ES2979153T3 - Métodos para purificar anticuerpos - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a un método para purificar un polipéptido recombinante a partir de proteínas de células huésped (HCP), comprendiendo el método: (a) aplicar una solución que comprende el polipéptido recombinante y HCP a un soporte sólido de cromatografía de superantígeno, (b) lavar el soporte sólido de cromatografía de superantígeno con un tampón de lavado que comprende caprilato y arginina; y (c) eluir el polipéptido recombinante del soporte sólido de cromatografía de superantígeno. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos para purificar anticuerpos
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la purificación de proteínas mediante un superantígeno seleccionado de proteína A, proteína G o proteína L inmovilizada a un soporte sólido. En particular, la invención se refiere a componentes del tampón de lavado y a métodos de uso de los tampones de lavado para eliminar impurezas de la célula hospedadora durante las etapas de lavado, minimizando la pérdida del producto proteico deseado.
Antecedentes de la invención
Las impurezas de proteínas de células hospedadoras (HCP, del ingléshost cell protein),clasificadas por la FDA como impurezas "relacionadas con el proceso", deben eliminarse a niveles suficientemente bajos en el procesamiento biofarmacéutico posterior. La depuración adecuada de las HCP puede ser particularmente compleja para algunos productos de anticuerpos monoclonales (AcM) durante el procesamiento posterior normal. La mayoría de los procesos posteriores con AcM utilizan un enfoque de "plataforma"; la plataforma normal de AcM cadena abajo consiste en captura por cromatografía de afinidad de proteína A, seguido de una a tres etapas de pulido sin afinidad. La etapa de captura por afinidad de proteína A es la herramienta de trabajo de la plataforma y proporciona la gran mayoría de la depuración de las HCP. Las etapas de pulido posteriores son generalmente cromatografía de intercambio iónico, interacción hidrófoba o multimodal.
Para muchos productos de AcM, la concentración de HCP es suficientemente baja después de la primera etapa de cromatografía de pulido. Sin embargo, hay muchos AcM para los cuales se implementa una segunda etapa de cromatografía de pulido específicamente para eliminar HCP adicionales; esto puede requerir un esfuerzo significativo en el desarrollo del proceso y da lugar a una mayor complejidad del proceso. Estudios anteriores han identificado una subpoblación de impurezas de HCP que tienen una interacción atractiva con la molécula del producto AcM (Levyet al.,(2014) Biotechnol. Bioeng. 111 (5):904-912; Aboulaichet al.,(2014) Biotechnol. Prog. 30(5): 1114-1124). La mayoría de las HCP que evaden la depuración a través de la etapa de proteína A se deben a una asociación de productos en lugar de a una coelución o adsorción al ligando de proteína A o a la matriz base. La población de HCP difíciles de eliminar es relativamente pequeña (en comparación con la población diversa de HCP presentes en cultivos celulares) y similar para diferentes productos de AcM.
Aunque la población de impurezas de HCP difíciles es en gran medida idéntica para todos los productos de AcM, diversos grados de interacciones HCP-AcM pueden afectar significativamente la depuración total de HCP en todo la etapa de proteína A; cambios muy pequeños en la secuencia de aminoácidos de los productos de AcM pueden afectar las interacciones HCP-AcM en las etapas de proteína A y de pulido. La población de HCP cargada en la columna de proteína A, que tiene un impacto obvio en el potencial de asociación HCP-AcM, puede verse afectada por la edad celular, metodología y condiciones de recogida, y se han observado pequeñas diferencias entre diferentes estirpes celulares hospedadoras. Además de la asociación de productos, para la mayoría de las resinas de proteína A hay un bajo nivel de impurezas de HCP que se unen a la matriz base y coeluyen con el producto. Las resinas de vidrio de poro controlado tienen niveles mucho más elevados de HCP unida a la matriz base.
Un aditivo de lavado particular, el caprilato de sodio, se ha identificado previamente como uno de los más exitosos para alterar las asociaciones HCP-AcM y dar como resultado concentraciones bajas de HCP en el eluido de proteína A. El caprilato de sodio (también conocido como octanoato de sodio) es un ácido graso saturado de ocho carbonos que no es tóxico en ratones con una concentración micelar crítica de aproximadamente 360 mM. Estudios anteriores han utilizado caprilato de sodio 50 mM (Aboulaichet al.,(2014) Biotechnol. Prog. 30(5): 1114-1124), caprilato de sodio 40 mM con NaCl y pH variables (Chollangiet al.,(2015) Biotechnol. Bioeng. 112(11 ):2292-2304) y caprilato de sodio hasta 80 mM (Herzeret al.,(2015) Biotechnol. Bioeng. 112(7):1417-1428) para mejorar la depuración de HCP, y caprilato de sodio 50 mM a pH elevado con NaCl para la depuración total de HCP y la eliminación de una impureza proteolítica de HCP (Beeet al.,(2015) Biotechnol. Prog. 31(5):1360-1369). Anteriormente se han presentado solicitudes de patente para lavados de proteína A que contienen hasta 100 mM de caprilato de sodio (Documentos WO2014/141150 y WO2014/186350). Además, el ácido caprílico se ha utilizado para la precipitación de impurezas de proteínas de la célula hospedadora en procesos no cromatográficos antes y después de la etapa de captura de proteína A (Brodskyet al.,(2012) Biotechnol. Bioeng. 109(10): 2589-2598; Zhenget al.,(2015) Biotechnol. Prog. 31(6): 1515-1525; Herzeret al.,(2015) Biotechnol. Bioeng. 112(7):1417-1428).
Existe una necesidad en la materia de proporcionar métodos mejorados para purificar proteínas, en particular, anticuerpos, a partir de proteínas de células hospedadoras.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un método para purificar un polipéptido recombinante a partir de proteínas de células hospedadoras (HCP), comprendiendo el método: (a) aplicar una solución que comprende el polipéptido recombinante y HCP en un soporte sólido de la cromatografía de superantígeno, (b) lavar el soporte sólido de la cromatografía de superantígeno con un tampón de lavado que comprende caprilato de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 300 mM y arginina a más de aproximadamente 0,5 M; y (c) eluir el polipéptido recombinante del soporte sólido de la cromatografía de superantígeno, en donde el superantígeno se selecciona del grupo que consiste en proteína A, proteína G y proteína L; y en donde aproximadamente significa /- 20 %, /- 10 %, /- 5 %, /- 1 % o /- 0,1 %.
En otro aspecto de la invención, el tampón de lavado comprende arginina de aproximadamente 0,75 M a aproximadamente 1,5 M, en donde aproximadamente significa /- 20 %, /- 10 %, /- 5 %, /- 1 % o /- 0,1 %.
En otro aspecto de la invención, el tampón de lavado comprende además lisina de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 1 M, en donde aproximadamente significa /- 20 %, /- 10 %, /- 5 %, /- 1 % o /- 0,1 %.
En una realización de la invención, el polipéptido recombinante eluido contiene menos de aproximadamente un 2 % de polipéptido recombinante fragmentado, en donde aproximadamente significa /- 20 %, /- 10 %, /- 5 %, /- 1 % o /- 0,1 %.
En un aspecto de la invención, la HCP procede de una célula de mamífero, por ejemplo, la HCP es proteína 2 de tipo fosfolipasa B y/o catepsina L. En otro aspecto más de la invención, la purificación del polipéptido recombinante a partir de catepsina L se mide mediante una actividad reducida de catepsina L en el eluido de la etapa (c).
En una realización, el pH del tampón de lavado está entre pH 7 y pH 9; o de pH 7,5 a pH 8,5.
En otra realización de la invención, el polipéptido recombinante es un anticuerpo monoclonal (AcM), tal como, por ejemplo, una IgG1 o una IgG4.
En otra realización más, el tampón de lavado no contiene cloruro de sodio.
En otro aspecto de la invención, después de la etapa (c), la cantidad de HCP es inferior a aproximadamente 200 ng de HCP/mg de producto.
En otra realización más, el método comprende: (b1) lavar el soporte sólido de la cromatografía de superantígeno con un tampón de lavado que comprende caprilato de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 300 mM; (b2) lavar el soporte sólido de la cromatografía de superantígeno con un tampón de lavado que comprende arginina a más de aproximadamente 0,5 M; en donde aproximadamente significa /- 20 %, /- 10 %, /- 5 %, /- 1 % o /- 0,1 %.
En otra realización más, el método comprende: (b1) lavar el soporte sólido de la cromatografía de superantígeno con un tampón de lavado que comprende arginina a más de aproximadamente 0,5 M; (b2) lavar el soporte sólido de la cromatografía de superantígeno con un tampón de lavado que comprende caprilato de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 300 mM; en donde aproximadamente significa /- 20 %, /- 10 %, /- 5 %, /- 1 % o /- 0,1 %.
En otra realización, la invención proporciona un método para purificar un polipéptido recombinante de la proteína 2 de tipo fosfolipasa B, comprendiendo el método: (b) lavar el soporte sólido de la cromatografía de superantígeno con un tampón de lavado que comprende caprilato aproximadamente 100 mM y arginina aproximadamente 1,1 M; en donde aproximadamente significa /- 20 %, /- 10 %, /- 5 %, /- 1 % o /- 0,1 %.
En otra realización más, la invención proporciona un método para purificar un polipéptido recombinante a partir de catepsina L, comprendiendo el método: (b) lavar el soporte sólido de la cromatografía de superantígeno con un tampón de lavado que comprende caprilato aproximadamente 150 mM y arginina aproximadamente 1,1 M; en donde aproximadamente significa /- 20 %, /- 10 %, /- 5 %, /- 1 % o /- 0,1 %.
Breve descripción de las figuras
Figura 1:Rendimiento porcentual (triángulos, ▲) y concentración de HCP (cuadrados, ■) en el eluido de proteína A utilizando AcM1 como modelo con concentraciones variables de caprilato de sodio en el lavado.
Figura 2:Porcentaje de AcM1 cargado en fracciones de elución, extracción y lavado para 5 concentraciones de caprilato de sodio en el tampón de lavado.
Figura 3:La isoterma de Langmuir se adapta para la adsorción de AcM1 a la resina MabSelect SuRe en soluciones de diferentes concentraciones de caprilato de sodio.
Figura 4:La proteína A eluye la concentración de HCP para 5 AcM con tampones de lavado con caprilato de sodio 100 mM y 250 mM.
Figura 5:La proteína A eluye la concentración de HCP para el AcM2 con tampones de lavado que contienen diferentes concentraciones de caprilato de sodio y arginina a diferentes pH. Nota: todos los tampones de lavado contienen acetato de sodio 300 mM.
Figura 6:La proteína A eluye la concentración de HCP para dos corrientes de alimentación de AcM1 diferentes con tampones de lavado que contienen diferentes concentraciones de caprilato de sodio y arginina a pH variables. Nota: todos los tampones de lavado contienen acetato de sodio 300 mM.
Figura 7:La proteína A eluye la concentración de PLBL2 para las corrientes de alimentación de AcM5 con tampones de lavado que contienen diferentes concentraciones de caprilato de sodio y arginina a diferentes pH.
Figura 8:La proteína A eluye la concentración de HCP para corrientes de alimentación de AcM5 con tampones de lavado que contienen diferentes concentraciones de caprilato de sodio y arginina a diferentes pH.
Figura 9:La etapa de proteína A produce corrientes de alimentación de AcM5 con tampones de lavado que contienen diferentes concentraciones de caprilato de sodio y arginina a diferentes pH.
Figura 10:Actividades de catepsina L en eluidos de proteína A de AcM3 para lavados que contienen caprilato de sodio y arginina o lisina.
Figura 11:Porcentaje de fragmentación de anticuerpos para intermediarios del proceso de anticuerpos monoclonales.
Figura 12:Concentración de HCP con tampones de lavado con caprilato solo frente a caprilato más arginina.Figura 13:Porcentaje de fragmentación de anticuerpos para el fármaco de anticuerpos monoclonales mantenido a 25 °C durante un máximo de 10 días.
Descripción detallada
Como se usan en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno/una", "el" y "la" incluyen las referencias en plural a menos que el contenido indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un polipéptido" incluye una combinación de dos o más polipéptidos, y similares.
La expresión "que comprende" abarca "que incluye" o "que consiste", por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y. La expresión "que consiste esencialmente en" limita el alcance de la característica a los materiales o etapas especificados y aquellos que no afectan materialmente las características básicas de la característica reivindicada. La expresión "que consiste en" excluye la presencia de cualquier componente adicional.
"Aproximadamente", como se utiliza en el presente documento, cuando se refiere a un valor medible, tal como una cantidad, una duración temporal y similares, pretende abarcar variaciones de ± 20 % o ± 10 %, incluido ± 5 %, ± 1 % y ± 0,1 % del valor especificado, ya que tales variaciones son adecuadas para realizar los métodos divulgados.
A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto en la materia a la que pertenece la invención. Aunque pueden utilizarse en la práctica para las pruebas de la presente invención cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento, los materiales y métodos preferidos se describen en el presente documento. En la descripción y las reivindicaciones de la presente invención, se utilizará la siguiente terminología.
"Polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de restos de aminoácidos. Un polipéptido puede ser de origen natural (procedente de tejido), de expresión recombinante o natural a partir de preparaciones celulares procariotas o eucariotas, o producido químicamente a través de métodos sintéticos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en donde uno o más restos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido correspondiente de origen natural, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y a polímeros de aminoácidos de origen no natural. Miméticos de aminoácidos se refiere a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de manera similar a un aminoácido de origen natural. Los restos no naturales están bien descritos en la bibliografía científica y de patentes; a continuación se describen algunas composiciones no naturales ilustrativas útiles como miméticos de restos de aminoácidos naturales y pautas. Los miméticos de aminoácidos aromáticos se pueden generar mediante el reemplazo por, por ejemplo, D- o L-naftilalanina; D- o L-fenilglicina; D- o L-2 tienilalanina; D- o L-1, -2,3- o 4-pirenilalanina; D- o L-3 tienilalanina; D- o L-(2-piridinil)-alanina; D- o L-(3-piridinil)-alanina; D- o L-(2-pirazinil)-alanina; D- o L-(4-isopropil)-fenilglicina: D-(trifluorometil)-fenilalanina; D-(trifluorometil)-fenilalanina: D-p-fluoro-fenilalanina; D- o L-p-bifenilfenilalanina; K- o L-p-metoxibifenilfenilalanina: D- o L-2-indol(alquil)alaninas; y D- o L-alquilaininas, donde alquilo puede ser metilo, etilo, propilo, hexilo, butilo, pentilo, isopropilo, isobutilo, sec-isotilo, isopentilo sustituido o no sustituido, o un aminoácido no ácido. Los anillos aromáticos de un aminoácido no natural incluyen, por ejemplo, anillos aromáticos de tiazolilo, tiofenilo, pirazolilo, bencimidazolilo, naftilo, furanilo, pirrolilo y piridilo.
"Péptido", como se utiliza en el presente documento, incluye péptidos que son variaciones conservadoras de los péptidos ejemplificados específicamente en el presente documento. "Variación conservadora", como se utiliza en el presente documento, indica la sustitución de un resto de aminoácido por otro resto biológicamente similar. Los ejemplos de variaciones conservadoras incluyen, pero sin limitación, la sustitución de un resto hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina, alanina, cisteína, glicina, fenilalanina, prolina, triptófano, tirosina, norleucina o metionina por otro, o la sustitución de un resto polar por otro, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico, o glutamina por asparagina, y similares. Los aminoácidos hidrófilos neutros que pueden sustituirse entre sí incluyen asparagina, glutamina, serina y treonina.
"Variación conservadora" también incluye el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido original no sustituido siempre que los anticuerpos producidos contra el polipéptido sustituido también inmunorreaccionen con el polipéptido no sustituido. Dichas sustituciones conservadoras están dentro de la definición de las clases de las proteínas descritas en el presente documento.
"Catiónico", como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier péptido que posea una carga neta positiva a pH 7,4. La actividad biológica de los péptidos puede determinarse mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia y descritos en el presente documento.
"Recombinante", cuando se utiliza con referencia a una proteína, indica que la proteína se ha modificado mediante la introducción de un ácido nucleico o una proteína heterólogos o la alteración de un ácido nucleico o una proteína naturales.
Como se utiliza en el presente documento, una "proteína terapéutica" se refiere a cualquier proteína y/o polipéptido que se puede administrar a un mamífero para provocar una respuesta biológica o médica de un tejido o sistema, animal o humano que se esté buscando, por ejemplo, por un investigador o médico. Una proteína terapéutica puede provocar más de una respuesta biológica o médica. Además, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" significa cualquier cantidad que, en comparación con un sujeto correspondiente que no ha recibido dicha cantidad, da como resultado, pero sin limitación, la curación, prevención o mejora de una enfermedad, trastorno o efecto secundario, o una disminución en la velocidad de avance de una enfermedad o trastorno. La expresión también incluye dentro de su alcance cantidades eficaces para potenciar la función fisiológica normal así como cantidades eficaces para provocar una función fisiológica en un paciente que potencia o ayuda al efecto terapéutico de un segundo agente farmacéutico.
Todos los restos de "aminoácidos" identificados en el presente documento están en la configuración L natural. Según la nomenclatura de polipéptidos convencional, las abreviaturas para los restos de aminoácidos se muestran en la siguiente tabla.
Tabla 1:Abreviaturas de aminoácidos.
Cabe señalar que todas las secuencias de restos de aminoácidos están representadas en el presente documento por fórmulas cuya orientación de izquierda a derecha está en la dirección convencional del extremo amino al extremo carboxilo.
Métodos de purificación
En un aspecto, la presente invención se dirige a un método para purificar un polipéptido recombinante a partir de proteínas de la célula hospedadora (HCP), comprendiendo el método: (a) aplicar una solución que comprende el polipéptido recombinante y HCP a un soporte sólido de la cromatografía de superantígeno; (b) lavar el soporte sólido de la cromatografía de superantígeno con un tampón de lavado que comprende caprilato de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 300 mM y arginina a más de aproximadamente 0,5 M; y (c) eluir el polipéptido recombinante del soporte sólido de la cromatografía de superantígeno, en donde el superantígeno se selecciona del grupo que consiste en proteína A, proteína G y proteína L; y en donde aproximadamente significa /- 20 %, /- 10 %, /- 5 %, /- 1 % o /- 0,1 %.
En una realización específica de la presente invención, el tampón de lavado comprende caprilato aproximadamente 100 mM y arginina aproximadamente 1,1 M, en donde aproximadamente significa /- 20 %, /- 10 %, /- 5 %, - 1 % o - 0,1 %. En una realización específica de la presente invención, el tampón de lavado comprende caprilato aproximadamente 150 mM y arginina aproximadamente 1,1 M, en donde aproximadamente significa /- 20 %, /- 10 %, /- 5 %, /- 1 % o /- 0,1 %.
En otra realización específica de la presente invención, el método comprende: (b1) lavar el soporte sólido de la cromatografía de superantígeno con un primer tampón de lavado que comprende caprilato de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 300 mM; (b2) lavar el soporte sólido de la cromatografía de superantígeno con un segundo tampón de lavado que comprende arginina a más de aproximadamente 0,5 M; en donde aproximadamente significa /- 20 %, /- 10 %, /- 5 %, /- 1 % o /- 0,1 %.
En otra realización específica de la presente invención, el método comprende: (b1) lavar el soporte sólido de la cromatografía de superantígeno con un primer tampón de lavado que comprende arginina a más de aproximadamente 0,5 M; (b2) lavar el soporte sólido de la cromatografía de superantígeno con un segundo tampón de lavado que comprende caprilato de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 300 mM; en donde aproximadamente significa /- 20 %, /- 10 %, /- 5 %, /- 1 % o /- 0,1 %.
Después de aplicar (o cargar) la solución al soporte sólido de la cromatografía de superantígeno en la etapa (a), el polipéptido recombinante será adsorbido al superantígeno inmovilizado en el soporte sólido. Las impurezas de HCP se pueden eliminar entonces mediante la puesta en contacto del superantígeno inmovilizado que contiene el polipéptido recombinante adsorbido con un tampón de lavado como se describe en el presente documento.
"Superantígeno" se refiere a ligandos genéricos que interactúan con miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas en un sitio que es distinto de los sitios de unión al ligando diana de estas proteínas. Las enterotoxinas estafilocócicas son ejemplos de superantígenos que interactúan con los receptores de linfocitos T. Los superantígenos que se unen a los anticuerpos incluyen, pero sin limitación, proteína G, que se une a la región constante de IgG (Bjorck y Kronvall (1984) J. Immunol., 133:969); proteína A que se une a los dominios VH y a la región constante de IgG (Forsgren y Sjoquist, (1966) J. Immunol., 97:822); y proteína L que se une a dominios VL (Bjorck, (1988) J. Immunol., 140: 1194). De acuerdo con la presente invención, el superantígeno se selecciona del grupo que consiste en proteína A, proteína G y proteína L.
Cuando se utiliza en el presente documento, el término "proteína A" abarca la proteína A recuperada de una fuente nativa de la misma (por ejemplo, la pared celular deStaphylococcus aureus),la proteína A producida sintéticamente (por ejemplo, mediante síntesis de péptidos o mediante técnicas recombinantes) y variantes de la misma que conservan la capacidad de unirse a proteínas que tienen una región C<h>2/C<h>3. La proteína A se puede comprar en el mercado, por ejemplo de Repligen o Pharmacia.
Como se utiliza en el presente documento, "cromatografía de afinidad" es un método cromatográfico que utiliza interacciones específicas y reversibles entre biomoléculas en lugar de propiedades generales de la biomolécula, tal como el punto isoeléctrico, la hidrofobicidad o el tamaño, para efectuar la separación cromatográfica. "Cromatografía de afinidad con proteína A" o "cromatografía con proteína A" se refiere a un método cromatográfico de afinidad específica que hace uso de la afinidad de los dominios de unión de IgG de la proteína A por la porción Fc de una molécula de inmunoglobulina. Esta porción Fc comprende dominios constantes C<h>2 y C<h>3 de inmunoglobulina humana o animal o dominios de inmunoglobulina sustancialmente similares a estos. En la práctica, la cromatografía con proteína A implica el uso de proteína A inmovilizada en un soporte sólido. Véase Gagnon, Protein A Affinity Chromatography, Purification Tools for Monoclonal Antibodies, págs. 155-198, Validated Biosystems, (1996). También se pueden utilizar la proteína G y la proteína L para la cromatografía de afinidad. El soporte sólido es una matriz no acuosa a la que se adhiere la proteína A (por ejemplo, una columna, resina, matriz, perla, gel, etc.). Dichos soportes incluyen agarosa, sefarosa, vidrio, sílice, poliestireno, carbón de colodión, arena, polimetacrilato, poli(estirenodivinilbenceno) reticulado y agarosa con extensor de superficie de dextrano y cualquier otro material adecuado. Dichos materiales son bien conocidos en la materia. Puede usarse cualquier método adecuado para fijar el superantígeno al soporte sólido. Los métodos para fijar proteínas a soportes sólidos adecuados son bien conocidos en la materia.
Véase,por ejemplo,Ostrove, en Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology, (1990) 182: 357-371. Dichos soportes sólidos, con y sin proteína A o proteína L inmovilizadas, están fácilmente disponibles en muchas fuentes comerciales, tales como Vector Laboratory (Burlingame, California), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Calif.), BioRad (Hércules, California), Amersham Biosciences (parte de GE Healthcare, Uppsala, Suecia) y Millipore (Billerica, Mass.).
El método descrito en el presente documento puede comprender una o más etapas de purificación adicionales, tal como una o más etapas de cromatografía adicionales. En una realización, la una o más etapas de cromatografía adicionales se seleccionan del grupo que consiste en: cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico y cromatografía de modo mixto, en particular cromatografía de intercambio aniónico.
En una realización, el método comprende adicionalmente filtrar el eluido producido mediante la etapa (c) de los métodos descritos en el presente documento.
En una realización, el método comprende además las siguientes etapas después de la etapa (c): (d) valorar la solución que contiene la proteína recuperada a aproximadamente pH 3,5 con ácido acético 30 mM, HCl 100 mM; (e) permitir que la solución de la etapa (d) permanezca a aproximadamente pH 3,5 durante aproximadamente 30 a aproximadamente 60 minutos; y (f) ajustar el pH de la solución de la etapa (e) a aproximadamente pH 7,5 con Tris 1 M. En una realización, el método comprende además filtrar la solución producida en la etapa (f).
En una realización, la cantidad de proteína recombinante aplicada a la columna en la etapa (a) (es decir, la relación de carga) es 35 mg/ml o inferior, tal como 30 mg/ml o inferior, 20 mg/ml o inferior, 15 mg/ml o inferior o 10 mg/ml o inferior. Se entenderá que "relación de carga" se refiere a miligramos (mg) de proteína(por ejemplo,anticuerpo monoclonal) por mililitro (ml) de resina.
Tampones de lavado
Un "tampón" es una solución tamponada que resiste los cambios de pH mediante la acción de sus componentes conjugados ácido-base. Un "tampón de equilibrio" se refiere a una solución utilizada para preparar la fase sólida para cromatografía. Un "tampón de carga" se refiere a una solución utilizada para cargar la mezcla de la proteína e impurezas en la fase sólida (es decir, matriz de cromatografía). Los tampones de equilibrio y carga pueden ser los mismos. Un "tampón de lavado" se refiere a una solución utilizada para eliminar las impurezas restantes de la fase sólida una vez completada la carga. El "tampón de elución" se utiliza para eliminar la proteína diana de la matriz de cromatografía.
Una "sal" es un compuesto formado por la interacción de un ácido y una base.
En un aspecto de la invención, el tampón de lavado comprende un carboxilato alifático. El carboxilato alifático puede ser de cadena lineal o ramificada. En determinadas realizaciones, el carboxilato alifático es un ácido carboxílico alifático o una sal del mismo, o la fuente del carboxilato alifático es un ácido carboxílico alifático o una sal del mismo. En determinadas realizaciones, el carboxilato alifático es de cadena lineal y se selecciona del grupo que consiste en ácido metanoico (fórmico), ácido etanoico (acético), ácido propanoico (propiónico), ácido butanoico (butírico), ácido pentanoico (valérico), ácido hexanoico (caproico), ácido heptanoico (enántico), ácido octanoico (caprílico), ácido nonanoico (pelargónico), ácido decanoico (cáprico), ácido undecanoico (undecílico), ácido dodecanoico (láurico), ácido tridecanoico (tridecílico), ácido tetradecanoico (mirístico), ácido pentadecanoico, ácido hexadecanoico (palmítico), ácido heptadecanoico (margárico), ácido octadecanoico (esteárico) y ácido icosanoico (araquidídico) o cualquiera de sus sales. Por consiguiente, el carboxilato alifático puede comprender una cadena principal de carbonos de 1 a 20 carbonos de longitud. En una realización, el carboxilato alifático comprende una cadena principal de 6 a 12 carbonos. En una realización, el carboxilato alifático se selecciona del grupo que consiste en caproato, heptanoato, caprilato, decanoato y dodecanoato. En una realización adicional, el carboxilato alifático es caprilato.
En una realización, la fuente del carboxilato alifático se selecciona del grupo que consiste en un ácido carboxílico alifático, una sal de sodio de un ácido carboxílico alifático, una sal de potasio de un ácido carboxílico alifático y una sal de amonio de un ácido carboxílico alifático. En una realización, la fuente del carboxilato alifático es una sal de sodio de un ácido carboxílico alifático. En una realización adicional, el tampón de lavado comprende caprilato de sodio, decanoato de sodio o dodecanoato de sodio, en particular caprilato de sodio.
En una realización, el tampón de lavado comprende caprilato de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 300 mM. En una realización más específica, el tampón de lavado comprende caprilato a más de aproximadamente 200 mM. En una realización, el tampón de lavado comprende caprilato a más de aproximadamente 250 mM. En una realización adicional, el tampón de lavado comprende caprilato al menos a aproximadamente 150 mM, aproximadamente 200 mM, aproximadamente 250 mM o aproximadamente 300 mM. En otra realización, el tampón de lavado comprende caprilato aproximadamente 100 mM, aproximadamente 125 mM, aproximadamente 150 mM, aproximadamente 175 mM, aproximadamente 200 mM o aproximadamente 250 mM.
En una realización, el tampón de lavado comprende caprilato de sodio de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 300 mM. En una realización más específica, el tampón de lavado comprende caprilato de sodio a más de aproximadamente 200 mM. En una realización, el tampón de lavado comprende caprilato de sodio a más de aproximadamente 250 mM. En una realización adicional, el tampón de lavado comprende caprilato de sodio al menos a aproximadamente 150 mM, aproximadamente 200 mM, aproximadamente 250 mM o aproximadamente 300 mM. En otra realización, el tampón de lavado comprende caprilato de sodio aproximadamente 100 mM, aproximadamente 125 mM, aproximadamente 150 mM, aproximadamente 175 mM, aproximadamente 200 mM o aproximadamente 250 mM.
En una realización, el tampón de lavado comprende caprilato más de aproximadamente 250 mM a aproximadamente 300 mM.
En una realización, el tampón de lavado comprende caprilato de sodio de más de aproximadamente 250 mM a aproximadamente 300 mM.
En una realización, el tampón de lavado comprende un ácido orgánico, una sal de metal alcalino o de amonio de la base conjugada del ácido orgánico, y una base orgánica. En una realización, el tampón de lavado se elabora sin la adición de NaCl.
En una realización, la base conjugada del ácido orgánico es la sal de sodio, potasio o amonio de la base conjugada del ácido orgánico. En una realización, el ácido orgánico es ácido acético y la base conjugada del ácido acético es la sal de sodio (es decir, acetato de sodio).
En una realización, el tampón de lavado comprende adicionalmente ácido acético de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 500 mM. En una realización, el tampón de lavado comprende ácido acético aproximadamente 45 mM. En una realización, el tampón de lavado comprende adicionalmente base Tris de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 500 mM. En una realización, el tampón de lavado comprende base Tris aproximadamente 55 mM. En una realización, el tampón de lavado comprende adicionalmente acetato de sodio de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 500 mM. En una realización, el tampón de lavado comprende acetato de sodio aproximadamente 300 mM.
En una realización, el pH del tampón de lavado está entre aproximadamente pH 7 y aproximadamente pH 9; por ejemplo, de aproximadamente pH 7,5 a aproximadamente pH 8,5.
En una realización, el tampón de lavado comprende arginina a más de aproximadamente 0,5 M. En una realización adicional, el tampón de lavado comprende arginina de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 2 M. En otra realización más, el tampón de lavado comprende arginina de aproximadamente 0,75 M a aproximadamente 1,5 M. En una realización adicional, el tampón de lavado comprende arginina aproximadamente 1 M, aproximadamente 1,1 M, aproximadamente 1,2 M, aproximadamente 1,3 M, aproximadamente 1,4 M, aproximadamente 1,5 M, aproximadamente 1,6 M, aproximadamente 1,7 M, aproximadamente 1,8 M, aproximadamente 1,9 M o aproximadamente 2 M. En una realización, el tampón de lavado comprende arginina de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 2 M, en particular arginina de aproximadamente 0,75 M a aproximadamente 2 M. En una realización adicional, el tampón de lavado comprende arginina a más de aproximadamente 1 M.
Se entenderá que las referencias a "arginina" no sólo se refieren a los aminoácidos naturales, sino que también abarca derivados de arginina o sales de los mismos, tal como HCl arginina, acetil arginina, agmatina, ácido argínico, N-abutiroil-L-arginina o N-a-pivaloil arginina.
Como alternativa, la arginina podría incluirse en el tampón de lavado inicial (es decir, utilizarse de manera simultánea). Por tanto, en un aspecto, la invención proporciona un método para purificar un polipéptido recombinante a partir de proteínas de la célula hospedadora (HCP), comprendiendo el método: (a) aplicar una solución que comprende el polipéptido recombinante y HCP a un soporte sólido de la cromatografía de superantígeno, (b) lavar el soporte sólido de la cromatografía de superantígeno con un tampón de lavado que comprende caprilato de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 850 mM y arginina de aproximadamente 0,25 M a aproximadamente 1,5 M; y (c) eluir el polipéptido recombinante del soporte sólido de la cromatografía de superantígeno. Como se utiliza en los ejemplos descritos en el presente documento, los lavados de la cromatografía de superantígenos que comprenden una combinación de caprilato y arginina tuvieron un efecto sinérgico inesperado de mejora de la depuración de proteínas de la célula hospedadora, en particular para eliminar PLBL2 y catepsina L, que son dos proteínas de la célula hospedadora particularmente difíciles de eliminar.
En una realización, el tampón de lavado comprende caprilato de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 300 mM; y arginina de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 1,5 M; o arginina de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 1 M.
En una realización, el tampón de lavado comprende caprilato de sodio de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 300 mM; y arginina de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 1,5 M; o arginina de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 1 M.
En una realización, el tampón de lavado comprende además lisina de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 1 M, tal como lisina aproximadamente 0,75 M. En esta realización, la lisina se incluye en el tampón de lavado inicial (es decir, se utiliza de manera simultánea). En una realización alternativa, la lisina se incluye en un tampón de lavado separado (es decir, se utiliza de manera secuencial). Como se muestra en los ejemplos proporcionados en el presente documento, se demostró que la adición de lisina reduce con éxito el volumen de elución.
Polipéptidos recombinantes
En una realización, el polipéptido es un polipéptido de unión a antígeno. En una realización, el polipéptido de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, dominio variable único de inmunoglobulina (dAc), AcMdAc, Fab, F(ab')<2>, Fv, Fv unido por disulfuro, scFv, anticuerpo multiespecífico de conformación cerrada, scFv unido por disulfuro, diacuerpo o un receptor soluble. En una realización adicional, la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal (AcM). Las expresiones polipéptido recombinante, molécula del producto y AcM se utilizan en el presente documento de manera indistinta. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo quimérico, humanizado o de dominio.
Los términos Fv, Fc, Fd, Fab o F(ab)<2>se utilizan con sus significados convencionales (véase, por ejemplo, Harlowet al.,Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)).
Un "anticuerpo quimérico" se refiere a un tipo de anticuerpo modificado por ingeniería que contiene una región variable natural (cadena ligera y cadenas pesadas) procedente de un anticuerpo donante en asociación con regiones constantes de cadena ligera y pesada procedente de un anticuerpo aceptor.
Un "anticuerpo humanizado" se refiere a un tipo de anticuerpo modificado por ingeniería que tiene sus CDR procedentes de una inmunoglobulina no humana donante, siendo las restantes partes procedentes de la inmunoglobulina de la molécula procedentes de una o más inmunoglobulinas humanas. Además, los restos de soporte del marco pueden alterarse para conservar la afinidad de unión (véanse, por ejemplo, Queenet al.,(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10032, Hodgsonet al.,(1991) Bio/Technology, 9:421). Un anticuerpo aceptor humano adecuado puede ser uno seleccionado de una base de datos convencional, por ejemplo, la base de datos KABAT.RTM., base de datos Los Alamos y base de datos Swiss Protein, por homología con las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del anticuerpo donante. Un anticuerpo humano caracterizado por una homología con las regiones marco del anticuerpo donante (basándose en los aminoácidos) puede ser adecuado para proporcionar una región constante de cadena pesada y/o una región marco variable de cadena pesada para la inserción de las CDR donantes. Un anticuerpo aceptor adecuado capaz de donar regiones marco variables o constantes de cadena ligera puede seleccionarse de manera similar. Cabe señalar que no es necesario que las cadenas pesada y ligera del anticuerpo aceptor se originen a partir del mismo anticuerpo aceptor. El estado de la técnica describe varias formas de producir dichos anticuerpos humanizados; véanse, por ejemplo, los documentos EP-A-0239400 y EP-A-054951.
La expresión "anticuerpo donante" se refiere a un anticuerpo (monoclonal y/o recombinante) que aporta las secuencias de aminoácidos de sus regiones variables, CDR u otros fragmentos funcionales o análogos de los mismos a un primer compañero de inmunoglobulina, para proporcionar a la región codificante de inmunoglobulina alterada y al anticuerpo alterado expresado resultante la especificidad antigénica y la actividad neutralizante características del anticuerpo donante. La expresión "anticuerpo aceptor" se refiere a un anticuerpo (monoclonal y/o recombinante) heterólogo al anticuerpo donante, que aporta todas (o cualquier porción, pero en algunas realizaciones la totalidad) las secuencias de aminoácidos que codifican sus regiones marco de cadena pesada y/o ligera y/o sus regiones constantes de cadena pesada y/o ligera al primer compañero de inmunoglobulina asociado. En determinadas realizaciones, un anticuerpo humano es el anticuerpo aceptor.
Las "CDR" se definen como secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad de un anticuerpo que son las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, Kabatet al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4.a ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). Hay tres CDR (o regiones CDR) de cadena pesada y tres de cadena ligera en la porción variable de una inmunoglobulina. Por lo tanto, "CDR", como se usa en el presente documento, se refiere a las tres CDR de cadena pesada, o las tres CDR de cadena ligera (o todas las CDR de cadena pesada y todas las de cadena ligera, si corresponde). La estructura y el plegamiento proteico del anticuerpo puede hacer que otros restos se consideren parte de la región de unión al antígeno y así lo debe entender un experto en la materia (véase, por ejemplo, Chothiaet al.,(1989) Nature 342:877-883).
Como se usa en el presente documento, el término "dominio" se refiere a una estructura de proteína plegada que tiene una estructura terciaria independiente del resto de la proteína. Generalmente, los dominios son responsables de las propiedades funcionales individuales de las proteínas y, en muchos casos, pueden añadirse, retirarse o transferirse a otras proteínas sin pérdida de función del resto de la proteína y/o del dominio. Un "dominio variable único de anticuerpo" es un dominio de polipéptido plegado que comprende secuencias características de dominios variables de anticuerpo. Por tanto, incluye dominios variables de anticuerpo completos y dominios variables modificados, por ejemplo, en los que uno o más bucles se han reemplazado por secuencias que no son características de los dominios variables de anticuerpo, o dominios variables de anticuerpo que se han truncado o comprenden extensiones amino o carboxiterminales, así como fragmentos plegados de dominios variables que conservan al menos la actividad de unión y la especificidad del dominio de longitud completa.
La expresión "dominio variable único de inmunoglobulina" se refiere a un dominio variable de anticuerpo (V<h>, V<hh>, V<l>) que se une específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de una región o dominio V diferente. Un dominio variable único de inmunoglobulina puede estar presente en un formato (por ejemplo, homo o heteromultímero) con otras regiones variables o dominios variables diferentes donde las otras regiones o dominios no son necesarios para la unión al antígeno por el dominio variable único de inmunoglobulina (es decir, donde el dominio variable único de inmunoglobulina se une al antígeno independientemente de los dominios variables adicionales). Un "anticuerpo de dominio" o "dAc" es lo mismo que un "dominio variable único de inmunoglobulina" que es capaz de unirse a un antígeno como se usa el término en el presente documento. Un dominio variable único de inmunoglobulina puede ser un dominio variable de anticuerpo humano, pero también incluye dominios variables únicos de anticuerpo de otras especies, tales como roedores (por ejemplo, como se divulga en el documento WO 00/29004), dAc VHH de tiburón nodriza y camélidos. Los VHH de camélidos son polipéptidos de dominio variable único de inmunoglobulina que proceden de especies que incluyen camello, llama, alpaca, dromedario y guanaco, que producen anticuerpos de cadena pesada desprovistos de forma natural de cadenas ligeras. Dichos dominios VHH pueden humanizarse de acuerdo con técnicas convencionales disponibles en la materia y dichos dominios se consideran "anticuerpos de dominio" de acuerdo con la invención. Como se utiliza en el presente documento, "VH" incluye dominios VHH de camélidos. Los NARV son otro tipo de dominio variable único de inmunoglobulina que se identificaron en peces cartilaginosos, incluido el tiburón nodriza. Estos dominios también se conocen como región variable de receptor de antígeno nuevo (comúnmente abreviada como V(NAR) o NARV). Para detalles adicionales, véase Mol. Immunol. (2006) 44, 656-665 y el documento US2005/0043519.
Los términos "AcMdAc" y dAcAcM" se utilizan en el presente documento para referirse a proteínas de unión a antígeno que comprenden un anticuerpo monoclonal y al menos un anticuerpo de dominio único. Los dos términos se pueden usar indistintamente y se pretende que tengan el mismo significado que se usa en el presente documento.
Con frecuencia, la purificación de polipéptidos recombinantes a partir de proteínas de la célula hospedadora da como resultado la fragmentación del polipéptido recombinante. Los solicitantes han descubierto que cuando se utilizan los métodos de purificación descritos en el presente documento, la cantidad de fragmentación del polipéptido recombinante se reduce significativamente. En una realización, el polipéptido recombinante eluido contiene menos de aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 9 %, aproximadamente un 8 %, aproximadamente un 7 %, aproximadamente un 6 %, aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 4 %, aproximadamente un 3 %, aproximadamente un 2 % o aproximadamente un 1 % de polipéptido recombinante fragmentado. En otra realización, el polipéptido recombinante es un anticuerpo y el anticuerpo eluido contiene menos de aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 9 %, aproximadamente un 8 %, aproximadamente un 7 %, aproximadamente un 6 %, aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 4 %, aproximadamente un 3 %, aproximadamente un 2 % o aproximadamente un 1 % de anticuerpo fragmentado.
Proteínas de la célula hospedadora
"Impureza" se refiere a cualquier molécula extraña o indeseable que esté presente en la muestra de carga antes de la cromatografía de superantígeno o después de la cromatografía de superantígeno en el eluido. Puede haber "impurezas del proceso" presentes. Son impurezas que están presentes como resultado del proceso en el que se produce la proteína de interés. Por ejemplo, estas incluyen proteínas de la célula hospedadora (HCP), ARN y ADN. "HCP" se refiere a proteínas, no relacionadas con la proteína de interés, producidas por la célula hospedadora durante el cultivo celular o la fermentación, incluidas proteínas intracelulares y/o secretadas. Un ejemplo de una proteína de la célula hospedadora es una proteasa, que puede provocar daño a la proteína de interés si todavía está presente durante y después de la purificación. Por ejemplo, si permanece una proteasa en la muestra que comprende la proteína de interés, puede crear sustancias o impurezas relacionadas con el producto que no estaban presentes originalmente. La presencia de proteasas puede provocar descomposición, por ejemplo, fragmentación, de la proteína de interés a lo largo del tiempo durante el proceso de purificación, y/o en la formulación final.
En una realización, las proteínas de la célula hospedadora se producen/proceden de una célula de mamífero o una célula bacteriana. En una realización adicional, la célula de mamífero se selecciona de una célula humana o de roedor (tal como un hámster o un ratón). En otra realización más, la célula humana es una célula HEK, la célula de hámster es una célula CHO o la célula de ratón es una célula NS0.
En ciertas realizaciones, la célula hospedadora se selecciona del grupo que consiste en células CHO, células NS0, células Sp2/0, células COS, células k 562, células BHK, células PER.C6 y células HEK (es decir, las proteínas de la célula hospedadora proceden de estas células hospedadoras). Como alternativa, la célula hospedadora puede ser una célula bacteriana seleccionada del grupo que consiste enE. coli(por ejemplo, W3110, BL21),B. subtilisy/u otras bacterias adecuadas; células eucariotas, tal como células de hongos o levaduras (por ejemplo,Pichia pastoris, Aspergillus sp., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe y Neurospora crassa).
La "solución" puede ser un medio de cultivo celular, por ejemplo, una corriente de alimentación de cultivo celular. La corriente de alimentación puede filtrarse. La solución puede ser un caldo clarificado sin procesar (CUB, del inglésClarified Unprocessed Broth)(o caldo/sobrenadante de fermentación clarificado). El CUB también se conoce como sobrenadante de cultivo celular y las células y/o restos celulares se eliminan mediante clarificación. La solución puede ser una preparación lisada de células que expresan la proteína (por ejemplo, la solución es un lisado).
Las impurezas del proceso también incluyen componentes utilizados para hacer crecer las células o para asegurar la expresión de la proteína de interés, por ejemplo, disolventes (por ejemplo, metanol utilizado para cultivar células de levadura), antibióticos, metotrexato (MTX), componentes de los medios, floculantes, etc. También se incluyen moléculas que forman parte de la fase sólida del superantígeno que se filtran en la muestra durante las etapas anteriores, por ejemplo, proteína A, proteína G o proteína L.
Las impurezas también incluyen "variantes relacionadas con el producto", que incluyen proteínas que conservan su actividad pero son diferentes en su estructura, y proteínas que han perdido su actividad debido a su diferencia en estructura. Estas variantes relacionadas con el producto incluyen, por ejemplo, especies de alto peso molecular (HMW, del ingléshigh molecular weight),especies de bajo peso molecular (l Mw , del ingléslow molecular weight),proteínas agregadas, precursores, proteínas degradadas, proteínas mal plegadas, proteínas con enlaces subdisulfuro, fragmentos y especies desamidadas.
La presencia de una cualquiera de estas impurezas en el eluido se puede medir para establecer si la etapa de lavado ha sido exitosa. Por ejemplo, se muestra una reducción en el nivel de HCP, expresado como ng de HCP por mg de producto (véanse los ejemplos). Como alternativa, las HCP detectadas se pueden expresar como "partes por millón" o "ppm", que equivale a ng/mg, o "ppmm" ("partes por mil millones"), lo que equivale a pg/mg.
En una realización, después de la etapa (c) la cantidad de HCP es inferior a aproximadamente 200 ng de HCP/mg de producto (es decir, ng/mg); inferior a aproximadamente 150 ng/mg; inferior a aproximadamente 100 ng/mg; inferior a aproximadamente 50 ng/mg; o inferior a aproximadamente 20 ng/mg.
También se puede mostrar una reducción en comparación con una etapa de lavado de control sin carboxilato alifático, y/o en comparación con la solución (por ejemplo, caldo clarificado sin procesar) antes de la purificación.
En una realización, después de la etapa (c), el factor de reducción relativo de HCP, en comparación con un lavado con caprilato 100 mM publicado previamente (por ejemplo, véase el documento WO2014/141150), es de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 50 veces. Por tanto, en una realización, después de la etapa (c), el factor de reducción relativo de HCP en comparación con un tampón de lavado que consiste esencialmente en caprilato 100 mM es de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 50 veces. En una realización adicional, el factor de reducción relativo es al menos aproximadamente 2 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 35 veces, 40 veces, 45 veces o 50 veces. Para disipar cualquier duda, la referencia a "un tampón de lavado que consiste esencialmente en caprilato 100 mM" no excluye la presencia de componentes adicionales que no afectan materialmente las características básicas del lavado con caprilato 100 mM, por ejemplo, sales tamponadoras y/o acetato de sodio.
En una realización, la recuperación de la proteína de interés del eluido es del 100 %, el 99 %, el 98 %, el 97 %, el 96 %, el 95 %, el 90 %, el 85 %, el 80 %, el 70 %, el 60 %, el 50 % o menos, incluido cualquier valor distinto en el intervalo del 100 % al 50 % o cualquier subintervalo definido por cualquier par de valores distintos en este intervalo, después de la etapa de lavado de la invención. En una realización, la recuperación de la proteína de interés del eluido es superior al 70 %, tal como más de un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 99 %. El porcentaje (%) de recuperación en el eluido se calcula mediante la determinación de la cantidad de proteína de interés en el eluido como porcentaje de la cantidad de proteína de interés aplicada a la columna de acuerdo con la siguiente fórmula:
Porcentaje de recuperación = Cantidad de producto en el eluido cantidad de producto aplicado a la columna X 100
La cantidad de impurezas (es decir, proteínas de la célula hospedadora) presentes en el eluido puede determinarse mediante ELISA, OCTET u otros métodos para determinar el nivel de uno o más de las impurezas descritas anteriormente. En los ejemplos descritos en el presente documento, se utiliza un método ELISA para determinar el nivel de HCP en una muestra.
En una realización, la proteína de la célula hospedadora se selecciona de PLBL2 (proteína 2 de tipo fosfolipasa B) y/o catepsina L.
En una realización, la proteína de la célula hospedadora es PLBL2. Por tanto, en un aspecto de la invención, se proporciona un método para purificar un polipéptido recombinante de la proteína 2 de tipo fosfolipasa B (PLBL2), comprendiendo el método: (a) aplicar una solución que comprende el polipéptido recombinante y PLBL2 a un soporte sólido de la cromatografía de superantígeno, (b) lavar el soporte sólido de la cromatografía de superantígeno con un tampón de lavado que comprende caprilato de aproximadamente 150 mM a aproximadamente 850 mM; y (c) eluir el polipéptido recombinante del soporte sólido de la cromatografía de superantígeno.
En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para purificar un polipéptido recombinante de la proteína 2 de tipo fosfolipasa B (PLBL2), comprendiendo el método: (a) aplicar una solución que comprende el polipéptido recombinante y PLBL2 a un soporte sólido de la cromatografía de superantígeno, (b) lavar el soporte sólido de la cromatografía de superantígeno con un tampón de lavado que comprende caprilato de aproximadamente 55 mM a aproximadamente 850 mM y arginina de aproximadamente 0,25 M a aproximadamente 1,5 M; y (c) eluir el polipéptido recombinante del soporte sólido de la cromatografía de superantígeno.
En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para purificar un polipéptido recombinante de la proteína 2 de tipo fosfolipasa B (PLBL2), comprendiendo el método: (a) aplicar una solución que comprende el polipéptido recombinante y PLBL2 a un soporte sólido de la cromatografía de superantígeno, (b) lavar el soporte sólido de la cromatografía de superantígeno con un tampón de lavado que comprende caprilato aproximadamente 100 mM y arginina aproximadamente 1,1 M; y (c) eluir el polipéptido recombinante del soporte sólido de la cromatografía de superantígeno.
Se ha descubierto que PLBL2 es una impureza de HCP que es difícil de eliminar durante el procesamiento posterior de anticuerpos, en particular, el AcM5 (véanse los ejemplos), debido a la aparente unión a la molécula del producto. Por tanto, en una realización, el polipéptido recombinante es un anticuerpo, tal como un anticuerpo IgG, en particular un anticuerpo IgG4. La cantidad de PLBL2 se puede medir por cualquier método conocido en la materia, tal como por ELISA, por ejemplo, el ELISA específico de PLBL2 descrito en los ejemplos o divulgado en el documento WO2015/038884.
La proteasa catepsina L se produce durante el cultivo de células CHO y potencialmente puede degradar los anticuerpos, tal como la molécula producto AcM3 (véanse los ejemplos). Por tanto, en una realización, el polipéptido recombinante es un anticuerpo, tal como un anticuerpo IgG, en particular un anticuerpo IgG1.
En una realización, la proteína de la célula hospedadora es catepsina L. En esta realización, la purificación del polipéptido recombinante de catepsina L se puede medir mediante una actividad de catepsina L reducida (por ejemplo con PromoKine PK-CA577-K142) en el eluido de la etapa (c).
En un aspecto de la invención, se proporciona un método para purificar un polipéptido recombinante a partir de catepsina L, comprendiendo el método: (a) aplicar una solución que comprende el polipéptido recombinante y catepsina L a un soporte sólido de la cromatografía de superantígeno, (b) lavar el soporte sólido de la cromatografía de superantígeno con un tampón de lavado que comprende caprilato de aproximadamente 150 mM a aproximadamente 850 mM; y (c) eluir el polipéptido recombinante del soporte sólido de la cromatografía de superantígeno.
En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para purificar un polipéptido recombinante a partir de catepsina L, comprendiendo el método: (a) aplicar una solución que comprende el polipéptido recombinante y catepsina L a un soporte sólido de la cromatografía de superantígeno, (b) lavar el soporte sólido de la cromatografía de superantígeno con un tampón de lavado que comprende caprilato de aproximadamente 55 mM a aproximadamente 850 mM y arginina de aproximadamente 0,25 M a aproximadamente 1,5 M; y (c) eluir el polipéptido recombinante del soporte sólido de la cromatografía de superantígeno.
En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para purificar un polipéptido recombinante a partir de catepsina L, comprendiendo el método: (a) aplicar una solución que comprende el polipéptido recombinante y catepsina L a un soporte sólido de la cromatografía de superantígeno, (b) lavar el soporte sólido de la cromatografía de superantígeno con un tampón de lavado que comprende caprilato aproximadamente 150 mM y arginina aproximadamente 1,1 M; y (c) eluir el polipéptido recombinante del soporte sólido de la cromatografía de superantígeno.
En un aspecto de la invención, se proporciona un polipéptido recombinante purificado obtenido mediante uno cualquiera de los métodos de purificación definidos en el presente documento.
La invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.
Degradación del polisorbato
Los polisorbatos, tal como el polisorbato 20 y el polisorbato 80, son tensioactivos no iónicos ampliamente utilizados para estabilizar productos farmacéuticos proteicos en el producto de formulación final. Los polisorbatos se pueden degradar mediante enzimas residuales en el producto farmacéutico, lo que puede afectar la vida útil final del producto. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, los métodos descritos en el presente documento reducen la cantidad de polisorbato degradado mediante la reducción de la cantidad de proteínas de la célula hospedadora residuales en el producto final. En una realización, la cantidad de polisorbato degradado es inferior a aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 4 %, aproximadamente un 3 %, aproximadamente un 2 % o aproximadamente un 1 %.
EJEMPLO 1: Detección y optimización del pH y la concentración de caprilato de sodio en el lavado de proteína A
Introducción
En el trabajo descrito en el presente documento, el lavado de proteína A se optimizó para lograr una eliminación suficiente de HCP con un proceso de dos columnas (proteína A seguida de intercambio aniónico) para todos los productos de AcM. Los procesos de plataformas existentes frecuentemente requieren una segunda etapa de pulido para alcanzar el nivel de HCP requerido. La eliminación de una etapa de cromatografía simplifica el proceso, permite un desarrollo más rápido del proceso y podría mitigar los riesgos de ajuste de las instalaciones. La estrategia para la optimización del lavado fue mejorar la depuración de HCP mediante la interrupción de las interacciones HCP-AcM. Se examinaron varios aditivos de lavado y pH de lavado y después se optimizaron para la eliminación total de HCP en todo el proceso con proteína A.
Materiales y métodos
n-octanoato de sodio, ácido acético glacial, acetato de sodio, hidróxido de sodio, alcohol bencílico y la base de trizma se adquirieron en Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO). Las soluciones se prepararon con agua que se purificó adicionalmente mediante un sistema Millipore Milli-Q®. Cualquier ajuste del pH se realizó con base tris 3 M o ácido acético 3 M.
Cultivo de células de ovario de hámster chino (CHO) para la producción de AcM
El caldo clarificado sin filtrar (CUB) contenía uno de varios productos de AcM de GSK, tal como AcM1 (IgG1, pI = 8,7, PM = 149 kDa), AcM2 (IgG1, pI = 8,3, PM = 149 kDa), AcM3 (IgG1, pI = 7,9, PM = 149 kDa), AcM4 (IgG1, pI = 8,6, PM = 148 kDa) o AcM5 (IgG4, pI = 7,1, PM = 145 kDa). Se utilizaron métodos similares para producir y recoger todos los AcM utilizados en este estudio. Por ejemplo, el AcM1 se preparó mediante la siembra de reactores de 2 litros con células DG44 que expresan AcM1 con un recuento de células viables de 1,23 a 1,24 MM/ml y una viabilidad de ~93,8 %. A continuación, el cultivo se mantuvo a ~34 °C, pH ~6,9 y 6 g/l de glucosa durante 16 días. La velocidad de agitación se fijó en ~300 rpm. Después del cultivo, las células no clarificadas y el líquido de cultivo que contenía AcM se centrifugaron por lotes a 10.000g durante 20 minutos. A continuación, el líquido de cultivo se filtró al vacío a través de un filtro de SFCA de 0,45 pM y 0,2 pM de Nalgene.
Purificación con proteína A
Se empaquetó la resina de proteína A MabSelect SuRe™ (MSS) de GE Healthcare en una columna de 0,5 cm de diámetro hasta una altura final del lecho de 25 cm. La resina se envasó en flujo, después de sedimentación por gravedad, en NaCl 0,4 M a un caudal lineal de 475 cm/h durante 2 horas utilizando un ÁKTA Avant 25. La calidad del empaquetamiento se evaluó con una inyección de 100 pl de NaCl 2 M para confirmar que la asimetría era de 1,0 /-0,2 y al menos 1000 placas por metro. Todos los experimentos con proteína A utilizaron una relación de carga de 35 mg de AcM/ml de resina y todos los caudales del proceso fueron equivalentes a una velocidad lineal de 300 cm/h. El método de cromatografía con proteína A y los tampones se describen en latabla 2.
T l 2:n i i n f n i n mi n ^ r r m r fí n r ín A D m n W 2 141411 .
Optimización del lavado
Estudios anteriores han demostrado que muchas impurezas de HCP difíciles de eliminar están directamente asociadas con los AcM (Levyet al.,(2014) Biotechnol. Bioeng. 111 (5):904-912; Aboulaichet al.,(2014) Biotechnol. Prog.
30(5):1114-1124); es probable que las condiciones de la solución que interrumpen las interacciones HCP-AcM proporcionen una mejor depuración de HCP durante la etapa de lavado de proteína A y en este trabajo se examinaron y optimizaron varias soluciones de lavado para este propósito. De manera específica, se utilizaron soluciones de lavado que contenían diferentes concentraciones de caprilato de sodio a diferentes pH después de la carga de la muestra para eliminar las HCP del AcM adsorbido en la proteína A antes de la elución. Para evaluar y cuantificar la eficacia de cada lavado en la eliminación de HCP, se desarrolló un ELISA de HCP interno como se describe en la sección de métodos ELISA a continuación. Anteriormente se descubrió que el caprilato de sodio proporcionaba una depuración sólida de HCP cuando se utilizaba en un lavado de proteína A. Sin embargo, estudios previos se limitaron a concentraciones de caprilato de sodio inferiores a 100 mM y pH 7,5; a un estudio inicial de alcance le siguió un estudio de diseño compuesto central esférico para caracterizar el comportamiento de los lavados con proteína A de caprilato de sodio en intervalos de concentración y pH. Los resultados se muestran en lastablas 3y4a continuación. El modelado estadístico se completó de acuerdo con la sección de métodos de análisis estadístico a continuación.
Análisis
Rendimiento de la proteína A
El rendimiento de la proteína A se determinó mediante la medición de la concentración de AcM en el eluido con un Nanodrop 2000c (Thermo Scientific). Se promediaron tres lecturas de Nanodrop para cada muestra de eluido para determinar la concentración de proteínas; el contenido total de AcM en el eluido de proteína A se calculó multiplicando la concentración de AcM por el volumen de eluido (determinado a partir del cromatograma). La concentración de AcM en la carga se determinó utilizando una columna POROS® de 20 pM en una HPLC Agilent serie 1100. Los datos sin procesar de cada muestra de CUB de la proteína A analítica se compararon con un patrón con una concentración conocida para cada AcM particular para calcular un valor. El volumen de carga total se multiplicó por el valor medido para calcular la masa total de AcM cargado, y el rendimiento se calculó dividiendo el AcM total en el eluido por el AcM total en la carga.
Medición de la concentración de proteínas de la célula hospedadora (HCP): ELISA de HCP
El análisis de proteínas de la célula hospedadora mediante ELISA de HCP se desarrolló internamente para cuantificar la cantidad total de HCP inmunogénicas en muestras de productos procedentes de CHO (Miharaet al.,(2015) J. Pharm. Sci. 104: 3991-3996). Este ELISA de HCP se desarrolló utilizando anticuerpos policlonales de cabra anti-HCP de CHO personalizados y un patrón de referencia de HCP producido internamente para uso en múltiples productos procedentes de CHO.
Análisis estadístico
Para analizar el rendimiento del lavado en términos de depuración y rendimiento de HCP, se realizaron un experimento de alcance y un estudio de diseño compuesto central. Ambos factores se escalaron a la escala de -1, 1 unidad y se ajustó a los datos un modelo lineal general. Se ajustó un modelo separado a cada respuesta. Una vez seleccionado el modelo final, se evaluaron los supuestos del modelo sobre el residuo y se realizó una transformación según procediera. Todos los términos del modelo se evaluaron con un nivel de significancia del 5 % y se realizó una eliminación hacia atrás, comenzando con el modelo completo, incluyendo todos los términos de factores cuadráticos.
Medición de isoterma de equilibrio MabSelect SuRe
La resina MabSelect SuRe™ se intercambió con agua desionizada para generar una suspensión de ~50 %. La suspensión se añadió a un ResiQuot, se secó con una línea de vacío doméstica y se dispensaron tapones de resina de 20,8 |jl en una placa de 96 pocilios profundos. En una placa de 96 pocilios separada, se generaron soluciones de proteínas entre 0 y 10 mg/ml con caprilato de sodio 100, 250 y 500 mM. Se midió la concentración de proteína para cada disolución y, a continuación, se añadió 1 ml a cada tapón de resina. La mezcla de resina y proteína se equilibró durante la noche con agitación. La resina se eliminó mediante filtración directamente en una placa UV de 96 pocillos y se midió la concentración final. La concentración de proteína adsorbida, q, se calculó mediante la siguiente ecuación:
n Vlíqu ido( C o ~ C f )
^vv r e s ■ m a '
Resultados y análisis
Los resultados presentados en esta sección demuestran que una concentración elevada de caprilato de sodio (>100 mM) elimina significativamente más proteínas de la célula hospedadora (HCP) durante la cromatografía con proteína A que los tampones de lavado de proteína A basados en caprilato de sodio publicados anteriormente. Esto se demostró con varios AcM con niveles relativamente elevados de HCP como modelo y se confirmó mediante un diseño experimental estadístico; el CUB (carga de proteína A) para los AcM probados tenía concentraciones de HCP entre 106 y 107 ng/mg.
El objetivo principal de este trabajo fue evaluar el impacto de la concentración de caprilato de sodio y el pH del tampón de lavado en la depuración de HCP a través de la etapa de cromatografía con proteína A. Los objetivos principales eran dos. El primero fue comprender el impacto en las HCP en todo el intervalo de trabajo de la concentración de caprilato de sodio y el pH. Se utilizó un diseño de alcance para explorar todo el intervalo de ambos parámetros(Tabla 3);la concentración máxima de caprilato de sodio fue 1 M y el intervalo de pH fue de 7 a 9. El segundo objetivo fue optimizar la concentración de caprilato de sodio y el pH para la depuración de HCP, manteniendo al mismo tiempo un rendimiento por etapas aceptable. Se utilizó un diseño compuesto central (CCD (del inglésCentral Composite Design),Tabla 4)esférico para esta optimización. Tanto los estudios de alcance como los de CCD utilizaron AcM1 como AcM modelo. Los hallazgos de estos estudios iniciales se probaron en AcM adicionales. Los resultados tanto del alcance como del CCD se presentan a continuación.
Tabla 3:Diseño de estudio de alcance para explorar concentraciones de caprilato de sodio de hasta 1 M y pH de 7,0 n l l v r ín A.
Tabla 4:Diseño experimental compuesto central esférico para optimizar la concentración de caprilato de sodio y el H n l l v r ín A.
Los resultados obtenidos del estudio CCD se presentan entabla 5.En general, el pH del tampón de lavado de proteína A tuvo un impacto mínimo en la depuración de HCP. Los lavados que contenían caprilato de sodio 500 mM o 750 mM tuvieron niveles de HCP casi idénticos en todo el intervalo de pH analizado. El análisis estadístico se realizó como se describe en la sección de métodos. En resumen, se ajustaron modelos separados para cada respuesta (rendimiento y HCP), y los términos del modelo se evaluaron con una significancia del 5 % mediante una prueba F. La prueba F confirmó que el pH del lavado no tuvo un efecto estadísticamente significativo en la concentración de las HCP. Un análisis similar también confirmó que el pH no fue un factor significativo para el porcentaje del rendimiento.
Tabla 5:Resultados del diseño compuesto central para la concentración de caprilato de sodio y el pH de las l i n l v r ín A r n A M1.
El análisis estadístico de los resultados del CCD confirmó que la concentración de caprilato de sodio es un factor significativo (tanto en términos lineales como cuadráticos) tanto para la depuración de HCP como para el rendimiento porcentual. La concentración de HCP (ng/mg) se redujo en dos órdenes de magnitud cuando la concentración de caprilato de sodio aumentó de 0 a 1 M(Figura 1- Rendimiento porcentual (triángulos, ▲) y concentración de HCP (cuadrados, ■)). Sin embargo, a medida que la concentración de caprilato de sodio aumenta más allá de 250 mM, el rendimiento cae de más del 90 % al 70 %(Figura 1).Esta gran disminución en el rendimiento por etapas por encima de 250 mM de caprilato de sodio podría deberse a la formación de micelas de caprilato. Se determinó experimentalmente que la concentración micelar crítica (CMC) de caprilato en el tampón de lavado de proteína A era 340 mM. Cuando la concentración de caprilato de sodio aumentó de 250 mM a 500 mM hubo una disminución del 15 % en el rendimiento y solo una disminución del 2,8 % en HCP. Esto puede indicar que la forma libre de caprilato de sodio es la forma activa para la eliminación de las HCP, mientras que cualquier concentración por encima de la CMC muestra rendimientos decrecientes porque las micelas de caprilato provocan pérdida de rendimiento.
EJEMPLO 2: Investigación de pérdida de rendimiento y posibles estrategias de mitigación
La disminución en el porcentaje de rendimiento por encima de la CMC sugiere que las micelas de caprilato, en lugar de la forma libre de caprilato, podrían reducir el rendimiento en toda la etapa con proteína A. Para determinar la naturaleza de la pérdida de rendimiento, se midió la concentración de AcM en las fracciones de eluido, extracción y lavado para procesos con proteína A con diferentes lavados de caprilato de sodio(Figura 2).Este resultado demuestra que la pérdida de rendimiento a una concentración elevada de caprilato de sodio se debió a la desorción durante la etapa de lavado.
Para caracterizar mejor la pérdida de rendimiento durante los lavados con contenido elevado de caprilato de sodio, se midieron las isotermas de unión en equilibrio para determinar la pérdida de capacidad del AcM en concentraciones elevadas de caprilato de sodio(Figura 3).El lavado con caprilato publicado anteriormente, que contenía caprilato de sodio 100 mM, tenía una capacidad de unión máxima de 57 g/l cuando se ajustaba a la isoterma de Langmuir. La isoterma de adsorción fue similar con caprilato de sodio 250 mM, pero con caprilato de sodio 500 mM la isoterma de Langmuir no encajaba bien. Este resultado confirma que los lavados con caprilato de sodio a concentración elevada disminuyen la capacidad de unión de la resina de proteína A y provocan una pérdida de rendimiento.
Después de determinar la fuente de la pérdida de rendimiento, se investigaron métodos para reducir la pérdida de rendimiento. Las dos estrategias que se investigaron fueron disminuir el volumen de lavado y disminuir la relación de carga. El lavado con caprilato de sodio 250 mM se probó a 4, 6 y 8 VC. Disminuir la duración del lavado de 8 a 4 VC solo proporcionó un aumento del 2 % en el rendimiento(Tabla 6)y la concentración de HCP solo aumentó de 31,0 a 35,8 ng/mg. Esto indicó que los lavados con contenido elevado de caprilato de sodio pueden alcanzar niveles aceptables de HCP con volúmenes más pequeños que los probados durante los estudios iniciales de alcance y CCD, y también demostró que los volúmenes de lavado más pequeños no compensan la disminución de la capacidad de unión con concentraciones elevadas de caprilato de sodio.
Tabla 6:Concentración de HCP y rendimiento por etapas con proteína A para diferentes volúmenes de un lavado con ca rilato de sodio 250 mM utilizando AcM1 como modelo.
También se investigó la disminución de la relación de carga durante la captura de proteína A como una mitigación de la pérdida de rendimiento durante los lavados con concentración elevada de caprilato de sodio(Tabla 7). Cuando la relación de carga se redujo de 30 mg/ml a 10 mg/ml, el rendimiento aumentó en un 4,7 % y un 7,7 % para lavados de caprilato de sodio de 250 mM y 500 mM, respectivamente. La relación de carga tuvo un impacto mínimo en la concentración de HCP en el eluido de proteína A.
Tabla 7:Concentración de HCP y rendimiento por etapas con proteína A para variar las relaciones de carga de r ín A n l v ril i 2 mM mM iliz n A M1 m m l .
EJEMPLO 3: Rendimiento del lavado mejorado con AcM adicionales
Los estudios de optimización del lavado de proteína A anteriores se completaron utilizando únicamente AcM1 como producto modelo. El estudio CCD confirmó que el pH no fue un factor significativo para la eliminación de HCP. El análisis estadístico y las investigaciones de rendimiento posteriores indicaron que la concentración de caprilato de sodio era óptima hasta 400 mM. Para confirmar la eliminación mejorada de HCP del lavado con caprilato de sodio 250 mM con respecto al lavado con caprilato de sodio 100 mM desarrollado previamente, en esta sección se estudiaron AcM adicionales. Se comparó la concentración de HCP en el eluido de proteína A para 5 AcM para lavados que contenían caprilato de sodio 100 o 250 mM(Figura 4).Un AcM (AcM3) se obtuvo de dos procesos anteriores separados: un proceso de densidad celular elevada con niveles más elevados de HCP y un proceso convencional que es comparable a las otras moléculas estudiadas.
Con la excepción del AcM2, todos los AcM analizados en el presente documento tenían menos de 100 ng/mg en el eluido de proteína A cuando se utilizó el lavado con caprilato de sodio 250 mM. En la mayoría de los casos, la concentración de HCP mejoró aproximadamente en un orden de magnitud simplemente mediante el aumento de la concentración de caprilato de sodio en el lavado. Además, estos AcM tuvieron un rendimiento por etapas y una calidad del producto aceptables con la concentración elevada de caprilato de sodio.
EJEMPLO 4: Adición de arginina a lavados con proteína A a base de caprilato de sodio
La arginina, un aminoácido, tiene propiedades físicas y químicas muy diferentes en comparación con el caprilato de sodio, un ácido graso. Se planteó la hipótesis de que las diferencias estructurales entre estos dos aditivos podrían conducir a mecanismos de eliminación de HCP ortogonales, es decir, las mezclas de arginina y caprilato podrían tener una mejor eliminación de HCP que un lavado que contenga un solo componente. Se completaron los siguientes estudios para evaluar tanto la eliminación total de HCP como la eliminación específica de HCP para mezclas de caprilato/arginina.
Depuración total de HCP con tampón de lavado de proteína A con caprilato/arginina
Se probaron tampones de lavado de proteína A que contenían combinaciones de caprilato de sodio y arginina con AcM1 y AcM2. Los resultados para el AcM2 se muestran en lafigura 5. Los tampones de lavado de proteína A que contienen sólo caprilato de sodio 100 mM o arginina 750 mM dieron como resultado concentraciones de HCP entre 700 y 1300 ng/mg. El aumento de la concentración de caprilato de sodio a 250 mM dio como resultado una gran mejora en la depuración de HCP, lo que coincide con los resultados de "caprilato de sodio elevado" discutidos anteriormente. Un lavado que contenía caprilato de sodio 250 mM a pH 8,5 dio como resultado 273 ng/mg de HCP en el eluido de proteína A. La adición de arginina al lavado de proteína A a base de caprilato mejoró aún más la eliminación de HCP: caprilato de sodio 250 mM con arginina 750 mM a pH 7,5 u 8,5 dieron como resultado concentraciones de HCP de 209 y 144 ng/mg, respectivamente.
Se completó un estudio similar de caprilato/arginina con AcM1. El AcM1 se obtuvo de dos procesos anteriores separados: un biorreactor alimentado por lotes "convencional" y un proceso de densidad celular elevada. El proceso de densidad celular elevada dio como resultado valores de producto y concentraciones de HCP más elevados. Se incluyó en este estudio como materia prima en el "peor de los casos". Los resultados se presentan en lafigura 6.
En general, los resultados de AcM1 son similares a los hallazgos de AcM2 presentados en lafigura 5.Tanto para la corriente de alimentación AcM1 convencional como para el material de densidad elevada, hubo una mejora en la depuración de HCP mediante el aumento del caprilato de sodio de 100 a 250 mM. Además, la arginina 500 mM tuvo una mejor depuración de HCP que cualquiera de los lavados con caprilato de sodio solo. Sin embargo, el lavado con caprilato de sodio y arginina, ya sea como una mezcla o mediante la aplicación de lavados secuenciales, mostró una depuración de HCP mejorada en comparación con cualquiera de los componentes individualmente. El mejor rendimiento fue un lavado que contenía caprilato de sodio 250 mM y arginina 750 mM a pH 8,5. Esta combinación de caprilato de sodio y arginina elevados produjo eluidos de proteína A de 113 y 67 ng/mg para el AcM1 convencional y de densidad elevada, respectivamente.
EJEMPLO 5: Lavado de proteína A con caprilato/arginina para eliminar PLBL2
PLBL2 es una impureza de HCP específica que es difícil de eliminar durante el procesamiento posterior del AcM5, una IgG4, debido a la aparente unión a la molécula del producto. Anteriormente se había descubierto que esta impureza particular de HCP se une a productos IgG4 durante el procesamiento posterior. PLBL2 también provoca "no linealidad dilucional" durante el análisis ELISA de HCP. Se analizaron lavados de proteína A que contenían una concentración elevada de caprilato de sodio y/o arginina para determinar la eliminación de PLBL2 durante la etapa de proteína A para AcM5.
Los lavados se probaron con concentraciones de caprilato de sodio de hasta 750 mM, pH de 7,5 y 8,5, y concentración de arginina de hasta 1 M. Para cada prueba de lavado de proteína A, la concentración total de PLBL2 (Figura 7,medida mediante un ELISA específico de PLBL2) se informó junto con la HCP total(Figura 8),y el rendimiento por etapas(Figura 9).
La concentración de PLBL2 varió de casi 1 a 600 ng/mg para diferentes lavados de prueba. Los lavados que no contenían arginina y caprilato de sodio a menos de 100 mM tuvieron los peores resultados y produjeron un eluido de proteína A con aproximadamente 600 ng/mg de PLBL2. El aumento de la concentración de caprilato de sodio a 250 mM redujo la PLBL2 a ~100 ng/mg; concentraciones de caprilato de sodio superiores a 250 mM continuaron disminuyendo la PLBL2 a ~50 ng/mg, pero también dio lugar a una pérdida de rendimiento. La HCP total también disminuyó generalmente al aumentar el caprilato de sodio.
Los lavados con proteína A que contienen arginina fueron los más exitosos en términos de depuración de PLBL2 y también demostraron una buena eliminación del HCP total. La arginina 1000 mM sin caprilato de sodio dio como resultado ~10 ng/mg de PLBL2 y 62 ng/mg de HCP. La concentración elevada de arginina no provocó pérdidas significativas de rendimiento.
La combinación de caprilato de sodio y arginina fue el lavado más eficaz para AcM5. De manera específica, el caprilato de sodio 250 mM con arginina 1 M a pH 7,5 u 8,5 dieron como resultado 2 a 3 ng/mg de PLBL2 y ~20 a 30 ng/mg de HCP mientras se mantenía ~90 % de rendimiento por etapas. Los lavados que contenían arginina 1 M y caprilato de sodio 100 mM también tuvieron éxito, pero dieron lugar a concentraciones ligeramente más elevadas de PLBL2 y HCP.
EJEMPLO 6: Lavado con caprilato/arginina para reducir la actividad de catepsina L
Se analizaron lavados de proteína A que contenían caprilato de sodio y arginina con AcM3 para determinar la capacidad de depuración de catepsina L. La proteasa catepsina L se produce durante el cultivo de células CHO y potencialmente puede degradar la molécula producto AcM3. Se ha demostrado que la catepsina L no se elimina del AcM3 durante el proceso de la proteína A. Se probaron lavados que contenían caprilato de sodio 100 mM, caprilato de sodio 250 mM, caprilato de sodio 100 mM con arginina 1000 mM, y caprilato de sodio 100 mM con lisina 750 mM.
Los lavados que contenían caprilato de sodio 250 mM para este producto específico dieron como resultado un comportamiento de elución de proteína A inesperado: la elución a bajo pH, normalmente completada en aproximadamente 2 volúmenes de columna, se extendió a 10 volúmenes de columna. Además, el eluido de proteína A de AcM3 tenía un agregado muy elevado (medido por SEC) cuando se probó el lavado con caprilato de sodio 250 mM. Este comportamiento no se observó con ningún otro producto probado con lavados con contenido elevado de caprilato de sodio.
Los lavados de proteína A que contenían arginina o lisina no tuvieron el comportamiento de elución prolongada que se observó con caprilato de sodio 250 mM solo. Las actividades de catepsina L medidas en los eluidos de proteína A para tres lavados diferentes (caprilato 100 mM ("eluido de la plataforma msss"); caprilato 250 mM, arginina 1 M ("eluido de cap/arg msss"); caprilato 250 mM, lisina 750 mM ("eluido de cap/lys msss")) se informan en lafigura 10;los volúmenes de elución de proteína A se enumeran en latabla 8.La actividad medida disminuyó significativamente con el lavado con caprilato de sodio 100 mM y arginina 1000 mM y un estudio de estabilidad posterior demostraron que la fragmentación disminuyó para el material preparado usando este lavado en comparación con el lavado con caprilato de sodio 100 mM. La adición de lisina 750 mM, en lugar de arginina, disminuyó con éxito el gran volumen de elución, pero no disminuyó significativamente la actividad de la catepsina L. La combinación de caprilato de sodio y arginina 1000 mM proporciona catepsina L mejorada y depuración de HCP total mientras mantiene un volumen de elución razonable y atributos de calidad del producto aceptables.
Tabl :V l m n l i r ín A r A M n if r n l i n l vado.
Ejemplo 7: Lavado de proteína A con caprilato/arginina para eliminar HCP
Se probaron lavados de proteína A que contenían caprilato de sodio y arginina con AcM3 para determinar la capacidad de depuración de HCP. Las concentraciones del tampón de lavado y las concentraciones de HCP resultantes se describen en latabla 9a continuación. El lavado con arginina/caprilato se comparó con lavados solo de caprilato para AcM3.
El lavado con caprilato de 150 mM proporciona una depuración de HCP significativamente mayor que el lavado con caprilato 100 mM. La combinación de arginina 1,1 M y caprilato 150 mM mejora aún más la depuración de HCP en un factor significativo. La depuración mejorada de HCP durante la etapa de proteína A permitió la eliminación de la etapa de cromatografía de pulido final que se requería en el proceso con caprilato solo.
Tabla 9
Ejemplo 8: Disminución de la fragmentación de AcM3
Se analizó la purificación de la proteína A de AcM3 con lavados que contenían caprilato de sodio y arginina para determinar la fragmentación de anticuerpos durante la purificación. Se generaron datos (Figuras 11 a 13) que incluyeron 3 lotes de tampón de lavado que contenían lavado con caprilato 100 mM y 2 lotes de tampón de lavado que contenían caprilato 150 M más arginina 1,1 M.
En lafigura 11se muestra el porcentaje de fragmentación de anticuerpos (medido con SEC HPLC) durante todo el proceso posterior. En lafigura 12se muestra la concentración de HCP a través del proceso. Los lotes de caprilato/arginina no tienen una formación significativa de fragmentación de anticuerpos durante el proceso, mientras que los lotes que contienen solo caprilato tienen una generación significativa de fragmentación de anticuerpos después de la tercera etapa de pulido (no es necesario con el lavado con caprilato/arginina).
Además, se comparó la estabilidad del fármaco producido mediante ambos procesos (caprilato solo y caprilato arginina). El fármaco procedente del proceso con caprilato arginina no generó fragmentación de anticuerpos en 10 días a 25 grados Celsius; el fármaco procedente del proceso solo con caprilato genera una fragmentación significativa de anticuerpos durante los 10 días a 25 grados Celsius(Figura 13).
La combinación de caprilato y arginina en el tampón de lavado disminuye significativamente la generación de fragmentación de anticuerpos durante todo el proceso posterior debido a la mejora de la depuración de catepsina L.
Conclusiones
La depuración de HCP a través de la etapa de proteína A se optimizó mediante la modificación del tampón de lavado para minimizar las interacciones HCP-AcM. Los estudios de detección iniciales concluyeron que el pH del tampón de lavado de proteína A (variado de 7 a 9) no afecta significativamente la depuración de h Cp ni el rendimiento por etapas. La concentración de caprilato de sodio tiene un fuerte efecto tanto en el rendimiento por etapas como en la eliminación de HCP. En concentraciones muy elevadas de caprilato de sodio (por encima de la CMC), la depuración del HCP es óptima, pero el rendimiento por etapas es muy bajo. Este estudio encontró que la utilización de un lavado de proteína A que contiene caprilato de sodio 250 mM ofrece una gran mejora en la depuración de HCP en comparación con los lavados con caprilato de sodio 100 mM utilizados anteriormente, manteniendo al mismo tiempo un rendimiento por etapas aceptable. Este estudio también encontró que los lavados de proteína A que contienen una combinación de caprilato de sodio 250 mM y arginina 500 a 1000 mM tienen una mayor depuración de HCP en comparación con los lavados que contienen solo caprilato de sodio. Se descubrió que los lavados de proteína A que contienen caprilato de sodio y arginina eliminan con éxito la catepsina L y PLBL2 (dos impurezas de HCP particularmente difíciles) a partir de AcM3 y AcM5, respectivamente.
Claims (15)
1. Un método para purificar un polipéptido recombinante a partir de proteínas de la célula hospedadora (HCP), comprendiendo el método: (a) aplicar una solución que comprende el polipéptido recombinante y HCP a un soporte sólido de la cromatografía de superantígeno, (b) lavar el soporte sólido de la cromatografía de superantígeno con un tampón de lavado que comprende caprilato de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 300 mM y arginina a más de aproximadamente 0,5 M; y (c) eluir el polipéptido recombinante del soporte sólido de la cromatografía de superantígeno; en donde el superantígeno se selecciona del grupo que consiste en proteína A, proteína G y proteína L; y en donde aproximadamente significa /- 20 %, /- 10 %, /- 5 %, /- 1 % o /- 0,1 %.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el caprilato es caprilato de sodio.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el tampón de lavado comprende arginina de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 1,5 M o arginina de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 1 M, en donde aproximadamente significa /- 20 %, /- 10 %, /- 5 %, /- 1 % o /- 0,1 %.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde i) el tampón de lavado comprende arginina de aproximadamente 0,75 M a aproximadamente 1,5 M y/o ii) el tampón de lavado comprende además lisina de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 1 M; en donde aproximadamente significa /- 20 %, /- 10 %, /- 5 %, /- 1 % o /- 0,1 %.
5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polipéptido recombinante eluido contiene menos de aproximadamente un 2 % de polipéptido recombinante fragmentado, en donde aproximadamente significa /- 20 %, /- 10 %, /- 5 %, /- 1 % o /- 0,1 %.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde i) la HCP procede de una célula de mamífero, y/o ii) la HCP es proteína 2 de tipo fosfolipasa B o catepsina L.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la purificación del polipéptido recombinante a partir de catepsina L se mide mediante una actividad reducida de catepsina L en el eluido de la etapa (c).
8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el pH del tampón de lavado está entre pH 7 y pH 9; o de pH 7,5 a pH 8,5.
9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polipéptido recombinante es un anticuerpo monoclonal (AcM).
10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el AcM es una IgG1 o una IgG4.
11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde i) el tampón de lavado no contiene cloruro de sodio y/o ii) después de la etapa (c) la cantidad de HCP es inferior a aproximadamente 200 ng de HCP/mg de producto.
12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método comprende: (b1) lavar el soporte sólido de la cromatografía de superantígeno con un tampón de lavado que comprende caprilato de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 300 mM; y (b2) lavar el soporte sólido de la cromatografía de superantígeno con un tampón de lavado que comprende arginina a más de aproximadamente 0,5 M; en donde aproximadamente significa /- 20 %, /- 10 %, /- 5 %, /- 1 % o /- 0,1 %.
13. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el método comprende: (b1) lavar el soporte sólido de la cromatografía de superantígeno con un tampón de lavado que comprende arginina a más de aproximadamente 0,5 M; y (b2) lavar el soporte sólido de la cromatografía de superantígeno con un tampón de lavado que comprende caprilato de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 300 mM; en donde aproximadamente significa /- 20 %, /- 10 %, /- 5 %, /- 1 % o /- 0,1 %.
14. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la HCP es proteína 2 de tipo fosfolipasa B, y el método comprende: (b) lavar el soporte sólido de la cromatografía de superantígeno con un tampón de lavado que comprende caprilato aproximadamente 100 mM y arginina aproximadamente 1,1 M; en donde aproximadamente significa /- 20 %, /- 10 %, /- 5 %, /- 1 % o /- 0,1 %.
15. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la HCP es catepsina L, y el método comprende: (b) lavar el soporte sólido de la cromatografía de superantígeno con un tampón de lavado que comprende caprilato aproximadamente 150 mM y arginina aproximadamente 1,1 M, en donde aproximadamente significa /- 20 %, /- 10 %, /- 5 %, /- 1 % o /- 0,1 %.
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