ES3013301T3 - Methods for determining drug efficacy using ikzf3 (aiolos) - Google Patents

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Abstract

La invención proporciona el uso de las proteínas asociadas al cereblon IKZF1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos) como biomarcadores para indicar la eficacia de un compuesto para alterar la respuesta inmune en un sujeto y para evaluar la eficacia de un compuesto en el tratamiento de un cáncer o una enfermedad inflamatoria, así como un kit que comprende el compuesto y un medio para identificar los biomarcadores. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para determinar la eficacia de un fármaco utilizando ikzf3 (aiolos)
2 CAMPO
La invención se refiere en general a métodos para determinar la eficacia de un compuesto inmunomodulador. También se proporcionan aquí métodos para utilizar las proteínas asociadas al cereblon, la proteína 1 de dedos de zinc Ikaros (IKZF1, Ikaros) y la proteína de dedos de zinc Ikaros (IKZF3, Aiolos), como biomarcadores de sensibilidad clínica al cáncer y enfermedades inflamatorias, y la respuesta del paciente a los fármacos. Además se proporcionan kits para llevar a cabo los métodos.
3 ANTECEDENTES
3.1 Patobiología del cáncer
El cáncer se caracteriza principalmente por un aumento en el número de células anormales derivadas de un tejido normal dado, la invasión de tejidos adyacentes por estas células anormales, o la propagación linfática o sanguínea de células malignas a los ganglios linfáticos regionales y a sitios distantes (metástasis). Los datos clínicos y los estudios biológicos moleculares indican que el cáncer es un proceso de varias etapas que comienza con cambios preneoplásicos menores, que en determinadas condiciones pueden progresar a neoplasia. La lesión neoplásica puede evolucionar clonalmente y desarrollar una capacidad creciente de invasión, crecimiento, metástasis y heterogeneidad, especialmente en condiciones en las que las células neoplásicas escapan a la vigilancia inmunitaria del hospedante. Roitt, I., Brostoff, J and Kale, D., Immunology, 17.1-17.12 (3a ed., Mosby, St. Louis, Mo., 1993).
Existe una enorme variedad de cánceres que se describen detalladamente en la bibliografía médica. Los ejemplos incluyen cánceres de pulmón, colon, recto, próstata, mama, cerebro, sangre e intestino. La incidencia del cáncer continúa aumentando a medida que la población general envejece, aparecen nuevos cánceres, y crecen las poblaciones susceptibles (por ejemplo, las personas infectadas con SIDA o excesivamente expuestas a la luz solar). Sin embargo, las opciones para el tratamiento del cáncer son limitadas. Por ejemplo, en el caso de los cánceres de la sangre (por ejemplo, el mieloma múltiple), hay pocas opciones de tratamiento disponibles, especialmente cuando la quimioterapia convencional falla y el trasplante de médula ósea no es una opción. Por lo tanto, existe una enorme demanda de nuevos métodos y composiciones que puedan utilizarse para tratar a pacientes con cáncer.
Muchos tipos de cáncer están asociados con la formación de nuevos vasos sanguíneos, un proceso conocido como angiogénesis. Se han elucidado varios de los mecanismos implicados en la angiogénesis inducida por tumores. El más directo de estos mecanismos es la secreción por las células tumorales de citocinas con propiedades angiogénicas. Algunos ejemplos de estas citocinas incluyen el factor de crecimiento fibroblástico ácido y básico (a,b-FGF), la angiogenina, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), y el TNF-a. Alternativamente, las células tumorales pueden liberar péptidos angiogénicos a través de la producción de proteasas y la posterior rotura de la matriz extracelular en la que se almacenan algunas citocinas (por ejemplo, b-FGF). La angiogénesis también puede inducirse indirectamente a través del reclutamiento de células inflamatorias (particularmente macrófagos) y su posterior liberación de citocinas angiogénicas (por ejemplo, TNF-a, b-FGF).
El linfoma se refiere a los cánceres que se originan en el sistema linfático. El linfoma se caracteriza por neoplasias malignas de linfocitos: linfocitos B y linfocitos T ( es decir, células B y células T). El linfoma generalmente comienza en los ganglios linfáticos o en acumulaciones de tejido linfático en órganos que incluyen, pero no se limitan a, el estómago o los intestinos. El linfoma puede afectar la médula ósea y la sangre en algunos casos. El linfoma puede propagarse de un sitio a otras partes del cuerpo.
El tratamiento de diversas formas de linfomas se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.468.363. Dichos linfomas incluyen, pero no se limitan a, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma cutáneo de células B, linfoma de células B activado, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma de células del manto (MCL), linfoma de centro folicular, linfoma transformado, linfoma linfocítico de diferenciación intermedia, linfoma linfocítico intermedio (ILL), linfoma linfocítico difuso pobremente diferenciado (PDL), linfoma centrocítico, linfoma difuso de células pequeñas hendidas (DSCCL), linfomas periféricos de células T (PTCL), linfoma cutáneo de células T y linfoma de la zona del manto y linfoma folicular de bajo grado.
El linfoma no Hodgkin (LNH) es el quinto cáncer más común tanto en hombres como en mujeres en los Estados Unidos, con un estimado de 63.190 casos nuevos y 18.660 muertes en 2007. Jemal A, et al., CA Cancer J Clin 2007; 57(1):43-66. La probabilidad de desarrollar LNH aumenta con la edad, y la incidencia de LNH en los ancianos ha aumentado de manera constante en la última década, lo que genera preocupación por la tendencia al envejecimiento de la población estadounidense.Id.Clarke C A, et al., Cancer 2002; 94(7):2015-2023.
El linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) representa aproximadamente un tercio de los linfomas no Hodgkin. Aunque algunos pacientes con DLBCL se curan con quimioterapia tradicional, el resto muere a causa de la enfermedad. Los medicamentos contra el cáncer provocan una disminución rápida y persistente de los linfocitos, posiblemente por inducción directa de apoptosis en las células T y B maduras. Véase K. Stahnke y col., Blood 2001,98:3066-3073. Se ha demostrado que el recuento absoluto de linfocitos (ALC) es un factor pronóstico en el linfoma no Hodgkin folicular, y resultados recientes han sugerido que el ALC en el momento del diagnóstico es un factor pronóstico importante en el linfoma difuso de células B grandes.
Los linfomas difusos de células B grandes (DLBCL) se pueden dividir en subtipos moleculares distintos según sus patrones de perfil genético: DLBCL similar a células B de centro germinal (GCB-DLBCL), DLBCL similar a células B activadas (ABC-DLBCL) y linfoma mediastínico primario de células B (PMBL) o tipo no clasificado. Estos subtipos se caracterizan por diferencias claras en la supervivencia, la respuesta a la quimioterapia y la dependencia de la ruta de señalización, en particular la ruta NF-kB. Véase D. Kim et al., Journal of Clinical Oncology, 2007 ASCO Annual Meeting Proceedings Part I. Vol 25, No. 18S (Junio 20 Suplemento), 2007: 8082. Véase Bea S, et al., Blood 2005; 106: 3183-90; Ngo V.N. et al., Nature 2011; 470: 115-9). Estas diferencias han impulsado la búsqueda de estrategias de tratamiento más eficaces y específicas para cada subtipo de DLBCL.
La leucemia se refiere a neoplasias malignas de los tejidos formadores de sangre. Se describen diversas formas de leucemias, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.393.862 y en la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 60/380.842, presentada el 17 de mayo de 2002. Aunque se dice que los virus causan varias formas de leucemia en animales, las causas de la leucemia en seres humanos son en gran medida desconocidas. The Merck Manual, 944-952 (17a ed. 1999). La transformación a malignidad generalmente ocurre en una sola célula a través de dos o más etapas con posterior proliferación y expansión clonal. En algunas leucemias, se han identificado translocaciones cromosómicas específicas con una morfología de células leucémicas consistente y características clínicas especiales (por ejemplo, translocaciones de 9 y 22 en la leucemia mielocítica crónica, y de 15 y 17 en la leucemia promielocítica aguda). Las leucemias agudas son predominantemente poblaciones de células indiferenciadas y las leucemias crónicas formas de células más maduras.
Las leucemias agudas se dividen en tipos linfoblásticos (LLA) y no linfoblásticos (LLNA). The Merck Manual, 946 949 (17a ed. 1999). Pueden subdividirse además según su aspecto morfológico y citoquímico según la clasificación franco-americana-británica (FAB) o según su tipo y grado de diferenciación. El uso de anticuerpos monoclonales específicos contra células B y T y antígenos mieloides es muy útil para la clasificación. La LLA es una enfermedad predominantemente infantil que se establece mediante hallazgos de laboratorio y examen de médula ósea. La LLNA, también conocida como leucemia mielógena aguda o leucemia mieloide aguda (LMA), se presenta a todas las edades y es la leucemia aguda más común entre los adultos; es la forma generalmente asociada con la irradiación como agente causal.
Las leucemias crónicas se describen como linfocíticas (LLC) o mielocíticas (LMC). The Merck Manual, 949-952 (17a ed. 1999). La LLC se caracteriza por la aparición de linfocitos maduros en la sangre, la médula ósea y los órganos linfoides. El sello distintivo de la LLC es una linfocitosis absoluta sostenida (> 5.000/pl) y un aumento de linfocitos en la médula ósea. La mayoría de los pacientes con LLC también presentan expansión clonal de linfocitos con características de células B. La LLC es una enfermedad de mediana o avanzada edad. En la LMC, el rasgo característico es el predominio de células granulocíticas de todos los estadios de diferenciación en la sangre, la médula ósea, el hígado, el bazo y otros órganos. En el paciente sintomático en el momento del diagnóstico, el recuento total de glóbulos blancos suele ser de unos 200.000/pl, pero puede alcanzar 1.000.000/pl. La LMC es relativamente fácil de diagnosticar debido a la presencia del cromosoma Filadelfia.
Es bien sabido que las células del estroma de la médula ósea favorecen la progresión de la enfermedad LLC y la resistencia a la quimioterapia. Interrumpir las interacciones entre las células LLC y las células del estroma es una diana adicional de la quimioterapia para la LLC.
Además de la categorización aguda y crónica, las neoplasias también se clasifican según las células que dan lugar a dicho trastorno en precursoras o periféricas. Véase, por ejemplo, la publicación de patente de EE.UU. n.° 2008/0051379. Las neoplasias precursoras incluyen las LLA y los linfomas linfoblásticos y se presentan en los linfocitos antes de que se hayan diferenciado en células T o B. Las neoplasias periféricas son aquellas que ocurren en los linfocitos que se han diferenciado en células T o B. Dichas neoplasias periféricas incluyen, pero no se limitan a, LLC de células B, leucemia prolinfocítica de células B, linfoma linfoplasmocítico, linfoma de células del manto, linfoma folicular, linfoma de células B de la zona marginal extranodal de tejido linfoide asociado a las mucosas y linfoma de la zona marginal nodal, linfoma de la zona marginal esplénica, leucemia de células peludas, plasmocitoma, linfoma difuso de células B grandes y linfoma de Burkitt. En más del 95 por ciento de los casos de LLC, la expansión clonal es de un linaje de células B. Véase Cancer: Principles & Practice of Oncology (3a edición) (1989) (págs. 1843-1847). En menos del 5 por ciento de los casos de LLC, las células tumorales tienen un fenotipo de células T. Sin embargo, a pesar de estas clasificaciones, el deterioro patológico de la hematopoyesis normal es el sello distintivo de todas las leucemias.
El mieloma múltiple (MM) es un cáncer de las células plasmáticas en la médula ósea. Normalmente, las células plasmáticas producen anticuerpos y desempeñan un papel clave en la función inmunológica. Sin embargo, el crecimiento descontrolado de estas células provoca dolor óseo y fracturas, anemia, infecciones y otras complicaciones. El mieloma múltiple es la segunda neoplasia hematológica más común, aunque las causas exactas del mieloma múltiple siguen siendo desconocidas. El mieloma múltiple provoca niveles elevados de proteínas en la sangre, la orina y los órganos, incluidas, pero no se limitan a, la proteína M y otras inmunoglobulinas (anticuerpos), albúmina y beta-2-microglobulina. La proteína M, abreviatura de proteína monoclonal, también conocida como paraproteína, es una proteína particularmente anormal producida por las células plasmáticas del mieloma y se puede encontrar en la sangre o la orina de casi todos los pacientes con mieloma múltiple.
Los síntomas esqueléticos, incluido el dolor óseo, se encuentran entre los síntomas clínicamente más significativos del mieloma múltiple. Las células plasmáticas malignas liberan factores estimulantes de osteoclastos (incluidos IL-1, IL-6 y TNF) que provocan la lixiviación de calcio de los huesos, causando lesiones líticas; la hipercalcemia es otro síntoma. Los factores estimulantes de los osteoclastos, también conocidos como citocinas, pueden prevenir la apoptosis o muerte de las células de mieloma. El cincuenta por ciento de los pacientes tienen lesiones esqueléticas relacionadas con el mieloma detectables radiológicamente en el momento del diagnóstico. Otros síntomas clínicos comunes del mieloma múltiple incluyen polineuropatía, anemia, hiperviscosidad, infecciones e insuficiencia renal.
Es bien sabido que las células del estroma de la médula ósea favorecen la progresión de la enfermedad del mieloma múltiple y la resistencia a la quimioterapia. Interrumpir las interacciones entre las células del mieloma múltiple y las células del estroma es una diana adicional de la quimioterapia para el mieloma múltiple.
El síndrome mielodisplásico (SMD) se refiere a un grupo diverso de trastornos de las células madre hematopoyéticas. El SMD se caracteriza por una médula celular con morfología y maduración deterioradas (dismielopoyesis), citopenias en sangre periférica y un riesgo variable de progresión a leucemia aguda, resultante de una producción ineficaz de células sanguíneas. Véase The Manual Merck 953 (17.a ed., 1999) y List et al., 1990, J Clin. Oncol. 8:1424. El tratamiento del SMD mediante compuestos inmunomoduladores se describe en la publicación de patente de EE. UU. n.° 2004/0220144.
Los tumores sólidos son masas anormales de tejido que pueden contener quistes o áreas líquidas, pero generalmente no lo hacen. Los tumores sólidos pueden ser benignos (no cancerosos) o malignos (cancerosos). Los diferentes tipos de tumores sólidos reciben su nombre según el tipo de células que los forman. Los ejemplos de tipos de tumores sólidos incluyen, pero no se limitan a, melanoma maligno, carcinoma suprarrenal, carcinoma de mama, cáncer de células renales, carcinoma de páncreas, carcinoma de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) y carcinoma de origen primario desconocido. Los medicamentos que se administran comúnmente a pacientes con diversos tipos o estadios de tumores sólidos incluyen, pero no se limitan a, celebrex, etopósido, ciclofosfamida, docetaxel, apecitabina, IFN, tamoxifeno, IL-2, GM-CSF o una combinación de los mismos.
Aunque los pacientes que logran una remisión completa después de la terapia inicial tienen buenas posibilidades de curación, menos del 10% de los que no responden o recaen logran una cura o una respuesta que dura más de 3 años. Véase Cerny T, et al., Ann Oncol 2002; 13 Suppl 4:211-216.
Se sabe que el rituximab agota las células B normales del hospedante. Véase M. Aklilu et al., Annals of Oncology 15:1109-1114, 2004. Los efectos inmunológicos a largo plazo de la depleción de células B con rituximab y las características del grupo de células B en reconstitución en pacientes con linfoma no están bien definidos, a pesar del uso generalizado de esta terapia. Véase Jennifer H. Anolik et al., Clinical Immunology, vol. 122, número 2, febrero de 2007, páginas 139-145.
El enfoque para los pacientes con enfermedad recidivante o refractaria se basa en gran medida en tratamientos experimentales seguidos de trasplante de células madre, que pueden no ser apropiados para pacientes con un estado funcional deficiente o edad avanzada. Por lo tanto, existe una enorme demanda de nuevos métodos que puedan utilizarse para tratar a pacientes con LNH.
El vínculo entre el cáncer y un metabolismo celular alterado está bien establecido. Véase Cairns, RA, et al. Nature Rev., 2011, 11:85-95. La comprensión del metabolismo de las células tumorales y los cambios genéticos asociados puede conducir a la identificación de métodos mejorados de tratamiento del cáncer.Id.Por ejemplo, la supervivencia y proliferación de células tumorales a través del aumento del metabolismo de la glucosa se ha relacionado con la ruta de PIK3, mediante la cual las mutaciones en genes supresores de tumores tales como PTEN activan el metabolismo de las células tumorales.Id.AKT1 (también conocida como PKB) estimula el metabolismo de la glucosa asociado con el crecimiento de células tumorales mediante diversas interacciones con PFKFB3, ENTPD5, mTOR y TSC2 (también conocida como tuberina).Id.
Los factores de transcripción HIF1 y HIF2 son en gran parte responsables de la respuesta celular a las condiciones de bajo oxígeno a menudo asociadas con los tumores.Id.Una vez activado, HIF1 promueve la capacidad de las células tumorales para realizar la glucólisis.Id.Por tanto, la inhibición de HIF1 puede retardar o revertir el metabolismo de las células tumorales. La activación de HIF1 se ha relacionado con PI3K, proteínas supresoras de tumores tales como VHL, succinato deshidrogenasa (SDH) y fumarato hidratasa.Id.El factor de transcripción oncogénico MYC también se ha relacionado con el metabolismo de las células tumorales, específicamente con la glucólisis.Id.MYC también promueve la proliferación celular a través de las rutas metabólicas de la glutamina.Id.
La proteína cinasa activada por AMP (AMPK) funciona como un punto de control metabólico que las células tumorales deben superar para proliferar.Id.Se han identificado varias mutaciones que suprimen la señalización de AMPK en células tumorales. Véase Shackelford, D.B. y Shaw, RJ, Nature Rev. Cancer, 2009, 9: 563-575. Se ha identificado a STK11 como un gen supresor de tumores relacionado con el papel de AMPK. Véase Cairns, RA, et al. Nature Rev., 2011, 11 :85-95.
El factor de transcripción p53, un supresor de tumores, también tiene un papel importante en la regulación del metabolismo celular.Id.La pérdida de p53 en las células tumorales puede contribuir significativamente a los cambios en el metabolismo de las células tumorales en la ruta glucolítica.Id.El factor de transcripción OCT1, otra diana potencial de los agentes quimioterapéuticos, puede cooperar con p53 en la regulación del metabolismo de las células tumorales.Id.
El piruvato quinaso M2 (PKM2) promueve cambios en el metabolismo celular que confieren ventajas metabólicas a las células cancerosas al apoyar la proliferación celular.Id.Por ejemplo, se ha descubierto que las células de cáncer de pulmón que expresan PKM2 en lugar de PKM1 tienen dicha ventaja.Id.En la clínica, se ha identificado que PKM2 está sobreexpresado en varios tipos de cáncer.Id.Por lo tanto, PKM2 puede ser un biomarcador útil para la detección temprana de tumores.
Las mutaciones en las isocitrato deshidrogenasas IDH1 e IDH2 se han relacionado con la tumorigénesis, específicamente, en el glioblastoma y la leucemia mieloide aguda. Véase Mardis, ER et al., N. Engl. J. Med., 2009, 361: 1058-1066; Parsons, D.W. et al., Science, 2008, 321: 1807-1812.
La incidencia del cáncer continúa aumentando a medida que la población general envejece, aparecen nuevos cánceres y crecen las poblaciones susceptibles (por ejemplo, las personas infectadas con SIDA, los ancianos o las expuestas excesivamente a la luz solar). Por lo tanto, existe una enorme demanda de nuevos métodos, tratamientos y composiciones que puedan usarse para tratar a pacientes con cáncer, incluidos, pero no se limitan a, aquellos con linfoma, LNH, mieloma múltiple, LMA, leucemias y tumores sólidos.
Una variedad de otras enfermedades y trastornos también están asociados o se caracterizan por una angiogénesis no deseada. Por ejemplo, la angiogénesis mejorada o no regulada se ha relacionado con una serie de enfermedades y afecciones médicas, incluidas, pero no se limitan a, enfermedades neovasculares oculares, enfermedades neovasculares coroideas, enfermedades neovasculares de la retina, rubeosis (neovascularización del ángulo), enfermedades virales, enfermedades genéticas, enfermedades inflamatorias, enfermedades alérgicas, fibrosis, artritis y enfermedades autoinmunes. Los ejemplos de dichas enfermedades y afecciones incluyen, pero no se limitan a: retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, rechazo del injerto de córnea, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental y vitreorretinopatía proliferativa.
En consecuencia, los compuestos que pueden controlar y/o inhibir la angiogénesis no deseada o inhibir la producción de ciertas citocinas, incluido el TNF-a, pueden ser útiles en el tratamiento y la prevención de diversas enfermedades y afecciones.
3.2 Enfermedades inflamatorias
La inflamación juega un papel fundamental en las defensas del hospedante y en la progresión de las enfermedades inmunomediadas. La respuesta inflamatoria se inicia en respuesta a una lesión (por ejemplo, traumatismo, isquemia y partículas extrañas) y una infección (por ejemplo, infección bacteriana o viral) mediante una cascada compleja de eventos, que incluye mediadores químicos (por ejemplo, citocinas y prostaglandinas) y células inflamatorias (por ejemplo, leucocitos). La respuesta inflamatoria se caracteriza por un aumento del flujo sanguíneo, una mayor permeabilidad capilar y la afluencia de células fagocíticas. Estos eventos provocan hinchazón, enrojecimiento, calor (patrones de calor alterados), y formación de pus en el sitio de la lesión o infección.
Las citocinas y las prostaglandinas controlan la respuesta inflamatoria y se liberan en una cascada ordenada y autolimitada en la sangre o los tejidos afectados. Esta liberación de citocinas y prostaglandinas aumenta el flujo sanguíneo al área de la lesión o infección, y puede provocar enrojecimiento y calor. Algunas de estas sustancias químicas provocan una fuga de líquido hacia los tejidos, lo que produce hinchazón. Este proceso protector puede estimular los nervios y causar dolor. Estos cambios, cuando ocurren durante un período limitado en la zona relevante, actúan en beneficio del cuerpo.
El factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) es una citocina que es liberada principalmente por los fagocitos mononucleares en respuesta a inmunoestimulantes. El TNF-a es capaz de mejorar la mayoría de los procesos celulares, tales como la diferenciación, el reclutamiento, la proliferación y la degradación proteolítica. En niveles bajos, el TNF-a confiere protección contra agentes infecciosos, tumores y daño tisular. Pero el TNF-a también tiene un papel en muchas enfermedades. Cuando se administra a mamíferos o humanos, el TNF-a causa o agrava inflamación, fiebre, efectos cardiovasculares, hemorragia, coagulación y respuestas de fase aguda similares a las observadas durante infecciones agudas y estados de shock. aumentada o no regulada de TNF-a se ha relacionado con una serie de enfermedades y afecciones médicas, por ejemplo, cánceres, tales como tumores sólidos y tumores transmitidos por la sangre; enfermedades cardíacas, como insuficiencia cardíaca congestiva; y enfermedades virales, genéticas, inflamatorias, alérgicas y autoinmunes.
El adenosín 3',5'-monofosfato cíclico (AMPc) también desempeña un papel en muchas enfermedades y afecciones, tales como por ejemplo, pero no se limitan a, el asma, la inflamación y otras afecciones (Lowe y Cheng, Drugs of the Future, 17(9), 799-807, 1992). Se ha demostrado que la elevación de AMPc en los leucocitos inflamatorios inhibe su activación y la posterior liberación de mediadores inflamatorios, incluidos TNF-a y NF-kB. El aumento de los niveles de AMPc también conduce a la relajación del músculo liso de las vías respiratorias.
Una interacción delicada y bien equilibrada entre los elementos inmunes humorales y celulares en la respuesta inflamatoria permite la eliminación de agentes dañinos y el inicio de la reparación del tejido dañado. Cuando se altera esta interacción delicadamente equilibrada, la respuesta inflamatoria puede provocar daños considerables al tejido normal y puede ser más dañina que la agresión original que inició la reacción. En estos casos de respuestas inflamatorias no controladas, se necesita intervención clínica para prevenir el daño tisular y la disfunción orgánica. Enfermedades tales como la psoriasis, la artritis reumatoide, la osteoartritis, la artritis psoriásica, la enfermedad de Crohn, el asma, las alergias o la enfermedad inflamatoria intestinal, se caracterizan por una inflamación crónica. Las enfermedades inflamatorias tales como la artritis, las afecciones artríticas relacionadas (por ejemplo, osteoartritis, artritis reumatoide y artritis psoriásica), la enfermedad inflamatoria intestinal (por ejemplo, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), la sepsis, la psoriasis, la dermatitis atópica, la dermatitis de contacto y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, las enfermedades pulmonares inflamatorias crónicas también son dolencias prevalentes y problemáticas. La producción aumentada o no regulada de TNF-a juega un papel central en la respuesta inflamatoria y la administración de sus antagonistas bloquea las respuestas crónicas y agudas en modelos animales de enfermedad inflamatoria.
La artritis es una enfermedad autoinmune sistémica que puede referirse a un grupo de afecciones que implican daño a las articulaciones del cuerpo. Hay más de 100 formas diferentes de artritis. La forma más común es la osteoartritis (enfermedad articular degenerativa) y otras formas de artritis son la artritis reumatoide, la artritis psoriásica y enfermedades autoinmunes relacionadas tales como el lupus y la gota. La artritis reumatoide se caracteriza por una inflamación crónica de las articulaciones. Tanto el tejido como el líquido sinovial son invadidos por células inflamatorias que conducen a la producción de citocinas. Las células T y los monocitos que se infiltran en las articulaciones muestran una mayor activación de los marcadores de respuesta inmune tipo 1 y 2.
La artritis psoriásica es una enfermedad artrítica inflamatoria crónica que afecta la piel, las articulaciones, los sitios de inserción de tendones, ligamentos y fascia. Gladman, Current Opinion in Rheumatology, ''Current concepts in psoriatic arthritis," 2002, 14:361-366, y Ruddy et al., Rheumatology, vol. 2., capítulo 71, página 1071,6a ed., 2001. La artritis psoriásica se asocia comúnmente con la psoriasis.Id.Aproximadamente el 7% de los pacientes con psoriasis desarrollan artritis psoriásica. The Merck Manual, 448 (17a ed., 1999). La artritis psoriásica puede presentarse en una variedad de patrones clínicos. Hay cinco patrones generales de artritis psoriásica: artritis de las articulaciones interfalángicas distales, artritis destructiva, poliartritis simétrica indistinguible de la artritis reumatoide, oligoartritis asimétrica y espondiloartropatía. Ruddy et al., página 1073. La psoriasis parece preceder a la aparición de la artritis psoriásica en el 60-80% de los pacientes. Ocasionalmente, la artritis y la psoriasis aparecen simultáneamente. Las erupciones cutáneas pueden estar precedidas de artropatía.
La psoriasis es una enfermedad autoinmune sistémica crónica que aparece en la piel. Existen cinco tipos de psoriasis: en placas, guttata, inversa, pustulosa y eritrodérmica. La forma más común, la psoriasis en placas, se observa habitualmente como manchas escamosas de color rojo y blanco que aparecen en la primera capa superior de la epidermis. Sin embargo, algunos pacientes no presentan síntomas dermatológicos. En la psoriasis en placas, la piel se acumula rápidamente en estos sitios, lo que le da un aspecto blanco plateado. Las placas aparecen con frecuencia en la piel de los codos y las rodillas, pero pueden afectar cualquier zona, incluido el cuero cabelludo, las palmas de las manos y las plantas de los pies y los genitales. A diferencia del eczema, la psoriasis es más probable que se encuentre en el lado externo de la articulación. El trastorno es una afección crónica recurrente que varía en gravedad desde parches localizados menores hasta una cobertura corporal completa. Las uñas de las manos y de los pies se ven frecuentemente afectadas (distrofia ungueal psoriásica) y puede observarse como un síntoma aislado. La psoriasis también puede causar inflamación de las articulaciones, lo que se conoce como artritis psoriásica. En la psoriasis, una hipótesis es que las células T se activan, migran a la dermis y desencadenan la liberación de citocinas, en particular TNF-a, lo que provoca inflamación y la rápida proliferación de queratinocitos.
3.3 Cereblon
Cereblon (CRBN) es una proteína de 442 aminoácidos conservada desde la planta hasta el ser humano. En los seres humanos, el gen CRBN ha sido identificado como un gen candidato de un retraso mental autosómico recesivo no sindrómico (ARNSMR). Véase Higgins, J.J. et al., Neurology, 2004, 63:1927-1931. Inicialmente, CRBN se caracterizó como una nueva proteína que contenía RGS que interactuaba con una proteína del canal de potasio activado por calcio (SLO1) en el cerebro de rata, y luego se demostró que interactuaba con un canal de cloruro dependiente de voltaje (CIC-2) en la retina con a MPk 7 y DDB1. Véase Jo, S. et al., J. Neurochem, 2005, 94:1212-1224; Hohberger B. et al., FEBS Lett, 2009, 583:633-637; Angers S. et al., Nature, 2006, 443:590-593. DDB1 se identificó originalmente como una proteína de reparación por escisión de nucleótidos que se asocia con la proteína de unión al ADN dañada 2 (DDB2). Su actividad defectuosa provoca el defecto de reparación en los pacientes con xeroderma pigmentoso grupo de complementación E (XPE). DDB1 también parece funcionar como un componente de numerosos complejos de ubiquitina-proteína ligasa DCX (DDB1-CUL4-X-box) E3 distintos que median la ubiquitinación y la posterior degradación proteasomal de las proteínas diana. El CRBN también se ha identificado como una diana para el desarrollo de agentes terapéuticos para enfermedades de la corteza cerebral. Véase el documento WO 2010/137547 A1.
Recientemente se ha identificado al Cereblon como una diana molecular clave que se une a la talidomida y causa defectos de nacimiento. Véase Ito, T. et al., Science, 2010, 327:1345-1350. Se descubrió que DDB1 interactuaba con CRBN y, por lo tanto, se asociaba indirectamente con la talidomida. Además, la talidomida fue capaz de inhibir la autoubiquitinación de CRBN in vitro, lo que sugiere que la talidomida es un inhibidor de la ubiquitina-ligasa E3.Id.Es importante destacar que esta actividad fue inhibida por la talidomida en células de tipo salvaje, pero no en células con sitios de unión de CRBN mutados que impiden la unión de la talidomida.Id.El sitio de unión de la talidomida se cartografió a una región C-terminal de 104 aminoácidos altamente conservada en CRBN.Id.Los mutantes puntuales individuales en CRBN, Y384A y W386A fueron defectuosos para la unión a la talidomida, y el mutante puntual doble tuvo la actividad de unión a la talidomida más baja.Id.Se confirmó un vínculo entre el CRBN y el efecto teratogénico de la talidomida en modelos animales de pez cebra y embriones de pollo.Id.
Aún queda por establecer si la unión a CRBN, al complejo ubiquitina-ligasa CRBN E3 o a uno o más sustratos de CRBN es necesaria para los efectos beneficiosos de la talidomida y otros fármacos. La comprensión de estas interacciones con la talidomida y otros fármacos permitirá definir los mecanismos moleculares de eficacia y/o toxicidad y puede conducir a fármacos con perfiles de eficacia y toxicidad mejorados.
La publicación de Sun, J. et al., titulada "Lack of the transcriptional coactivator OBF-1 prevents the development of systemic lupus erythematosus-like phenotypes in Aiolos mutant mice", (The Journal of Immunology, 15 de febrero de 2003, vol. 170, no. 4, ISSN 0022-1767, páginas 1699 - 1706) revela que los ratones que carecen del factor de transcripción de dedos de zinc Aiolos desarrollan los síntomas del lupus eritematoso sistémico (LES) humano, lo que implica a Aiolos como un posible gen candidato para el LES.
La publicación de Zhu, Y.X., et al., titulada "Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide", (Blood, (3 de noviembre de 2011), vol. 118, n.° 18, doi:10.1182/blood-2011-05-356063, ISSN 0006-4971, páginas 4771 - 4779) revela que el cereblon es una diana principal de lenalidomida y pomalidomida, y su presencia es esencial para la actividad antimieloma de estos fármacos.
3.4 Compuestos
Se han realizado varios estudios con el objetivo de proporcionar compuestos que puedan usarse de forma segura y eficaz para tratar enfermedades asociadas con la producción anormal de TNF-a. Véase, por ejemplo, Marriott, JB, et al., Expert Opin. Biol. Ther., 2001, 1(4): 1-8; G.W. Muller, et al., J Med Chem., 1996, 39(17): 3238-3240; y G.W. Muller, et al., Bioorg & Med Chem Lett., 1998, 8: 2669-2674). Algunos estudios se han centrado en un grupo de compuestos seleccionados por su capacidad para inhibir potentemente la producción de TNF-a por PBMC estimuladas con LPS. L.G. Corral, et al., Ann. Rheum. Dis., 1999, 58:(Suppl I) 1107-1113. Estos compuestos muestran no sólo una potente inhibición del TNF-a sino también una marcada inhibición de la producción de IL1p e IL12 en monocitos inducida por LPS. La IL6 inducida por LPS también es inhibida por dichos compuestos, aunque parcialmente. Estos compuestos son potentes estimuladores de la IL10 inducida por LPS.Id.
Los compuestos para los métodos proporcionados aquí incluyen, pero no se limitan a, las 2-(2,6-dioxopiperidin-3-il) ftalimidas sustituidas y los 2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1-oxoisoindoles sustituidos descritos en las patentes de EE. UU. n.° 6.281.230 y 6.316.471, ambos de G.W. Muller, et al. Otros compuestos específicos descritos aquí pertenecen a una clase de isoindol-imidas descritas en las patentes de EE. UU. núms. 6.395.754, 6.555.554, 7.091.353, publicación de patente de EE. UU. n.° 2004/0029832, y publicación internacional n.° WO 98/54170.
La talidomida, la lenalidomida y la pomalidomida han mostrado respuestas notables en pacientes con mieloma múltiple, linfoma y otras enfermedades hematológicas tal como el síndrome mielodisplásico. Véase Galustian C, et al., Expert Opin Pharmacother., 2009, 10:125-133. Estos fármacos muestran un amplio espectro de actividad, que incluye propiedades antiangiogénicas, modulación de citocinas proinflamatorias, coestimulación de células T, aumento de la toxicidad de las células NK, efectos antitumorales directos y modulación de la diferenciación de células madre.
Por ejemplo, la talidomida y la lenalidomida han surgido como opciones importantes para el tratamiento del mieloma múltiple en pacientes recién diagnosticados, en pacientes con enfermedad avanzada que no han respondido a la quimioterapia o al trasplante, y en pacientes con mieloma múltiple recidivante o refractario. Lenalidomida en combinación con dexametasona ha sido aprobado para el tratamiento de pacientes con mieloma múltiple que han recibido al menos una terapia previa. La pomalidomida también puede administrarse en combinación con dexametasona. La publicación de patente de EE. UU. n.° 2004/0029832 A1 revela el tratamiento del mieloma múltiple.
Otro compuesto proporcionado aquí es 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona ("Compuesto A"), que tiene la siguiente estructura:
o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo; o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo del mismo.
El Compuesto A se puede preparar de acuerdo con los métodos descritos en los Ejemplos proporcionados aquí o como se describe en la patente de EE. UU. n.° 7.635.700. El compuesto también puede sintetizarse de acuerdo con otros métodos evidentes para aquellos expertos en la técnica basándose en la enseñanza aquí contenida. En ciertas realizaciones, el Compuesto A está en una forma cristalina descrita en la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/451,806, presentada el 11 de marzo de 2011. En algunas realizaciones, la sal de hidrocloruro del Compuesto A se utiliza en los métodos proporcionados aquí. Los métodos para tratar, prevenir y/o controlar cánceres y otras enfermedades utilizando el Compuesto A se describen en la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/451,995, presentada el 11 de marzo de 2011.
En ciertas realizaciones, se proporciona aquí 3-(4-((4-(morfolinometil)bencil)oxi)-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona. En una realización, se proporciona aquí el estereoisómero (S) de 3-(4-((4-(morfolinometil)bencil)oxi)-1 -oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona ("Compuesto B"). En la publicación de patente de EE. UU. n.° 2011/019615 se han descrito compuestos racémicos de 3-(4-((4-(morfolinometil)bencil)oxi)-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y otros compuestos de 4'-arilmetoxi isoindolina y métodos para prepararlos. El Compuesto B tiene la siguiente estructura:
Los métodos convencionales para evaluar los efectos de los compuestos inmunomoduladores requieren ensayos celulares vivos o criterios de valoración clínicos prolongados. Estas pruebas celulares son engorrosas y a menudo requieren el uso de diversos estimulantes (por ejemplo, lipopolisacárido o anticuerpo anti-CD3). Se evalúan criterios de valoración indirectos, tal como la producción de citocinas, que puede verse influida por múltiples rutas. Además, la eficacia clínica de estos compuestos no se pudo predecir correctamente, ya que sólo se pudo medir en términos de respuesta del paciente, que generalmente requiere un mínimo de varios meses de tratamiento. En vista de las deficiencias de los métodos convencionales, existe la necesidad de desarrollar un método eficiente, sensible y preciso para detectar, cuantificar y caracterizar la actividad farmacodinámica de los compuestos inmunomoduladores.
4 SUMARIO DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la invención proporciona un método para determinar si un compuesto es capaz de alterar la respuesta inmune en un sujeto, que comprende: (a) poner en contacto una primera célula del sujeto con el compuesto in vitro; (b) obtener una primera muestra de la primera célula de la etapa (a); (c) determinar los niveles de IKZF1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos) en la primera muestra; y (d) comparar los niveles de IKZF1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos) de la etapa (c) con los niveles de referencia de IKZF 1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos), respectivamente, obtenidos a partir de una muestra de referencia, en el que una disminución en el nivel de IKZF1 (Ikaros) en comparación con el nivel de referencia de IKZF 1 (Ikaros) y una disminución en el nivel de IKZF3 (Aiolos) en comparación con el nivel de referencia de IKZF3 (Aiolos) son indicativas de la eficacia del compuesto para alterar la respuesta inmune en el sujeto.
En una realización, la primera célula es una célula mononuclear de sangre periférica, una célula B, una célula T, un monocito o un granulocito. En otra realización, la muestra de referencia se prepara utilizando una segunda célula que no está en contacto con el compuesto; en la que la segunda célula es del mismo tipo que la primera célula.
En un segundo aspecto, la invención proporciona un método para evaluar la eficacia de un compuesto en el tratamiento de un cáncer o una enfermedad inflamatoria, que comprende: (a) determinar los niveles de IKZF1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos) en una primera muestra de un sujeto que tiene cáncer o enfermedad inflamatoria a quien se le ha administrado el compuesto; y (b) comparar los niveles de IKZF 1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos) de la etapa (a) con los niveles de referencia de IKZF 1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos), respectivamente, obtenidos a partir de una muestra de referencia, en el que una disminución en el nivel de IKZF 1 (Ikaros) en comparación con el nivel de referencia de IKZF 1 (Ikaros) y una disminución en el nivel de IKZF3 (Aiolos) en comparación con el nivel de referencia de IKZF3 (Aiolos) son indicativas de la eficacia del compuesto en el tratamiento del cáncer o la enfermedad inflamatoria.
En una realización, la primera muestra se obtiene de una biopsia de tumor, biopsia de ganglio o biopsia de médula ósea, bazo, hígado, cerebro o mama. En otra realización, la muestra de referencia se prepara utilizando: (i) una segunda muestra obtenida del sujeto antes de la administración del compuesto al sujeto; y en la que la segunda muestra proviene de la misma fuente que la primera muestra; o (ii) una segunda muestra obtenida de un sujeto sano que no tiene cáncer o enfermedad inflamatoria; y en la que la segunda muestra proviene de la misma fuente que la primera muestra. En otra realización, el cáncer o la enfermedad inflamatoria es mieloma múltiple, leucemia linfocítica crónica, linfoma no Hodgkin, linfoma de células del manto, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren o esclerosis sistémica.
En una realización, la determinación de los niveles de IKZF1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos) en la primera muestra comprende: (i) poner en contacto las proteínas dentro de la primera muestra con un primer anticuerpo IKZF1 (Ikaros) y un primer anticuerpo IKZF3 (Aiolos) que se unen inmunoespecíficamente a IKZF1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos), respectivamente; (ii) poner en contacto las proteínas unidas al primer anticuerpo IKZF1 (Ikaros) y al primer anticuerpo IKZF3 (Aiolos) con un segundo anticuerpo IKZF1 (Ikaros) con un marcador detectable y un segundo anticuerpo IKZF3 (Aiolos) con un marcador detectable, en la que el segundo anticuerpo IKZF1 (Ikaros) y el segundo anticuerpo IKZF3 (Aiolos) se unen inmunoespecíficamente a IKZF1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos), respectivamente, y en la que el segundo anticuerpo IKZF1 (Ikaros) y el segundo anticuerpo IKZF3 (Aiolos) se unen inmunoespecíficamente a un epítopo diferente en IKZF1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos), respectivamente, del primer anticuerpo IKZF1 (Ikaros) y el primer anticuerpo IKZF3 (Aiolos), respectivamente; (iii) detectar la presencia del segundo anticuerpo IKZF1 (Ikaros) y del segundo anticuerpo IKZF3 (Aiolos) unidos a las proteínas; y (iv) determinar los niveles de IKZF1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos) en función de la cantidad de marcador detectable en el segundo anticuerpo IKZF 1 (Ikaros) y la cantidad de marcador detectable en el segundo anticuerpo IKZF3 (Aiolos).
En otra realización, la determinación de los niveles de IKZF1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos) en la primera muestra comprende: (i) poner en contacto el ARN dentro de la primera muestra con un cebador que comprende una secuencia que se une específicamente al ARN para generar una primera molécula de ADN que tiene una secuencia complementaria al ARN; (ii) amplificar el ADN correspondiente a segmentos de genes que codifican dichos IKZF1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos), respectivamente; y (iii) determinar los niveles de ARN de dichos IKZF1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos) basándose en las cantidades del<a>D<n>amplificado.
En otra realización, el compuesto es talidomida, lenalidomida, pomalidomida, 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)piperidina-2,6-diona o 3-(4-((4-(morfolinometil)bencil)oxi)-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona, un estereoisómero del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo del mismo.
En otra realización, dicho IKZF3 (Aiolos) tiene un peso molecular de proteína de 58 kDa o 42 kDa medido mediante análisis de transferencia Western.
En un tercer aspecto, la invención proporciona un kit para determinar si un compuesto es capaz de alterar la respuesta inmune en un sujeto, o para evaluar la eficacia de un compuesto en el tratamiento de un cáncer o una enfermedad inflamatoria, en la que el kit comprende: (i) el compuesto; (ii) un soporte sólido; y (iii) un medio para detectar los niveles de expresión de proteínas o los niveles de ARNm de IKZF1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos) en una muestra biológica.
En una realización, el compuesto es talidomida, lenalidomida, pomalidomida, 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)piperidina-2,6-diona o 3-(4-((4-(morfolinometil)bencil)oxi)-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona, un estereoisómero del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo del mismo. En otra realización, los medios comprenden PCR cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR), micromatrices, citometría de flujo o inmunofluorescencia. En otra realización, el kit comprende además un dispositivo para administrar el compuesto al sujeto.
5 BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra el efecto del Compuesto B en la inhibición de la expresión de Aiolos en poblaciones de linfocitos (panel izquierdo), granulocitos (panel superior) y monocitos (panel derecho) presentados como un porcentaje del control de DMSO, n = 3.
La Figura 2 muestra que el Compuesto B inhibe significativamente la expresión de Aiolos en células B CD20+ como porcentaje del control de DMSO, n = 3.
La Figura 3 muestra que el Compuesto B inhibe significativamente la expresión de Aiolos en células T CD3+ como porcentaje del control de DMSO, n = 3.
La Figura 4 muestra el muestreo de PD en el estudio del régimen de dosis del Compuesto B en primates no humanos.
La Figura 5 muestra el Compuesto B en un estudio de pauta posológica de respuesta de anticuerpos dependiente de T (TDAR) en monos. El panel superior muestra el título de varios tratamientos: vehículo, QD, EoD, 2x/semana y 4 días sí/3 días no. El esquema inferior representa la pauta posológica .
La Figura 6 muestra los grupos de tratamiento 1 a 4 en el estudio de monos cangrejeros.
La Figura 7 muestra la transferencia Western de Aiolos en sangre entera humana. Las muestras de sangre entera se trataron con compuestos o DMSO a 250 nM durante 18 h y luego se sometieron a preparación de PBMC e IB. La Figura 8 muestra la transferencia Western de Aiolos en PBMC de mono. Las PBMC de mono de Mauricio se trataron con DMSO o Compuesto B a 2 nM y 200 nM. El panel izquierdo es el tratamiento a las 0 horas, y el panel derecho es el tratamiento a las 18 horas.
La Figura 9 muestra la transferencia Western de Aiolos en el estudio del mono cangrejero, grupo 1, control de vehículo.
La Figura 10 muestra representaciones gráficas de la expresión de Aiolos 58 kD (paneles de la izquierda) y 42 kD (paneles de la derecha) en el estudio del mono cangrejero, grupo 1, control de vehículo.
La Figura 11 muestra la transferencia Western de Aiolos en el estudio del mono cangrejero, grupo 2, dosis del Compuesto B QD. El Compuesto B redujo Aiolos 58 kD y aumentó Aiolos 42 kD en varios monos.
La Figura 12 muestra representaciones gráficas de la expresión de Aiolos 58 kD (paneles de la izquierda) y 42 kD (paneles de la derecha) en el estudio del mono cangrejero, Grupo 2, dosificación del Compuesto B QD.
La Figura 13 muestra la transferencia Western de Aiolos en el estudio del mono cangrejero, grupo 3, dosificación del Compuesto B Q2D. El Compuesto B redujo Aiolos 58 kD y aumentó Aiolos 42 kD en varios monos.
La Figura 14 muestra representaciones gráficas de la expresión de Aiolos 58 kD (paneles de la izquierda) y 42 kD (paneles de la derecha) en el estudio del mono cangrejero, Grupo 3, dosificación del Compuesto B Q2D.
La Figura 15 muestra la transferencia Western de Aiolos en el estudio del mono cangrejero, grupo 4, dosis del Compuesto B 4 días a la semana. El Compuesto B redujo Aiolos 58 kD y aumentó Aiolos 42 kD en varios monos. La Figura 16 muestra representaciones gráficas de la expresión de Aiolos 58 kD (paneles de la izquierda) y 42 kD (paneles de la derecha) en el estudio del mono cangrejero, grupo 4, dosis del Compuesto B 4 días a la semana. La Figura 17 muestra que los derivados inmunomoduladores de la talidomida (compuestos IMiD) regulan el factor de transcripción Aiolos a través de su degradación en las células T. El Compuesto A inhibe la expresión de la proteína Aiolos de manera dependiente de la concentración en concentraciones clínicamente relevantes.
La Figura 18 muestra el efecto diferencial de los IMiD sobre la proteína Aiolos. El efecto parece correlacionarse con la actividad antiproliferativa del compuesto en las células de mieloma. Pom, Compuesto A y Compuesto B tienen mayor potencia que Len en la inhibición de la proteína Aiolos en células de mieloma.
La Figura 19 muestra la regulación de Aiolos por IMiDs. La regulación se anula en líneas celulares con baja expresión de CRBN. El panel izquierdo muestra la respuesta a la dosis con pomalidomida a las 4 horas. El panel derecho muestra la proliferación celular después de 5 días (n = 3-7).
La Figura 20 muestra que la pérdida de la proteína CRBN impide la regulación negativa de Aiolos por lenalidomida y pomalidomida. La disminución de la expresión de Aiolos por lanalidomida o pomalidomida requiere proteína CRBN.
La Figura 21 muestra que la atenuación de Aiolos es similar al tratamiento con IMiDs, en la que la atenuación induce la expresión de p21, disminuye IRF4 y disminuye el número de células en fase S. Aiolos es necesario para la expresión de IRF4 y la progresión del ciclo celular en células U266.
La Figura 22 muestra que los IMiD afectan el nivel de proteína Aiolos en células B de donantes sanos y LLC. La expresión de Aiolos es mayor en las células LLC-B que en las células B de donantes sanos. El tratamiento con IMids inhibe Aiolos en células de pacientes con LLC-B.
La Figura 23 muestra que los IMiD inhiben la expresión de la proteína Aiolos en las líneas celulares de linfoma MCL (Rec-1) y DLBCL (U2932, OCI-LY19).
La Figura 24 muestra que la atenuación de Aiolos induce la expresión de p21.
La Figura 25 muestra el efecto del Compuesto A sobre los niveles de Aiolos endógeno en la línea de cáncer de mama inflamatorio AU565 y la línea celular de carcinoma humano ZR 75-1.
La Figura 26 muestra el efecto del Compuesto A sobre los niveles de Aiolos en células AU565 y los patrones de detección utilizando anticuerpos anti-flag y anti-myc.
La Figura 27 muestra la evolución temporal de la inhibición de Aiolos por el Compuesto A y el rescate de dicha inhibición por MF-132.
La Figura 28 muestra el efecto del compuesto A sobre los niveles de Aiolo en las células Her2+ en comparación con las células triple negativas ("TN"; EP-/PR-/Her2-).
La Figura 29 muestra la inhibición de la expresión de Aiolos por lenalidomida en el linfoma de xenoinjerto OCI-Ly10.
La Figura 30 muestra la inhibición de la expresión de Aiolos por el Compuesto A en el linfoma de xenoinjerto OCI-Ly10.
La Figura 31 muestra la inhibición de la expresión de Aiolos por el isómero R del Compuesto A en el linfoma de xenoinjerto OCI-Ly10.
La Figura 32 muestra la inhibición de la expresión de Aiolos por el isómero S del compuesto A en el linfoma de xenoinjerto OCI-Ly10.
La Figura 33A muestra los resultados del análisis FACS con respecto a la inhibición de la expresión de Aiolos en linfocitos 1,5 horas después del tratamiento de sangre entera con el Compuesto A o el Compuesto B.
La Figura 33B muestra la inhibición de la expresión de Aiolos en células T y células B 1,5 horas después del tratamiento de sangre entera con el Compuesto A o el Compuesto B.
La Figura 34A muestra los resultados del análisis FACS con respecto a la inhibición de la expresión de Aiolos en linfocitos 5 horas después del tratamiento de sangre entera con el Compuesto A o el Compuesto B.
La Figura 34 B muestra la inhibición de la expresión de Aiolos en células T y células B 5 horas después del tratamiento de sangre entera con el Compuesto A o el Compuesto B.
La Figura 35A muestra los resultados del análisis FACS con respecto a la inhibición de la expresión de Aiolos en PMBC viables congelados preparados a partir de sangre entera 1,5 horas después del tratamiento con el Compuesto A o el Compuesto B.
La Figura 35 B muestra la inhibición de la expresión de Aiolos en células T y células B viables congeladas preparadas a partir de sangre entera 1,5 horas después del tratamiento con el Compuesto A o el Compuesto B. La Figura 36 A muestra los resultados del análisis FACS con respecto a la inhibición de la expresión de Aiolos en PMBC viables congelados preparados a partir de sangre entera 5 horas después del tratamiento con el Compuesto A o el Compuesto B.
La Figura 36B muestra la inhibición de la expresión de Aiolos en células T y células B viablemente congeladas preparadas a partir de sangre entera 5 horas después del tratamiento con el Compuesto A o el Compuesto B. La Figura 37 muestra la inhibición de la expresión de Aiolos e Ikaros a las 6 horas después del tratamiento con pomalidomida, lenalidomida, Compuesto A y Compuesto B.
La Figura 38 muestra la mejora de la detección del péptido Aiolos que contiene lisina 203 por lenalidomida y pomalidomida en células de mieloma múltiple.
La Figura 39 A muestra la degradación de Aiolos e Ikaros por lenalidomida y pomalidomida en células de mieloma múltiple, células T y células B de una manera dependiente de la concentración y del proteasoma.
La Figura 39 B muestra la degradación de Aiolos por lenalidomida y pomalidomida en células de mieloma múltiple de manera dependiente de la concentración.
La Figura 39 C muestra la degradación de Ikaros por lenalidomida y pomalidomida en células de mieloma múltiple de una manera dependiente de la concentración y del proteasoma.
La Figura 40 muestra que la lenalidomida y la pomalidomida destruyen Aiolos e Ikaros en cuestión de horas después del tratamiento farmacológico en células de MM, células T y células B de manera dependiente del tiempo. La Figura 41 muestra que lenalidomida y pomalidomida inducen la destrucción de Aiolos en presencia de cicloheximida y un inhibidor de la síntesis de proteínas.
La Figura 42 A muestra que la degradación de Aiolos e Ikaros por lenalidomida y pomalidomida depende de CRBN. La Figura 42 B muestra que siCRBN reduce la expresión del gen CRBN.
La Figura 43 A muestra que Aiolos es un regulador negativo de IL-2 en las células T.
La Figura 43 B muestra que el silenciamiento de Aiolos imita el tratamiento con lenalidomida.
La Figura 43 C muestra que siAiolos reduce los niveles de Aiolos.
La Figura 43 D muestra que el silenciamiento de Aiolos imita el tratamiento con pomalidomida.
La Figura 44A muestra la actividad antitumoral de lenalidomida contra células MM H929 en ratones.
La Figura 44B muestra que la lenalidomida induce la degradación de Aiolos e Ikaros en células MM H929 en ratones, según lo medido por inmunohistoquímica.
La Figura 44C muestra que la actividad antitumoral in vivo de lenalidomida se correlaciona con la degradación de Aiolos e Ikaros.
La Figura 45 muestra que la degradación de Aiolos e Ikaros en células de mieloma múltiple es exclusiva de los compuestos proporcionados aquí.
La Figura 46 muestra los efectos in vivo del Compuesto A sobre Ikaros y Aiolos en tumores de linfoma OCI-Ly10 en ratones.
La Figura 47 A muestra que la inhibición de Aiolos se correlaciona con la exposición al compuesto A en las células T según el tiempo y la dosis en pacientes con cáncer.
La Figura 47 B muestra que la inhibición de Aiolos se correlaciona con la exposición al Compuesto A en las células B según el tiempo y la dosis en pacientes con cáncer.
La Figura 48 A muestra que los compuestos inmunomoduladores afectan la expresión de Ikaros en las células T. La Figura 48 B muestra que el compuesto A afecta la expresión de Aiolos en las células T.
La Figura 49 muestra que el Compuesto A degrada tanto el Aiolos endógeno como el sobreexpresado en las células Jurkat; la ubiquitinación de múltiples lisinas es necesaria para la degradación de Aiolos mediada por el Compuesto A, evidencia de que la degradación de Aiolos inducida por IMiD se debe a la ubiquitinación de Aiolos; y la degradación de la proteína Ikaros por el Compuesto A es independiente de Aiolos en las células Jurkat.
La Figura 50 A muestra la transferencia Western de Aiolos de células T humanas primarias. El gel muestra una comparación de los compuestos IMiD en la degradación de Aiolos en células T primarias a las 6 horas.
La Figura 50 B muestra la comparación de cuantificación de los compuestos proporcionados aquí sobre la degradación de Aiolos en células T primarias a las 6 horas.
La Figura 50 C muestra la transferencia Western de Aiolos de células T humanas primarias. El gel muestra una comparación de los compuestos proporcionados aquí sobre la degradación de Aiolos en células T primarias a las 24 horas.
La Figura 50 D muestra la comparación de cuantificación de los compuestos proporcionados aquí sobre la degradación de Aiolos en células T primarias a las 24 horas.
La Figura 51 A muestra las reducciones de Aiolos en las células B en respuesta a varias dosis del Compuesto B en voluntarios sanos.
La Figura 51 B muestra las reducciones de Aiolos en las células T en respuesta a diversas dosis del Compuesto B en voluntarios sanos.
La Figura 52 muestra que el compuesto B reduce los niveles de proteínas Ikaros y Aiolos en las células B.
La Figura 53 A muestra la sobreexpresión de Cereblon en la SSc y el LES.
Las Figuras 53 B-E muestran la sobreexpresión de Ikaros en SSc y LES.
La Figura 53F muestra la sobreexpresión de Helios en la SSc y el LES.
La Figura 53G muestra la sobreexpresión de Aiolos en la SSc y el LES.
La Figura 54 muestra los niveles de Ikaros de muestras de PBMC de 32 monos tratados con diversas dosis del Compuesto B.
La Figura 55 A muestra el efecto del Compuesto B sobre los niveles de Ikaros en PBMC de monos machos y hembras.
La Figura 55 B muestra el efecto del Compuesto B sobre los niveles de Ikaros en PBMC de monas.
La Figura 55 C muestra el efecto del compuesto B sobre los niveles de Ikaros en PBMC de monos machos. La Figura 56 A muestra los efectos del tratamiento con compuestos proporcionados aquí mediante transferencia Western de proteínas clave de proliferación y supervivencia en células LLC.
La Figura 56 B muestra los efectos del tratamiento con los compuestos proporcionados aquí a través de la cuantificación de proteínas clave de proliferación y supervivencia en células LLC.
La Figura 56 C muestra la inhibición dependiente de la dosis de Aiolos por pomalidomida, lenalidomida, compuesto A y compuesto B en tres muestras de cocultivo diferentes de pacientes con LLC-B.
La Figura 57 A muestra la cuantificación de Aiolos en células LLC-B de control y con atenuación de CRBN tratadas con DMSO, pomalidomida, lenalidomida, Compuesto A o Compuesto B.
La Figura 57 B muestra la cuantificación de la medida de citometría de flujo de la proteína Aiolos en células LLC-B de control y con atenuación de CRBN tratadas con DMSO, pomalidomida, lenalidomida, Compuesto A o Compuesto B.
La Figura 57 C muestra la cuantificación de las isoformas de Ikaros detectadas en células LLC-B de control y con atenuación de CRBN tratadas con DMSO, pomalidomida, lenalidomida, Compuesto A o Compuesto B.
6 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
6.1 Definiciones
Como se utilizan aquí, y a menos que se especifique lo contrario, los términos "tratar", "tratando" y "tratamiento" se refieren a una acción que ocurre mientras un paciente sufre el cáncer especificado, que reduce la gravedad del cáncer o retarda o ralentiza la progresión del cáncer.
El término "sensibilidad" y "sensible", cuando se utiliza en referencia al tratamiento con un compuesto es un término relativo que se refiere al grado de eficacia del compuesto para disminuir o disminuir el progreso de un tumor o de la enfermedad que se está tratando. Por ejemplo, la expresión "mayor sensibilidad", cuando se utiliza en referencia al tratamiento de una célula o un tumor en relación con un compuesto, se refiere a un aumento de al menos un 5% o más en la eficacia del tratamiento del tumor.
Como se utiliza aquí, la expresión "compuesto inmunomodulador" o "fármaco inmunomodulador" se refiere generalmente a una molécula o agente capaz de alterar la respuesta inmunitaria de alguna manera. Los ejemplos no limitativos de compuestos inmunomoduladores incluyen aquellos descritos en la Sección 5.3 a continuación.
Como se utiliza aquí, y a menos que se especifique lo contrario, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" de un compuesto es una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico en el tratamiento o manejo de un cáncer, o para retrasar o minimizar uno o más síntomas asociados con la presencia del cáncer. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto significa una cantidad de agente terapéutico, solo o en combinación con otras terapias, que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o manejo del cáncer. La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" puede abarcar una cantidad que mejora la terapia general, reduce o evita los síntomas o las causas del cáncer o mejora la eficacia terapéutica de otro agente terapéutico.
Como se utiliza aquí, una "respuesta tumoral eficaz del paciente" se refiere a cualquier aumento del beneficio terapéutico para el paciente. Una "respuesta tumoral eficaz del paciente" puede ser, por ejemplo, una disminución del 5%, 10%, 25%, 50% o 100% en la tasa de progreso del tumor. Una "respuesta tumoral eficaz del paciente" puede ser, por ejemplo, una disminución del 5%, 10%, 25%, 50% o 100% en los síntomas físicos de un cáncer. Una "respuesta tumoral eficaz del paciente" también puede ser, por ejemplo, un aumento del 5%, 10%, 25%, 50%, 100%, 200% o más en la respuesta del paciente, medido por cualquier medio adecuado, tales como expresión genética, recuentos de células, resultados de ensayos, etc.
El término "probabilidad" generalmente se refiere a un aumento en la probabilidad de un evento. El término "probabilidad", cuando se utiliza en referencia a la eficacia de la respuesta tumoral de un paciente, generalmente contempla una mayor probabilidad de que la tasa de progreso del tumor o el crecimiento de las células tumorales disminuya. El término "probabilidad", cuando se utiliza en referencia a la eficacia de la respuesta tumoral de un paciente, también puede significar generalmente el aumento de indicadores, tal como la expresión de ARNm o de proteínas, que pueden evidenciar un aumento en el progreso en el tratamiento del tumor.
El término "predecir" generalmente significa determinar o decir de antemano. Cuando se utiliza para "predecir" la eficacia de un tratamiento contra el cáncer, por ejemplo, el término "predecir" puede significar que la probabilidad del resultado del tratamiento contra el cáncer se puede determinar desde el principio, antes de que el tratamiento haya comenzado o antes de que el período de tratamiento haya progresado sustancialmente.
El término "monitorizar", como se utiliza aquí, generalmente se refiere a la supervisión, control, regulación, observación, rastreo o vigilancia de una actividad. Por ejemplo, la expresión "monitorizar la eficacia de un compuesto" se refiere al seguimiento de la eficacia en el tratamiento de un cáncer en un paciente o en un cultivo de células tumorales. De manera similar, el "monitorización", cuando se utiliza en relación con el cumplimiento del paciente, ya sea individualmente o en un ensayo clínico, se refiere al seguimiento o confirmación de que el paciente está realmente tomando el medicamento que se está probando según lo prescrito. El seguimiento puede realizarse, por ejemplo, siguiendo la expresión de ARNm o de biomarcadores proteicos.
Una mejoría en el cáncer o en una enfermedad relacionada con el cáncer puede caracterizarse como una respuesta completa o parcial. "Respuesta completa" se refiere a la ausencia de enfermedad clínicamente detectable con normalización de cualquier estudio radiográfico previamente anormal, médula ósea y líquido cefalorraquídeo (LCR) o medidas anormales de proteína monoclonal. "Respuesta parcial" se refiere a al menos una disminución de aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% en toda la carga tumoral medible (es decir, la cantidad de células malignas presentes en el sujeto, o la masa medida de masas tumorales o la cantidad de proteína monoclonal anormal) en ausencia de nuevas lesiones. El término “tratamiento” contempla tanto una respuesta completa como una parcial.
"Tumor", como se utiliza aquí, se refiere a todo crecimiento y proliferación de células neoplásicas, ya sean malignas o benignas, y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos. "Neoplásico", como se utiliza aquí, se refiere a cualquier forma de crecimiento celular desregulado o no regulado, ya sea maligno o benigno, que resulta en un crecimiento anormal del tejido. Así, las "células neoplásicas" incluyen células malignas y benignas que tienen un crecimiento celular desregulado o no regulado.
Como se utiliza aquí, la expresión "proteína asociada a cereblon" o "proteína asociada a CRBN" se refiere a una proteína que interactúa con o se une a CRBN directa o indirectamente. En ciertas realizaciones, una "proteína asociada a cereblon" o "proteína asociada a CRBN" es un sustrato de CRBN, por ejemplo un sustrato proteico del complejo de ubiquitina ligasa E3 que involucra a CRBN, o los sustratos posteriores del mismo. En el contexto de la invención, las proteínas asociadas a CRBN proporcionadas aquí son IKZF3, también conocida como "Aiolos", e IKZF1, también conocida como "Ikaros", que son sustratos de CRBN. En ciertas realizaciones, una "proteína asociada a cereblon" o "proteína asociada a CRBN" es una proteína de unión de CRBN.
El término "regular", como se utiliza aquí, se refiere a controlar la actividad de una molécula o función biológica, tal como mejorar o disminuir la actividad o función.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la condición fisiológica de los mamíferos que generalmente se caracteriza por un crecimiento celular desregulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, tumores transmitidos por la sangre (por ejemplo, mieloma múltiple, linfoma y leucemia) y tumores sólidos.
La expresión "refractario o resistente" se refiere a una circunstancia en la que los pacientes, incluso después de un tratamiento intensivo, tienen células cancerosas residuales (por ejemplo, células de leucemia o linfoma) en su sistema linfático, sangre y/o tejidos formadores de sangre (por ejemplo, médula ósea).
Como se utilizan aquí, los términos "polipéptido" y "proteína", como se utilizan indistintamente aquí, se refieren a un polímero de aminoácidos de tres o más aminoácidos en una disposición en serie, unidos a través de enlaces peptídicos. El término "polipéptido" incluye proteínas, fragmentos de proteínas, análogos de proteínas, oligopéptidos y similares. El término polipéptido, como se utiliza aquí, también puede referirse a un péptido. Los aminoácidos que componen el polipéptido pueden ser de origen natural o sintéticos. El polipéptido se puede purificar a partir de una muestra biológica.
El término "anticuerpo" se utiliza aquí en el sentido más amplio, y cubre anticuerpos completamente ensamblados, fragmentos de anticuerpos que conservan la capacidad de unirse específicamente al antígeno (por ejemplo, Fab, F(ab')2, Fv y otros fragmentos), anticuerpos de cadena sencilla, diacuerpos, quimeras de anticuerpos, anticuerpos híbridos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos humanizados, y similares. El término "anticuerpo" abarca tanto los anticuerpos policlonales como los monoclonales. El término "anticuerpo" e "inmunoglobulina" o "Ig" pueden usarse indistintamente aquí. Las expresiones "anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno CRBN", "anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un epítopo CRBN", "anticuerpos CRBN", "anticuerpos anti-CRBN" y términos análogos también se utilizan indistintamente aquí, y se refieren a anticuerpos y fragmentos de los mismos, que se unen específicamente a un polipéptido CRBN, tal como un antígeno o epítopo CRBN (por ejemplo, péptido 65-76 CRBN humano). Los anticuerpos, incluidos tanto los anticuerpos modificados (es decir, los anticuerpos que comprenden un dominio constante de IgG modificado (por ejemplo, IgG1) como los anticuerpos no modificados (es decir, los anticuerpos que no comprenden un dominio constante de IgG modificado (por ejemplo, IgG1) que se unen específicamente a un polipéptido CRBN). Un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une inmunoespecíficamente a un antígeno CRBN puede tener reacción cruzada con antígenos relacionados. En ciertas realizaciones, un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une inmunoespecíficamente a un antígeno CRBN no reacciona de forma cruzada con otros antígenos. Un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une inmunoespecíficamente a un antígeno CRBN se puede identificar, por ejemplo, mediante inmunoensayos, BIAcore u otras técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica. Un anticuerpo o un fragmento del mismo se une específicamente a un antígeno CRBN cuando se une a un antígeno CRBN con mayor afinidad que a cualquier antígeno reactivo cruzado, según se determina utilizando técnicas experimentales, tales como radioinmunoensayos (RIA) y ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA). Normalmente, una reacción específica o selectiva será al menos el doble de la señal o ruido de fondo, y más habitualmente, más de 10 veces el fondo. Véase, por ejemplo, Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology Segunda Edición, Raven Press, Nueva York, páginas 332-336, para un análisis de la especificidad de los anticuerpos.
Los anticuerpos proporcionados aquí incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos sintéticos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos producidos de forma recombinante, anticuerpos multiespecíficos (incluidos anticuerpos biespecíficos), anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, intracuerpos, Fv de cadena sencilla (scFv) (por ejemplo, incluidos monoespecíficos, biespecíficos, etc.), anticuerpos camelizados, fragmentos Fab, fragmentos F(ab"), Fv unidos por disulfuro (sdFv), anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id), y fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos proporcionados aquí incluyen moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, dominios de unión a antígeno o moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une inmunoespecíficamente a un antígeno CRBN (por ejemplo, una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo anti-CRBN). Los anticuerpos proporcionados aquí pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), de cualquier clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o de cualquier subclase (por ejemplo, IgG2a e IgG2b) de molécula de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-CRBN son completamente humanos, tales como los anticuerpos monoclonales CRBN completamente humanos. En ciertas realizaciones, los anticuerpos proporcionados aquí son anticuerpos IgG, o una clase (por ejemplo, IgG1 o IgG4 humana) o subclase de los mismos.
La expresión "dominio de unión al antígeno'', "región de unión al antígeno'', "fragmento de unión al antígeno'', y términos similares, se refieren a aquella porción de un anticuerpo que comprende los restos de aminoácidos que interactúan con un antígeno y confieren al agente de unión su especificidad y afinidad por el antígeno (por ejemplo, la CDR). La región de unión al antígeno puede derivar de cualquier especie animal, tales como roedores (por ejemplo, conejo, rata o hámster) y seres humanos. En algunas realizaciones, la región de unión al antígeno será de origen humano.
La expresión "región constante" o "dominio constante" de un anticuerpo se refiere a una porción carboxiterminal de la cadena ligera y pesada que no está directamente involucrada en la unión del anticuerpo al antígeno pero que exhibe varias funciones efectoras, tal como la interacción con el receptor Fc. Los términos se refieren a la porción de una molécula de inmunoglobulina que tiene una secuencia de aminoácidos más conservada en relación con la otra porción de la inmunoglobulina, el dominio variable, que contiene el sitio de unión del antígeno. El dominio constante contiene los dominios CH1, CH2 y CH3 de la cadena pesada y el dominio CL de la cadena ligera.
El término "epítopo", como se utiliza aquí, se refiere a una región localizada en la superficie de un antígeno, tal como un polipéptido CRBN o un fragmento de polipéptido CRBN, que es capaz de unirse a una o más regiones de unión a antígeno de un anticuerpo, y que tiene actividad antigénica o inmunogénica en un animal, tal como un mamífero (por ejemplo, un ser humano), que es capaz de provocar una respuesta inmune. Un epítopo que tiene actividad inmunogénica es una porción de un polipéptido que provoca una respuesta de anticuerpos en un animal. Un epítopo que tiene actividad antigénica es una porción de un polipéptido al cual un anticuerpo se une inmunoespecíficamente según lo determinado por cualquier método bien conocido en la técnica, por ejemplo mediante los inmunoensayos descritos aquí. Los epítopos antigénicos no necesariamente tienen que ser inmunogénicos. Los epítopos generalmente consisten en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Una región de un polipéptido que contribuye a un epítopo pueden ser aminoácidos contiguos del polipéptido o el epítopo puede unirse a partir de dos o más regiones no contiguas del polipéptido. El epítopo puede ser o no una característica superficial tridimensional del antígeno.
Las expresiones "anticuerpo completamente humano" o "anticuerpo humano" se utilizan indistintamente aquí, y se refieren a un anticuerpo que comprende una región variable humana y, en algunas realizaciones, una región constante humana. En realizaciones específicas, los términos se refieren a un anticuerpo que comprende una región variable y una región constante de origen humano. Los anticuerpos anti-CRBN "completamente humanos", en ciertas realizaciones, también pueden abarcar anticuerpos que se unen a polipéptidos CRBN y están codificados por secuencias de ácidos nucleicos que son variantes somáticas naturales de la secuencia de ácidos nucleicos de inmunoglobulina de línea germinal humana. En una realización específica, los anticuerpos anti-CRBN proporcionados aquí son anticuerpos completamente humanos. La expresión "anticuerpo completamente humano" incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes correspondientes a secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana como lo describen Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE. UU., publicación NIH No. 91-3242, 1991. Se proporcionan métodos ejemplares para producir anticuerpos completamente humanos, por ejemplo, en los Ejemplos incluidos aquí, pero se puede utilizar cualquier método conocido en la técnica.
La frase "anticuerpo humano recombinante" incluye anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedante, anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatorios recombinantes, anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón o una vaca) que es transgénico y/o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylor, L.D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Estos anticuerpos humanos recombinantes pueden tener regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Véase Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU., NIH Publication No. 91-3242. Sin embargo, en ciertas realizaciones, dichos anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesisin vitro(o, cuando se utiliza un animal transgénico para secuencias de Ig humanas, mutagénesis somáticain vivo)y, por lo tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, si bien derivan de y están relacionadas con las secuencias VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanosin vivo.
La expresión "cadena pesada", cuando se utiliza en referencia a un anticuerpo, se refiere a cinco tipos distintos, llamados alfa (a), delta (5), épsilon (s), gamma (<y>) y mu (p), según la secuencia de aminoácidos del dominio constante de la cadena pesada. Estos distintos tipos de cadenas pesadas son bien conocidos y dan lugar a cinco clases de anticuerpos, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente, incluidas cuatro subclases de IgG, a saber, IgG1, IgG1, IgG3 e IgG4. En algunas realizaciones, la cadena pesada es una cadena pesada humana.
Las expresiones "numeración de Kabat" y expresiones similares se reconocen en la técnica, y se refieren a un sistema de numeración de restos de aminoácidos que son más variables (es decir, hipervariables) que otros restos de aminoácidos en las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo. Kabat et al. (1971) Ann. any Acad. Sci. 190:382-391 y, Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU., NIH Publication No. 91-3242. Para la región variable de la cadena pesada, la región hipervariable generalmente varía entre las posiciones de aminoácidos 31 a 35 para CDR1, las posiciones de aminoácidos 50 a 65 para CDR2 y las posiciones de aminoácidos 95 a 102 para CDR3. Para la región variable de la cadena ligera, la región hipervariable generalmente varía entre las posiciones de aminoácidos 24 a 34 para CDR1, las posiciones de aminoácidos 50 a 56 para CDR2 y las posiciones de aminoácidos 89 a 97 para CDR3. Los expertos en la técnica comprenderán fácilmente otros esquemas de numeración.
La expresión "cadena ligera", cuando se utiliza en referencia a un anticuerpo, se refiere a dos tipos distintos, llamados kappa (k) o lambda (A) según la secuencia de aminoácidos de los dominios constantes. Las secuencias de aminoácidos de cadena ligera son bien conocidas en la técnica. En ciertas realizaciones, la cadena ligera es una cadena ligera humana.
La expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos homogéneos o sustancialmente homogéneos, y cada anticuerpo monoclonal normalmente reconocerá un único epítopo en el antígeno. En algunas realizaciones, un "anticuerpo monoclonal", como se usa aquí, es un anticuerpo producido por un solo hibridoma u otra célula, en la que el anticuerpo se une inmunoespecíficamente sólo a un epítopo CRBN como se determina, por ejemplo, mediante ELISA u otro ensayo de unión a antígeno o de unión competitiva conocido en la técnica o en los Ejemplos proporcionados aquí. El término "monoclonal" no se limita a ningún método particular para producir el anticuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales proporcionados aquí se pueden producir mediante el método de hibridoma como se describe en Kohler et al.; Nature, 256:495 (1975), o se pueden aislar de bibliotecas de fagos utilizando las técnicas como se describe aquí, por ejemplo. Son bien conocidos en la técnica otros métodos para la preparación de líneas celulares clonales y de anticuerpos monoclonales expresados por ellas. Véase, por ejemplo, el Capítulo 11 en: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5a ed., Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, Nueva York. En los Ejemplos incluidos aquí se proporcionan otros métodos ejemplares para producir otros anticuerpos monoclonales.
"Anticuerpos policlonales", como se utiliza aquí, se refiere a una población de anticuerpos generada en una respuesta inmunogénica a una proteína que tiene muchos epítopos y, por lo tanto, incluye una variedad de anticuerpos diferentes dirigidos al mismo y a diferentes epítopos dentro de la proteína. Se conocen en la técnica métodos para producir anticuerpos policlonales. Véase, por ejemplo, el Capítulo 11 en: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5a ed., Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, Nueva York.
Los términos "cereblon" o "CRBN" y términos similares se refieren a los polipéptidos ("polipéptidos", "péptidos" y "proteínas" se usan indistintamente aquí) que comprenden la secuencia de aminoácidos de cualquier CRBN, tal como una proteína CRBN humana (por ejemplo, isoforma 1 de CRBN humana, número de acceso de GenBank NP_057386; o isoformas 2 de CRBN humana, número de acceso de GenBank NP_001166953 y polipéptidos relacionados, incluidas las variantes de SNP de las mismas. Los polipéptidos CRBN relacionados incluyen variantes alélicas (por ejemplo, variantes de SNP); variantes de empalme; fragmentos; derivados; variantes de sustitución, deleción e inserción; polipéptidos de fusión; y homólogos interespecies, que, en ciertas realizaciones, retienen la actividad de CRBN y/o son suficientes para generar una respuesta inmune anti-CRBN.
La expresión "antígeno CRBN" se refiere a aquella porción de un polipéptido CRBN a la que se une inmunoespecíficamente un anticuerpo. Un antígeno CRBN también se refiere a un análogo o derivado de un polipéptido CRBN o fragmento del mismo al que se une inmunoespecíficamente un anticuerpo. Una región localizada en la superficie de un antígeno CRBN que es capaz de provocar una respuesta inmune es un "epítopo" de CRBN. Una región de un polipéptido CRBN que contribuye a un epítopo pueden ser aminoácidos contiguos del polipéptido, o el epítopo puede unirse a partir de dos o más regiones no contiguas del polipéptido. El epítopo puede ser o no una característica superficial tridimensional del antígeno.
La expresión "región variable" o "dominio variable" se refiere a una porción de las cadenas ligera y pesada, típicamente alrededor de los 120 a 130 aminoácidos amino-terminales en la cadena pesada y alrededor de 100 a 110 aminoácidos en la cadena ligera, que difieren ampliamente en secuencia entre los anticuerpos y se utilizan en la unión y especificidad de cada anticuerpo en particular para su antígeno particular. La variabilidad en la secuencia se concentra en aquellas regiones llamadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), mientras que las regiones más altamente conservadas en el dominio variable se denominan regiones estructurales (FR). Las CDR de las cadenas ligeras y pesadas son las principales responsables de la interacción del anticuerpo con el antígeno. La numeración de las posiciones de aminoácidos utilizada aquí se realiza de acuerdo con el índice EU, como se indica en Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU., NIH Publication No. 91-3242. En algunas realizaciones, la región variable es una región variable humana.
El término "expresado" o "expresión", como se utiliza aquí, se refiere a la transcripción de un gen para dar una molécula de ácido nucleico de ARN al menos complementaria en parte a una región de una de las dos cadenas de ácido nucleico del gen. El término "expresado" o "expresión", como se utiliza aquí, también se refiere a la traducción de la molécula de ARN para dar una proteína, un polipéptido o una porción del mismo.
Un ARNm que está "regulado positivamente" generalmente aumenta ante un tratamiento o condición determinada. Un ARNm "regulado a la baja" generalmente se refiere a una disminución en el nivel de expresión del ARNm en respuesta a un tratamiento o condición determinados. En algunas situaciones, el nivel de ARNm puede permanecer inalterado ante un tratamiento o condición determinados.
Un ARNm de una muestra de un paciente puede "regularse positivamente" cuando se trata con un fármaco, en comparación con un control no tratado. Esta regulación positiva puede ser, por ejemplo, un aumento de aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 90%, 100%, 200%, 300%, 500%, 1.000%, 5.000% o más del nivel de ARNm de control comparativo.
Alternativamente, un ARNm puede ser "regulado a la baja", o expresado a un nivel más bajo, en respuesta a la administración de ciertos compuestos u otros agentes. Un ARNm regulado negativamente puede estar presente, por ejemplo, en un nivel de aproximadamente 99%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 1% o menos del nivel de ARNm de control comparativo.
De manera similar, el nivel de un biomarcador polipeptídico o proteico de una muestra de un paciente puede aumentar cuando se lo trata con un medicamento, en comparación con un control no tratado. Este aumento puede ser de aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 90%, 100%, 200%, 300%, 500%, 1.000%, 5.000% o más del nivel de proteína de control comparativo.
Alternativamente, el nivel de un biomarcador proteico puede disminuir en respuesta a la administración de ciertos compuestos u otros agentes. Esta disminución puede estar presente, por ejemplo, en un nivel de aproximadamente 99%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 1% o menos del nivel de proteína de control comparativo.
Los términos "determinar", "medir", "evaluar", "valorar" y "ensayo", como se utilizan aquí, generalmente se refieren a cualquier forma de medida, e incluyen determinar si un elemento está presente o no. Estos términos incluyen determinaciones tanto cuantitativas como cualitativas. La evaluación puede ser relativa o absoluta. "Evaluar la presencia de" puede incluir determinar la cantidad de algo presente, así como determinar si está presente o ausente.
Las expresiones "ácido nucleico" y "polinucleótido" se utilizan indistintamente aquí para describir un polímero de cualquier longitud compuesto de nucleótidos, por ejemplo desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o compuestos producidos sintéticamente, que pueden hibridarse con ácidos nucleicos naturales de una manera específica de secuencia análoga a la de dos ácidos nucleicos naturales, por ejemplo pueden participar en interacciones de apareamiento de bases Watson-Crick. Como se utiliza aquí en el contexto de una secuencia de polinucleótidos, el término "bases" (o "base") es sinónimo de "nucleótidos" (o "nucleótido"), es decir, la subunidad monomérica de un polinucleótido. Los términos "nucleósido" y "nucleótido" pretenden incluir aquellas fracciones que contienen no sólo las bases de purina y pirimidina conocidas, sino también otras bases heterocíclicas que han sido modificadas. Estas modificaciones incluyen purinas o pirimidinas metiladas, purinas o pirimidinas aciladas, ribosas alquiladas u otros heterociclos. Además, los términos "nucleósido" y "nucleótido" incluyen aquellos restos que contienen no sólo los azúcares ribosa y desoxirribosa convencionales, sino también otros azúcares. Los nucleósidos o nucleótidos modificados también incluyen modificaciones en el resto de azúcar, por ejemplo, en el que uno o más de los grupos hidroxilo se reemplazan con átomos de halógeno o grupos alifáticos, o se funcionalizan como éteres, aminas o similares. "Análogos" se refieren a moléculas que tienen características estructurales que se reconocen en la bibliografía como miméticos, derivados, que tienen estructuras análogas u otros términos similares, e incluyen, por ejemplo, polinucleótidos que incorporan nucleótidos no naturales, miméticos de nucleótidos tales como nucleósidos modificados en 2', ácidos nucleicos peptídicos, fosfonatos de nucleósidos oligoméricos y cualquier polinucleótido que tenga grupos sustituyentes añadidos, tales como grupos protectores o restos enlazantes.
El término "complementario" se refiere a la unión específica entre polinucleótidos en función de las secuencias de los polinucleótidos. Como se utiliza aquí, un primer polinucleótido y un segundo polinucleótido son complementarios si se unen entre sí en un ensayo de hibridación en condiciones rigurosas, por ejemplo si producen un nivel de señal determinado o detectable en un ensayo de hibridación. Las porciones de polinucleótidos son complementarias entre sí si siguen las reglas convencionales de apareamiento de bases, por ejemplo, A se aparea con T (o U) y G se aparea con C, aunque pueden estar presentes pequeñas regiones (por ejemplo, menos de aproximadamente 3 bases) de desajuste, inserción o secuencia eliminada.
"identidad de secuencia" o "identidad", en el contexto de dos secuencias de ácidos nucleicos, se refiere a los restos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para lograr la máxima correspondencia en una ventana de comparación especificada, y pueden tomar en consideración adiciones, eliminaciones y sustituciones.
La expresión "identidad sustancial" u "homólogo", en sus diversas formas gramaticales en el contexto de polinucleótidos, generalmente significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene una identidad deseada, por ejemplo al menos un 60% de identidad, preferiblemente al menos un 70% de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos un 80%, aún más preferiblemente al menos un 90% y aún más preferiblemente al menos un 95%, en comparación con una secuencia de referencia. Otra indicación de que las secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas es si dos moléculas se hibridan entre sí en condiciones rigurosas.
Los términos "aislado" y "purificado" se refieren al aislamiento de una sustancia (como ARNm, anticuerpo o proteína) de modo que la sustancia comprenda una porción sustancial de la muestra en la que reside, es decir, mayor que la que normalmente se encuentra en su estado natural o no aislado. Normalmente, una porción sustancial de la muestra comprende, por ejemplo, más del 1 %, más del 2%, más del 5%, más del 10%, más del 20%, más del 50% o más, normalmente hasta aproximadamente el 90%-100% de la muestra. Por ejemplo, una muestra de ARNm aislado normalmente puede comprender al menos aproximadamente un 1% de ARNm total. Las técnicas para purificar polinucleótidos son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, electroforesis en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, clasificación de flujo y sedimentación según la densidad.
El término "muestra", como se utiliza aquí, se refiere a un material o mezcla de materiales, típicamente, aunque no necesariamente, en forma fluida, que contiene uno o más componentes de interés.
"Muestra biológica", como se utiliza aquí, se refiere a una muestra obtenida de un sujeto biológico, incluida una muestra de origen biológico, de tejido o fluido, obtenida, alcanzada o recolectadain vivooin situ.Una muestra biológica también incluye muestras de una región de un sujeto biológico que contiene células o tejidos precancerosos o cancerosos. Estas muestras pueden ser, pero no se limitan a, órganos, tejidos, fracciones y células aislados de un mamífero. Las muestras biológicas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, un lisado celular, un cultivo celular, una línea celular, un tejido, un tejido oral, un tejido gastrointestinal, un órgano, un orgánulo, un fluido biológico, una muestra de sangre, una muestra de orina, una muestra de piel, y similares. Las muestras biológicas preferidas incluyen, pero no se limitan a, sangre entera, sangre parcialmente purificada, PBMC, biopsias de tejido y similares.
La expresión "agente de captura", como se utiliza aquí, se refiere a un agente que se une a un ARNm o proteína a través de una interacción que es suficiente para permitir que el agente se una y concentre el ARNm o proteína a partir de una mezcla homogénea.
El término "sonda", como se utiliza aquí, se refiere a un agente de captura que se dirige a una secuencia de biomarcador de ARNm diana específica. En consecuencia, cada sonda de un conjunto de sondas tiene un biomarcador de ARNm diana respectivo. Un dúplex de ARNm sonda/diana es una estructura formada mediante la hibridación de una sonda con su biomarcador de ARNm diana.
La expresión "ácido nucleico" o "sonda de oligonucleótidos" se refiere a un ácido nucleico capaz de unirse a un ácido nucleico diana de secuencia complementaria, tales como los biomarcadores de ARNm proporcionados aquí, a través de uno o más tipos de enlaces químicos, generalmente a través del apareamiento de bases complementarias, generalmente a través de la formación de enlaces de hidrógeno. Como se utiliza aquí, una sonda puede incluir bases naturales (por ejemplo, A, G, C o T) o modificadas (7-deazaguanosina, inosina, etc.). Además, las bases de una sonda pueden estar unidas mediante un enlace distinto de un enlace de fosfodiéster, siempre que no interfiera con la hibridación. Un experto en la técnica entenderá que las sondas pueden unirse a secuencias diana que carecen de complementariedad completa con la secuencia de la sonda dependiendo de la rigurosidad de las condiciones de hibridación. Las sondas se marcan preferiblemente directamente con isótopos, por ejemplo cromóforos, lumíforos, cromógenos, o se marcan indirectamente con biotina a la que posteriormente se puede unir un complejo de estreptavidina. Al analizar la presencia o ausencia de la sonda, se puede detectar la presencia o ausencia de un biomarcador de ARNm de interés.
La expresión "condiciones de ensayo rigurosas" se refiere a condiciones que son compatibles para producir pares de unión de ácidos nucleicos, por ejemplo sondas y ARNm diana, de suficiente complementariedad para proporcionar el nivel deseado de especificidad en el ensayo mientras que son generalmente incompatibles con la formación de pares de unión entre miembros de unión de complementariedad insuficiente para proporcionar la especificidad deseada. La expresión condiciones de ensayo rigurosas generalmente se refiere a la combinación de condiciones de hibridación y lavado.
Una "marcador" o un "resto detectable", en referencia a un ácido nucleico, se refiere a una composición que, cuando se une con un ácido nucleico, hace que el ácido nucleico sea detectable, por ejemplo, por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Los marcadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, isótopos radiactivos, perlas magnéticas, perlas metálicas, partículas coloidales, colorantes fluorescentes, enzimas, biotina, digoxigenina, haptenos y similares. Una "sonda de oligonucleótido o ácido nucleico marcado" es generalmente aquella que está unida, ya sea covalentemente, a través de un enlazador o un enlace químico, o no covalentemente, a través de enlaces iónicos, fuerzas de van der Waals, atracciones electrostáticas, interacciones hidrofóbicas o enlaces de hidrógeno, a un marcador de modo que la presencia del ácido nucleico o la sonda se puede detectar detectando la presencia del marcador unido al ácido nucleico o la sonda.
Las expresiones "reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR", como se utilizan aquí, generalmente se refieren a un procedimiento en el que se amplifican pequeñas cantidades de un ácido nucleico, ARN y/o ADN, como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 4.683.195 de Mullis. Generalmente, es necesario que la información de la secuencia de los extremos de la región de interés o más allá esté disponible, de modo que se puedan diseñar cebadores de oligonucleótidos; estos cebadores serán idénticos o similares en secuencia a las cadenas opuestas de la plantilla que se va a amplificar. Los nucleótidos terminales 5' de los dos cebadores pueden coincidir con los extremos del material amplificado. La PCR se puede utilizar para amplificar secuencias de ARN específicas, secuencias de ADN específicas del ADN genómico total, y ADNc transcrito del ARN celular total, secuencias de bacteriófagos o plásmidos, etc. Véase en general Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989).
La expresión "número de ciclo" o "CT", cuando se utiliza aquí en referencia a los métodos de PCR, se refiere al número de ciclo de PCR en el que el nivel de fluorescencia pasa un nivel de umbral establecido determinado. La medida de CT se puede utilizar, por ejemplo, para aproximar los niveles de ARNm en una muestra original. La medida del CT se utiliza a menudo en términos de "dCT" o la puntuación de "diferencia en el CT", cuando el CT de un ácido nucleico se resta del CT de otro ácido nucleico.
Como se utiliza aquí, y a menos que se indique lo contrario, la expresión "ópticamente puro" significa una composición que comprende un isómero óptico de un compuesto y está sustancialmente libre de otros isómeros de ese compuesto. Por ejemplo, una composición ópticamente pura de un compuesto que tiene un centro quiral estará sustancialmente libre del enantiómero opuesto del compuesto. Una composición ópticamente pura de un compuesto que tiene dos centros quirales estará sustancialmente libre de otros diastereómeros del compuesto. Un compuesto ópticamente puro típico comprende más de aproximadamente 80% en peso de un enantiómero del compuesto y menos de aproximadamente 20% en peso de otros enantiómeros del compuesto, más preferiblemente más de aproximadamente 90% en peso de un enantiómero del compuesto y menos de aproximadamente 10% en peso de los otros enantiómeros del compuesto, incluso más preferiblemente más de aproximadamente 95% en peso de un enantiómero del compuesto y menos de aproximadamente 5% en peso de los otros enantiómeros del compuesto, más preferiblemente más de aproximadamente 97% en peso de un enantiómero del compuesto y menos de aproximadamente 3% en peso de los otros enantiómeros del compuesto, y lo más preferiblemente más de aproximadamente 99% en peso de un enantiómero del compuesto y menos de aproximadamente 1% en peso de los otros enantiómeros del compuesto.
Como se utiliza aquí y a menos que se indique lo contrario, la expresión "sal farmacéuticamente aceptable" abarca sales de adición de ácidos y bases no tóxicas del compuesto al que se refiere la expresión. Las sales de adición de ácido no tóxicas aceptables incluyen aquellas derivadas de ácidos o bases orgánicos e inorgánicos conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido metanosulfónico, ácido acético, ácido tartárico, ácido láctico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido maleico, ácido sórbico, ácido aconítico, ácido salicílico, ácido ftálico, ácido embólico, ácido enántico, y similares.
Los compuestos que son de naturaleza ácida son capaces de formar sales con diversas bases farmacéuticamente aceptables. Las bases que se pueden utilizar para preparar sales de adición de bases farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos ácidos son aquellas que forman sales de adición de bases no tóxicas, es decir, sales que contienen cationes farmacológicamente aceptables tales como, pero sin limitarse a, sales de metales alcalinos o alcalino-térreos y las sales de calcio, magnesio, sodio o potasio en particular. Las bases orgánicas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, N,N-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, meglumaína (N-metilglucamina), lisina, y procaína.
Como se usa aquí, y a menos que se indique lo contrario, el término "hidrato" significa un compuesto proporcionado aquí o una sal del mismo, que incluye además una cantidad estequiométrica o no estequiométrica de agua unida por fuerzas intermoleculares no covalentes. Cuando el disolvente es agua, el solvato es un hidrato.
Como se utiliza aquí, y a menos que se indique lo contrario, la expresión "estereoméricamente puro" significa una composición que comprende un estereoisómero de un compuesto y está sustancialmente libre de otros estereoisómeros de ese compuesto. Por ejemplo, una composición estereoméricamente pura de un compuesto que tiene un centro quiral estará sustancialmente libre del enantiómero opuesto del compuesto. Una composición estereoméricamente pura de un compuesto que tiene dos centros quirales estará sustancialmente libre de otros diastereómeros del compuesto. Un compuesto estereoméricamente puro típico comprende más de aproximadamente 80% en peso de un estereoisómero del compuesto y menos de aproximadamente 20% en peso de otros estereoisómeros del compuesto, más preferiblemente más de aproximadamente 90% en peso de un estereoisómero del compuesto y menos de aproximadamente 10% en peso de los otros estereoisómeros del compuesto, incluso más preferiblemente más de aproximadamente 95% en peso de un estereoisómero del compuesto y menos de aproximadamente 5% en peso de los otros estereoisómeros del compuesto, y lo más preferiblemente más de aproximadamente 97% en peso de un estereoisómero del compuesto y menos de aproximadamente 3% en peso de los otros estereoisómeros del compuesto. Como se utiliza aquí y a menos que se indique lo contrario, la expresión "enriquecido estereoméricamente" significa una composición que comprende más de aproximadamente 60% en peso de un estereoisómero de un compuesto, preferiblemente más de aproximadamente 70 % en peso, más preferiblemente más de aproximadamente 80% en peso de un estereoisómero de un compuesto. Como se utiliza aquí, y a menos que se indique lo contrario, la expresión "enantioméricamente puro" significa una composición estereoméricamente pura de un compuesto que tiene un centro quiral. De manera similar, la expresión "enriquecido estereoméricamente" significa una composición enriquecida estereoméricamente de un compuesto que tiene un centro quiral.
Como se utiliza aquí, y a menos que se indique lo contrario, el término "cocristal" significa una forma cristalina que contiene más de un compuesto en una red cristalina. Los cocristales incluyen complejos moleculares cristalinos de dos o más compuestos no volátiles unidos entre sí en una red cristalina a través de interacciones no iónicas. Como se utiliza aquí, los cocristales incluyen cocristales farmacéuticos en los que los complejos moleculares cristalinos contienen un compuesto terapéutico y uno o más compuestos no volátiles adicionales (denominados aquí contramolécula(s)). Una contramolécula en un cocristal farmacéutico es típicamente una molécula farmacéuticamente aceptable y no tóxica, tales como, por ejemplo, aditivos alimentarios, conservantes, excipientes farmacéuticos, u otros API. En algunas realizaciones, los cocristales farmacéuticos mejoran ciertas propiedades fisicoquímicas de los productos farmacéuticos (por ejemplo, solubilidad, velocidad de disolución, biodisponibilidad y/o estabilidad) sin comprometer la integridad estructural química del ingrediente farmacéutico activo (API). Véase, por ejemplo, Jones et al., "Pharmaceutical Cocrystals: An Emerging Approach to Physical Property Enhancement," MRS Bulletin, 2006, 31, 875-879; Trask, "An OverView of Pharmaceutical Cocrystals as Intellectual Property," Molecular Pharmaceutics, 2007, 4(3), 301-309; Schultheiss & Newman, "Pharmaceutical Cocrystals and Their Physicochemical Properties," Crystal Growth & Design, 2009, 9(6), 2950-2967; Shan & Zaworotko, "The Role of Cocrystals in Pharmaceutical Science," Drug Discovery Today, 2008, 13(9/10), 440-446; y Vishweshwar et al., "Pharmaceutical Co-Crystals," J. Pharm. Sci., 2006, 95(3), 499-516.
Un marcador biológico o "biomarcador" es una sustancia cuya detección indica un estado biológico particular, tal como, por ejemplo, la presencia de cáncer. En algunas realizaciones, los biomarcadores pueden determinarse individualmente o pueden medirse varios biomarcadores simultáneamente.
En algunas realizaciones, un "biomarcador" indica un cambio en el nivel de expresión de ARNm que puede correlacionarse con el riesgo o la progresión de una enfermedad, o con la susceptibilidad de la enfermedad a un tratamiento determinado. En algunas realizaciones, el biomarcador es un ácido nucleico, tal como un ARNm o un ADNc.
En realizaciones adicionales, un "biomarcador" indica un cambio en el nivel de expresión de polipéptidos o proteínas que puede correlacionarse con el riesgo, la susceptibilidad al tratamiento o la progresión de una enfermedad. En algunas realizaciones, el biomarcador puede ser un polipéptido o proteína, o un fragmento del mismo. El nivel relativo de proteínas específicas se puede determinar mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden utilizar métodos basados en anticuerpos, tal como inmunotransferencia, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), u otros métodos.
Se debe tener en cuenta que si existe una discrepancia entre una estructura representada y un nombre dado a esa estructura, se le debe dar más peso a la estructura representada. Además, si la estereoquímica de una estructura o de una parte de una estructura no se indica, por ejemplo, con líneas en negrita o discontinuas, la estructura o parte de la estructura debe interpretarse como si abarcara todos los estereoisómeros de la misma.
La práctica de las realizaciones proporcionadas aquí empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología e inmunología, que están dentro de la habilidad de quienes trabajan en la técnica. Estas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía. Algunos ejemplos de textos especialmente adecuados para consulta son los siguientes: Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning; A Laboratory Manual (2d ed.); D.N Glover, ed. (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; M.J. Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; B.D. Hames & SJ. Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridizatio; B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984) Transcription and Translation; R.I. Freshney, ed. (1986) Animal Cell Culture; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, Londres); Scopes (1987) Protein Purification: Principles and Practice (2a ed.; Springer Verlag, N.Y.); y D.M. Weir y C. C. Blackwell, eds. (1986) Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV.
6.2 Métodos para evaluar la eficacia de un compuesto
Se considera que los métodos descritos aquí se encuentran dentro del alcance de la invención cuando las referencias a la "proteína asociada a CRBN" se interpretan como que incluyen tanto a IKZF1 como a IKZF3.
En una realización, se proporcionan aquí métodos para determinar si un compuesto es inmunomodulador, que comprenden: (a) poner en contacto una primera célula con el compuesto; (b) obtener una primera muestra de la primera célula de la etapa (a); (c) determinar el nivel de una proteína asociada a CRBN en la primera muestra; y (d) comparar el nivel de la proteína asociada a CRBN de la etapa (c) con el nivel de la misma proteína obtenida de una muestra de referencia, en los que una disminución en el nivel en comparación con la referencia es indicativa de la eficacia del compuesto como compuesto inmunomodulador. El contacto en la etapa (a) se realizain vitro.En una realización, las células se ponen en contacto con el compuesto durante un período de tiempo, por ejemplo 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o 55 minutos, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 horas, o 2 o 3 o más días. En algunas realizaciones, las células son células mononucleares de sangre periférica, células B, células T, monocitos o granulocitos. En otras realizaciones, las células son células tumorales o cancerosas, por ejemplo, linfoma, mieloma o leucemia. En una realización, las células tumorales o cancerosas se obtienen de una línea celular.
En cierta realización, la etapa (c) comprende: (i) poner en contacto las proteínas dentro de la primera muestra de la etapa (b) con un primer anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a una proteína asociada a CRBN; (ii) poner en contacto las proteínas unidas al primer anticuerpo con un segundo anticuerpo con un marcador detectable, en la que el segundo anticuerpo se une inmunoespecíficamente a la proteína asociada a CRBN, y en la que el segundo anticuerpo se une inmunoespecíficamente a un epítopo diferente en la proteína asociada a CRBN que el primer anticuerpo; (iii) detectar la presencia del segundo anticuerpo unido a las proteínas; y (iv) determinar la cantidad de la proteína asociada a CRBN basándose en la cantidad de marcador detectable en el segundo anticuerpo.
En cierta realización, la etapa (c) comprende: (i) poner en contacto el ARN dentro de la primera muestra con un cebador que comprende una secuencia que se une específicamente al ARN para generar una primera molécula de ADN que tiene una secuencia complementaria al ARN; (ii) amplificar el ADN correspondiente a un segmento de un gen que codifica la proteína asociada a CRBN; y (iii) determinar el nivel de ARN de la proteína asociada a CRBN en función de la cantidad de ADN amplificado.
Según la invención, el compuesto es inmunomodulador si el nivel (por ejemplo, nivel de proteína o ARN) de la proteína asociada a CRBN en comparación con la referencia disminuye. En una realización, la referencia se prepara utilizando una segunda célula que no está en contacto con el compuesto; en la que la segunda célula es del mismo tipo que la primera célula.
En otra realización, se proporcionan aquí métodos para evaluar la eficacia de un compuesto en el tratamiento de un cáncer o una enfermedad inflamatoria, que comprenden: (a) administrar un compuesto a un sujeto que tiene cáncer o enfermedad inflamatoria; (b) obtener una primera muestra del sujeto; (c) determinar el nivel de una proteína asociada a CRBN en la primera muestra; y (d) comparar el nivel de la proteína asociada a CRBN de la etapa (c) con el nivel de la misma proteína obtenida de una muestra de referencia, en los que una disminución en el nivel en comparación con la referencia es indicativa de la eficacia del compuesto en el tratamiento de. En ciertas realizaciones, el cáncer es, por ejemplo, un tumor sólido o cáncer de sangre como se describe en la Sección 5.2.3 a continuación, y la enfermedad inflamatoria es, por ejemplo, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren, esclerosis sistémica, otras enfermedades inflamatorias o autoinmunes, o una enfermedad inflamatoria como se describe en la Sección 2.2 anterior. En ciertas realizaciones, la enfermedad o trastorno es mieloma múltiple, leucemia linfocítica crónica, linfoma no Hodgkin, linfoma de células del manto, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren, o esclerosis sistémica. En algunas realizaciones, la muestra se obtiene de una biopsia de tumor, una biopsia de ganglio o una biopsia de médula ósea, bazo, hígado, cerebro o mama.
En cierta realización, la etapa (c) comprende: (i) poner en contacto las proteínas dentro de la primera muestra de la etapa (b) con un primer anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a una proteína asociada a CRBN; (ii) poner en contacto las proteínas unidas al primer anticuerpo con un segundo anticuerpo con un marcador detectable, en la que el segundo anticuerpo se une inmunoespecíficamente a la proteína asociada a CRBN, y en la que el segundo anticuerpo se une inmunoespecíficamente a un epítopo diferente en la proteína asociada a CRBN que el primer anticuerpo; (iii) detectar la presencia del segundo anticuerpo unido a las proteínas; y (iv) determinar la cantidad de la proteína asociada a CRBN basándose en la cantidad de marcador detectable en el segundo anticuerpo.
En cierta realización, la etapa (c) comprende: (i) poner en contacto el ARN dentro de la primera muestra con un cebador que comprende una secuencia que se une específicamente al ARN para generar una primera molécula de ADN que tiene una secuencia complementaria al ARN; (ii) amplificar el ADN correspondiente a un segmento de un gen que codifica la proteína asociada a CRBN; y (iii) determinar el nivel de ARN de la proteína asociada a CRBN en función de la cantidad de ADN amplificado.
Según la invención, es probable que el compuesto sea eficaz en el tratamiento del cáncer o la enfermedad inflamatoria si el nivel (por ejemplo, el nivel de proteína o ARN) de la proteína asociada a CRBN en comparación con la referencia disminuye. En una realización, la referencia se prepara utilizando una segunda muestra obtenida del sujeto antes de la administración del compuesto al sujeto; en la que la segunda muestra es de la misma fuente que la primera muestra. En una realización, la referencia se prepara usando una segunda muestra obtenida de un sujeto sano que no tiene enfermedad o trastorno; y en la que la segunda muestra proviene de la misma fuente que la primera muestra.
En diversas realizaciones de los métodos proporcionados aquí, el compuesto es un compuesto proporcionado en la Sección 5.3 a continuación. En diversas realizaciones de los métodos proporcionados aquí, el compuesto inmunomodulador es talidomida, lenalidomida, pomalidomida, 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona o 3-(4-((4-(morfolinometil)bencil)oxi)-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona, un estereoisómero del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo del mismo. Según la invención, el compuesto disminuye el nivel (por ejemplo, el nivel de proteína o ARN) de la proteína asociada a CRBN en comparación con la referencia.
Los métodos proporcionados aquí se basan, en parte, en el descubrimiento de que CRBN está asociado con las actividades antiproliferativas de ciertos fármacos, tales como los compuestos proporcionados aquí. CRBN o una proteína asociada a CRBN se pueden utilizar como biomarcadores para indicar la eficacia o el progreso del tratamiento de una enfermedad con un compuesto proporcionado aquí. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, los métodos proporcionados aquí son útiles para caracterizar un cáncer o una enfermedad inflamatoria en un sujeto, antes, durante o después de que el sujeto reciba un tratamiento de un compuesto inmunomodulador (por ejemplo, un compuesto proporcionado en la Sección 5.3 a continuación).
Sin estar limitado a una teoría en particular, la unión de CRBN puede contribuir o incluso ser necesaria para actividades antiproliferativas u otras actividades de ciertos compuestos, tales como los compuestos proporcionados aquí. En ciertas realizaciones, los compuestos proporcionados aquí se dirigen a CRBN o a una o más proteínas asociadas a CRBN. En una realización, los compuestos proporcionados aquí se unen directamente a CRBN-DDB1 y/o al complejo ubiquitina-ligasa CRBN E3. Las mutaciones en CRBN podrían estar asociadas con resistencia a los compuestos proporcionados aquí.
Por ejemplo, los niveles de CRBN fueron significativamente más bajos en la línea de células resistentes a pomalidomida DF15R y en las células resistentes a lenalidomida, H929 R10-1, H929 R10-2, H929 R10-3, H929 R10-4 y MM1/R en comparación con las líneas parentales coincidentes. Además, se encontró una mutación interesante en el gen CRBN de una de las líneas de mieloma que había adquirido resistencia a la lenalidomida, mientras que en la línea parental el gen CRBN era de tipo salvaje. Esta mutación se cartografió al dominio de unión DDB1 en CRBN. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la sensibilidad de una célula cancerosa, por ejemplo una célula de mieloma, o un paciente que tiene cáncer, a la terapia con un compuesto proporcionado aquí está relacionada con la expresión de CRBN.
En el linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) recidivante o refractario, se observaron respuestas más altas en el subtipo similar a células B activadas (ABC) que en el subtipo similar a células B del centro germinal. Como se proporciona aquí, utilizando líneas celulares DLBCL, se demostró que el tratamiento con lenalidomida suprimió preferentemente la proliferación de células ABC-DLBCLin vitroy retrasó el crecimiento del tumor en un modelo de xenoinjerto tumoral humano, con un efecto mínimo en las células no ABC-DLBCL. Este efecto tumoricida se asoció con la regulación negativa del factor regulador del interferón 4 (IRF4), un sello distintivo de las células ABC-DLBCL.
La inhibición de IRF4 por lenalidomida provocó una regulación negativa de la activación de NF-kB dependiente del receptor de células B (BCR). Mientras que el ARNi específico de IRF4 imitó los efectos de la lenalidomida al reducir la activación de NF-kB, la sobreexpresión de IRF4 mejoró la activación de NF-kB y confirió resistencia a la lenalidomida. Además, la regulación negativa de IRF4 inducida por lenalidomida requirió la expresión de CRBN. Sin estar limitados por una teoría en particular, estos datos muestran que la lenalidomida puede tener actividad antitumoral directa contra las células DLBCL, preferentemente las células ABC-DLBCL, al bloquear la expresión de IRF4 y la ruta de señalización BCR-NF-kB de una manera dependiente de CRBN.
Se ha propuesto que la proteína CRBN funciona como un receptor de sustrato para los complejos Cul4-E3-ligasa a través de su interacción con DDB1. Como se describe aquí, se ha investigado si la ubiquitinaciónin vivoestá asociada con respuestas a fármacos en células de mieloma múltiple. En las células H929, los compuestos proporcionados aquí disminuyen la poliubiquitinación total ligada a K48 pero no la ubiquitinación ligada a K-63 después de 30 minutos de tratamiento. En la actualidad, se informa que casi dos docenas de proteínas son degradadas por una Cul4-DDB1 ligasa 2. Varios estudios han demostrado la ubiquitinación dependiente de Cul4/DDB1 de histonas centrales, proteínas de reparación del ADN, reguladores del ciclo celular y moléculas clave de las rutas de señalización. La señalización de mTORC1 requiere la función proteasomal y la participación de la ligasa ubiquitina E3 CUL4-DDB1. Utilizando la tecnología CST Ubiscan, se identificaron 162 péptidos de ubiquitina únicos que fueron modulados significativamente por los compuestos proporcionados aquí después de tratamientos cortos (1 - 4 h). Las proteínas correspondientes participan en la función del nucleasoma y la cromatina, en el ensamblaje proteína-ADN y en la histona H2A. Se está investigando la relevancia de esta modificación temprana en el modo de acción de los compuestos proporcionados aquí y su relación con las actividades de CRBN y CUL4/DDB1.
En ciertas realizaciones, los métodos proporcionados aquí son útiles para evaluar la sensibilidad clínica y la respuesta del paciente al tratamiento con un compuesto inmunomodulador (por ejemplo, un compuesto proporcionado en la Sección 5.3 a continuación). En una realización, el compuesto inmunomodulador proporcionado aquí regula (por ejemplo, regula a la baja o disminuye) CRBN o una o más proteínas asociadas a CRBN. En otra realización, el compuesto inmunomodulador proporcionado aquí se une directamente a CRBN-DDB1.
De acuerdo con el método de la presente invención, las proteínas asociadas a CRBN son IKZF1 e IKZF3. Otras proteínas asociadas a CRBN descritas aquí son DDB1, DDB2, GSK3B, CUL4A, CUL4B, XBP-1, FAS1, RANBP6, DUS3L, PHGDH, AMPK, IRF4 o NFkB. Otros ejemplos de proteínas asociadas a CRBN incluyen DDB1, PABPC1, HNRNPR, RPL19, SYNCRIP, H2AFX, HSPA8, ALDOA, HIST1H2AA, HSPA1A, XRCC6, RPL12, RPL18A, RPL4, HNRNPA2B1, HNRNPC, RPS2, SEC24C, RPL9, USP15, SEC24A, CTPS, ABCE1, EEF1A1, IPO5, CPSF6, KCNAB2, C7ORF42, SMC4, GNB3, H2AFZ, HIST1H1C, HIST1H1 D, HIST1H1 E, ACTB, CSNK2A1, CRBN, DDX21, DHX9, DNAJC1, G3BP1, HSPA1B, IGF2BP2, RPL10A, RPL13A, RPL14, RPL15, RPL21, RPL3, RPL30, RPL7, RPL7A, RPLP1, RPLP2, MYH10, ILF3, NCL, RPS13, RPS16, RPS19, RPS6, SND1, EIF2S2, HNRNPH2, UBB, EEF1G, TBL1XR1, NACA, EIF4A1, FASN, PPAT, G3BP2, TUBA1A, UBAP2L, MCM2, UAP1, TUBA1C, EIF2S1, EIF3J, PRKDC, MCM7, RPL11, TUBA1B, STAT3, PTRH2, PABPC4, PTPRC, MACF1, UBE2O, DUT, GNB2L1, NUP88, H2AFJ, SEC23B, PDXK, ACLY, ARID1A, GBE1, HSPA9, DDX17, FUBP1, FBXO21, EWSR1, IFI16, YWHAE, UBA52, COPS6, GNAS, UBE2Q1, FERMT3, NAP1L2, TPD52, VAPA, EEF1AL3, DDIT4, NEDD8, HIST1H1A, HIST1H1B, o PCM1,
Según la invención, una de las proteínas asociadas a CRBN es IKZF3 (también conocida como "Aiolos"). En una realización de los métodos proporcionados aquí, la proteína asociada a CRBN es IKZF3 que tiene un peso molecular de proteína de 58 kDa. En una realización de los métodos proporcionados aquí, la proteína asociada a CRBN es IKZF3 que tiene un peso molecular de proteína de 42 kDa. De acuerdo con la invención, los compuestos inmunomoduladores proporcionados aquí regulan negativamente la expresión de IKZF3 (Aiolos) (por ejemplo, la expresión de proteínas). En otra realización, los compuestos inmunomoduladores proporcionados aquí regulan negativamente la expresión de IL-2. En otra realización, los IMiD proporcionados aquí regulan negativamente la expresión de Aiolos (por ejemplo, expresión de proteínas o genes). En otra realización, la pomalidomida regula negativamente la expresión de Aiolos (por ejemplo, expresión de proteínas o genes). En otra realización, la lenalidomida regula negativamente la expresión de Aiolos (por ejemplo, expresión de proteínas o genes).
IKZF3, también conocido como "Aiolos", es un miembro de la familia Ikaros de proteínas de dedos de zinc. IKZF3 es un factor de transcripción hematopoyético específico involucrado en la regulación del desarrollo de los linfocitos (por ejemplo, proliferación y diferenciación de los linfocitos B). El dominio de unión al ADN de IKZF3 reconoce el motivo central de GGGA. Se demostró que IKZF3 participa en la remodelación de la cromatina, regula a los miembros de la familia Bcl, se une a HDAC, mSin3, Mi-2 en las células T y actúa como represor transcripcional. Se ha demostrado que la interacción Aiolos-Foxp3 silencia la expresión de IL-2 en las células T humanas.
Según la invención, una de las proteínas asociadas a CRBN es IKZF1 (también conocida como "Ikaros"). De acuerdo con la invención, los compuestos proporcionados aquí regulan negativamente la expresión de Ikaros (por ejemplo, expresión de proteínas o genes). En otra realización, el compuesto es pomalidomida, y la expresión de Ikaros (por ejemplo, expresión de proteínas o genes) está regulada negativamente. En otra realización, el compuesto es lenalidomida, y la expresión de Ikaros (por ejemplo, expresión de proteínas o genes) está regulada negativamente. En otra realización, el compuesto es 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona, y la expresión de Ikaros (por ejemplo, expresión de proteínas o genes) está regulada negativamente. En otra realización, el compuesto es 3-(4-((4-(morfolinometil)bencil)oxi)-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona, y la expresión de Ikaros (por ejemplo, expresión de proteínas o genes) está regulada negativamente. En otra realización, el compuesto es el estereoisómero (S) de 3-(4-((4-(morfolinometil)bencil)oxi)-1 -oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona, y la expresión de Ikaros (por ejemplo, expresión de proteínas o genes) está regulada negativamente.
La invención proporciona métodos para determinar si un compuesto es inmunomodulador, que comprenden: (a) poner en contacto una primera célula con el compuesto; (b) obtener una primera muestra de la primera célula de la etapa (a); (c) determinar los niveles de Ikarios y Aiolos en la primera muestra; y (d) comparar los niveles de Ikaros y Aiolos de la etapa (c) con los niveles de Ikarios y Aiolos obtenidos a partir de una muestra de referencia, en los que una disminución en los niveles de Ikaros y Aiolos en comparación con la referencia es indicativa de la eficacia del compuesto como compuesto inmunomodulador. Según la invención, la puesta en contacto en la etapa (a) se realizain vitro.En una realización, las células se ponen en contacto con el compuesto durante un período de tiempo, por ejemplo 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o 55 minutos, o 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 horas, o 2 o 3 o más días. En algunas realizaciones, las células son células mononucleares de sangre periférica, células B, células T, monocitos o granulocitos. En otras realizaciones, las células son células tumorales o cancerosas, por ejemplo, linfoma, mieloma o leucemia. En una realización, las células tumorales o cancerosas se obtienen de una línea celular.
En ciertas realizaciones, la etapa (c) comprende: (i) poner en contacto las proteínas dentro de la primera muestra de la etapa (b) con un primer anticuerpo Ikaros y un primer anticuerpo Aiolos que se unen inmunoespecíficamente a Ikaros y Aiolos, respectivamente; (ii) poner en contacto las proteínas unidas al primer anticuerpo Ikaros y al primer anticuerpo Aiolos con un segundo anticuerpo Ikaros con un marcador detectable y un segundo anticuerpo Aiolos con un marcador detectable, en la que el segundo anticuerpo Ikaros y el segundo anticuerpo Aiolos se unen inmunoespecíficamente a Ikaros y Aiolos, respectivamente, y en la que el segundo anticuerpo Ikaros y el segundo anticuerpo Aiolos se unen inmunoespecíficamente a un epítopo diferente en Ikaros y Aiolos, respectivamente, del primer anticuerpo Ikaros y el primer anticuerpo Aiolos respectivamente; (iii) detectar la presencia del segundo anticuerpo Ikaros y del segundo anticuerpo Aiolos unidos a las proteínas; y (iv) determinar los niveles de Ikaros y Aiolos basándose en la cantidad de marcador detectable en el segundo anticuerpo Ikaros y la cantidad de marcador detectable en el segundo anticuerpo Aiolos.
En ciertas realizaciones, la etapa (c) comprende: (i) poner en contacto el ARN dentro de la primera muestra con un cebador que comprende una secuencia que se une específicamente al ARN para generar una primera molécula de ADN que tiene una secuencia complementaria al ARN; (ii) amplificar el ADN correspondiente a segmentos de genes que codifican Ikaros y Aiolos, respectivamente, y (iii) determinar los niveles de ARN de Ikaros y Aiolos en función de las cantidades de ADN amplificado.
Según la invención, el compuesto es inmunomodulador si los niveles (por ejemplo, los niveles de proteína o ARN de Ikaros y Aiolos en comparación con la referencia disminuyen. En una realización, la referencia se prepara utilizando una segunda célula que no está en contacto con el compuesto; en la que la segunda célula es del mismo tipo que la primera célula.
En otra realización, se proporcionan aquí métodos para evaluar la eficacia de un compuesto en el tratamiento de una enfermedad o trastorno, que comprenden: (a) administrar un compuesto a un sujeto que tiene la enfermedad o trastorno; (b) obtener una primera muestra del sujeto; (c) determinar los niveles de Ikaros y Aiolos en la primera muestra; y (d) comparar los niveles de Ikaros y Aiolos de la etapa (c) con los niveles de Ikaros y Aiolos obtenidos de una muestra de referencia, en los que una disminución en el nivel en comparación con la referencia es indicativa de la eficacia del compuesto en el tratamiento de la enfermedad o trastorno. Según la invención, la enfermedad o trastorno es cáncer (por ejemplo, tumor sólido o cáncer de sangre como se describe en la sección 5.2.3 a continuación) o una enfermedad inflamatoria tal como lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren, esclerosis sistémica, otras enfermedades inflamatorias o autoinmunes, o una enfermedad inflamatoria como se describe en la sección 2.2 anterior. En ciertas realizaciones, la enfermedad o trastorno es mieloma múltiple, leucemia linfocítica crónica, linfoma no Hodgkin, linfoma de células del manto, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren, o esclerosis sistémica. En algunas realizaciones, la muestra se obtiene de una biopsia de tumor, una biopsia de ganglio o una biopsia de médula ósea, bazo, hígado, inserto de cerebro o mama.
En una realización, se proporcionan aquí métodos para detectar y cuantificar los niveles de proteína de Ikaros y Aiolos de una muestra biológica, que comprenden: (a) poner en contacto la muestra con un primer anticuerpo Ikaros y un primer anticuerpo Aiolos que se unen inmunoespecíficamente a Ikaros y Aiolos, respectivamente; (b) poner en contacto la muestra unida al primer anticuerpo Ikaros y al primer anticuerpo Aiolos con un segundo anticuerpo Ikaros con un marcador detectable y un segundo anticuerpo Aiolos con un marcador detectable, en los que el segundo anticuerpo Ikaros y el segundo anticuerpo Aiolos se unen inmunoespecíficamente a Ikaros y Aiolos, respectivamente, y en los que el segundo anticuerpo Ikaros y el segundo anticuerpo Aiolos se unen inmunoespecíficamente a un epítopo diferente en Ikaros y Aiolos, respectivamente, del primer anticuerpo Ikaros y el primer anticuerpo Aiolos respectivamente; (c) detectar la presencia del segundo anticuerpo Ikaros y del segundo anticuerpo Aiolos unidos a la muestra; y (d) determinar el nivel de proteína de Ikaros y Aiolos basándose en la cantidad de marcador detectable en el segundo anticuerpo Ikaros y la cantidad de marcador detectable en el segundo anticuerpo Aiolos.
En ciertas realizaciones, la etapa (c) comprende: (i) poner en contacto el ARN dentro de la primera muestra con un cebador que comprende una secuencia que se une específicamente al ARN para generar una primera molécula de ADN que tiene una secuencia complementaria al ARN; (ii) amplificar el ADN correspondiente a segmentos de genes que codifican Ikaros y Aiolos, respectivamente; y (iii) determinar los niveles de ARN de Ikaros y Aiolos en función de las cantidades de ADN amplificado.
Según la invención, es probable que el compuesto sea eficaz en el tratamiento del cáncer o la enfermedad inflamatoria si los niveles (por ejemplo, los niveles de proteína o ARN de Aiolos o Ikaros en comparación con los niveles de referencia) disminuyen. En una realización, la referencia se prepara utilizando una segunda muestra obtenida del sujeto antes de la administración del compuesto al sujeto; en la que la segunda muestra es de la misma fuente que la primera muestra. En otra realización, la referencia se prepara utilizando una segunda muestra obtenida de un sujeto sano que no tiene cáncer ni enfermedad inflamatoria; en la que la segunda muestra proviene de la misma fuente que la primera muestra.
En diversas realizaciones de los métodos proporcionados aquí, el compuesto es un compuesto proporcionado en la Sección 5.3 a continuación. En diversas realizaciones de los métodos proporcionados aquí, el compuesto inmunomodulador es talidomida, lenalidomida, pomalidomida, 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona o 3-(4-((4-(morfolinometil)bencil)oxi)-1 -oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona, un estereoisómero del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo del mismo. En una realización, el compuesto disminuye el nivel (por ejemplo, el nivel de proteína o ARN) de la proteína asociada a CRBN en comparación con la referencia. En otra realización, el compuesto aumenta el nivel (por ejemplo, el nivel de proteína o ARN) de la proteína asociada a CRBN en comparación con la referencia. Según la invención, el compuesto disminuye el nivel (por ejemplo, el nivel de proteína o ARN) de Aiolos o Ikaros en comparación con la referencia. En otra realización, el compuesto disminuye el nivel (por ejemplo, nivel de proteína o ARN) de Aiolos que tiene un peso molecular de proteína de 42 kDa en comparación con la referencia. En otra realización, el compuesto aumenta el nivel (por ejemplo, nivel de proteína o ARN) de Aiolos que tiene un peso molecular de proteína de 42 kDa en comparación con la referencia. En otra realización, el compuesto disminuye el nivel (por ejemplo, nivel de proteína o ARN) de Aiolos que tiene un peso molecular de 58 kDa en comparación con la referencia.
Según la presente invención, la enfermedad o trastorno es cáncer o una enfermedad inflamatoria. En diversas realizaciones de los métodos proporcionados aquí, la enfermedad o trastorno es mieloma múltiple, leucemia linfocítica crónica, linfoma no Hodgkin, linfoma de células del manto, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren o esclerosis sistémica.
6.2.1 Métodos de detección y cuantificación de las proteínas cereblon o asociadas a cereblon
Se proporcionan aquí métodos para detectar y cuantificar el nivel de proteína de la proteína asociada a CRBN de una muestra biológica, que comprenden: (a) poner en contacto la muestra con un primer anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a la proteína asociada a CRBN; (b) poner en contacto la muestra unida al primer anticuerpo con un segundo anticuerpo con un marcador detectable, en los que el segundo anticuerpo se une inmunoespecíficamente a la proteína asociada a CRBN, y en los que el segundo anticuerpo se une inmunoespecíficamente a un epítopo diferente en la proteína asociada a CRBN que el primer anticuerpo; (c) detectar la presencia del segundo anticuerpo unido a la muestra; y (d) determinar el nivel de proteína de la proteína asociada a CRBN basándose en la cantidad de marcador detectable en el segundo anticuerpo.
En ciertas realizaciones, se proporcionan aquí métodos para detectar y cuantificar el nivel de ARN (por ejemplo, ARNm) de la proteína asociada a CRBN de una muestra biológica, que comprende: (a) obtener ARN de la muestra; (b) poner en contacto el ARN con un cebador que comprende una secuencia que se une específicamente a una secuencia en el ARN para generar una primera molécula de ADN que tiene una secuencia complementaria a dicho ARN; (c) amplificar el ADN correspondiente a un segmento de un gen que codifica la proteína asociada a CRBN; y (d) determinar el nivel de ARN de la proteína asociada a CRBN basándose en las proteínas IKF1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos). Otras cantidades de CRBN del ADN amplificado. Las proteínas asociadas descritas aquí son
Según la presente invención, las proteínas asociadas a CRBN son IKF1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos). Otras proteínas asociadas a CRBN descritas aquí son DDB1, DDB2, GSK3B, CUL4A, CUL4B, XBP-1, FAS1, RANBP6, DUS3L, PHGDH, AMPK, IRF4 o NFkB. En otros aspectos de la descripción, la proteína asociada a CRBN es DDB1, PABPC1, HNRNPR, RPL19, SYNCRIP, H2AFX, HSPA8, ALDOA, HIST1H2AA, HSPA1A, XRCC6, RPL12, RPL18A, RPL4, HNRNPA2B1, HNRNPC, RPS2, SEC24C, RPL9, USP15, SEC24A, CTPS, ABCE1, EEF1A1, IPO5, CPSF6, KCNAB2, C7ORF42, SMC4, GNB3, H2AFZ, HIST1H1C, HIST1H1 D, HIST1H1 E, ACTB, CSNK2A1, CRBN, DDX21, DHX9, DNAJC1, G3BP1, HSPA1B, IGF2BP2, RPL10A, RPL13A, RPL14, RPL15, RPL21, RPL3, RPL30, RPL7, RPL7A, RPLP1, RPLP2, MYH10, ILF3, NCL, RPS13, RPS16, RPS19, RPS6, SND1, EIF2S2, HNRNPH2, UBB, EEF1G, TBL1XR1, NACA, EIF4A1, FASN, PPAT, G3BP2, TUBA1A, UBAP2L, MCM2, UAP1, TUBA1C, EIF2S1, EIF3J, PRKDC, MCM7, RPL11, TUBA1B, STAT3, PTRH2, PABPC4, PTPRC, MACF1, UBE2O, DUT, GNB2L1, NUP88, H2AFJ, SEC23B, PDXK, ACLY, ARID1A, GBE1, HSPA9, DDX17, FUBP1, FBXO21, EWSR1, IFI16, YWHAE, UBA52, COPS6, GNAS, UBE2Q1, FERMT3, NAP1L2, TPD52, VAPA, EEF1AL3, DDIT4, NEDD8, HIST1H1A, HIST1H1B, o PCM1. En el contexto de la invención, las proteínas asociadas a CRBN son IKF1 e IKZF3.
En una realización, se proporcionan aquí métodos para detectar y cuantificar los niveles de proteína de Ikaros y Aiolos de una muestra biológica, que comprenden: (a) poner en contacto la muestra con un primer anticuerpo Ikaros y un primer anticuerpo Aiolos que se unen inmunoespecíficamente a Ikaros y Aiolos, respectivamente; (b) poner en contacto la muestra unida al primer anticuerpo Ikaros y al primer anticuerpo Aiolos con un segundo anticuerpo Ikaros con un marcador detectable y un segundo anticuerpo Aiolos con un marcador detectable, en los que el segundo anticuerpo Ikaros y el segundo anticuerpo Aiolos se unen inmunoespecíficamente a Ikaros y Aiolos, respectivamente, y en los que el segundo anticuerpo Ikaros y el segundo anticuerpo Aiolos se unen inmunoespecíficamente a un epítopo diferente en Ikaros y Aiolos, respectivamente, del primer anticuerpo Ikaros y el primer anticuerpo Aiolos respectivamente; (c) detectar la presencia del segundo anticuerpo Ikaros y del segundo anticuerpo Aiolos unidos a la muestra; y (d) determinar el nivel de proteína de Ikaros y Aiolos basándose en la cantidad de marcador detectable en el segundo anticuerpo Ikaros y la cantidad de marcador detectable en el segundo anticuerpo Aiolos.
En otra realización, se proporcionan aquí métodos para detectar y cuantificar los niveles de ARN (por ejemplo, ARNm) de Ikaros y Aiolos de una muestra biológica, que comprenden: (a) obtener ARN de la muestra; (b) poner en contacto el ARN con un cebador que comprende una secuencia que se une específicamente a una secuencia en el ARN para generar una primera molécula de ADN que tiene una secuencia complementaria a dicho ARN; (c) amplificar el ADN correspondiente a segmentos de genes que codifican Ikaros y Aiolos, respectivamente y (d) determinar los niveles de ARN de Ikaros y Aiolos en función de las cantidades de ADN amplificado.
En ciertas realizaciones de los diversos métodos proporcionados aquí, las dos o más etapas se realizan secuencialmente. En otras realizaciones de los métodos proporcionados aquí, dos o más etapas se realizan en paralelo (por ejemplo, al mismo tiempo).
Los ensayos ejemplares proporcionados aquí para los métodos de detección y cuantificación del nivel de proteína de la proteína asociada a CRBN son inmunoensayos tales como análisis de transferencia Western y un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) (por ejemplo, un ELISA tipo sándwich). Un ensayo ejemplar proporcionado aquí para los métodos de detección y cuantificación del nivel de ARN de la proteína asociada a CRBN es la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR), por ejemplo PCR cuantitativa o qPCR.
6.2.2 Sujetos y muestras
En ciertas realizaciones, los diversos métodos proporcionados aquí utilizan muestras (por ejemplo, muestras biológicas) de sujetos o individuos (por ejemplo, pacientes). El sujeto puede ser un paciente, por ejemplo un paciente con un cáncer de sangre tal como mieloma múltiple, leucemia o un linfoma; inflamación o enfermedad residual mínima. El sujeto puede ser un mamífero, por ejemplo un ser humano. El sujeto puede ser hombre o mujer, y puede ser un adulto, un niño o un lactante. Las muestras se pueden analizar en un momento durante una fase activa de una enfermedad o trastorno, o cuando una enfermedad o trastorno está inactivo. En ciertas realizaciones, se puede obtener más de una muestra de un sujeto.
En ciertas realizaciones, la muestra utilizada en los métodos proporcionados aquí comprende fluidos corporales de un sujeto. Los ejemplos no limitativos de fluidos corporales incluyen sangre (por ejemplo, sangre entera periférica, sangre periférica), plasma sanguíneo, líquido amniótico, humor acuoso, bilis, cerumen, líquido de Cowper, líquido preeyaculatorio, quilo, quimo, eyaculación femenina, líquido intersticial, linfa, menstruación, leche materna, moco, líquido pleural, pus, saliva, sebo, semen, suero, sudor, lágrimas, orina, lubricación vaginal, vómito, agua, heces, fluidos corporales internos, incluido el líquido cefalorraquídeo que rodea el cerebro y la médula espinal, el líquido sinovial que rodea las articulaciones de los huesos, el líquido intracelular es el líquido dentro de las células, y el humor vítreo son los fluidos en el globo ocular. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de sangre. La muestra de sangre se puede obtener utilizando técnicas convencionales como se describe, por ejemplo, en Innis et al, editores, PCR Protocols (Academic Press, 1990). Los glóbulos blancos se pueden separar de las muestras de sangre utilizando técnicas convencionales o kits disponibles comercialmente, por ejemplo el kit RosetteSep (Stein Cell Technologies, Vancouver, Canadá). Las subpoblaciones de glóbulos blancos, por ejemplo, células mononucleares, células B, células T, monocitos, granulocitos o linfocitos, se pueden aislar aún más utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, clasificación celular activada magnéticamente (MACS) (Miltenyi Biotec, Auburn, California) o clasificación de células activadas mediante fluorescencia (FACS) (Becton Dickinson, San José, California).
En una realización, la muestra de sangre es de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 10,0 ml, de aproximadamente 0,2 ml a aproximadamente 7 ml, de aproximadamente 0,3 ml a aproximadamente 5 ml, de aproximadamente 0,4 ml a aproximadamente 3,5 ml, o de aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 3 ml. En otra realización, la muestra de sangre es de aproximadamente 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 o 10,0 ml.
En algunas realizaciones, la muestra utilizada en los presentes métodos comprende una biopsia (por ejemplo, una biopsia de tumor). La biopsia puede ser de cualquier órgano o tejido, por ejemplo, piel, hígado, pulmón, corazón, colon, riñón, médula ósea, dientes, ganglio linfático, cabello, bazo, cerebro, mama u otros órganos. Cualquier técnica de biopsia conocida por los expertos en la técnica se puede utilizar para aislar una muestra de un sujeto, por ejemplo biopsia abierta, biopsia cerrada, biopsia con aguja gruesa, biopsia incisional, biopsia escisional o biopsia por aspiración con aguja fina.
En una realización, la muestra utilizada en los métodos proporcionados aquí se obtiene del sujeto antes de que el sujeto reciba un tratamiento para la enfermedad o trastorno. En otra realización, la muestra se obtiene del sujeto mientras éste recibe un tratamiento para la enfermedad o trastorno. En otra realización, la muestra se obtiene del sujeto después de que el sujeto recibe un tratamiento para la enfermedad o trastorno. En diversas realizaciones, el tratamiento comprende administrar un compuesto (por ejemplo, un compuesto proporcionado en la Sección 5.3 a continuación) al sujeto.
6.2.3 Tipos de células
En ciertas realizaciones, la muestra utilizada en los métodos proporcionados aquí comprende una pluralidad de células. Estas células pueden incluir cualquier tipo de células, por ejemplo células madre, células sanguíneas (por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica), linfocitos, células B, células T, monocitos, granulocitos, células inmunes o células tumorales o cancerosas. El tumor o las células cancerosas o un tejido tumoral, tal como una biopsia de tumor o un explanto de tumor. Las células T (linfocitos T) incluyen, por ejemplo, células T auxiliares (células T efectoras o células Th), células T citotóxicas (CTL), células T de memoria, y células T reguladoras. En una realización, las células utilizadas en los métodos proporcionados aquí son células T CD3+, por ejemplo detectadas mediante citometría de flujo. El número de células T utilizadas en los métodos puede variar desde una sola célula hasta aproximadamente 109 células. Las células B (linfocitos B) incluyen, por ejemplo, células B plasmáticas, células B de memoria, células B1, células B2, células B de la zona marginal y células B foliculares. Las células B pueden expresar inmunoglobulinas (anticuerpos, receptor de células B). En una realización, las células utilizadas en los métodos proporcionados aquí son células B CD20+, por ejemplo detectadas mediante citometría de flujo.
Se pueden obtener poblaciones de células específicas utilizando una combinación de anticuerpos disponibles comercialmente (por ejemplo, Quest Diagnostic (San Juan Capistrano, California); Dako (Dinamarca)).
Las células de los métodos proporcionados aquí pueden obtenerse a partir de una línea celular. En ciertas realizaciones, la línea celular es la línea celular DF15R resistente a pomalidomida. En otras realizaciones, la línea celular es la línea celular H929 R10-1, H929 R10-2, H929 R10-3, H929 R10-4 o MM1/R resistente a lenalidomida. En ciertas realizaciones, la línea celular utilizada en los métodos proporcionados aquí es una línea celular de linfoma. En ciertas realizaciones, la línea celular es una línea celular de leucemia. En ciertas realizaciones, la línea celular es una línea celular ABC-DLBCL (linfoma difuso de células B grandes similar a células B activadas), por ejemplo, la línea celular U2932. En ciertas realizaciones, la línea celular es una línea celular GCB-DLBCL (linfoma difuso de células B grandes tipo célula B de centro germinal), por ejemplo, la línea celular OCI-LY19 o WSU-DLBCL2. En ciertas realizaciones, la línea celular es una línea celular MCL, por ejemplo, la línea celular Rec-1, Mino, JeKo-1 o GRANta-519. En ciertas realizaciones, la línea celular es una línea celular MCL, por ejemplo, la línea celular U266. En una realización, la línea celular es U2932, OCI-LY19, WSU-DLBCL2, Rec-1, Mino, JeKo-1, GRANta-519 o U266. En otra realización, la línea celular tumoral o cancerosa es una línea celular del cáncer de sangre o tumor sólido que se describe a continuación. En otra realización, el tejido tumoral proviene de un individuo que tiene un cáncer, por ejemplo, un tumor sólido o un cáncer de sangre.
En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer de sangre. En una realización, el cáncer de sangre es mieloma múltiple. En otra realización, el cáncer de sangre es leucemia linfocítica crónica (LLC). En otra realización, el cáncer de sangre es un linfoma difuso de células B grandes (DLBCL). En otra realización, el cáncer de sangre es síndrome mielodisplásico, una leucemia aguda, por ejemplo, leucemia aguda de células T, leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia promielocítica aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia megacarioblástica aguda, leucemia linfoblástica aguda de precursores B, leucemia linfoblástica aguda de precursores T, leucemia de Burkitt (linfoma de Burkitt) o leucemia bifenotípica aguda; una leucemia crónica, por ejemplo, linfoma mieloide crónico, leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia monocítica crónica, linfoma linfocítico pequeño o leucemia prolinfocítica de células B; linfoma de células pilosas; leucemia prolinfocítica de células T; o un linfoma, por ejemplo, linfoma histiocítico, linfoma linfoplasmocítico (por ejemplo, macroglobulinemia de Waldenstrom), linfoma de la zona marginal esplénica, neoplasia de células plasmáticas (por ejemplo, mieloma de células plasmáticas, plasmocitoma, una enfermedad por depósito de inmunoglobulina monoclonal o una enfermedad de la cadena pesada), linfoma de células B de la zona marginal extranodal (linfoma MALT), linfoma de células B de la zona marginal nodal (NMZL), linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma difuso de células B grandes, linfoma mediastínico (tímico) de células B grandes, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de derrame primario, leucemia linfocítica granular grande de células T, leucemia de células NK agresiva, leucemia/linfoma de células T adultas, linfoma de células NK/T extranodal, tipo nasal, linfoma de células T de tipo enteropatía, linfoma de células T hepatoesplénico, linfoma de células NK blástico, micosis fungoide (síndrome de Sézary), un linfoma cutáneo primario Trastorno linfoproliferativo de células T CD30-positivo (por ejemplo, linfoma anaplásico de células grandes cutáneo primario o papulosis linfomatoide), linfoma de células T angioinmunoblástico, linfoma de células T periférico, linfoma anaplásico de células grandes no especificado, linfoma de Hodgkin o linfoma de Hodgkin con predominio linfocítico nodular.
En otras realizaciones, el cáncer es un tumor sólido, por ejemplo un carcinoma, tal como un adenocarcinoma, un carcinoma adrenocortical, un adenocarcinoma de colon, un adenocarcinoma colorrectal, un carcinoma colorrectal, un carcinoma de células ductales, un carcinoma de pulmón, un carcinoma de tiroides, un carcinoma nasofaríngeo, un melanoma (por ejemplo, un melanoma maligno), un carcinoma de piel no melanoma o un carcinoma no especificado; un tumor desmoide; un tumor desmoplásico de células redondas pequeñas ; un tumor endocrino; un sarcoma de Ewing; un tumor de células germinales (por ejemplo, cáncer testicular, cáncer de ovario, coriocarcinoma, tumor del seno endodérmico, germinoma, etc.); un hepatoblastoma; un carcinoma hepatocelular; un neuroblastoma; un sarcoma de tejidos blandos no rabdomiosarcoma; un osteosarcoma; un retinoblastoma; un rabdomiosarcoma; o un tumor de Wilms. En otra realización, el tumor sólido es cáncer de páncreas o cáncer de mama. En otras realizaciones, el tumor sólido es un neurinoma acústico; un astrocitoma (por ejemplo, un astrocitoma pilocítico de grado I, un astrocitoma de bajo grado de grado II; un astrocitoma anaplásico de grado III; o un glioblastoma multiforme de grado IV); un cordoma; un craneofaringioma; un glioma (por ejemplo, un glioma
del tronco encefálico; un ependimoma; un glioma mixto; un glioma del nervio óptico; o un subependimoma); un glioblastoma; un meduloblastoma; un meningioma; un tumor cerebral metastásico; un oligodendroglioma; un pineoblastoma; un tumor hipofisario; un tumor neuroectodérmico primitivo; o un schwannoma. En otra forma de realización, el cáncer es cáncer de próstata.
En ciertas realizaciones, las células tumorales son células de una línea de células tumorales. En otras realizaciones,
las células tumorales son células madre tumorales o células madre cancerosas. En una realización, las células
tumorales son células de mesotelioma, células de melanoma, células de adenoma, células de carcinoma, células
de adenocarcinoma, células de carcinoma ductal, células de leucemia, células de leucemia mielógena aguda,
células de leucemia mieloide aguda, células de leucemia aguda de células T, células de leucemia linfoblástica
aguda, células de leucemia de células pilosas, células de leucemia promielocítica aguda, células de linfoma, células
de linfoma de Burkitt, células de leucemia linfocítica crónica de células B, células de linfoma no Hodgkin, células
de linfoma de Hodgkin o células de mieloma múltiple, células de rabdomiosarcoma, células de osteosarcoma,
células de neuroblastoma, células de astrocitoma o células de glioblastoma. En otra realización, la línea celular
tumoral es 5637 (carcinoma), KHOS/NP (osteosarcoma), MNNG/HOS (osteosarcoma), Saos-2 (osteosarcoma), U-2 OS (osteosarcoma), SJSA-1 (osteosarcoma), CCF-STTG1 (astrocitoma), DBTRG-05MG (glioblastoma), U87 MG (glioblastoma), T98<g>(glioblastoma),<s>K-N-SH (neuroblastoma), SK-N-AS (neuroblastoma), MCF-7 (adenocarcinoma), MDA-MB-231 (adenocarcinoma), MDA-MB-436 (adenocarcinoma), SK-BR-3 (adenocarcinoma),
BT-20 (carcinoma), BT-474 (carcinoma), CAMA-1 (carcinoma), HCC2218 (carcinoma), SW527 (carcinoma), MDA-MB-453 (carcinoma), MDA-MB-435S (carcinoma), T-47D (carcinoma), ZR-75-1 (carcinoma), Ua Cc -812 (carcinoma), HCC1419 (carcinoma), HeLa (adenocarcinoma), Caco-2 (adenocarcinoma), COLO205 (adenocarcinoma), COLO320/DM (adenocarcinoma), DLD-1 (adenocarcinoma), HCT-15 (adenocarcinoma), SK-CO-1 (adenocarcinoma), SW48 (adenocarcinoma), SW480 (adenocarcinoma), HCT-8 (adenocarcinoma), RKO (carcinoma), LS411N (carcinoma), T84 (carcinoma), AGS (adenocarcinoma), KATO III (carcinoma), NCI-N87 (carcinoma), SNU-16 (carcinoma), 769-P (adenocarcinoma), 786-O (adenocarcinoma), ACHN (adenocarcinoma),
A-498 (carcinoma), Caki-1 (carcinoma), G-402 (leiomioblastoma), CML-T1 (leucemia), CTV-1 (leucemia), JVM-2 (leucemia), K562 (leucemia), MHH-CALL2 (leucemia), NALM-6 (leucemia), 8E5 (leucemia), C<c>R<f>-SB (leucemia),
CEM/C1 (leucemia), CEM/C2 (leucemia), CEM-CM3 (leucemia), CCRF-HSB-2 (leucemia), KG-1 (leucemia), KG-1a (leucemia), C<c>R<f>-CEM (leucemia), MOLT-3 (leucemia), SUP-B15 (leucemia), TALL-104 (leucemia), Loucy (leucemia), RS4;11 (leucemia), REH (leucemia), AML-193 (leucemia), THP-1 (leucemia), Mo Lm -13 (leucemia),
Kasumi-1 (leucemia), Kasumi-3 (leucemia), BDCM (leucemia), HL-60 (leucemia), I 2.1 (leucemia), I 9.2 (leucemia), J.gamma1.WT (leucemia), J.<r>T3-T3.5 (leucemia), P116 (leucemia), P116.cl39 [P116.c39] (leucemia), D1.1 (leucemia), J45.01 (leucemia), MV-4-11 (leucemia), Kasumi-4 (leucemia), MEG-01 (leucemia), KU812 (leucemia),
Mo (leucemia), JM1 (leucemia), GDM-1 (leucemia), CESS (leucemia), ARH-77 (leucemia), SK-HEP-1 (adenocarcinoma), Bel-7402 (carcinoma), Bel-7404 (carcinoma), HEP-3B (carcinoma), HepG2 (carcinoma), Calu-3 (adenocarcinoma), NCI-H1395 (adenocarcinoma), NCI-H1975 (adenocarcinoma), SK-LU-1 (adenocarcinoma),
NCI-H2122 (adenocarcinoma), NCI-H727 (carcinoide), A-427 (carcinoma), A549 (carcinoma), SW1573 (carcinoma),
NCI-H358 (carcinoma), NCI-H460 (carcinoma), NCI-H292 (carcinoma), NCI-H82 (carcinoma), NCI-H226 (carcinoma), NCI-H526 (carcinoma) o MSTO-211H (mesotelioma).
En ciertas realizaciones, la muestra utilizada en los métodos proporcionados aquí proviene de un tejido enfermo,
por ejemplo, de un individuo que tiene cáncer, inflamación o una enfermedad o trastorno hematopoyético. En
algunas realizaciones, el cáncer es un tumor sólido o un cáncer de sangre, como se describió anteriormente. En
otras realizaciones, la enfermedad o trastorno hematopoyético es hemoglobinopatía, inmunodeficiencia o enfermedad residual mínima. En ciertas realizaciones, los métodos proporcionados aquí son útiles para detectar
el reordenamiento genético en células de un individuo sano. En ciertas realizaciones, el número de células
utilizadas en los métodos proporcionados aquí puede variar desde una sola célula hasta aproximadamente 109
células. En algunas realizaciones, la cantidad de células utilizadas en los métodos proporcionados aquí es d aproximadamente 1 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, o 5 x 108.
La cantidad y el tipo de células recolectadas de un sujeto se pueden monitorizar, por ejemplo, midiendo los cambios
en la morfología y los marcadores de la superficie celular utilizando técnicas de detección de células estándar,
tales como citometría de flujo, clasificación de células, inmunocitoquímica (por ejemplo, tinción con anticuerpos específicos de tejido o marcadores de células), clasificación de células activada por fluorescencia (FACS), clasificación de células activada magnéticamente (MACS), mediante el examen de la morfología de las células
utilizando microscopía óptica o confocal, y/o midiendo los cambios en la expresión genética utilizando técnicas
bien conocidas en la técnica, tales como PCR y perfil de expresión genética. Estas técnicas también se pueden
utilizar para identificar células que sean positivas para uno o más marcadores particulares. La clasificación de
células activada por fluorescencia (FACS) es un método bien conocido para separar partículas, incluidas las células,
en función de las propiedades fluorescentes de las partículas (Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165).
La excitación láser de los restsos fluorescentes en las partículas individuales produce una pequeña carga eléctrica
que permite la separación electromagnética de las partículas positivas y negativas de una mezcla. En una realización, los anticuerpos o ligandos específicos de marcadores de superficie celular se marcan con marcadores fluorescentes distintos. Las células se procesan a través del clasificador celular, lo que permite la separación de
las células en función de su capacidad para unirse a los anticuerpos utilizados. Las partículas clasificadas por FACS se pueden depositar directamente en pocillos individuales de placas de 96 o 384 pocillos para facilitar la separación y la clonación.
En ciertas realizaciones, se utilizan subconjuntos de células en los métodos proporcionados aquí. Los métodos para clasificar y aislar poblaciones específicas de células son bien conocidos en la técnica, y pueden basarse en el tamaño de la célula, la morfología o marcadores intracelulares o extracelulares. Dichos métodos incluyen, pero no se limitan a, citometría de flujo, clasificación de flujo, FACS, separación basada en perlas tal como la clasificación magnética de células, separación basada en tamaño (por ejemplo, un tamiz, una matriz de obstáculos o un filtro), clasificación en un dispositivo de microfluidos, separación basada en anticuerpos, sedimentación, adsorción por afinidad, extracción por afinidad, centrifugación en gradiente de densidad, microdisección por captura láser, etc.
En una realización, el ARN (por ejemplo, ARNm) o la proteína se purifica del tumor, y la presencia o ausencia de un biomarcador se mide mediante análisis de expresión genética o proteica. En ciertas realizaciones, la presencia o ausencia de un biomarcador se mide mediante PCR cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR), micromatrices, citometría de flujo o inmunofluorescencia. En otras realizaciones, la presencia o ausencia de un biomarcador se mide mediante metodologías basadas en ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) u otros métodos similares conocidos en la técnica.
6.2.4 Métodos para detectar los niveles de ARNm en una muestra
Se conocen en la técnica varios métodos para detectar o cuantificar los niveles de ARNm. Los métodos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, transferencias Northern, ensayos de protección de ribonucleasa, métodos basados en PCR, y similares. La secuencia de ARNm, por ejemplo el ARNm de CRBN o de proteínas asociadas a CRBN, o un fragmento del mismo, se puede utilizar para preparar una sonda que sea al menos parcialmente complementaria. La sonda se puede utilizar entonces para detectar la secuencia de ARNm en una muestra, utilizando cualquier ensayo adecuado, tales como métodos basados en PCR, transferencia Northern, un ensayo con tira reactiva, y similares.
En otras realizaciones, se puede preparar un ensayo de ácido nucleico para probar la actividad inmunomoduladora en una muestra biológica. Un ensayo normalmente contiene un soporte sólido y al menos un ácido nucleico en contacto con el soporte, en el que el ácido nucleico corresponde a al menos una porción de un ARNm que tiene una expresión alterada durante un tratamiento inmunomodulador en un paciente, tal como el ARNm de CRBN o proteínas asociadas a CRBN. El ensayo también puede tener un medio para detectar la expresión alterada del ARNm en la muestra.
El método de ensayo puede variar dependiendo del tipo de información de ARNm deseada. Los métodos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, transferencias Northern y métodos basados en PCR (por ejemplo, qRT-PCR). Métodos tales como qRT-PCR también pueden cuantificar con precisión la cantidad de ARNm en una muestra.
Se puede utilizar cualquier plataforma de ensayo adecuada para determinar la presencia del ARNm en una muestra. Por ejemplo, un ensayo puede tener la forma de una tira reactiva, una membrana, un chip, un disco, una tira de prueba, un filtro, una microesfera, un portaobjetos, una placa multipocillo, o una fibra óptica. Un sistema de ensayo puede tener un soporte sólido sobre el cual se adhiere un ácido nucleico correspondiente al ARNm. El soporte sólido puede comprender, por ejemplo, un plástico, silicio, un metal, una resina, vidrio, una membrana, una partícula, un precipitado, un gel, un polímero, una lámina, una esfera, un polisacárido, un capilar, una película, una placa, o un portaobjetos. Los componentes del ensayo se pueden preparar y empaquetar juntos como un kit para detectar un ARNm.
El ácido nucleico se puede marcar, si se desea, para formar una población de ARNm marcados. En general, una muestra se puede marcar utilizando métodos que son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, utilizando ADN ligasa, transferasa terminal, o marcando la cadena principal de ARN, etc.; véase, por ejemplo, Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3.a ed., Wiley & Sons 1995 y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, 2001 Cold Spring Harbor, N.Y.). En algunas realizaciones, la muestra está marcada con un marcador fluorescente. Los colorantes fluorescentes ejemplares incluyen, entre otros, colorantes de xanteno, colorantes de fluoresceína, colorantes de rodamina, isotiocianato de fluoresceína (FITC), 6-carboxifluoresceína (FAM), 6-carboxi-2',4',7',4,7-hexaclorofluoresceína (HEX), 6-carboxi 4',5' dicloro 2',7' dimetoxifluoresceína (JOE o J), N,N,N',N' tetrametil 6-carboxirodamina (TAMRA o T), 6-carboxi X-rodamina (r Ox o R), 5-carboxirodamina 6G (R6G5 o G5), 6-carboxirodamina 6G (R6G6 o G6) y rodamina 110; colorantes de cianina, por ejemplo, colorantes Cy3, Cy5 y Cy7; Colorantes Alexa, por ejemplo Alexa-fluor-555; cumarina, dietilaminocumarina, umbeliferona; colorantes de bencimida, por ejemplo Hoechst 33258; colorantes de fenantridina, por ejemplo Texas Red; colorantes de etidio; colorantes de acridina; colorantes de carbazol; colorantes de fenoxazina; colorantes de porfirina; colorantes de polimetina, colorantes BODIPY, colorantes de quinolina, pireno, fluoresceína clorotriazinil, R110, eosina, JOE, R6G, tetrametilrodamina, lisamina, ROX, naptofluoresceína, y similares.
En algunas realizaciones, el ARNm de IKZF1 o IKZF3 o fragmentos de los mismos. En otros aspectos, las secuencias de ARNm comprenden al menos un ARNm seleccionado del grupo que consiste en el ARNm de DDB 1, PABPC1, HNRNPR, RPL19, SYNCRIP, H2AFX, HSPA8, ALDOA, HIST1H2AA, HSPA1A, XRCC6, RPL12, RPL18A, RPL4, HNRNPA2B1, HNRNPC, RPS2, SEC24C, RPL9, USP15, SEC24A, CTPS, ABCE1, EEF1A1, IPO5, CPSF6, KCNAB2, C7ORF42, SMC4, GNB3, H2AFZ, HIST1H1C, HIST1H1 D, HIST1H1 E, ACTB, CSNK2A1, CRBN, DDX21, DHX9, DNAJC1, G3BP1, HSPA1B, IGF2BP2, RPL10A, RPL13A, RPL14, RPL15, RPL21, RPL3, RPL30, RPL7, RPL7A, RPLP1, RPLP2, MYH10, ILF3, NCL, RPS13, RPS16, RPS19, RPS6, SND1, EIF2S2, HNRNPH2, UBB, EEF1G, TBL1XR1, NACA, EIF4A1, FASN, PPAT, G3BP2, TUBA1A, UBAP2L, MCM2, UAP1, TUBA1C, EIF2S1, EIF3J, PRKDC, MCM7, RPL11, TUBA1B, STAT3, PTRH2, PABPC4, PTPRC, MACF1, UBE2O, DUT, GNB2L1, NUP88, H2AFJ, SEC23B, PDXK, ACLY, ARID1A, GBE1, HSPA9, DDX17, FUBP1, FBXO21, EWSR1, IFI16, YWHAE, UBA52, COPS6, GNAS, UBE2Q1, FERMT3, NAP1L2, TPD52, VAPA, EEF1AL3, DDIT4, NEDD8, HIST1H1A, HIST1H1B, PCM1 o IKZF3, o un fragmento de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en ubicaciones específicas y direccionables en un soporte sólido; cada uno correspondiente a al menos una porción de secuencias de ARNm que se expresan de manera diferencial durante el tratamiento de un compuesto inmunomodulador en una célula o un paciente.
Un método típico de ensayo de ARNm puede contener las etapas de 1) obtener sondas unidas a la superficie; 2) hibridación de una población de ARNm con las sondas unidas a la superficie en condiciones suficientes para proporcionar una unión específica, (3) lavados posteriores a la hibridación para eliminar los ácidos nucleicos no unidos en la hibridación; y (4) detección de los ARNm hibridados. Los reactivos utilizados en cada uno de estas etapas y sus condiciones de uso pueden variar dependiendo de la aplicación particular.
La hibridación se puede llevar a cabo en condiciones de hibridación adecuadas, que pueden variar en rigurosidad según se desee. Las condiciones típicas son suficientes para producir complejos sonda/diana en una superficie sólida entre miembros de unión complementarios, es decir, entre sondas unidas a la superficie y ARNm complementarios en una muestra. En ciertas realizaciones, se pueden emplear condiciones de hibridación rigurosas.
La hibridación normalmente se realiza en condiciones de hibridación rigurosas. Las técnicas de hibridación estándar (por ejemplo, en condiciones suficientes para proporcionar la unión específica de los ARNm diana en la muestra a las sondas) se describen en Kallioniemi et al., Science 258:818-821 (1992) y el documento WO 93/18186. Hay varias guías disponibles sobre técnicas generales, por ejemplo, Tijssen, Hybridization with Nucleic Acid Probes, Partes I y II (Elsevier, Amsterdam 1993). Para descripciones de técnicas adecuadas para hibridacionesin situ,véanse Gall et al. Meth. Enzymol., 21:470-480 (1981); y Angerer et al. in Genetic Engineering: Principles and Methods (Setlow y Hollaender, Eds.) Vol 7, págs 43-65 (Plenum Press, Nueva York 1985). La selección de condiciones apropiadas, incluyendo temperatura, concentración de sal, concentración de polinucleótidos, tiempo de hibridación, rigurosidad de las condiciones de lavado, y similares, dependerá del diseño experimental, incluyendo fuente de muestra, identidad de los agentes de captura, grado de complementariedad esperado, etc., y puede determinarse como una cuestión de experimentación de rutina para aquellos con conocimientos normales en la técnica.
Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente que se pueden utilizar condiciones de hibridación y lavado alternativas pero comparables para proporcionar condiciones de rigurosidad similar.
Después del procedimiento de hibridación de ARNm, los polinucleótidos unidos a la superficie normalmente se lavan para eliminar los ácidos nucleicos no unidos. El lavado puede realizarse utilizando cualquier protocolo de lavado conveniente, en el que las condiciones de lavado suelen ser rigurosas, como se describió anteriormente. Después, la hibridación de los ARNm diana con las sondas se detecta utilizando técnicas estándar.
También se pueden utilizar otros métodos, tales como los basados en PCR, para seguir la expresión de CRBN o proteínas asociadas a CRB. Se pueden encontrar ejemplos de métodos de PCR en la bibliografía. Se pueden encontrar ejemplos de ensayos de PCR en la patente de EE. UU. n.° 6.927.024. Se pueden encontrar ejemplos de métodos de RT-PCR en la patente de EE. UU. n.° 7.122.799. En la patente de EE. UU. n.° 7.186.507 se describe un método de PCR in situ fluorescente.
En algunas realizaciones, la PCR con transcripción inversa en tiempo real (qRT-PCR) se puede utilizar tanto para la detección como para la cuantificación de dianas de ARN (Bustin, et al., 2005, Clin. Sci., 109:365-379). Los resultados cuantitativos obtenidos mediante qRT-PCR son generalmente más informativos que los datos cualitativos. Por lo tanto, en algunas realizaciones, los ensayos basados en qRT-PCR pueden ser útiles para medir los niveles de ARNm durante ensayos basados en células. El método qRT-PCR también es útil para monitorizar la terapia del paciente. Se pueden encontrar ejemplos de métodos basados en qRT-PCR, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.27.101.663.
A diferencia de la PCR con transcriptasa inversa convencional y del análisis mediante geles de agarosa, la PCR en tiempo real proporciona resultados cuantitativos. Una ventaja adicional de la PCR en tiempo real es la relativa facilidad y conveniencia de uso. Los instrumentos para PCR en tiempo real, tal como el Applied Biosystems 7500, están disponibles comercialmente, al igual que los reactivos, tal como la química de detección de secuencias TaqMan. Por ejemplo, se pueden utilizar ensayos de expresión genética TaqMan®, siguiendo las instrucciones del fabricante. Estos kits son ensayos de expresión genética preformulados para la detección y cuantificación rápida y confiable de transcripciones de ARNm de seres humanos, ratones y ratas. Un programa de PCR ejemplar, por ejemplo, es 50 °C durante 2 minutos, 95 °C durante 10 minutos, 40 ciclos de 95 °C durante 15 segundos, y después 60 °C durante 1 minuto.
Para determinar el número de ciclo en el que la señal de fluorescencia asociada con una acumulación particular de amplicón cruza el umbral (denominado CT), los datos se pueden analizar, por ejemplo, utilizando un software de detección de secuencias del sistema de PCR en tiempo real 7500 v1.3 utilizando el método de cálculo de cuantificación relativa de CT comparativo. Usando este método, el resultado se expresa como un cambio en los niveles de expresión. En algunas realizaciones, el nivel de umbral se puede seleccionar para que el software lo determine automáticamente. En algunas realizaciones, el nivel de umbral se establece para que esté por encima de la línea de base pero lo suficientemente bajo para estar dentro de la región de crecimiento exponencial de una curva de amplificación.
6.2.5 Métodos para detectar niveles de polipéptidos o proteínas en una muestra
Se pueden utilizar varios métodos de detección y cuantificación de proteínas para medir el nivel de CRBN o de proteínas asociadas a CRBN. Se puede utilizar cualquier método de cuantificación de proteínas adecuado. En algunas realizaciones, se utilizan métodos basados en anticuerpos. Los métodos ejemplares que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a, inmunotransferencia (Western blot), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunohistoquímica, citometría de flujo, matriz de perlas citométricas, espectroscopia de masas, y similares. Comúnmente se utilizan varios tipos de ELISA, incluidos ELISA directo, ELISA indirecto, y ELISA sándwich.
6.3 Compuestos
Los compuestos para los métodos proporcionados aquí incluyen, pero no se limitan a, los compuestos inmunomoduladores, incluidos los compuestos conocidos como "IMiDs®" (Celgene Corporation), un grupo de compuestos que pueden ser útiles para tratar varios tipos de enfermedades humanas, incluidos ciertos cánceres.
Como se utiliza aquí y a menos que se indique lo contrario, la expresión "compuesto inmunomodulador" puede abarcar ciertas moléculas orgánicas pequeñas que inhiben la producción de TNF-a, IL-1 p, IL-12, IL-6, MIP-1a, MCP-1, GM-CSF, G-CSF y COX-2 en monocitos inducida por LPS. Estos compuestos pueden prepararse sintéticamente o pueden obtenerse comercialmente.
Los compuestos inmunomoduladores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, N-{[2-(2,6-dioxo(3-piperidil)-1,3-dioxoisoindolin-4-il]metil}ciclopropil-carboxamida; 3-[2-(2,6-dioxo-piperidin-3-il)-1,3-dioxo-2,3-dihidro-1 H-isoindol-4-ilmetil]-1,1-dimetil-urea; (-)-3-(3,4-dimetoxi-fenil)-3-(1 -oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-propionamida; (+)-3-(3,4-dimetoxi-fenil)-3-(1 -oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-propionamida; (-)-{2-[1 -(3-etoxi-4-metoxifenil)-2- metilsulfoniletil]-4-acetilaminoisoindolina-1,3-diona}; (+)-{2-[1 -(3-etoxi-4-metoxifenil)-2-metils ulfoniletil]-4-acetilaminoisoindolina-1,3-diona}; difluoro-metoxi SelCID; 1-ftalimido-1-(3,4-dietoxifenil)etano; 3-(3,4-dimetoxifenil)-3-(3,5-dimetoxifenil)acrilonitrilo; 1-oxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-4-aminoisoindolina; 1,3-dioxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-4-aminoisoindolina; 4-amino-2-(3-metil-2,6-dioxo-piperidin-3-il)-isoindol-1,3-diona; 3-(3-acetoamidoftalimido)-3-(3-etoxi-4-metoxifenil)-N-hidroxipropionamida; 1-oxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-4-metilisoindolina; ciclopropil-N-{2-[(1S)-1-(3-etoxi-4-metoxifenil)-2-(metilsulfonil)etil]-3-oxoisoindolina-4-il}carboxamida; 2-(3-hidroxi-2,6-dioxopiperidin-5-il)isoindolina sustituida; N-[2-(2,6-dioxo-piperidin-3-il)-1,3-dioxo-2,3-dihidro-1 H-isoindol-5-ilmetil]-4-trifluorometoxibenzamida; (S)-4-cloro-N-((2-(3-metil-2,6-dioxopiperidin-3-il)-1,3-dioxoisoindolin-5-il)metil) benzamida; [2-[(3S)-3-metil-2,6-dioxo-piperidin-3-il]-1,3-dioxo-2,3-dihidro-1 H-isoindol-5-ilmetil]-amida del ácido piridin-2-carboxílico; (S)-N-((2-(3-metil-2,6-dioxopiperidin-3-il)-1,3-dioxoisoindolin-5-il)metil)-4-(trifluorometil)benzamida; 3-(2,5-dimetil-4-oxo-4H quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona, y similares.
La citocina inflamatoria TNF-a, que es producida por los macrófagos y monocitos durante la inflamación aguda, provoca una amplia gama de eventos de señalización dentro de las células. Sin estar limitados por una teoría en particular, uno de los efectos biológicos ejercidos por los compuestos inmunomoduladores descritos aquí es la reducción de la producción de TNF-a en las células mieloides. Los compuestos inmunomoduladores descritos aquí pueden mejorar la degradación del ARNm de TNF-a.
Además, sin limitarse a la teoría, los compuestos inmunomoduladores descritos aquí también pueden ser potentes coestimuladores de las células T y aumentar la proliferación celular drásticamente de una manera dependiente de la dosis. Los compuestos inmunomoduladores descritos aquí también pueden tener un mayor efecto coestimulador en el subconjunto de células T CD8+ que en el subconjunto de células T CD4+. Además, los compuestos pueden tener propiedades antiinflamatorias contra las respuestas de las células mieloides, pero coestimulan eficazmente las células T para producir mayores cantidades de IL-2, IFN-yy para mejorar la proliferación de células T y la actividad citotóxica de las células T CD8+. Además, sin estar limitados por una teoría particular, los compuestos inmunomoduladores divulgados aquí pueden ser capaces de actuar tanto indirectamente a través de la activación de citocinas como directamente sobre las células asesinas naturales ("NK") y las células T asesinas naturales ("NKT"), y aumentar la capacidad de las células NK para producir citocinas beneficiosas tales como, pero sin limitarse a, IFN-y, y para mejorar la actividad citotóxica de las células NK y NKT.
Los ejemplos específicos de compuestos inmunomoduladores incluyen derivados ciano y carboxi de estirenos sustituidos tales como los descritos en la patente de EE. UU. n.° 5.929.117; 1-oxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3il) isoindolinas y 1,3-dioxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-il) isoindolinas, tales como las descritas en las patentes de EE. UU. n.° 5.874.448 y 5.955.476; las 2-(2,6-dioxopiperdin-3-il)-1-oxoisoindolinas tetrasustituidas descritas en la patente de EE. UU. n.° 5.798.368; 1-oxo y 1,3-dioxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il) isoindolinas (por ejemplo, derivados 4-metil de talidomida), 2-(2,6-dioxopiperidin-3-il) ftalimidas sustituidas y 2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1-oxoisoindoles sustituidos que incluyen, pero no se limitan a, los descritos en las patentes de EE. UU. n.° 5.635.517, 6.281.230, 6.316.471,6.403.613, 6.476.052 y 6.555.554; 1-oxo y 1,3-dioxoisoindolinas sustituidas en la posición 4 o 5 del anillo de indolina (por ejemplo, ácido 4-(4-amino-1,3-dioxoisoindolina-2-il)-4-carbamoilbutanoico) descritas en la patente de EE. UU. n.° 6.380.239; isoindolina-1-ona e isoindolina-1,3-diona sustituidas en la posición 2 con 2,6-dioxo-3-hidroxipiperidin-5-ilo (por ejemplo, 2-(2,6-dioxo-3-hidroxi-5-fluoropiperidin-5-il)-4-aminoisoindolin-1-ona) descritas en la patente de EE. UU. n.° 6.458.810; una clase de amidas cíclicas no polipeptídicas descritas en las patentes de EE. UU. n.° 5.698.579 y 5.877.200; y compuestos de isoindol-imida tales como los descritos en la publicación de patente de EE. UU. n.° 2003/0045552 publicada el6de marzo de 2003, la publicación de patente de EE. UU. n.° 2003/0096841 publicada el 22 de mayo de 2003 y la solicitud internacional n.° PCT/US01/50401 (publicación internacional n.° WO 02/059106). La publicación de patente de EE. UU. n.° 2006/0205787 describe composiciones de 4-amino-2-(3-metil-2,6-dioxopiperidin-3-il)-isoindol-1,3-diona. La publicación de patente de EE. UU. n.° 2007/0049618 describe compuestos de isoindol-imida. En una realización, los compuestos inmunomoduladores no incluyen talidomida.
Diversos compuestos inmunomoduladores descritos aquí contienen uno o más centros quirales, y pueden existir como mezclas racémicas de enantiómeros o mezclas de diastereómeros. Por tanto, también se proporciona aquí el uso de formas estereoméricamente puras de dichos compuestos, así como el uso de mezclas de dichas formas. Por ejemplo, se pueden utilizar mezclas que comprendan cantidades iguales o desiguales de los enantiómeros de un compuesto inmunomodulador particular. Estos isómeros pueden sintetizarse o resolverse asimétricamente utilizando técnicas estándar tales como columnas quirales o agentes de resolución quirales. Véase, por ejemplo, Jacques, J., et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley-Interscience, Nueva York, 1981); Wilen, S. H., et al., Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel, E. L., Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962); y Wilen, S. H., Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p.268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN, 1972).
Los compuestos inmunomoduladores proporcionados aquí incluyen, pero no se limitan a, 1-oxo-y 1,3 dioxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il) isoindolinas sustituidas con amino en el anillo benzo como se describe en la patente de EE. UU. n.° 5.635.517.
Estos compuestos tienen la estructura I:
en la que uno de X e Y es C=O, el otro de X e Y es C=O o CH2, y R<2>es hidrógeno o alquilo inferior, en particular metilo. Los compuestos inmunomoduladores específicos incluyen, pero no se limitan a:
1-oxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-4-aminoisoindolina;
idin-3-il)-4-aminoisoindolina; y
1,3-dioxo-2-(3-metil-2,6-dioxopiperidin-3-il)-4-aminoisoindol, y sus isómeros ópticamente puros.
Los compuestos pueden obtenerse mediante métodos sintéticos estándar (véase, por ejemplo, la patente de los EE. UU. n.° 5.635.517). Los compuestos también están disponibles en Celgene Corporation, Warren, NJ.
Otros compuestos inmunomoduladores específicos pertenecen a una clase de 2-(2,6-dioxopiperidin-3-il) ftalimidas sustituidas y 2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1-oxoisoindoles sustituidos, tales como los descritos en las patentes de EE. UU. núms. 6.281.230; 6.316.471; 6.335.349; y 6.476.052, y la solicitud de patente internacional n.° PCT/US97/13375 (publicación internacional n.° WO 98/03502). Los compuestos representativos son de fórmula:
uno de X e Y es C=O y el otro de X e Y es C=O o CH2;
(i) cada uno de R1, R2, R3, y R4, independientemente de los demás, es halo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono o alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono o (ii) uno de R1, R2, R3, y R4, es -NHR5, y el resto de R1, R2, R3, y R4, son hidrógeno;
R5es hidrógeno o alquilo de 1 a8átomos de carbono;
R6es hidrógeno, alquilo de 1 a8átomos de carbono, bencilo, o halo;
con la condición de que R6sea distinto de hidrógeno si X e Y son C=O y (i) cada uno de R1,
R2, R3, y R4, es flúor o (ii) uno de R1, R2, R3, o R4, es amino.
Los compuestos representativos de esta clase son de fórmulas:
en las que R1es hidrógeno o metilo. En una realización separada, se proporciona aquí el uso de formas enantioméricamente puras (por ejemplo, enantiómeros (R) o (S) ópticamente puros) de estos compuestos. Otros compuestos inmunomoduladores específicos descritos aquí pertenecen a una clase de isoindol-imidas descritas en la patente de EE. UU. n.° 7.091.353, la publicación de patente de EE. UU. n.° 2003/0045552 y la solicitud internacional n.° PCT/US01/50401 (publicación internacional n.° WO 02/ 059106). Los compuestos representativos son de fórmula II:
y sales, hidratos, solvatos, clatratos, enantiómeros, diastereómeros, racematos, y mezclas de estereoisómeros farmacéuticamente aceptables de los mismos, en la que:
uno de X e Y es C=O, y el otro es CH2 o C=O;
R<1>es H, alquilo (C1-C8 ), cicloalquilo (C3-C7), alquenilo (C2-C8), alquinilo (C2-C8), bencilo, arilo, alquil (C0-C4)-heterocicloalquilo (C1-C6), alquil (C<0>-C<4>)-heteroarilo (C2-C5), C(O)R<3>, C(S)R<3>, C(O)OR<4>, alquil (C<1>-C<8>)-N(R<6>)2, alquil
(C1-C8)-OR<5>, alquil (C1-C8)-C(O)OR<5>, C(O)NHR<3>, C(S)NHR<3>, C(O)NR<3>R3', C(S)NR<3>R3' o alquil (C1-C8)-O(CO)R<5>;
R<2>es H, F, bencilo, alquilo (C1-C8), alquenilo (C2-C8), o alquinilo (C2-C8);
R<3>y R3' son independientemente alquilo (C1-C8), cicloalquilo (C3-C7), alquenilo (C2-C8), alquinilo (C2-C8), bencilo, arilo, alquil (C<0>-C<4>)-heterocicloalquilo (C1-C6), alquil (C<0>-C<4>)-heteroarilo (C2-C5), alquil (C<0>-C<8>)-N(R<6>)2, alquil (C1-C<8>)-OR<5>, alquil (C1-C8)-C(O)OR<5>, alquil (C1-C8)-O(CO)R<5>, o C(O)OR<5>;
R<4>es alquilo (C1-C8), alquenilo (C2-C8), alquinilo (C2-C8), alquil (C<1>-C<4>)-OR<5>, bencilo, arilo, alquil (C0-C4)-heterocicloalquilo (C1-C6), o alquil (C<0>-C<4>)-heteroarilo (C2-C5);
R<5>es alquilo (C1-C8), alquenilo (C2-C8), alquinilo (C2-C8), bencilo, arilo, o heteroarilo (C2-C5);
cada aparición de R<6>es independientemente H, alquilo (C1-C8), alquenilo (C2-C8), alquinilo (C2-C8), bencilo, arilo, heteroarilo (C2-C5), o alquil (C0-C8)-C(O)O-R<5>, o los grupos R<6>se pueden unir para formar un grupo heterocicloalquilo;
n es0o1; y
* representa un centro de carbono quiral.
En compuestos específicos de fórmula II, cuando n es 0 entonces R<1>es cicloalquilo (C3-C7), alquenilo (C2-C8), alquinilo (C2-C8), bencilo, arilo, alquil (C0-C4)-heterocicloalquilo (C1-C6), alquil (C0-C4)-heteroarilo (C2-C5), C(O)R<3>, C(O)OR<4>, alquil (C1-C8)-N(R<6>)2, alquil (C1-C8)-OR<5>, alquil (C1-C8)-C(O)OR<5>, C(S)NHR<3>, o alquil (C1-C8)-O(CO)R<5>;
R<2>es H o alquilo (C1-C8); y
R<3>es alquilo (C1-C8), cicloalquilo (C3-C7), alquenilo (C2-C8), alquinilo (C2-C8), bencilo, arilo, alquil (C0-C4)-heterocicloalquilo (C1 -C<6>), alquil (C<0>-C<4>)-heteroarilo (C2-C5), alquil (C<5>-C<8>)-N(R<6>)2; alquil (C0-C8)-NH-C(O)O-R<5>; alquil (C1-C8)-OR<5>, alquil (C1-C8)-C(O)OR<5>, alquil (C1-C8)-O(CO)R<5>, o C(O)OR<5>; y las otras variables tienen las mismas definiciones.
En otros compuestos específicos de fórmula II, R<2>es H o alquilo (C1-C4).
En otros compuestos específicos de fórmula II, R<1>es alquilo (C1-C8) o bencilo.
En otros compuestos específicos de fórmula II, R<1>es H, alquilo (C1-C8), bencilo, CH2OCH3, CH2CH2OCH3, o
En otra realización de los compuestos de fórmula II, R1es
en la que Q es O o S, y cada aparición de R<7>es independientemente H, alquilo (C1-C8), cicloalquilo (C3-C7), alquenilo (C2-C8), alquinilo (C2-C8), bencilo, arilo, halógeno, alquil (C<0>-C<4>)-heterocicloalquilo (C1-C6), alquil (C0-C4)-heteroarilo (C2-C5), alquil (C0-C8)-N(R<6>)2, alquil (C1-C8)-OR<5>, alquil (C1-C8)-C(O)OR<5>, alquil (C1-C8)-O(CO)R<5>, o C(O)OR<5>, o las apariciones adyacentes de R<7>pueden tomarse juntas para formar un anillo de alquilo o arilo bicíclico.
En otros compuestos específicos de fórmula II, R1es C(O)R3.
En otros compuestos específicos de fórmula II, R<3>es alquil (C0-C4)-heteroarilo (C2-C5), alquilo (C1-C8), arilo, o alquil (C<0>-C<4>)-OR<5>.
En otros compuestos específicos de fórmula II, el heteroarilo es piridilo, furilo, o tienilo.
En otros compuestos específicos de fórmula II, R<1>es C(O)OR<4>.
En otros compuestos específicos de fórmula II, el H de C(O)NHC(O) puede reemplazarse por alquilo (C1-C4), arilo, o bencilo.
Otros ejemplos de compuestos de esta clase incluyen, pero no se limitan a: [2-(2,6-dioxo-piperidin-3-il)-1,3-dioxo-2,3-dihidro-1H-isoindol-4-ilmetil]-amida; éster ferc-butílico del ácido (2-(2,6-dioxo-piperidin-3-il)-1,3-dioxo-2,3-dihidro-1 H-isoindol-4-ilmetil)-carbámico; 4-(aminometil)-2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-isoindolina-1,3-diona; N-(2-(2,6-dioxo-piperidin-3-il)-1,3-dioxo-2,3-dihidro-1H-isoindol-4-ilmetil)-acetamida; N-{(2-(2,6-dioxo(3-piperidil)-1,3-dioxoisoindolin-4-il)metil}ciclopropil-carboxamida; 2-cloro-N-{(2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il)metil}acetamida; N-(2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il)-3-piridilcarboxamida; 3-{1 -oxo-4-(bencilamino)isoindolin-2-il}piperidina-2,6-diona; 2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-4-(bencilamino)isoindolina-1,3-diona; N-{(2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il)metil}propanamida; N-{(2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il)metil}-3-piridilcarboxamida; N-{(2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il)metil}heptanamida; N-{(2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il)metil}-2-furilcarboxamida; acetato de {N-(2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il)carbamoil}metilo; N-(2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il)pentanamida; N-(2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il)-2-tienilcarboxamida; N-{[2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il]metil}(butilamino)carboxamida; N-{[2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il]metil}(octilamino)carboxamida; y N-{[2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il]metil}(bencilamino)carboxamida.
Otros compuestos inmunomoduladores específicos descritos aquí pertenecen a una clase de isoindol-imidas descritas en las publicaciones de solicitudes de patente de EE. UU. n.° US 2002/0045643, publicación internacional n.° WO 98/54170 y patente de Estados Unidos n.° 6.395.754. Los compuestos representativos son de fórmula III:
y sales, hidratos, solvatos, clatratos, enantiómeros, diastereómeros, racematos, y mezclas de estereoisómeros farmacéuticamente aceptables de los mismos, en la que:
uno de X e Y es C=O, y el otro es CH2 o C=O;
R es H o CH2OCOR';
(i) cada uno de R<1>, R<2>, R<3>, o R<4>, independientemente de los demás, es halo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono o alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono o (ii) uno de R<1>, R<2>, R<3>, o R<4>, es -NHR<5>, y el resto de R<1>, R<2>, R<3>, o R<4>, son hidrógeno;
R<5>es hidrógeno o alquilo de 1 a8carbonos
R6hidrógeno, alquilo de 1 a8átomos de carbono, benzo, cloro, o fluoro;
R' es R7-CHR10-N(R8R9);
R7es m-fenileno o p-fenileno o -(CnH2n)-, en el que n tiene un valor de 0 a 4;
cada uno de R8y R9, tomados independientemente del otro, es hidrógeno o alquilo de 1 a8átomos de carbono, o R8y R9, tomados juntos, son tetrametileno, pentametileno, hexametileno,
o -CH2CH2X1CH2CH2- en el que X1es -O-, -S-, o -NH-;
R10es hidrógeno, alquilo de hasta8átomos de carbono, o fenilo; y
* representa un centro de carbono quiral.
Otros compuestos representativos son de fórmula:
en la que:
uno de X e Y es C=O y el otro de X e Y es C=O o CH2;
(i) cada uno de R1, R2, R3, o R4, independientemente de los demás, es halo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono o alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono o (ii) uno de R1, R2, R3, y R4, es -NHR5, y el resto de R1, R2, R3, y R4, son hidrógeno;
R5es hidrógeno o alquilo de 1 a8átomos de carbono;
R6es hidrógeno, alquilo de 1 a8átomos de carbono, benzo, cloro, o fluoro;
R7es m-fenileno o p-fenileno o -(CnH2n)-, en el que n tiene un valor de 0 a 4;
cada uno de R8y R9, tomados independientemente del otro, es hidrógeno o alquilo de 1 a8átomos de carbono, o R8y R9, tomados juntos, son tetrametileno, pentametileno, hexametileno, o -CH2CH2X1CH2CH2- en el que X1es -O-, -S-, o -NH-; y
R10es hidrógeno, alquilo de hasta8átomos de carbono, o fenilo.
Otros compuestos representativos son de fórmula:
en la que
uno de X e Y es C=O y el otro de X e Y es C=O o CH2;
cada uno de R<1>, R<2>, R<3>, y R<4>, independientemente de los demás, es halo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono o alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono o (ii) uno de R<1>, R<2>, R<3>, y R<4>es nitro o amino protegido y el resto de R<1>, R<2>, R<3>, y R<4>son hidrógeno; y
R<6>es hidrógeno, alquilo de 1 a8átomos de carbono, benzo, cloro, o fluoro.
Otros compuestos representativos son de fórmula:
e n la qu e :
u n o d e X e Y e s C = O y e l o tro d e X e Y e s C = O o C H 2 ;
( i) c a d a u n o d e R 1, R 2, R 3, y R 4, in d e p e n d ie n te m e n te d e lo s d e m á s , e s h a lo , a lq u ilo d e 1 a 4 á to m o s d e c a rb o n o o a lc o x i d e 1 a 4 á to m o s d e c a rb o n o o ( ii) u n o d e R 1, R 2, R 3, y R 4, e s -N H R 5, y e l re s to d e R 1, R 2, R 3, y R 4, s o n h id ró g e n o ;
R 5 e s h id ró g e n o , a lq u ilo d e 1 a 8 á to m o s d e c a rb o n o o C O -R 7-C H (R 10)N R 8R 9 e n e l q u e c a d a u n o d e R 7, R 8, R 9, y R 10 e s c o m o s e d e fin e a q u í; y
R 6 e s a lq u ilo d e 1 a 8 á to m o s d e c a rb o n o , b e n z o , c lo ro , o f lu o ro .
E je m p lo s e s p e c íf ic o s d e c o m p u e s to s s o n d e fó rm u la :
u n o d e X e Y e s C = O y e l o tro d e X e Y e s C = O o C H 2;
R 6 e s h id ró g e n o , a lq u ilo d e 1 a 8 á to m o s d e c a rb o n o , b e n c ilo , c lo ro , o f lu o ro .
R 7 e s m -fe n ile n o , p - fe n ile n o o - (C n H 2 n ) - , e n el q u e n t ie n e un v a lo r d e 0 a 4 ; c a d a u n o d e R 8 y R 9, to m a d o s in d e p e n d ie n te m e n te d e l o tro , e s h id ró g e n o o a lq u ilo d e 1 a 8 á to m o s d e c a rb o n o , o R 8 y R 9, to m a d o s ju n to s , so n te tra m e tile n o , p e n ta m e tile n o , h e x a m e tile n o o - C H 2C H 2X 1C H 2C H 2-, e n el q u e X 1 e s -O -, -S - o -N H -; y
R 10 e s h id ró g e n o , a lq u ilo d e 1 a 8 á to m o s d e c a rb o n o , o fe n ilo .
O tro s c o m p u e s to s in m u n o m o d u la d o re s e s p e c íf ic o s s o n 1 -o x o -2 - (2 ,6 -d io x o -3 - f lu o ro p ip e r id in -3 il) is o in d o lin a s y 1 ,3 -d io x o -2 - (2 ,6 -d io x o -3 - f lu o ro p ip e r id in -3 - i l) is o in d o lin a s ta le s c o m o la s d e s c r ita s e n la s p a te n te s d e E E . u U. n .° 5.874.448 y 5.955.476. L o s c o m p u e s to s re p re s e n ta t iv o s s o n d e fó rm u la :
e n la qu e :
Y e s o x íg e n o o H 2 y
c a d a u n o R 1, R 2, R 3, y R 4, in d e p e n d ie n te m e n te d e lo s d e m á s , e s h id ró g e n o , h a lo , a lq u ilo d e 1 a 4 á to m o s de c a rb o n o , a lc o x i d e 1 a 4 á to m o s d e c a rb o n o , o a m in o .
O tro s c o m p u e s to s in m u n o m o d u la d o re s e s p e c íf ic o s s o n 2 - (2 ,6 -d io x o p ip e rd in -3 - i l) -1 -o x o is o in d o lin a s te tra s u s t itu id a s d e s c r ita s e n la p a te n te d e E E . U U . n .° 5.798.368. L o s c o m p u e s to s re p re s e n ta t iv o s s o n d e fó rm u la :
en la que cada uno de R1, R2, R3, y R4, independientemente de los demás, es halo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, o alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono.
Otros compuestos inmunomoduladores específicos son 1-oxo y 1,3-dioxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il) isoindolinas descritas en la patente de EE. UU. n.° 6.403.613. Los compuestos representativos son de fórmula:
en la que
Y es oxígeno o H2,
un primero de R1y R2es halo, alquilo, alcoxi, alquilamino, dialquilamino, ciano, o carbamoilo, el segundo de R1y R2, independientemente del primero, es hidrógeno, halo, alquilo, alcoxi, alquilamino, dialquilamino, ciano, o carbamoilo, y
R3es hidrógeno, alquilo, o bencilo.
Ejemplos específicos de los compuestos son de fórmula:
en la que
un primero de R1y R2es halo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, dialquilamino en el que cada alquilo es de1a 4 átomos de carbono, ciano, o carbamoilo;
el segundo de R1y R2, independientemente del primero, es hidrógeno, halo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, alquilamino en el que el alquilo tiene de 1 a 4 átomos de carbono, dialquilamino en el que cada alquilo es de 1 a 4 átomos de carbono, ciano, o carbamoilo; y
R3es hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, o bencilo. Los ejemplos específicos incluyen, pero no se limitan a, 1-oxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-4-metilisoindolina.
Otros compuestos representativos son de fórmula:
un primero de R1y R2es halo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, dialquilamino en el que cada alquilo tiene de 1 a 4 átomos de carbono, ciano, o carbamoilo;
el segundo de R1y R2, independientemente del primero, es hidrógeno, halo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, alquilamino en el que el alquilo tiene de 1 a 4 átomos de carbono, dialquilamino en el que cada alquilo es de 1 a 4 átomos de carbono, ciano, o carbamoilo; y
R3es hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, o bencilo.
Otros compuestos inmunomoduladores específicos descritos aquí son 1-oxo y 1,3-dioxoisoindolinas sustituidas en la posición 4 o 5 del anillo de indolina descritas en la patente de EE. UU. n.° 6.380.239 y la patente de EE. UU. n.° 7.244.759. Los compuestos representativos son de fórmula:
en la que el átomo de carbono designado C* constituye un centro de quiralidad (cuando n no es cero y R1no es lo mismo que R2); uno de X1y X2es amino, nitro, alquilo de uno a seis carbonos, o NH-Z, y el otro de X1o X2es hidrógeno; cada uno de R1y R2, independientemente del otro, es hidroxi o NH-Z; R3es hidrógeno, alquilo de uno a seis carbonos, halo, o haloalquilo; Z es hidrógeno, arilo, alquilo de uno a seis carbonos, formilo, o acilo de uno a seis carbonos; y n tiene un valor de 0, 1, o 2; siempre que si X1es amino, y n es 1 o 2, entonces R1y R2no sean ambos hidroxi; y sus sales.
Otros compuestos representativos son de fórmula:
en la que el átomo de carbono designado C* constituye un centro de quiralidad cuando n no es cero y R1no es R2; uno de X1y X2es amino, nitro, alquilo de uno a seis carbonos, o NH-Z, y el otro de X1o X2es hidrógeno; cada uno de R1y R2, independientemente del otro, es hidroxi o NH-Z; R3es alquilo de uno a seis carbonos, halo, o hidrógeno; Z es hidrógeno, arilo o un alquilo o acilo de uno a seis carbonos,; y n tiene un valor de 0, 1, o 2.
Los ejemplos específicos incluyen, pero no se limitan a, ácido 2-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-4-carbamoil-butírico y ácido 4-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-4-cabamoil-butírico, que tienen las siguientes estructuras, respectivamente, y sales farmacéuticamente aceptables, solvatos, profármacos, y estereoisómeros de los mismos:
Otros compuestos representativos son de fórmula:
en la que el átomo de carbono designado C* constituye un centro de quiralidad cuando n no es cero y R1no es R2; uno de X1y X2es amino, nitro, alquilo de uno a seis carbonos, o NH-Z, y el otro de X1o X2es hidrógeno; cada uno de R1y R2, independientemente del otro, es hidroxi o NH-Z; R3es alquilo de uno a seis carbonos, halo, o hidrógeno; Z es hidrógeno, arilo, o un alquilo o acilo de uno a seis carbonos; y n tiene un valor de 0, 1, o 2; y sus sales. Los ejemplos específicos incluyen, pero no se limitan a, ácido 4-carbamoil-4-{4-[(furan-2-il-metil)-amino]-1,3-dioxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il}-butírico, ácido 4-carbamoil-2-{4-[(furan-2-il-metil)-amino]-1,3-dioxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il}-butírico, ácido 2-{4-[(furan-2-il-metil)-amino]-1,3-dioxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il}-4-fenilcarbamoil-butírico y ácido 2-{4-[(furan-2-il-metil)-amino]-1,3-dioxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il}-pentanodioico, que tienen las siguientes estructuras, respectivamente, y sales farmacéuticamente aceptables, solvatos, profármacos, y estereoisómeros aceptables de los mismos:
Otros ejemplos específicos de los compuestos son de fórmula:
en la que:
uno de X1y X2es nitro, o NH-Z, y el otro de X1o X2es hidrógeno;
cada uno de R1y R2, independientemente del otro, es hidroxilo o NH-Z;
R3es alquilo de uno a seis carbonos, halo, o hidrógeno;
Z es hidrógeno, fenilo, un acilo de uno a seis carbonos, o un alquilo de uno a seis carbonos; y
n tiene un valor de0,1, o2; y
si -COR2y -(CH2)nCOR1son diferentes, el átomo de carbono designado C* constituye un centro de quiralidad. Otros compuestos representativos son de fórmula:
en la que:
uno de X1y X2es alquilo de uno a seis carbonos;
cada uno de R1y R2, independientemente del otro, es hidroxilo o NH-Z;
R3es alquilo de uno a seis carbonos, halo, o hidrógeno;
Z es hidrógeno, fenilo, un acilo de uno a seis carbonos, o un alquilo de uno a seis carbonos; y
n tiene un valor de0,1, o2; y
si -COR2y -(CH2)„COR1son diferentes, el átomo de carbono designado C* constituye un centro de quiralidad. Otros compuestos inmunomoduladores específicos son isoindolina-1-ona e isoindolina-1,3-diona sustituidas en la posición 2 con 2,6-dioxo-3-hidroxipiperidin-5-ilo descritas en la patente de EE. UU. n.° 6.458.810. Los compuestos representativos son de fórmula:
en la que:
los átomos de carbono designados * constituyen centros de quiralidad;
X es -C(O)- o -CH2-;
R1es alquilo de 1 a8átomos de carbono o -NHR3;
R2es hidrógeno, alquilo de 1 a8átomos de carbono, o halógeno; y
R3es hidrógeno,
alquilo de1a8átomos de carbono, no sustituido o sustituido con alcoxi de1a8átomos de carbono, halo, amino, o alquilamino de 1 a 4 átomos de carbono,
cicloalquilo de 3 a 18 átomos de carbono,
fenilo, no sustituido o sustituido con alquilo de1a8átomos de carbono, alcoxi de1a8átomos de carbono, halo, amino, o alquilamino de 1 a 4 átomos de carbono,
bencilo, no sustituido o sustituido con alquilo de1a8átomos de carbono, alcoxi de1a8átomos de carbono, halo, amino o alquilamino de 1 a 4 átomos de carbono, o -COR4, en el que
R4es hidrógeno,
alquilo de1a8átomos de carbono, no sustituido o sustituido con alcoxi de1a8átomos de carbono, halo, amino, o alquilamino de 1 a 4 átomos de carbono,
cicloalquilo de 3 a 18 átomos de carbono,
fenilo, no sustituido o sustituido con alquilo de1a8átomos de carbono, alcoxi de1a8átomos de carbono, halo, amino, o alquilamino de 1 a 4 átomos de carbono, o
bencilo, no sustituido o sustituido con alquilo de1a8átomos de carbono, alcoxi de1a8átomos de carbono, halo, amino, o alquilamino de 1 a 4 átomos de carbono,
Otros compuestos específicos proporcionados aquí son de fórmula:
y sales farmacéuticamente aceptables, solvatos, y estereoisómeros de los mismos, en la que:
R<1>es: hidrógeno; halo; -(CH2)nOH; alquilo (Ci -Ca), opcionalmente sustituido con uno o más halo; alcoxi (Ci -Ca), opcionalmente sustituido con uno o más halo; o
-(CH2)nNHRa, en el que Ra es:
hidrógeno;
alquilo (Ci -Ca), opcionalmente sustituido con uno o más halo;
-(CH2)n-(arilo de6a 10 miembros);
-C(O)-(CH2)n-(arilo de6a 10 miembros) o -C(O)-(CH2)n-(heteroarilo de6a 10 miembros), en los que el arilo o heteroarilo está opcionalmente sustituido con uno o más de: halo; -SCF3; alquilo (C1-Ca), opcionalmente sustituido con uno o más halo; o alcoxi (C1-Ca), opcionalmente sustituido con uno o más halo;
-C(O)-alquilo (C1-C8), en el que el alquilo está opcionalmente sustituido con uno o más halo;
-C(O)-(CH2)n-(cicloalquilo C3-C10);
-C(O)-(CH2)n-NRbRc, en el que Rb y Rc son cada uno independientemente:
hidrógeno;
alquilo (C1-Ca), opcionalmente sustituido con uno o más halo;
alcoxi (C1-Ca), opcionalmente sustituido con uno o más halo; o
arilo de a a 10 miembros, opcionalmente sustituido con uno o más de: halo; alquilo (C1-Ca), opcionalmente sustituido en sí mismo con uno o más halo; o alcoxi (C1-Ca), opcionalmente sustituido en sí mismo con uno o más halo;
-C(O)-(CH2)n-O-alquilo (C1-Ca); o
-C(O)-(CH2)n-O-(CH2)n-(arilo de a a 10 miembros);
R<2>es: hidrógeno; -(CH2)nOH; fenilo; -O-alquilo (C1-Ca); o alquilo (C1-Ca), opcionalmente sustituido con uno o más halo;
R<3>es: hidrógeno; o alquilo (C1-Ca), opcionalmente sustituido con uno o más halo; y
n es0,1, o2.
Los ejemplos específicos incluyen, pero no se limitan a, 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,a-diona ("Compuesto A"), que tiene la siguiente estructura:
o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo; o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo del mismo.
El Compuesto A se puede preparar de acuerdo con los métodos descritos en los Ejemplos proporcionados aquí o como se describe en la patente de EE. UU. n.° 7.a35.700. El compuesto también puede sintetizarse de acuerdo con otros métodos evidentes para aquellos expertos en la técnica basándose en la enseñanza aquí contenida. En ciertas realizaciones, el Compuesto A está en una forma cristalina descrita en la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° a1/451,80a, presentada el 11 de marzo de 2011. En algunas realizaciones, la sal de hidrocloruro del Compuesto A se utiliza en los métodos proporcionados aquí. Los métodos para tratar, prevenir y/o controlar cánceres y otras enfermedades utilizando el Compuesto A se describen en la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° a1/451,995, presentada el 11 de marzo de 2011.
Otros compuestos específicos proporcionados aquí son de fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o estereoisómero de los mismos, en la que:
X es C=O o CH2;
R1es -Y-R3;
R<2>es H o alquilo (C1-C6);
Y es: arilo, heteroarilo o heterociclo de6a 10 miembros, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o más halógenos; o un enlace;
R<3>es: -(CH2)n-arilo, -O-(CH2)n-arilo o -(CH2)n-O-arilo, en los que el arilo está opcionalmente sustituido con uno o más: alquilo (C1-C6), opcionalmente sustituido con uno o más halógenos; alcoxi (C1-C6), opcionalmente sustituido con uno o más halógenos; oxo; amino; carboxilo; ciano; hidroxilo; halógeno; deuterio; arilo o heteroarilo de6a10miembros, opcionalmente sustituido con uno o más alquilo (C1-C6), alcoxi (C1-C6) o halógeno; -CONH2; o -COO-alquilo (C1-C6), en el que el alquilo puede estar opcionalmente sustituido con uno o más halógenos; -(CH2)nheterociclo, -O-(CH2)n-heterociclo o -(CH2)n-O-heterociclo, en los que el heterociclo está opcionalmente sustituido con uno o más: alquilo (C1-C6), en sí mismo opcionalmente sustituido con uno o más halógenos; alcoxi (C1-C6), en sí mismo sustituido con uno o más halógenos; oxo; amino; carboxilo;
ciano; hidroxilo; halógeno; deuterio; arilo o heteroarilo de6a10miembros, opcionalmente sustituido con uno o más alquilo (C1-C6), alcoxi (C1-C6) o halógeno; -CONH2; o -COO-alquilo (C1-C6), en el que el alquilo puede estar opcionalmente sustituido con uno o más halógenos; o
-(CH2)n-heteroarilo, -O-(CH2)n-heteroarilo o -(CH2)n-O-heteroarilo, en los que el heteroarilo está opcionalmente sustituido con uno o más: alquilo (C1-C6), en sí mismo opcionalmente sustituido con uno o más halógenos; alcoxi (C1-C6), en sí mismo sustituido con uno o más halógenos; oxo; amino; carboxilo;
ciano; hidroxilo; halógeno; deuterio; arilo o heteroarilo de6a10miembros, opcionalmente sustituido con uno o más alquilo (C1-C6), alcoxi (C1-C6) o halógeno; -CONH2; o -COO-alquilo (C1-C6), en el que el alquilo puede estar opcionalmente sustituido con uno o más halógenos; y
n es 0, 1, 2 o 3.
Los ejemplos específicos incluyen, pero no se limitan a, 3-(4-((4-(morfolinometil)bencil)oxi)-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona. En una realización, se proporciona aquí el estereoisómero (S) de 3-(4-((4-(morfolinometil)bencil)oxi)-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona ("Compuesto B"), por ejemplo para uso en los métodos descritos aquí. La 3-(4-((4-(morfolinometil)bencil)oxi)-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona racémica y los métodos para prepararla se han informado en la publicación de patente de EE. UU. n.° 2011/0196150. El Compuesto B tiene la siguiente estructura:
Todos los compuestos descritos pueden adquirirse comercialmente o prepararse de acuerdo con los métodos descritos en las patentes o publicaciones de patentes aquí descritas. Además, los compuestos ópticamente puros pueden sintetizarse o resolverse asimétricamente utilizando agentes de resolución conocidos o columnas quirales, así como otras técnicas estándar de química orgánica sintética. Se puede encontrar información adicional sobre compuestos inmunomoduladores, su preparación y uso, por ejemplo, en las publicaciones de solicitudes de patente de EE. UU. núms. US20060188475, US20060205787 y US20070049618.
Los compuestos pueden ser pequeñas moléculas orgánicas que tienen un peso molecular menor que aproximadamente1.000g/mol, y no son proteínas, péptidos, oligonucleótidos, oligosacáridos u otras macromoléculas.
Se debe tener en cuenta que si existe una discrepancia entre una estructura representada y un nombre dado a esa estructura, se le debe dar más peso a la estructura representada. Además, si la estereoquímica de una estructura o de una parte de una estructura no se indica, por ejemplo, con líneas en negrita o discontinuas, la estructura o parte de la estructura debe interpretarse como si abarcara todos los estereoisómeros de la misma.
6.4 Kits
También se contemplan kits y composiciones para llevar a cabo los métodos aquí descritos. En ciertas realizaciones, se proporcionan aquí kits útiles para determinar la eficacia de un compuesto inmunomodulador. En ciertas realizaciones, se proporcionan aquí kits útiles para determinar si un compuesto es inmunomodulador. En ciertas realizaciones, se proporcionan aquí kits útiles para evaluar la eficacia de un compuesto en el tratamiento de una enfermedad o trastorno. En algunas realizaciones, se proporcionan aquí kits útiles para determinar el efecto de un compuesto inmunomodulador. En ciertas realizaciones, se proporcionan aquí kits útiles para predecir la probabilidad de un tratamiento eficaz de linfoma, leucemia, mieloma múltiple, un tumor sólido, linfoma no Hodgkin, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de células del manto, linfoma folicular, leucemia mieloblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, síndrome mielodisplásico o melanoma o para monitorizar la efectividad de un tratamiento con uno o más compuestos (por ejemplo, fármacos). El kit comprende un soporte sólido y un medio para detectar la expresión proteica de al menos un biomarcador en una muestra biológica. Un kit de este tipo puede emplear, por ejemplo, una tira reactiva, una membrana, un chip, un disco, una tira de prueba, un filtro, una microesfera, un portaobjetos, una placa multipocillo, o una fibra óptica. El soporte sólido del kit puede ser, por ejemplo, un plástico, silicio, un metal, una resina, un vidrio, una membrana, una partícula, un precipitado, un gel, un polímero, una lámina, una esfera, un polisacárido, un capilar, una película, una placa, o un portaobjetos. La muestra biológica puede ser, por ejemplo, un cultivo celular, una línea celular, un tejido, un tejido oral, tejido gastrointestinal, un órgano, un orgánulo, un fluido biológico, una muestra de sangre, una muestra de orina, o una muestra de piel. La muestra biológica puede ser, por ejemplo, una biopsia de ganglio linfático, una biopsia de médula ósea o una muestra de células tumorales de sangre periférica.
En otra realización, el kit comprende un soporte sólido, ácidos nucleicos en contacto con el soporte, en el que los ácidos nucleicos son complementarios con al menos 20, 50, 100, 200, 350 o más bases de ARNm, y un medio para detectar la expresión del ARNm en una muestra biológica.
En ciertas realizaciones, los kits proporcionados aquí emplean medios para detectar la expresión de un biomarcador mediante PCR cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR), micromatrices, citometría de flujo o inmunofluorescencia. En otras realizaciones, la expresión del biomarcador se mide mediante metodologías basadas en ELISA u otros métodos similares conocidos en la técnica.
En otras realizaciones más, los kits proporcionados aquí son útiles para predecir la probabilidad de un tratamiento eficaz de una enfermedad o trastorno seleccionado de lupus eritematoso sistémico, vasculitis inducida por ANCA, glomerulonefritis, granulomatosis de Wegener aguda, miastenia grave, síndrome de Sjogren, síndrome antifosfolípido, artritis reumatoide y afecciones fibróticas tal como esclerosis sistémica.
En una realización, un kit proporcionado aquí comprende un compuesto proporcionado aquí, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, solvato o hidrato. Los kits pueden comprender además agentes activos adicionales, incluidos, pero no se limitan a, los descritos aquí.
Los kits proporcionados aquí pueden comprender además dispositivos que se utilizan para administrar los ingredientes activos. Ejemplos de tales dispositivos incluyen, pero no se limitan a, jeringas, bolsas de goteo, parches, e inhaladores.
Los kits pueden comprender además células o sangre para trasplante, así como vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden usarse para administrar uno o más ingredientes activos. Por ejemplo, si un ingrediente activo se proporciona en una forma sólida que debe reconstituirse para administración parenteral, el kit puede comprender un recipiente sellado de un vehículo adecuado en el que el ingrediente activo puede disolverse para formar una disolución estéril libre de partículas que se adecuada para administración parenteral. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a: Agua para inyección USP; vehículos acuosos tales como, pero sin limitarse a, inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de dextrosa, inyección de dextrosa y cloruro de sodio, e inyección de Ringer lactada; vehículos miscibles en agua tales como, pero sin limitarse a, alcohol etílico, polietilenglicol, y polipropilenglicol; y vehículos no acuosos tales como, pero sin limitarse a, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, oleato de etilo, miristato de isopropilo, y benzoato de bencilo.
En ciertas realizaciones de los métodos y kits proporcionados aquí, se utilizan soportes de fase sólida para purificar proteínas, marcar muestras o llevar a cabo ensayos en fase sólida. Los ejemplos de fases sólidas adecuadas para llevar a cabo los métodos descritos aquí incluyen perlas, partículas, coloides, superficies individuales, tubos, placas multipocillo, placas de microtitulación, portaobjetos, membranas, geles y electrodos. Cuando la fase sólida es un material en particulas (por ejemplo, perlas), en una realización, se distribuye en los pocillos de placas multipocillos para permitir el procesamiento paralelo de los soportes de la fase sólida.
Se observa que cualquier combinación de las realizaciones enumeradas anteriormente, por ejemplo, con respecto a uno o más reactivos, tales como, sin limitación, cebadores de ácidos nucleicos, soporte sólido y similares, también se contemplan en relación con cualquiera de los diversos métodos y/o kits proporcionados aquí.
7 EJEMPLOS
Ciertas realizaciones de la invención se ilustran mediante los siguientes ejemplos no limitativos.
7.1 Procedimientos
7.1.1 Conjugación y prueba del anticuerpo Aiolos
Este ejemplo demuestra la conjugación de los anticuerpos Aiolos con Alexa Fluor 647 utilizados en ciertas realizaciones de los métodos proporcionados aquí, y la prueba de los anticuerpos conjugados. Brevemente, los anticuerpos policlonales de conejo Aiolos 0-21 (SantaCruz Cat# sc-101982) u otros anticuerpos poli- o monoclonales adecuados se conjugan directamente con Alexa Fluor 647 y después se prueban para determinar su especificidad en una línea celular de control positiva (sangre periférica) y negativa. Las células se fijan con BD Lyse/Fix, seguido de BD Perm Buffer I. La especificidad de los anticuerpos se realiza con y sin compuestos de prueba.
En primer lugar, se conjugan 100 gg de anticuerpos purificados con un exceso molar (ME) de 5 y 10 ME de Alexa Fluor 647 para determinar las condiciones de conjugación óptimas. La especificidad posterior a la conjugación se determina incubando 0,5 gg de cada conjugado de prueba y anticuerpo purificado con un bloqueador de péptidos específico por separado. Las células sanguíneas completas normales (control positivo) y las células HEK-293 (control negativo) se procesan y se tiñen con los anticuerpos conjugados y purificados (con y sin bloqueadores) por separado. Los reactivos purificados se desarrollan con el secundario anti-especie Alexa Fluor 647 apropiado. Se determina la relación señal/ruido y el porcentaje de fluorescencia específica. Si la relación señal/ruido y el porcentaje de fluorescencia específica de los anticuerpos conjugados y los anticuerpos purificados son comparables, entonces se determina la relación molar óptima entre el colorante fluorescente y el anticuerpo. El resto de los anticuerpos purificados se conjugan en la proporción molar óptima. La titulación completa de anticuerpos conjugados para la determinación de la saturación se realiza en células sanguíneas enteras normales tratadas o no tratadas con compuestos de prueba.
7.1.2 Determinación de la fijación para las células
Objetivo:Determinar un método óptimo para la detección de todos los marcadores de interés manteniendo la expresión de marcadores de superficie en PBMC. Las PBMC o sangre entera reciente de un donante normal se tratan con un control portador o con el Compuesto B a 1 micromolar durante 2 horas, y entonces se procesan a continuación. También se utilizan MM-BMMC sin tratar.
Las PBMC congeladas (de control y tratadas), la sangre entera reciente de donante normal (de control y tratada) y las MM-BMMC congeladas (sólo sin tratar) se descongelan y entonces se fijan mediante uno de los siguientes métodos de fijación/permeabilización: (1) BD Lyse/Fix Perm Buffer I; (2) BD Lyse/Fix Perm Buffer II; o (3) fijador patentado Esoterix.
7.1.3 Estabilidad del ensayo
Se examina la estabilidad de muestras de sangre entera reciente de donantes normales. Se extraen cinco (5) muestras de sangre entera de donantes normales (sólo expresión basal) y se fijan mediante el método determinado en el ejemplo anterior. Las muestras fijadas se dividen en dos alícuotas. Una alícuota se coloca a 4 °C durante 1 hora, y otra se coloca a -20 °C durante 1 hora. Estas muestras se analizan inmediatamente (día 0). Las alícuotas restantes se almacenan a 4 °C o -20 °C, y se analizan durante 1 día ex vivo, 2 días ex vivo y 3 días ex vivo.
Las muestras se analizan para determinar la variabilidad biológica mediante el análisis de la diferencia basal de Aiolos en sangre entera normal de cinco donantes diferentes.
7.1.4 Reproducibilidad intraensayo y precisión interoperador
Para determinar la repetibilidad de los ensayos, las mismas muestras de 5-NWB analizadas para determinar su estabilidad anteriormente se analizan por triplicado en un momento dado. Estas muestras se analizaron por triplicado en el día 0, muestras preparadas a 4 °C. Para probar la precisión intraoperador, las mismas muestras son procesadas por un segundo operador el mismo día. El análisis incluye los niveles de expresión cuantitativa de Aiolos en la población de linfocitos CD19+ a, CD3+ y CD45+ total (informados en MEFL). La media, la desviación estándar y el %CV se calculan entre réplicas y entre operadores.
7.1.5 Determinación de Aiolos mediante análisis de FACS en líneas celulares y PBMC
Este ejemplo demuestra la determinación de Aiolos en líneas celulares y PBMC mediante análisis FACS.
Materiales:Amortiguador BD Fix Buffer I (n.° de cat. 55870); amortiguador BD Perm Buffer III (n.° de cat. 558050); amortiguador de tinción BD Stain Buffer (n.° de cat. 554657); anticuerpo anti-IKZF3 (Santa Cruz, lote n.° B1612) y anticuerpo secundario (BD FITC Goat Anti-Rabbit Ig, n.° de cat. 554020).
Procedimientos de ensayo:
El amortiguador Fix I se calentó hasta 37 °C en una incubadora o baño de agua antes de su uso. El amortiguador Perm Buffer III se enfrió en un congelador a -20 °C antes de su uso. Las células se recogieron al final del tratamiento con los compuestos de prueba. Se mezcló un volumen del amortiguador Fix Buffer I precalentado con un volumen de suspensión celular. Si el volumen de la suspensión celular es mayor a 100 pl, las células se centrifugaron y se resuspendieron en 100 pl de medio o PBS. El amortiguador y la suspensión celular se mezclaron bien y se incubaron en un baño de agua a 37 °C durante 10 minutos. Las células se centrifugaron a 250 xg durante 10 minutos y se aspiró el sobrenadante. Las células se lavaron una vez con amortiguador BD Stain Buffer. El pelete se centrifugó, y se eliminó el sobrenadante. Las células se agitaron para dejarlas sueltas, y se permeabilizaron añadiendo lentamente amortiguador Perm Buffer III frío mientras se agitaban o mezclaban. Posteriormente, las células se incubaron en hielo durante 30 minutos. Después, se centrifugaron y se lavaron dos veces con amortiguador de tinción Stain Buffer. El sobrenadante se centrifugó y se aspiró. Las células se resuspendieron en un pequeño volumen de amortiguador de tinción (50 o 100 pl que contenía de 200.000 a 1 millón de células). El anticuerpo anti-IKFZ3 se añadió a la suspensión celular en una dilución de 1:1000, y se incubó durante 45 minutos a 4 °C. Después, las células se centrifugaron y se lavaron una vez con amortiguador de tinción. Se añadió anticuerpo secundario a las células en una dilución de 1:5000, y se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos en la oscuridad. Las células se lavaron una vez con amortiguador de tinción antes del análisis por FACS.
7.1.6 Procedimiento para el procesamiento de sangre de macaco cangrejero para análisis de proteínas y ARNm
La sangre de macaco cangrejero(M. fascicularis)produce aproximadamente 10 millones (10x106) de células mononucleares (PBMC) por 2,5 ml de sangre entera (según el protocolo de Non Human Primate Reagent Source, Boston). Después de aislar las PBMC de la sangre de macacos cangrejeros, se tomaron alícuotas de aproximadamente 7x106células para el análisis de proteínas, mientras que se utilizaron 3x106células para el análisis de ARNm.
Procesamiento de PBMC para análisis de proteínas
Las siguientes etapas se realizaron en hielo, y cualquier centrifugación se realizó en una centrífuga refrigerada a 4 °C. El amortiguador de lisis RIPA (Pierce, n.° de cat. 89900) se preparó primero añadiendo 10 pl de inhibidores de proteinasa (Pierce, n.° de cat. 78443) a 1 ml de amortiguador RIPA. Posteriormente, las PBMC se lavaron una vez en disolución salina amortiguada con fosfato (PBS) enfriada con hielo. Después, las PBMC se lisaron con 0,25 ml de amortiguador de lisis RIPA. Las PBMC se colocaron en hielo durante 30 minutos y se agitaron cada 10 minutos. Los lisados se congelaron y almacenaron a -80 °C antes de su procesamiento posterior.
Los lisados se colocaron en un tubo QIAshredder (QIAGEN, n.° de cat. 79656) y se centrifugaron durante 30 segundos a máxima velocidad (13200 rpm) en una centrífuga de sobremesa Eppendorf (modelo 5415 R). Después, el lisado se transfirió a un tubo Eppendorf transparente de 1,5 ml y se centrifugó durante 10 minutos a máxima velocidad. El sobrenadante se recogió sin alterar el pelete de desechos celulares. El sobrenadante se congeló con hielo seco y se almacenó a -80 °C antes del análisis.
La concentración de proteína en el sobrenadante se midió utilizando el ensayo BCA, y el rendimiento de proteína esperado fue aproximadamente 0,5-5 pg/pl, o 125-1250 pg en total. Se cargaron aproximadamente >10 pg de proteína por banda para transferencia Western (IRF4, IKZF3, etc.) utilizando anticuerpos contra las proteínas humanas.
Procesamiento de PBMC para análisis de ARNm
Las PBMC se lisaron en 0,35 ml de amortiguador RLT (Qiagen cat #79216) y se agitaron hasta homogeneidad. Los lisados se congelaron y almacenaron a -20 °C hasta su posterior procesamiento. Los lisados se descongelaron a temperatura ambiente. El ARN se aisló utilizando el manual del kit Qiagen Rneasy Mini (n.° de cat. 74104) o utilizando QIAcube. Las concentraciones de ARN se obtuvieron con Nanodrop. El ARN necesario o la preparación de ADNc fue aproximadamente 500 a 1000 ng de ARN en un volumen total de aproximadamente 38,5 pl.
La preparación de ADNc se realizó preparando primero una disolución maestra de reactivos de transcripción inversa Tagman (Applied Biosys n.° N808-0234). Se añadieron 61,5 pl de mezcla maestra a los 38,5 pl de ARN (volumen total = 100 pl). La mezcla maestra/ARN se colocó inmediatamente en el ciclador térmico.
Preparación de la placa de qRT-PCR IRF4, BLIMP-1, BCL-6, IgJ, etc. utilizando el ADNc de macaco cangrejero y cebadores específicos de la secuencia de macaco cangrejero se llevó a cabo preparando primero la mezcla maestra Tagman, agua y el ensayo de expresión génica Tagman. Se añadieron 5 pl de una muestra de ADNc por triplicado en la placa. Se añadieron 45 pl de mezcla maestra. La placa se centrifugó y se colocó en el RT-PCR para su ejecución.
7.1.7 Muestreo de PD en el estudio de pauta posológica del Compuesto B en primates no humanos
Como se muestra en la Figura 4, el estudio en monos cinomolgos se dividió en dos fases: Fase I (7 días de administración oral con el artículo de prueba, hidrocloruro del Compuesto B) seguido de un período libre de artículo de prueba de 28 días, y finalmente la Fase II (28 días de administración oral con el artículo de prueba). El objetivo de la Fase I de este estudio fue determinar el inicio y la duración del efecto farmacodinámico del Compuesto B. El objetivo de la Fase II de este estudio fue explorar la relación entre los efectos farmacodinámicos y la seguridad/tolerabilidad del Compuesto B. Además, se determinaron las características toxicocinéticas del Compuesto B. Las dosis del Compuesto B probadas fueron 0,75 mg/kg una vez al día, cada dos días, o 4 días sí y 3 días no. Los artículos de prueba y de control se administraron a los animales apropiados mediante sonda desde los días 1 al 7 para la Fase I, y desde los días 1 al 28 en la Fase II, siguiendo los regímenes de dosis descritos anteriormente. La Fase I y la Fase II estuvieron separadas por al menos una sesión sin dosis de 28 días. El volumen de la dosis para cada animal se basó en la medida del peso corporal más reciente. Se insertó una sonda nasogástrica a través de una fosa nasal (nasogástrica) o a través de la boca (orogástrica) y se avanzó hasta el esófago inferior hasta el estómago. Los animales se inmovilizaron temporalmente (por ejemplo, manualmente) para la administración de la dosis y no se sedaron. Se utilizaron jeringas estériles desechables y sondas nasogástricas/orogástricas para cada animal/dosis. Cada dosis se siguió de un enjuague con agua corriente de aproximadamente 5 ml. Las formulaciones de dosificación se agitaron continuamente durante la administración de la dosis. Los subconjuntos de células mononucleares de sangre periférica analizados mediante citometría de flujo fueron: CD45+/CD3+/CD20+/CD16+, CD45+/CD20+, CD45+/CD3+, CD45+/CD3+/CD4+, CD45+/CD3+/CD8+, CD45+/CD3-/CD16+, CD45+/CD3- /CD14+. Los títulos de anticuerpos anti-KLH se analizaron mediante ELISA (Figura 5).
Los niveles de proteína de Aiolos/IKZF3 se midieron en las células mononucleares de sangre periférica de la siguiente manera. La sangre de macacos cangrejeros (M. fascicularis) produjo aproximadamente 10 millones (10x106) de células mononucleares (PBMC) por 2,5 ml de sangre entera (según el protocolo de Non Human Primate Reagent Source, Boston). Después del aislamiento de PBMC de los macacos, cada muestra se dividió en dos porciones: 7x106células para análisis de proteínas y 3x106células para análisis de ARNm. Todos las etapas se realizaron en hielo, toda la centrifugación en una centrífuga refrigerada a 4 °C. El amortiguador de lisis RIPA (Pierce, n.° de cat. 89900) se preparó añadiendo 10 pl de inhibidores de proteinasa (Pierce, n.° de cat. 78443) a 1 ml de amortiguador RIPA. Las PBMC se lavaron una vez en disolución salina amortiguada con fosfato (PBS) enfriada con hielo. Se añadió amortiguador de lisis (utilice 0,25 ml de amortiguador de lisis RIPA por cada 7x106PBMC). El tubo se colocó en hielo durante 30 minutos y se agitó cada 10 minutos. El lisado se congeló y se almacenó a -80 °C hasta su análisis. El lisado se colocó en un tubo QIAshredder (QIAGEN, n.° de cat. 79656) y se centrifugó durante 30 segundos a máxima velocidad (13 200 rpm) en una centrífuga de sobremesa Eppendorf (modelo 5415 R). El lisado se transfirió a un tubo Eppendorf transparente de 1,5 ml y se centrifugó durante 10 minutos a máxima velocidad (los tubos de recolección QIAshredder son de color lechoso y es difícil ver el sedimento de restos celulares, de ahí la transferencia a los nuevos tubos). El sobrenadante se recogió sin alterar el pelete de desechos celulares (el reactivo RIPA permite la extracción de proteínas de membrana, nucleares y citoplasmáticas que permanecerán en el sobrenadante). El lisado de proteína se congeló en hielo seco y se almacenó a -80 °C hasta su análisis. La concentración de proteína se midió mediante el ensayo BCA. Se esperaba que el rendimiento de proteína fuera de 0,5 a 5 pg/pl, o 125 a 1250 pg en total. Se cargaron > 10 pg de proteína por banda para la prueba Western de IKZF3/Aiolos utilizando anticuerpos contra las proteínas humanas.
7.1.8 Transferencias Western de células B y T U266, DF15
Las células U266 se obtuvieron de ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, EE. UU.). Las células DF15 se obtuvieron de John Shaughnessy (Universidad de Arkansas, Little Rock, AR, EE. UU.). Las células B CD19+ se adquirieron de HemaCare BioResearch Products (Van Nuys, CA). Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 (Cellgro, Manassas, VA) que contenía 10 % (V/V) de suero bovino fetal inactivado por calor (Gibco, Grand Island, NY, EE. UU.) suplementado con 2 mM de glutamina. Las células U266 y DF15 (8x105/pocillo) o las células B (4x105células/pocillo) se sembraron en placas de6pocillos y se trataron con lenalidomida o pomalidomida durante distintos tiempos y concentraciones. Las células T primarias se aislaron de leucocitos humanos (Blood Center of New Jersey, East Orange, NJ) mediante centrifugación a través de Ficoll siguiendo el protocolo "RosetteSep" (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canadá). Las células T purificadas se estimularon con anticuerpo anti-CD3 (Ebioscience, San Diego, CA) y se trataron con lenalidomida o pomalidomida durante distintos tiempos y concentraciones. El tratamiento con dexametasona (Sigma, St. Louis, MO), melfalán (Sigma, St. Louis, MO) y bortezomib (Selleck Chemicals, Houston, TX) se realizó durante6horas. La concentración final de DMSO es 0,1%. Las células se trataron previamente con 10 pM de MG-132 (Calbiochem Biochemicals, Billerica, MA) durante 30 minutos antes de añadir el fármaco. Las células se recolectaron, se lavaron con PBS, y los lisados celulares se separaron en geles SDS-PAGE (Bio-Rad, Hercules, CA). Las membranas se inmunotransferieron con anti-Aiolos (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX), anti-Ikaros (Millipore, Billerica, MA) y anti-actina (Sigma, St. Louis, MO; o LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) y anticuerpos secundarios (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE). Las transferencias se analizaron en un generador de imágenes Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE).
7.1.9 Métodos experimentales de cicloheximida
Se sembraron dos millones y medio de células de mieloma múltiple U266 (ATCC) por pocillo en placas de6pocillos, se incubaron con 100 mg/ml de cicloheximida (Sigma, C4859) y se trataron con DMSO, 10 pM de lenalidomida o 1 pM de pomalidomida durante 0, 1,5, 3 o6horas. Los lisados celulares se separaron en un gel de SDS-PAGE t Gx al 10 % (Bio-Rad) y se analizaron para Aiolos (Santa Cruz, sc-10198), Ikaros (Millipore, ABD16) y Actina (Sigma, AC15).
7.1.10 Transfección de ARNip de CRBN y Aiolos en células T
Las células T primarias se aislaron de leucocitos humanos (Blood Center of New Jersey, East Orange, NJ) mediante centrifugación a través de Ficoll siguiendo el protocolo "RosetteSep" (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canadá). Las células T purificadas se trataron con 1 pg/ml de PHA-L (Sigma, St. Louis, MO) a 37 °C durante 24 horas, y después se transfectaron con siCRBN o siAiolos (Invitrogen) (200 nM de ARNi/100 pl de amortiguador T/8x106células/inyección x 5 inyecciones) utilizando el sistema de transfección Neon (Invitrogen, Grand Island, NY) con el programa 2100 voltaje 15 ancho 2 pulsos. Se transfectó ARNip con bajo contenido de GC (Invitrogen, Grand Island, NY) como control negativo. Las células transfectadas se agruparon y se cultivaron en una placa de 10 cm recubierta con OKT3 (3 pg/ml, eBioscience, San Diego, CA) con 20 ml de RPMI que contenía 10% de FBS a 37 °C durante 24 horas. Se recolectaron células para medir la eficiencia de atenuación de CRBN o Aiolos mediante transferencia Western (anti-Aiolos: Santa Cruz, sc-10198, loteC-0212) y qRT-PCR (Applied Biosystem, expresión génica CRBN Hs00372271_ml; IKZF3 ID#:Hs00232635 _ml). También se recolectaron células para medir el ARN de IL-2 mediante qRT-PCR (Applied Biosystem, ID de expresión génica n.°: Hs00174114_ml). Para la expresión de Aiolos en las células transfectadas con siCRBN, las células transfectadas con siCRBN restantes se sembraron en placas TC de 12 pocillos preunidos con OKT3 (3 pg/ml) a 15x106 células/3 ml/pocillo, y se trataron con DMSO o fármaco a 37 °C durante 24 horas, y después se recolectaron para análisis Western. La expresión de las proteínas Aiolos e Ikaros se determinó mediante análisis de inmunotransferencia utilizando anticuerpos contra Aiolos (Santa Cruz, Dallas, TX) e Ikaros (Millipore, Billerica, MA). Para la producción de IL-2 en las células transfectadas con siAiolos, las células transfectadas restantes se sembraron en placas TC de 96 pocillos preunidos con OKT3 (3 pg/ml) a 2x106células por pocillo, y se trataron con DMSO o fármaco a 37 °C durante 2 días. Se recolectaron los sobrenadantes, y la proteína IL-2 se detectó mediante ELISA (Thermo Scientific, Lafayette, CO).
7.1.11 Métodos de xenoinjerto H929 e211
Se inyectaron ratones SCID hembra (Fox Chase SCID®, CB-17/Icr-Prkdcscid, Charles River) (Wilmington, MA) por vía subcutánea en el flanco derecho con un total de 1 x 107células tumorales NCI-H929 en matrigel al 50% (BD Biosciences). Una vez que los tumores alcanzaron un tamaño promedio de 100-150 mg, 10 ratones en cada grupo se trataton con vehículo (carboximetilcelulosa al 0,5%: Tween 80 al 0,25% en H2O desionizada), o dosis indicadas de lenalidomida oral diariamente durante 19 días. Se monitorizó diariamente el estado de salud de los ratones y el crecimiento del tumor. Los tumores de todos los ratones se midieron con un calibrador digital, y los volúmenes se calcularon con la siguiente fórmula: volumen del tumor (mm3) = largo (mm) x ancho (mm)2. En un grupo satélite, los ratones (3 por grupo) se trataron durante 7 días con vehículo o dosis indicadas de lenalidomida oral diaria; los tumores se extirparon y se congelaron rápidamente para el análisis inmunohistoquímico.
7.1.12 Inmunohistoquímica
Secciones de tumores de xenoinjerto fijados con formalina e incluidos en parafina de cuatro micrómetros de grosor se tiñeron con anticuerpos contra CRBN (anticuerpo monoclonal de conejo Celgene CRBN65), Aiolos (anticuerpo policlonal de conejo; Santa Cruz, Dallas, Texas) e Ikaros (anticuerpo policlonal de conejo; Millipore, Billerica, MA) utilizando el colador de portaobjetos automatizado Bond-Max (Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL) y el kit de detección de refinamiento de polímeros Bond asociado. La recuperación de antígeno se realizó con Epitope Retrieval 2 (pH 9,0) durante 20 minutos a 100 °C en el instrumento. Los portaobjetos se bloquearon para la actividad de peroxidasa endógena con Peroxide Block durante 5 min a temperatura ambiente. Después, las secciones se incubaron con anticuerpos primarios contra CRBN a 1:4000, Aiolos a 1:1000, e Ikaros a 1:1000 durante 15 minutos a temperatura ambiente. Dado que estos anticuerpos primarios son especies hospedantes de conejo, la etapa postprimaria se eliminó del protocolo para evitar la reactividad cruzada con los componentes del xenoinjerto de ratón. Los portaobjetos de control negativo recibieron diluyente de anticuerpo primario Bond en lugar de anticuerpo primario. Se aplicó el polímero marcado con peroxidasa de rábano picante (HRP) en las condiciones predeterminadas del instrumento, y se utilizó tetrahidrocloruro de diaminobencidina (DAB) como sustrato enzimático para visualizar la localización de anticuerpos específicos. Los portaobjetos se contrateñieron con hematoxilina. La intensidad de la tinción IHC se calificó en una escala de 0 a 3 (0 = negativa, 1 = débil, 2 = intermedia, 3 = fuerte). Se registró el intervalo de células con inmunorreactividad específica (<1%=0, 1 -25%=1,26-75%=2 y >75%=3). La puntuación total de la intensidad de la inmunorreactividad se calculó como el producto de la intensidad y el intervalo de células positivas.
7.1.13 Inhibición de Aiolos por cohorte
A los pacientes con cáncer se les administró el Compuesto A en dosis de 0,5 mg, 1 mg, 1,5 mg, 2 mg, 2,5 mg, 3 o 3,5 mg. Se extrajeron muestras de sangre inmediatamente antes de la dosificación y 1,5 horas y 5 horas después de la dosis única del Compuesto A. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica con Ficoll a partir de muestras de sangre entera y se congelaron de forma viable en DMSO. Las células se lavaron dos veces con 2 ml de disolución salina amortiguada con fosfato (PBS) fría, después se permeabilizaron añadiendo 2 ml de amortiguador BD Cytofix/cytoperm frío, y se incubaron en hielo durante 15 minutos. Las células se centrifugaron, después se lavaron dos veces con amortiguador de BD perm/wash, y entonces se resuspendieron en 40 gl de amortiguador BD perm/wash. Las células se tiñeron con anticuerpo anti-CD3 o anti-CD19, y 20 gl de Ab anti-Aiolos (Santa Cruz Santa Cruz, IgG policlonal de conejo, n.° de cat. sc-101982 a una dilución 1:200 con amortiguador de tinción), o 20 gl de controles de isotipo apropiados a las células. Las células se mezclaron a conciencia, y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad, se lavaron una vez con amortiguador BD perm/wash, después se resuspendieron en 80 gl de amortiguador BD perm/wash, y se añadieron 20 gl de anticuerpo secundario antes del análisis en un citómetro de flujo.
7.1.14 Tratamiento con fármaco en células T
Las células T primarias de hasta 3 donantes se aislaron de leucocitos humanos (Blood Center of New Jersey, East Orange, NJ) mediante centrifugación a través de Ficoll siguiendo el protocolo "RosetteSep" (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canadá). Las células T purificadas se estimularon con anticuerpo anti-CD3 (Ebioscience, San Diego, CA), se trataron con el fármaco durante seis horas, se recolectaron, y la expresión de las proteínas Aiolos e Ikaros se determinó mediante análisis de inmunotransferencia utilizando anticuerpos contra Aiolos (Santa Cruz, Dallas, TX) e Ikaros (Millipore, Billerica, MA) con o sin péptido de bloqueo.
7.1.15 Degradación de la proteína Aiolos en células Jurkat
Las células Jurkat se transfectaron con ADN de Aiolos de longitud completa de tipo salvaje y diferentes ADN de Aiolos de longitud completa mutados con lisina (Origene, 5 gg de ADN/100 gl de amortiguador R/2x106células/inyección) utilizando el sistema de transfección Neon (Invitrogen, Grand Island, NY) con el programa 1350 voltaje 10 ancho 3 pulsos. También se transfectó ADN de control de GFP (Lonza). Las células transfectadas se cultivaron en una placa de 24 pocillos con 1 ml de RPMI 10% de FBS a 37 °C durante6horas, y después se trataron con DMSO o fármaco durante otras 48 horas. Las células tratadas con fármaco se recolectaron para medir la expresión de proteínas de Aiolos e Ikaros mediante transferencia Western con anticuerpos contra Aiolos (Santa Cruz, Dallas, TX) e Ikaros (Millipore, Billerica, MA).
7.1.16 Citometría de flujo de Aiolos en células B y T
A voluntarios sanos se les administró placebo (n=10) o Compuesto B en dosis de 0,03 mg, 0,1 mg, 0,3 mg, 1 mg, o 2 mg (N=6cada uno). Se extrajeron muestras de sangre antes de la dosificación, o 3 h, 12 h y 24 h después de la dosificación. 1. Las muestras de sangre se lisaron y fijaron inmediatamente mezclando 1 volumen de sangre con 20 volúmenes de amortiguador Lyse/Fix 1x (BD Biosciences, n.° de cat. 558049) y mezclando bien, invirtiendo el tubo varias veces. Esta mezcla de muestra se incubó en un baño de agua a 37°C durante 10 minutos, y las células se peletizaron mediante centrifugación a 800x g durante 5 minutos para eliminar el sobrenadante mediante aspiración, Las células se lavaron dos veces con 2 ml de disolución salina amortiguada con fosfato (PBS) fría, después se permeabilizaron añadiendo 2 ml de amortiguador BD Cytofix/cytoperm frío, y se incubaron en hielo durante 15 minutos. Las células se centrifugaron, después se lavaron dos veces con amortiguador de BD perm/wash, y entonces se resuspendieron en 40 pl de amortiguador BD perm/wash. Las células se tiñeron con anticuerpo anti-CD3 o anti-CD19, y 20 pl de Ab anti-Aiolos (Santa Cruz Santa Cruz, IgG policlonal de conejo, n.° de cat. sc-101982 a una dilución1 :200con amortiguador de tinción), o20pl de controles de isotipo apropiados a las células. Las células se mezclaron a conciencia, y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad, se lavaron una vez con amortiguador BD perm/wash, después se resuspendieron en 80 pl de amortiguador BD perm/wash, y se añadieron 20 pl de anticuerpo secundario antes del análisis en un citómetro de flujo.
7.1.17 Electroferogramas mediante SimpleWestern de células B CD19+ humanas normales
Se aislaron células B humanas de tres donantes de sangre entera del Centro de Sangre de Nueva Jersey utilizando kits de aislamiento de células B de StemCell Technologies. Las proteínas de la familia IKZF se cuantificaron utilizando el sistema capilar automatizado SimpleWestern System Sally (ProteinSimple). Se mezclaron 100 ng de proteína de lisado celular o diluciones seriadas de proteínas recombinantes en un amortiguador reductor con estándares de peso molecular (PM) fluorescentes. Después de calentar estas muestras a 95 °C durante 5 minutos, se cargaron en cada tubo capilar, y las proteínas se separaron según el tamaño de MW a través de matrices de apilamiento y separación durante 40 minutos a 250 voltios. Después, las proteínas se inmovilizaron en las paredes capilares utilizando una química de captura fotoactivada óptima. Después de la inmovilización de proteínas, los capilares se incubaron con un reactivo de bloqueo durante 23 minutos, y las proteínas diana se sondearon con un anticuerpo primario específico y un anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (ProteinSimple). Se añadió una mezcla de luminol y peróxido (ProteinSimple), la señal quimioluminiscente resultante se capturó por una cámara CCD, y las intensidades de la señal se cuantificaron y analizaron utilizando el software Compass para Sally (ProteinSimple). Las proteínas de la familia Ikaros en cada muestra se calcularon entonces basándose en la curva patrón de proteínas recombinantes humanas. También se utilizó b-actina como control de normalización interno.
7.1.18 Procedimiento para el análisis de ARNm
Las PBMC se aislaron de sangre entera de voluntarios normales y pacientes con enfermedades inflamatorias indicadas (Conversant Bio, Huntsville, Alabama). Las células se cultivaron entonces durante 24 horas en medio RPMI-1640 suplementado con 5% de suero autólogo y antibióticos. Tras la incubación, se recolectaron 1x106células, se lavaron con PBS frío y se lisaron con 350 pl de amortiguador RLT (Qiagen). Los lisados celulares se transfirieron a tubos con código de barras para el control de calidad del ARN y el análisis de la expresión genética con micromatrices. Los experimentos con la matriz Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 se realizaron en el Laboratorio de Genómica de Covance (Covance).
7.1.19 Procedimiento para muestras de PBMC de macacos cangrejeros
32 macacos cangrejeros se dividieron aleatoriamente en 4 grupos. Cada grupo tenía 4 monos hembras y 4 monos machos (n=8). A los 3 grupos de monos se les administró por vía oral el Compuesto B en dosis de 0,04, 0,15 y 0,75 mg/kg respectivamente. El grupo izquierdo se utilizó como control del vehículo (carboximetilcelulosa al 0,5%: Tween 80 al 0,25% en H2O desionizada). Después de administrar los medicamentos durante 1 mes, se tomaron muestras de sangre entera de cada mono, y se aislaron las PBMC. Los niveles de Ikaros en PBMC se cuantificaron utilizando el sistema capilar automatizado SimpleWestern System Sally (ProteinSimple) como se mencionó anteriormente. Los análisis para comparaciones de grupos múltiples se realizaron con análisis de varianza de una vía, seguido de la prueba posterior de Dunnett, utilizando GraphPad Prism® versión 501 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EE. UU.). Un valor de P<0,05 se consideró significativo en todos los análisis.
7.1.20 Materiales de cultivo celular de LLC-B
Las células LLC-B humanas primarias congeladas viables a partir de muestras de pacientes se obtuvieron de AllCells (Emeryville, California, EE. UU.) y se mantuvieron en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los fibroblastos que expresaban CD40L (obsequio de Angela Piperno, Universidad Rockefeller, NY, NY) se mantuvieron en medio DMEM suministrado con 20% de FBS. Antes de los co-cultivos, los fibroblastos CD40L se trataron previamente durante 3 horas con 10 pg/ml de mitomicina C, seguido de un lavado con PBS y disociación con Accutase. Después, las células se volvieron a sembrar a una densidad de 6x105células por pocillo (formato de 24 pocillos por placa), y se cultivaron durante la noche para permitir la formación de una monocapa. Las células de pacientes con LLC-B primarias viables descongeladas se tiñeron previamente con reactivo CFSE (Vibrant CFDA SE Cell Tracer Kit, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) de acuerdo con un protocolo provisto por el fabricante, y se sembraron a 0,8-1x106células por pocillo en la monocapa preformada de fibroblastos CD40L en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS, 5 ng/ml de rh-IL4 y 10 ng/ml de rh-IL 10 (Peprotech, EE. UU.). Para los cultivos a largo plazo, la mitad del medio de cultivo se renovó cada tres días. Como alternativa, para otros ensayos, las células LLC-B se co-cultivaron en CD40L sin ser teñidas previamente.
7.2 Efectos sobre la expresión de Aiolos
El efecto del Compuesto B en la inhibición de la expresión de Aiolos en linfocitos (panel izquierdo), granulocitos (panel superior) y monocitos (panel derecho) se muestra en la Figura 1. Como se muestra en las Figuras 2 y 3, respectivamente, el Compuesto B inhibió significativamente la expresión de Aiolos en células B CD20+ y células T CD3+. Como se muestra en la Figura 51 A y B, si bien se observó cierta inhibición de Aiolos en las células B CD19+ y las células T CD3+ tras el tratamiento con el Compuesto B, se encontró que dosis superiores a 0,3 mg del Compuesto B inhibieron la expresión de Aiolos en niveles significativos.
El análisis de transferencia Western de sangre entera humana, tratada con los compuestos especificados a 250 nM durante 18 horas, se muestra en la Figura 7, y lo mismo se muestra en la Figura8para las PMBC de mono de Mauricio. Como se muestra en la Figura8, el Compuesto B, 18 horas después del tratamiento, inhibió la expresión de Aiolos.
Se realizaron estudios en macacos cangrejeros utilizando el Compuesto B de acuerdo con el régimen de tratamiento resumido en la Figura6. Brevemente, se asignaron cuatro grupos de tratamiento, cada uno de los cuales recibió el tratamiento con el Compuesto B de acuerdo con la pauta posológica y las dosis especificadas en la Figura6. Los resultados de cada uno de los grupos se muestran en las Figuras 9 a 16, que muestran que los efectos del Compuesto B sobre la expresión de Aiolos pueden variar según el régimen de dosificación, pero el Compuesto B generalmente inhibe la expresión de Aiolos.
También se evaluaron los efectos de los Compuestos A y B, lenalidomida ("len") y pomalidomida ("pom") sobre la expresión de Aiolos. Como se muestra en la Figura 17, se demostró que el Compuesto A inhibe la expresión de Aiolos en ausencia de un inhibidor del proteasoma, pero se observó poca inhibición cuando estaba presente un inhibidor del proteasoma. Como se muestra en la Figura 18, len, pom, Compuesto A y Compuesto B mostraron todos un efecto inhibidor sobre la expresión de Aiolos. Parece que el efecto inhibidor se correlaciona con la actividad antiproliferativa del compuesto en las células de mieloma. Como se muestra en la Figura 43 A-D, Aiolos es un regulador negativo de IL-2 en las células T, y el silenciamiento de Aiolos imita el tratamiento con IMiD. Como se muestra en la Figura 50 A-D, lenalidomida, pomalidomida, Compuesto A y Compuesto B mostraron un efecto inhibidor sobre la expresión de Aiolos en células T primarias.
Se realizaron estudios sobre la expresión de Aiolos en varias células de leucemia. Se encontró que el nivel de Aiolos es mayor en las células B obtenidas de pacientes con LLC que en las células B obtenidas de sujetos sanos (Figura22). También se demostró que len, pom, Compuesto A y Compuesto B inhiben la expresión de Aiolos en células B obtenidas de pacientes con LLC así como de sujetos sanos (Figura 22). También se mostraron efectos similares en células de linfoma MCL y DLBCL (Figura 23). En particular, se demostró que se produce poca o ninguna inhibición de la expresión de Aiolos en células con baja expresión de cereblon (Figura 19), y de manera similar, se demostró que la pérdida de cereblon previene la regulación negativa de la expresión de Aiolos (Figura 20), lo que implica la participación de cereblon en este proceso. Finalmente, se demostró que la atenuación de Aiolos induce la expresión de p21, disminuye IRF4, y disminuye el número de células en fase S (Figuras 21 y 24).
7.3 Identificación de proteínas asociadas a cereblon
Espectrometría de masas de proteínas ubiquitinadas (Ubiscan): La plataforma de proteómica UbiScanTM de Cell Signaling Technology se utilizó para identificar y cuantificar las diferencias en la ubiquitinación en células T humanas primarias no tratadas (Tratamiento 1) o tratadas con el Tratamiento 2 o el Tratamiento 3, y en líneas de células de MM tratadas con compuestos inmunomoduladores en presencia o ausencia del inhibidor del proteasoma MG132. El método UbiScan combina el aislamiento de péptidos ubiquitinados de extractos de proteínas digeridas con proteasa utilizando el método de purificación por inmunoafinidad patentado de CST con la identificación y cuantificación de péptidos mediante cromatografía de líquidos y espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). La cuantificación de la ubiquitinación se basa en la abundancia de los péptidos ubiquitinados recuperados por inmunoprecipitación de anticuerpos. La información de abundancia o intensidad de cada péptido ubiquitinado se basa en la altura del pico de ese péptido medida en el canal MS1. La confianza en el cambio de pliegue calculado depende de varios factores, siendo uno importante la intensidad o la altura del pico del péptido ubiquitinado. Las muestras se analizaron mediante LC-MS/MS en un espectrómetro de masas Orbitrap Velos. Las intensidades de los picos cromatográficos de los iones peptídicos en cada muestra se obtuvieron de sus cromatogramas de iones extraídos correspondientes. La cuantificación sin marcadores se realizó comparando las intensidades máximas del mismo ion peptídico en cada muestra para generar sus cambios correspondientes. La evaluación de datos cualitativos fue principalmente un procedimiento automatizado. Las asignaciones de péptidos que cumplieron con los criterios de puntuación específicos de la plataforma SORCERER y se encontraban dentro de los parámetros experimentales establecidos se conservaron en los resultados finales del estudio. Se obtuvo mayor confianza en la asignación si el péptido particular contenía múltiples líneas de evidencia del SORCERER redundante resultante para apoyar la misma identificación del sitio, tales como secuencias superpuestas debido a una digestión incompleta de la proteasa, la presencia de un resto de metionina en la forma reducida y/o oxidada, o la presencia del péptido ubiquitinado en múltiples estados de carga. Los péptidos que se han identificado de forma independiente varias veces tienen una mayor probabilidad de ser asignados correctamente en comparación con los péptidos con un recuento de 1. Sin embargo, aquellas asignaciones de péptidos con recuentos bajos también deben considerarse identificadas con confianza si tienen suficiente evidencia experimental como lo indican sus puntuaciones SORCERER correspondientes y las métricas de calidad de datos (XCorr, DeltaCn, probabilidad PP y error de masa). Como se muestra en la Figura 38, se encontró que la pomalidomida y la lenalidomida mejoran la ubiquitinación del péptido Aiolos que contiene lisina 203. El resultado muestra que lenalidomida y pomalidomida promueven la degradación de Aiolos.
7.4 Identificación de proteínas de unión a compuestos mediante reticulación covalente con farmacóforos reactivos (Caprotec)
La lenalidomida y opcionalmente una (1) molécula precursora nitro-lenalidomida se sintetizaron utilizando tres (3) enlazadores diferentes y un (1) andamio de captura para sintetizar seis (6) Capture CompoundsTM en total. Los compuestos de captura pueden contener una biotina o un resto de fluorescencia como función de extracción. Esto requirió aproximadamente 24 etapas sintéticas. 4 etapas eran de riesgo medio para ser optimizadas. 20 etapas fueron una transformación rutinaria y de bajo riesgo para ser optimizadas. Todos los compuestos de captura se purificaron y analizaron para confirmar la identidad estructural, la pureza y la estabilidad. Se investigó críticamente la fotoquímica de los compuestos de captura. Los lisados de líneas celulares de mieloma múltiple se incubaron con los compuestos de captura utilizando las condiciones de captura optimizadas para realizar el perfil de todos los compuestos de captura de la Etapa 3 dentro del material biológico especificado. Las interacciones selectivas se confirmaron mediante experimentos de control y competencia apropiados empleando lenalidomida y posiblemente análogos inactivos proporcionados en cantidades suficientes. El número de muestras de MS en esta etapa fue aproximadamente 100. Las etapas6, 4 y 5 se acompañaron de un análisis de espectrometría de masas, seguido de un análisis estadístico y cuantitativo de datos LC-MSn de las proteínas capturadas. Sobre esta base, se evaluó la optimización del ensayo en la Etapa 4, y se generará una lista de todas las proteínas que interactúan específicamente con la molécula pequeña en la Etapa 5.
7.5 Efectos del Compuesto A sobre Aiolos endógeno en las células del cáncer de mama
Las líneas celulares (AU565, ZR 75-1, BT-474, EFM-192A, HCC1954, HCC70, MB436 y BT549) se mantuvieron utilizando técnicas de cultivo celular estándar. Para la expresión endógena de Aiolos, las células se sembraron en una placa de6pocillos a 0,5x106células por pocillo en un volumen de 3 ml de medio. Se dejó que las células se adhirieran a la placa durante la noche. Las células se expusieron a 0, 1 y 10 pM del Compuesto A durante los períodos de tiempo especificados.
En algunos experimentos, se transfectaron líneas celulares con un vector de sobreexpresión de Aiolos utilizando el reactivo Lipofectamine en un método por lotes. Las células se sembraron en una placa de 12 pocillos a 1x105células en un volumen de 3 ml por pocillo. Cuando se especificó, las células se pretrataron con MG132 a 10 uM durante 1 hora, o se añadió DMSO como control. Después del pretratamiento, el Compuesto A se añadió directamente al medio de cultivo celular en la concentración especificada.
Las células se recolectaron y se lisaron en amortiguador Ripa Pierce #89900 que contenía cóctel de inhibidores de proteasa 2x de Pierce #78442. El lisado se aplicó a un QiaShredder para eliminar el ADN. El rendimiento total de proteína se midió utilizando el kit de determinación de proteína BioRad DC (Cat#500-0112). Los lisados se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Las muestras se aplicaron a geles BioRad Criterion PreCast al 10% (Bio-Rad n.° 345-0010), y se transfirieron a sándwiches de papel de filtro/nitrocelulosa Bio-Rad (n.° 162-0233) para el análisis mediante transferencia Western.
Como se muestra en la Figura 25, se encontró que, 24 horas después del tratamiento, el Compuesto A redujo los niveles de Aiolos (una banda que aparece alrededor de 60 kD) en las líneas celulares ZR 75-1 y AU565. En ciertos experimentos, la proteína de fusión flag-Aiolos-myc se sobreexpresó en células AU565, y las células se trataron con el Compuesto A. En tales casos, se encontró que el análisis de transferencia Western usando anticuerpo antimyc proporcionó una banda de Aiolos alrededor de 65 KD, mientras que el mismo análisis de anticuerpo anti-flag proporcionó múltiples bandas (Figura 26). Además, se encontró que la reducción de Aiolos sobreexpresado comienza a mostrarse aproximadamente 5 horas después del tratamiento con el Compuesto A (Figura 27), y la inhibición de Aiolos por el Compuesto A se rescató mediante la adición del inhibidor del proteasoma MG-132 (Figuras 26 y 27). Finalmente, se demostró que Aiolos endógeno es inhibido por el Compuesto A en células Her2+ (AU565, BT-474, EFM-192A y HCC1954), pero no en células triple negativas (HCC70, MB436 y BT549). Estos resultados sugieren que Aiolos es inhibido por el Compuesto A, y por lo tanto, puede usarse como biomarcador para el tratamiento con el Compuesto A.
7.6 Expresión de Aiolos en células de linfoma
Se utilizaron xenoinjertos de células de linfoma OCI-LY10 para los siguientes experimentos. La inmunohistoquímica se realizó en el equipo de tinción de portaobjetos automatizado Bond-Max (Leica Microsystems) utilizando el kit de detección Bond Polymer Refine asociado. Se desparafinaron secciones FFPE de cuatro micrómetros de grosor en el instrumento. La recuperación de antígenos se realizó con Epitope Retrieval 2 (pH 9,0) durante 20 minutos a 100 °C. Los portaobjetos se bloquearon para la actividad de peroxidasa endógena con Peroxide Block durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después, las secciones se incubaron con anticuerpo policlonal de conejo contra Aiolos (Santa Cruz, sc-101982) a una dilución de 1/1000 durante 15 minutos a temperatura ambiente, seguido de una incubación con polímero marcado con HRP durante8minutos a temperatura ambiente. La detección enzimática del anticuerpo anti-Aiolos se logró con sustrato de peróxido de hidrógeno y cromógeno tetrahidrocloruro de diaminobencidina (DAB) a temperatura ambiente durante 10 minutos. Los portaobjetos se contrateñieron con hematoxilina durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Como se muestra en las Figuras 29-32, se demostró que la lenalidomida (Figura 29), el Compuesto A (Figura 30), el isómero R del Compuesto A (Figura 31) y el isómero S del Compuesto A (Figura 32) inhibieron la expresión de Aiolos en células de linfoma. Los niveles aproximados de Aiolos en los tumores tratados con el compuesto fueron: Isómero S del Compuesto A < Compuesto A < Isómero R del Compuesto A < lenalidomida, pero los tumores tratados con cualquiera de estos compuestos mostraron niveles de Aiolos más bajos que los tumores tratados con vehículo o vincristina. Los resultados sugieren que la expresión de Aiolos puede ser un buen biomarcador con respecto al tratamiento con cualquiera de los compuestos probados.
7.7 Efectos del Compuesto A o del Compuesto B sobre la expresión de Aiolos en linfocitos
7.7.1 Efectos en sangre entera determinados mediante ensayo de FACS
El compuesto de prueba previamente pesado se disolvió en DMSO al 100% para obtener concentraciones madre de 100 mM o 10 mM. El compuesto en DMSO al 100% se diluyó a concentraciones madre de 10 mM, 1 mM, 0,1 mM, 0,01 mM o 0,001 mM, según corresponda. Los compuestos se añadieron directamente a sangre entera humana heparinizada (dilución 1:1000) para obtener concentraciones finales de 10 pM, 1 pM o 0,1 pM, según corresponda. Se transfirieron diez (10) ml de sangre entera a un tubo cónico de 50 ml, y se trataron con el compuesto de prueba. La concentración final de DMSO fue 0,1%. La sangre se incubó durante 1,5 o 5 horas a 37 °C, 5% de CO2. Después de cada punto de tiempo, la sangre se lisó/fijó, se permeabilizó, se lavó y se tiñó con Aiolos como se describe a continuación.
El amortiguador BD Lyse/Fix se diluyó 5 veces con agua destilada (o desionizada). El amortiguador Lyse/Fix se precalentó en un baño de agua a 37 °C durante 10 minutos antes de su uso. Las células se lisaron y se fijaron inmediatamente mezclando 1 volumen de sangre entera con 20 volúmenes de amortiguador Lyse/Fix 1x (para 1 ml de sangre compuesto, añada 20 ml de amortiguador Lyse/Fix 1x), y se mezclaron completamente invirtiendo el tubo varias veces. La mezcla de células lisadas/fijadas y sangre se incubó en un baño de agua a 37 °C durante 10 minutos. Las células se peletizaron mediante centrifugación a 500 x g durante 5 minutos, y el sobrenadante se eliminó por aspiración. Las células se suspendieron con 5 ml de PBS frío, y después se sedimentaron por centrifugación a 500 x g durante 5 minutos, y el sobrenadante se separó por aspiración. Se añadieron doscientos (200) pl de PBS a las células. Las células se transfirieron a placas de poliestireno de 96 pocillos con fondo en U (BD, n.° de cat. 353910) para usar con el FACSCanto HTS. Las células se lavaron con 200 pl de PBS frío y se centrifugaron a 500 x g durante 5 minutos, y la placa se sacudió y se secó suavemente sobre una toalla de papel para eliminar el exceso de amortiguador. Las células se resuspendieron y se permeabilizaron añadiendo 200 pl de amortiguador BD Perm/Wash Buffer I frío, y se incubaron en hielo durante 30 minutos. Las células se peletizaron mediante centrifugación a 500 x g durante 5 minutos, y se eliminó el amortiguador. Las células se lavaron una vez con 200 pl de amortiguador BD perm/wash, y se volvieron a peletizar; y se eliminó el amortiguador.
El pelete celular se resuspendió en 40 pl de amortiguador BD perm/wash. Se añadieron a las células veinte (20) pl de cada uno de los anticuerpos anti-CD3-PE, anti-CD20-APC y anti-Aiolos de conejo, o 20 pl de controles de isotipo apropiados, o 20 pl de 1:400 de IgG de conejo normal (control para Aiolos). La mezcla se mezcló a conciencia, y se incubó a temperatura ambiente durante 45 minutos en la oscuridad. La mezcla se centrifugó y se lavó una vez con amortiguador de BD perm/wash a 500 x g durante 5 minutos. El pelete celular se resuspendió en 80 pl de amortiguador de BD perm/wash, y se añadieron 20 pl de anticuerpo secundario IgG AF488 de cabra anti conejo (a una dilución de 1:400 en amortiguador de perm/wash), y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad. No se añadió anticuerpo secundario a los controles de isotipo. La mezcla se lavó una vez con 200 pl de amortiguador de tinción BD y se centrifugó a 500 x g durante 5 minutos, y las células peletizadas se resuspendieron en 200 pl de amortiguador de tinción. Las células se analizaron en el BD FACSCanto utilizando la plataforma HTS. Las células se analizaron utilizando el método estándar. Si las células no se pueden leer inmediatamente, las placas se cubren con papel de aluminio para protegerlas de la luz y se almacenan a 4 °C durante hasta 2 días. El análisis de datos se realizó utilizando FlowJo de Tree Star, Inc. para evaluar la intensidad de fluorescencia media y el porcentaje de inhibición de Aiolos en la población de células.
Como se muestra en la Figura 33A, tanto el Compuesto A como el Compuesto B inhibieron significativamente la expresión de Aiolos en linfocitos a 1,5 horas después del tratamiento, pero no se observó ningún efecto significativo en los no linfocitos. En los linfocitos, el efecto inhibidor se observó en las poblaciones de células T y B (Figura 33B). Se observó un patrón sustancialmente similar a las 5 horas después del tratamiento, aunque el grado de inhibición fue más significativo que el observado a las 1,5 horas (Figuras 34A y 34B).
7.7.2 Efectos sobre PBMC viablemente congeladas
El compuesto de prueba previamente pesado se disolvió en DMSO al 100% para obtener concentraciones madre de 100 mM o 10 mM. El compuesto en DMSO al 100% se diluyó a concentraciones madre de 10 mM, 1 mM o 0,1, según corresponda. Los compuestos se añadieron directamente a sangre entera humana heparinizada (dilución 1:1000) para obtener concentraciones finales de 10 pM, 1 pM o 0,1 pl, según corresponda. Se transfirieron siete (7) ml de sangre entera a un tubo cónico de 50 ml, y se trataron con el compuesto de prueba. La sangre se incubó durante 1,5 o 5 horas a 37 °C, 5% de CO2. Después de cada punto de tiempo, se transfirieron 3,5 ml de sangre a un tubo de preparación de células BD Vacutainer CPT, y el tubo se invirtió genéricamente 10 veces y se centrifugó a temperatura ambiente, 1800 RCF durante 20 minutos. La capa mononuclear se recogió y se transfirió a un tubo cónico de 15 ml (se añadieron 3 controles de DMSO de 3,5 ml a tres tubos CPT, y las capas mononucleares se recogieron y combinaron para las siguientes etapas). El tubo se llenó con PBS frío y se centrifugó a 4 °C, 300 RCF durante 15 minutos. El sobrenadante se descartó, y el pelete celular se resuspendió en 2 ml de medio de congelación (10% DMSO 90% FBS). La suspensión celular se transfirió a un criovial y se colocó en Mr. Frosty (Fisher, cat. 15-350-50), y se dejó a -80 °C congelador O/N.
Las células se descongelaron en un baño de agua a 37 °C y se centrifugaron, y se eiminó el medio de congelación. El pelete celular se lavó 1 vez con PBS frío. Las células se lisaron y se fijaron añadiendo amortiguador Lyse/Fix 1 x, y se mezclaron completamente invirtiendo el tubo varias veces. La mezcla de células lisadas/fijadas y sangre se incubó en un baño de agua a 37 °C durante 10 minutos. Las células se peletizaron mediante centrifugación a 500 x g durante 5 minutos, y el sobrenadante se eliminó por aspiración. Las células se suspendieron con 1 ml de PBS frío, y después se sedimentaron por centrifugación a 500 x g durante 5 minutos, y el sobrenadante se separó por aspiración. Se añadieron doscientos (200) pl de PBS a las células. Las células se transfirieron a placas de poliestireno de 96 pocillos con fondo en U (BD, n.° de cat. 353910) para usar con el FACSCanto HTS. Las células se lavaron con 200 pl de PBS frío y se centrifugaron a 500 x g durante 5 minutos, y la placa se sacudió y se secó suavemente sobre una toalla de papel para eliminar el exceso de amortiguador. Las células se resuspendieron y se permeabilizaron añadiendo 200 pl de amortiguador BD Perm/Wash Buffer I frío, y se incubaron en hielo durante 30 minutos. Las células se peletizaron mediante centrifugación a 500 x g durante 5 minutos, y se eliminó el amortiguador. Las células se lavaron una vez con 200 pl de amortiguador BD perm/wash, y se volvieron a peletizar; y se eliminó el amortiguador.
El pelete celular se resuspendió en 40 pl de amortiguador BD perm/wash. Se añadieron a las células veinte (20) pl de cada uno de los anticuerpos anti-CD3-PE, anti-CD20-APC y anti-Aiolos de conejo, o 20 pl de controles de isotipo apropiados, o 20 pl de 1:400 de IgG de conejo normal (control para Aiolos). La mezcla se mezcló a conciencia, y se incubó a temperatura ambiente durante 45 minutos en la oscuridad. La mezcla se centrifugó y se lavó una vez con amortiguador de BD perm/wash a 500 x g durante 5 minutos. El pelete celular se resuspendió en 80 pl de amortiguador de BD perm/wash, y se añadieron 20 pl de anticuerpo secundario IgG AF488 de cabra anti conejo (a una dilución de 1:400 en amortiguador de perm/wash), y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad. No se añadió anticuerpo secundario a los controles de isotipo. La mezcla se lavó una vez con 200 pl de amortiguador de tinción BD y se centrifugó a 500 x g durante 5 minutos, y las células peletizadas se resuspendieron en 200 pl de amortiguador de tinción. Las células se analizaron en el BD FACSCanto utilizando la plataforma HTS. Las células se analizaron utilizando el método estándar. Si las células no se pueden leer inmediatamente, las placas se cubren con papel de aluminio para protegerlas de la luz y se almacenan a 4 °C durante hasta 2 días. El análisis de datos se realizó utilizando FlowJo de Tree Star, Inc. para evaluar la intensidad de fluorescencia media y el porcentaje de inhibición de Aiolos en la población de células.
Como se muestra en la Figura 35A, el Compuesto A y el Compuesto B muestran algunos efectos inhibitorios sobre la expresión de Aiolos en linfocitos congelados 1,5 horas después del tratamiento, pero no se observó ningún efecto en los no linfocitos. En los linfocitos, el efecto inhibidor se observó en las poblaciones de células T y B (Figura 35B). En las células linfocitarias congeladas 5 horas después del tratamiento, se observó que tanto el Compuesto A como el Compuesto B exhibieron efectos inhibidores significativos, mientras que no se observaron tales efectos en los no linfocitos (Figuras 36A y 36B). Los resultados indican que las células se pueden congelar antes de que se pueda realizar la prueba real de los niveles de Aiolos, y por lo tanto, implican que congelar las células puede ser un método viable cuando se requiere el almacenamiento de las células durante un período de tiempo antes de la prueba.
7.8 Efectos de los compuestos sobre la expresión de Aiolos e Ikaros
Los efectos de los compuestos de prueba (pomalidomida, lenalidomida, Compuesto A y Compuesto B) sobre la expresión de Aiolos e Ikaros se evaluaron mediante análisis de transferencia Western a las6horas después del tratamiento con los compuestos, utilizando procedimientos similares a los utilizados con respecto a la transferencia Western descrita en la Figura 7, arriba. Como se muestra en la Figura 37, se demostró que todos los compuestos, con diferentes grados, inhibieron la expresión de Aiolos e Ikaros.
7.8.1 Lenalidomida y pomalidomida
El efecto de lenalidomida y pomalidomida en la inhibición de la expresión de Aiolos e Ikaros en U266, células T CD3+ primarias, y células B CD19+ primarias se muestra en la Figura 39A. Como se muestra en la Figura 39 B y C, diversas concentraciones de lenalidomida y pomalidomida inhibieron significativamente la expresión de Aiolos e Ikaros en seis líneas de células MM (OPM-2, RPMI-8226, LP-1, U266, H929 y JJN3). Cada barra representa la media de6líneas celulares probadas por duplicado, y las barras de error representan una desviación estándar.
El efecto de 10 pM de lenalidomida y 1 pM de pomalidomida en la inhibición de la expresión de Aiolos e Ikaros en células MM U266, DF15, células T CD3+ primarias y células B CD19+ primarias se muestra en la Figura 40. El efecto de las células U266 tratadas con cicloheximida y tratadas con 10 pM de lenalidomida y 1 pM de pomalidomida se muestra en la Figura 41. Los resultados mostraron que lenalidomida y pomalidomida redujeron la expresión de Aiolos e Ikaros en todas las células respectivas analizadas.
También se encontró que la reducción de los niveles de Aiolos e Ikaros por lenalidomida y pomalidomida depende de CRBN. Las células T CD3+ humanas primarias se transfectaron con siControl o siCRBN durante 24 horas y después se trataron con lenalidomida o pomalidomida en las concentraciones indicadas durante 6/24 horas. Los lisados celulares se separaron en geles SDS-PAGE y se inmunotransferieron para la expresión de las proteínas Aiolos, Ikaros y Actina. Como se muestra en la Figura 42 A y B, en las células en las que se atenúa CRBN, el efecto de lenalidomida y pomalidomida en la reducción o inhibición de la expresión de Aiolos e Ikaros se redujo significativamente en comparación con las células de control sin atenuación de CRBN.
La Figura 44 A muestra la actividad antitumoral in vivo de lenalidomida, mientras que las Figuras 44 B y C muestran la reducción en la expresión de Aiolos e Ikaros por las mismas dosis de lenalidomida. Como se puede ver en estas dos figuras, se encontró que la actividad antitumoral in vivo de lenalidomida se correlaciona con la reducción de los niveles de Aiolos e Ikaros. Además, como se muestra en la Figura 46, esta correlación también se extendió a la actividad antitumoral de lenalidomida mostrada en modelos de xenoinjerto de DLBCL. Además, se probaron otros compuestos de tratamiento para el mieloma múltiple (MM) junto con lenalidomida y pomalidomida por su capacidad para reducir los niveles de Aiolos e Ikaros. Curiosamente, se descubrió que la reducción de los niveles de Aiolos e Ikaros en las células de MM es exclusiva de los compuestos inmunomoduladores proporcionados aquí, es decir, lenalidomida y pomalidomida (Figura 45).
7.8.2 Compuesto A y Compuesto B
El efecto del Compuesto A sobre la expresión de Aiolos en células B y T se muestra en la Figura 47 A y B. El efecto de diversos compuestos proporcionados aquí, incluidos el Compuesto A y el Compuesto B, sobre Aiolos e Ikaros se muestra en la Figura 48 A y B. Los resultados muestran que el Compuesto A y el Compuesto B redujeron la expresión de Aiolos e Ikaros en todas las células respectivas analizadas.
También se evaluaron los efectos del Compuesto A sobre Aiolos endógeno y sobreexpresado en células Jurkat. Como se muestra en la Figura 49, la ubiquitinación de múltiples lisinas es necesaria para la degradación de Aiolos mediada por el Compuesto A. Se descubrió que la degradación de Aiolos inducida por el compuesto se debe a la ubiquitinación de Aiolos, y la degradación de Ikaros inducida por el Compuesto A es independiente de Aiolos en las células Jurkat.
El análisis de transferencia Western (electroferogramas de lisados) de células B CD19+ humanas normales, tratadas con el Compuesto B en concentraciones específicas, se muestra en la Figura 52. Como se muestra en la figura, el Compuesto B inhibió la expresión de Ikaros y Aiolos en diversas concentraciones sin afectar a Helios, Pegasus, o p-Actina.
En la Figura 53 A-G se muestran los niveles relativos de ARNm correspondientes a diversas proteínas en células obtenidas de diversas fuentes de enfermedades. Como se muestra en las figuras, Ikaros y Aiolos se sobreexpresan en la esclerosis sistémica (ES) y el lupus eritematoso sistémico (LES).
Se realizaron estudios en 32 macacos cangrejeros utilizando el Compuesto B. Brevemente, se asignaron cuatro grupos de tratamiento, cada uno de los cuales recibió tratamiento con el Compuesto B según las dosis especificadas en la Figura 54. Los resultados de las Figuras 54 y 55 A-C muestran que el Compuesto B generalmente reduce los niveles de Ikaros.
7.9 Efectos de los compuestos sobre los niveles de proteína medidos por transferencia Western
Las células B-CLL se cocultivaron con fibroblastos CD40L como se describió anteriormente, seguido de 72 horas de tratamiento con DMSO, 10 pM de lenalidomida, 1 pM de pomalidomida, 0,1 pM de Compuesto A y 0,1 pM de Compuesto B. Las células se recolectaron y analizaron mediante transferencia Western. Se evaluaron los efectos del tratamiento compuesto sobre CRBN, Aiolos, p21WAF-1e IRF4 en tres muestras de células de pacientes diferentes (Figura 56A). Las tres muestras de pacientes muestran niveles de expresión similares de la proteína CRBN (compare la banda 1 de las 3 transferencias Western en la Figura 56A; las muestras se ejecutaron en la misma membrana aunque los geles se presentan como 3 imágenes independientes en la figura). Los tratamientos con compuestos no afectan los niveles de proteína CRBN, o en algunas muestras inducen un ligero aumento de los niveles de CRBN. Los niveles de proteína de los factores de transcripción Aiolos e IRF4, dianas propuestas de los IMiD aguas abajo de CRBN, se regularon a la baja (Figura 56A) y el nivel de proteína p21 WAF-1se reguló al alza mediante el tratamiento con lenalidomida, pomalidomida, Compuesto A y Compuesto B en las tres muestras de pacientes evaluadas. El efecto de los compuestos sobre la disminución de Aiolos fue dependiente de la dosis, como se demostró mediante citometría de flujo (Figura 56B) utilizando un anticuerpo específico de Aiolos (Santa Cruz) en tres cocultivos diferentes de pacientes con LLC-B. Los efectos sobre p21, IRF4 y Aiolos son consistentes con la detención del ciclo celular y la inhibición de la proliferación observados con el tratamiento con compuesto.
7.10 La atenuación de CRBN anula el efecto de los compuestos IMiD sobre Aiolos e Ikaros en células B-CLL
Las células B-CLL transfectadas durante 48 horas con ARNip de control negativo o ARNip específico de CRBN se cocultivaron con fibroblastos CD40L y se trataron con compuestos. Después de 5 días de tratamiento, se midieron los niveles de proteína Aiolos e Ikaros mediante transferencia Western o citometría de flujo. La atenuación de CRBN redujo significativamente el efecto de los compuestos IMiD sobre los niveles de proteína Aiolos e Ikaros, evitando su degradación en tres muestras diferentes de pacientes con LLC-B (Figura 57). Como se muestra en la Figura 57, se encontró que la atenuación de CRBN disminuye los efectos inhibitorios de los compuestos sobre los niveles de proteínas Aiolos e Ikaros, las dianas más proximales de los compuestos aguas abajo de CRBN. Estos resultados concuerdan con datos similares obtenidos en mieloma y células T. Aiolos se sobreexpresa en pacientes con LLC-B, y es necesario para la viabilidad de la LLC-B, lo que sugiere que Aiolos y otros miembros de la familia de factores de transcripción Ikaros podrían ser buenas dianas terapéuticas en las células LLC-B.
Los ejemplos expuestos anteriormente se proporcionan para proporcionar a aquellos con conocimientos normales en la técnica una descripción y divulgación completa de cómo hacer y utilizar las realizaciones reivindicadas, y no pretenden limitar el alcance de lo que se describe aquí. Las modificaciones que sean obvias para los expertos en la técnica se consideran dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para determinar si un compuesto es capaz de alterar la respuesta inmune en un sujeto, que comprende:
(a) poner en contacto una primera célula del sujeto con el compuestoin vitro;
(b) obtener una primera muestra de la primera célula de la etapa (a);
(c) determinar los niveles de IKZF1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos) en la primera muestra; y
(d) comparar los niveles de IKZF1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos) de la etapa (c) con los niveles de referencia de IKZF1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos), respectivamente, obtenidos a partir de una muestra de referencia,
en el que una disminución en el nivel de IKZF1 (Ikaros) en comparación con el nivel de referencia de IKZF1 (Ikaros) y una disminución en el nivel de IKZF3 (Aiolos) en comparación con el nivel de referencia de IKZF3 (Aiolos) son indicativas de la eficacia del compuesto para alterar la respuesta inmune en el sujeto.
2. El método de la reivindicación1, en el que la primera célula es una célula mononuclear de sangre periférica, una célula B, una célula T, un monocito o un granulocito.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que la muestra de referencia se prepara utilizando una segunda célula que no está en contacto con el compuesto; en el que la segunda célula es del mismo tipo que la primera célula.
4. Un método para evaluar la eficacia de un compuesto en el tratamiento de un cáncer o una enfermedad inflamatoria, que comprende:
(a) determinar los niveles de IKZF1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos) en una primera muestra de un sujeto que padece cáncer o enfermedad inflamatoria a quien se le ha administrado el compuesto; y
(b) comparar los niveles de IKZF1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos) de la etapa (a) con los niveles de referencia de IKZF1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos), respectivamente, obtenidos a partir de una muestra de referencia,
en el que una disminución en el nivel de IKZF1 (Ikaros) en comparación con el nivel de referencia de IKZF1 (Ikaros) y una disminución en el nivel de IKZF3 (Aiolos) en comparación con el nivel de referencia de IKZF3 (Aiolos) son indicativas de la eficacia del compuesto en el tratamiento del cáncer o la enfermedad inflamatoria.
5. El método de la reivindicación 4, en el que la primera muestra se ha obtenido de una biopsia de tumor, biopsia de ganglio, o biopsia de médula ósea, bazo, hígado, cerebro o mama.
6. El método de la reivindicación 4 o 5, en el que la muestra de referencia se prepara utilizando:
(i) una segunda muestra obtenida del sujeto antes de la administración del compuesto al sujeto; y en el que la segunda muestra proviene de la misma fuente que la primera muestra; o
(ii) una segunda muestra obtenida de un sujeto sano que no tiene cáncer ni enfermedad inflamatoria; y en el que la segunda muestra proviene de la misma fuente que la primera muestra.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en el que el cáncer o la enfermedad inflamatoria es mieloma múltiple, leucemia linfocítica crónica, linfoma no Hodgkin, linfoma de células del manto, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren, o esclerosis sistémica.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la determinación de los niveles de IKZF 1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos) en la primera muestra comprende:
(i) poner en contacto las proteínas dentro de la primera muestra con un primer anticuerpo IKZF1 (Ikaros) y un primer anticuerpo IKZF3 (Aiolos) que se unen inmunoespecíficamente a IKZF1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos), respectivamente;
(ii) poner en contacto las proteínas unidas al primer anticuerpo IKZF1 (Ikaros) y al primer anticuerpo IKZF3 (Aiolos) con un segundo anticuerpo IKZF1 (Ikaros) con un marcador detectable y un segundo anticuerpo IKZF3 (Aiolos) con un marcador detectable, en el que el segundo anticuerpo IKZF1 (Ikaros) y el segundo anticuerpo IKZF3 (Aiolos) se unen inmunoespecíficamente a IKZF1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos), respectivamente, y en el que el segundo anticuerpo IKZF1 (Ikaros) y el segundo anticuerpo IKZF3 (Aiolos) se unen inmunoespecíficamente a un epítopo diferente en IKZF1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos), respectivamente, del primer anticuerpo IKZF1 (Ikaros) y el primer anticuerpo IKZF3 (Aiolos), respectivamente;
(iii) detectar la presencia del segundo anticuerpo IKZF1 (Ikaros) y del segundo anticuerpo IKZF3 (Aiolos) unidos a las proteínas; y
(iv) determinar los niveles de IKZF1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos) en función de la cantidad de marcador detectable en el segundo anticuerpo IKZF1 (Ikaros) y la cantidad de marcador detectable en el segundo anticuerpo IKZF3 (Aiolos).
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la determinación de los niveles de IKZF1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos) en la primera muestra comprende:
(i) poner en contacto el ARN dentro de la primera muestra con un cebador que comprende una secuencia que se une específicamente al ARN para generar una primera molécula de ADN que tiene una secuencia complementaria al ARN;
(ii) amplificar el ADN correspondiente a segmentos de genes que codifican dichos IKZF1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos), respectivamente; y
(iii) determinar los niveles de ARN de dichos IKZF1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos) en función de las cantidades de ADN amplificado.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el compuesto es talidomida, lenalidomida, pomalidomida, 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)piperidina-2,6-diona o 3-(4-((4-(morfolinometil)bencil)oxi)-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona, un estereoisómero del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo de los mismos.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que dicho IKZF3 (Aiolos) tiene un peso molecular de proteína de 58 kDa o 42 kDa, medido mediante análisis de transferencia Western.
12. Un kit para determinar si un compuesto es capaz de alterar la respuesta inmune en un sujeto, o para evaluar la eficacia de un compuesto en el tratamiento de un cáncer o una enfermedad inflamatoria, en el que el kit comprende
(i) el compuesto;
(ii) un soporte sólido; y
(iii) un medio para detectar los niveles de expresión de proteína o los niveles de ARNm de IKZF1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos) en una muestra biológica.
13. El kit de la reivindicación 12, en el que el compuesto es talidomida, lenalidomida, pomalidomida, 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)piperidina-2,6-diona o 3-(4-((4-(morfolinometil)bencil)oxi)-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona, un estereoisómero de los mismos, o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo de los mismos.
14. El kit de la reivindicación 12 o 13, en el que el medio comprende PCR cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR), micromatrices, citometría de flujo e inmunofluorescencia.
15. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en el que el kit comprende además un dispositivo para administrar el compuesto al sujeto.
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