteria silvestre tipo CRM197es una cadena polipeptídica única de 535 aminoácidos (58 kD) consistente de dos subunidades unidas por puentes disulfuro que tienen una sola sustitución de aminoácido de ácido glutámico por glicina. Se utiliza como una proteína transportadora en un número de vacunas conjugadas aprobadas (por ejemplo, Prevnar) para enfermedades tales como infecciones bacterianas de neumococos.
[0128] Preferiblemente, el adipato de di(N-succinimidilo) se une primero a un sacárido sintético (I) que tiene un grupo amino primario. El sacárido activado (I), se condensa posteriormente con una proteína transportadora tal como CRM197para proporcionar el glicoconjugado. Además, se puede aplicar el uso del glutarato de disuccinimidilo relacionado (Figura 2 (A)).
[0129] Dicho sacárido conjugado con una proteína transportadora tiene preferentemente una pureza de s 95%, preferiblemente de s 96% más preferiblemente s 97%, todavía más preferiblemente s 98%, y más preferiblemente s 99%.
[0130] Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de los sacáridos inventivos y sus glicoconjugados como fármacos, es decir, como agentes farmacéuticamente activos aplicables en medicina.
[0131] Se encontró que los sacáridos de las fórmulas generales (I), (II-1), (II-2 ), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) y (IV-2) y dicho glicoconjugado obtenido por reacción de los sacáridos de las fórmulas generales (I), (II-1 ), (II-2), (III-1), (III-2), (lV -1) y (IV-2) con un vehículo inmunogénico son adecuados para agente farmacéuticamente activo en medicina. Dichos sacáridos y dichos glicoconjugados son útiles para provocar una respuesta inmune en un animal y por lo tanto son útiles para elevar una respuesta inmune protectora en un huésped humano y/o animal.
[0132] Se prefieren dichos sacáridos y dichos glicoconjugados ya que son útiles para la prevención y/o tratamiento de enfermedades asociadas conHaemophilus influenzae tipo bpreferiblemente enfermedades seleccionadas de meningitis, neumonía y epiglotitis.
[0133] Sorprendentemente, se encontró que los nuevos conjugados de la presente invención son también adecuados para elevar una respuesta inmune en el huésped humano y/o animal y por lo tanto son adecuadas para protección contra enfermedades asociadas conHaemophilus influenzae tipo b.De Esta manera, los conjugados de la invención descritos en la presente, son útiles para la prevención o tratamiento de enfermedades asociadas conHaemophilus influenzae tipo b.Dichas enfermedades incluyen, pero no se limitan a: meningitis, neumonía, epiglotitis y otras enfermedades del tracto respiratorio. Además, se encontró que el tratamiento de un animal con el nuevo conjugado de la presente invención conduce a la formación de isotipos de inmunoglobulina IgG, que demuestra el desarrollo de células-B con memoria en el organismo vivo. La presencia de células-B con memoria demuestra memoria inmunológica. Así, se ha demostrado que los conjugados de la presente invención son capaces para inducir una protección a largo plazo en un animal contraHaemophilus influenzae tipo b.
[0134] Por lo tanto, los conjugados de acuerdo con la presente invención son adecuados para el uso como un agente farmacéuticamente activo aplicable en medicina, especialmente para su uso en la vacunación contra enfermedades causadas o asociadas conHaemophilus influenzae tipo b.
C o m p o s ic ió n de la V acuna
[0135] Un aspecto de la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas, especialmente composiciones de vacuna que contienen al menos un sacárido de cualquiera de las fórmulas generales (I), (II-1), (II-2), (II-4 ), (III-1), (III-2) (IV-1), y (IV-2), sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, glicoconjugado de los mismos, junto con al menos un adyuvante, vehículo, crioprotector, lioprotector, excipiente y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.
[0136] De esta manera, las síntesis de la invención para los sacáridos sintéticos de la fórmula general (I) pueden incluir además la etapa B)
B) preparar una sal de un sacárido de la fórmula general (I) o preparar un liofilizado de un sacárido de la fórmula general (I) o de la sal de un sacárido sintético de la fórmula general (I).
[0137] En una modalidad preferida, las síntesis de la invención para el sacárido de la fórmula (I) pueden comprender además la etapa B)
B) preparar una sal de un sacárido de la fórmula general (I) o preparar un liofilizado de un sacárido de la fórmula (I) o de la sal de un sacárido de la fórmula (I).
[0138] Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención incluyen al menos un sacárido de cualquiera de las fórmulas generales (I), (II-1), (II-2), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) y (IV-2) de sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Especialmente los sacáridos 2a, 2b, 2c, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 6a, 6b, 6c 8a, 8b y 8c obtenidas de acuerdo con la síntesis química total descrita en la presente, se utilizan en estas vacunas. Los sacáridos de fórmulas generales (I), (II-1), (II-2 ), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) y (IV -2) así como los sacáridos 2a 2b, 2c, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 6a, 6b, 6c, 8a 8b y 8c obtenidas por la síntesis química total descrita en la presente, tienen una pureza de al menos el 95% más preferiblemente de al menos 96%, todavía más preferiblemente de al menos 97%, todavía más preferiblemente de al menos 98% y con la máxima preferencia de al menos 99%.
[0139] Los sacáridos de la presente invención así como las composiciones farmacéuticas que contienen al menos un sacárido de cualquiera de las fórmulas generales (I), (II-1), (II-2), (II-4), (III-1 ), (III-2), (IV-1) y (IV-2 ) y especialmente las vacunas que contienen al menos un sacárido inventivo, especialmente sacáridos 2a, 2b 2c, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 6a, 6b, 6c 8a, 8b y 8c son muy útiles para su uso como una vacuna en la inmunización contra enfermedades causadas o asociadas conHaemophilus influenzae tipo bde preferencia meningitis, neumonía y epiglotitis.
[0140] De acuerdo con la presente invención, los sacáridos 2a, 2b, 2c, 4a 4b, 4c, 4d, 4e, 6a, 6b, 6c, 8a 8b y 8c así como cualquier otro sacárido inventivo descrito en la presente, es útil para la fabricación de dicha composición farmacéutica para su uso como vacuna para la inmunización contra enfermedades mencionadas anteriormente.
[0141] La vacuna se puede preparar en forma de una suspensión o puede liofilizarse. La forma de suspensión puede almacenarse congelada. En la forma liofilizada, es preferible añadir uno o más estabilizadores. La vacunación se puede aplicar a cualquier edad. La vacuna se puede administrar subcutáneamente, por spray, por inyección, por vía oral, intraocular, intratraqueal o nasal. La cantidad de vacuna de la invención que se va a administrar a un ser humano o animal y el régimen de administración se puede determinar de acuerdo con técnicas estándar bien conocidas por los expertos en la técnica farmacéutica y veterinaria, considerando factores tales como el antígeno particular, el adyuvante (si está presente), la edad, el sexo, el peso, la especie y la condición del animal o paciente particular, y la vía de administración.
[0142] Un método para inducir la respuesta inmune contraHaemophilus influenzae tipo ben un sujeto comprende la administración del sacárido de la presente invención, una mezcla de los mismos, la conjugación de la misma o una composición farmacéutica del mismo. Un método para tratar o prevenir enfermedades provocadas o asociadas conHaemophilus influenzae tipo b,preferiblemente meningitis, neumonía y epiglotitis en un sujeto, comprende la administración de al menos un sacárido sintético de la presente invención o una mezcla de los mismos, la conjugación de los mismos o la composición o la vacuna de los mismos.
[0143] En la presente invención, la cantidad del sacárido de cualquiera de las fórmulas (I), (II-1), (II-2 ), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1 ) y (IV-2) para proporcionar una dosis eficaz para la vacunación contraHaemophilus influenzae tipo bpuede ser de aproximadamente 0,02 |jg a aproximadamente 10 |jg por kg de peso corporal. El sacárido de cualquiera de las fórmulas (I), (II-1), (II-2 ), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) y (IV-2) opcionalmente conjugado a un vehículo inmunogénico, la proteína transportadora preferida tal como CRM197puede administrarse como una sola dosis o en una serie (es decir con un "reforzador" o "reforzadores"). Por ejemplo, un niño podría recibir una sola dosis temprana en la vida, luego se les administra una dosis de refuerzo hasta diez años después, como se recomienda actualmente para otras vacunas para prevenir las enfermedades de la niñez.
[0144] Se prefiere la administración intravenosa y parenteral. Tales composiciones pueden estar en mezcla con un portador adecuado, diluyente o excipiente tal como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa o similares. Las composiciones o los sacáridos de cualquiera de las fórmulas (I), (II-1), (II-2), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) y (IV-2) de acuerdo con la presente invención, opcionalmente conjugadas a un vehículo inmunogénico, también se puede liofilizar.
[0145] Los sacáridos liofilizados de la invención se reconstituirán finalmente con un componente líquido para dar un material adecuado para su administración a un paciente. La reconstitución tendrá lugar típicamente en el punto de uso. Así, un sacárido de la invención y un adyuvante de emulsión de aceite-en-agua o una solución amortiguadora de un adyuvante puede mantenerse por separado en un estuche de vacuna empaquetado o distribuido, listo para la formulación final en el momento de su uso. En un estuche que contiene dos contenedores, uno incluirá líquido para reconstitución y el segundo contenedor incluirá el material liofilizado. Por razones de estabilidad, el componente liofilizado de la invención puede incluir un estabilizador tal como lactosa, sacarosa y/o manitol, así como mezclas de los mismos. La utilización de una mezcla de sacarosa/manitol puede acelerar el proceso de secado. Un componente liofilizado también puede incluir cloruro de sodio. Los componentes solubles en el material liofilizado serán retenidos en la composición después de la reconstitución y por lo tanto las vacunas líquidas finales pueden contener de este modo lactosa y/o sacarosa.
[0146] La formulación de las vacunas de la presente invención se puede lograr utilizando métodos conocidos por la técnica. Obviamente, la elección de vehículos adecuados y otros aditivos dependerá de la ruta exacta de administración y la naturaleza de la forma de dosificación particular.
[0147] Las composiciones de vacuna de la presente invención pueden contener uno o más adyuvantes. Como se define en la presente, un " adyuvante " es una sustancia que sirve para mejorar la inmunogenicidad de un sacárido de cualquiera de las fórmulas (I), (II-1), (II-2), (II-4 ), (III-1), (III-2), (IV-1), ( IV -l), ( I I I - ) y (IV-2) de acuerdo con la presente invención, opcionalmente conjugado con un vehículo inmunogénico. Un adyuvante inmune puede mejorar una respuesta inmune a un antígeno que es débilmente inmunogénico cuando se administra individualmente, por ejemplo, no induciendo títulos de anticuerpos o débilmente o respuesta inmune mediada por células. Además, un adyuvante puede incrementar los títulos de anticuerpo al antígeno y/o disminuir la dosis del antígeno eficaz para conseguir una respuesta inmune en el individuo. De esta manera, a menudo se dan adyuvantes para reforzar la respuesta inmune y son bien conocidos por la persona experta. Los adyuvantes adecuados para mejorar la efectividad incluyen, a manera de ejemplo y no de limitación, adyuvantes de aluminio (por ejemplo, sales de aluminio tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio o combinaciones de los mismos), adyuvante de Freund (Completo o Incompleto ), BAY-R1005 (N-(2-Desoxi-2-L-leuilamino-beta-D-glucopiranosilo )-N-octadecildodecanoilamida), DC-chol (dimetilaminoetano )-carbamoil-colesterol, PCPP (poli [ di (carboxilatofenoxi) fosfaceno ]), monofosfato-lípido a oligonucleótidos de CpG, QS-21 (adyuvante inmunológico de saponaria saponina), toxina de cólera y péptido de formil-metionilo.
[0148] Los adyuvantes alternativos incluyen formulaciones de emulsión de aceite-en-agua por ejemplo MF59 como se describe en la Publicación PCT No. WO 90/14837, SAF-1 (Syntex Adyuvant Formulation treonil-MDP (0,05 -1% ) en un vehículo en emulsión [5% de escualano, 2.5%, Pluronic © R L121, 0.2% de Polisorbato 80 y solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4 )], y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforilípido A (MPL), trehalosa-dimicolato (TDM), y esqueleto de la pared celular (CWS), pueden usarse adyuvantes de la saponina, tales como StimulonTM (Cambridge Bioscience, Worcester, Masa) o partículas generadas de los mismos. Se conocen diversos adyuvantes de emulsión de aceite-en-agua e incluyen típicamente por lo menos un aceite y al menos un surfactante, con el aceite(s) y surfactante(s) que son biodegradable (metabolizable) y biocompatible. El escualano, el análogo saturado de escualeno, es el aceite preferido. Otros aceites preferidos son los tocoferoles. Pueden utilizarse mezclas de aceites. Los surfactantes pueden ser clasificados por su " HLB " (balance hidrófilo/lipófilo). Los surfactantes preferidos de la invención tienen un HLB de al menos 10, preferiblemente al menos 15 y más preferiblemente al menos 16. La invención se puede utilizar con agentes surfactantes que incluyen pero no se limitan a: los esteres surfactantes de sorbitán de polioxietileno (referidos comúnmente como Tweens); copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO) y/o óxido de butileno (BO ); octoxinoles, que pueden variar en el número de grupos etoxi repetidos (oxi -1,2-etanodiil)), tales como octoxinol-9 (Triton X -100, o totilfenoxipolietoxietanol); fosfolípidos tales como fosfatidilcolina (lecitina); éteres grasos de polioxietileno derivados de alcoholes laurílico, cetílico, estearílico y oleílico (conocidos como surfactantes Brij). Los surfactantes preferidos para incluir en la emulsión son: Tween 80 (monooleato de polioxietilen sorbitán), Span 85 (trioleato de sorbitán), lecitina y Triton X -100.
[0149] Otros adyuvantes pueden ser citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2 IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferones (por ejemplo, gamma-interferón), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF).
[0150] Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes, agentes tamponantes de pH, agentes gelificantes o potenciadores de la viscosidad, conservadores, agentes aromatizantes, colores y similares, dependiendo de la vía de administración y de la preparación deseada. Las composiciones de la invención pueden incluir un antimicrobiano, particularmente cuando se empacan en un formato de múltiples dosis. Los antimicrobianos tales como timersal y 2-fenoxietanol se encuentran comúnmente en vacunas, pero se prefiere utilizar ya sea un conservador libre de mercurio o ningún conservador en absoluto.
[0151] Una composición puede incluir un agente protector a la temperatura. Los ejemplos incluyen glicerina, propilenglicol y/o polietilenglicol (PEG).
[0152] Las composiciones de vacuna de la presente invención pueden comprender además al menos uno de: antígeno de difteria antígeno de tétanos, antígeno de pertussis, antígeno de hepatitis B, vacuna de polio inactivada y vacuna de rotavirus inactivada.
[0153] El término “antígeno de la difteria”, según se utiliza en la presente, es preferiblemente un toxoide de la difteria. El toxoide de la difteria es la toxina inactivada con formaldehído deCorynebacterium Diphtheriae,utilizada como agente inmunizante activo contra la difteria. La preparación de toxoides de la difteria está bien documentada (por ejemplo, Plotkin et al., Vaccines, 6a edición, 2012, capítulo l2 ). Se puede usar cualquier toxoide de difteria adecuado. La concentración del toxoide de la difteria se encuentra generalmente entre 5 y 100 Lf (Límite de Floculación)/ml. Una concentración preferida está entre 10 y 50 Lf/ml. Una concentración más preferida está entre 20 y 40 Lf/ml. Más preferiblemente, la concentración es aproximadamente de 30 Lf/ml.
[0154] El término “antígeno del tétanos”, tal como se utiliza en la presente, es preferiblemente un toxoide del tétanos. El toxoide del tétanos es bien conocido por una persona experta en la técnica (por ejemplo, Plotkin et al. Vaccines, 6a edición, 2012, capítulo 33). Se puede usar cualquier toxoide de tétanos adecuado. La concentración del toxoide de tétanos es generalmente entre 1 y 50 Lf/ml. Una concentración preferida está entre 2 y 9 Lf/ml. Una concentración más preferida está entre 5 y 8 Lf/ml. Más preferiblemente, la concentración es de aproximadamente 6.5 Lf/ml.
[0155] El término “antígeno pertussis”, tal como se utiliza en la presente, puede ser celular (por ejemplo, célula completa) o acelular. La preparación de ambos tipos de antígeno está bien documentada (por ejemplo, Plotkin Et al. Vaccines, 6a edición, 2012, capítulo 23). Para antígenos celulares de pertussis, la concentración de antígenos de pertussis es generalmente entre 5 y 50 OU/ml. Una concentración preferida está entre 10 y 40 OU/ml. Una concentración más preferida está entre 25 y 35 oU/ml. Más preferiblemente, la concentración es de aproximadamente 30 OU/ml. Cuando se usan antígenos acelulares, se prefiere usar la holotoxina pertussis (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA), más preferiblemente combinada con pertactina (también conocida como PRN o antígeno 69 kDa) y opcionalmente, aglutinógenos (también conocidos como fimbrias) 2 y 3. PT es una proteína tóxica y, cuando está presente en el antígeno de pertussis, se detoxifica preferentemente. La detoxificación puede ser por medios químicos y/o genéticos. Un mutante detoxificado preferido es el doble mutante 9K/129G
[0156] El término “antígeno de hepatitis B”, según se utiliza en la presente, puede ser el antígeno de la superficie de hepatitis B. La preparación del antígeno de superficie de la hepatitis B está bien documentada (por ejemplo, Plotkin Et al. Vaccines, 6a edición, 2012, capítulo 15).
[0157] El término “vacuna de polio inactivada (IPV)”, tal como se utiliza en la presente memoria, consiste preferentemente de cepas de poliovirus I-3 inactivadas (muertas). En la presente invención la inactivación del virus se refiere a la eliminación de la capacidad infecciosa de un virus. En los dos métodos de inactivación (química y física), los químicos más comúnmente usados son formaldehído y betapropiolactona. La preparación de toxoides de difteria está bien documentada (por ejemplo, Plotkin et al., Vaccines, 6a edición, 2012, capítulo 27).
[0158] El término “vacuna de rotavirus inactivada”, según se utiliza en la presente, puede ser preferiblemente la vacuna bovina (cepa UK) humana de reagrupamiento humano, la cepa de RV3 neonatal humana o la cepa bovina/humana neonatal 116E. En la presente invención la inactivación del virus se refiere a la eliminación de la capacidad infecciosa de un virus. En los dos métodos de inactivación (química y física), los químicos más comúnmente utilizados son formaldehído y betapropiolactona. La preparación de la vacuna de rotavirus inactivada está bien documentada (por ejemplo, Plotkin Et al., Vaccines, 6a edición, 2012, capítulo 30).
[0159] Las composiciones de la invención se proporcionan convenientemente como preparaciones líquidas, por ejemplo, soluciones acuosas isotónicas, suspensiones, emulsiones o composiciones viscosas que pueden tamponarse a un pH seleccionado. Los vehículos farmacéuticamente aceptables para formulaciones que pueden ser líquidas o no acuosas, suspensiones, emulsiones o aceites. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medios tamponados. El pH de una composición después de la reconstitución es preferiblemente entre 6 y 8, y más preferiblemente entre 6,5 y 7,5 (por ejemplo, aproximadamente 7). Las composiciones de la invención se pueden mantener mediante el uso de un amortiguador, por ejemplo, amortiguador Tris, acetato, glutamato lactato, maleato, tartrato, fosfato, citrato, carbonato, glicinato, histidina, glicina, succinato y amortiguador de trietanolamina.
Así, las composiciones de la invención incluirán preferiblemente un amortiguador. El agente isotónico puede ser un agente isotónico iónico tal como una sal o un agente isotónico no iónico tal como un carbohidrato. Los ejemplos de agentes isotónicos iónicos incluyen, pero no se limitan a, NaCl, CaCh, KCl y MgCh. Los ejemplos de agentes isotónicos no iónicos incluyen, pero no se limitan a sorbitol y glicerol.
[0160] En una modalidad preferida de la invención, la composición de la vacuna se formula como un líquido estéril, libre de pirógenos, en solución salina fisiológica amortiguada con fosfato, con o sin un conservador.
[0161] Se puede emplear un conservador farmacéuticamente aceptable para aumentar la vida en anaquel de las composiciones. El alcohol bencílico puede ser adecuado, aunque una variedad de conservantes incluyen, por ejemplo, parabenos, timerosal, clorobutanol o cloruro de benzalconio que también pueden ser utilizados. Una concentración adecuada del conservador será de 0.02% a 2% en base al peso total, aunque puede haber una variación apreciable dependiendo del agente seleccionado.
[0162] La composición de la invención se puede formular como viales de dosis única, viales de múltiples dosis o como jeringas prellenadas.
[0163] Otro aspecto de la presente invención se refiere a formulaciones farmacéuticas y composiciones farmacéuticas que contienen al menos un sacárido de cualquiera de las fórmulas generales (I), (II-1), (II-2), (II-4), (II-1 ), (III-2), (IV-1) y (IV-2) opcionalmente conjugado con un vehículo inmunogénico o la vacuna como un ingrediente activo junto con al menos un adyuvante, vehículo, excipiente, disolvente y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
[0164] Además, la composición farmacéutica se formula en forma de un liofilizado o solución amortiguadora líquida.
[0165] La vacuna o composición farmacéutica también se puede administrar en forma de su sal farmacéuticamente activa opcionalmente usando vehículos, excipientes, adyuvantes o diluyentes farmacéuticamente aceptables, sustancialmente no tóxicos. La vacuna o composición farmacéutica de la presente invención se prepara en un vehículo o diluyentes sólidos o líquidos convencionales y un adyuvante convencional preparado farmacéuticamente a un nivel de dosificación adecuado de una manera conocida. Las preparaciones y formulaciones preferidas están en forma administrable que es adecuada para aplicación oral. Estas formas administrables, por ejemplo, incluyen píldoras, tabletas, tabletas de película, tabletas revestidas, cápsulas, polvos y depósitos. También son posibles otras formas administrables por vía oral. La vacuna inventiva o composición farmacéutica se puede administrar por cualquier medio apropiado incluyendo, pero no limitado a, inhalación, inyección (intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea) mediante absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (mucosa oral, revestimientos epiteliales rectales y vaginales, mucosa nasofaringe, mucosa intestinal); por vía oral, rectal, transdérmica, tópica, intradérmica, intragástrica, intracutánea, intravaginal, intravasal, intranasal, intrabucal, percutánea, sublingual, o cualquier otro medio disponible dentro de las técnicas farmacéuticas.
[0166] La vacuna o composición farmacéutica de la presente invención, que contiene al menos un sacárido de cualquiera de las fórmulas generales (I), (II-1), (II-2 ), (II-4), (II-1 ), (III-2), (IV-1) y (IV-2), los sacáridos 2a, 2b, 2c, 4a, 4b 4c, 4d, 4e, 6a, 6b, 6c, 8a 8b y 8c o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo como ingrediente activo se administrarán típicamente en mezcla con materiales portadores adecuados seleccionados adecuadamente con respecto a la forma deseada de administración es decir, tabletas orales, cápsulas (ya sea de relleno sólido, relleno semi-sólido o relleno de líquido), polvos para constitución, geles orales, elixires, gránulos dispersables jarabes, suspensiones y similares, y consistente con las prácticas farmacéuticas convencionales. Por ejemplo, para administración oral en forma de tabletas o cápsulas el ingrediente activo se puede combinar con cualquier portador inerte farmacéuticamente aceptable no tóxico, tal como lactosa, almidón, sacarosa, celulosa, estearato de magnesio, fosfato de dicalcio, sulfato de calcio, talco, manitol, alcohol etílico (formas líquidas) y similares. Además, cuando se desee o se necesita, también se pueden incorporar en la mezcla aglutinantes, lubricantes, agentes de desintegración y agentes colorantes adecuados. Los polvos y tabletas pueden estar comprendidos de aproximadamente 5 a aproximadamente 95 por ciento del tetrasacárido.
[0167] Aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas tales como acacia, alginato de sodio, carboximetilcelulosa, polietilenglicol y ceras. Entre los lubricantes que se pueden mencionar para uso en estas formas de dosificación están: ácido bórico, benzoato sódico, acetato sódico, cloruro sódico y similares. Los desintegrantes incluyen almidón, metilcelulosa, goma guar y similares. También se pueden incluir agentes edulcorantes y saborizantes y conservantes cuando sea apropiado. Algunos de los términos indicados anteriormente, es decir, desintegrantes, diluyentes, lubricantes, aglutinantes y similares, se describen con mayor detalle a continuación.
[0168] Adicionalmente, la vacuna o composición farmacéutica de la presente invención se puede formular en forma de liberación sostenida para proporcionar la liberación a velocidad controlada de cualquiera de uno o más de los componentes o ingredientes activos para optimizar los efectos terapéuticos. Las formas de dosificación adecuadas para liberación sostenida incluyen tabletas con capas en las que cada una posee tasas variables de desintegración o matrices poliméricas de liberación controlada impregnadas con los componentes activos y conformadas en forma de tabletas o cápsulas que contienen dichas matrices poliméricas porosas impregnadas o encapsuladas.
[0169] Las preparaciones de forma líquida incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones. Como ejemplo se pueden mencionar soluciones de agua o agua-propilenglicol para inyecciones parenterales o adición de edulcorantes y opacificantes para soluciones, suspensiones y emulsiones orales. Las preparaciones en forma líquida también pueden incluir soluciones para administración intranasal.
[0170] Las preparaciones en aerosol adecuadas para la inhalación pueden incluir soluciones y sólidos en forma de polvo, que puede estar en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como gas comprimido inerte, por ejemplo nitrógeno.
[0171] Para preparar supositorios, se funde primero una cera de bajo punto de fusión tal como una mezcla de glicéridos de ácidos grasos tales como manteca de cacao y el ingrediente activo se dispersa homogéneamente en el mismo por agitación o mezclado similar. La mezcla homogénea fundida se vierte entonces en moldes de tamaño conveniente, se deja enfriar y por lo tanto se solidifica.
[0172] También se incluyen preparaciones de forma sólida que se pretenden convertir, poco antes de su uso a preparaciones en forma líquida para administración oral o parenteral. Tales formas líquidas incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones.
[0173] La vacuna o composición farmacéutica inventiva que contiene al menos un sacárido de cualquiera de las fórmulas generales (I), (11-1), (II-2 ), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) y (IV-2), preferiblemente los sacáridos 2b, 4 b , 6b, y 8b también pueden entregarse transdérmicamente. Las composiciones transdérmicas pueden tomar la forma de cremas, lociones aerosoles y/o emulsiones y se pueden incluir en un parche transdérmico del tipo de matriz o depósito como son convencionales en la técnica para este propósito.
[0174] El término cápsula se refiere a un recipiente o recinto especial hecho de metilcelulosa, alcoholes polivinílicos o gelatinas o almidón desnaturalizado para sostener o contener composiciones que comprenden los ingredientes activos. Las cápsulas de cubierta dura se hacen típicamente de mezclas de gelatinas de piel de cerdo y hueso con dureza relativamente alta del gel. La propia cápsula puede contener pequeñas cantidades de colorantes, agentes opacificantes, plastificantes y conservadores.
[0175] Tableta significa dosis sólida comprimida o moldeada que contiene los ingredientes activos con diluyentes adecuados. La tableta se puede preparar por compresión de mezclas o granulaciones obtenidas por granulación húmeda, en seco o por compactación bien conocida por una persona experta en la técnica.
[0176] Los geles orales se refieren a los ingredientes activos dispersados o solubilizados en una matriz hidrófila semisólida.
[0177] Los polvos para constitución se refieren a mezclas de polvo que contienen los ingredientes activos y diluyentes adecuados que pueden suspenderse en agua o jugos.
[0178] Los diluyentes adecuados son sustancias que constituyen habitualmente la mayor parte de la composición o forma de dosificación. Los diluyentes adecuados incluyen azúcares tales como lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol, almidones derivados de trigo, arroz, maíz y papa, y celulosas tales como celulosa microcristalina. La cantidad de diluyentes en la composición puede variar de 5 a 95% en peso de la composición total, preferiblemente de aproximadamente 25 a aproximadamente 75% más preferiblemente de aproximadamente 30 a aproximadamente 60% en peso, y más preferiblemente de aproximadamente 40 a 50% en peso.
[0179] El término desintegrantes se refiere a materiales añadidos a la composición para ayudar a romperse (desintegrarse) y liberar los medicamentos. Los desintegrantes adecuados incluyen almidones, almidones modificados "solubles en agua fría", tales como carboximetilalmidón de sodio, gomas naturales y sintéticas, tales como algarrobo, karaya, guar, tragacanto y agar, derivados de celulosa tales como metilcelulosa y carboximetilcelulosa sódica, celulosas microcristalinas y celulosas microcristalinas entrecruzadas, tales como croscarmelosa de sodio, alginatos tales como ácido algínico y alginato sódico, arcillas tales como bentonitas y mezclas efervescentes. La cantidad de desintegrante en la composición puede variar de 1 a 40% en peso de la composición, preferiblemente de 2 a 30% en peso de la composición, más preferiblemente de 3 a 20% en peso de la composición y más preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 10% en peso.
[0180] Los aglutinantes caracterizan a sustancias que unen o "pegan" polvos y los hacen cohesivos formando gránulos, sirviendo así como el “adhesivo” en la formulación. Los aglutinantes añaden resistencia cohesiva a la ya disponible en los diluyentes o agente de carga. Aglutinantes adecuados incluyen azúcares tales como sacarosa, almidones derivados de trigo, arroz, maíz y papa; gomas naturales tales como acacia, gelatina y tragacanto; derivados de algas tales como ácido algínico, alginato sódico y alginato cálcico amónico; materiales celulósicos tales como metilcelulosa y carboximetilcelulosa sódica e hidroxipropil-metilcelulosa; polivinilpirrolidona; e inorgánicos tales como silicato de magnesio-aluminio. La cantidad de aglutinante en la composición puede variar de aproximadamente 1 a 30% en peso de la composición, preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 20% en peso de la composición, más preferiblemente de aproximadamente 3 a aproximadamente 10% en peso, y aún más preferiblemente de aproximadamente 3 a aproximadamente 6% en peso.
[0181] Lubricante se refiere a una sustancia añadida a la forma de dosificación para permitir a la tableta, gránulos etc. después de haber sido comprimida, liberarse del molde o matriz mediante la reducción de la fricción o desgaste. Los lubricantes adecuados incluyen estearatos metálicos tales como estearato de magnesio, estearato de calcio o estearato de potasio; ácido esteárico; ceras de alto punto de fusión; y lubricantes solubles en agua tales como cloruro de sodio, benzoato de sodio, acetato de sodio, oleato de sodio, polietilenglicoles y d'-l-leucina. Los lubricantes se añaden usualmente en la última etapa antes de la compresión ya que deben estar presentes en las superficies de los gránulos y entre ellas y las partes de la máquina pastilladora. La cantidad de lubricante en la composición puede variar de 0.05 a 15% en peso de la composición, preferiblemente de 0.2 a 5% en peso de la composición, más preferiblemente de aproximadamente 0.3 a aproximadamente 3%, y más preferiblemente de aproximadamente 0.3 a aproximadamente 1.5% en peso de la composición.
[0182] Los deslizadores son materiales que evitan el apelmazamiento y mejoran las características de flujo de las granulaciones de manera que, el flujo es suave y uniforme. Los deslizadores adecuados incluyen dióxido de silicio y talco. La cantidad de deslizador en la composición puede variar de 0.01 a 10% en peso de la composición, de 0.1% a 7% en peso de la composición total, más preferiblemente de aproximadamente 0.2 a 5% en peso, y más preferiblemente de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 2% en peso.
[0183] Los agentes colorantes son excipientes que proporcionan coloración a la composición o a la forma de dosificación. Tales excipientes pueden incluir tintes de grado alimenticio y tintes de grado alimenticio adsorbidos sobre un adsorbente adecuado tal como arcilla u óxido de aluminio. La cantidad del agente colorante puede variar de aproximadamente 0.01 hasta 10% en peso de la composición, preferiblemente de aproximadamente 0.05 hasta 6% en peso, más preferiblemente de aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 4% en peso de la composición, y más preferiblemente de aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 1%.
[0184] Las técnicas para la formulación y administración de la vacuna de la presente invención pueden encontrarse en " Remington 's Pharmaceutical Sciences " Mack Publishing Co Easton PA. Una composición de vacuna adecuada que comprende al menos un sacárido de cualquiera de las fórmulas generales (I), (11-1), (II-2), (II-4 ), (III-1), (III-2), (IV-1) y (IV-2 ) , preferiblemente los sacáridos 2b, 4b, 6b, y 8b y/o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos puede ser una solución de tal sacárido(s) en un portador farmacéutico líquido adecuado o cualquier otra formulación tal como tabletas, píldoras, tabletas de película, tabletas recubiertas, grageas, cápsulas, polvos y depósitos, geles, jarabes, lechadas, suspensiones, emulsiones y similares.
[0185] Una dosificación terapéuticamente efectiva del sacárido de cualquiera de las fórmulas generales (I), (II-1), (II-2), (II-4 ), (III-1), (III-2), (IV-1) y (IV-2 ) , preferiblemente los sacáridos 1f, 2a, 2b, 4b, 6b, , y 8 b , se refiere a esa cantidad del compuesto que da como resultado una inmunización al menos parcial contra una enfermedad. La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos, farmacológicos y toxicológicos estándar, en cultivos celulares o animales experimentales. La relación de dosis entre efecto tóxico y terapéutico es el índice terapéutico. La cantidad real de la composición administrada dependerá del sujeto que se trate, del peso del sujeto, la gravedad de la afección, la forma de administración y el criterio del médico que prescribe.
[0186] La formulación de la vacuna mencionada presenta una extraordinaria estabilidad a temperatura ambiente debido a la constitución modular de los compuestos de la presente invención, en donde dicha formulación de vacuna se puede mantener a una temperatura de al menos 25°C durante un período de al menos 3 meses antes de la reconstitución. La estabilidad a temperatura de las formulaciones de vacunas descritas en la presente memoria constituye una ventaja particular de la presente invención sobre las vacunas dirigidas contraHaemophilus influenzae tipo b,que se han descrito hasta el presente.
[0187] En una modalidad preferida de la invención, dicho período comprende 6 meses o al menos 12 meses.
A n tic u e rp o
[0188] La presente invención se refiere también a un anticuerpo contra al menos un sacárido sintético de las fórmulas generales (I), (II-1), (II-2), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1), (III-), y (IV-2). El anticuerpo es producido por el hibridoma monoclonal. El anticuerpo es para diagnóstico, profilaxis y tratamiento de neumonía, meningitis otitis media, bacteriemia y exacerbación aguda de bronquitis crónica, sinusitis, artritis y conjuntivitis. Otra modalidad de la presente invención es el uso del anticuerpo para la fabricación de medicamentos o dispositivos para diagnóstico profilaxis y tratamiento de meningitis, neumonía y epiglotitis causada porHaemophilus influenzae Tipo b.
[0189] El término “anticuerpo”, según se utiliza en la presente, abarca preparaciones de anticuerpos policlonales y monoclonales así como preparaciones que incluyen anticuerpos híbridos, fragmentos F(ab')2, moléculas F(ab), anticuerpos de un solo dominio y fragmentos funcionales de los mismos, que presentan propiedades de unión inmunológica de la molécula de anticuerpo parental. El anticuerpo de acuerdo con la invención puede ser policlonal o monoclonal.
[0190] El sacárido de cualquiera de las fórmulas generales (I), (II-1), (II-2), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1), y (IV-2), preferiblemente los sacáridos 2b, 4b, 6b, y 8 b , o el anticuerpo del mismo puede utilizarse para preparar una composición farmacéutica especialmente vacunas para el tratamiento o prevención de enfermedades provocadas porHaemophilus influenzae tipo b.El sacárido de la presente invención o su anticuerpo puede utilizarse para el tratamiento o prevención de una enfermedad causada porHaemophilus influenzae tipo b.
[0191] Además, la presente invención se refiere al uso de al menos un sacárido de fórmulas generales (generales (I), (II-1), (II-2), ( (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1), y (IV-2), preferiblemente los sacáridos 2b, 4b, 6b, y 8 b , de acuerdo con la invención o al menos un anticuerpo contra al menos un sacárido de la presente invención en ensayos inmunológicos para diagnóstico de meningitis, neumonía y epiglotitis causada porHaemophilus Influenzae tipo b.
[0192] Tales ensayos comprenden, por ejemplo, microarreglos y ELISA útiles para el diagnóstico de enfermedades provocadas porHaemophilus Influenzae tipo b.Por lo tanto otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de cualquiera de los sacáridos de las fórmulas generales (I), (II-1), (II-2), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1), y (IV-2), preferiblemente los sacáridos 2b, 4b, 6b, y 8 b , para el diagnóstico de enfermedades provocadas porHaemophilus influenzae tipo b.
[0193] Cualquiera de los sacáridos de las fórmulas generales (I), (II-1), (II-2), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1), y (IV-2), preferiblemente los sacáridos 2b, 4b, 6b, y 8 b , o una mezcla de tales sacáridos podría inmovilizarse sobre una superficie de microarreglo o cualquier otra superficie y utilizarse para un métodoin vitropara detectarHaemophilus influenzae tipo b.Un método para identificar
[0194]Haemophilus influenzae tipo bcomprende el uso de al menos un sacárido de la presente invención. Además, el sacárido sintético de fórmulas generales (I), (II-1), (II-2), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1), y (IV-2), preferiblemente los sacáridos 2b, 4b, 6b, y 8 b , o una mezcla de tales sacáridos se puede usar como un estándar analítico para ensayos inmunológicos.
D is p o s itiv o s de d ia g n ó s tic o
[0195] Otro aspecto de la presente invención se refiere a un soporte sólido que comprende al menos un sacárido de fórmula general (I), sacáridos preferidos de las fórmulas (II-1), (II-2), (II-4), un sacárido más preferido de las fórmulas (III-1), (III-2), (IV-1), y (IV-2), preferiblemente los sacáridos 2b, 4b, 6b, y 8 b ,.
[0196] Este soporte sólido es preferentemente una parte de un dispositivo de diagnóstico. El soporte sólido y el dispositivo de diagnóstico se utilizan para el diagnóstico de meningitis, neumonía y epiglotitis causada porHaemophilus Influenzae tipo b,en la que al menos un sacárido de fórmula general (I) se inmoviliza sobre dicho soporte sólido mediante preferentemente unión covalente.
[0197] La otra modalidad de la presente invención es el dispositivo de diagnóstico en el que el soporte sólido se selecciona del grupo que comprende un portaobjetos de vidrio, placa de vidrio, placa de microtitulación, microesferas o perlas.
[0198] Todavía otra modalidad de la presente invención es el dispositivo de diagnóstico en el que al menos un sacárido de fórmula general (I) se une covalentemente usando una molécula de enlace.
[0199] Además, la presente invención muestra que el sacárido de acuerdo con la fórmula (I) puede usarse en ensayos inmunológicos para meningitis, neumonía y epiglotitis causada porHaemophilus influenzae tipo b.
[0200] Tales ensayos comprenden, por ejemplo, microarreglos y ELISA útiles para el diagnóstico de meningitis, neumonía y epiglotitis causada porHaemophilus Influenzae tipo b.
[0201] Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un sacárido de fórmula (I) para el diagnóstico de meningitis, neumonía y epiglotitis causada porHaemophilus influenzae tipo b.
[0202]El sacárido (I) de acuerdo con la invención se inmoviliza sobre un soporte sólido mediante unión covalente. Al menos un sacárido sintético (I) no unido o inmovilizado sobre un soporte sólido se utiliza para el diagnóstico de meningitis, neumonía y epiglotitis causada porHaemophilus influenzae tipo b.
[0203] El uso de sacárido (I) para el diagnóstico de meningitis, neumonía y epiglotitis causada porHaemophilus influenzae tipo bse basa en la detección de la presencia de anticuerpos específicos para al menos un sacárido de fórmula general (I). De este modo, un dispositivo de diagnóstico que comprende al menos un sacárido de fórmula general (I) es usado para la diagnosis de meningitis, neumonía y epiglotitis causada porHaemophilus influenzae tipo b.
[0204] Se prefiere además que un sacárido de fórmula (I) utilizado para la meningitis neumonía y epiglotitis causada porHaemophilus influenzae tipo bes sustancialmente puro, teniendo una pureza de s 95%, preferiblemente s 96%, más preferiblemente s 97% todavía más preferiblemente s 98%, y más preferiblemente s 99%.
[0205] Existen diferentes posibilidades para la elección de un sistema de ensayo en el que un sacárido de fórmula (I) es usado para el diagnóstico de meningitis, neumonía y epiglotitis causada porHaemophilus influenzae tipo b.Un ensayo realizado con fines de diagnóstico, de acuerdo con la invención puede ser un inmunoensayo como un inmunoensayo enzimático de fase sólida (EIA), un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), especialmente un ELISA “indirecto” o un ensayo radioinmune (RIA). Para el uso de un sacárido de fórmula (I) en tales ensayos podría ser necesario inmovilizar el sacárido de fórmula (I) sobre un soporte sólido.
[0206] De esta manera, otra modalidad de la presente invención es un soporte sólido sobre el cual al menos un sacárido (I) se inmoviliza mediante unión covalente a través de un enlazador o espaciador. Incluso otra modalidad de la invención es un sacárido inmovilizado por un enlace covalente en un soporte sólido directamente o indirectamente a través del átomo de nitrógeno del grupo-O-L-NH2(Figura 2 (B)).
[0207] Por lo tanto, un sacárido de fórmula (I) puede ser inmovilizado sobre un soporte sólido, particularmente para aplicaciones de diagnóstico. Una modalidad preferida de la presente invención es un sacárido de fórmula general (I) inmovilizado sobre un soporte sólido mediante unión covalente. Una modalidad particularmente preferida de la presente invención es un sacárido de fórmula general (I) inmovilizado sobre un soporte sólido mediante unión covalente directa o indirecta. Por lo tanto, se prefiere especialmente la unión covalente directa.
[0208] Más preferido el soporte sólido se selecciona del grupo que comprende o consiste en: un portaobjetos de vidrio, una placa de microtitulación, tubos de ensayo, microesferas, nanopartículas o perlas.
[0209] Se prefiere particularmente que el soporte sólido sea un portaobjetos de vidrio o una placa de microtitulación. Una placa de microtitulación o placa de micropozos es una placa plana con múltiples “pozos” utilizadas como tubos de ensayo pequeños. Típicamente se puede usar una placa de microtitulación que tiene 6, 24, 96, 384 o incluso 1536 pozos de muestra. Las microplacas se producen a partir de muchos materiales diferentes, como el policarbonato para la placa de microtitulación utilizada para PCR. El más común es el poliestireno como se utiliza para la mayoría de las microplacas de detección óptica. Puede ser de color blanco mediante la adición de dióxido de titanio para la absorbancia óptica o detección de luminiscencia o negro mediante la adición de carbono para ensayos biológicos fluorescentes.
[0210] La “unión covalente directa”, según se utiliza en la presente memoria, se refiere a la inmovilización de un compuesto de fórmula general (I) haciendo reaccionar un grupo funcional del sacárido de fórmula general (I) con un grupo funcional del material del soporte sólido con que se fabrica. Se prefiere que el grupo funcional del sacárido de fórmula general (I) sea amina como se define anteriormente en-O-L-NH2. Los grupos funcionales posiblemente reactivos del soporte sólido pueden ser: fenilo, grupos amino, grupos hidroxilo, tioles, carbonilos, carboxilos, vinilos, haluros tales como fluoruros cloruros, bromuros y yoduros, maleimidas; ésteres de succinimida.
[0211] La “unión covalente indirecta”, según se utiliza en la presente memoria, se refiere a la inmovilización de un sacárido de fórmula general (I) en un soporte sólido, en el que el sacárido de fórmula general (I) se une covalentemente a un segundo compuesto que media la inmovilización al soporte sólido. Se prefiere que este segundo compuesto sea una proteína que no provoque una reacción inmune. Es importante que el mismo segundo compuesto no sea unido probablemente por ningún anticuerpo presente en la sangre o el suero de un paciente para evitar resultados falsos positivos. Además, el segundo compuesto debe ser capaz de ser inmovilizado sobre el portador sólido, mediante unión covalente o no covalente. Se prefiere que este segundo compuesto se seleccione del grupo que comprende o consiste en albúmina de suero bovino (BSA), albúmina de suero humano (HAS), gelatina o caseína. Por lo tanto, la inmovilización usando enlace covalente indirecto se refiere preferiblemente a la unión covalente de un sacárido de fórmula general (I) a una proteína como segundo compuesto (por ejemplo, utilizando los grupos amino libres de una proteína) y posteriormente la unión de la proteína al soporte sólido mediante unión covalente o interacción no covalente entre el soporte sólido y la proteína. Posibles interacciones no covalentes son: enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos, fuerzas de van der Waals e interacciones hidrófobas. Muchos polímeros, tales como poliestireno y polipropileno, son de naturaleza hidrofóbica. Sin embargo, también existen fabricantes que suministran soporte sólido con superficies especializadas optimizadas para diferentes condiciones de adhesión.
[0212] Sin embargo, la inmovilización, especialmente usando enlaces covalentes indirectos, puede ocurrir también por adhesión fuerte. De esta manera, una inmovilización efectiva de acuerdo con la presente invención se puede realizar no solo por unión química, pero también sin consolidarse por inmovilización relacionada con sorción física. Como característica clave para la sorción física, actúa el fenómeno de que la fuerza de adhesión es causada por la fuerza de van Der Waals. El término "no unido” se refiere a una unión diferente de la unión covalente.
[0213] La quimisorción como forma de inmovilización de acuerdo con la presente invención utiliza enlaces químicos entre el soporte sólido y un sacárido de fórmula (I). Tal enlace puede ser covalente, pero también puede ser iónico.
[0214] En una modalidad preferida de la presente invención la inmovilización de un sacárido de la fórmula (I) sobre un soporte sólido se realiza mediante unión covalente directa, a saber, una reacción química entre estos dos reactivos, preferiblemente mediante una reacción de sustitución. En una modalidad más preferida de la presente invención, el soporte sólido se modifica con un grupo funcional que es capaz de dejar el soporte sólido tras la reacción con el compuesto de la presente invención. Tal grupo funcional puede unirse directamente a una molécula de composición del soporte sólido o puede unirse a un enlazador que se une directamente a la molécula de composición del soporte sólido. De esta manera, en una modalidad más preferida de la presente invención, el soporte sólido se modifica para soportar un grupo saliente adecuado. Los grupos salientes adecuados pueden ser haluros tales como cloruros, bromuros y yoduros; hidróxidos, oximas, maleimidas, succinimida, alcoholes y ésteres. Tal grupo saliente puede ser o puede ser incorporado en maleimida; D-yodoacetilo; □-bromoacetilo; éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) y 2-piridilditioles. En otra modalidad más preferida, el grupo saliente en el soporte sólido es capaz de reaccionar con aminas alcoholes y tioles, preferiblemente con intercambio de protones. En la modalidad más preferida de la presente invención, el soporte sólido se funcionaliza con un grupo funcional de hidróxido de succinimidilo más preferiblemente hidróxido de N-succinimidilo que dejará el soporte sólido tras la reacción con un compuesto de la presente invención como N-hidroxisuccinimida.
[0215] La modificación del soporte sólido mediante la introducción de un grupo saliente adecuado se lleva a cabo preferentemente por reacción de un portador no modificado con una molécula bifuncional reactiva, preferentemente una molécula bifuncional con un puente molecular o un brazo espaciador entre los dos grupos funcionales. En una modalidad preferida de la presente invención, los grupos funcionales determinados a reaccionar con el soporte sólido comprenden ésteres de sulfosuccinimida y succinimidas.
[0216] Otro aspecto preferido de las moléculas de enlace bifuncionales es la capacidad de proporcionar el grupo funcional destinado a unirse con un sacárido de la fórmula (I) es una distancia apropiada para el portador sólido. Dicha distancia apropiada es proporcionada por un puente molecular o brazo separador de longitud adecuada. Dicho puente molecular o brazo espaciador puede tener una longitud preferentemente de 3 A (10-10 m) a 10 nm, más preferiblemente de 5 A a 50 A, y lo más preferiblemente de 6 A a 30 A.
[0217] Las moléculas bifuncionales reactivas adecuadas para modificación del soporte sólido comprenden N-(ymaleimidobutiriloxi), éster de sulfosuccinimida (sulfo-GMBO), succinimidil (4-yodoacetil) aminobenzoato (sulfo-SIAN), propionato de succinimidilo-3-(bromoacetamido) (SBAP), glutaramida de disuccinimidilo (DSG), 2-piridilditioltetraoxatetradecano-N-hidroxisuccinimida (PEG-4-SPDP).
[0218] También existen soportes sólidos comercialmente disponibles de polímeros con funcionalidad reactiva introducida por unión covalente. Un ejemplo son microplacas denominadas CovaLink™ NH por Thermo scientific que permiten la unión covalente a través de un grupo amino secundario.
[0219] Otro aspecto de la presente invención es el uso del dispositivo de diagnóstico que comprende al menos un sacárido sintético de fórmula general (I) inmovilizado sobre un soporte sólido mediante unión covalente para el diagnóstico de meningitis, neumonía y epiglotitis causadapor Haemophilus influenzae tipo b.
K it
[0220] Una modalidad de la presente invención se refiere a un kit que comprende al menos un sacárido de fórmula general (I) inmovilizado sobre un soporte sólido mediante enlace covalente o el sacárido de fórmula general (I) para inmovilización sobre un soporte sólido. El al menos un sacárido de fórm ula general (I) se puede usar como m arcador en dichos ensayos. Otra modalidad de la presente invención se refiere a un kit que comprende al menos un anticuerpo contra un sacárido de cualquiera de las fórm ulas generales (I), (II-1), (II-2), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) y (IV-2).
[0221] Un kit en biología molecular o en diagnóstico médico es un paquete que incluye todos los ingredientes necesarios para realizar un determinado método o paso singular. Los productos químicos estándar como los presentes en cualquier laboratorio de biología molecular o médico estándar normalmente no están incluidos. Sin embargo, algunos de estos productos químicos estándar pueden ser indispensables para llevar a cabo el diagnóstico o la inmovilización correctamente. Se entiende que todos los ingredientes se proporcionan en cantidades que permiten una ejecución adecuada de las reacciones deseadas para la mayoría de las aplicaciones científicas, de diagnóstico y industriales.
[0222] A menudo, pero no siempre, estos ingredientes se proporcionan en soluciones ya preparadas listas o casi listas para usar. También puede haber com binaciones de diferentes ingredientes que ya se han agregado juntos. Otra ventaja es que tales kits deben ser verificados. Por lo tanto, el operador no tiene que probar de nuevo la viabilidad del método de diagnóstico y puede ahorrar en al menos algunos experimentos de control. Por lo tanto, los kits son una herram ienta muy popular en los laboratorios de investigación, diagnóstico y la industria.
[0223] Un kit de acuerdo con la invención deberá incluir al menos los siguientes componentes:
A) un soporte sólido sobre el cual al menos un sacárido de fórmula general (I), (II-1), (II-2), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) y (IV-2) está inmovilizado
B) al menos un anticuerpo, como anticuerpo de detección.
C) una solución estándar
o un kit de acuerdo con la invención deberá incluir al menos los siguientes componentes:
A') un soporte sólido sobre el cual al menos un anticuerpo contra un sacárido de fórm ula general (I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) y (IV-2) es inmovilizado
B) al menos un anticuerpo adicional, como anticuerpo de detección
C) una solución estándar.
[0224] Los siguientes componentes también pueden incluirse en dichos kits.:
D) una solución de bloqueo.
E) una solución de lavado
F) un am ortiguador de muestra
[0225] Un anticuerpo en el kit puede ser un anticuerpo específico que se puede usar como un anticuerpo de captura. Pero se prefiere que sea al menos un anticuerpo secundario unido a una enzima que se utiliza como anticuerpo de detección que se une específicamente a la región Fc del anticuerpo. Para determ inaciones cuantitativas, la densidad óptica (DO) o la fluorescencia de la muestra se compara con una curva estándar, que es típicamente una dilución en serie de una solución de concentración conocida de la molécula diana (una solución estándar). Una solución de bloqueo puede ser una solución de una proteína que no reacciona, como la albúmina o caseína de suero bovino, que se agrega para bloquear cualquier superficie plástica en el pozo que permanece sin recubrir por el antígeno. Las soluciones de lavado se utilizan para elim inar componentes no unidos. Se puede usar un amortiguador de muestra para diluir la muestra del paciente (sangre, suero, orina) de modo que la concentración de la molécula diana se encuentre en el rango que normalmente se puede detectar por el sistema de prueba utilizado.
[0226] Si se permite el kit para la inmovilización de un sacárido de fórm ulas generales (I), (II-1), (II-2), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) y (IV-2) en un soporte sólido, el kit debe incluir al menos:
A) al menos un sacárido de cualquiera de las fórm ulas generales (I), (II-1), (II-2), (II-4), (III-1), (III-2 ), (IV-1) y (IV-2), o un anticuerpo contra al menos un sacárido sintético de fórm ula general (I), (II-1), (II-2), (II -4), (III-1), (III-2), (IV-1) y (IV-2)
B) un soporte sólido, como una placa de microtitulación o un portaobjetos de microarreglos.
[0227] De este modo, el soporte sólido puede modificarse, por ejemplo, el soporte sólido puede funcionalizarse con una molécula conectora como se describe anteriormente.
[0228] Los siguientes componentes también pueden incluirse en dichos kits:
C) una solución de bloqueo.
D) una solución de lavado
E) un am ortiguador de muestra
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
[0229]
F igu ra 1: M oléculas de interconexión disponib les com ercialm ente de acuerdo con la presente invención.
F igu ra 2: (A) sacárido conjugado con una proteína transportadora; (B) sacárido conjugado sobre un soporte sólido. F igu ra 3: Esquem a sin té tico de tetrám ero de 2-m etoxiribosilrib ito lfosfa to 29 conjugado a C R M 197 y cisteína.
F igu ra 4: espectros de RMN 1H de (A) CPS fragm entado de Hib después del tratam iento con una solución de hidróxido de sodio 0.1 M durante 20 horas (B) CPS de Hib sin tra tar como referencia. La com paración m uestra que el CPS de Hib se hidroliza com pletam ente en 20 horas en condiciones básicas.
F igu ra 5: (A) crom atogram a de HPLC y (B) el espectro de masas ESI de CPS fragm entado de Hib después del tratam iento con una solución de hidróxido de sodio 0.1 M durante 20 horas.
F igu ra 6: crom atogram a HPLC de CPS de Hib después del tratam iento con A lhydrogel® (A) durante 7 días y (B) durante 2 días a 37° C así como (D) durante 7 días y (E) durante 2 días a tem peratura ambiente. El crom atogram a de HPLC de CPS de Hib no tratado se muestra en (C).
F igu ra 7: crom atogram a de HPLC del com puesto 16 después del tratam iento con (A) A lhydrogel®, (B) con fosfato de aluminio, (C) con agua durante 7 días a 37° C. Los crom atogram as de HPLC de los com puestos 16 y 8 no tratados se muestran en (D) y (E).
F igu ra 8: crom atogram a de HPLC del com puesto 16 después del tratam iento con (A) A lhydrogel®, (B) con fosfato de alum inio, (C) con agua durante 7 días a 2 -8 ° C. Los crom atogram as de HPLC de los com puestos 16 y 8 no tra tados se muestran en (D) y (E).
F igu ra 9: crom atogram a de HPLC del com puesto 16 después del tratam iento con (A) A lhydrogel®, (B) con fosfato de aluminio, (C) con agua durante 7 días a tem peratura ambiente. Los crom atogram as de HPLC de los com puestos 16 y 8 no tratados se muestran en (D) y (E).
F igu ra 10: crom atogram a de HPLC del com puesto 16 después del tratam iento con (A) A lhydrogel®, (B) con fosfato de aluminio, (C) con agua durante 7 días a 70° C. Los crom atogram as de HPLC de loa com puestos 16 y 8 no tratados se muestran en (D) y (E).
F igu ra 11: crom atogram a de HPLC del com puesto 30 después del tratam iento con (A) A lhydrogel®, (B) con am ortiguador de fosfato, (C) con agua durante 14 días a tem peratura ambiente. Los crom atogram as de HPLC de los com puestos 30, 16 y 8 no tratados se muestran en (D), (E) y (F).
F igu ra 12: crom atogram a de HPLC del com puesto 30 después del tratam iento con (A) A lhydrogel®, (B) con am ortiguador de fosfato, (C) con agua durante 14 días a 2 -8 ° C. Los crom atogram as de HPLC de los com puestos 30, 16 y 8 no tratados se muestran en (D), (E) y (F).
F igu ra 13: crom atogram a de HPLC del (A) com puesto 30 después del tratam iento con tratam iento posterior con solución de hidróxido de sodio 0.1 M durante 3 días; (C) el com puesto 16 después del tratam iento con tratam iento posterior con solución de hidróxido de sodio 0.1 M durante 3 días, los crom atogram as de HPLC de los compuestos 30, 16 y 8 no tratados se muestran en (B), (D) y (E).
F igu ra 14: Espectro de m asas MALDI del (A) com puesto 30 conjugado con C R M 197 y (B) com puesto 94.
F igu ra 15: crom atogram as de HPLC-SEC del com puesto 94 en presencia de am ortiguador de fosfato.
F igu ra 16: muestra la estructura del conjugado 94.
F igu ra 17: Análisis de matriz de glicanos: (A) unión de com puestos 19, 24, 29, 53 y 62 a anticuerpos (suero de referencia humano con Hib) en presencia de inhib idor de PRP de Hib (barras grises) o sin inhib idor (barras negras) después de 21 días; (B) unión de los com puestos 19, 24, 29, 53 y 62 a anticuerpos (suero de tip ificación de conejos) en presencia de inhib idor de PRP de Hib (barras grises) o sin inhib idor (barras negras) después de 21 días; La unión de los com puestos 19, 24, 29, 53, 62 y PRP natural de Hib com o referencia a los anticuerpos generados por inm unización con el com puesto 94 (C) y el com puesto 94 con A lhydrogel (D) después de 35 días. Las barras de error representan la desviación estándar de las muestras por cuadruplicado.
F igu ra 18: Estudio ELISA: unión de anticuerpos IgG de conejos (n = 4) inm unizados con conjugado sin adyuvante 94 ( H ), con conjugado 94 con adyuvante con A lhydrogel ( A ) , con PBS / A lhydrogel ( ® ) y con H iberiX® ( ▼ ) en placas recubiertas con antígeno PRP nativo de HP después de 0 días (A - control negativo), 14 días (B), 21 días (C) y 35 días (D). Los sueros se diluyeron 5 veces con BSA-PBS al 1%. Se añadieron sueros diluidos (100 pl) por pocillo de la placa de m icrotitu lación que se recubrió con 1 pg de polisacárido Hib-PRP, detectado con un anticuerpo secundario anti-conejo de cabra conjugado con HRP diluido a 1:10000 y desarro llado con TMB. La absorbancia se midió a 450 nm y los datos se representaron utilizando el software de prisma Graphpad.
F igu ra 19: Estudio ELISA: unión de anticuerpos IgG de conejos (n = 4) inm unizados con conjugado 94 sin adyuvante ( H ), con conjugado 94 con adyuvante con A lhydrogel ( A ) , con PBS / A lhydrogel ( ® ) y con H iberiX® ( ▼ ) en placas com erciales de ADi prerecubierto con antígeno PRP nativo de Hib después de 0 días (control negativo (A)), 14 días (B), 21 días (C) y 35 días (D). Los sueros se diluyeron 5 veces con BSA-PBS al 1%. Se añadieron sueros diluidos (100 |jl) por pocilio de la placa de m icrotitu lación que se recubrió con 1 j g de polisacárido Hib-PRP, detectado con un anticuerpo secundario anti-conejo de cabra conjugado con HRP diluido a 1:10000 y desarro llado con TMB. La absorbancia se midió a 450 nm y los datos se representaron utilizando el software de prisma Graphpad.
Ejemplos
S ín tes is Q uím ica
A b re v ia c io n e s :
[0230] CCL: cromatografía en capa fina, EtOAc: acetato de etilo, DCM: diclorometano, RBF: matraz de fondo redondo, ACN: acetonitrilo, AcOH: ácido acético, TBAF: fluoruro de tetrabutilamonio, BnBr: bromuro de bencilo, DMAP: dimetilam inopiridina, PTFE: politetrafluoroetileno, AIBN: azobisisobutironitrilo, THF: tetrahidrofurano, NAP: 2-naftilmetilo, Lev: levulinilo.
In fo rm a c ió n genera l para la s ín te s is qu ím ica
[0231] Los reactivos comerciales se utilizaron sin purificación adicional, excepto cuando se indique. Los disolventes se secaron y se volvieron a destilar antes de usar de la manera habitual. Todas las reacciones se realizaron en cristalería secada en estufa bajo una atmósfera inerte a menos que se indique lo contrario. La cromatografía analítica de capa fina (CCF) se realizó en placas de aluminio Kieselgel 60 F254 prerecubiertas con 0.25 mm de espesor de silica gel. Las placas de CCF se visualizaron con luz UV y se tiñeron con solución de Hanessian (sulfato cérico y molibdato de amonio en ácido sulfúrico acuoso) o solución de ácido sulfúrico-etanol. La crom atografía en columna se realizó en Fluka Kieselgel 60 (malla 230-400). Las rotaciones ópticas (OR) se midieron con un polarímetro Schm idt & Haensch UniPol L1000 a una concentración (c) expresada en g/100 ml. Los espectros de RMN 1H y 13C se midieron con un espectrómetro Varian 400-MR o Varian 600 con Me4Si como estándar interno. Los desplazamientos químicos de RMN (5) se registraron en ppm y las constantes de acoplam iento (J) se reportaron en Hz. Los espectros de masas de alta resolución (HRMS) se registraron con un espectrómetro de masas Agilent 6210 ESI-TOF.
P ro ce d im ie n to genera l A ) D esp ro te cc ión de d is ili lo x i.
[0232] Se añadieron TBAF (0.21 ml, 0.21 mmol) y AcOH (7 |jl, 0.11 mmol) a una solución en agitación de material de partida (0.073 mmol) en THF (1.5 ml) a tem peratura ambiente en 10 ml de RBF (secado en estufa) bajo argón atmósfera. La mezcla de reacción se agitó a tem peratura ambiente durante 4 h. La reacción se monitoreo por CCF. Una vez que se completó el consumo del material de partida, la mezcla de reacción se diluyó con DCM (10 ml) y se concentró a vacío para obtener el producto crudo. El producto crudo se sometió a cromatografía flash autom atizada utilizando EtOAc en n-hexano (20-60%) como eluyente. La concentración del disolvente de los tubos de ensayo que contienen el producto (basado en CCF) al vacío dio como resultado un aceite incoloro.
P ro ce d im ie n to genera l B) B en c ilac ió n u tiliz a n d o Bu2SnO
[0233] Se añadieron Ag2O (0.116 g, 0.5 mmol) y BnBr (8 j l , 0.07 mmol) a una solución en agitación de material de partida (0.063 mmol) en DCM (1 ml) a tem peratura am biente en un RBF de 10 ml (secado en estufa) bajo atmósfera de argón. La mezcla de reacción se mantuvo en agitación a temperatura ambiente durante 6 h. La reacción se monitoreó por CCF. Una vez que se com pletó el consum o de material de partida, la mezcla de reacción se diluyó con DCM (30 ml) y se filtró a través de una capa de celita y el filtrado se concentró al vacío para obtener el producto crudo. El producto crudo se purificó por cromatografía flash automatizada utilizando EtOAc en n-hexano (0-50%) como eluyente. La concentración de disolvente de los tubos de ensayo que contienen el producto (basado en CCF) al vacío dio como resultado el aceite incoloro.
[0234] Se añadió Bu2SnO (2.42 g, 9.73 mmol) a una solución transparente de material de partida diol (4.6 g, 6.48 mmol) en tolueno (50 ml) a tem peratura ambiente en atmósfera de argón equipada con una barra de agitación y agitación de 1400 rpm. Luego, la mezcla de reacción se mantuvo a reflujo a 130° C durante 6 h. Después de 6 h, el disolvente se elim inó al vacío y la reacción se secó azeotrópicam ente con tolueno (5 x 10 ml de tolueno seco). Después de la elim inación completa de los disolventes, el acetal se secó al vacío durante 20 min. El acetal se elim inó al vacío en presencia de argón y se disolvió en DMF (50 ml). A esta solución, se agregaron BnBr (1.16 mL, 9.73 mmol) y TBAI (4.78 g, 12.96 mmol) y la mezcla de reacción se mantuvo en agitación a 100° C durante 20 h. La reacción se monitoreó por CCF (40% de EtOAc en n-hexano). Después de 20 h, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (50 ml) y agua (20 ml). La capa acuosa se separó y se lavó con EtOAc (2 x 30 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 (~ 2 g), se filtraron y el filtrado se concentró al vacío para obtener el producto crudo. El producto crido se purificó por cromatografía en columna sobre silica gel usando EtOAc en n-hexano (gradiente, 0 a 30%) como eluyente. La concentración de disolvente de los tubos de ensayo dio como resultado el aceite incoloro (3.8 g, 73%).
P ro ce d im ie n to genera l C) P ro te cc ión con Lev
[0235] A una solución del compuesto hidroxilo (0.195 mmol) en DCM (3 ml) en un RBF de 25 ml bajo atmósfera de argón, se le añadió ácido levulínico (0.3 mmol, 30 |jl), clorhidrato de N-(3-dimetilam inopropil)-N '-etilcarbodiim ida (0.3 mmol, 58 mg) y DMAP (0.2 mmol, 24 mg). La mezcla de reacción resultante se agitó a tem peratura ambiente durante 2 h. La reacción se monitoreó por CCF. Después de que se completó el consumo de material de partida, la mezcla de reacción se diluyó con DCM (10 ml) y se lavó con salmuera (5 ml). La capa acuosa se extrajo con DCM (2 x 5 ml). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 (0.2 g), se filtró y el filtrado se concentró al vacío para obtener el producto crudo. El producto crudo se purificó por cromatografía flash automatizada utilizando EtOAc en n-hexano (0-50%) como eluyente. La concentración de disolvente de los tubos de ensayo que contienen los productos (basados en CCF) al vacío resultó en un aceite blanco.
P roce d im ien to genera l D) d e sp ro te cc ió n de NAP
[0236] A una solución del compuesto protegido con NAP (0.048 mmol) en diclorom etano:H2O (1.8:0.2 ml) en un RBF de 10 mL (secado en estufa) bajo atm ósfera de argón se añadió 2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4- benzoquinona (14 mg, 0.058 mmol) a 0° C. La mezcla de reacción se agitó a tem peratura ambiente durante 1.5 h. La reacción se monitoreó por CCF. La reacción se diluyó con DCM (10 ml) y se extrajo con solución acuosa saturada de NaHCO 3 (5 ml) y salmuera (5 ml). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 (0.2 g), se filtró y el filtrado se concentró a vacío durante 15 minutos para obtener el producto crudo. El producto crudo se purificó mediante cromatografía flash automatizada utilizando EtOAc en n-hexano (0-80%) como eluyente. La concentración de disolvente de los tubos de ensayo que contienen los productos (basados en CCF) al vacío resultó en un aceite blanco.
P roce d im ien to genera l E) A c o p la m ie n to de fo s fa to : m é todo de fo s fo ra m id ita
[0237] A una solución del compuesto 3-OH (0.054 mmol) en DCM (1.2 ml) en un RBF de 25 ml (secado en estufa) bajo atmósfera de argón, se añadió bis(diisopropilam in)-benciloxifosfina (0.108 mmol) y tetrazolida de diisopropilamonio (0.081 mmol) y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 1.5 h. La reacción se monitoreó por CCF. La mezcla de reacción se diluyó con DCM (10 ml) y se inactivó con solución acuosa saturada de NaHCO 3 (5 mL). La capa acuosa se extrajo con DCM (2 x 5 ml). La capa orgánica combinada se lavó con salmuera (5 ml), se secó sobre Na2SO4 (0.5 g), se filtró y el filtrado se concentró al vacío para obtener el producto crudo. El producto crudo se purificó en cromatografía en columna con silica gel (columna 2 X 10 cm) utilizando EtOAc en n-hexano (0-30%) y 2% de trietilam ina como eluyente. La concentración del disolvente de los tubos de ensayo que contienen el producto (basado en CCF) al vacío dio como resultado un aceite amarillo. El producto se transfirió a un RBF más pequeño (10 ml) usando tolueno (5 ml) y la evaporación del disolvente al vacío durante 20 minutos dio como resultado un aceite blanco. El producto se dejó en alto vacío durante 10 min purgado con argón y se usó inm ediatamente para la siguiente etapa. A una solución de fosforam idita (0.054 mmol) en DCM (1.2 ml) en un RBF de 10 (secado en estufa) bajo atmósfera de argón, se añadió el compuesto 5-OH (0.036 mmol) y tetrazol 0.45 M en ACN (0.24 ml, 0.108). mmol) y la solución se agitó a tem peratura ambiente durante 2 h. Luego, se añadió solución de peróxido de t-butilo 5.0 - 6.0 M en decano (0.015 ml, 0.072 mmol) a temperatura ambiente y la mezcla de reacción se agitó durante 1 h. La mezcla de reacción se diluyó con DCM (10 ml) y se inactivo con solución acuosa saturada de NaHCO3 (5 mL). La capa acuosa se extrajo con DCM (2 x 5 ml). La capa orgánica combinada se lavó con salmuera (5 ml), se secó sobre Na2SO4 (0.3 g), se filtró y el filtrado se concentró al vacío a 35° C a la tem peratura del baño del evaporador rotatorio durante 15 minutos para obtener el producto crudo. El producto crudo se purificó por cromatografía flash automatizada utilizando EtOAc en n-hexano (0-80%). La concentración del disolvente de los tubos de ensayo que contienen el producto (basado en CCF) al vacío dio como resultado un aceite incoloro.
P ro ce d im ie n to gene ra l F) A c o p la m ie n to de l fo s fa to con el con e c to r: m é tod o de fo s fo ra m id ita (p ro ce d im ie n to en un s o lo rec ip ien te )
[0238] A una solución del com puesto hidroxilo (0.016 mmol) en DCM (1.0 mL) en un RBF de 10 ml (secado en estufa) bajo atmósfera de argón se le añadió bis(diisopropilamin) benciloxifosfina (0.032 mmol) y tetrazolida de diisopropilamonio (0.024 mmol) y La solución se agitó a tem peratura ambiente durante 1.5 h. Luego, el conector (0.097 mmol) y la solución de tetrazol 0.45 M en ACN (0.11 ml, 0.049 mmol) y se agitó a tem peratura ambiente durante 2 h. La reacción se monitoreó por CCF. Luego, se añadió solución de peróxido de t-butilo 5.0 - 6.0 M en decano (0.006 ml, 0.032 mmol) a tem peratura ambiente y la mezcla de reacción se agitó durante 1 h. La reacción se monitoreó por CCF. La mezcla de reacción se diluyó con DCM (5 ml) y se inactivó con una solución acuosa saturada de NaHCO 3 (3 mL). La capa acuosa se extrajo con DCM (2 x 3 ml). La capa orgánica combinada se lavó con salmuera (3 ml), se secó sobre Na2SO4 (0.2 g), se filtró y el filtrado se concentró al vacío para obtener el producto crudo. El producto crudo se purificó por cromatografía flash automatizada utilizando EtOAc en n-hexano (0-80%). La concentración de disolvente de los tubos de ensayo que contienen el producto (basado en CCF) al vacío resultó en un aceite incoloro.
[0239] Los siguientes conectores fueron empleados en la síntesis.:
P ro ce d im ie n to genera l G) d e sp ro te cc ió n de Lev.
[0240] A una solución del compuesto protegido con Lev (0.060 mmol) en DCM (2 ml), se agregó una solución de hidrato de hidracina (0.267 mmol, 13 |jl) disuelto en ácido acético (0.08 ml) y se añadió piridina (0.12 ml). La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. La reacción se inactivó mediante la adición de acetona (0.5 ml) y el disolvente se eliminó al vacío para obtener el producto crudo. El producto crudo se purificó mediante cromatografía flash automatizada utilizando EtOAc en n-hexano (0-80%) como eluyente. La concentración de disolvente de los tubos de ensayo que contienen los productos (basados en CCF) al vacío resultó en un aceite blanco.
P roce d im ien to genera l H) H id rogenac ión .
[0241] A una solución del compuesto protegido (20 mg) en EtOAc: MeOH: H2O: AcOH (1.0: 0.5: 0.25: 0.125, 1.825 ml) en un matraz de fondo redondo de 10 ml equipado con una barra de agitación, se añadió paladio sobre carbono (20 mg). Usando un globo, la solución se purgó con hidrógeno durante 2 minutos y se agitó a temperatura ambiente bajo presión de hidrógeno durante 40 h. La reacción se filtró a través de un filtro de PTFE (0.45 |<j>M) y el matraz se lavó usando una solución de H2O:MeOH (1:1.5 ml). El filtrado se concentró al vacío para obtener el producto crudo. El producto crudo se purificó en SepPak C18 ec (pequeño) usando 100% de H2O, H2O:MeOH (1:1) y 100% de MeOH como eluyente. La concentración de disolvente del vial que contiene el producto principal en liofilizador durante la noche dio como resultado un sólido blanco.
E jem p lo A. G lic o s ila c ió n
E jem p lo A-1. C o m pu esto 4
[0242]
Se coevaporó 2,3,4-Tri-O-bencil-5-O-(2-naftalenilm etil)-1-O-D-ribitol 2 (40 g, 71.08 mmol) con tolueno anhidro y se secó al vacío. Una solución de 2 en DCM anhidro (320 ml) en atm ósfera de argón y agitación se enfrió a 0° C y BF3^Et2O (19.3 ml, 156.38 mmol) añadido gota a gota. Después de 5 minutos, se añadió una solución de 1,2,3,5-tetra-O-acetil-p-D-ribofuranosa 1 (15.08 g, 47.38 mmol) en tolueno (480 ml) durante 45 minutos. La mezcla de reacción se calentó a tem peratura ambiente y se agitó durante 2 h. La reacción se monitoreó por CCF. La mezcla de reacción se inactivó mediante la adición de trietilam ina (50 ml) y se diluyó con DCM (200 ml). La mezcla de reacción se lavó con solución acuosa saturada de NaHCO3 (200 ml) y la capa acuosa se extrajo con DCM (2 x 150 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con solución acuosa saturada de NaCl (100 ml) y se secó sobre Na2SO4 (~ 20 g), se filtró y el filtrado se concentró al vacío para obtener el producto crudo. El producto crudo 4 se purificó por cromatografía en columna con silica gel usando EtOAc en n-hexano (20-30%) como eluyente. La concentración de disolvente de los tubos de ensayo que contenían el producto al vacío dio como resultado el aceite amarillo. El producto (31.05 g, 37.82 mmol) se redisolvió entonces en metanol (70 ml) en un RBF de 250 ml (secado en estufa) bajo atmósfera de argón y se añadió solución de metóxido de sodio al 25% en peso en metanol (4.09 ml, 18.91 mmol). La solución se agitó a tem peratura ambiente durante 4 h. La reacción se monitoreó por CCF. La mezcla de reacción se neutralizó (pH 7) mediante la adición de Amberlite IR-120H (500 mg), se filtró y el disolvente se evaporó al vacío para obtener el producto crudo. El producto crudo se purificó por cromatografía en columna con silica gel usando EtOAc en n-hexano (50-100%) como eluyente. La concentración de disolvente de los tubos de ensayo que contenían el producto 4 al vacío dio como resultado el aceite amarillo (11.46 g, 35% en 2 pasos). HRMS (ESI+) Calculado para C42H46OgNa+ [M+Na]+ 717.3040, encontrado 717.3057.
E jem p lo A-2. C o m pu esto 5
[0243]
[0244] Se añadió gota a gota 1,3-dicloro-1,1,3,3-tetraisopropildisiloxano (8.2 g, 11.79 mmol) a una solución de triol 4 (3.53 g, 11.2 mmol) e im idazol (3.05 mg, 44.8 mmol) en acetonitrilo (70 ml) en un RBF de 100 ml (secado en estufa) bajo atmósfera de argón. La reacción se monitoreó por CCF. Después de agitar a tem peratura ambiente durante 10 minutos, la mezcla de reacción se inactivó mediante la adición de agua (10 ml) y se diluyó con DCM (50 ml) y agua (20 ml). La capa acuosa se separó y se lavó con DCM (2 x 30 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 (~ 2 g), se filtraron y el filtrado se concentró a vacío para obtener el producto crudo. El producto crudo se purificó por cromatografía flash automatizada utilizando EtOAc en n-hexano (0-30%) como eluyente. La concentración de disolvente de los tubos de ensayo que contenían el producto 5 al vacío dio como resultado un aceite incoloro (8.4 g, 76%). HRMS (ESI+) Calculado para C54H72N2O1üSi2Na+ [M+Na]+ 959.4562, encontrado 959.4590.
E jem p lo B. 2 '-M e to x ip o lir ib o s ilr ib ito lfo s fa to
E jem p lo B-1. C o m pu esto 6
[0246] Se añadió Ag2O (6 g, 26.0 mmol) a una solución en agitación del alcohol 5 (3.5 g, 3.73 mmol) en MeI (6 ml) a temperatura ambiente en un RBF de 25 ml (secado en estufa) bajo atmósfera de argón. La mezcla de reacción se agitó durante 2.5 días. La reacción se monitoreó por CCF. Una vez que se completó el consumo del material de partida la mezcla de reacción se diluyó con DCM (50 ml) y se filtró a través de una capa de Celite® y el filtrado se concentró al vacío para obtener el producto crudo. El producto crudo se purificó por cromatografía en columna con silica gel usando EtOAc en n-hexano (0-20%) como eluyente. La concentración de disolvente de los tubos de ensayo que contenían el producto al vacío dio como resultado el aceite incoloro 6 (3.0 g, 85%). HRMS (ESI+) Calculado para C55^4N2O ^S i2Na+ [M+Na]+ 973.4718, encontrado 973.4738.
E jem p lo B-2. C o m pu esto 7
[0248] De acuerdo con el procedimiento general A ), el compuesto sililado 6 se convirtió al producto diol 7 (4.6 g, 96%). HRMS (ESI+) Calculado para C43H48O9Na+ [M+Na]+ 731.3196, encontrado 731.3217.
Ejemplo B-3. Com puesto 8
[0249]
[0250] De acuerdo con el procedimiento general H), el monómero 7 se convirtió en el monómero desprotegido 8 (5 mg, 67%). HRMS (ESI+) Calculado para C n H 22O9Na+ [M+Na]+ 321.1162, encontrado 321.1187.
E jem p lo B-4. C o m pu esto 9
[0251]
[0252] Se añadió bromuro de bencilo (77 mg, 0.45 mmol) e hidruro de sodio (16 mg, 0.672 mmol) a una solución agitada del diol 7 (80 mg, 0.112 mmol) en THF:DM F (1.5:0.2, 1.7 ml) de solución bajo atmósfera de argón a 0° C. La reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante la noche. La mezcla de reacción se inactivó con agua helada (1 ml) y se extrajo con EtOAc (3 x 10 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 (~ 0.5 g), se filtraron y el filtrado se concentró al vacío para obtener el producto crudo. El producto crudo se purificó por cromatografía flash utilizando EtOAc en n-hexano (0-50%) como eluyente. La concentración del disolvente de los tubos de ensayo que contenían el producto 9 al vacío dio como resultado un aceite incoloro (75 mg, 75%). HRMS (ESI+) Calculado para C57H60O9Na+ [M+Na]+ 911.4135, encontrado 911.4162.
E jem p lo B-5. C o m pu esto 10
[0254] De acuerdo con el procedimiento general D), el intermediario 9 protegido por NAP se convirtió en el 5-hidroxilo del compuesto 10 (189 mg, 89%). HRMS (ESI+) Calculado para C46H52O9Na+ [M+Na]+ 771.3509, encontrado 771.3521.
Ejemplo B-6. Com puesto 11
[0255]
[0256] De acuerdo con el procedim iento general B), el diol 7 se convirtió en el producto bencilado 11 (3.8 g, 73%). HRMS (ESI+) Calculado para C50H54OgNa+ [M+Na]+ 821.3666, encontrado 821.3672.
E jem p lo B-7. C o m pu esto 12
[0258] De acuerdo con el procedim iento general C), el intermediario 3-hidroxilo 11 se convirtió en el compuesto 12 protegido con Lev (1.75 g, 97%). HRMS (ESI+) Calculado para C55H60OnNa+ [M+Na]+ 919.4033, encontrado 919.4062.
Ejemplo B-8. Com puesto 13
[0259]
[0260] De acuerdo con el procedim iento general D), el intermediario 12 protegido con NAP se convirtió en el 5-hidroxilo del compuesto 13 (1.23 g, 80%). HRMS (ESI+) Calculado para C44H52OnNa+ [M+Na]+ 779.3407, encontrado 779.3431.
E jem p lo B-9. C o m pu esto 15
[0261]
De acuerdo con el procedimiento general E), el 3-hidroxilo del compuesto 11 y el 5-hidroxilo del compuesto 10 se convirtieron en el dímero 15 (60 mg, 95%). HRMS (ESI+) Calculado para Cio3H-mO2oPNa+ [M+Na]+ 1721.7304, encontrado 1721.7393.
Ejemplo B-10. Com puesto 16
[0263]
[0264] De acuerdo con el procedim iento general H), el dímero 15 se convirtió en el dímero desprotegido 16 (5.6 mg, 77%). HRMS (ESI+) Calculado para C n H 22Ü 9Na+ [M+Na]+ 681.1983, encontrado 681.2000.
E jem p lo B-11. C o m pu es to 17
[0266] De acuerdo con el procedim iento general D), el dímero 15 protegido con NAP se convirtió en el 5-hidroxilo del compuesto 17 (30 mg, 60%). HRMS (ESI+) Calculado para C92Hio3O2oNa+ [M+Na]+ 1581.6678, encontrado 1581.6734.
E jem p lo B-12. C o m pu es to 18
18
[0268] De acuerdo con el procedim iento general E), el dímero 17 se acopló al conector 5-azido-pentanol para dar el dímero 18 (6 mg, 42%). HRMS (ESI+) Calculado para C 104H n 9N3O 23P2Na+ [M+Na]+ 1863.7641, encontrado 1863.7709.
Ejemplo B-13. Com puesto 19
[0269]
[0270] De acuerdo con el procedim iento general H), el dímero 18 se convirtió en el dímero desprotegido 19 (1.2 mg, 55%). HRMS (ESI+) Calculado para C27H5Ü 23P2Na+ [M+Na]+ 846.2538, encontrado 846.2540.
E jem p lo B-14. C o m pu es to 20
[0272] De acuerdo con el procedim iento general E), el 3-hidroxilo del compuesto 11 y el 5-hidroxilo del compuesto 13 se convirtieron en el dímero 20 (1.5 g, 76%). HRMS (ESI+) Calculado para C io iH iiiÜ 22PNa+ [M+Na]+ 1729.7202, encontrado 1729.7240.
E jem p lo B-15. C o m pu es to 21
[0273]
21
[0274] De acuerdo con el procedimiento general D), el intermediario 20 protegido con NAP se convirtió en el 5-hidroxilo del compuesto 21 (386 mg, 63%). HRMS (ESI+) Calculado para CMHi03Ü22PNa+ [M+Na]+ 1589.6576, encontrado 1589.6613.
Ejemplo B-16. Com puesto 22
0275
[0276] De acuerdo con el procedim iento general G), el dímero 20 se convirtió en el 3-hidroxil del dímero 22 (473 mg, 74%). HRMS (ESI+) Calculado para C96H105O20PNa+ [M+Na]+ 1631.6835, encontrado 1631.6873.
E jem p lo B-17. C o m pu es to 23
[0278] De acuerdo con el procedim iento general E), el 3-hidroxil del dímero 22 se acopló al conector 5-azido-pentanol para dar el dímero 23 (3 mg, 30%). HRMS (ESI+) Calculado para C 10sH121N3O23P2Na+ [M+Na]+ 1912.7764, encontrado 1912.7781. E jem p lo B-18. C o m pu es to 24
[0279]
[0280] De acuerdo con el procedimiento general H), el dímero 23 se convirtió en el dímero desprotegido 24 (1.1 mg, 76%). HRMS (ESI+) Calculado para C27^ O 23P2Na+ [M+Na]+ 846.2538, encontrado 846.2540.
Ejemplo B-19. Com puesto 25
0281
[0282] De acuerdo con el procedim iento general E), el 3-hidroxilo del dímero 22 y el 5-hidroxilo del dímero 21 se convirtieron en el tetrám ero 25 (367 mg, 86%). HRMS (ESI+) Calculado para C 193H213O44P3Na+ [M+Na]+ 3350.3540, encontrado 3350.3531. E jem p lo B-20. C o m pu es to 26
[0283]
[0284] De acuerdo con el procedim iento general D), el tetrám ero 25 protegido con NAP se convirtió en el 5-hidroxilo del tetrám ero 26 (125 mg, 75%). HRMS (ESI+) Calculado para C 182H205O44P3Na+ [M+Na]+ 3210.2914, encontrado 3210.2911. E jem p lo B-21. C o m pu es to 27
[0285]
[0286] De acuerdo con el procedim iento general E), el tetrám ero 26 se acopló al conector 5-azido-pentanol para dar el tetrám ero 27 (35 mg, 77%). HRMS (ESI+) Calculado para C ^ 4H221N3° 47P4Na+ [M+Na]+ 3491.3844, encontrado 3492.3787. E jem p lo B-22. C o m pu es to 28
[0288] De acuerdo con el procedim iento general G), el tetrámero 27 se convirtió en el 3-hidroxilo del tetrám ero 28 (30 mg, 90%). HRMS (ESI+) Calculado para C i89H2i 5N3O45P4Na+ [M+Na]+ 3393.3476, encontrado 3393.3543.
E jem p lo B-23. C o m pu es to 29
[0290] De acuerdo con el procedim iento general H), el tetrám ero 28 se convirtió al tetrám ero desprotegido 29 (10 mg, 73%). HRMS (ESI+) Calculado para C49^ 7N ° 45P4Na+ [M+Na]+ 1566.4181, encontrado 1566.4174.
E jem p lo B-24. C o m pu es to 30
[0291]
[0292] El tetrámero 30 se prepara en dos pasos a partir del tetrám ero 26 según el procedimiento general G) y el procedimiento general H).
E jem p lo B-25. C o m pu es to 31
[0294] De acuerdo con el procedimiento general E), el 3-hidroxilo del dímero 22 y el 5-hidroxilo del tetrámero 26 se convirtieron en el hexámero 31 (85 mg, 85%). HRMS (ESI+) Calculado para C285H315O66P5Na+ [M/2+Na]+ 2496.9888, encontrado 2496.0271.
E jem p lo B-26. C o m pu es to 32
[0296] De acuerdo con el procedimiento general D), el hexámero 31 protegido por NAP se convirtió en el 5-hidroxilo del hexámero 32 (50 mg, 65%). HRMS (ESI+) Calculado para C274H307O66P5Na+ [M/2+Na]+ 2426.9677, encontrado 2426.9977.
E jem p lo B-27. C o m pu es to 33
[0300] De acuerdo con el procedim iento general D), el octámero 33 protegido con NAP se convirtió en el 5-hidroxilo del octámero 34 (35 mg, 73%). 1H RMN (400 MHz, Cloroformo-d) 5 7.43 - 7.07 (m, 195H), 5.10 (t,J= 5.4 Hz, 1H), 5.08 - 4.78 (m, 29H), 4.70 - 4.45 (m, 51H), 4.45 - 4.15 (m, 38H), 3.95 - 3.54 (m, 50H), 3.54 - 3.36 (m, 16H), 3.36 - 3.25 (m, 24H), 2.72<(t,>J= 6.5 Hz, 2H), 2.65 - 2.56 (m, 2H), 2.16 (s, 3H).
E jem p lo B-29. C o m pu es to 35 - q u ím ica de l fo s fo n a to
[0301]
[0302] A una solución del 3-hidroxilo del compuesto 11 (10 mg) e im idazol (5.96 mg, 0.087 mmol) en DCM (2 ml) en un RBF de 10 ml (secado en estufa) bajo atmósfera de argón, se agregó PCl3 (4.37 |jl, 0.050 mmol) y trietilam ina (12.28 |jl, 0.087 mmol) a 0° C. Después de 5 min, la mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 1 h. La reacción se monitoreó por CCF. La reacción se diluyó con DCM (5 ml), se inactivó mediante la adición de una solución saturada acuosa de NaHCÜ3 (5 ml) y solución amortiguadora de trietilamonio (5 ml). La capa acuosa se extrajo con DCM (2 x 10 ml), las capas orgánicas combinadas se lavaron con salm uera (5 ml). La capa orgánica se secó sobre Na2SÜ4 (0.25 g), se filtró y el filtrado se concentró al vacío para obtener el producto crudo. El producto crudo se purificó por cromatografía en columna con silica gel usando MeÜH al 10% en DCM como eluyente. La concentración de disolvente de los tubos de ensayo que contienen el producto 35 (basado en CCF) al vacío dio como resultado el aceite amarillo (10 mg, 83%). HRMS (ESl+) Calculado para C56H71N Ü nS P [M+H]+ 964.4765, encontrado 964.4759.
E jem p lo B-30. C o m pu es to 36
[0304] El H-fosfonato 35 (10 mg, 0.010 mmol) y el compuesto 13 (7.85 mg, 0.010 mmol) se disolvieron en piridina (1 ml). Se añadió lentamente cloruro de trimetilacetilo (3.83 j l , 0.031 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadió una solución de yodo (2.6 mg, 0.010 mmol) en piridina-agua (96:4, v/v; 67 j l ) y la reacción se agitó adicionalmente durante 30 minutos a tem peratura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con CH2Ch (5 ml) y se lavó con una solución saturada acuosa de Na2S2O3 (5 ml) y luego con solución de TEAB 1.0 M (5 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron al vacío. El residuo se purificó por cromatografía flash (DCM / MeOH, 10:1, v/v) para producir 36 (5.5 g, 29%) como un aceite incoloro. HRMS (ESI+) Calculado para C94H104O22P+ [M]- 1615.6762, encontrado 1615.7056.
E jem p lo C. 2 '-D e s o x ip o lir ib o s ilr ib ito lfo s fa to (co m p u e s to de re fe renc ia 53)
E jem p lo C-1. C o m pu esto 37
[0305]
[0306] A una solución del alcohol 4 (860 mg, 0.92 mmol) en 1,2-dicloroetano (5 ml) en un RBF de 25 ml (secado en estufa) bajo atmósfera de argón se le añadió tiocarbonildiim idazol (327 mg, 1.83 mmol). La solución se agitó a 60° C durante 64 h. La reacción se monitoreó por CCF. El disolvente se evaporó al vacío para obtener el producto crudo. El producto crudo se purificó por cromatografía flash en columna utilizando EtOAc en n-hexano (0-30%) como eluyente. La concentración de disolvente de los tubos de ensayo que contienen el producto 37 (basado en CCF) al vacío resultó en un aceite blanco (950 mg, 98%). HRMS (ESI+) Calculado para C5sH74N2O 10SSi2Na+ [M+Na]+ 1069.4500, encontrado 1069.4525.
E jem p lo C-2. C o m pu esto 38
[0308] A una solución de BusSnH (0.49 ml, 1.814 mmol) y AIBN (0.2 M en tolueno, 0.46 ml, 0.091 mmol) en tolueno (20 ml) en un RBF de 100 ml (secado en estufa) bajo atmósfera de argón a 60° C se añadió gota a gota una solución de tiocarbamato 37 (950 mg, 0.907 mmol) en tolueno (20 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 2 h. La reacción se monitoreó por CCF. La mezcla de reacción se diluyó, se inactivó con una solución saturada acuosa de NaHCO3 (10 ml). La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 20 ml). La capa orgánica combinada se lavó con salmuera (10 ml), se secó sobre Na2SO4 (0.5 g), se filtró y el filtrado se concentró al vacío para obtener el producto crudo. El producto crudo se purificó por cromatografía flash automatizada utilizando EtOAc en n-hexano (0-50%). La concentración de disolvente de los tubos de ensayo que contienen el producto 38 (basado en CCF) al vacío resultó en un aceite incoloro (510 mg, 61%). HRMS (ESI+) Calculado para C58H72O9Si2Na+ [M+Na]+ 943.4613, encontrado 943.4640
E jem p lo C-2. C o m pu esto 39
[0309]
[0310] De acuerdo con el procedim iento general A), el compuesto silbado 38 se convirtió en producto diol 39 (330 mg, 90%). HRMS (ESI+) Calculado para C42H46O8Na+ [M+Na]+ 701.3090, encontrado 701.3117.
E jem p lo C-3. C o m pu esto 40
[0312] De acuerdo con el procedim iento general B), el diol 39 se convirtió en el producto bencilado 40 (260 mg, 69%). HRMS (ESI+) Calculado para C49^ 2O8Na+ [M+Na]+ 791.3560, encontrado 791.3565.
E jem p lo C-4. C o m pu esto 41
[0314] De acuerdo con el procedimiento general C), el intermediario 3-hidroxilo 40 se convirtió en el compuesto 41 protegido con Lev (135 mg, 82%). HRMS (ESI+) Calculado para C54H58O10Na+ [M+Na]+ 889.3928, encontrado 889.3928.
E jem p lo C-5. C o m pu esto 42
[0315]
[0316] De acuerdo con el procedim iento general D), el intermediario 41 protegido con NAP se convirtió en el 5-hidroxilo del compuesto 42 (95 mg, 85%). HRMS (ESI+) Calculado para C43H50O™Na+ [M+Na]+ 749.3302, encontrado 749.3325.
E jem p lo C-6. C o m pu esto 44
[0318] De acuerdo con el procedim iento general E), el 3-hidroxilo del compuesto 40 y el 5-hidroxilo del compuesto 42 se convirtieron en el dímero 44 (160 mg, 78%). HRMS (ESI+) Calculado para C99H ^ O 20PNa+ [M+Na]+ 1669.6991, encontrado 1669.6981.
E jem p lo C-7. C o m pu esto 45
[0320] De acuerdo con el procedimiento general D), el dímero 44 se convirtió en el 5-hidroxil del dímero 45 (53 mg, 73%). HRMS (ESI+) Calculado para C99Hw O20PNa+ [M+Na]+ 1529.6365, encontrado 1529.6397.
E jem p lo C-8. C o m pu esto 46
[0322] De acuerdo con el procedim iento general G), el dímero 44 se convirtió en el 3-hidroxilo del dímero 46 (85 mg, 91%). HRMS (ESI+) Calculado para C94H101Ü 18PNa+ [M+Na]+ 1571.6623, encontrado 1571.6656.
E jem p lo C-9. C o m pu esto 49
[0324] De acuerdo con el procedim iento general E), el 3-hidroxilo del dímero 46 y el 5-hidroxilo del dímero 45 se convirtieron en el tetrám ero 49 (96 mg, 83%). HRMS (ESI+) Calculado para C 189H205O4oP3Na+ [M+Na]+ 3230.3118, encontrado 3230.3111.
E jem p lo C-10. C o m pu es to 50
[0325]
[0326] De acuerdo con el procedim iento general D), el tetrám ero 49 protegido con NAP se convirtió en el 5-hidroxilo del tetrám ero 50 (50 mg, 56%). HRMS (ESI+) Calculado para C 178H197O 4üP3Na+ [M+Na]+ 3090.2492, encontrado 3090.2405.
E jem p lo C-11. C o m pu es to 51
[0328] De acuerdo con el procedim iento general E), el tetrám ero 50 se acopló al conectorr 5-azido-pentanol para dar el tetrám ero 51 (41 mg, 76%). HRMS (ESI+) Calculado para C i90H2i 3N3O43P4Na+ [M+Na]+ 3371.3421, encontrado 3371.3321.
E jem p lo C-12. C o m pu es to 52
[0329]
[0330] De acuerdo con el procedim iento general G), el tetrámero 51 se convirtió en el 3-hidroxilo del tetrám ero 52 (36 mg, 92%). HRMS (ESI+) Calculado para C 185H207NsO41P4Na+ [M+Na]+ 3273.3053, encontrado 3273.3079.
E jem p lo C-13. C o m pu es to de re fe renc ia 53
[0332] De acuerdo con el procedimiento general H), el tetrám ero 52 se convirtió al tetrám ero desprotegido 53 (6 mg, 70%). HRMS (ESI+) Calculado para C45H89NO4^ N a [M+Na/2]+ 723.1879, encontrado 723.1996.
E jem p lo D. 2 '-N .N .-D im e tila m in o c a rb o n ilp o lir ib o s ilr ib ito lfo s fa to (co m p u e s to de re fe renc ia 62)
E jem p lo D-1. C o m pu esto 54
[0333]
[0334] A una solución del alcohol 4 (2.153 g, 2.299 mmol) en DCM (10 ml) a tem peratura ambiente bajo atmósfera de argón, se añadió 1,1-carbonildiim idazol (145 mg, 4.598 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 20 minutos (cuando la CDI se disolvió por completo) y se monitoreó por CCF hasta que se consumió por completoel material de partida. El disolvente se evaporó al vacío para dar el producto crudo. El producto crudo se purificó por cromatografía flash automatizada utilizando EtOAc en n-hexano (0-100%) como eluyente. La concentración de disolvente de los tubos de ensayo que contienen el producto 54 (basado en CCF) al vacío resultó en un aceite incoloro (2.35 g, 99%). HRMS (ESI+) Calculado para C58H75N2O nS i2+ [M+H]+ 1031.4909, encontrado 1031.4936.
E jem p lo D-2. C o m pu esto 55
[0335]
[0336] El monómero 54 (2.396 g, 2.32 mmol) se disolvió en ACN (20 ml) a tem peratura ambiente bajo atmósfera de argón y se añadió Me2NH (1.89 g, 23.2 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 65 horas y se monitoreó por CCF. La solución se filtró a través de una almohadilla de celita y se lavó con DCM (50 ml). El disolvente se evaporó al vacío. El sólido resultante se solubilizó en DCM (100 ml) y la solución orgánica se lavó con salm uera (100 ml) y se secó con Na2SO 4 (~ 2 g). El disolvente orgánico se evaporó al vacío para dar un producto crudo. El producto crudo se purificó por cromatografía flash automatizada utilizando EtOAc en n-hexano (0-100%) como eluyente. La concentración de disolvente de los tubos de ensayo que contienen el producto 55 (basado en CCF) al vacío resultó en un aceite incoloro (2 g, 85%). HRMS (ESI+) Calculado para C57H77N O nS i2Na+ [M+Na]+ 1030.4933, encontrado 1030.4958.
E jem p lo D-3. C o m pu esto 56
[0337]
[0338] De acuerdo con el procedimiento general A), el compuesto sililado 55 se convirtió al producto diol 56 (1.1 g, 73%). HRMS (ESI+) Calculado para C45H51NO-,0Na+ [M+Na]+ 788.3411, encontrado 788.3431.
E jem p lo D-4. C o m pu esto 57
[0339]
[0340] De acuerdo con el procedim iento general B), el diol 56 se convirtió en el producto bencilado 57 (91 mg, 16%). HRMS (ESI+) Calculado para C52^ 7NO 1oNa+ [M+Na]+ 878.3880, encontrado 878.3930.
E jem p lo D-5. C o m pu esto 58
[0341]
[0342] De acuerdo con el procedim iento general C), el intermediario 3-hidroxilo 57 se convirtió en el compuesto 58 protegido con Lev (46 mg, 92%). HRMS (ESI+) Calculado para C57H6sNOi2Na+ [M+Na]+ 976.4248, encontrado 976.4318.
E jem p lo D-6. C o m pu esto 59
[0344] De acuerdo con el procedimiento general D), el monómero 58 se convirtió en el 5-hidroxilo del monómero 59 (23 mg, 60%). HRMS (ESI+) Calculado para C4eH55NO12Na+ [M+Na]+ 836.3622, encontrado 836.3682.
E jem p lo D-7. C o m pu esto 60
[0346] De acuerdo con el procedim iento general E), el monómero 59 se acopló al conector 5-azido-pentanol para dar el monómero 60 (19 mg, 70%). HRMS (ESI+) Calculado para C58H71N4O-,5PNa+ [M+Na]+ 1117.4551, encontrado 1117.4628.
E jem p lo D-8. C o m pu esto 61
61
[0348] De acuerdo con el procedim iento general G), el monómero 60 se convirtió en el 3-hidroxilo del monómero 61 (12 mg, 71%). HRMS (ESI+) Calculado para C53H65N4O-,3PNa+ [M N a]+1019.4183, encontrado 1019.4246.
E jem p lo D-9. C o m pu esto de re fe renc ia 62
[0350] De acuerdo con el procedim iento general H), el monómero 61 se convirtió en el monómero desprotegido 62 (3 mg, 60%). HRMS (ESI+) Calculado para C 18H38N2O 13PNa+ [M+H]+ 521.2112, encontrado 521.2125.
E jem p lo G. S ín tes is de un c o n ju g a d o de s a cá rid o - CRM197 -c is te ín a e s ta b ilizad o
E jem p lo G-1. C o m pu esto 90
[0351]
[0352] P reparando el CRM 197 para la c o n ju g a c ió n : Se transfirió el CRM 197 (3.0 mg, 0.0517 |jmol) de la solución madre al filtro Am icon (0.5 ml, MWCO 30KDa) y se centrifugó durante 3 m inutos a 10000 RPM. Se añadieron 300 j l del 1X PBS a la proteína restante en el filtro Am icon y se centrifugaron nuevamente durante 3 m inutos a 10000 RPM. Luego, se agregaron 400 j l de amortiguador 1X PBS (pH 7.4) al filtro Amicon y se centrifugaron durante 3 minutos a 10000 RPM. Luego, se invirtió el filtro que contenía proteína dentro de un nuevo tubo de m icrocentrífuga Amicon (1.5 ml) y se centrifugó durante 1 minuto a 1000 RpM para recolectar la proteína en tubos de m icrocentrífuga (volumen ~ = 100-120 jl) .
[0353] P roce d im ien to de con ju gac ión : CRM 197 en amortiguador 1X PBS (~ 100 j l ) se diluyó con 1.3 ml de amortiguador 1X PBS en el vial de reacción a tem peratura ambiente equipado con una barra de agitación.
El éster N-hidroxisuccinim ida del ácido 3- (maleimido) propiónico (0.668 mg, 2.58 jm o l) se transfirió a un vial de reacción de vidrio Tipo I de 2 ml, se disolvió con 20 j l de DMSO, se agregó al vial de reacción que contenía C R M 197 en amortiguador 1X PBS. Se agitó la reacción a tem peratura ambiente durante 4 h. El RM era una solución clara e incolora.
[0354] E tapas de lavado: la mezcla de reacción se transfirió al filtro Am icon (0.5 ml, MWCO 30KDa) y se centrifugó durante 3 minutos a 10000 RPM y se repitió el proceso hasta que la mezcla de reacción completa se transfirió y se centrifugó. Luego, se agregaron 400 j l de amortiguador 1X PBS al vial de reacción, se enjuagaron y se transfirieron al filtro Amicon. Este lavado se repitió cuatro veces más con 400 j l de la solución amortiguador de PBS. Finalmente, se invirtió el filtro Amicon que contenía CRM197-maleim ida en el interior de un nuevo tubo de m icrocentrífuga Amicon (1.5 ml) y se centrifugó durante 1 minuto a 1000 RPM para recolectar ~ 130 j l de CRM197-maleim ida en tubos de m icrocentrífuga. Se agregaron 950 j l de solución de PBS (pH 7.4) y se almacenó el vial a 2-8° C (volumen total = ~ 1.08 mL). El conjugado CRM 197-maleim ida se analizó por MALDl, SDS-page, W estern blot, SEC-HPLC y estimación de la proteína por BCA. El conjugado CRM 197-maleim ida se analizó mediante MALDI y se encontró entre 21-24. La estimación de BCA también mostró la buena recuperación de la proteína. La página SDS mostró que el conjugado CRM-maleim ida 90 tenía un peso molecular más alto que el CRM 197 y estable. El W estern blot muestra que los anticuerpos anti-CRM de cabra reconocen el conjugado CRM 90 mientras que los anticuerpos anti-H ib de conejo no reconocieron el conjugado CRM-maleim ida 90 que estaba sin azúcar. La muestra se almacenó a 2-8° C hasta su uso posterior.
E jem p lo G-2. C o m pu es to 94 c o n ju g a d o de s a cá rid o - CRM197 - c is te ín a
[0355] La ruta sintética para el compuesto 94 se describe en la F igu ra 3.
[0356] M étodo DTT: El compuesto 29 (5 mg, 0.003 mmol) se disolvió en amortiguador PBS a pH 7.4 (5 ml) y se añadió DSP (ditiobis(propionato de succinim idilo)) (20 mg, 0.049 mmol) en DMSO (2.5 ml) a tem peratura ambiente durante la noche. Después de eso, se añadió ditiotreitol (DTT) (4 mg, 0.025 mmol) y la solución se agitó a 40° C durante 2h más. El compuesto 91 se purificó mediante cromatografía en columna Sephadex G-25 (4.5 mg, 88%). HRMS (ESI+) Calculado para C51H99NO46P4S [M+2Na+2K-4H]- 1736.2793, encontrado 1736.279.
[0357] P reparar e l t io l de l sacá rid o para la c o n ju g a c ió n : m é todo TCEP: se tomaron 100 j l de suspensión TCEP en un vial de 1.5 ml y se añadieron 300 jL de solución 1X PBS (pH 7.4). Se llevó a cabo centrifugación y la solución sobrenadante se eliminó. Y el lavado con PBS se repitió una vez más. Y finalmente, el residuo se recogió en 100 j l de solución de PBS y se añadió al disulfuro del azúcar 91. (1.38 mg, 0.292 jm o l) en amortiguador PBS (0.15 ml) en un vial de vidrio tipo I de 2 ml. Se agita suavem ente con un agitador orbital durante 1 hora a tem peratura ambiente. El RM se transfirió a un vial, y el vial de vidrio de la reacción se enjuagó con 200 j l de solución de PBS y se transfirió al vial. Se realizó una centrifugación, se recogió el sobrenadante (~ 325 j l ) de solución de PBS en un vial de vidrio tipo I de 2 ml. Se añadieron 200 j l de solución de PBS al residuo y se mezcló bien, se centrifugó, se recogió el sobrenadante y se transfirió de nuevo al vial de vidrio de tipo I de 2 ml. Así, el volumen total de la reducción del tiol 78 fue ~ 525 j l ~ 25 j l y se mantuvieron para el análisis.
[0358] P ro ce d im ie n to de co n ju g a c ió n : Se tom ó el CRM 197-maleim ida 90 en amortiguador 1X PBS (~ 850 j l ) en un vial de reacción a tem peratura ambiente equipado con una barra de agitación. El tiol del sacárido 92 en solución de PBS (~ 500 j l ) en amortiguador de 1X PBS se añadió a la solución de C R M ^-m a le im id a 90 gota a gota. El vial se enjuagó con 50 j l de solución de PBS y la solución se transfirió a la mezcla de reacción a temperatura ambiente. El RM fue una solución clara y se agitó a t.a. durante 20 h. [Se extrajo una parte alícuota de ~ 40 j l de la mezcla de reacción para fines de análisis]. Entonces la cisteína (0.14 mg) en amortiguador de fosfato (pH 7.4, 30 |jl) se añadió al RM que contiene 93 y se agitó durante una hora a temperatura ambiente.
[0359] Pasos de lavado : La mezcla de reacción que contiene 94 se transfirió al filtro Amicon (0.5 ml, MWCO 30KDa) y se centrifugó durante 3 minutos a 10000 RPM y se repitió el proceso hasta que se transfirió completa la mezcla de reacción y se centrifugó. Luego, se agregaron 400 j l de amortiguador 1X PBS al vial de reacción y se enjuagaron y la solución se transfirió al filtro Amicon. Este lavado se repitió cuatro veces más con 400 j l de la solución amortiguadora de PBS. Finalmente, el filtro que contiene el sacárido - CRM i 97-maleimida - cisteína 94 se invirtió en el interior de un nuevo tubo de microcentrífuga Amicon (1.5 ml) y se centrifugó durante 1 minuto a 1000 RPM para recolectar ~ 150 j l de sacárido - CRM i 97-maleimida - cisteína en un tubo de microcentrífuga. Se añadieron 200 j l de solución de PBS (pH 7.4) al filtro Amicon y se enjuaga bien y se transfiere la solución al tubo de microcentrífuga y se diluye la solución con 750 j l de solución de PBS (pH 7.4) y almacena el vial a 2-8° C (volumen total = ~ 1100 jl) . Una alícuota de 40 j l de conjugado 94 se lavaron con agua milliQ utilizando un filtro de Amicon y se analizaron con un MALDI (matriz de ácido sinapínico) y se obtuvo una carga de 3.4 a 4.2. El conjugado 94 se analizó más exitosamente usando SDS-Page, Western Blot y SEC-HPLC. La estimación de proteínas utilizando el método BCA mostró una buena recuperación de la proteína en el conjugado.
E jem p lo H. P ruebas de es tab ilidad .
E jem p lo H-1. E s tab ilidad de l p o lis a c á rid o c a p su la r de H ib en m ed io básico .
[0360] El estudio de estabilidad de los sacáridos de la invención son críticos para el desarrollo de vacunas líquidas estables de glicoconjugado de Hib. Como control, examinamos primero la estabilidad y la escisión del polisacárido capsular (CPS) poliribosilribitolfosfato de Hib. En consecuencia, el CPS de Hib se fragmentó utilizando procedimientos estándar como se describe enVaccine,2000 ,18,1982-1993: 1 mg de CPS de Hib en 0.43 ml de NaOH 0.1 M, 20 h. Los fragmentos obtenidos después de la purificación (filtrados a través de filtros Amicon de 30 kDa seguidos de desalinización) se analizaron por RMN 1H, HPLC y HRMS.
[0361] La f ig u ra 4A muestra el espectro de RMN 1H del CPS fragmentado del Hib y la F igu ra 4 B muestra el espectro de RMN 1H del CPS de Hib no tratado. La f ig u ra 5A muestra el cromatograma de HPLC del CPS fragmentado del Hib y la F igu ra 5B muestra el espectro de ESI del CPS de Hib tratado. Este conjunto de experimentos iniciales demostró que el CPS de Hib se escindió a sus fragmentos 2 y 3-O fosfato más pequeños en medio básico.
E jem p lo H - 2. E s tab ilidad de l P o lisa cá rid o c a p su la r de H ib en su sp e n s ió n de h id ró x id o de a lum in io .
[0362] Después de haber establecido los datos de estabilidad del CPS de Hib de control, entonces se investigó la estabilidad del CPS de Hib en hidróxido de aluminio, donde se sabe que es inestable en una formulación de vacuna {0.5 mg de CPS de Hib, 3 ml de Alhydrogel® (Brentag) y 22 ml de agua mili-Q} a varias temperaturas {37° C (A1) y ta (A3)}. A 37° C se observaron escisiones a los fragmentos más pequeños después de 2 días y a ta se observó este patrón después del día 7 (F igu ra 6 ). A partir de este experimento, se confirmó que, el CPS de Hib se descompone en fragmentos 2 y 3-O fosfato en 2 a 7 días, dependiendo de la temperatura en hidróxido de aluminio, el adyuvante más común que se usa en las vacunas comerciales. E jem p lo H-3. E s tab ilidad de l c o m p u e s to 16
[0363] Los estudios de estabilidad del dímero 2'metoxiribosilribitolfosfato 16 sintetizado se llevaron a cabo en presencia de diferentes adyuvantes. Como primer paso la estabilidad de 16 se estudió utilizando Al (OH)3, AlPO4y agua a varias tem peraturas {37° C (A1), 2-8° C (A2), tem peratura ambiente (A3) y 70° C (A4)}.
[0364] El monte de A l(OH)3, y A lPO 4 utilizado para este estudio fue sim ilar a la cantidad presente en las vacunas contra Hib comerciales. El análisis de muestras a diferentes tem peraturas utilizando HPLC después de una semana se muestran en las F igu ras 7-10. Los compuestos 16 y 8 se usaron como referencia ya que la descomposición del dímero 16 debería llevar al monómero 8. Cada 24 h 40 |jl de solución se dividió en alícuotas de cada vial y se centrifugó durante 4 m inutos a 5000 rpm. Se tom ó sobrenadante (25 j l ) para el análisis de HPLC. Incluso después de 7 días, no se observó descomposición. De este estudio quedó claro que el dímero 2'metoxiribosilribitolfosfato 16 se mantuvo estable a 37° C (A1), 2-8° C (A2), t.a. (A3) y a 70° C.
[0365] La estabilidad del dímero 16 se investigó adicionalmente en condiciones básicas acuosas como se aplica en el E jem p lo H-1. A partir del cromatograma de HPLC en la F igu ra 13D se concluyó que el dímero 16 se escindió completamente después de 4 días, mientras que el CPS natural de Hib se escindió completamente dentro de las 20 horas. Esto dem uestra que los oligómeros de 2-m etoxiribosilrib itolfosfato son muy estables incluso en condiciones básicas extremas en comparación con el CPS natural de Hib.
E jem p lo H-4. E s tab ilidad de l c o m p u e s to 29
[0366] Se llevaron a cabo estudios de estabilidad de tetrám ero de 2-m etoxiribosilrib itolfosfato sintetizado que llevaba un conector 29 en presencia de diversos adyuvantes. Como primer paso se estudió la estabilidad de 29 utilizando Al(OH)3, amortiguador de fosfato (PBS) y agua a varias tem peraturas {2-8° C (A2), y ta (A3)}.
[0367] La cantidad de Al(OH)3 utilizado para este estudio fue sim ilar a la cantidad presente en las vacunas contra Hib comerciales. El análisis de muestras a diferentes tem peraturas utilizando HPLC después de una semana se muestran en las F igu ras 11 y 12. Los compuestos 29, 16 y 8 se usaron como referencia ya que la descomposición del tetrámero 29 debe llevar al dímero 16 y al monómero 8. Cada 24 h 40 j l de solución se dividió en alícuotas de cada vial y se centrifugó durante 4 minutos a 5000 rpm. Se tom ó sobrenadante (25 j l ) para el análisis de HPLC. Incluso después de 7 días, no se observó descomposición. De este estudio quedó claro que el tetrám ero de 2-m etoxiribosilrib itolfosfato 29 es estable en presencia de A l(O H)3, en amortiguador de fosfato (PBS) y an agua a 2-8° C (A2) y t.a. (A3).
[0368] La estabilidad del tetrám ero 29 se investigó adicionalmente en condiciones básicas acuosas como se aplicó en el E jem p lo H-1. A partir del cromatograma de HPLC en la F igu ra 13A, se concluyó que el tetrám ero 29 se escindió completamente después de 4 días, m ientras que el CPS natural de Hib se escindió completamente dentro de las 20 horas. Esto demuestra que los oligómeros de 2-m etoxiribosilrib itolfosfato son muy estables incluso en condiciones básicas extremas en comparación con el CPS natural de Hib.
E jem p lo H-5. E s tab ilidad de co n ju g a d o 94 en p resenc ia de a m o rtig u a d o r de fo s fa to
[0369] ~ 5 jg del compuesto 94 en dos viales se diluyeron cada uno a 500 j l de PBS a pH 7.4; un vial se almacenó a 25° C y otro a 2-8° C. Las muestras se analizaron mediante un ensayo de ácido bicinconínico (BCA) y HPLC-SEC (columna: TSKgel G2000SWxl, amortiguador: Tris 50 mM, NaCl 20 mM, pH 7.2) después de un día y después de 15 días. Los datos mostraron que aún después de 15 días, el conjugado 94 estaba presente y estable en ambas condiciones de tem peratura 25° C y 2 - 8° C.
E jem p lo H-6. E s tab ilidad de l c o m p u e s to 94 en p resenc ia de h id ró x id o de a lu m in io
[0370] Dos via les que contienen ~ 5 jg de compuesto 94 y A lhydrogel® (0.125 mg/dosis) se llenaron cada uno hasta 500 j l de PBS a pH 74; un vial se almacenó a 25° C y otro a 2-8° C. Las muestras se analizaron mediante un ensayo de ácido bicinconínico (BCA), HPLC-SEC (columna: TSKgel G2000SWxl, amortiguador: Tris 50 mM, NaCl 20 mM, pH 7.2), SDS-page y W estern Blot después de un día y después de una semana. Los datos mostraron que ~ 75% del conjugado 94 se adsorbió en A lhydrogel® y el conjugado adsorbido fue estable en ambas condiciones de temperatura. No se observaron productos de degradación durante este curso de tiempo.
T ab la 1: ensayo de BCA del conjugado 94 en presencia de amortiguador de fosfato e hidróxido de aluminio.
E jem p lo I. A n á lis is de m atriz de G licano .
E jem p lo I-1. Inm un iza c ión en C one jos
[0371] Se realizaron experimentos de inmunización en conejos (Chong et al. Infect. Immun., 1997, p. 4918-4925; Fernández-Santana et al. Science, 2004, 305 (5683), pág. 522-525). Los conejos fueron alojados y manejados de acuerdo con las regulaciones internacionales de animales (Directiva de la UE 2010/63/UE) y sancionados por las autoridades gubernamentales (Oficina Estatal de Agricultura, Seguridad Alim entaria y Pesca Mecklenburg-Vorpommern).
[0372] Cuatro grupos con cuatro conejos por cada grupo se inmunizaron en un régimen de refuerzo con conjugado sin adyuvante 94 que contenía 5 |jg de sacárido 29 o conjugado 94 (conteniendo 5 |jg de sacárido 29 de Hib) con adyuvante Alhydrogel. El grupo de control negativo recibió sólamente PBS / Alhydrogel. El grupo de control positivo recibió la vacuna aprobada ActH lB® (5 jg de PRP, correspondiente a la mitad de la dosis humana, un conjugado de PRP nativo para toxoide tetánico (TT). Se tomaron y analizaron en una matriz de glicano suero preinmune y antisuero del sangrado del día 21 (siguiendo dos inmunizaciones). El suero específico de ActH lB se obtuvo después de tres administraciones en contraste a dos inm unizaciones de los análogos de HIB de la presente invención.
E jem p lo I-2. A n á lis is de m a triz de g lic a n o
[0373] Los sacáridos en PBS se imprimieron en portaobjetos de vidrio activados con N-hidroxi succinim ida (portaobjetos CodeLink, Surmodics) utilizando un detector de micromaarreglos S3 (Scienion). Los portaobjetos se incubaron durante la noche en una cámara saturada de humedad, se inactivaron durante 2 h con etanolam ina 100 mM, fosfato sódico 50 mM, pH 7.5, se lavaron con agua y se secaron.
[0374] Para la incubación, los portaobjetos se bloquearon durante 1 h con BSA-PBS al 3% (p/v), se lavaron con PBS y agua y se secaron por centrifugación. Se adjuntó una rejilla de incubación de 64 pozos. Los sueros se diluyeron en BSA-PBS al 3%, Tween-20 al 0.1% (v/v), se incubaron a 37° C durante 15 min y se centrifugaron durante 2 min a 3220 rpm. Se aplicaron diluciones de suero al portaobjetos y se incubaron durante 1 hora a tem peratura ambiente. Los pocillos se lavaron tres veces con PBS Tween-20 al 0.1% (PBS-T). Los anticuerpos secundarios (anti-IgG de conejo FITC, IgM anti-conejo A lexaFluor 647, anti-IgG-Fc de humano AlexaFluor 488 y A lexaFluor 594 IgM) se incubaron en los portaobjetos durante 30 minutos a tem peratura ambiente. Los pocillos se lavaron dos veces con PBS-T, la rejilla de incubación se eliminó, y el portaobjetos se lavó con PBS y agua. Después de secar por centrifugación, el portaobjetos se exploró utilizando un lector de m icroarreglos GenePix 4300A (M olecular Devices).
[0375] La respuesta primaria inmune se evaluó mediante el cribado de la matriz de glicano de la muestra de suero recuperadas el día 0, el día 21 y el día 35. El dímero 2'-metoxiribosilribitolfosfato 19, el dímero 2'-m etoxiribosilribitolfosfato 24, el tetrámero 2'-m etoxiribosilribitolfosfato 29, del tetram ero 2'-desoxiribosilribitolfosfato 53 y el 2'-dimetil am inocarbonilribosilribitolfosfato 62, así como el PRP natural de Hib, se imprimieron en portaobjetos de m icroarreglos activados con éster de NHS. Después de la inmunización con el conjugado 94 con adyuvante Alhydrogel y sin adyuvante, fueron detectados los anticuerpos de los subtipos IgG e IgM contra los derivados de PRP de Hib 19, 24, 29, 53 y 62, así como contra el polisacárido PRP natural de Hib en todos los conejos inmunizados.
[0376] El cribado de la matriz de glicano también mostró que los anticuerpos anti-H ib presentes en el suero de referencia humano (F igu ra 17A) y en el suero de tipificación de conejo (F igu ra 17B) se unen a los derivados de PRP de Hib 19, 24, 29, 53 y 62. La presencia de PRP natural de Hib inhibe la unión de los derivados de PRP de Hib 19, 24, 29 y 62, pero no de 2'-desoxiribosilribitolfosfato 53.
[0377] Los anticuerpos IgG del suero se detectaron 21 días después de la primera inmunización con el conjugado 94 con adyuvante Alhydrogel y 35 días después de la primera inmunización con el conjugado 94 sin adyuvante. Los anticuerpos de reacción cruzada con el polisacárido PRP natural de Hib indican el potencial de estos anticuerpos para unirse a bacterias deHaemophilus influenzaey para conferir protección contra la infección porHaemophilus influenzae.
E jem p lo J. E s tu d io s ELISA
[0378]
• Placas de ELISA (alta unión, placa EIA / RIA, 96 pozos, fondo plano con tapa de baja evaporación, compañía: costar® 3361)
• kit de montaje de ELISA IgG de conejo anti-Hib-PRP (Alpha Diagnostic Intl. Inc, #980-130-PRG; Lote: 170531K5, Caducidad: 06/2018)
• antígeno: Polisacárido capsular de fosforibosilfosfato (PRP) deHaemophilius influenzab (NIBSC, Código: 12/306) • suero de prueba: proporcionado por BioGenes GmbH.
• detección de anticuerpo: conjugado anti-IgG de conejo - peroxidasa de cabra (Sigma, #A 4914).
• Solución salina amortiguada con fosfato (PBS): fabricada internamente desde el stock (Biochrom GmbH, Cat: L182-10)
• solución de bloqueo: FCS al 1% (v/v) en PBS.
• diluyente de anticuerpo: PBS BSA al 1% (w/v).
• am ortiguador de lavado: PBS Tween 20 al 0.1% (PBS-T)
• solución de desarrollo: desarrollado de 1 step™ Ultra TMB-ELISA. (ThermoScientific, número de catálogo: 34028) • solución de parada - ácido sulfúrico 2M (H2SO4) (fabricada internamente)
• lector de placa: Anthos ht 2.
software: W inRead 2.36 para mediciones de absorbancia y GraphPad Prism 7 para graficas de datos y análisis.
E jem p lo J -1. Esquem a de in m un izac ión y reco le cc ió n de sueros.
[0379] Todos los experimentos de inmunización se realizaron en BioGenes GmbH Berlín. Los grupos experimentales incluyeron i) PBS con Alhydrogel (control negativo), ii) compuesto 94 sin Alhydrogel, iii) compuesto 94 con Alhydrogel, y iv) la vacuna comercial Hiberix ® (control positivo). Brevemente, los conejos (n = 4) se inmunizaron en un régimen de refuerzo primario con las construcciones para los respectivos grupos experimentales como se indica en la Tabla 1. Los ratones se inmunizaron siguiendo un régimen de refuerzo primario y los sueros se recogieron el día 0 (preinmune), el día 14, el día 21 y el día 35.
T l 2. Pr r m inm niz i n inf rm i n i n í n n n=4 .
R eco lecc ión de S ue ro y M anejo:
[0380] Los sueros de diferentes grupos experimentales y puntos de tiempo respectivos se almacenaron a -20° C. Se agruparon los sueros de conejos individuales (20 |jl) de grupos experimentales específicos y se almacenaron a -20° C. Los sueros de conejo individuales (20 j l ) se dividieron en partes alícuotas como un stock separado y se almacenaron a -20° C hasta su uso posterior.
E jem p lo J-2. E nsayo de in m u n o a d so rc ió n ligada a enz im as (ELISA) de sue ro s qu e u tilizan p lacas recu b ie rtas con a n tíg eno fa b ric a d o in te rnam en te
R e cub rim ie n to de p lacas con an tígeno :
[0381] El antígeno, polisacárido capsular PRP de Hib (concentración del s tock 1 mg/ml) se diluyó a una concentración de antígeno de trabajo 10 mg/ml en PBS a pH 7.4. Se agregaron 100 j l en cada pocillo (1 jg de antígeno/pocillo) y se incubaron durante la noche a 4° C.
Lavado:
[0382] Después de la adsorción del antígeno durante la noche, las placas se lavaron 3 veces con PBS-T (200 |jl/pociMo) y el exceso de líquido por pocillo se elim inó invirtiendo la placa y golpeando suavem ente sobre una toalla de tejido limpio y seco. B loqueo:
[0383] Las placas se bloquearon utilizando 300 j l de solución de bloqueo (PBS FCS al 1%) durante 2 horas a tem peratura ambiente.
Lavado:
[0384] Después del bloqueo, las placas se lavaron 3X con PBS-T (200 jl/poc illo ) y se elim inó el exceso de fluido por pocillo invirtiendo la placa y golpeando suavem ente sobre una toalla de tejido limpio y seco.
D ilu c ió n de S ue ros e Incubac iones :
[0385] La agrupación (n = 4 conejos / grupo) de sueros pre-inmune y de ensayo de los diferentes grupos experimentales y los sueros de prueba de conejo individual (n = 4) se diluyeron a las diluciones respectivas, en el diluyente de anticuerpo (PBS BS A a l 1%). 100 j l de las muestras de suero diluidas de los diferentes grupos experimentales (100 se añadieron en duplicados a los pocillos correspondientes y se incubaron en un agitador ajustado a 250 rpm durante 1 h a t.a. 100 j l / pocillo del diluyente de anticuerpo (PBS BSA al 1%) form ó el blanco experimental. Después de la incubación con sueros, las placas se lavaron 5 veces con PBS-T (200 jl/p oc illo ) y el exceso de líquido por pocillo se elim inó invirtiendo la placa y golpeando suavemente sobre una toalla de tejido limpio y seco.
In cu bac ión (de tecc ión de a n ticue rpos ):
[0386] El anticuerpo de detección, anti-IgG de conejo-peroxidasa en cabra se diluyó 1:10.000 en el diluyente de anticuerpo (PBS BSA al 1%) y se añadieron 100 j l al pocillo y se incubaron en un agitador a 250 rpm durante 1 h a t.a. Después de la incubación con el anticuerpo de detección, las placas se lavaron 5X con PBS-T (200 j l / pocillo) y se elim inó el exceso de fluido por pocillo invirtiendo la placa y golpeando suavemente sobre una toalla de tejido limpio y seco.
D esarro llo :
[0387] A cada pocillo, se agregaron 100 j l de sustrato TMB listo para usar (normalizado a la form a de t.a. a 4° C) y se incubaron en la oscuridad durante 15 min. El color azul de la reacción enzimática se detuvo mediante la adición de 100 j l / pocillo de solución de H2SO42M resultante en una solución de color amarillo. La absorción de la solución de color amarillo se midió a 450 nm con una longitud de onda de corrección de 630 nm utilizando un lector de placas. Los valores de absorción se analizaron trazando un gráfico utilizando el software Graphpad Prism.
R esu ltados:
[0388] Como se ve en la F igu ra 18A, los sueros preinmunes de todos los grupos experimentales a través de todas las diluciones no mostraron ninguna respuesta significativa y las lecturas fueron iguales a 0. En los sueros postinmunes / de prueba, el grupo HiberiX del día 14 (triángulos invertidos) mostró una respuesta inmunitaria considerablemente mayor que el grupo de control de PBS (círculos rellenos) que aumentó hasta títulos de 1:2500 en los grupos de día 21 y día 35 (F igu ras 18B - D). En los grupos experimentales inmunizados con el compuesto 94 con adyuvante (triángulos), los títulos de anticuerpos fueron más bajo que el del grupo de PBS en el día-14 que aumentó sustancia lm ente a la del grupo HiberiX a un títu lo de 1:25000, pero 1 veces menor. Aunque el grupo experimental inmunizado con el compuesto 94 sin adyuvante (cuadrados) mostró títulos inmunes comparables al grupo H iberiX en el día 14, no se observó una respuesta de refuerzo en el momento del día 21 punto en el que el grupo con adyuvante mostró una respuesta de refuerzo. Sin embargo, después del segundo refuerzo, el compuesto 94 con adyuvante mostró un título inmune comparable al grupo con adyuvante, pero menor que la del grupo HiberiX.
E jem p lo J-3. E nsayo de in m u n o a d so rc ió n ligada a enz im as (ELISA) de sue ros u tiliza n d o p lacas com e rc ia les de A D i [0389] El kit ELISA de IgG de conejo anti-Hib-PRP (ADi) detecta anticuerpos IgG específicos de Hib-PRP en los sueros de animales vacunados. El kit incluye una placa de m icrotitulación de 96 pocillos previamente recubierta con el antígeno de polisacárido de Hib-PRP, suministrado con los amortiguadores de lavado y el anticuerpo de detección conjugado con peróxido. El kit también incluye un conjunto de calibradores (0.5, 1.0, 2.5, y 5.0 U/mL) y un control positivo/sueros de referencia. Los calibradores proporcionaron un control de los parámetros de ensayo internos y diferencia los falsos positivos en una dilución de sueros de 1:50 y anteriores. El valor de 0.5 U/ml se convierte en el título detectable más bajo por debajo del cual los valores de las pruebas serían un falso positivo. El ensayo se realizó en un form ato ELISA normal siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, los sueros que se analizaron se diluyeron a un rango de dilución apropiado de 1:100 y superior en el diluyente proporcionado en el kit. Se añadieron 100 j l de los sueros diluidos junto con el calibrador, control positivo y negativo a los pocilios predeterm inados y se incubaron durante 1 hora a tem peratura ambiente. Los pocilios se lavaron entonces 4 veces con el kit de amortiguador de lavado y 100 |jl del anticuerpo de detección se añade y se incuban adicionalmente durante 30 min seguido de 5 lavados. Los pocillos se desarrollaron mediante la adición de 100 j l de sustrato TMB y la incubación durante 15 min seguido de la detención de la reacción utilizando 100 j l de la solución de parada dando como resultado una solución de color amarillo. La absorción de la solución de color amarillo se midió a 450 nm con una longitud de onda de corrección de 630 nm utilizando un lector de microplacas. Los valores de absorción se analizaron trazando un gráfico utilizando el software Graphpad Prism.
R esu ltados:
[0390] El polisacárido Hib-PRP (antígeno) es muy sensible a la hidrólisis debido a las diferencias de pH y otros factores fisicoquím icos que pueden conducir a una menor detección de antígeno en un ELISA. Para corroborar los títu los inmunes observados en las F igu ras 18B - D y para descartar las anomalías que surgen debido al recubrimiento del antígeno hecho de manera interior, los sueros de conejo se cribaron en una placa de diagnóstico comercial (Advanced Diagnostics-adi) prerecubiertos con el polisacárido de Hib-PRP. Como se describe en el E jem p lo J-2, los sueros inmunizados de conejo de los diferentes grupos experimentales y puntos de tiem po se diluyeron 5 veces (1:100, 500, 2500 y 12500) y se analizaron para detectar anticuerpos IgG específicos de polisacáridos. Como se ve en la F igu ra 19A, los sueros preinmunes de todos los grupos experimentales a través de todas las diluciones no mostraron ninguna respuesta significativa y las lecturas estuvieron por debajo del valor umbral. El umbral se refiere al valor de absorción obtenido para la corrida del calibrador de 0.5 U/mL en la misma placa, valores por debajo de los cuales se pueden asignar como negativos o falsos positivos.
[0391] En los sueros postinmunes / de prueba, el grupo HiberiX del día 14 (triángulos invertidos), compuesto 94 con (triángulos) y sin (cuadrados) A lhydrogel mostró un título inm unitario inferior al valor del umbral incluso a la dilución más alta de 1:100 (F igu ra 19B). Sin embargo, el grupo de control de PBS (círculos rellenos) mostró una señal más alta que el valor del umbral en la dilución más alta de 1:100 solo en el punto de tiem po del día 14, pero fue más bajo que el umbral en todos los otros puntos de tiempo del día - 21, y - 35. Esta fue una tendencia sim ilar observada en las placas de antígeno recubiertas que se tienen al interior (F igu ra 18B - D). El compuesto 94 con adyuvante (triángulos) y el grupo HiberiX (triángulos invertidos) en los puntos de tiempo del día 21 y 35 mostraron una saturación hasta diluciones de 1:500 y 1:2500, respectivamente. El efecto de la respuesta adyuvante y de refuerzo era claramente visible en el compuesto 94 con el grupo Alhydrogel ya que los títulos aumentan significativam ente a partir de 1:2500 en el punto de tiem po del día 21 hasta 1:12500 en el punto de tiempo del día 35. Claramente en el día 35, el grupo inmunizado con el compuesto 94 con adyuvante mostró una respuesta com parable a H iberiX pero por 1 vez menor. Sin embargo, en el grupo inmunizado con el compuesto 94 sin adyuvante, no había títulos de IgG detectable hasta el día 21, pero aumentó significativamente hasta 1:2500 después del segundo refuerzo. Esta tendencia fue s im ilar a la observada en ELISA realizada con placas recubiertas con antígeno que se tienen al interior (propias) (F igu ra 18 C, D).
[0392] Estos datos demuestran la inmunogenicidad de conjugado 94. El cambio de isotipo indica respuestas de anticuerpos dependientes de células T. Los anticuerpos IgG séricos fueron detectables 21 días después de la primera inmunización con el conjugado 94 con adyuvante con Alhydrogel y 35 días después de la primera inmunización con el conjugado 94 sin adyuvante. Los anticuerpos de reacción cruzada con el polisacárido PRP natural de Hib indican el potencial de estos anticuerpos para unirse a bacterias deHaemophilus influenzaey para conferir protección contra infecciones porHaemophilus influenzae.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un sacárido de fórmula general (I)
    T 1 y T2 representan -H , -L -N H 2; en donde si T 1 es -L -N H 2, entonces T 2 es -H y si T 1 es -H , entonces T2 es -L -N H 2; X i, X2, X 3, X4, X5, y X6 representan — OCH3; n es un número entero seleccionado de 1, 2, 3, o 4; n i, n2, n3 y n4 se seleccionan independientemente entre sí de 0 y 1 y n1+n2+n3+n4 s 1; con la condición de que si n i+ n 2 n 3 n 4 = 1 y si n = 1 y si A es 9 que ? — o O '
    y c
    L es un conector y L se selecciona de: - L a- , - L a- L e- , - L a- L b- L e- , - L a- L d- L e- , en donde - L a- se selecciona de: - (C H 2)o-, - (C H 2-C H 2-O )o -C 2H4- , - (C H 2-C H 2-O )o -C H 2 - L b- representa -O - , o -O P (O )(O H )-O -; - L d- se selecciona de - (C H 2)q-, - (C F 2)q-, - (C H 2-C H 2-O )q -C 2H4- , y - (C H 2-C H 2-O )q -C H 2- ; - L e- se selecciona de: - (C H 2)p i-, - (C F 2)pi-, - C 2H4- (O -C H 2-C H 2)p1- , -C H 2- (O -C H 2-C H 2)p i- y -(C H 2)p1-O -(C H 2)p2- ; y o, q, p1 y p2 son independientemente entre sí un número entero seleccionado de 1, 2, 3, 4, 5, y 6 ; o enantiómeros, diastereómeros, mezclas de enantiómeros, mezclas de diastereómeros, anómeros, hidratos, solvatos de los compuestos mencionados anteriormente y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. 2. El sacárido de la fórmula (II-1) de conformidad con la reivindicación 1,
    B, C, D, E, L, n1, n2, n3 y n4 los significados definidos de conformidad con la reivindicación 1; n es 1 o 2 ; y X2 - X6 son -O C H 3. 3. El sacárido de formula (II-2) de conformidad con la reivindicación 1,
    en donde F es -O- B, C, D, E, L, n1, n2, n3 y n4 tienen los significados definidos de conformidad con la reivindicación 1 ; n es 1 o 2 ; y X i - X5 son -O C H 3. 4. El sacárido de formula (III-1) de conformidad con la reivindicación 1,
    en donde L tiene el significado definido de conformidad con la reivindicación 1; m es un número entero seleccionado de 1 a 9; y Xa es -O C H 3.
    en donde m es un número entero seleccionado de 1 a 9; y Xa es -O C H 3. 6. El sacárido de conformidad con la reivindicación 1, en donde se selecciona del grupo que consiste en:
    7. El sacárido de la fórmula general (I) de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 conjugado con un portador inmunogénico a través del átomo de nitrógeno del grupo-O-L-NH2. 8. El sacárido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 7 para su uso como agente farmacéuticamente activo en medicina. 9. El sacárido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8 para su uso en la generación de una respuesta inmune protectora en un huesped animal y/o humano. 10. El sacárido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 9 para su uso en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades asociadas conHaemophilus influenzaetipo b. 11. Una composición de vacuna que comprende un sacárido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes junto con al menos un adyuvante, portador, crioprotector, lioprotector, excipiente y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. 12. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 11 para su uso en la inmunización contra enfermedades asociadas conHaemophilus influenzaetipo b. 13. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 11, que comprende además al menos antígeno de difteria, antígeno tetánico, antígeno de pertussis, antígeno de hepatitis B, vacuna de polio inactivada y vacuna de rotavirus inactivada. 14. El sacárido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -6para su uso como marcador en ensayos inmunológicos para el diagnóstico de enfermedades causadas porHaemophilus influenzaetipo b. 15. Un compuesto intermedio para la síntesis del sacárido de la fórmula (I) seleccionado del grupo que consiste de: A1*-2 , A1*-3 , A1*-4 , A1*-5 , A 1*-5 ', A 1*-5 '', A1*-6 , A1*-7 , A 1*-8 , B1*-1, B1*-2, B1*-3, B1*-4, B1*-5, B1*-6, C1*-2, C1*-3, C1*-3', C1*-3'', A2*-1 , A2*-2 , A2*-3 , A2*-4 , B2*-1, B2*-2, B2*-3, B2*-4 , C2*-1, C2*-2, C2*-3, C2*-4, A 2*-1 ', A 2*-2 ', A 2*-3 ', A 2*-4 ', A 2*-2", A2*-3", A 2*-4", B2*-1 ', B 2 M " , B 2 M " , B2*-2', B2*-3 ', B 2 *-3 " , B2*-3 " , B2*-4 ', B2*-4", C2*-1 ',C2*-2 ', C2*-3' y C2*-4 ': A 1*-2 A1*-3 A1*-4
    B2*-3' B2*-4' p' <
    en donde P1, P2, P3, P4, y P5 representan grupos protectores que cuando se enlazan a - O - no son idénticos a X ¡ y X¡; X ¡ y Xj representan -OCH3 L tiene el significado definido en la reivindicación 1; M+ representa Na+, K+, NH4+, o HNEt3+, y en donde los grupos protectores P1, P2, P3, P4, y P5 se seleccionan independientemente de acetilo, bencilo, benzoílo, pmetoxibencilo, p-metoxifenilo, para-bromobencilo, o-nitrofenilo, p-nitrofenilo, alilo, metilo, isopropilo, levulinilo, dimetoxitritilo (DMTr), tritilo, 2-naftilmetil (Nap), pivaloilo, triisopropilsililo, terc-butildimetilsililo, terc-butildifenilsililo, terc-butilmetoxifenilsililo, trietilsililo, trimetilsililo, y 2-trimetilsililetoximetilo.
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