ES3020807T3 - Veterinary composition of marine algae and andrographis sp extracts, which can be used to treat infections in fish - Google Patents

Abstract

Composición veterinaria que comprende un extracto de algas marinas con un contenido de al menos 5% de fucoidianos y un extracto de planta Andrographis sp con un contenido de al menos 5% de andrografolidos, la que es útil en el control y prevención de infecciones producidas por microorganismos intracelulares en peces.

Description

DESCRIPCIÓN

Composición veterinaria de algas marinas y extractos de andrographis sp, que pueden utilizarse para tratar infecciones en peces

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invención se refiere a una composición veterinaria que comprende un extracto de algas marinas con un contenido de al menos 5% de fucoidianos y un extracto de plantaAndrographis spcon un contenido de al menos 5% de andrografolidos, la que es útil en el control y prevención de infecciones producidas por microorganismos intracelulares en peces.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Es sabido que el ambiente acuático en que se hacen crecer o cultivan peces, propicia el surgimiento de enfermedades. Se han tomado muchas medidas para tratar de controlar o prevenir tales enfermedades, y hasta ahora la vacunación, es una de las herramientas más usadas para el control de enfermedades bacterianas en peces. Esto porque las vacunas muestran una serie de ventajas que van desde su buena efectividad en prevenir y corregir infecciones a su bajo impacto en el ambiente y en la salud pública, permitiendo la obtención de un producto limpio. Lo que en general, no sucede con los antibióticos, pudiéndose mencionar entre sus efectos adversos: desarrollo de resistencia bacteriana; acumulación del antibiótico en el músculo del pez; contaminación de ambientes acuáticos entre otros.

Sin embargo, la vacunación cuenta entre sus desventajas que requiere de una gran manipulación de los peces, por lo que su práctica requiere de cuidado para no estresar a los peces y hacer poco efectiva la vacunación o provocar mortalidad, a su vez se pueden presentar efectos adversos tales como la presentación de adherencias que pueden llevar a mortalidades y disminución de las tasas de crecimiento de los peces.

En general, las enfermedades se potencian bajo condiciones de estrés, y ciertamente, en los sistemas de producción intensiva usados para el cultivo de peces, tales condiciones, se encuentran claramente presentes. No hay que olvidar que la acuicultura es el sector de mayor crecimiento en la producción de alimento, situándose como una de las principales actividades económicas de este siglo y con importantes proyecciones de transformarse en la principal fuente de proteína animal para consumo humano según señalan los últimos informes de la FAO.

Las pérdidas de producción son cuantiosas y los daños devastadores, en los sistemas productivos intensivos, cuando las enfermedades surgen.

Por otra parte, es sabido que no existen vacunas eficientes en la prevención de algunos patógenos intracelulares relevantes, tal es el caso dePisciricketssia salmonis, SAV virus, Francisella noatunensis, Renibacterium salmoninarum,IPNv, en etapas tempranas, previo a la vacunación inyectable. Lo anterior, debido a la naturaleza intracelular de los patógenos, la que requiere de la activación de una respuesta inmune de tipo Th1, activando mayoritariamente linfocitos T citotóxicos, los que se encargan de destruir las células infectadas. La combinación de moléculas bioactivas formada por Fucoidianos Andrografolidos, gatilla la producción por parte de los macrófagos de citokinas como la IL-12 e IFN, los que promueven la diferenciación de linfocitos Th0 a Th1, está particularidad en su mecanismo de acción, transforma a la combinación en una herramienta nueva para la prevención y control de patógenos intracelulares en peces salmonideos.

Las enfermedades provocan en los peces, síntomas tales como erosiones, verrugas, erupciones o manchas en la piel, deshilachamiento de aletas, inflamación de abdomen, nado errático, hemorragias, lesiones y úlceras en páncreas, esófago y estómago, espasmos musculares y ascitis, entre otros.

Entre los microorganismos intracelulares obligados para peces, se encuentran: piscirickettsias; virus tales como el virus de la septicemia hemorrágica viral (VHS), virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNv); virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV), Alphavirus del salmón (SAV), Anemia infecciosa del salmón (ISAv) y bacterias tales comoFrancicella spyRenibacterium salmoninarum.

Dentro de las enfermedades causadas por estos patógenos, de importancia en cultivos acuícolas es posible mencionar piscirickettsiosis, septicemia hemorrágica viral, necrosis pancreática infecciosa, necrosis hematopoyética infecciosa, enfermedad del páncreas y sleeping disease, anemia infecciosa del salmón, francicellosis y renibacteriosis.

En particular, a partir de 1989, en el sur de Chile, se detectó una enfermedad con altas mortalidades en salmones, denominada “Síndrome del salmón coho”, “Síndrome de Huito” o piscirickettsiosis (Larenas, J.J.; P.A. Smith; L.H. Garcés; C. Lannan; J.L. Fryer. (1994). Piscirickettsiosis of Atlantic salmón (Salmo salar)and coho salmón (Oncorhynchus kisutch)inoculated withP. salmonis.International Symposium on Aquatic Animal Health. Seattle, Washington, USA) y que afectó a diversas especies de salmonídeos. Inicialmente, se describió sólo en salmón coho, pero pronto afectó todas las especies salmonídeas cultivadas en Chile, llegando a producir hasta un 90% de mortalidad en algunos centros (Branson E.J., Nieto Díaz-Muñoz D. (1991). Description of a new disease condition occurring in farmed coho salmon, Oncorhynchus kisutch (Walbaum), in South America. J Fish Dis; 14: 147-156. Cvitanich J.D., Garate O.N., Smith C.E. (1991). The isolation of rickettsia-like organism causing disease and mortality in Chilean salmonids and its confirmation by Koch’s postúlate. J Fish Dis; 14: 121-145). La enfermedad se describió principalmente en agua de mar y estuarina (Fryer J.L., Lannan C.N., Garcés H.L., Larenas J.J., Smith P.A. (1990) Isolation of a rickettsiales-like organism from diseased coho salmon (Oncorhynchus kisutch) in Chile. Fish Pathol; 25: 107-114. Branson E.J., Nieto Díaz-Muñoz D. (1991). Description of a new disease condition occurring in farmed coho salmon, Oncorhynchus kisutch (Walbaum), in South America. Journal Fish Disease; 14: 147-156; Cvitanich J.D., Garate O.N., Smith C.E. (1991). The isolation of rickettsia-like organism causing disease and ortality in Chilean salmonids and its confirmation by Koch’s postúlate. Journal Fish Disease; 14: 121-145) y muy ocasionalmente en agua dulce (Gaggero A., Castro H., Sandino A.M. (1995). First isolation ofPiscirickettsia salmonisfrom coho salmón,Oncorhynchus kisutch(Walbaum), and rainbow trout,Oncorhynchus mykiss(Walbaum), during the freshwater stage of their life cycle. J Fish Dis; 18: 277-279.).

El agente etiológico correspondía a la primera rickettsia aislada y caracterizada desde animales acuáticos y se denominóPiscirickettsia salmonis (P. salmonis).Este patógeno es un parásito intracelular obligado, citopático para diferentes líneas celulares de salmones y algunas de peces de aguas cálidas. Es Gram negativo, pleomórfico, habitualmente cocoide, en pares o en forma de anillo y de un tamaño entre 0,5 -1,5 |jm de diámetro (Fryer J.L., Lannan C.N., Garcés H.L., Larenas J.J., Smith P.A. (1990) Isolation of a rickettsiales-like organism from diseased coho salmon(Oncorhynchus kisutch)in Chile. Fish Pathol; 25: 107-114).

Los signos clínicos de la piscirickettsiosis se caracterizan por nadar en la superficie, de forma lenta, errática y a veces en tirabuzón. Además se ha descrito letargia, anorexia, choque contra las paredes de la balsa jaula, orillamiento y oscurecimiento. Las lesiones macroscópicas externas más relevantes que se describen, incluyen: descamación, palidez branquial, hemorragias equimóticas y petequiales en la base de las aletas, nódulos y úlceras en la piel de hasta 2 cm de diámetro (Bravo, S.; Campos, M. (1989) Síndrome del Salmón Coho.Chile Pesquero54: 47-48; Cubillos V.; Farías, C.; Alberdi, A.; Alvarado, V.; Schafer, W.; Monrás, M. (1990) Características anatomopatológicas del síndrome del salmón coho (S.S.C.), nueva enfermedad de los salmonídeos.Patología Animal4: 14-17; Cvitanich J.D., Garate O.N., Smith C.E. (1991). The isolation of rickettsia-like organism causing disease and mortality in Chilean salmonids and its confirmation by Koch’s postúlate. Journal Fish Disease; 14: 121-145.; Larenas J., Hidalgo L., Garcés H., Fryer J.L., Smith P. (1995). Piscirickettsiosis: Lesiones en salmón del atlántico(Salmo salar)infectados naturalmente conPiscirickettsia salmonis.Av Cienc Vet; 10: 53-58.). Los niveles de hematocrito reflejan una severa anemia (Branson E.J., Nieto Díaz-Muñoz D. (1991). Description of a new disease condition occurring in farmed coho salmon,Oncorhynchus kisutch(Walbaum), in South America. Journal Fish Disease; 14: 147-156.).

En el análisis de necropsia de la cavidad abdominal, frecuentemente se encontró la presencia de ascitis, renomegalia y esplenomegalia, nodulaciones subcapsulares de color cremoso a amarillento en el hígado, presencia de una pseudomembrana sobre el corazón y hemorragias petequiales en estómago, ciegos pilóricos, intestino, vejiga natatoria, muscular y grasa visceral (Schafer J.W.; Alvarado, V.; Enríquez, R.; Monrás, M. (1990) The coho salmon syndrome (CSS): A new disease in Chilean salmon, reared in sea water. 1990Bulletin of the European Association of Fish Pathologists10:130.; Larenas J., Hidalgo L., Garcés H., Fryer J.L., Smith P. (1995).Piscirickettsiosis:Lesiones en salmón del atlántico(Salmo salar)infectados naturalmente conPiscirickettsia salmonis.Av Cienc Vet; 10: 53-58.). En la mayoría de los casos, el intestino estaba lleno con un contenido mucoso amarillento y el estómago con un líquido transparente seromucoso (Schafer J.W.; Alvarado, V.; Enríquez, R.; Monrás, M. (1990) The coho salmon syndrome (CSS): A new disease in Chilean salmon, reared in sea water. 1990Bulletin of the European Association of Fish Pathologists10:130); esto último da la impresión de que el pez haya tragado agua (Alvarado V.; Schafer, W.; Enríquez, R.; Monrás, M.; Cubillos, V.; Farías, C.; Alberdi, A. (1990) Síndrome del salmón coho (S.S.C.), nueva enfermedad de salmonídeos cultivados en fase de agua de mar en Chile. Situación actual.Patología Animal4: 10-13).

Desde el punto de vista histopatológico, las lesiones principales correspondían a necrosis en diversos órganos y tejidos, siendo los más afectados el riñón, hígado, bazo e intestino. También fue común observar lesiones vasculares semejantes a las descritas para rickettsias en mamíferos, tales como necrosis endotelial y formación de trombos. Además se pudo encontrar macrófagos conteniendo organismos dentro del citoplasma, coagulación intravascular, inflamación perivascular, pericarditis, endocarditis, lesión inflamatoria crónica en la lámina propia del intestino, incremento del número de células granulares del estrato granuloso intestinal e hiperplasia y fusión laminillar (Cubillos V.; Farías, C.; Alberdi, A.; Alvarado, V.; Schafer, W.; Monrás, M. (1990) Características anatomopatológicas del síndrome del salmón coho (S.S.C.), nueva enfermedad de los salmonídeos.Patología Animal4: 14-17, Branson E.J., Nieto Díaz-Muñoz D. (1991). Description of a new disease condition occurring in farmed coho salmon,Oncorhynchus kisutch(Walbaum), in South America. Journal Fish Disease; 14: 147-156.; Larenas J., Hidalgo L., Garcés H., Fryer J.L., Smith P. (1995).Piscirickettsiosis:Lesiones en salmón del atlántico (Salmo salar) infectados naturalmente conPiscirickettsia salmonis.Av Cienc Vet; 10: 53-58).

Para la diagnosis, se recomiendan métodos de tinción de frotis y tejidos son Gram, Giemsa, naranja de acridina (Cvitanich J.D., Garate O.N., Smith C.E. (1991). The isolation of rickettsia-like organism causing disease and ortality in Chilean salmonids and its confirmation by Koch’s postúlate. Journal Fish Disease; 14: 121-145; Lannan C., Fryer, J. (1994) Extracellular survival ofPiscirickettsia salmonis. Journal of Fish Diseases17: 545-548; Office International des Epizooties, OIE. (1997)Diagnostic manual for aquatic animal diseases.París, Francia, OIE. pp. 161 - 168) y/o azul de toluidina (Larenas J., Hidalgo L., Garcés H., Fryer J.L., Smith P. (1995). Piscirickettsiosis: Lesiones en salmón del atlántico(Salmo salar)infectados naturalmente conPiscirickettsia salmonis.Av Cienc Vet; 10: 53-58). Estas técnicas son adecuadas para la identificación inicial de rutina. El método de inmunofluorescencia indirecta (IFAT), desarrollado por Lannan y col. (Lannan C.N., Ewing S.A., Fryer J.L. (1991). A fluorescent antibody test for detection of the rickettsia causing disease in chilean salmonids. J Aquat Anim Health; 3: 229-234), es en la actualidad uno de los métodos más sensible y específico para el diagnóstico de la piscirickettsiosis. Esta técnica ha sido modificada mediante el uso de microondas (Larenas, J.; Astorga, C.; Contreras, J.; Garcés, H.; Fryer, J.L.; Smith, P. (1996) Rapid detection ofPiscirickettsia salmonisusing microwave irradiation.Fish Pathology31(4): 231 - 232), disminuyendo marcadamente los tiempos de incubación del primer y segundo anticuerpo, sin variar la especificidad y sensibilidad.

Otra enfermedad importante es la necrosis pancreática infecciosa (IPN), una enfermedad ocasionada por un birnavirus que afecta a varios organismos acuáticos silvestres y de cultivo (Reno PW. Infectious pancreatic necrosis and associated aquatic birnaviruses. In: Woo PTK, Bruno DW, editors. Fish Diseases and Disorders. Viral, Bacterial and Fungal Infections. London: CABI Publishing, 1999:1-55). Los salmónidos son principalmente afectados, por lo que esta enfermedad tiene un impacto considerable en la salmonicultura y truticultura, debido a una elevada mortalidad de crías y alevines. La IPN se encuentra en la lista de enfermedades de peces de la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) en su Código Sanitario Internacional para los Animales Acuáticos, por lo que debe ser notificada (Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE). Código Sanitario Internacional para los Animales Acuáticos. Francia: OIE, 2004).

El agente causal en un virus de la familia birnavirus que tiene forma icosaédrica, aproximadamente de 60 nm de diámetro (Cerini CP, Malsberger RG. Morphology of infectious pancreatic necrosis virus. Ann N Y Acad Sci 1965; 126:315-319; Dobos P. Size and structure of the genome of infectious pancreatic necrosis virus. Nucleic Acids Res 1976;3: 1903-1924). Contiene un genoma compuesto de dos segmentos de ácido ribonucleico (ARN) de doble hebra. El segmento A codifica para dos proteínas estructurales (VP2 y VP3) y una proteasa no estructural, mientras que el segmento B codifica para una polimerasa de ARN (Dobos P. Size and structure of the genome of infectious pancreatic necrosis virus. Nucleic Acids Res 1976; 3: 1903-1924). La proteína VP2 estimula la producción de anticuerpos monoclonales neutralizantes de tipo específico (Nicholson BL. Use of monoclonal antibodies in identification and characterization of fish viruses. Annu Rev Fish Dis 1993; 3:241-257) y se piensa que contiene todos los epítopos reconocidos por estos anticuerpos (Caswell-Reno P,<Reno PW, Nicholson>B<l>.<Monoclonal antibodies to infectious pancreatic virus: analysis of viral epitopes and comparison of>different isolates. J Gen Virol 1986; 67: 2193-2205).

IPNV penetra a través de branquias y la boca, o pasando también por los poros sensoriales del sistema de la línea lateral (Novoa B, JL Barja, A Figueras. 1995. Entry and sequential distribution of an aquatic birnavirus in turbot(Scophthalmus maximus). Aquaculture131,1-9, Chou HY, TY Peng, SJ Chang, YL Hsu, JL Wu. 1999. Effect of heavy metal stressors and salinity shock on the susceptibility of grouper(Epinephelus sp.)to infectious pancreatic necrosis virus.Vir Res63, 121 129). La transmisión vertical se ha comprobado en trucha arco iris(Oncorhynchus mykiss)y trucha café(Salmo trutta);en otras especies se han observado casos asociados a ovas o fluidos sexuales infectados, que probablemente correspondan a una infección vertical por contaminación externa (Reno PW. 1999. Infectious pancreatic necrosis virus and associated aquaticBirnaviruses.En“Fish Diseases and D iso rde rsViral, bacterial and fungal infections (PT Woo and DW Bruno, eds.), Vol 3, CAB Publishing, Wallingford, U.K., pp 1-55). Se ha propuesto que la infección vertical también esté asociada a la concentración de partículas virales (Rodríguez S, JJ Borrego, SI Pérez-Prieto. 2003. Infectious pancreatic necrosis virus: biology, pathogenesis, and diagnostic methods.Adv Vir Res62, 113-165). Después de un periodo de viremia no detectable, aproximadamente al cuarto día post-infección se observan áreas de necrosis en páncreas exocrino y otros órganos (Reno PW. 1999. Infectious pancreatic necrosis virus and associated aquaticBirnaviruses.En“Fish Diseases and D isordersViral, bacterial and fungal infections (PT Woo and DW Bruno, eds.), Vol 3, CAB Publishing, Wallingford, U.K., pp 1-55); no obstante, la distribución viral puede ser variable en los distintos órganos. Eléouet et al., (Eléouet JF, N Druesne, S Chilmonczyk, D Momge, M Dorson, B Delmas. 2001. Comparative study ofin-situcell death inducid by the viruses of viral haemorrhagic septicaemia (VHS) and infectious pancreatic necrosis (IPN) in rainbow trout.J Comp Pathol124, 300-307) observaron que el virus podría ser encontrado en varios órganos a excepción del páncreas, lo que puede estar asociado a un distinto nivel de tropismo tisular que presenten diferentes aislados virales.

Durante la enfermedad clínica, la mortalidad es inversamente proporcional a la edad de los animales afectados (Wolf K.

1988. Infectious pancreatic necrosis. En“Fish Viruses and Fish Diseases”,Cornell Univ, Press, Ithaca, NY, pp 115-157). El cuadro clínico más característico se presenta en la trucha arco iris, trucha de arroyo, trucha café, salmón del Atlántico y varias especies de salmón del Pacífico (Roberts RJ, MD Pearson. 2005. Infectious pancreatic necrosis in Atlantic salmon,Salmo salarL.J Fish Dis28,383-389). En crías que han completado en forma normal la primera alimentación, el brote suele ser menos explosivo, pudiendo alcanzar pérdidas del 70% o más en un periodo de dos meses. Las pérdidas en animales más grandes pueden ser entre 10 y 20% (Roberts RJ, MD Pearson. 2005. Infectious pancreatic necrosis in Atlantic salmon,Salmo salarL.J Fish Dis28, 383-389).

Generalmente, los peces afectados muestran anorexia y nadan de forma irregular (nado en sacacorchos con lapsos de ataxia). Estos peces cambian a un color oscuro (hiperpigmentación) y presentan exoftalmia moderada y distensión abdominal. También se observan pálidas las branquias y hemorragias en la zona ventral, incluidas las aletas. Los peces se observan delgados y con “heces colgantes” de color blanquecino (Wolf K. Fish viruses and fish virus diseases. New York: Cornell University Press, Ithaca, 1988).

De acuerdo con los principales hallazgos en la necropsia en crías, bazo, corazón, hígado y riñones se observan pálidos, y la mayoría de las veces no se encuentra alimento en el tracto digestivo. Se observan hemorragias petequiales en vísceras. En algunas ocasiones, se encuentra alimento en pequeñas cantidades, confinado en la parte distal y recto del intestino. Es frecuente observar líquido ascítico en la cavidad abdominal. En estómago e intestino anterior se puede observar un moco lechoso cohesivo, entre otros hallazgos (Wolf K. Fish viruses and fish virus diseases. New York: Cornell University Press, Ithaca, 1988).

Las lesiones principales halladas en el estudio histopatológico incluyen focos de necrosis coagulativa en páncreas, riñón e intestino. El tejido pancreático se ve degenerado, incluso en las áreas acinares, con liberación de los gránulos de zimógeno. Los núcleos de las células acinares se observan picnóticos y de tamaños variables. En muchos casos no se aprecia infiltración de células inflamatorias. (McKnight IJ, Roberts RJ. The pathology of infectious pancreatic necrosis. I. The sequential histopathology of the naturally occurring condition. Br Vet J 1976; 132:76-85).

En el estómago e intestino anterior, se producen procesos variables de degeneración y necrosis (Smail DA, N Bain, DW Bruno, JA King, F Thompson, DJ Pendrey, S Morrice, CO Cunningham.2006. Infectious pancreatic necrosis virus in Atlantic salmon,Salmo salarL., post-smolts in the Shetland Isles, Scotland: virus identification, histopathology, immunohistochemistry and genetic comparison with Scottish mainland isolates.J Fish Dis29, 31-41), desprendimiento de mucosa (enteritis catarral) hacia el lumen intestinal, en donde se pueden observar células epiteliales con citoplasma hialino eosinofílico e hinchadas, con núcleo generalmente fragmentado, formando acúmulos de material basofílico, distribuido en periferia celular, indicativas de un proceso de apoptosis (McKnight IJ, Roberts RJ. The pathology of infectious pancreatic necrosis. I. The sequential histopathology of the naturally occurring condition. Br Vet J 1976; 132: 76-85). En el hígado, es posible encontrar áreas de necrosis focal o generalizada, las cuales suelen ser severas en salmón, mientras que en trucha arco iris son más moderadas o poco significativas (Roberts RJ, MD Pearson.2005. Infectious pancreatic necrosis in Atlantic salmon,Salmo salar L. J Fish Dis28,383-389).

La virulencia, que es la habilidad relativa del agente patógeno para causar enfermedad, es una manifestación de la interacción entre los efectos adversos producidos por componentes del virus y los mecanismos de defensa desarrollados por las células para tratar de eliminar la infección; sin embargo, el resultado de tal interacción siempre es determinado por el virus a través de sus factores de virulencia, función que puede ser ejercida por cualquier componente de la partícula viral (Lyles D. 2000. Cytopathogenesis and inhibition of host gene expression by RNA viruses.Microbiol and Mol Biol Rev64, 709-724). Las diferencias en el nivel de virulencia observadas entre distintas cepas de IPNV han sido atribuidas a su variación genética (Dobos P. 1995a. The molecular biology of infectious pancreatic necrosis virus.Annual Rev Fish Dis5, 25-54), y con la propiedad del virus para modificar las vías de señalización celular a través de las proteínas virales codificadas por su segmento A, capaces de manipular la maquinaria celular para facilitar la síntesis viral y evadir la respuesta de defensa (Hong JR, YL Hsu, JL Wu. 1999. Infectious pancreatic necrosis virus induces apoptosis due to downregulation of survival factor MCL-1 protein expression in a fish cell line.Virus Res63, 75-83; Larsen R, TP R0kenes, B Robertsen. 2004. Inhibition of infectious pancreatic necrosis virus replication by Atlantic salmon Mx1 protein.J Virol78, 7938-7944). En este sentido, las proteínas virales consideradas como los principales factores de virulencia de IPNV son la VP2, componente de la cubierta externa de la cápside viral que participa en el reconocimiento del virus a las células; la proteína VP5 de función no concluyente, dado que se ha observado no ser necesaria para establecer la infección y la multiplicación viral, pero con actividad antiapoptótica que aparentemente no tiene relación en el establecimiento del estado portador. Recientemente, se ha informado que la sobreexpresión de la proteína VP3 induce apoptosis en células de cultivo, pero es difícil de detectar en una infección con partículas virales completas. En cambio, VP4 y VP1 no se han asociado con efectos adversos a nivel celular, pero proteínas de actividad similar en otros virus sí se han observado con implicancia en la patogenicidad de las cepas (Lyles D. 2000. Cytopathogenesis and inhibition of host gene expression by RNA viruses.Microbiol and Mol Biol Rev64, 709-724; Liu M, VN Vakharia. 2004. VP1 protein of infectious bursal disease virus modulates the virulencein vivo.Virol 330, 62-73; Nanda S, M Baron. 2006. Rinderpest virus blocks type I and type II interferon action: role of structural and nonstructural proteins.J Virol80, 7555-7568).

Durante el proceso de infección, el hospedero expresa una respuesta variada encaminada a tratar de impedir la infección o diseminación del agente. Para esto, el sistema de defensa inespecífico es el más importante como medida de protección para los peces y, dentro de éste, el sistema interferón (IFN) es una de las primeras líneas de defensa a la infección viral a través de inducir la síntesis de proteínas que tienen actividad antiviral; en el caso de IPNV, la proteína MxI y la proteína kinasa dependiente de RNA doble hebra (PKR) han demostrado tener actividad antiviral (Roberts RJ, MD Pearson. 2005. Infectious pancreatic necrosis in Atlantic salmon,Salmo salar L. J Fish Dis28,383-389). Sin embargo, se ha informado que algunos virus pueden inhibir o modular la respuesta antiviral ejercida por IFN (Nanda S, M Baron. 2006. Rinderpest virus blocks type I and type II interferon action: role of structural and nonstructural proteins.J Virol80, 7555-7568), lo cual también es supuesto para IPNV (Rodríguez S, JJ Borrego, SI Pérez-Prieto. 2003. Infectious pancreatic necrosis virus: biology, pathogenesis, and diagnostic methods.Adv Vir Res62, 113-165), pero no ha sido evaluado.

IPNV presenta alta variabilidad antigénica y genotípica, características que influyen en la interacción virus-célula, la virulencia y el desarrollo del estado portador; sin embargo, los mecanismos involucrados en dichos procesos no están plenamente determinados (Rodríguez S, JJ Borrego, SI Pérez-Prieto. 2003. Infectious pancreatic necrosis virus: biology, pathogenesis, and diagnostic methods.Adv Vir Res62, 113-165).

El procedimiento para la identificación de la NPI, recomendado por la OIE, se basa en el aislamiento del VNPI en cultivo celular, seguido por la identificación inmunológica de los aislamientos mediante pruebas de inmunofluorescencia (World Organisation for Animal Health. Diagnostic Manual for Aquatic Animal Diseases. France: OIE.2003), seroneutralización (Lientz JC, Springer JE. Neutralization test of infectious pancreatic necrosis virus with polyvalent antiserum. J Wildl Dis 1973;9:120-124) y ELISA (Davis FJ, Laidler LA, Perry PW, Rossington D. Alcock R. The detection of infectious pancreatic necrosis virus in asymptomatic carrier fish by an integrated cell-culture and ELISA technique. J Fish Dis 1994; 17:99-110). El diagnóstico de casos clínicos generalmente se basa en la histología y en la evidencia inmunológica del VNPI en los tejidos infectados. Estos casos se confirman mediante el aislamiento e identificación inmunológica del virus por medio de dichas pruebas (World Organisation for Animal Health. Diagnostic Manual for Aquatic Animal Diseases. France: OIE. 2003). Las pruebas serológicas de identificación de anticuerpos contra el VNPI en peces infectados no han sido reconocidas aún por la OIE (2003), debido al insuficiente conocimiento de la respuesta inmune humoral de los peces a este virus (Wolf K, Quimby MC. Infectious pancreatic necrosis: clinical and immune response of adult trouts to inoculation with live virus. J Fish Res Board Can 1969; 26: 2511-2516).

La detección del VNPI en líneas celulares es consistente y simple, principalmente en líneas procedentes de especies homólogas. Esto se debe a que 1) el virus está presente en títulos elevados en los tejidos; 2) el aislamiento se puede realizar a partir de animales no enfermos; 3) no hay fase en la que el virus no pueda ser aislado; 4) el tiempo requerido para el aislamiento e identificación del agente es de dos a tres semanas, lo cual no es crítico para la presentación de una epizootia, y 5) alta sensibilidad y efecto citopático fácilmente observable. Las líneas celulares empleadas para el aislamiento del VNPI incluyen la RTG-2 (rainbow trout gonad), CHSE-214 (chinook salmon embryo) y BF-2 (bluegill fry) (Kelly RK, Souter BW, Miller HR. Fish cells lines: comparisons of CHSE-214, FHM, and RTG-2 in assaying<i>H<n>and IPN viruses. J Fish Res Board Can 1978; 35:1009-1011).

Actualmente, se han desarrollado varios métodos de detección por medio de la técnica de transcripción reversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR, por sus siglas en inglés: reverse transcriptase-polymerase chain reaction) (Rodriguez S-JS, Borrego JJ, Perez-Prieto SI. Comparative evaluation of five serological methods and RT-PCR assay for the detection of IPNV in fi sh. J Virol Methods 2001; 97:23-31). Sin embargo, la sensibilidad de esta técnica, no ha sido mayor a la del cultivo celular, por lo que el aislamiento del virus y la confirmación serológica son los procesos de elección para la identificación del VNPI.

Por otra parte, se conoce el uso deAndrographis paniculataen el tratamiento de una amplia gama de patologías (Abu-Ghefreh, A.A., Canatan, H. and Ezeamuzie, C.I. (2008)In vitroandin vivoanti-inflammatory effects of andrographolide. International Immunopharmacology, 9:313-318); incluyendo enfermedades como el resfriado común, disentería, fiebre, tonsilitis, diarrea, patologías del hígado, herpes, entre otras (Patarapanich, C., Laungcholatan, S., Mahaverawat, N., Chaichantipayuth, C., Pummangura, S. (2007) HPLC determination of active diterpene lactones from Andrographis paniculata Nees planted in various seasons and regions in Thailand. Thai. J. Pharm. Sci., 31:91-9). Presenta propiedades antiinflamatorias, antimicrobianas (Hai, X., Gui, D., Gai, L., Jun, W. and Hong, L. (2007) Synthesis of andrographolide derivatives: A new family of a-glucosidase inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 15: 4247-4255), antitrombóticas (Zhao, H.Y. and Fang, W.Y. (1991) Antithrombotic effects of Andrographis paniculata nees in preventing myocardial infraction.Chin. Med. J., 104(9):770-5), hepatoprotectoras (Siripong, P., Kongkathip, B., Preechanukool, K., Picha, P., Tunsuwan, K. and Taylor, W. (1992) Cytotoxic diterpenoid constituents fromAndrographis paniculataNees leaves. J. Sci. Soc. Thailand, 18:187-194), actividad anti-VIH (Chang, R.S., Ding, L., Chen, G.Q., Pan, Q.C., Zhao, Z.L. and Smith, K.M. (1991) Dehydroandrographolide succinic acid monoester as an inhibitor against the human immunodeficiency virus. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 197(1):59-66), antidiabética (Zhang, Z.,Jiang, J.,Yu, P.,Zeng. X., Larrick, J. and Wang, Y. (2009) Hypoglycemic and beta cell protective effects of andrographolide analogue for diabetes treatment. J. of T. Medicine, 7:62) y antitumorales (Rao, S., Suseno, G., Matthews, C., Sazali, A., Haji, L., Said, Saad, M., Stevens, M. and Stanslas, J. (2007) Semisynthesis andin vitroanticancer activities of andrographolide analogues. Phytochemistry, 68: 904-912).

La planta es extremadamente amarga en cada una de sus partes (Sheeja, K. and Kuttan, G. (2006) Protective effect ofAndrographis paniculataand andrographolide on cyclophosphamide-induced urothelial toxicity. Integr. Cancer Ther., 5(3):244-51), sin embargo son las porciones aéreas deAndrographis paniculatalas utilizadas para extraer los principios activos fitoquímicos. El extracto contiene diterpenos, flavonoides y estigmasteroles (Koteswara, R., Vimalamma, G., Venkata, R. and Yew, T. (2004) Flavonoids and andrographolides fromAndrographis paniculata.Phyto., Volume 65, Issue 16, Pages 2317-2321). Siendo el andrografolido, el primer y mejor principio activo aislado, el que químicamente se ha definido como una lactona diterpénica bicíclica (Thamlikitkul, V., Dechatiwongse, T., Theerapong, S., Chantrakul, C., Boonroj, P., Punkrut, W., Ekpalakorn, W., Boontaeng, N., Taechaiya, S. and Petcharoen, S. (1991) Efficacy of Andrographis paniculata, Nees for pharyngotonsillitis in adults. J. Med. Assoc. Thai., 74 (10):437 - 42).

Se han realizado diversos estudios preclínicos y clínicos para identificar las propiedades farmacológicas de los componentes deAndrographis paniculata, para esto, se ha utilizado tanto el extracto crudo de la planta, como el andrografolido purificado. En estudios preclínicos, el extracto de la planta ha mostrado diversas actividades, tales como: efecto hepatoprotector administrado intraperitonealmente en ratas (Sharma, A., Lal, K. and Handa, S. (1992) Standardization of the indian crude drug. Kalmegh by high pressure liquid chromatographic determination of andrografolide. Phytochem. Anal., 3, 129-131), actividad antidiarreica en modelos animales tratados con enterotoxina deEscherichia coli(Gupta, S., Choudhry, M.A. and Yadava, J.N.S. (1990) Antidiarrhoeal activity of diterpenes of Andrographis paniculata (Kal-Megh) againstEscherichia colienterotoxinin vivomodels Int. J. Crude Drug Res., 28:273 - 283), y capacidad inmunoestimulante en ratones BALB/c (Puri, A., Saxena, R., Saxena, R.P., Saxena, K.C., Srivastava, V. and Tandon, J.S. (1993) Inmunostimulant agents fromAndrographis paniculata.J. of Natural Products 56: 995 -999). Otro principio activo relacionado, pero menos estudiado, es el 14-deoxiandrografolido, el cual ha demostrado un efecto hipotensor (Zhang, C. Y., Kuroyangi, M. and Tan, B. K. H. (1998) Cardivascular activity of 14-Deoxy- 11, 12-didehydroandrographolide in the anesthetized rat and insolated right atria. The Italian Pharmacol. Society, 1:1-5) y propiedades antiinflamatorias y antipiréticas (Zhang, C. Y. and Tan, B. K. H. (1998) Vasorelaxation of rat thoracic aorta caused by 14-deoxyandrographolide. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 25:424-429).

Otras especies que pueden ser usadas en lugar deAndrographis paniculatason:Andrographis affinis Nees, Andrographis beddomei, Andrographis echioides Nees, Andrographis elongata, Andrographis humifusa, Andrographis lineata Nees, Andrographis macrobotrys Nees, Andrographis nallamalayana, Andrographis neesiana, Andrographis ovata, Andrographis paniculata Nees, Andrographis rothii, Andrographis serpyllifolia, Andrographis viscosula Nees,Andrographis viscosula var. explicata yAndrographis wightiana.

También, en un estudio realizado en el Research Cluster for Health, Southern Cross University de Lismore NSW, Australia, informa que extractos de algas pardas que contienen fucoidán, han demostrado tener efecto modulador de la inmunidad. Este estudio tenía como objetivo determinar si las algas marinas que contienen una mezcla de extractos de tres especies diferentes de algas pardas, es seguro de administrar, y si tiene, un potencial biológico como inmunomodulador. Los resultados permitieron concluir que el complejo de nutrientes era seguro de administrar y además, que efectivamente la preparación demostró tener potencial como un modulador inmune (Myers SP, O'Connor J, Fitton JH, Brooks L, Rolfe M, Connellan P, Wohlmuth H, Cheras PA, Morris C. (2001). A combined Phase I and II open-label study on the immunomodulatory effects of seaweed extract nutrient complex. Research Cluster for Health and Wellbeing, Southern Cross University, Lismore, NSW, Australia; 5:45-60).

Numerosos estudios indican que los polianiones sulfatados, principalmente heparina, dextrán sulfato, lambda y kappa carragenano xilogalactanos, xilomananos y fucoidianos, poseen potente actividad terapéutica contra enfermedades virales, así como otras propiedades anticoagulante y antitumoral (Chapman VJ, Chapman DJ. 1980. Seaweed and Their Uses. In: Chapman and Hall (eds). Londres, p 327).

El mecanismo de acción antiviral de los polisacáridos sulfatados es principalmente inhibiendo la entrada de virus envueltos, como por ejemplo Herpesvirus (HSV), dentro de la célula hospedera, por competencia por los receptores de la superficie celular (Luscher-Mattli M. 2000. Polyanions a lost chance in the fight against HIV and other virus diseases. Antiviral chemistry; Schaeffer DJ, Krylov VS. 2000. Anti-HIV activity of extracts and compounds from algal and cyanobacteria. Ecotoxicology and environmental safety 45:208-227; Witvrouw M, Pannecouque C, De Clerq E. 1997. In: Carbohydrates in drug design, Witczak ZJ and Nieforth KA (eds). Marcel Dekker, Inc: New York, pp. 157-207). Hay un número de receptores, incluyendo el receptor heparin sulfato, expresados en varios tipos de células, los cuales proveen los puntos de entrada para el virus Herpes. La actividad antiviral, en parte, es debida a la similitud de los polianiones sulfatados a las moléculas heparin sulfato de los mamíferos (Campadelli-Fiume et al., 2000).

El fucoidán fue probado contra varios virus envueltos de DNA y RNA, como HSV, HCMV, VSV y HIV, y demostró ser un inhibidor potente y selectivo de estos virus, no importando su tipo de ácido nucleico (Baba M, Snoeck R, Pauwels R, De Clercq E. 1988. Antimicrob sulfated polysaccharides are potent and selective inhibitors of various enveloped viruses, including herpes simplex virus, cytomegalovirus, vesicular stomatitis virus, and human immunodeficiency virus.<Antimicrobial agents and chemotherapy 32:1742-1745; Ponce NM, Pujol CA, Damonte EB, Flores ML, Stortz c>A.<2003.>Fucoidans from the brown seaweed Adenocystis utricularis: extraction methods, antiviral activity and structural studies. Carbohydrate research 338:153-65).

A modo de ejemplo, se revelan variadas composiciones inmunoestimulantes que contienen andrografolidos o sus derivados o fucoidianos, para aplicación en humanos, ver a modo de ejemplo, la siguiente literatura de patente: WO2005087223, WO9617605, WO2006008115, WO2013117149, CN102399245, RU2381807, CN1939413, CN1939420, JP2005082806, JP2002265370, WO0185709, WO0185710, US2002032229, JPH11228602, JPH01313433.

También, se conocen composiciones farmacéuticas inmunoestimulantes de fucoidianos y quitosano, y fucoidianos ylactobacillus,ver a modo de ejemplo, JP2005060327 y JP2010235528.

De igual forma, se conocen vacunas para peces que comprenden fucoidianos, ver JP2006312595.

El arte previo también divulga, variadas composiciones inmunoestimulantes, nutritivas o para tratar y prevenir enfermedades en humanos, que comprenden terpenos o sus derivados y flavonoides y sus derivados, ver a modo de ejemplo, la siguiente literatura de patente: WO2005020881, US5108750, US4906471, US4842859, WO2014201637, CN103923795, CN103735654, CN103417630, CN103005447, MX2011002765, CN102614228y EA201001289.

Asimismo, el arte previo divulga composiciones que comprenden terpenos o sus derivados, y flavonoides y sus derivados, para restablecer el color de peces de cultivo o pigmentarlos, promover su crecimiento o alimentos que potencian su inmunidad, ver a modo de ejemplo, la siguiente literatura de patente: JPH4166040, WO2006123939, JP2010124768 y CN103355491.

De igual forma, se conocen composiciones antivirales o contra esporozoarios, que comprenden terpenos o sus derivados y flavonoides y sus derivados, para tratar enfermedades de peces, ver a modo de ejemplo, la siguiente literatura de patente: CN103989865 y KR20120118805.

Sin embargo, la presente invención se relaciona con una composición sinérgica inmunoestimulante para peces que comprende fucoidianos y andrografólidos.

Respecto de los fucoidianos es importante señalar que los mismos provienen de distintas especies de algas pardas, y se diferencian de acuerdo a los órdenes correspondientes a algas pardas.

Así, el orden fucales comprende la unión de las unidades de Fucosa que varía según la especie que se analice pero principalmente muestra enlaces glicosídicos de tipo (1 —> 3) o (1 —> 4) y los grupos sulfatados se pueden ubicar en las posiciones C-2, C-3 o C-4. Ejemplos de algas de las que se pueden obtener fucoidianos del orden fucales son:Fucus vesiculosus, Fucus evanescens, Fucus distichus, Fucus serratus, Pelvetia wrightii, Ascophyllum nodosum, Himanthalia Lorea, Bifurcaria bifurcata, Sargassum stenophyllum, Hizikia fusiformeyDurvillaea antárctica.

En el orden Laminares y otras algas pardas, la unión de las unidades de Fucosa varía según la especie pero principalmente muestra enlaces glicosídicos de tipo (1 —> 2) o (1 —> 3) y los grupos sulfatados se pueden ubicar en las posiciones C-2 o C-4. Se menciona también que la fracción Galactano presente se da por enlaces (1 —> 3) y (1 —> 6) con grupos sulfatados sobre todo en la posición C-4. Ejemplos de algas de las que se pueden obtener fucoidianos del orden laminares y otras algas pardas son:Lessonia nigrescens, Lessonia trabeculata, Lessonia vadosa, Macrocystis pyrifera, Undaria pinnatifida, Padina pavonia, Laminaria angustata, Laminaria japónica, Ecklonia kurome, Adenocytis utricularis, Dictyota menstrualis, Spatoglossum schroederi y Chordaria flagelliformis.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con una composición sinérgica inmunoestimulante para peces que comprende fucoidianos y andrografólidos. Más preferentemente, la presente invención se relaciona con una composición sinérgica inmunoestimulante para peces que comprende fucoidianos y andrografólidos, y que permite un control y prevención efectiva de infecciones producidas por microorganismos intracelulares. Aún más particularmente, la presente invención se relaciona más con una composición sinérgica que comprende fucoidianos y andrografólidos, y que permite un control y prevención efectiva depiscirickettsiosisy necrosis pancreática infecciosa (IPN), en peces.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1.Ilustra la conformación de distribución en los estanques de peces antes de desafío conP. salmonis,donde DE indica dieta con la composición de la presente invención y C significa dieta sin la composición de la presente invención.

Figura 2.Ilustra la conformación de distribución en los estanques durante el desafío conP. salmonis,donde DE indica dieta con la composición de la presente invención, C significa dieta sin la composición de la presente invención y T significa troyanos.

Figura 3.Ilustra el análisis de expresión de IL-12 en células SHK-1 tratadas con el extracto de algas (FUTERPENOL®, una composición de extractos botánicos y derivados de algas marinas con moléculas bioactivas que promueven la inmunidad frente a patógenos intracelulares), a distintas concentraciones (0,01-1 pg/ml) y re-suspendido en etanol y agua. El análisis del efecto de la expresión de IL-12 se realizó a las 4 horas post-tratamiento en células SFIK-1 tratadas con el extracto 0,001 pg/mL, 0,01 pg/mL y 0,1 pg/mL. Los resultados muestran las medias ± error estándar de muestras por triplicado. Los * indican diferencias significativas con respecto al control sin estímulo, analizados por t-student, p < 0,05, ns, no significativo.

Figuras 4A y 4B.Ilustra el análisis de la cinética de expresión de IL-12 (4A) e IFN-I (4B) en células SHK-1 tratadas con Andrografólido (AP) 0,5 nM, el extracto de algas (BC) 1 pg/ml, la composición de la invención (AP BC) y dieta sola como control (C). El análisis del efecto de la expresión de IL-12 e IFN-I se realizó en células SHK-1 tratadas con la composición de la presente invención. Las diferencias fueron estadísticamente significativas con respecto al control, t-Student. *p<0,05, n=3.

Figura 5.Ilustra la detección deP. salmonisen células sobrevivientes a la infección. Se determinó las veces de cambio de la bacteria en células SHK-1 tratadas con Andrografólido (AP) 0,5 nM, el extracto de algas (BlendC) 1 pg/ml, la composición de la invención (AP BlendC) y dieta sola como control (C). Este análisis se determinó en base a las diferencias de Ct. Las diferencias fueron estadísticamente significativas con respecto al control de célula sin tratamiento e infectadas conP. salmonis,t-Student. *p<0,05, n=3.

Figuras 6A y 6B.Ilustra el análisis de la expresión de IL-12 (6A) e IFN-I (6B) en células sobrevivientes a la infección con IPNv: La expresión de IL-12 e IFN-I se realizó en células SHK-1 tratadas con el extracto de algas (BlendC) 1 pg/ml, la composición de la invención (AP BlendC) y dieta sola como control (C) e infectadas con el virus. Las diferencias fueron estadísticamente significativas con respecto al control, t-Student. *p<0,05, n=3.

Figura 7.Ilustra la detección de IPNv en células sobrevivientes a la infección. Se determinó las veces de cambio del virus en células SHK-1 tratadas con el extracto de algas (BlendC) 1 pg/ml, la composición de la invención (AP BlendC) y dieta sola como control (C). Este análisis de determinó en base a las diferencias de Ct. Las diferencias fueron estadísticamente significativas con respecto al control de células sin tratamiento e infectadas con el virus, t-Student. *p<0,05, n=3.

Figura 8.Ilustra la distribución de la mortalidad diaria de peces del grupo alimentado solo con dieta sin la composición de la presente invención, de los troyanos y de los tratados, durante los 60 días de estudio por desafío SRS.

Figura 9.Ilustra la distribución porcentual acumulada de la mortalidad diaria de peces del grupo alimentado solo con dieta sin la composición de la presente invención, de los troyanos y de los tratados, durante los 60 días de estudio por desafío SRS.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

La presente invención se relaciona con una composición sinérgica inmunoestimulante para peces que comprende fucoidianos y andrografólidos, donde los fucoidianos son obtenidos de extractos preparados a partir deFucus vesiculosus, Fucus evanescens, Fucus distichus, Fucus serratus, Pelvetia wrightii, Ascophyllum nodosum, Himanthalia Lorea, Bifurcaria bifurcata, Sargassum stenophyllum, Hizikia fusiforme, Durvillaea antárctica, Lessonia nigrescens, Lessonia trabeculata, Lessonia vadosa, Macrocystis pyrifera, Undaria pinnatifida, Padina pavonia, Laminaria angustata, Laminaria japónica, Ecklonia kurome, Adenocytis utricularis, Dictyota menstrualis, Spatoglossum schroederi o Chordaria flagelliformis.En tanto los andrografólidos, son obtenidos de extractos preparados a partir deAndrographis affinis Nees, Andrographis beddomei, Andrographis echioides Nees, Andrographis elongata, Andrographis humifusa, Andrographis lineata Nees, Andrographis macrobotrys Nees, Andrographis nallamalayana, Andrographis neesiana, Andrographis ovata, Andrographis paniculata Nees, Andrographis rothii, Andrographis serpyllifolia, Andrographis viscosula Nees,Andrographis viscosula var. explicata yAndrographis wightiana.En la composición sinérgica inmunoestimulante, la proporción fucoidano a andrografólido está en el rango de 5:95 a 20:80. Preferentemente, la proporción fucoidano a anrografólido es 10:90.

La presente invención se relaciona principalmente con una composición sinérgica inmunoestimulante para peces que comprende fucoidianos y andrografólidos, y que permite un control y prevención efectiva de infecciones producidas por microorganismos intracelulares.

La presente invención se relaciona más particularmente con una composición sinérgica que comprende fucoidianos y andrografólidos, y que permite un control y prevención efectiva de piscirickettsiosis, septicemia hemorrágica viral, necrosis pancreática infecciosa, necrosis hematopoyética infecciosa, enfermedad del páncreas y sleeping disease, anemia infecciosa del salmón, francicellosis y renibacteriosis.

La presente composición comprende sinérgica que comprende fucoidianos y andrografólidos, y que permite un control y prevención efectiva de piscirickettsiosis y necrosis pancreática infecciosa (IPN), en peces.

Ejemplo 1: Obtención del Extracto acuoso de harina que contiene fucoidiano

Las algas pardas secas fueron primeramente pulverizadas llevándolas a congelación en N2 líquido, y utilizando un mortero de porcelana, hasta obtener un polvo de algas de 300 micras.

Diez gramos de la mezcla de algas secas molidas fueron extraídos con 200 mL de agua destilada con agitación continua por 4 horas a 25°C. El tejido algal se removió por filtración simple. El extracto acuoso se centrifugó hasta obtener una solución clarificada. La solución se precipitó por adición de 3 volúmenes de etanol. El precipitado se recuperó por centrifugación y se secó en una estufa eléctrica a 50°C.

Ejemplo 2: Obtención de Andrografolido y preparación de Extracto.

Para la elaboración del extracto de andrografolido, se utilizaron hojas secas deAndrographis sp,la extracción se realizó utilizando una mezcla agua-etanol al 80% v/v, el extracto final, es una composición que contiene 80% del extracto nativo y 20% de maltodextrina.

Ejemplo 3: Preparación composición Andrografolido y Fucoidán.

Se realizó una mezcla mecánica de ambos extractos secos en una proporción 90/10 de extracto de algas y extracto deAndrographissp., respectivamente. Para esto, se utilizó un mezclador KitchenAid Heavy Duty (Modelo KS5SS, USA) con contenedor de acero inoxidable, velocidad regulable y capacidad >1,5 L. La velocidad de mezcla seleccionada fue, según indica el equipo, de nivel 2 equivalente a ±70 rpm del eje superior. El tiempo de mezclado fue de 10 minutos, la mezcla fue elaborada según las proporciones de ingredientes y se determinaron las densidades de estas a través de un método gravimétrico con resultados de 0,77 grs/cm3.

Ejemplo 4: resultados de efecto inmune en líneas celulares de Fucoidán

Se utilizó la línea celular SHK-1, derivada de riñón anterior deSalmo salar.Se dio inicio al ensayo cuando las células presentaron un 90% de confluencia, momento en que fueron estimuladas con el extracto de algas (5% de Fucoidanos).

El tratamiento fue aplicado independientemente a las células SHK-1, en medio L15 suplementado con 10% suero fetal bovino en una dosis de 1 |jg/ml, las células fueron incubadas a 20°C por 24 horas de tiempo de estimulación.

Terminado el tratamiento, el sobrenadante celular fue descartado y las células fueron lisadas con 200 j l de tampón de lisis TRK y guardadas en tubos de 1,5 ml a -80°C. Se realizó la extracción de RNA de las células, utilizando el kit de extracción de RNA (Omega-bio-tek), según protocolo del fabricante.

Una vez obtenido el RNA total, los mRNAs fueron transformados a cDNA por medio de la reacción de transcripción reversa, la cual se realizó en un volumen total de 20 j l de solución, dividido en dos partes. La primera reacción se efectuó en una mezcla conteniendo 1,6 j l de oligo-dT (1,25 jg/ml) para análisis de expresión génica de los marcadores 1,0 j l de dNTPs (10 mM); 8,0 j l de RNA total (5 jg ) y 0,1 j l de agua libre de nucleasas y se incubó por 10 min a 60°C para eliminar estructuras secundarias de los mRNAs. Paso seguido, se agregó a esta solución una segunda mezcla comprendida por 1 j l de transcriptasa reversa M-MLV (200 U), 4 j l de tampón de la enzima 5X y 0,5 j l de inhibidor de ribonucleasa recombinante RNAsaOUT (40 U), en un volumen total de 5,5 j l y se incubará por 1 h a 37°C. Finalmente para la inactivación de la transcriptasa reversa, la mezcla de reacción se incubó a 72°C por 10 min. El cDNA sintetizado fue almacenado a -20°C para su posterior amplificación por PCR o cuantificación mediante PCR tiempo real (qPCR) para los genes IFN-I e IL-12 relativos a la expresión de EF-1a utilizando los partidores indicados en la tabla 1 siguiente:

Tabla 1

Cada reacción de amplificación, se realizó empleando como templado 2 j l de cDNA, partidores 0,2 jM (Tabla 1), 0,8 j l MgCI2 (25 mM), 1 j l de mezcla de amplificación Lightcycler® Fast Start DNA Master SYBR Green en un volumen de 10 jl. La reacción se llevó a cabo en un termociclador LightCycler®1.5. El programa constó de los siguientes pasos: denaturación inicial a 95°C por 10 min, seguido de una reacción de PCR de 35 ciclos cada uno compuesto de denaturación a 95°C por 10 s, apareamiento 58°C por 10 s y extensión a 70°C por 10 s. Posteriormente un ciclo para la obtención de la curva de fusión por 20 s a 95°C, y por último un ciclo de enfriamiento a 40°C por 30 s. Para la cuantificación relativa, se realizó con una curva estándar, que consiste en reacciones conteniendo diluciones del producto de PCR purificado y de concentración conocida para el gen de interés. Una vez obtenido y cuantificado el producto de PCR correspondiente a cada gen, se realizaron diluciones sucesivas en un rango de 107 a 102 números de copias/jl para cada gen en estudio, para el posterior cálculo de la eficiencia de la reacción, donde se utilizará la siguiente relación, E=10 (-1/pendiente)-1. Para el cálculo de la expresión relativa mediante la técnica de qPCR se realizaron reacciones de amplificación del cDNA del gen ELF-1 en cada muestra de RNA de células tratadas con los distintos estímulosin vitro.Luego, los cambios de expresión fueron calculados a través del método comparativo CT (Pfaffl, 2001).

Los resultados se ilustran en la Figura 3.

Ejemplo 5: resultado de efecto inmune en líneas celulares de Andrografólido

Se utilizó la línea celular SHK-1, derivada de riñón anterior deSalmo salar.Se dio inicio al ensayo cuando las células presentaron un 90% de confluencia, donde fueron estimuladas con un extracto deAndrographis sp(10% Andrografolidos totales).

El tratamiento fue aplicado independientemente a las células SHK-1, en medio L15 suplementado con 10% suero fetal bovino en una dosis de 5 nM del extracto deAndrographis sp, las células fueron incubadas a 20°C por 24 horas de tiempo de estimulación.

Terminado el tratamiento, el sobrenadante celular fue descartado y las células fueron lisadas con 200 j l de tampón de lisis TRK y guardadas en tubos de 1,5 ml a -80°C. Se realizó la extracción de RNA de las células, utilizando el Kit de extracción de RNA (Omega-bio-tek), según protocolo del fabricante.

Una vez obtenido el RNA total, los mRNAs fueron transformados a cDNA por medio de la reacción de transcripción reversa, la cual se realizó en un volumen total de 20 j l de solución, dividido en dos partes. La primera reacción se efectuó en una mezcla conteniendo 1,6 j l de oligo-dT (1,25 jg/ml) para análisis de expresión génica de los marcadores 1,0 j l de dNTPs (10 mM); 8,0 j l de RNA total (5 jg ) y 0,1 j l de agua libre de nucleasas y se incubó por 10 min a 60°C para eliminar estructuras secundarias de los mRNAs. Paso seguido, se agregó a esta solución una segunda mezcla comprendida por 1 j l de transcriptasa reversa M-MLV (200 U), 4 j l de amortiguador de la enzima 5X y 0,5 j l de inhibidor de ribonucleasa recombinante RNAsaOUT (40 U), en un volumen total de 5,5 j l y se incubará por 1 h a 37°C. Finalmente para la inactivación de la transcriptasa reversa, la mezcla de reacción se incubó a 72°C por 10 min. El cDNA sintetizado fue almacenado a -20°C para su posterior amplificación por PCR o cuantificación mediante PCR tiempo real (qPCR) para los genes IFN-I e IL-12 relativos a la expresión de EF-1a utilizando los partidores señalados en la Tabla 2 siguiente:

Tabla 2

Cada reacción de amplificación, se realizó empleando como templado 2 pl de cDNA, partidores 0,2 pM (Tabla 2), 0,8 pl MgCh (25 mM), 1 pl de mezcla de amplificación Lightcycler® Fast Start DNA Master SYBR Green en un volumen de 10pl. La reacción se llevó a cabo en un termociclador LightCycler®1.5. El programa constó de los siguientes pasos: denaturación inicial a 95°C por 10 min, seguido de una reacción de PCR de 35 ciclos cada uno compuesto de denaturación a 95°C por 10 s, apareamiento 58°C por 10 s y extensión a 70°C por 10 s. Posteriormente un ciclo para la obtención de la curva de fusión por 20 s a 95°C., y por último un ciclo de enfriamiento a 40°C por 30 s. Para la cuantificación relativa se realizó con una curva estándar, que consiste en reacciones conteniendo diluciones del producto de PCR purificado y de concentración conocida para el gen de interés. Una vez obtenido y cuantificado el producto de PCR correspondiente a cada gen, se realizaron diluciones sucesivas en un rango de 107 a 102 números de copias/pl para cada gen en estudio, para el posterior cálculo de la eficiencia de la reacción, donde se utilizará la siguiente relación, E=10 (-1/pendiente)-1. Para el cálculo de la expresión relativa mediante la técnica de qPCR se realizaron reacciones de amplificación del cDNA del gen ELF-1 en cada muestra de RNA de células tratadas con los distintos estímulosin vitro.Luego, los cambios de expresión fueron calculados a través del método comparativo CT (Pfaffl, 2001).

Los resultados se ilustran en las Figuras 4A y 4B.

Ejemplo 6: resultado de efecto inmune en líneas celulares de la mezcla fucoidianos más Andrografólidos

Se utilizó la línea celular SHK-1, derivada de riñón anterior deSalmo salar.Se dio inicio al ensayo cuando las células presentaron un 90% de confluencia, donde fueron estimuladas con un extracto deAndrographis spy un extracto de algas pardas.

El tratamiento fue aplicado en forma conjunta a las células SHK-1, en medio L15 suplementado con 10% suero fetal bovino en dosis de 1 pg/ml de extracto de algas pardas (5% fucoidianos totales) y 5 nM de extracto deAndrographis sp(10% andrografolidos totales), las células fueron incubadas a 20°C por 24 horas de tiempo de estimulación.

Terminado el tratamiento, el sobrenadante celular fue descartado y las células fueron lisadas con 200 pl de tampón de lisis TRK y guardadas en tubos de 1,5 ml a -80°C. Se realizó la extracción de RNA de las células, utilizando el kit de extracción de RNA (Omega-bio-tek), según protocolo del fabricante.

Una vez obtenido el RNA total, los mRNAs fueron transformados a cDNA por medio de la reacción de transcripción reversa, la cual se realizó en un volumen total de 20 pl de solución, dividido en dos partes. La primera reacción se efectuó en una mezcla conteniendo 1,6 pl de oligo-dT (1,25 pg/ml) para análisis de expresión génica de los marcadores 1,0 pl de dNTPs (10 mM); 8,0 pl de RNA total (5 pg) y 0,1 pl de agua libre de nucleasas y se incubó por 10 min a 60°C para eliminar estructuras secundarias de los mRNAs. Paso seguido, se agregó a esta solución una segunda mezcla comprendida por 1 pl de transcriptasa reversa M-MLV (200 U), 4 pl de tampón de la enzima 5X y 0,5 pl de inhibidor de ribonucleasa recombinante RNAsaOUT (40 U), en un volumen total de 5,5 pl y se incubará por 1 h a 37°C. Finalmente para la inactivación de la transcriptasa reversa, la mezcla de reacción se incubó a 72°C por 10 min. El cDNA sintetizado fue almacenado a -20°C para su posterior amplificación por PCR o cuantificación mediante PCR tiempo real (qPCR) para los genes IFN-I e IL-12 relativos a la expresión de EF-1a utilizando los partidores señalados en la tabla 3 siguiente:

Tabla 3

Cada reacción de amplificación se realizó empleando como templado 2 pl de cDNA, partidores 0,2 pM (Tabla 3), 0,8 pl MgCh (25 mM), 1 pl de mezcla de amplificación Lightcycler® Fast Start DNA Master SYBR Green en un volumen de 10pl. La reacción se llevó a cabo en un termociclador LightCycler®1.5. El programa constó de los siguientes pasos: denaturación inicial a 95°C por 10 min, seguido de una reacción de PCR de 35 ciclos cada uno compuesto de denaturación a 95°C por 10 s, apareamiento 58°C por 10 s y extensión a 70°C por 10 s. Posteriormente un ciclo para la obtención de la curva de fusión por 20 s a 95°C, y por último un ciclo de enfriamiento a 40°C por 30 s. Para la cuantificación relativa se realizó con una curva estándar, que consiste en reacciones conteniendo diluciones del producto de PCR purificado y de concentración conocida para el gen de interés. Una vez obtenido y cuantificado el producto de PCR correspondiente a cada gen, se realizaron diluciones sucesivas en un rango de 107 a 102 números de copias/pl para cada gen en estudio, para el posterior cálculo de la eficiencia de la reacción, donde se utilizará la siguiente relación, E=10 (-1/pendiente)-1. Para el cálculo de la expresión relativa mediante la técnica de qPCR se realizaron reacciones de amplificación del cDNA del gen ELF-1 en cada muestra de RNA de células tratadas con los distintos estímulosin vitro.Luego, los cambios de expresión fueron calculados a través del método comparativo CT (Pfaffl, 2001).

Los resultados se ilustran en las Figuras 4A y 4B.

Ejemplo 7: resultado de efecto inmune por desafío P. salmonis

Se utilizó la línea celular SHK-1, derivada de riñón anterior deSalmo salar.Se dio inicio al ensayo cuando las células presentaron un 90% de confluencia, donde fueron estimuladas con una combinación que asegurará una concentración del extracto de algas pardas de 1 pg/ml y de 5 nM del extracto deAndrographis sp,así como la estimulación individual con una concentración de 1 pg/ml de extracto de algas pardas, y la estimulación individual con una concentración de 5 nM del extracto deAndrographis sp.Los tratamientos fueron aplicados independientemente a las células SHK-1, en medio L15 suplementado con 10% suero fetal bovino en las dosis antes señaladas, las células fueron incubadas a 20°C por 24 hrs de incubación.

La infección conP. salmonisse realizó posterior al periodo de incubación. Para el desafío, se utilizó una cepa dePiscirickettsia salmonisPPT005 cultivada en una línea celular SHK-1, la cual fue originalmente aislada desde población moribunda de ejemplares de salmones del atlántico(Salmo salar)de un centro de cultivo cercano a Puerto Montt, Chile, utilizando células CHSE-214. Las células fueron infectadas e incubadas a 18°C en medio L-15 suplementado con 2% SFB. Las bacterias fueron cosechadas desde las células infectadas cuando éstas presentaron un 90% de efecto citopático (CPE). Finalmente, los ensayos funcionales se realizaron sembrando 104 bacterias por mL en células SHK-1 al 90% de confluencia.

La duración del ensayo de desafío fue de 9 días, tiempo necesario para obtener un 50% de efecto citopático en las monocapas control.

Terminado el tratamiento, se cosecharon los sobrenadantes y las células sobrevivientes fueron lisadas con 200 pl de buffer de lisis TRK y guardadas en tubos de 1,5 ml a -80°C.

Se tomó 1 ml de cada uno de los sobrenadantes de cultivos de células SHK-1 con 9 días de infección. Estos sobrenadantes se centrifugaron a 700 x g por 10 min para eliminar el residuo celular, y luego a 16.000 x g por 45 min para recuperar las bacterias en una centrífuga Eppendorf 5402. Todos los sedimentos se procesaron por el método de Chelex para la obtención del DNA a amplificar. Brevemente, éstos se resuspendieron en 100 pl de 6% Instagene p/v (Chelex 100, Bio-Rad), se agitaron a máxima velocidad en un vortex y se centrifugaron a 11.600 x g por 5 min en una centrífuga Eppendorf para colectar las perlitas de Chelex en el sedimento y el DNA en el sobrenadante. Para la estimación del número de bacterias se usó como referencia estándares con números conocidos de copias deP. salmonis,obtenidos a través del clonamiento del ITS de esta bacteria en el vector pCR® 2.1 TOPO TA (Invitrogen). Se amplificó en paralelo los estándares de 104 a 1010 número de copias y los DNA obtenidos por Chelex. Cada reacción se realizó en un volumen de 30 pl con 1 pg de cada muestra de DNA, y 0,5 mM de los partidores para ITS (Marshall y col. 1998) marcados con FAM (495 - 535 nm). Para la amplificación se realizó una denaturación inicial de 10 min a 95°C, seguido por 35 ciclos con los siguientes segmentos: denaturación a 95°C por 15 segundos, alineamiento a 60°C por 30 segundos y extensión a 72°C por 45 segundos, y luego una extensión final de 6 min a 72°C. A partir de las curvas de amplificación obtenidas para cada muestra, se estimaron los valores de Ct (“Crossing threshold”) de los estándares de número de copias, de acuerdo al método descrito por Phaffl, 2001, los resultados se grafican en la figura 5.

En el caso de las células sobrevivientes, se realizó la extracción de RNA de las células, utilizando el kit de extracción de RNA (Omega-bio-tek), según protocolo del fabricante.

Una vez obtenido el RNA total, los mRNAs fueron transformados a cDNA por medio de la reacción de transcripción reversa, la cual se realizó en un volumen total de 20 pl de solución, dividido en dos partes. La primera reacción se efectuó en una mezcla conteniendo 1,6 pl de oligo-dT (1,25 pg/ml) para análisis de expresión génica de los marcadores 1,0 pl de dNTPs (10 mM); 8,0 pl de RNA total (5 pg) y 0,1 pl de agua libre de nucleasas y se incubó por 10 min a 60°C para eliminar estructuras secundarias de los mRNAs. Paso seguido, se agregó a esta solución una segunda mezcla comprendida por 1 pl de transcriptasa reversa M-MLV (200 U), 4 pl de buffer de la enzima 5X y 0,5 pl de inhibidor de ribonucleasa recombinante RNAsaOUT (40 U), en un volumen total de 5,5 pl y se incubará por 1 h a 37°C. Finalmente para la inactivación de la transcriptasa reversa, la mezcla de reacción se incubó a 72°C por 10 min. El cDNA sintetizado fue almacenado a -20°C para su posterior amplificación por PCR o cuantificación mediante PCR tiempo real (qPCR) para los genes IFN-I e IL-12 relativos a la expresión de EF-1a utilizando los partidores que se señalan en la tabla 4 siguiente:

Tabla 4

Cada reacción de amplificación se realizó empleando como templado 2 pl de cDNA, partidores 0,2 pM (Tabla I), 0,8 pl MgCI2 (25 mM), 1 pl de mezcla de amplificación Lightcycler® Fast Start DNA Master SYBR Green en un volumen de 10pl. La reacción se llevó a cabo en un termociclador LightCycler®1.5. El programa constó de los siguientes pasos: denaturación inicial a 95°C por 10 min, seguido de una reacción de PCR de 35 ciclos cada uno compuesto de denaturación a 95°C por 10 s, apareamiento 58°C por 10 s y extensión a 70°C por 10 s. Posteriormente un ciclo para la obtención de la curva de fusión por 20 s a 95°C, y por último un ciclo de enfriamiento a 40°C por 30 s. Para la cuantificación relativa se realizó con una curva estándar, que consiste en reacciones conteniendo diluciones del producto de PCR purificado y de concentración conocida para el gen de interés. Una vez obtenido y cuantificado el producto de PCR correspondiente a cada gen, se realizaron diluciones sucesivas en un rango de 107 a 102 números de copias/pl para cada gen en estudio, para el posterior cálculo de la eficiencia de la reacción, donde se utilizará la siguiente relación, E=10 (-1/pendiente)-1. Para el cálculo de la expresión relativa mediante la técnica de qPCR se realizaron reacciones de amplificación del cDNA del gen ELF-1 en cada muestra de RNA de células tratadas con los distintos estímulosin vitro.Luego, los cambios de expresión fueron calculados a través del método comparativo CT (Pfaffl, 2001).

Ejemplo 8. Inmunoestimulación contra microorganismos intracelulares (IPNv) con la composición de la presente invención en líneas celulares de peces salmonideos.

Se realizó estudio en líneas celulares de peces salmonideos, donde la composición de la presente invención fue evaluada. Las líneas celulares expuestas a la combinación de fucoidianos Andrografolidos, líneas celulares expuestas sólo a fucoidianos, y posteriormente, se evaluaron marcadores moleculares relevantes en la diferenciación de Th0 a Th1 tales como IL-12 e IFN-1. Los fucoidianos por separado y la combinación de éstos Andrographolidos son significativamente diferentes en las células sobrevivientes posterior a un desafío con IPNV. Al mismo tiempo, existe una disminución en el número de copias de los agentes patógenos significativamente superior en las células que recibieron la composición de la presente invención con respecto a la utilización de sólo los fucoidianos o el extracto acuoso de algas pardas. Ver figuras 6A, 6B y 7.

Los estudios en peces, se realización en estanques, donde la composición de la presente invención fue un extracto acuoso de algas marinas con un porcentaje de fucoidianos referencial de 5% obtenido deMacrocystes Pyriferaen combinación con un extracto de la plantaAndrographis spcon un 10% de andrografolidos totales en una proporción 10% y 90% respectivamente, se incorporó al alimento o dieta de los peces, en una dosis en el rango de 0,5 a 2,5 Kg por tonelada de alimento. De preferencia, en una dosis de 1Kg por tonelada de alimento.

Se utilizaron 450 ejemplares de truchas arcoíris(Oncorhynchus mykiss)con peso promedio de 100-120 g., no obstante, se disponía de peces adicionales para logar un coeficiente de variación menor o igual a 15%.

Se tomaron muestras de 30 peces para ser analizados en el laboratorio mediante técnica de RT-PCR tiempo real, para descartar la presencia de IPNv, BKD y SRS.

Se realizó un muestreo exploratorio para conocer el peso promedio de la población y realizar la selección de los peces destinados al ensayo. Se incluyeron solo animales que presenten el peso requerido, buena condición de adaptación al ambiente salino y condición sanitaria aprobada por el veterinario (libre de IPNv, SRS y BKD).

Con el dato de selección, al realizar el marcaje, se excluyeron todos los animales que presenten peso fuera del rango de selección, así como también aquellos con descamación o que su condición no fuese la adecuada para el presente estudio.

Los peces fueron marcados con pittags 10 días antes del inicio del ensayo, procediendo de la siguiente forma:

a) Los peces fueron extraídos desde el estanque y puestos en una batea con una solución anestésica, Tricaina metanosulfonato 80%.

b) Una vez alcanzado el plano II (anestesia profunda), se tomaron individualmente y se dispusieron en el mesón de trabajo, en forma lateral, de manera que la cabeza quede al lado izquierdo del operador.

c) Se insertó una aguja para realizar la incisión en flanco a la altura de aletas ventrales, por donde se introdujo el chip. Luego de realizó un pequeño masaje para deslizar el chip hacia la cavidad ventral.

d) Los peces se transfirieron al estanque de origen para su recuperación y a espera de conformación de estanques de prueba.

Se conformaron 6 estanques de 1 m3 a partir de los peces previamente marcados con pittags. En cada estanque se depositaron 50 peces y de los cuales el código del chip fue leído, creando una base de datos que asoció, peso y longitud inicial y número de estanque. La base de datos permitió seguir la trazabilidad de los peces marcados, relacionado a índices productivos y posterior desafío con el patógeno. En forma simultánea se conformaron 2 estanques con 75 peces cada uno, según mismo procedimiento, que se mantuvieron hasta iniciar la etapa de desafío, ver Figura 1.

Los peces fueron mantenidos en los estanques por 10 días como periodo de aclimatación, bajo condiciones controladas; temperatura promedio de 14°C (±1°C), salinidad en un rango de 31-32 ppt, oxígeno 80 - 100% de saturación y pH de 7-8. Los parámetros ambientales fueron monitoreados diariamente.

Durante esta etapa, los estanques se alimentaron con dieta sin la presente composición, en forma manual a 2-2,5% PC, con ración del 100% en la mañana. Diariamente, se recuperó el alimento no consumido de cada estanque, para posteriormente estimar la tasa de alimentación real de cada grupo.

De existir mortalidad, esta fue extraída y registrada en el estanque correspondiente, y se practicó necropsia por personal capacitado de la piscicultura.

Los peces se alimentaron 2-2,5% pc/día, durante la aclimatación, administración de tratamiento y etapa de desafío con patógeno. El alimento se administró en forma manual, entregando el 100% de la ración durante la mañana. Cabe señalar que durante la aclimatación y desafío se administró una dieta comercial sin aditivos.

La cantidad de alimento suministrado se ajustó regularmente de acuerdo al crecimiento esperado para la especie y mortalidad. Diariamente, se realizó la recolección de alimento no consumido en los estanques, obteniendo así, el consumo real de alimento para la estimación de índices productivos posteriores.

Durante el desarrollo del ensayo, se tomaron muestras de tejido, considerando riñón anterior, intestino proximal y muestras de sangre para la obtención de plasma. La cantidad de muestras y tiempo de muestreo se indican en la tabla 3 de más adelante.

Las muestras de riñón anterior se tomaron en dos trozos de 0,5 cm3, que fueron inmersos en tubos eppendorf de 2 ml (en forma individual para cada pez) que contienen 800 pL de RNA later (Ambion). Estas muestras fueron rotuladas y refrigeradas (4-6°C) por 24 h, para luego proceder a refrigeración de -80°C.

El intestino proximal fue destinado a análisis histológico, por lo cual se depositaron en tubos falcón con formalina tamponada. En este caso, el número de muestras por estanque (3) se depositó en un mismo tubo, rotulado con fecha, número estanque y tratamiento.

Las muestras de sangre, se depositaron inmediatamente después de la toma, en tubos eppendorf preparados con heparina (25UI). Luego fueron centrifugadas para retirar el plasma, el cual fue depositado en un nuevo tubo (previamente rotulado) y conservado en el ultra freezer (-80°C) hasta su retiro.

T l . N m r i m m m r i

El alimento con la composición de la presente invención fue entregado a tres estanques (triplicado), según se indica en la tabla 4, por 30 días consecutivos. Los estanques restantes (controles), continuaron su alimentación con dieta estándar por todo el periodo de evaluación. La entrega del tratamiento fue de acuerdo a lo antes descrito.

Durante este tiempo, temperatura, pH, salinidad y oxígeno fueron monitoreados, en forma diaria. De existir mortalidad en esta etapa, fue extraída y registrada en el estanque correspondiente, realizando examen anatomopatológico.

Tabla 6. Detalle administración tratamiento

N° N° peces Grupo Tipo d ieta Tiem po Estanque adm inistración ( días)

1 47 Tratam iento Inm unoestim ulante 30

2 47 Control Comercial 30

3 47 Tratam iento Inm unoestim ulante 30

447 Control Comercial 30

S 47 Tratam iento Inm unoestim ulante 30

6 47 Control Comercial 30

Control corresponde a la dieta comercial.

Inmunoestilmulante corresponde a la composición de la presente invención.

Luego, se realizó un desafío conP. salmomisEn la tabla 3, se detalla las especificaciones del aislado deP. salmonisque se utilizó en la inoculación de peces troyanos.

Tabla 7. Especificaciones del aislado deP. salmonis.

Órgano de aislamiento Riñón

N° de animalizaciones 1

Condición del aislado Reanimalizado-criopreservado

Tipo producción del inoculo Cultivo bacteriológico

El inóculo fue entregado con TCID50/ml determinada a través del método Karber-Spearman por el laboratorio ADL Diagnostic Chile Ltda. Además se evaluó la pureza del inóculo, considerando análisis de RT-PCR ISAv, IPNv, BKD,F. psycrophilum ycultivos bacteriológicos en medio TSA y TSA/s a 18 y 35° de incubación.

Al término de la administración de la dieta con la composición de la presente invención, los peces fueron redistribuidos para realizar el desafío. Se conformaron 3 estanques de 1 m3, considerando la mezcla de peces tratados y no tratados en forma aleatoria en los nuevos estanques, según se indica en la tabla 6. Al momento de la nueva distribución el pittag fue leído, asignando a cada chip el grupo y estanque, ver Figura 2.

Tabla 8. Redistribución peces para desafio

Origen TK 1 TK-2 TK 3 TK-4 TK-S TK-6 Total n=40 n=40 n=4Q n=4Q n=40 n=40

N° Estanque Tratado Control Tratado Control Tratado Control desafio 7 13 14 13 13 14 13 8 13 13 14 13 13 14

9 14 13 13 14 13 13

Observación: El número de peces está estimado considerando mortalidad y toma de muestras en la etapa de administración de tratamiento, de no existir, el numero será ajustado al n real.

Tratado significa que se ha proporcionado una dieta que comprende la composición de la presente invención. Control significa que se ha proporcionado sólo una dieta comercial.

El desafío se realizó mediante cohabitación, que consistía en introducir peces infectados conP. salmonis,troyanos, en los estanques de peces sanos (tratados y control), como se indica en la tabla 7, considerando una presión de infección de 33%. El inóculo fue administrado al grupo de troyanos por vía intraperitoneal a razón de 0,2 ml/pez. La inoculación se realizó de acuerdo al siguiente procedimiento:

a) Los peces fueron extraídos desde el estanque y dispuestos en un contenedor con solución anestésica (Tricaina 80% de ASL).

b) Una vez alcanzado el plano anestésico III se tomaron individualmente y se sostuvieron con la cara ventral hacia arriba. c) La aguja se insertó en un ángulo de aproximadamente 45° en la línea media ventral, entre las aletas pectorales y las pélvicas, inyectando 0,2 mi por pez.

d) En esta etapa el pittag fue leído asignando al código del chip el grupo “troyanos”, número del estanque y fecha de inoculación.

e) Post aplicación los peces fueron transferidos al estanque asignado, monitoreando constantemente el estado de recuperación.

Tabla 9 Distribución de grupos desafío por cohabitación Grupo TK-7 TK-8 TK-9

n n n

Tratado 40 40 40

Control 40 40 40

Troyanos 40 40 40

T ota l 120 120 120

Tratado significa que ha recibido la dieta con la composición de la presente invención.

Control significa que sólo ha recibido la dieta comercial.

Posteriormente, los peces se dejaron en los estanques a la espera de la aparición de mortalidad. Durante esta etapa, la alimentación se efectuó de acuerdo a lo señalado en el punto 6.8 y diariamente se registraron parámetros ambientales como temperatura, salinidad, oxígeno y pH. La mortalidad fue identificada de acuerdo al número de pittag a partir de la base de datos, registrándose diariamente.

El desafío tuvo una duración de 60 días, periodo en el cual, se esperaba alcanzar mortalidad acumulada del grupo control, de 40-60%, dando así por finalizado el ensayo.

La mortalidad registrada durante los días de desafío fue enviada al laboratorio de diagnóstico para ser analizada mediante observaciones anatomopatológicas. En forma paralela se realizaron análisis moleculares por la técnica RT-PCR tiempo real, para virus IPN y SRS, al 20% del total, considerando 15 troyanos, 30 del grupo tratado y 30 del grupo control, para confirmar la presencia del patógeno.

Se medió peso y longitud al día 0 (inicio aclimatación), a 30 días de administración de tratamiento y al final del desafío conP. salmonis,sobre el 100% de los peces de cada grupo. A partir de los datos se calculó el Factor de condición (K), Tasa de alimentación (SFR), Tasa específica de crecimiento (SGR),%de crecimiento, Tasa de crecimiento térmico (GF3) y tasa de Conversión de Alimento (FCRb).

A continuación se resumen en tablas algunas de las variables productivas tales como peso corporal promedio, factor de condición K, coeficiente de variación e incremento de peso al término de la administración de tratamiento. Según se observa el peso final (ver Fig. 12) se incrementó en todos los estanques.

Tabla 10: Peso corporal, factor de condición, coeficiente de variación e incremento de peso al término de la etapa de administración de tratamiento.

Tabla 11: Alimento suministrado % SFR factor de conversión de alimento.

La Tabla 12 resume los parámetros productivos obtenidos durante el período de administración del tratamiento (Dieta con la presente composición de la presente invención). De la tabla se puede observar que los indicadores de crecimiento (% crecimiento, SGR y SFR) fueron similares entre el grupo tratado y el grupo control. Los datos de cada grupo no presentan diferencias significativas en cuanto a peso, obtenido al término de la administración (p>0,05), en la tasa de crecimiento específica SGR (p>0,05) y en la tasa térmica de crecimiento GF3 (p>0,05).

T l 12: R m n v ri l r iv r r r mi n

La Tabla 13 muestra el incremento de biomasa y crecimiento acumulado (%) post administración de la dieta comercial con la composición de la presente invención. El aumento de biomasa fluctuó de 6,35 a 7,28 kg y el crecimiento acumulado de 135,7 a 162,2% entre los distintos estanques de prueba.

La tasa de crecimiento específica (SGR) vario en un rango de 1,65 a 1,85 entre las distintas replicas, sin embargo, no se observaron diferencias entre el grupo al que se le ha suministrado la dieta comercial con la composición de la presente invención y el grupo al cual sólo se le ha suministrado la dieta comercial. Lo mismo se dio para la tasa de crecimiento término (GF3), con rango de 2,16 a 2,42 comportándose en forma similar en ambos grupos.

Tabla 13 Biomasa, porcentaje de crecimiento relativo, tasa de crecimiento térmico y tasa específica de crecimiento al término de la eta a de administración de tratamiento

A partir de los resultados obtenidos, se realizó prueba T para muestras independientes, no observando diferencias significativas (p>0,05) para la variable de crecimiento, entre grupo control y grupo tratado con aditivo experimental.

Para la tasa de crecimiento térmico y tasa específica, se aplicó el mismo análisis, no registrando diferencias significativas (p<0,05) entre el grupo tratado y el grupo contro.

En la etapa de desafío conP. salmonis,se analizó la mortalidad post desafío. Para ello, durante el período de cohabitación los grupos e trucha arcoíris presentaron un porcentaje de mortalidad acumulada similar entre réplicas, en el grupo de troyanos. En el grupo control y aquel administrado con alimento con la composición de la presente invención, se observó mayor en una de las réplicas (TK C9), mientras que la réplica 2 y 3 (TK C10 y C11) presentaron mortalidad similar, sin embargo, la tendencia fue semejante entre las réplicas, donde el grupo control obtuvo mayor mortalidad que los grupos tratados. Las figuras 17 y 18 presentan la evolución de mortalidad diaria y acumulada por estanque.

Con el fin de confirmar la causa de mortalidad de los grupos desafiados, se analizaron peces muertos mediante técnicas moleculares (RT-PCR tiempo real) con un total de 63 muestras, obteniéndose el 100% de casos positivos con presencia deP. salmonis,y 0 muestras positivas para IPNV, en los diferentes grupos evaluados (ver Tabla 10). El Ct promedio para grupo control fue de 21,71 y para el grupo experimental 23,1.

Tabla 14 Resultados del análisis de PCRP. salmonisen trucha arco iris durante el desafío de cohabitación.

Además del análisis molecular, se realizó necropsia de la mortalidad, observándose lesiones externas e internas asociadas a SRS. En general, las lesiones más recurrentes fueron, lesiones ulcerativas en piel, hemorragias en base de aletas, serosa intestinal congestiva, cerebro congestivo, renomegalia, tejido adiposo congestivo, esplenomegalia y ciegos pilóricos congestivos.

La Tabla 15 muestra el peso promedio, factor de condición (K) y porcentaje de crecimiento obtenido al final del desafío para el grupo control y el grupo tratado. Según se observa, el grupo tratado con la composición de la presente invención obtuvo mayor peso promedio, factor de condición y%de crecimiento acumulado al término del desafío.

Tabla 15: Peso romedio al término del desafío conP. salmonis.

Para la interpretación de los resultados de eficacia del tratamiento, se calculó el porcentaje relativo de sobrevivencia (RPS), a partir de la mortalidad registrada durante el desafío. El RPS es la relación entre la mortalidad acumulada de los peces tratados en el momento que la mortalidad acumulada de los peces control (no tratados) alcanzan el 40-60%. El RPS se expresa de acuerdo a la siguiente fórmula:

RPS = 1 - (% mortalidad peces tratados/ % mortalidad peces no tratados (control) * 100

También, se calculó la mortalidad acumulada del grupo control al día 60 post desafío y al término del ensayo (día 80). El RPS para el grupo tratado por estanque y como grupo se presenta a continuación en las Tablas 15 y 16.

Tabla 17 Porcentae Relativo de Sobrevivencia RPS en trucha arcoíris a tiem o final.

Según se observa en las tablas, el RPS al día 60 fue de 62,3% para luego disminuir al día 80 post desafío con un 57,14%.

El Estudio concluyó luego de 133 días, contemplando un período de aclimatación de 23 días, un período de administración de tratamiento de 30 días y un período de desafío por cohabitación de 80 días. Los resultados obtenidos muestran que la incorporación de la composición en la dieta, mejoró sustancialmente la sobrevivencia de los peces al ser expuestos aPiscirickettsia salmonispor la vía de infestación natural (cohabitación), obteniendo diferencias significativas respecto al grupo que no fue tratado. Por otra parte, a nivel productivo no se observaron diferencias significativas en el consumo de alimento, conversón, incremento en peso y tasa de crecimiento específico, comportándose en forma similar a una dieta normal sin aditivo.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Composición veterinaria para uso en peces, que comprende: un extracto acuoso de algas marinas con un porcentaje de fucoidianos de 5% y un extracto de plantaAndrographis spcon un porcentaje de andrografolidos totales de 10%, donde:

el extracto acuoso de algas marinas se selecciona de un extracto acuoso de algas pardas seleccionadas deFucus vesiculosus, Fucus evanescens, Fucus distichus, Fucus serratus, Pelvetia wrightii, Ascophyllum nodosum, Himanthalia Lorea, Bifurcaría bifurcata, Sargassum stenophyllum, Hizikia fusiforme, Durvillaea antárctica, Lessonia nigrescens, Lessonia trabeculata, Lessonia vadosa, Macrocystis pyrifera, Undaria pinnatifida, Padina pavonia, Laminaria angustata, Laminaria japónica, Ecklonia kurome, Adenocytis utricularis, Dictyota menstrualis, Spatoglossum schroederi y Chordaria flagelliformis;y

la proporción extracto de alga y extracto deAndrographis spes 10:90.

2. La composición para el uso de la reivindicación 1 donde el extracto de plantaAndrographis spse selecciona de un extracto deAndrographis paniculata, Andrographis affinis Nees, Andrographis beddomei, Andrographis echioides Nees, Andrographis elongata, Andrographis humifusa, Andrographis lineata Nees, Andrographis macrobotrys Nees, Andrographis nallamalayana, Andrographis neesiana, Andrographis ovata, Andrographis paniculata Nees, Andrographis rothii, Andrographis serpyllifolia, Andrographis viscosula Nees, Andrographis viscosulavar.explicatayAndrographis wightiana.

3. La composición de la reivindicación 1, donde el extracto acuoso de algas marinas se selecciona de un extracto acuoso deMacrocystes Pyrifera.

4. La composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores para uso en controlar y prevenir de infecciones producidas por microorganismos intracelulares en peces, donde las infecciones son producidas por microorganismos intracelulares seleccionados de piscirickettsia, virus de la septicemia hemorrágica viral (VHS), virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNv); virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV), Alphavirus del salmón (SAV), Anemia infecciosa del salmón (ISAv) y bacterias incluyendoFrancicella spyRenibacterium salmoninarum.

5. La composición para el uso de la reivindicación 4, donde dichas infecciones son producidas por microorganismos intracelulares seleccionados de piscirickettsiosis e IPNv.

6. La composición para el uso de la cláusula 5 donde dicha infección es producida por psicirickettsiosis.

7. La composición para el uso de la cláusula 6 donde dicha infección es producida por el virus de necrosis pancreática infecciosa (IPNv).

8. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde los peces son salmones, preferentemente, dichos peces sonSalmo salar.

9. Un alimento para peces para uso en controlar y prevenir infecciones causadas por microorganismos intracelulares en peces que comprende una composición veterinaria que comprende un extracto acuoso de alga marina con un porcentaje de fucoidano de 5% y un extracto deAndrographisde 10% donde la proporción extracto de alga y extracto deAndrographis spes 10:90 mezclado con alimento o dieta de peces y donde el extracto acuoso de algas marinas se selecciona de un extracto acuoso de algas pardas seleccionadas deFucus vesiculosus,Fucus evanescens,Fucus distichus, Fucus serratus, Pelvetia wrightii, Ascophyllum nodosum, Himanthalia Lorea, Bifurcaria bifurcata, Sargassum stenophyllum,Hizikia fusiforme,Durvillaea antárctica,Lessonia nigrescens, Lessonia trabeculata, Lessonia vadosa, Macrocystis pyrifera, Undaria pinnatifida, Padina pavonia, Laminaria angustata, Laminaria japónica, Ecklonia kurome, Adenocytis utricularis, Dictyota menstrualis, Spatoglossum schroederi y Chordaria flagelliformisy donde los microorganismos intracelulares son seleccionados de psicirickettsia, virus de la septicemia hemorrágica viral (HSV), virus de necrosis pancreática infecciosa (IPNv), virus de necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV), alfavirus de salmon (SAV), anemia infecciosa del salmón (SAV) y bacteria que incluyeFrancicella spyRenbacterium salmoninarum.

10. El alimento para peces para el uso de la reivindicación 9 que comprende mezclar el alimento o dieta de peces en una razón en el rango de 0,5 a 2,5 Kg por tonelada de alimento.

11. El alimento para preces para el uso de la reivindicación 10, que comprende mezclar la composición veterinaria con el alimento o dieta de los peces, en una razón de 1 Kg por tonelada de alimento.