ES2975982T3 - Microscopía óptica - Google Patents

Abstract

Un método para aumentar el contraste de interferencia en microscopía óptica de dispersión interferométrica. El método comprende proporcionar una región de detección de partículas que comprende una cámara o canal que tiene un límite definido por una o más interfaces, iluminar una partícula en la región de detección de partículas con luz coherente usando una lente objetivo de manera que la luz se refleja desde la interfaz y se dispersa por la partícula, capturando la luz reflejada y la luz dispersada usando la lente objetivo, y proporcionando la luz reflejada y dispersada capturada a un dispositivo de imágenes para visualizar la interferencia entre la luz reflejada y la luz dispersada. La partícula se ilumina con luz coherente en un ángulo oblicuo con respecto a la interfaz. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Microscopía óptica

Campo

Esta invención se refiere en general a la microscopía óptica de dispersión interferométrica.

El trabajo que condujo a esta invención ha recibido financiación del Consejo Europeo de Investigación en el ámbito del Séptimo Programa Fotograma de la Unión Europea (FP7/2007-2013)/acuerdo de subvención ERC No. 337969. El proyecto que ha dado lugar a esta solicitud ha recibido financiación del programa Horizonte 2020 de la Unión Europea programa de investigación e innovación en virtud del acuerdo de subvención No. 766972. El proyecto que dio lugar a esta solicitud ha recibido financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención Marie Sklodowska-Curie No. 674979.

Antecedentes

La microscopía óptica de dispersión interferométrica (iSCAT) es una técnica en la que una partícula fotografiada se ilumina con luz coherente y la señal resulta de la interferencia entre la luz dispersada por la partícula y una luz de referencia reflejada desde una interfaz cercana. Esta interferencia puede dar como resultado señales que se amplifican en comparación con otros enfoques, y la técnica es capaz de detectar moléculas individuales sin etiquetas, como moléculas biológicas, por ejemplo, proteínas/complejos de proteínas. Sin embargo, la señal de interferencia puede ser muy pequeña y difícil de detectar y, por lo general, la configuración iSCAT crea una reflexión espuria que limita la relación señal-ruido alcanzable.

Con más detalle, la señal iSCAT se puede separar en tres componentes: la intensidad del láser reflejada, la intensidad dispersa y la interferencia entre las dos. La intensidad del láser reflejado es dominante pero no transmite ninguna información, la intensidad dispersada es demasiado débil para detectarla y sólo la interferencia es útil.

Como se describe en Arroyo et al, "Microscopía de dispersión interferométrica y su combinación con imágenes de fluorescencia de una sola molécula", Nature Protocols, vol. 11, núm. 4, pág. 617, 2016, "La alineación del haz de iluminación es fundamental para la calidad de la imagen final. Por lo tanto, para garantizar una alineación adecuada, es imperativo que el haz [de iluminación] viaje recto a través del objetivo a lo largo de su eje óptico". Sin embargo, esta disposición plantea el problema de que, a pesar de utilizar revestimientos antirreflectantes de muy alta calidad, una pequeña fracción de la luz incidente se refleja desde la parte posterior del lente objetivo. Como el láser de iluminación tiene una longitud de coherencia corta, del orden de cientos de micrones para un diodo láser, esta reflexión espuria puede reducir la relación señal/ruido y el contraste en un orden de magnitud. Sin embargo, el uso de una "longitud de coherencia larga conduce a la interferencia de casi cualquier reflexión dentro de la configuración experimental, lo que resulta en ruido de imagen adicional" (ibid).

Una forma de aumentar el contraste se describe en Cole et al., "Label-Free Single-Molecule Imaging with Numerical-Aperture-Shaped Interferometric Scattering Microscopy" ACS Photonics 20174(2), 211-216, y también en WO2018/0l.

1591. Utiliza una máscara de fase parcialmente transmisiva que reduce la intensidad de la luz de fondo que llega al detector, aumentando así el contraste interferométrico. Una técnica muy similar que implica una máscara parcialmente transmisiva se describe en Liebel et al., "UltraSENSITIVE Label-Free Nanosensing and High-Speed Tracking of Single Proteins", Nano Letters 2017, 17(2), 1277-1281.

Sin embargo, estas técnicas tienen desventajas, por ejemplo, artefactos marginales y distorsión de la imagen; también pueden mejorar el fondo relativo de la rugosidad de la superficie de la interfaz. De manera contraria a la intuición, utilizar una máscara de fase como la descrita por Cole et al. mejora el contraste, pero no cambia la relación señalruido (esto se debe a que la señal es interferométrica). Por lo tanto, si bien la técnica puede ayudar si el microscopio está limitado por la velocidad de fotogramas de la cámara y puede facilitar el enfoque, no mejora la relación señalruido, que es el parámetro crucial.

Se pueden encontrar más antecedentes de la técnica anterior en Goldfain et al. "Dynamic measurements of the position, orientation, and DNA content of individual unlabeled bacteriophages", Journal of Phys. Chem. B, vol. 120(26), págs. 6130-6138, 2016; W02017/041809; W02015/059682; W02018/189187; W02018/047239; US2012/218629; y Konopka et al. "Variable-angle epifluorescence microscopy: a new way to look at protein dynamics in the plant cell cortex" Plant Journal, vol. 53(1), págs. 186-196, 2008. EP3276389Al propone un sistema de imágenes de dispersión interferométrica de trayectoria común. Joanna Andrecka et al: "Direct Observation and Control of Supported Lipid Bilayer Formation with Interferometric Scattering Microscopy", ACS Nano, vol. 7 núm. 12, 23 de diciembre de 2013 (2013-12-23, páginas 10662-10670, propone microscopía de dispersión interferométrica. El documento WO 02/086578A2 propone un microscopio de campo oscuro. Pache C et al: "Dark-field Optical Coherence Microscopy", Proceedings of s P iE/IS&T, vol. 7554, 25 de enero de 2010 (201001-25), páginas 755425-1 propone la microscopía de coherencia óptica de campo oscuro Matthias D. Koch et al: "Label-free imaging and bending analysis of Microtubules by ROCS Microscopy and Optical Trapping", Biophysical Journal, vol. 114, No. 1, 1 de enero de 2018 (2018-01-01), páginas 168-177 propone microscopía ROCS en modo de campo oscuro.

Resumen

Por lo tanto, en un aspecto se describe un método para aumentar el contraste de la señal (de interferencia) en microscopía óptica de dispersión interferométrica. El método comprende proporcionar una región de detección de partículas que tiene un límite definido por una o más interfaces. La región de detección de partículas puede comprender una cámara o canal, o la región de detección de partículas puede comprender una gotita de líquido sobre una superficie ópticamente transmisiva, como un cubreobjetos. El método comprende, además, iluminar una partícula en la región de detección de partículas con luz coherente usando un lente objetivo de manera que la luz se refleja desde la interfaz y se dispersa por la partícula. El método comprende además capturar la luz reflejada y la luz dispersada usando el lente objetivo. El método comprende además proporcionar la luz reflejada y dispersada capturada a un dispositivo de formación de imágenes para visualizar la interferencia entre la luz reflejada y la luz dispersada. El lente objetivo tiene un eje óptico. El dispositivo de obtención de imágenes puede comprender una óptica de obtención de imágenes y, es decir, seguido en una trayectoria óptico, un detector.

En las implementaciones, el método comprende además proporcionar la luz coherente en un ángulo oblicuo con respecto a la interfaz, para iluminar la partícula. Por lo tanto, el método comprende además proporcionar la luz coherente al lente objetivo fuera del eje, es decir, desplazada del eje óptico del lente objetivo. La luz coherente, por ejemplo, se puede proporcionar luz láser o luz procedente de una fuente LED de banda estrecha al lente objetivo en una dirección paralela y desviada del eje óptico.

Por lo tanto, en las implementaciones, en lugar de ser normal a la interfaz, la luz que ilumina la partícula comprende un haz colimado en un ángulo oblicuo con respecto a la interfaz. Expresado de otra manera, un ángulo de incidencia entre el haz y una normal a la interfaz es mayor que 0 grados y menor que 90 grados; Si el haz no está colimado con precisión, el ángulo medio de incidencia puede ser mayor que cero grados. En implementaciones, el ángulo de incidencia es menor que un ángulo crítico en la interfaz.

Así, en las implementaciones, la luz coherente proporcionada en un ángulo oblicuo con respecto a la interfaz comprende un haz paralelo o colimado. El haz puede ser colimado por el lente objetivo; de este modo, la luz coherente puede enfocarse en un plano focal posterior del lente objetivo. La luz coherente puede propagarse a lo largo de un eje paralelo al eje óptico del lente objetivo, por ejemplo, la luz láser puede estar alineada paralela pero desviada del eje óptico del lente objetivo. Por el contrario, la luz reflejada y dispersada se captura en una dirección a lo largo del eje óptico del lente objetivo.

En algunas implementaciones, un ángulo de incidencia de la luz coherente en la interfaz puede ser mayor que un valor de ángulo en el que, en el dispositivo de imágenes, una intensidad de la luz reflejada es mayor que una intensidad de la luz reflejada desde una superficie posterior del lente objetivo. El ángulo de incidencia puede ser menor que este valor de ángulo más 5, 10 o 20 grados. Por ejemplo, el ángulo de incidencia en el rango de 1-30, 3-20 o 5-15 grados, por ejemplo, alrededor de 10 grados.

No es esencial que la luz coherente se enfoque precisamente en un plano focal posterior del objetivo, y la técnica funcionará cuando la luz que ilumina la partícula no esté colimada con precisión.

Estas técnicas pueden mejorar enormemente la relación señal a ruido y también el contraste de la imagen del patrón de interferencia. En implementaciones, el reflejo espurio procedente de la parte posterior del lente objetivo se puede eliminar sustancialmente, recogiendo únicamente el reflejo que interfiere. Mientras el láser está enfocado en el plano focal posterior, está fuera de eje; la distancia del eje del láser al eje óptico del lente objetivo cambia el ángulo de incidencia de la luz desde el objetivo. Por lo tanto, el reflejo espurio procedente de la parte posterior del objetivo no se refleja directamente en la cámara. Esto impide que el reflejo espurio llegue a la cámara y no reduce la relación señal a ruido; en lugar de ello, principalmente o sólo la reflexión interfiriente, por ejemplo, de una interfaz vidrio-agua del microscopio. En términos generales, al iluminar en un ángulo oblicuo con respecto a la luz dispersada, se puede reducir el nivel de la señal reflejada del fondo, aumentando la relación señal a ruido, así como el contraste de interferencia. La intensidad de la luz reflejada desde la interfaz depende del ángulo (como se esperaba de la ley de Snell), pero la relación señal a ruido no. Sin embargo, en caso de incidencia normal, existe una contribución adicional de la reflexión espuria que reduce sustancialmente la señal a ruido.

En algunas implementaciones, una superficie posterior del lente objetivo está curvada, por ejemplo, abovedada, en lugar de plano. En este caso, se puede obtener un beneficio adicional ya que la reflexión espuria forma un ligero ángulo con respecto a la luz entrante. Esto desvía la reflexión espuria, por ejemplo, lejos del dispositivo óptico/de imágenes posterior, por ejemplo, en las paredes del detector.

Algunas implementaciones de esta técnica son particularmente, pero no exclusivamente, adecuadas para obtener imágenes de partículas en solución, por ejemplo, solución acuosa. Las partículas pueden comprender moléculas o complejos moleculares, tales como moléculas/complejos biológicos, por ejemplo, proteínas, complejos proteicos o anticuerpos. De manera más general, las partículas pueden tener una dimensión máxima que sea inferior a una longitud de onda de la luz coherente, o inferior a la mitad de esta longitud de onda. Dichas partículas pueden incluir nanopartículas metálicas u otras, partículas coloides, partículas poliméricas, virus, exosomas y otras vesículas extracelulares, proteínas y biopartículas en general.

Como se describe más adelante, en implementaciones las partículas pueden iluminarse en el ángulo oblicuo usando luz polarizada cerca del ángulo de Brewster, a través del lente objetivo, para recoger la luz de interferencia, reduciendo así el nivel de señal reflejada de fondo y aumentando el contraste de interferencia. Si bien iluminar en un ángulo oblicuo puede reducir el nivel de luz dispersa capturada por el lente objetivo en la dirección del eje, en general se puede mejorar el contraste.

En caso de ángulos oblicuos muy grandes (con respecto al eje óptico), la relación señal a ruido puede volver a disminuir. Por lo tanto, el método puede comprender ajustar el ángulo oblicuo para maximizar la relación señala a ruido de la interferencia entre la luz reflejada y la luz dispersada, es decir, para maximizar el contraste de interferencia. El contraste de interferencia se puede determinar a la salida del dispositivo de formación de imágenes, es decir, a partir de la imagen capturada de la interferencia. Esto se debe a que la respuesta del dispositivo de imágenes, como su sensibilidad/nivel de ruido inherente, también puede afectar esta compensación. El dispositivo de imágenes puede ser un dispositivo de imágenes 1D o 2D, por ejemplo, una cámara. El ángulo óptimo también puede depender de la rugosidad de la superficie de la interfaz.

A medida que el ángulo de incidencia aumenta alejándose de los 0 grados, es decir, a medida que la iluminación se vuelve más oblicua, el efecto del reflejo espurio desde la parte posterior del lente objetivo disminuye, pero el patrón de interferencia se vuelve más distorsionado. Por lo tanto, en algunas implementaciones, el ángulo oblicuo se selecciona de modo que la intensidad de la luz procedente de los reflejos espurios sea igual o menor que la intensidad de la luz reflejada desde la interfaz de la cámara o canal (como se mide en el dispositivo de imágenes), pero no sustancialmente mayor que este valor, por ejemplo, no más de 10, 20 o 30 grados mayores que este valor.

Una forma de mejorar el contraste de interferencia sin necesidad de dicho ángulo oblicuo y, por lo tanto, con menos reducción del retorno disperso, es polarizar la luz coherente iluminadora. Más particularmente, en algunas implementaciones el método comprende además polarizar linealmente la luz coherente de modo que su vector de campo eléctrico esté parcial o completamente polarizado con respecto a un plano de incidencia de la luz coherente en la interfaz.

Luego, el ángulo de iluminación se puede ajustar aún más para que esté cerca del ángulo de Brewster para la interfaz en la longitud de onda de iluminación, aunque puede no ser exactamente en el ángulo de Brewster ya que se necesita algo de luz reflejada para la interferencia (aunque como el láser no está típicamente perfectamente colimado todavía hay algo de reflexión incluso si está exactamente en el ángulo de Brewster). Por ejemplo, el ángulo de iluminación puede ser sustancialmente el ángulo de Brewster, es decir, puede estar lo suficientemente cerca del ángulo de Brewster como para que la reflectancia de la interfaz para la luz coherente sea inferior al 10 %, 1 % o 0.1 %, o para que la intensidad de la luz reflejada sea mayor que la luz dispersada.

También o en su lugar se puede utilizar un filtro o máscara espacial para aumentar el contraste del patrón de interferencia, en particular cambiando la intensidad de la luz reflejada. El filtro o máscara espacial puede estar situado en un plano focal del microscopio, más particularmente en un plano focal de la luz reflejada y dispersada capturada, por ejemplo, en un plano focal posterior o plano de Fourier del lente objetivo.

En implementaciones, la luz reflejada se desplaza desde el eje óptico del lente objetivo en una dirección opuesta al desplazamiento (desde el eje óptico) de la trayectoria óptica de la luz coherente hasta el lente objetivo. Por lo tanto, el filtro espacial puede estar fuera del eje, por ejemplo, configurado para enmascarar selectivamente una región del plano de Fourier desplazada del eje óptico, y puede ser asimétrico alrededor del eje óptico dejando desenmascarada la luz coherente iluminadora y/o una región en el eje del plano focal posterior. Normalmente, el centro del plano de Fourier sobre/alrededor del eje óptico contiene información importante relacionada con la señal de interferencia deseada, y las implementaciones del método facilitan el filtrado espacial lejos de esta ubicación en una parte menos importante del plano de Fourier. En general, la máscara puede tener una transmitancia baja pero distinta de cero.

En las implementaciones, la máscara espacial reduce la intensidad tanto de la luz reflejada como del ruido y, por lo tanto, puede dejar la relación señal a ruido relativamente sin cambios (ver más adelante para una discusión más detallada). Sin embargo, reducir la intensidad de la luz reflejada puede aumentar el contraste: debido a que la señal es interferométrica, la relación señal a ruido y el contraste están algo desacoplados entre sí.

La técnica iSCAT se basa en la interferencia entre la luz reflejada y la dispersada, y estas se superponen en el detector (dispositivo de imágenes), donde se forma un patrón de interferencia. En el plano focal posterior del objetivo, la luz dispersada se propaga a lo largo del plano focal posterior, pero la luz reflejada se enfoca en una ubicación específica (aunque se propaga a través del detector porque hay una transformada de Fourier entre el plano focal posterior y el detector). En esta ubicación específica en el plano focal posterior del objetivo, una máscara puede atenuar selectivamente la luz reflejada.

Por lo tanto, en algunas implementaciones la máscara (filtro espacial) puede ser pequeña, por ejemplo, correspondiente a un tamaño del punto focal del láser (por ejemplo, ancho total a la mitad del máximo), para reducir la pérdida de información. La máscara puede tener forma de disco. La máscara puede ser parcialmente transmisiva, como se describe más adelante, por ejemplo, bloquear más del 50 %, 75 %, 90 % o 94 % de la luz que incide sobre la máscara, pero menos del 100 %, 99 % o 95 % de la luz, por ejemplo, bloqueando alrededor del 99 % de la luz.

En algunas implementaciones, la máscara puede proporcionarse sobre un soporte sustancialmente transparente. Si no se puede acceder al plano focal posterior, la máscara aún puede estar ubicada en un plano de enfoque del láser, que puede estar un poco desplazado del plano focal posterior, es decir, el láser puede desenfocarse un poco (o el láser puede enfocarse en el plano focal posterior plano focal posterior, pero el filtro está un poco desplazado y con una región de filtrado ligeramente más grande de lo que tendría de otro modo).

Cuando se utiliza para obtener imágenes de una partícula en solución (en lugar de limitarse a una superficie de vidrio), el método puede comprender además limitar el movimiento de la partícula en una dirección a lo largo del eje óptico,

es decir, la dirección z, a menos de una distancia 2^ÁTÁ’^2'o^4’ donde A donde es la longitud de onda de la luz coherente (en la solución). Esto se puede hacer, por ejemplo, dimensionando adecuadamente la cámara o canal, por ejemplo, A

proporcionando un par de límites opuestos espaciados por esta distancia en la dirección z. Un rango de<2>representa un rango de contraste máximo a contraste cero en la imagen de interferencia. Restringir de esta manera el movimiento A

de las partículas, por ejemplo, hacia dentro de 4’, facilita el seguimiento de la partícula porque se inhibe que la partícula desaparezca de la vista (y reaparezca en otro lugar). Sin embargo, no es esencial que el movimiento en la dirección z A A

se limite a A o 4, para obtener algún beneficio. Como se describió anteriormente, el método utiliza dispersión y no, por ejemplo, fluorescencia. Por lo tanto, la partícula puede ser una partícula no fluorescente. La partícula puede estar libre de etiquetas. En general, el método se utiliza fuera de resonancia, es decir, lejos de un pico/borde de absorción de la partícula. Sin embargo, esto no es esencial y, en principio, se puede utilizar luz cercana a un pico/borde de absorción.

En un aspecto relacionado se describe un microscopio óptico de dispersión interferométrica. En implementaciones, el microscopio comprende una región de detección de partículas, por ejemplo, que comprende una cámara o canal o una gota sobre una superficie, teniendo la región de detección de partículas un límite definido por una interfaz, una fuente de luz coherente tal como un láser, y un lente objetivo para dirigir la luz coherente para iluminar una partícula en la región de detección de la partícula de manera que la luz se refleja desde la interfaz y se dispersa por la partícula. El lente objetivo tiene un eje óptico y está configurado para capturar la luz reflejada y la luz dispersada. El microscopio comprende además un dispositivo de formación de imágenes configurado para visualizar la interferencia entre la luz reflejada y la luz dispersada. La luz coherente que ilumina la partícula forma un ángulo oblicuo con respecto a la interfaz. De este modo, una trayectoria óptica de la luz coherente hacia el lente objetivo está desplazada del eje óptico del lente objetivo. En implementaciones, la luz coherente puede proporcionarse al lente objetivo en una dirección paralela y desviada del eje óptico.

En algunas implementaciones, la fuente de luz coherente está polarizada linealmente como se describió anteriormente.

Así, la luz coherente que ilumina la partícula puede estar parcial o completamente polarizada p con respecto a un plano de incidencia de la luz coherente sobre la interfaz.

En algunas implementaciones, la fuente de luz coherente está polarizada lineal o circularmente, y se proporciona un analizador con una polarización ortogonal en una trayectoria óptica entre la partícula y el dispositivo de formación de imágenes. Esto puede proporcionar una señal que depende de una asimetría de forma de la partícula, pero con una relación señal a ruido reducida.

Una trayectoria óptica entre el lente objetivo y la fuente de luz coherente puede incluir un divisor de haz para separar la luz reflejada y dispersada devuelta de la luz de iluminación incidente, pero esto no es esencial ya que en las implementaciones estas dos trayectorias de luz están en diferentes posiciones espaciales con respecto a el eje óptico. El dispositivo de imágenes puede comprender un sensor de imágenes 1D o 2D, por ejemplo, un sensor EMCCD (dispositivo acoplado de carga multiplicadora de electrones) o una cámara CMOS rápida, y un elemento óptico como un lente o espejo para enfocar la luz devuelta al sensor.

En algunas implementaciones, el microscopio/método está configurado para procesar la interferencia de la imagen para determinar una diferencia entre la interferencia de la imagen en dos momentos diferentes, por ejemplo, usando un procesador bajo control de programa almacenado. Por ejemplo, se puede determinar un cuadro de diferencia entre dos cuadros de imagen de interferencia, o grupos de cuadros, capturados por el dispositivo de imágenes. El fotograma de diferencia puede ser transformado de Fourier, por ejemplo, por el procesador, para determinar una imagen de Fourier. Esto puede luego procesarse para caracterizar la partícula o una solución de las partículas, por ejemplo, seleccionando una porción de la imagen de Fourier dentro de un círculo de dispersión esperado. El círculo de dispersión esperado puede comprender una región de la imagen de Fourier dentro de la cual está/debería estar confinada la interferencia entre la luz reflejada y la luz dispersada de la(s) partícula(s). La región de la imagen de Fourier dentro del círculo de dispersión esperado puede procesarse, por ejemplo, para determinar un nivel o medida de dispersión en esta región, para caracterizar la(s) partícula(s) o una solución de las partículas.

Otras características del microscopio pueden corresponder a las del método descrito anteriormente, es decir, el microscopio puede incluir sistemas/dispositivos para implementar estas características.

Dibujos

Estos y otros aspectos del sistema se describirán ahora con mayor detalle únicamente a modo de ejemplo, con referencia a las figuras adjuntas, en las que:

La Figura 1 muestra un diagrama esquemático de un microscopio óptico de dispersión interferométrica (iSCAT).

Las Figuras 2a y 2b ilustran, respectivamente, técnicas de iluminación normal e iluminación de ángulo oblicuo para el microscopio óptico iSCAT de la Figura 1, y la Figura 2c muestra una modificación del microscopio de la Figura 1 para implementar iluminación de ángulo oblicuo de acuerdo con una realización de la invención.

Las Figuras 3a y 3b ilustran, respectivamente, imágenes capturadas utilizando las técnicas de iluminación de incidencia normal y oblicua de la Figura 2.

La Figura 4 muestra, esquemáticamente, detalles de la geometría óptica de otro ejemplo de un microscopio iSCAT con iluminación de ángulo oblicuo.

La Figura 5 muestra un gráfico de contraste e intensidad de la señal iSCAT vista por la cámara frente al ángulo de incidencia.

La Figura 6 muestra imágenes de interferencia de ejemplo de una partícula fuertemente dispersada (fila superior) y los patrones de interferencia predichos correspondientes (fila inferior).

La Figura 7 muestra transformadas de Fourier de imágenes de interferencia capturadas en diferentes ángulos de incidencia en un microscopio iSCAT.

La Figura 8 muestra la geometría óptica relacionada con la generación de hologramas.

En las figuras, los elementos similares se indican con números de referencia similares.

Descripción

Con referencia a la Figura 1, ésta muestra un diagrama esquemático de un microscopio óptico 100 de dispersión interferométrica (iSCAT). El microscopio comprende un láser 102 de onda continua que proporciona un haz 104 de luz coherente a un elemento de enfoque, el lente 108, que enfoca el haz en el plano focal posterior 110 de un lente objetivo de microscopio 112. En este ejemplo, el láser está en el visible, a 445 nm, y el espejo 106 dobla su trayectoria óptica hacia el lente 108. El láser puede tener una longitud de coherencia superior a 50 pm o 100 pm y/o menos de 100 mm o 10 mm.

El lente objetivo 112, que puede ser un objetivo de inmersión en aceite, puede ajustarse para proporcionar una iluminación generalmente uniforme en una región de detección 114. En el ejemplo de la Figura 1, la región de detección 114 está definida por una cámara o canal 116 con superficies superior e inferior 116a,b, fabricados, por ejemplo, de vidrio o polímero. La cámara/canal 116 puede contener una solución 118, tal como una solución acuosa (es decir, agua), que contiene una o más partículas 120 de las que se van a formar imágenes. En algunas otras disposiciones, las partículas que van a ser imágenes pueden inmovilizarse sobre una superficie de vidrio, tal como la superficie de un cubreobjetos. En algunas implementaciones, la distancia entre las superficies 116a,b puede ser del orden de la mitad de la longitud de onda de la luz coherente en la solución, para mantener una vista de la partícula m representada.

La iluminación se refleja desde una interfaz reflectante 122, por ejemplo, entre la superficie inferior 116a de la cámara/canal 116 y la solución 118. La iluminación también es dispersada por la(s) partícula(s) 120. Tanto la luz reflejada como la luz dispersada son capturadas por el lente objetivo 112, devuelta a lo largo de la trayectoria óptica de la iluminación, y se dirige a una trayectoria separada 124 mediante un divisor de haz 126. Luego se obtienen imágenes de la luz reflejada y la luz dispersada. Por ejemplo, la luz reflejada y la luz dispersada se enfocan sobre un sensor de imagen 130 mediante una óptica de imagen tal como un lente 128. El sensor de imagen (cámara) puede ser, por ejemplo, un sensor de imagen CMOS o un sensor de imagen EMCCD; puede tener una velocidad de cuadros suficiente para capturar y rastrear el movimiento de una partícula fotografiada.

La Figura 2a muestra detalles de una técnica de iluminación de incidencia normal para el microscopio óptico iSCAT de la Figura 1. El haz 104 de luz coherente puede estar no polarizado; es decir, puede comprender luz de dos polarizaciones lineales ortogonales 202a,b o, más generalmente, puede tener polarización elíptica. En el ejemplo particular ilustrado, la solución fluye a lo largo del canal 116, que tiene una altura (dirección z) de aproximadamente 450 nm y una anchura de aproximadamente 5 pm.

La Figura 2b muestra detalles de una técnica de iluminación de ángulo oblicuo para el microscopio óptico iSCAT de la Figura 1. Un eje óptico del lente objetivo 112 se encuentra a lo largo de la dirección de la línea 200, que representa la luz reflejada y la luz dispersada capturadas por el objetivo. El haz 104 de luz coherente que ilumina la región de detección 114 está fuera de eje, es decir, está desplazado lejos del eje óptico 200; un eje del haz 104 puede ser paralelo al eje óptico 200. Así, el haz 104 define un ángulo 0i con respecto al eje óptico 200 en el punto de salida del objetivo, que forma un ángulo oblicuo con respecto a la interfaz reflectante 122. (La dirección de este haz se modifica posteriormente por refracción, pero la iluminación permanece, no obstante, en un ángulo oblicuo con respecto a la interfaz 122).

Mediante la(s) partícula(s) fotografiada(s) que iluminan en un ángulo oblicuo, aumenta el nivel de señal, es decir, la interferencia entre la luz dispersada y reflejada, en comparación con el nivel de fondo de la luz reflejada. La proporción de estos componentes se puede ajustar ajustando el ángulo oblicuo, si el ángulo 0i es demasiado grande, se reduce la intensidad de la luz dispersada a lo largo de la dirección; si es demasiado pequeña, la luz reflejada reduce la relación señal a ruido. El ángulo óptimo se puede encontrar mediante experimento; En general, puede depender del ruido de fondo de la cámara.

En algunas implementaciones, la iluminación oblicua puede estar parcial o completamente polarizada linealmente, en particular polarizada p 204, para reducir el nivel de luz reflejada desde la interfaz 122. En el ángulo de Brewster, el nivel de luz reflejada desde la interfaz 122 se reduce sustancialmente a cero (en realidad se reduce mucho pero no a cero porque el láser no está perfectamente colimado). En la práctica, el ángulo oblicuo puede alejarse ligeramente del ángulo de Brewster para proporcionar algo de luz reflejada para generar la interferencia. Controlar la polarización de la iluminación es ventajoso ya que permite desacoplar en cierta medida la reducción de la intensidad de la luz reflejada de la reducción de la intensidad de la luz dispersa capturada a lo largo de la dirección 200.

La Figura 2c muestra un ejemplo de implementación de la técnica de iluminación de ángulo oblicuo de la Figura 2b en el contexto del microscopio de la Figura 1.

Así, la Figura 2c muestra un diagrama esquemático de un microscopio óptico iSCAT 200 que incluye un láser 202 para generar un haz 204 de luz coherente. El haz 204 se enfoca, por ejemplo, mediante un lente 206, por ejemplo, sobre un plano focal posterior del lente objetivo 112. Un reflector, espejo diagonal 210, dirige el haz 204 de luz coherente fuera del eje hacia el lente objetivo 112, es decir, el haz 204 se desplaza lejos de un eje óptico del lente objetivo 112, dirección 200 en la Figura 2b. El haz fuera de eje 204 es transformado por el lente objetivo 112 en un haz colimado 204a que ilumina la interfaz reflectante 122 en un ángulo oblicuo.

Las Figuras 3a y 3b ilustran, respectivamente, imágenes capturadas usando las técnicas de iluminación de incidencia normal y oblicua de la Figura 2. Puede verse que la Figura 3b, capturada usando iluminación oblicua, muestra un contraste de interferencia mucho mayor que la Figura 3a y, en consecuencia, mucho más detalle de la imagen. En la práctica, para detectar una partícula como una sola molécula, se utiliza una detección diferencial, por ejemplo, se puede emplear la técnica de sustracción de fondo.

Como se describe con más detalle más adelante, una imagen de interferencia capturada de una partícula puede denominarse holograma ya que lo que se captura es un patrón de interferencia. Sin embargo, el holograma suele tener una región central brillante (u oscura) (de acuerdo con la fase), que da la apariencia de una partícula.

En implementaciones, el contraste de interferencia puede referirse, por ejemplo, a una relación de intensidades de luz entre regiones brillantes y oscuras de un patrón de interferencia (del microscopio iSCAT), o a una relación de valores de brillo de imagen entre regiones brillantes y oscuras de una imagen de interferencia (del microscopio iSCAT).

A continuación, se describen más detalles de algunas implementaciones de ejemplo.

Implementaciones de ejemplo

En implementaciones de dispersión interferométrica (iSCAT), una onda receptora de alta intensidad interfirió con una señal dispersa, lo que permite que el sistema funcione en un régimen limitado por ruido de disparo. La dependencia de la señal del diámetro de la partícula se expresa en tercera potencia; Se puede utilizar una etiqueta de dispersión, normalmente una nanopartícula de oro, para aumentar la sección transversal de dispersión. iSCAT se puede utilizar para detectar partículas en solución, por ejemplo, en agua, lo que permite estimar su coeficiente de difusión. Sin embargo, en esta aplicación el tiempo de integración es limitado ya que la partícula no debe difundirse más allá del ancho de la función de dispersión del punto, aunque los ángulos de incidencia subcríticos pueden disminuir la dispersión de fondo y mejorar la relación señal a ruido.

La dispersión interferométrica (iSCAT) funciona recogiendo tanto la luz dispersada como la luz reflejada en el detector. Como ambos tienen la misma longitud de onda, interferirán. La intensidad recogida (Pcol) es el resultado del campo eléctrico reflejado (Er) y del campo eléctrico disperso (Es):

donde la potencia incidente es Pinc y la potencia reflejada es Pref = Pinc |r|2 con r el coeficiente de reflexión del campo eléctrico. La potencia de interferencia es P¡nt = Pinc2|r| |s| cos O donde s es el coeficiente de dispersión y O es la diferencia de fase. El coeficiente de reflexión (r) viene dado por las ecuaciones de Fresnel (ver más adelante) y la sección transversal de dispersión a= |s|2 está dada por la Dispersión de Rayleigh (ver más adelante). Generalmente |s| « |r|, por lo que el término |s|2 final es insignificante. El término reflejado Pref se puede eliminar si cambia más lentamente que el término que interfiere P¡nt. Este es el caso de una muestra en difusión o de eventos de unión, por ejemplo. El contraste depende de la reflectividad:

pero, sorprendentemente, la relación señal a ruido no lo es: suponiendo que el sistema esté limitado por el ruidoPruidoKjPcot ~7pref■ El ruido viene dado por la relación señal a ruido (SNR) es:

que es independiente de la intensidad reflejada. El coeficiente de dispersión se puede mejorar disminuyendo la longitud de onda del láser; de lo contrario, parece que la única forma de mejorar la relación señal a ruido es aumentar la potencia del láser o utilizar tiempos de integración más largos, aunque los tiempos de integración más largos están limitados por la deriva.

Iluminación oblicua

La Figura 4 muestra, esquemáticamente, detalles de la geometría óptica de un ejemplo adicional de un microscopio iSCAT 400 como se describe en el presente documento.

Como anteriormente, un haz 204 de luz coherente, por ejemplo, desde un láser 202, se refleja en un espejo semitransparente o divisor de haz 410, en este ejemplo desplazado lejos del plano focal posterior 110 del lente objetivo 112. El haz 204 se enfoca en un plano focal posterior del lente objetivo 112, colimado por el lente objetivo 112 y, en este ejemplo, pasa a través de un aceite de índice de refracción adaptado 412 a la interfaz reflectante 122. El haz 204 está desplazado del eje óptico 200, y este sale del lente objetivo 112 como un haz colimado 204a en un ángulo oblicuo a la interfaz reflectante vidrio-agua 122.

En este ejemplo, la interfaz reflectante 122 comprende una interfaz vidrio-agua formada por la interfaz entre una pared de vidrio 414 de una cámara o canal y una solución acuosa en la región 416. A medida que el haz 204 atraviesa esta trayectoria, pequeñas cantidades de luz se reflejan en otras interfaces en la trayectoria, tales como interfaces en el lente objetivo 112; el aceite con índice coincidente 412, coincidía, por ejemplo, con un índice de refracción del elemento final del objetivo, reduce el número de interfaces que la luz iluminadora ve en la trayectoria. La intensidad de los reflejos del aceite de vidrio es casi nula porque el aceite tiene un índice coincidente.

En la interfaz vidrio-agua 122 la luz iluminadora se separa en componentes transmitidos y reflejados. La iluminación transmitida alcanza una o más partículas 120 en la solución acuosa que dispersan la iluminación. La luz dispersada se dispersa en muchas direcciones, por ejemplo, aproximadamente sobre una esfera (aunque esto depende de factores como la forma y configuración de la partícula dispersante y la polarización de la luz). Parte de la luz dispersada es recogida por el lente objetivo 112 y proporciona un haz de luz dispersada 430 que en implementaciones se extiende a lo ancho de la superficie trasera del objetivo y viaja en la dirección 200 a lo largo del eje óptico.

La luz reflejada regresa a lo largo de la trayectoria 418, en un ángulo de reflexión que coincide con el ángulo de incidencia, al lente objetivo 112. El lente objetivo 112 que enfoca la luz reflejada en el plano focal posterior 110 en una región desplazada lejos del eje óptico 200, en el lado opuesto del eje al haz de iluminación 204. Esta luz reflejada interfiere con la luz dispersada en el detector, por ejemplo, cámara 130, generando franjas de interferencia.

En algunas implementaciones, se puede ubicar un filtro espacial 422 en o cerca del plano focal posterior 110 del lente objetivo 112 para mejorar aún más el contraste. Por ejemplo, el 422 espacial puede comprender un disco ubicado en el foco del haz reflejado, con una extensión correspondiente a una extensión del punto focal del haz reflejado o mayor. El filtro espacial puede comprender una máscara atenuadora de luz 422 sobre un soporte de máscara sustancialmente transparente 420, por ejemplo, un soporte de máscara que tiene forma de medio disco (en el lado del eje óptico que incluye el haz reflejado). Más adelante se describe un método para determinar un grado de transmisividad de la máscara atenuadora de luz 422.

Reflexiones espurias e interferenciales

El análisis anterior supone que la reflexión interfiere con la intensidad de dispersión. Esto sólo es cierto si la diferencia de trayectoria es menor que la longitud de coherencia del láser (ver más adelante), normalmente cientos de micrómetros (para diodos láser). Sin embargo, la iluminación láser se refleja desde la parte posterior del objetivo y en cada interfaz que cruza. Incluso los objetivos con revestimientos antirreflectantes no tienen una transmitancia del 100 %, en cuyo caso la intensidad recopilada se puede reescribir con la intensidad reflejada separada en componentes de reflexión que interfieren y espurios:

donde el campo eléctrico de reflexión espuria Ers no interfiere con la señal dispersada o la señal reflejada desde la interfaz; el campo eléctrico de reflexión que interfiere es E„. Por lo tanto, la relación señal a ruido (SNR) anterior se reduce si |rs|2 >> |n|2:

En los casos considerados aquí sólo la reflexión en la interfaz reflectante 122, por ejemplo, una interfaz vidrio-agua, será un reflejo de interferencia. Por lo tanto, se puede utilizar la ley de Fresnel (ver más adelante) para distinguir los dos tipos de reflexión.

La Figura 5 muestra un gráfico de contraste e intensidad de la señal iSCAT vista por la cámara frente al ángulo de incidencia. La intensidad medida (puntos) comprende la intensidad reflejada, equipada con una línea y un componente debido a reflexiones espurias cerca de la normal (0 grados), donde los puntos divergen de la línea. En ángulos mayores que aquel en el que se encuentran los puntos (en este ejemplo, alrededor de 10 grados), la línea el efecto de las reflexiones espurias esencialmente llega a cero (observando la escala logarítmica). Se analizan dos regiones de la imagen, una región con un fuerte dispersor (control positivo, cruces superiores) y una región sin dispersores aparentes (control negativo, cruces inferiores). Sin reflexiones espurias, la distancia en el espacio logarítmico entre la dispersión y el fondo debe ser constante y el valor debe depender de la intensidad reflejada (la señal, y por lo tanto también la relación señal a ruido, se relaciona con la diferencia entre los cruces superiores e inferiores). Por debajo de unos 10 grados, este no es el caso y la relación señal a ruido llega a cero en ángulos pequeños (es decir, los cruces superior e inferior convergen).

Por lo tanto, la línea representa la intensidad ajustada utilizando las ecuaciones de Fresnel. Los puntos, que son las intensidades medidas, siguen esta línea para ángulos elevados, pero se desvían del ajuste en incidencias normales debido a reflexiones espurias. El efecto se puede ver en el contraste de una región con partículas fuertemente dispersadas y una región de fondo: tanto el ruido como la intensidad dispersada son proporcionales a |r| y ambos contrastes siguen la forma de la línea, pero no en incidencia normal donde el contraste es enmascarado por el reflejo espurio.

Deformación de la imagen

La imagen se forma por la interferencia entre la luz dispersada y el reflejo interfiriente. La forma del patrón de interferencia se puede calcular a partir de la longitud de onda y el ángulo del láser (ver más adelante).

La Figura 6 muestra ejemplos de imágenes de interferencia de una partícula fuertemente dispersada (fila superior) y los correspondientes patrones de interferencia predichos, es decir, hologramas (fila inferior) para diferentes ángulos de incidencia del haz de iluminación. En incidencia normal, la fuerte reflexión espuria oculta la señal, pero en ángulos de incidencia más altos, la reflexión espuria no está presente pero la imagen se distorsiona progresivamente a medida que el patrón circular se vuelve más elíptico. Para minimizar la distorsión, se puede elegir que el ángulo de incidencia esté en el ángulo donde se manifiesta la reflexión espuria o justo por encima de él. Esto puede definirse como un ángulo en el que, en el dispositivo de formación de imágenes, la intensidad de la luz reflejada es mayor que la intensidad de la luz reflejada desde una superficie posterior del lente objetivo. Para minimizar la distorsión, el ángulo no puede ser mayor que este ángulo más, por ejemplo, 10 grados.

Mayor contraste

Disminuir la intensidad reflejada aumentará el contraste, C, como se muestra en la ecuación anterior para C. Sorprendentemente, no cambia la relación señal a ruido, SNR, como se muestra en la ecuación anterior para SNR. Mejorar el contraste es útil ya que disminuye la presión sobre el rango dinámico de la cámara y puede ayudar al usuario a vislumbrar la señal dispersa mientras mira un vídeo sin procesar, por ejemplo, mientras enfoca. Cuando se utiliza iluminación oblicua, se pueden emplear dos técnicas para lograrlo. En primer lugar, se puede utilizar el ángulo de incidencia de Brewster para disminuir la intensidad reflejada, aunque esto normalmente requiere una polarización y un ángulo fijos. Además, o en su lugar, se puede ubicar un filtro espacial en el plano focal posterior, como se muestra en la Figura 4. Esto no es posible con incidencia normal ya que tanto el láser incidente como el reflejado pasan por el mismo punto, pero con incidencia oblicua solo es posible filtrar la intensidad reflejada ya que la luz incidente y reflejada están separadas espacialmente.

Plano de Fourier

Un lente objetivo crea una transformada de Fourier del plano focal en el plano focal posterior. El plano de Fourier se puede recrear a partir de la imagen tomando una transformada de Fourier de la imagen de interferencia, es decir, un holograma, por ejemplo, una transformada rápida de Fourier (FFT) como se describe más adelante.

La Figura 7 muestra transformadas rápidas de Fourier de imágenes de interferencia (hologramas) capturadas en diferentes ángulos de incidencia en un microscopio iSCAT. Las imágenes son de una partícula de 100 nm (imágenes izquierda y central) y una partícula de 40 nm (imágenes a la derecha). Como la información de fase se pierde cuando la luz llega a la cámara, el plano de Fourier reconstruido muestra un patrón simétrico. La distancia entre los centros de los círculos en las imágenes del medio y de la derecha es proporcional a la traslación del láser de iluminación desde el eje óptico (más tarde, AX).

En la Figura 7, el círculo discontinuo indica el límite de difracción de Abbe (impuesto por la apertura numérica). La línea continua indica el círculo de dispersión esperado, calculado como se describe más adelante, denominado aquí círculo de Fourier. La cruz indica la posición del láser reflejado. El tamaño del punto láser reflejado (que se ve más fácilmente en la imagen inferior derecha) se puede reducir enfocando con precisión el lente 128 de modo que la longitud focal coincida con la distancia desde el lente hasta el plano focal posterior del objetivo; luego puede filtrarse de la transformada de Fourier.

En incidencia normal (imágenes de la izquierda), el láser reflejado domina tanto las imágenes de fotograma único como las de partículas diferentes, mientras que apenas es visible en ángulos más altos: al aumentar el ángulo de incidencia (imágenes del medio y de la derecha), esencialmente solo se ve la reflexión que interfiere. En el ejemplo particular que se muestra, la señal de dispersión de la partícula de 100 nm es más fuerte que el ruido de la cámara, mientras que la de la partícula de 40 nm está oculta en el ruido.

Como la señal dispersada está contenida en el círculo de Fourier, el resto de la imagen (fuera del círculo de dispersión esperado) se puede filtrar, reduciendo en gran medida el ruido del disparo. La mancha residual del reflejo del láser se puede reducir si se utiliza un filtro espacial como se describió anteriormente.

En la Figura 7, la fila superior muestra la FFT de un solo cuadro y la fila inferior muestra la FFT de una diferencia entre dos, por ejemplo, fotogramas consecutivos (un fotograma diferencial); en este ejemplo, la velocidad de fotogramas se ajusta a 125 FPS sumando fotogramas consecutivos. Por lo tanto, la fila inferior muestra solo elementos dinámicos de las imágenes capturadas, por ejemplo. Algunas partes capturan imágenes de interferencia relacionadas con partículas en movimiento.

La señal dentro del círculo de Fourier, por ejemplo, la amplitud o intensidad integrada sobre el área del círculo de Fourier, en la FFT de un fotograma diferencial, se puede utilizar como una medida (unidimensional) de la cantidad de dispersión en un fotograma. Esto puede usarse como medida de la concentración y/o tamaño de las partículas en una muestra de la solución que contiene las partículas; la medida puede calibrarse para determinar un valor para la concentración y/o el tamaño de las partículas.

Ejemplo de configuración del aparato

Haciendo referencia nuevamente a la Figura 4, en una implementación de ejemplo, un láser se refleja en un espejo semitransparente y se enfoca en el plano focal posterior de un objetivo. El láser o un elemento óptico para guiar el láser se puede montar en una fase para permitir una traslación del punto focal del láser en el plano focal posterior mientras se mantiene el láser paralelo al eje óptico del objetivo. Se puede utilizar un objetivo de inmersión en aceite para evitar la creación de interfaces entre el objetivo y el vidrio (por ejemplo, cubreobjetos). Un lente 128, por ejemplo, un lente de tubo enfoca la imagen en una cámara 130.

El láser puede enfocarse en el plano focal posterior, de modo que salga del objetivo como un haz colimado. La ubicación del plano focal posterior se puede encontrar minimizando el tamaño de un punto en una pantalla distante (por ejemplo, una pared o un techo) mientras se cambia la posición del punto focal. La intensidad reflejada también se enfocará entonces en el plano focal posterior, y se puede encontrar una posición óptima del lente del tubo tomando imágenes del plano focal posterior y minimizando el punto reflejado. Esto se puede hacer usando otro lente de tubo con la mitad del lente focal para obtener imágenes del plano de Fourier directamente o aplicando una transformada rápida de Fourier a la imagen grabada.

El láser debe estar paralelo al eje óptico del objetivo. Se puede aplicar un desplazamiento entre el eje óptico y el eje del láser para cambiar el ángulo de incidencia de la iluminación. Se puede dibujar un gráfico del tipo mostrado en la Figura 5, por ejemplo, registrando la intensidad de la señal reflejada y ajustándola a la ecuación de Fresnel. De este modo se puede identificar el rango de ángulos en los que es visible una reflexión espuria y seleccionar en consecuencia un ángulo de iluminación oblicuo para el microscopio iSCAT, es decir, un ángulo de incidencia para el haz de iluminación.

En algunas implementaciones, el ángulo de incidencia (90 grados respecto al ángulo oblicuo de iluminación de la interfaz reflectante) puede ser suficientemente grande para eliminar sustancialmente la reflexión espuria pero no significativamente mayor que esto para reducir la distorsión de la imagen de interferencia - por ejemplo, en el rango 1 30, 3-20 o 5-15 grados, por ejemplo, alrededor de 10 grados en el ejemplo de la Figura 5.

Se puede extraer una parte dinámica de la imagen tomando una diferencia entre dos fotogramas de imagen de interferencia o entre dos conjuntos de fotogramas, por ejemplo, grupos de fotogramas promediados. Como se describió anteriormente, el círculo de Fourier se puede utilizar para eliminar una gran parte del ruido del disparo de la cámara que se encuentra fuera del círculo (en el ejemplo de la Figura 7, la región dentro de la línea continua se retiene junto con su contraparte simétrica). El ruido creado por la reflexión del láser se puede eliminar ya que está bien localizado en el plano de Fourier. Tenga en cuenta que, si el lente del tubo no se coloca correctamente de modo que la distancia desde el objetivo al lente del tubo sea igual a la distancia focal del lente del tubo, la ubicación del ruido del reflejo quedará borrosa en el plano de Fourier.

La máscara espacial, si se utiliza, idealmente debería ubicarse en el plano focal posterior. El láser reflejado debe pasar a través de una región de baja transmitancia mientras que el resto del plano focal posterior debe ser lo más transparente posible.

En términos generales, el objetivo es tener, al mismo tiempo, una gran relación señal a ruido (SNR) y un gran contraste del patrón de interferencia. Para aumentar el contraste se debe reducir la intensidad reflejada tanto como sea posible. En principio, esto no afecta la SNR si el ruido se limita al ruido. Sin embargo, a medida que se reduce la intensidad, eventualmente dominan otras fuentes de ruido y la SNR comienza a disminuir. Por lo tanto, la transmitancia de la máscara debe reducirse hasta que comience a hacerse evidente otro ruido de fondo, por ejemplo, hasta que el ruido del disparo esté al mismo nivel o justo por encima del ruido de fondo, por ejemplo, no más de 2x o 10x el ruido de fondo. El ruido de fondo proviene de muchas fuentes, por ejemplo, iluminación parásita, ruido eléctrico en el detector (cámara), etc.

En el patrón de interferencia, si la máscara fuera transparente, el ruido del disparo dominaría el componente de ruido de la señal de interferencia detectada (siempre que la fuente láser sea lo suficientemente brillante). El ruido del disparo escala como n, donde n es el número de fotones. A medida que la transmitancia de la máscara disminuye hay menos fotones, lo que implica un nivel reducido de ruido de disparo. Sin embargo, con muy pocos fotones se hacen evidentes las otras fuentes de ruido. Puede resultar ventajoso reducir la transmisividad de la máscara para bloquear la mayor cantidad posible de luz reflejada mientras se escucha el ruido del disparo sigue siendo dominante. En la práctica, esto puede ser una transmisividad del orden del 10 %, pero esta cifra depende significativamente de los detalles de implementación. Como técnica práctica, se puede disminuir la transmisividad de la máscara hasta que se observe el ruido de fondo, y luego disminuir ligeramente este valor.

Si no se puede acceder al plano focal posterior, la posición focal del enfoque láser se puede ajustar ligeramente de modo que el foco del haz reflejado se ubique en la máscara espacial. Alternativamente, el láser puede enfocarse en el plano focal posterior, pero el filtro se desplaza un poco de éste, teniendo así una región de filtrado ligeramente mayor que la que tendría de otro modo.

Las técnicas descritas pueden mejorar iSCAT eliminando la reflexión espuria que limita la relación señal a ruido. El contraste también se puede mejorar de varias maneras, por ejemplo, utilizando el ángulo de Brewster y/o un filtro espacial en o cerca del plano focal posterior.

Para ayudar a comprender las técnicas, es útil describir algunas de las teorías subyacentes.

Dispersión

La dispersión de Rayleigh describe la dispersión de partículas pequeñas, normalmente mucho más pequeñas que la longitud de onda. La intensidad Is a una distancia X de una partícula con un ángulo de dispersión 0 es proporcional a la intensidad incidente Iq:

donde nm es el índice de refracción del medio circundante, np es el índice de refracción de la partícula,<y>es la longitud de onda de la luz coherente y r es el radio de la partícula. La integración sobre los ángulos da la sección transversal de dispersión a. La asimetría se puede detectar mediante el uso de una disposición de polarización cruzada para detectar cambios en la polarización causados por la asimetría de la forma de la partícula; esta señal es mucho más débil que la intensidad dispersa.

Al enfocar el láser en el plano focal posterior del objetivo, se puede aplicar iluminación oblicua a la muestra. Si las partículas de interés están relativamente lejos de la superficie, la técnica puede funcionar en ángulos subcríticos para obtener cierta intensidad, es decir, una señal de una región interior de un canal o cámara o del interior de una gota en un cubreobjetos. Para un objetivo de inmersión en aceite, la distancia focal del objetivo Fobj se puede calcular a partir del lente focal del lente del tubo Fti y el aumento (Ma) usando:

donde naceite índice de refracción del aceite de inmersión. Luego, el ángulo de incidencia se puede calcular a partir de la distancia de la posición del láser en la apertura posterior (plano focal posterior) desde el eje óptico (AX):

s

donde se puede usar seno en lugar de tangente porque el objetivo se corrige para la condición de seno de Abbe. El ángulo en el agua se puede entonces calcular a partir de la ley de Snell:

La longitud de coherencia es la distancia máxima en la que la luz es coherente consigo misma y depende del ancho espectral de la fuente de luz, por ejemplo, láser. Para ¡SCAT, una longitud de coherencia corta puede ayudar a evitar interferencias de muchas reflexiones. Los diodos láser tienen espectros relativamente amplios, por ejemplo,AX=2 nm; la longitud de coherencia L viene dada por:

y para un diodo láser típico puede ser tan corto como 100 pm. Por lo tanto, un reflejo procedente de una superficie trasera del lente objetivo normalmente no contribuirá a la señal de interferencia.

Las ecuaciones de Fresnel describen el coeficiente reflejado y transmitido de un medio 1 a un medio 2 dependiendo del ángulo de incidencia. Son, para luz polarizada s:

Y para luz p-polarizada:

En el ángulo de Brewster no hay luz reflejada para la polarización p, aunque la luz de un láser real normalmente no está perfectamente colimada ni polarizada, por lo que aún se producirá cierta reflexión.

El lente objetivo transforma ondas circulares en haces colimados y viceversa. Esto es matemáticamente similar a realizar una transformada de Fourier y la imagen en el plano focal posterior de un objetivo es la transformada de Fourier del plano focal.

La Figura 8 muestra la geometría óptica relacionada con la generación de hologramas. Se supone que la región "Vidrio" tiene un índice de reflexión igual al del agua, de modo que se puedan comparar las longitudes relevantes; esto no se aplica si el plano focal está debajo de la interfaz.

Con referencia a la Figura 8, la imagen de interferencia se crea por la diferencia de trayectoria entre la luz reflejada y la dispersada. Se supone que el sistema óptico (por ejemplo, el lente 128) transmite el holograma ampliado a la cámara. La luz dispersada recorre una distancia d0 desde la interfaz vidrio-agua hasta la partícula, y una distancia r desde la partícula hasta el plano focal. La luz reflejada no cruza el plano focal, pero la reflexión parece provenir del plano focal, a una distancia Ar, que es negativa para ángulos pequeños de 9W, donde 0w es el ángulo en el agua. Aquí se supone que la longitud de coherencia es lo suficientemente grande como para que los rayos paralelos tengan la misma fase. La diferencia de trayectoria es A = As- Ar= d0 r - An La geometría da, para la distancia de la trayectoria reflejada:

donde Zf es la distancia del plano focal del objetivo a la interfaz reflectante y z es la distancia de la partícula al plano focal. Luego, para la diferencia de camino disperso:

Por lo tanto, la diferencia de longitud de camino es:

y definiendo d como:

esto se puede reescribir como:

con

Esto define una imagen de interferencia u holograma que tiene una elipse de excentricidad e = |sen 9w| centrada alrededor de (x,y) = (dtan9w, 0). La elipse más interna está centrada alrededor del valor más pequeño posible de A, que corresponde a x= |z| tan 0w. Aquí es donde llegaría la luz si fuera reflejada por la partícula. A partir de la ecuación de Pcol, se encuentra que el holograma normalizado es:

Donde viene dado por la ecuación de dispersión de Rayleigh anterior. La intensidad debe integrarse sobre un píxe:

donde el ángulo sólido del píxel viene dado por:

Las frecuencias espaciales del holograma están lideradas por el término cosO, con En el caso donde z = 0, x, y, y r están vinculados por x = rcos0, y = rsen0.

La transformada de Fourier de:

comprende dos anillos con radio y centro ±sen0wnm/A. Si z £0 las frecuencias estarán ubicadas dentro del círculo.

La apertura numérica (NA) es una propiedad del lente objetivo y describe el ángulo de incidencia máximo 0max en un<medio con índice de refracción n que es aceptado por el objetivo. Está dada por NA = nsen0max y está relacionada con 2NA>

la frecuencia máxima resoluble mediante el límite de difracción de abbe Esto se puede utilizar para

calcular el tamaño de píxel útil (px) como la frecuencia máxima que se puede resolver comol y por lo

tanto, el tamaño de píxel debe ser menor quev r Para detectar el círculo de Fourier descrito anteriormente la apertura numérica debe ser tal <f maxAbbey por lo tantoN

Aplicaciones

Las aplicaciones de los sistemas descritos incluyen localizar y/o rastrear una o más partículas.

Por ejemplo, al ajustar una imagen de interferencia capturada a la ecuación anterior para un holograma elíptico, se puede determinar una profundidad o posición 3D de la partícula a partir de una distancia de una partícula desde el plano focal del lente objetivo y/o desde la interfaz reflectante (distancia z arriba).

En otra aplicación, se puede seguir una partícula en una, dos o tres dimensiones, en cuyo caso la cámara puede ser una cámara de vídeo. Esto puede permitir caracterizar una partícula determinando un coeficiente de difusión para la partícula, que depende de un tamaño efectivo o hidrodinámico de la partícula. El coeficiente de difusión depende del desplazamiento cuadrático medio de una partícula por unidad de tiempo.

En algunas implementaciones, una partícula puede estar confinada en la dirección z, por ejemplo, en un canal de microfluidos. Esto puede ayudar a que las partículas se encuentren con mayor frecuencia en el plano focal del objetivo o atravesándolo, donde la señal es más alta.

Puede usarse procesamiento de imágenes para mejorar la señal, por ejemplo, promediando fotogramas de imágenes de interferencia para determinar un fondo que se resta. Dado que la señal surge de la interferencia, después de dicha resta la señal puede ser positiva o negativa, lo que debe tenerse en cuenta al promediar. Por ejemplo, la señal se puede promediar durante un tiempo menor que el tiempo durante el cual viaja un cuarto de longitud de onda en la dirección z. Cuando se emplea la resta de fondo, una estática, por ejemplo, la partícula unida se puede detectar moviendo el canal/cámara en la que está unida la partícula.

En general, es deseable minimizar las vibraciones, por ejemplo, utilizando una mesa antivibración, ya que éstas mueven los patrones de interferencia y pueden eliminar la señal.

El límite de la cámara o canal que define la interfaz es típicamente un límite interno del canal/cámara, es decir, una interfaz con la solución. En principio, sin embargo, podría tratarse de un límite exterior del canal/cámara. En principio, la interfaz podría ser curva, en cuyo caso la luz coherente iluminaría la partícula en un ángulo oblicuo con respecto a un plano tangente a la interfaz en el punto de iluminación. En principio, la iluminación podría estar cerca o en un borde de absorción de una partícula fotografiada.

Al experto se le ocurrirán muchas alternativas. La invención no se limita a las realizaciones descritas y abarca modificaciones evidentes para los expertos en la técnica que se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método para aumentar el contraste de la señal en microscopía óptica de dispersión interferométrica, el método comprende:

proporcionar una región de detección de partículas (114) que tiene un límite definido por una interfaz (122); iluminar una partícula en la región de detección de partículas (114) con luz coherente usando un lente objetivo (112) de modo que la luz se refleje desde la interfaz (122) y se disperse por la partícula;

capturar la luz reflejada y la luz dispersada usando el lente objetivo (112); y proporcionar la luz reflejada y dispersada capturada a un dispositivo de imágenes (130) para obtener interferencia de imágenes entre la luz reflejada y la luz dispersada;

en el que el lente objetivo (112) tiene un eje óptico, el método comprende, además,

proporcionar luz coherente al lente objetivo (112) desplazada del eje óptico del lente objetivo (112).

de modo que un ángulo medio de incidencia de la luz coherente que ilumina la partícula forma un ángulo oblicuo con respecto a la interfaz (122).

2. Un método como se reivindicó en la reivindicación 1, que comprende además polarizar linealmente la luz coherente que ilumina la partícula de manera que la luz coherente que ilumina la partícula esté parcial o completamente polarizada p con respecto a un plano de incidencia de la luz coherente sobre la interfaz (122).

3. Un método como se reivindicó en la reivindicación 1 o 2, en el que el ángulo oblicuo define sustancialmente el ángulo de Brewster para la luz coherente en la interfaz (122).

4. Un método como se reivindicó en la reivindicación 1, 2 o 3, que comprende además ajustar el ángulo oblicuo para maximizar la relación señal a ruido de la interferencia entre la luz reflejada y la luz dispersada.

5. Un método como se reivindicó en una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 que comprende proporcionar la partícula en solución (118) y usar una cámara o canal (116) con un par de límites opuestos configurados para restringir el- A . A. -movimiento de la partícula en una dirección a lo largo del eje óptico a una distancia menor que 2 o 2, donde A es la longitud de onda de la luz coherente.

6. Un método como se reivindicó en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la partícula comprende una molécula biológica en solución acuosa.

7. Un método como se reivindicó en cualquier reivindicación anterior, que comprende además procesar la interferencia reflejada para determinar una diferencia entre la interferencia reflejada en dos momentos diferentes, y Fourier transforma la diferencia para caracterizar la partícula o una solución de las partículas.

8. Un microscopio óptico de dispersión interferométrica, el microscopio comprende:

una región de detección de partículas (114) que tiene un límite definido por una interfaz (122);

una fuente (202) de luz coherente;

un lente objetivo (112) para dirigir la luz coherente para iluminar una partícula en la región de detección de partículas (114) de manera que la luz se refleje desde la interfaz (122) y se disperse por la partícula;

en el que el lente objetivo (112) tiene un eje óptico y está configurada para capturar la luz reflejada y la luz dispersada; y

un dispositivo de formación de imágenes (130) configurado para visualizar la interferencia entre la luz reflejada y la luz dispersada; y

en el que una trayectoria óptica de la luz coherente hacia el lente objetivo (112) está desplazada del eje óptico del lente objetivo (112) de manera que un ángulo de incidencia promedio de la luz coherente que ilumina la partícula forma un ángulo oblicuo con respecto a la interfaz.

9. Un microscopio como se reivindicó en la reivindicación 8, en el que la fuente de luz coherente está polarizada linealmente de manera que la luz coherente que ilumina la partícula está parcial o completamente polarizada p con respecto a un plano de incidencia de la luz coherente sobre la interfaz (122).

10. Un método o microscopio como se reivindicó en cualquier reivindicación anterior, en el que la luz coherente que ilumina la partícula en un ángulo oblicuo comprende un haz colimado de luz coherente, y en el que la luz coherente proporcionada al lente objetivo (112) se enfoca en un plano focal posterior (110) del lente objetivo (112).

11. Un método o microscopio como se reivindicó en cualquier reivindicación anterior, en el que un ángulo de incidencia de la luz coherente en la interfaz (122) está entre i) un valor de ángulo en el que, en el dispositivo de formación de imágenes (130), una intensidad de la luz reflejada es mayor que la intensidad de la luz reflejada desde una superficie posterior del lente objetivo (112), y ii) el valor del ángulo más 10 grados.

12. Un método o microscopio como se reivindicó en cualquier reivindicación anterior, que comprende además un filtro espacial fuera de eje en o adyacente a un plano de Fourier del lente objetivo (112) configurado para enmascarar selectivamente una región del plano de Fourier desplazada del eje óptico en una dirección opuesta al desplazamiento desde el eje óptico de la trayectoria óptica de la luz coherente hasta el lente objetivo (112).

13. Un método o microscopio como se reivindicó en cualquier reivindicación anterior, en el que una máscara de filtro espacial está situada en o adyacente a un plano focal posterior (110) del lente objetivo (112) o en un plano focal de la luz coherente, y está configurada para enmascarar una región ubicada en el foco de una reflexión de la luz coherente desde la interfaz (122) y/o en la que la luz coherente está polarizada, y se proporciona un analizador con una polarización ortogonal en una trayectoria óptica entre la partícula y el dispositivo de obtención de imágenes (130).

14. Un microscopio como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, que comprende además un procesador para procesar la interferencia de la imagen para determinar una diferencia entre la interferencia de la imagen en dos momentos diferentes, y transformar la diferencia de Fourier para caracterizar la partícula o una solución de las partículas.

15. Un método o microscopio como se reivindicó en cualquier reivindicación anterior, en el que una superficie trasera del lente objetivo (112) está curvada y/o en el que la región de detección de partículas comprende una cámara o canal (116).