ES2972035T3 - Biomarcadores para respondedores a la AIT - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a proteínas marcadoras o biomarcadores para su uso en la identificación de pacientes alérgicos y para su uso en la identificación de personas que responden a la inmunoterapia con alérgenos (AIT). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Biomarcadores para respondedores a la AIT

La invención se refiere al uso de proteínas marcadoras o biomarcadores en la identificación de pacientes con alergia al polen de gramíneas y/o abedul que son respondedores a la inmunoterapia con alérgenos (AIT).

Antecedentes de la invención

Las alergias tipo 1 tienen importancia mundial. Hasta el 20% de la población de los países industrializados padece enfermedades tales como rinitis alérgica, conjuntivitis o asma bronquial.

Estas alergias son provocadas por fuentes de diverso origen, tal como árboles y gramíneas (polen), hongos (esporas), ácaros (excrementos), gatos o perros. Las fuentes de alérgenos se liberan directamente al aire (polen, esporas) o pueden llegar al aire adheridas a partículas de hollín de diésel (polen) o al polvo doméstico (excrementos de ácaros, partículas de piel, pelo). Dado que las sustancias que provocan alergias se encuentran en el aire, también se utiliza el término "aeroalérgenos".

Las sustancias que provocan alergia de tipo 1 son proteínas, glicoproteínas o polipéptidos. Después de su absorción a través de las membranas de la mucosa, estos alérgenos reaccionan con las moléculas de IgE unidas a la superficie de los mastocitos en personas sensibilizadas. Si estas moléculas de IgE se entrecruzan entre sí mediante un alérgeno, esto da como resultado la secreción de mediadores (por ejemplo, histamina, prostaglandinas) y citocinas mediante la célula efectora y, por lo tanto, los correspondientes síntomas alérgicos.

Hasta el 40% de las personas con alergia de tipo 1 muestran una reactividad de IgE específica con extractos de polen de gramíneas verdaderas (Burney et al., 1997, J. Allergy Clin. Inmunol. 99:314-322; D'Amato et al., 1998, Allergy 53: 567-578; Freidhoff et al., 1986, J. Allergy Clin Immunologv. 78, 1190-2002). La familia de las gramíneas verdaderas (Poaceae) abarca más de 10000 especies, muchas de las cuales más de 20 se conocen hasta ahora como desencadenantes de síntomas alérgicos (Andersson y Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Immunol. 130:87-107; Esch, 2008, Allergens and Allergen Immunotherapy, Clinical Allergy and Immunology Series, 107-126).

La mayoría de las gramíneas verdaderas que provocan alergias pertenecen a la subfamilia Pooideae. Además de las especies de gramíneas que se encuentran en forma nativa, tal como, por ejemplo, Holcus lanatus (gramínea aterciopelada), Phalaris acuática (gramínea canaria), Anthoxanthum odoratum (gramínea dulce de primavera), Dactylis glomerata (gramínea de huerto), Festuca pratensis (festuca de pradera), Poa pratensis (gramínea azul de Kentucky) o Lolium perenne (gramínea de centeno), cereales cultivados tales como Triticum aestivum (trigo), Secale cereale (centeno) y Hordeum vulgare (cebada), también son miembros conocidos de esta subfamilia.

La inmunoterapia con alérgenos (AIT), la inmunoterapia específica (SIT) o la hiposensibilización se consideran un enfoque eficaz para el tratamiento terapéutico de las alergias (Fiebig 1995 Allergo J. 4 (6): 336-339, Bousquet et al., 1998, J. Allergy Clin. Inmunol. 102 (4): 558-562; Cox et al., 2007, J. Allergy Clin. Inmunol. 120: S25-85; James & Durham, 2008, Clin. Exp. Allergy 38: 1074-1088).

La forma terapéutica clásica de terapia de inyección (SCIT), en donde los extractos de alérgenos naturales se inyectan al paciente en dosis crecientes por vía subcutánea, se ha utilizado con éxito desde hace unos 100 años. En esta terapia, el sistema inmunológico de la persona alérgica se enfrenta repetidamente a los alérgenos, lo que provoca que se logre una reprogramación del sistema inmunológico junto con la tolerancia a los alérgenos. Después de la absorción de los antígenos de las preparaciones de alérgenos por las células presentadoras de antígenos, los péptidos se presentan a los antígenos en la superficie celular. Algunos péptidos particulares que contienen los también denominados epítopos de células T son reconocidos por las células T específicas de antígeno. Esta unión conduce, entre otras cosas, al desarrollo de distintos tipos de células T que tienen una función reguladora. En el curso de la AIT, la respuesta de las células T reguladoras da como resultado la tolerancia al alérgeno, la regulación negativa de las citocinas TH2, el restablecimiento del equilibrio TH1/TH2, la supresión de la IgE específica del alérgeno, la inducción de los anticuerpos IgG4, IgG1 e IgA, la supresión de las células efectoras (mastocitos, basófilos y eosinófilos) y la renovación del tejido inflamado (Akdis et al., 2007, J. Allergy Clin. Inmunol. 119 (4):780-789; Larche et al., 2008, Nature Reviews 6:761-771). Por lo tanto, los epítopos de células T tienen una importancia decisiva para el efecto terapéutico de las preparaciones de alérgenos en caso de hiposensibilización.

Debido a la reactividad cruzada de los principales alérgenos de las gramíneas verdaderas, que están presentes en la IgE y también a nivel de las células T, normalmente es suficiente una terapia exitosa con un extracto de alérgeno de una sola especie de gramíneas representativa (Mailing et al., 1993, EAACI Position Paper: Immunotherapy, Allergy 48: 935; Cox et al., 2007, J Allergy Clin Immunol 120: 25-85).

Además de la inmunoterapia subcutánea, una alternativa a la terapia con inyecciones es una forma de terapia sublingual, en donde los alérgenos o derivados de los alérgenos se absorben a través de la membrana de la mucosa oral (James & Durham, 2008, Clin. Exp. Allergy 38: 1074-1088).

Una posibilidad adicional es el tratamiento con DNA expresable que codifique los alérgenos relevantes (vacunación inmunoterapéutica). Se han obtenido pruebas experimentales de la influencia específica de los alérgenos en la respuesta inmunitaria en roedores mediante la inyección de DNA que codifica los alérgenos (Hsu et al. 1996, Nature Medicine 2 (5): 540-544; Weiss et al., 2006, Int. Arch. Allergy Immunol. 139: 332-345).

En todas estas formas de terapia existe un riesgo fundamental de reacciones alérgicas o incluso de shock anafiláctico (Kleine-Tebbe, 2006, Allergologie, 4:135-156). Para minimizar estos riesgos se utilizan preparaciones innovadoras en forma de alergoides. Estos son extractos de alérgenos químicamente modificados que tienen una reactividad de IgE significativamente reducida, pero una reactividad de células T idéntica comparada con el extracto no tratado (Fiebig 1995 Allergo J. 4 (6): 336-339; Kahlert et al., 1999, Int. Arch. Allergy Immunol, 120: 146-157).

La optimización de la terapia es posible con alérgenos preparados mediante métodos recombinantes. Mezclas definidas de alérgenos de alta pureza preparadas mediante métodos recombinantes, que eventualmente se adaptan a los patrones de sensibilización individuales de los pacientes, podrían sustituir a los extractos de fuentes de alérgenos naturales, ya que, además de los diferentes alérgenos, estos últimos contienen una cantidad relativamente grande de proteínas acompañantes inmunogénicas pero no alergénicas. Los primeros estudios clínicos con alérgenos recombinantes ya se han llevado a cabo con éxito (Jutel et al., 2005, J. Allergy Clin. Inmunol., 116: 608-613.; Valenta & Niederberger, 2007, J. Allergy Clin. Inmunol. 119: 826-830).

Las perspectivas realistas que pueden dar como resultado una hiposensibilización segura con productos de expresión recombinantes las ofrecen específicamente los alérgenos recombinantes mutados en donde los epítopos de IgE se modifican sin alterar los epítopos de las células T que son esenciales para la terapia (Schramm et al. 1999, J. Inmunol.

162:2406-2414). Estas proteínas hipoalergénicas podrían emplearse en dosis relativamente altas durante la AIT sin aumentar la probabilidad de efectos secundarios no deseados promovidos por la IgE.

En el pasado se han publicado dichas variantes "hipoalergénicas" con unión reducida a IgE para muchos aeroalérgenos (entre otros, alérgenos del polen y de los ácaros del polvo doméstico) y alérgenos alimentarios. A partir del DNA de alérgenos no modificados se ha podido preparar y expresar un DNA recombinante, entre otras cosas mediante fragmentación, oligomerización, deleciones, mutaciones puntuales o recombinación de secciones individuales de un alérgeno (DNA mixto) (Ferreira et al., 2006, Inflamm. & allergy - Drug Targets 5: 5 14; Bhalla & Singh, 2008, Trends in Biotechnology 26:153-161; Westritschnig et al., 2007, J. Immunol. 179: 7624-7634).

La elegibilidad para la inmunoterapia se basa en la determinación de la reactividad de la IgE a un alérgeno específico mediante punción cutánea o pruebas in vitro. Los biomarcadores o proteínas marcadoras que predicen la probabilidad de mejoría clínica durante la inmunoterapia mejorarían significativamente la selección de pacientes.

Aunque la AIT es eficaz, el grado de remisión varía mucho dependiendo de la compleja interacción entre el paciente, la alergia, los síntomas y las vacunas utilizadas para la AIT (Bousquet J, Van Cauwenberge P, Khaltaev N, Aria Workshop G, World Health O. J Allergy Clin Immunol 2001;108(5 Suppl.): S147-S334; Bousquet J, Khaltaev N, Cruz AA, Denburg J, Fokkens WJ, Togias A et al. Allergy 2008;63 (Suppl. 86): 8-160; Bousquet J, Lockey R, Mailing HJ. J Allergy Clin Immunol 1998;102: 558-562; Shamji MH, Ljorring C, Francis JN, Calderón MA, Larche M, Kimber I et al. Allergy 2012; 67: 217-226; Durham SR, Walker SM, Varga EM, Jacobsonm R ,O'Brien F, Noble W et al. N Engl J Med 1999; 341:468-475; Calderón MA, Alves B, Jacobson M, Hurwitz B, Sheikh A, Durham S. Cochrane Database Syst Rev 2007; CD001936; Radulovic S, Calderón MA, Wilson D, Durham S. Cochrane Database Syst Rev 2010; CD002893).

El manejo clínico de los pacientes que reciben AIT y la eficacia en ensayos controlados de manera aleatoria para el desarrollo de fármacos podrían mejorarse significativamente si existieran medios para identificar a aquellos que tienen más probabilidades de responder, cuándo suspender el tratamiento, cómo predecir la recaída y cuándo realizar AIT de refuerzo. Además, los biomarcadores en AIT pueden desempeñar un papel central en la medicina personalizada (Galli SJ. J Allergy Clin Immunol 2016; 137:1289-1300). Aunque recientemente se han definido recomendaciones para la estandarización de los resultados clínicos utilizados en los ensayos de AIT para AR (Pfaar O, Demoly P, Gerth van Wijk R, Bonini S, Bousquet J, Canonica GW et al. Allergy 2014;69:854-867. Burks AW, Calderón MA, Casale T, Cox L, Demoly P, Jutel M et al. J Allergy Clin Immunol 2013; 131: 1288-1296. Calderónm A ,Casale T, Cox L, Akdis CA, Burksa W ,Nelson HS et al. Allergy 2013;68: 825-828. Calderón MA, Bernstein DI, Blaiss M, Andersen JS, Nolte H. Clin Exp Allergy 2014;44: 1228-1239), hasta la fecha no existe consenso sobre candidatos a biomarcadores sustitutos de eficacia o combinaciones de biomarcadores que serían pronósticos, predictivos y/o sustitutos de la respuesta clínica a la AIT (Food, Drug Administration HHS. International Conference on harmonization; guidance on E15 pharmacogenomics definitions and sample coding: availability. Notice. Fed Regist 2008; 73: 19074-19076.). En el sentido de la medicina personalizada, los biomarcadores se pueden utilizar para ayudar en la selección de pacientes, identificar los respondedores, dirigir la intervención a aquellos que se beneficiarán y excluir a aquellos que tienen menos probabilidades de responder al tratamiento, cumpliendo así los criterios de la medicina personalizada.

Además, pueden ser de gran importancia para el desarrollo de nuevas vacunas y para la optimización de los regímenes terapéuticos existentes. Según la guía de International Conference on Harmonization (ICH) E15 sobre "Definiciones de biomarcadores genómicos, farmacogenómica, farmacogenética, datos genómicos y categorías de codificación de muestras", los biomarcadores son "indicadores de procesos biológicos normales, procesos patógenos y/o respuesta a intervenciones terapéuticas o de otro tipo".' (Food, Drug Administration HHS. International Conference on harmonization; guidance on E15 pharmacogenomics definitions and sample coding; availability. Notice. Fed Regist 2008; 73: 19074-19076.). Los biomarcadores se pueden aplicar en el contexto de ensayos clínicos controlados para aprobación regulatoria, así como en la práctica clínica.

Los criterios para evaluar y seleccionar biomarcadores candidatos son proporcionados por la guía de ICH E16 'Biomarcadores relacionados con desarrollos de fármacos o productos biotecnológicos: contexto, estructura y formato de las presentaciones de calificación' (Food, Drug Administration HHS. International conference on harmonization; guidance on E16 biomarkers related to drug or biotechnology producto development: context, structure, an dormat of qualification submissions; availability. Notice. Fed Regist 2011; 76: 49773-49774.). Por biomarcador candidato, se debe reportar una descripción general que contenga las fortalezas y las limitaciones, y el diseño de los estudios que respaldan su utilidad. La ”Guideline on the Clinical Development of Products for Specific Immunotherapy for the Treatment of Allergic Diseases” de European Medicines Agency (EMA) publicada en 2008 recomienda incluir los cambios inmunológicos (por ejemplo, cambios en los niveles de IgG específicos de alérgenos, respuestas de células T y/o producción de citocinas) y/o modificaciones de la respuesta específica del órgano terminal (por ejemplo, pruebas de provocación) en estudios farmacocinéticos y dinámicos para mostrar el efecto de la AIT en el sistema inmunológico (CHMP EMA Guideline on the Clinical Development of Products for Specific Immunotherapy for the Treatment of Allergic Diseases. 2008. Sin editor independiente).

Sin embargo, desde 2008 se encuentran disponibles varios marcadores inmunológicos novedosos en la AIT y potencialmente pueden usarse como biomarcadores sustitutos/predictivos para la AIT. En este contexto, las técnicas de laboratorio deben ser reproducibles, robustas, sensibles y específicas siguiendo las directrices de la ICH para la validación de procedimientos analíticos ”Validation of Analytical Procedures: Methodology” (International Conference on Harmonization of Technical Requirements for registration of pharmaceuticals for human use (ICH) adopts consolidated guideline on good clinical practice in the conducto f clinical trial son medicinal products for human use. Int Dig Health Legis 1997; 48:231-234.). El Grupo de Interés en Inmunoterapia (IT IG) de The European Academy of Allergy and Clinical Immunology (EAACI) ha llevado a cabo un grupo de trabajo (TF) sobre 'Biomarcadores para el seguimiento de la eficacia clínica de la inmunoterapia con alérgenos'.

Por lo tanto, sigue habiendo una necesidad de biomarcadores y pruebas de diagnóstico altamente efectivas que utilicen proteínas marcadoras específicas que sean capaces de identificar a los respondedores a la AIT y a los no respondeores y a los individuos sanos en donde la AIT está contraindicada.

Compendio de la invención

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

Sorprendentemente se encontró que el nivel de expresión de las proteínas marcadoras específicas en muestras de plasma o de fluido nasal (este último no según la invención) es predictivo para una inmunoterapia alérgica exitosa en un paciente alérgico, es decir, para la identificación de los respondedores a la AIT, o para la discriminación entre pacientes alérgicos e individuos sanos.

Por lo tanto, una realización de la presente invención es un método para identificar un paciente con alergia al polen de gramíneas y/o abedul que responde al tratamiento con inmunoterapia alérgica (AIT) que comprende determinar in vitro en una muestra de plasma de dicho paciente alérgico el nivel de expresión de la proteína marcadora CCL8 sola o en combinación con una o más proteínas marcadoras seleccionadas del grupo que consiste en ITGB3, MYL6, FLNA, ACTB, KLKB1, APOA1, ITIH1, C2, SERPINA6, SHBG, GFRA2, GKN1, CCL11, BTN3A2, SIGLEC7, IL18, CHRDL2, REG4, GHRL, CXCL11, MEP1B, GSAP, CXCL5 y METAP1 D.

Otra realización de la presente invención es un método para determinar la eficacia clínica de un tratamiento con AIT usando el método según la presente invención.

Otra realización de la presente invención es un método para la identificación de un paciente alérgico en donde el tratamiento con AIT está contraindicado, utilizando el método según la presente invención. Por lo tanto, otra realización de la presente invención es un método para la identificación de un paciente alérgico no respondedor al tratamiento con AIT, utilizando el método según la presente invención y comparando los niveles de expresión de las proteínas marcadoras según la presente invención con un control.

Otra realización de la presente invención es un método para determinar si un paciente con alergia al polen de gramíneas y/o abedul se beneficia del tratamiento con AIT caracterizado por determinar el nivel de expresión de las proteínas marcadoras según la presente invención in vitro en una muestra de plasma de dicho paciente alérgico, en donde en caso de que la expresión de una o más de las proteínas marcadoras mencionadas anteriormente esté por encima o por debajo de un cierto límite, el paciente es elegible para dicho tratamiento con AIT.

Otra realización que no forma parte de la presente invención es un método para la selección de un régimen de tratamiento de AIT para un paciente con alergia al polen de gramíneas y/o abedul usando el método según la presente invención.

Las proteínas marcadoras mencionadas anteriormente son biomarcadores predictivos para un tratamiento exitoso con AIT. Por lo tanto, otra realización de la presente invención es el uso de una proteína marcadora según la presente invención en la identificación de un paciente con alergia al polen de gramíneas y/o abedul que responde al tratamiento con AIT que comprende determinar in vitro en una muestra de plasma de dicho paciente el nivel de expresión de dicha proteína marcadora.

Otra realización de la presente invención es el uso de un dispositivo de ensayo para la identificación de un paciente alérgico que responde al tratamiento con AIT usando el método según la presente invención.

Otra realización de la presente invención es el uso de un dispositivo de ensayo para la identificación de un paciente como elegible para AIT usando el método según la presente invención.

Otra realización de la presente invención es el uso de un kit (conjunto) para la identificación de un paciente alérgico que responde al tratamiento con AIT, que comprende:

a) medios para determinar el nivel de expresión de una o más proteínas marcadoras según la presente invención,

b) una curva de control estándar o valor de control que muestra una relación entre el nivel de expresión de las proteínas marcadoras en muestras de plasma o fluido nasal y la capacidad de respuesta a la AIT de pacientes alérgicos, y

c) una muestra de control o valor de control indicativo del nivel de expresión de las proteínas marcadoras en una muestra de plasma o fluido nasal de un no respondedor a la AIT.

El kit (conjunto) comprende recipientes adecuados, tales como cajas o cartones, frascos individuales, bolsas o ampollas.

Otra realización que no forma parte de la presente invención es un método para la identificación de un paciente con alergia al polen de gramíneas y/o abedul usando el método según la presente invención y comparando los niveles de expresión de las proteínas marcadoras según la presente invención con un control.

Otra realización que no forma parte de la presente invención es un método para la identificación de un paciente con alergia al polen de gramíneas y/o abedul caracterizado por determinar el nivel de expresión de las proteínas marcadoras según la presente invención in vitro en una muestra de plasma de dicho paciente, en donde en caso de que la expresión de una o más de las proteínas marcadoras mencionadas anteriormente esté por encima o por debajo de un cierto límite, el paciente es un paciente alérgico.

Otra realización que no forma parte de la presente invención es el uso de una proteína marcadora según la presente invención en la identificación de un paciente con alergia al polen de gramíneas y/o abedul usando el método según la presente invención.

El nivel de expresión de la proteína marcadora puede determinarse mediante electroforesis en gel (SDS-PAGE), en particular electroforesis en gel en una y dos dimensiones (1D-, 2D-PAGE), realizada sobre la muestra o un extracto de la misma que contiene proteínas. 2D-PAGE es una técnica bien establecida en donde las proteínas se separan primero en una dimensión mediante enfoque isoeléctrico y después se separan mediante SDS-PAGE a lo largo de una segunda dimensión. La expresión de proteínas se puede analizar mediante visualización de proteínas marcadas o mediante transferencia de Western (es decir, utilizando un anticuerpo monoclonal o policlonal). La cuantificación de proteínas mediante 2D-PAGE normalmente se lleva a cabo mediante 2D-DiGE, en donde las proteínas de una muestra de control y la muestra de prueba se marcan con diferentes colorantes. Los colorantes tienen una masa similar y una carga idéntica, por lo que las proteínas marcadas migran a la misma posición en el gel, lo que permite realizar la cuantificación dentro de un único gel. El nivel de expresión de la proteína marcadora también puede determinarse mediante ensayos de espectrometría de masas (LC-MS o LC-MS/MS). Se conocen y utilizan en la técnica técnicas de espectrometría de masas cualitativas y cuantitativas. A este fin, se seleccionan y cuantifican péptidos objetivo específicos para proteínas marcadoras basado en curvas de calibración establecidas con péptidos sintéticos marcados con isótopos estables. Digestos enzimáticos, enriquecidos con una cantidad definida de isótopo marcado

Otra realización que no forma parte de la presente invención es un método para identificar un paciente alérgico que comprende determinar in vitro en una muestra de plasma de dicho paciente el nivel de expresión de una combinación de dos o más proteínas marcadoras seleccionadas del grupo que consiste en CCL8, VEGFD y WNT9A o de un mRNA de las mismas.

Otra realización que no forma parte de la presente invención es un método para identificar un paciente alérgico que comprende determinar in vitro en una muestra de fluido nasal de dicho paciente el nivel de expresión de una combinación de dos o más proteínas marcadoras seleccionadas del grupo que consiste en ALOX15, KIAA0513, SULT1A1, RSPH3, GMPPA, TUBB2A, LRRC46, UBE2N, IFT46, MYCBP, PLIN3, LZTFL1, KRT75, HSPA9, ATP5F1B, FABP5, SIRT2, IRAK4, DAPP1, ICA1, SH2B3, PIK3AP1, ZBTB16, ZBTB17, DCTN1, TANK, BIRC2, IRF9, ARHGEF12, PAK4, PPP1 R9B, DGKZ, GCNT1, IL22RA1, CTSO y METRNL o un mRNA de las mismas.

Otra realización que no forma parte de la presente invención es un método para la identificación de un paciente alérgico usando el método según la presente invención y comparando los niveles de expresión de las proteínas marcadoras según la presente invención o los mRNAs de las mismas con un control.

Otra realización que no forma parte de la presente invención es un método para la identificación de un paciente alérgico caracterizado por determinar el nivel de expresión de las proteínas marcadoras según la presente invención o los mRNAs de las mismas in vitro en una muestra de plasma o una muestra de fluido nasal de dicho paciente, en donde en caso de que la expresión de una o más de las proteínas marcadoras mencionadas anteriormente o los mRNAs de las mismas esté por encima o por debajo de un cierto límite, el paciente es un paciente alérgico.

Otra realización que no forma parte de la presente invención es una proteína marcadora según la presente invención o un mRNA de la misma para su uso en la identificación de un paciente alérgico usando el método según la presente invención.

El nivel de expresión de la proteína marcadora puede determinarse mediante electroforesis en gel (SDS-PAGE), en particular electroforesis en gel en una y dos dimensiones (1D-, 2D-PAGE), realizada sobre la muestra o un extracto de la misma que contiene proteínas. 2D-PAGE es una técnica bien establecida en la que las proteínas se separan primero en una dimensión mediante enfoque isoeléctrico y después se separan mediante SDS-PAGE a lo largo de una segunda dimensión. La expresión de proteínas se puede analizar mediante visualización de proteínas marcadas o mediante transferencia de Western (es decir, utilizando un anticuerpo monoclonal o policlonal). La cuantificación de proteínas mediante 2D-PAGE normalmente se lleva a cabo mediante 2D-DiGE, en donde las proteínas de una muestra de control y la muestra de prueba se marcan con diferentes colorantes. Los colorantes tienen una masa similar y una carga idéntica, por lo que las proteínas marcadas migran a la misma posición en el gel, lo que permite realizar la cuantificación dentro de un único gel. El nivel de expresión de la proteína marcadora también puede determinarse mediante ensayos de espectrometría de masas (LC-MS o LC-MS/MS). Se conocen y se utilizan en la técnica técnicas de espectrometría de masas cualitativas y cuantitativas. A este fin, se seleccionan y cuantifican péptidos objetivo específicos de proteínas marcadoras basándose en curvas de calibración establecidas con péptidos sintéticos marcados con isótopos estables. Los digestos enzimáticos, enriquecidos con una cantidad definida de péptidos objetivo marcados con isótopos, se analizan mediante cromatografía líquida acoplada con espectrometría de masas. La relación entre los péptidos objetivo marcados y no marcados se mide para evaluar las concentraciones de péptidos objetivo y, por lo tanto, la concentración del marcador proteico.

El nivel de expresión de la proteína marcadora también se puede determinar usando un anticuerpo que se une a la proteína, por ejemplo un anticuerpo monoclonal o policlonal, una variante o fragmentos de anticuerpo tales como un anticuerpo monocatenario, un diacuerpo, un minicuerpo, un fragmento Fv de cadena sencilla (sc(Fv)), un anticuerpo Sc(Fv), un fragmento Fab o un fragmento F(ab'), un anticuerpo VHH o un anticuerpo de dominio único. El anticuerpo puede ser mono, bi, tri o multivalente. El anticuerpo puede inmovilizarse sobre un soporte sólido. Los anticuerpos se pueden usar para determinar la expresión de proteínas en una variedad de ensayos inmunológicos que incluyen sistemas de ensayo competitivos y no competitivos usando técnicas tales como la transferencia de Western, inmunohistoquímica/inmunofluorescencia (es decir, detección de proteínas en células o tejidos fijados), radioinmunoensayo tal como RIA (inmunoensayo ligado a radio), ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), inmunoensayos de tipo "sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación del complemento, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, por ejemplo, FIA (inmunoensayo ligado a fluorescencia), inmunoensayos de quimioluminiscencia, ECLIA (inmunoensayo de electroquimioluminiscencia) e inmunoensayos de proteína A.

Dichos ensayos son rutinarios y bien conocidos por el experto en la técnica. Alternativamente, el nivel de expresión de la proteína marcadora se puede determinar usando un aptámero específico de la proteína. Un aptámero es un péptido corto capaz de unirse específicamente a una secuencia de proteínas específica, que consiste en un bucle peptídico variable unido en ambos extremos a un andamio proteico. Los métodos para preparar aptámeros de proteínas son bien conocidos en la técnica, siendo el método más comúnmente utilizado el sistema de doble híbrido en levadura. Preferiblemente, dichos aptámeros pueden marcarse para permitir la detección de una interacción proteína-ligando. También se podría utilizar un ensayo basado en nanotecnología. Por consiguiente, en realizaciones particulares, el nivel de expresión de al menos una proteína marcadora como se define anteriormente se determina mediante ensayo inmunológico, ensayos de espectrometría de masas o electroforesis en gel.

El nivel de expresión de los mRNAs de las proteínas marcadoras puede determinarse mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real, utilizando cebadores específicos para las proteínas marcadoras que se van a medir. Este método permite la detección de mRNA en una muestra biológica mediante la generación de cDNA por transcripción inversa utilizando al menos un cebador; amplificando el cDNA así producido usando polinucleótidos específicos de genes como cebadores sentido y antisentido y detectando la presencia del cDNA amplificado mediante métodos bien conocidos por el experto en la técnica. Esto incluye la amplificación del cDNA con cebadores específicos prediseñados utilizando reactivos los SYBR GREEN o Taqman. También son aplicables otros métodos, tales como la secuenciación de alto rendimiento.

El término "proteína marcadora" o "biomarcador" incluye todas las isoformas de dichas proteínas. Por lo tanto, para las proteínas marcadoras descritas anteriormente, el término "proteína marcadora" o "biomarcador" incluye el polipéptido que tiene el nombre de la proteína, los sinónimos, las secuencias de aminoácidos, el número ID del gen, el número de Pubmed Entrez, el ID o el número de acceso de la proteína, el ID o el número de acceso de Uniprot descrito en la presente memoria y todas las isoformas del mismo.

Respondedores versus no respondedores de plasma de FGCZ (en todas las tablas siguientes solo proteínas marcadoras seleccionadas del grupo que consiste en CCL8, ITGB3, MYL6, FLNA, ACTB, KLKB1, APOA1, ITIH1, C2, SERPINA6, SHBG, GFRA2, GKN1, CCL11, BTN3A2, SIGLEC7, IL18, CHRDL2, REG4, GHRL, CXCL11, MEP1B, GSAP, CXCL5 y METAP1D están según la invención y los marcadores restantes están presentes solo con fines ilustrativos).

Respondedores versus no respondedores de plasma de OLINK

Respondedores versus No respondedores nasales FGCZ (no según la invención)

Respondedores versus no respondedores nasales de OLINK (no según la invención)

Paciente alérgico al plasma de OLINK vs. Sanos

Pacientes alérgico nasal de FGCZ vs. Sanos (no según la invención)

Pacientes alérgico nasal de OLINK vs. Sanos (no según la invención)

"Isoforma" se refiere a todas las formas alternativas de una proteína, por ejemplo formas sustituidas de aminoácidos, versiones empalmadas de manera alternativa y formas modificadas después de la traducción tales como glicoformas. Las isoformas modificadas después de la traducción pueden incluir formas acetiladas, formiladas, lipoiladas, miristoiladas, palmitoiladas, alquiladas, metiladas, amidadas, glicosiladas, hidroxiladas, nitrosiladas, fosforiladas, sulfatadas, polisialiladas y sialiladas. Las isoformas incluyen variantes naturales, variantes alélicas, SNPs (polimorfismos de un solo nucleótido), variantes de empalme alternativas y formas truncadas o secretadas de la proteína. Alternativamente, también pueden detectarse mRNAs empalmados y truncados que codifican las proteínas marcadoras. La detección del "nivel de expresión" de una proteína marcadora puede referirse al nivel de expresión de cualquier isoforma individual de dicha proteína, el nivel de expresión colectivo de las isoformas seleccionadas de dicha proteína, o el nivel total de expresión de dicha proteína incluyendo la secuencia de referencia y todas las isoformas.

"Muestra de plasma" o "muestra de fluido nasal" tal y como se usa en la presente memoria indica una muestra de plasma o muestra de fluido nasal obtenida de un paciente, es decir, un individuo sano o un paciente alérgico según la presente invención. Un ejemplo de la preparación de una muestra de plasma y una muestra de fluido nasal para la determinación in vitro de la expresión de las proteínas marcadoras según la presente invención se describe en el ejemplo 1 pero, alternativamente, se puede obtener una muestra de plasma o una muestra de fluido nasal mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica y dependiendo del método de determinación de la expresión.

"In vitro", tal y como se usa en la presente memoria, indica que se obtiene una muestra de sangre de un paciente y el plasma se aísla de la muestra de sangre o se obtiene una muestra de fluido nasal de un paciente y se prepara para la determinación in vitro de la expresión de la proteínas marcadoras según la presente invención como se describe en el ejemplo 1. "In vitro", como se usa en la presente memoria, incluye o es un sinónimo del término "ex vivo".

"Control" o "valor estándar" como se usa en la presente memoria indica, en el caso de la identificación de un paciente alérgico que responde al tratamiento con AIT, el valor medio o la media aritmética del nivel de expresión de la proteína marcadora individual obtenida de los no respondedores. "Control" o "valor estándar" tal y como se usa en la presente memoria indica, en el caso de la identificación de un paciente alérgico, el valor medio o la media aritmética del nivel de expresión de la proteína marcadora individual obtenida de individuos sanos.

"Sensibilidad", tal y como se utiliza en la presente memoria, indica la proporción de positivos reales que se identifican correctamente. También se le denomina tasa de verdaderos positivos. A modo de ejemplo, se muestra el porcentaje de pacientes respondedores verdaderamente identificados que se identifican con un determinado biomarcador. La sensibilidad se calcula dividiendo el número de verdaderos positivos por el número de positivos totales (total positivo = verdadero positivo falso negativo).

"Especificidad", tal y como se utiliza en la presente memoria, indica la proporción de negativos reales que se identifican correctamente. También se le denomina tasa negativa verdadera. A modo de ejemplo, se muestra el porcentaje de pacientes no respondedores verdaderamente identificados que se identifican con un determinado biomarcador. La especificidad se calcula dividiendo el número de verdaderos negativos por el número de negativos totales (negativos totales = negativos verdaderos falsos positivos).

"Terapia", "terapéutica", "tratamiento" o "que trata" incluyen reducir, aliviar o inhibir o eliminar los síntomas de las alergias, así como el tratamiento que pretende reducir, aliviar, inhibir o eliminar dichos síntomas. Estos términos pueden incluir un tratamiento preventivo que pretende, o tiene el efecto de, reducir, aliviar, inhibir o eliminar síntomas futuros. También pueden incluir el tratamiento de los síntomas actuales.

La "alergia" o "hipersensibilidad de tipo 1" es una afección caracterizada por la producción de IgE específica del alérgeno en respuesta a un alérgeno específico, generalmente una proteína. Las manifestaciones y los síntomas clínicos de la alergia pueden incluir congestión nasal, prurito nasal, prurito ocular, lagrimeo, rinorrea, sinusitis, rinitis, estornudos, sibilancias, conjuntivitis, picazón dérmica, dermatitis, irritación de la piel y asma.

Un "alérgeno" es una sustancia, normalmente una proteína, que provoca la producción de anticuerpos IgE en individuos predispuestos. Los alérgenos pueden incluir alérgenos de polen (tales como alérgenos de polen de árboles, hierbas, malas hierbas y gramíneas), alérgenos de insectos (tales como alérgenos de inhalantes, saliva y veneno, por ejemplo, alérgenos de cucarachas, mosquitos y ácaros del polvo doméstico y alérgenos de veneno de himenópteros), alérgenos del pelo y la caspa de animales (de, por ejemplo, perro, gato, caballo, rata, ratón, conejo) y alérgenos alimentarios (de, por ejemplo, nueces, maní, leche, huevo). En una realización preferida, el paciente tiene alergia al polen de gramíneas y la inmunoterapia utiliza alérgenos del polen de gramíneas.

Por ejemplo, se puede seleccionar un alérgeno proteico del grupo que consiste en un alérgeno proteico del género Dermatophagoides; un alérgeno proteico del género Felis; un alérgeno proteico del género Ambrosia; un alérgeno proteico del género Lolium; un alérgeno proteico del género Cryptomeria; un alérgeno proteico del género Alternaría; un alérgeno proteico del género Alder, un alérgeno proteico del género Betula; un alérgeno proteico del género Blomia; un alérgeno proteico del género Quercus; un alérgeno proteico del género Olea; un alérgeno proteico del género Artemisia; un alérgeno proteico del género Plantago; un alérgeno proteico del género Parietaria; un alérgeno proteico del género Canine; un alérgeno proteico del género Blattella; un alérgeno proteico del género Apis; un alérgeno proteico del género Cupressus; un alérgeno proteico del género Thuya; un alérgeno proteico del género Chamaecyparis; un alérgeno proteico del género Periplaneta; un alérgeno proteico del género Agropyron; un alérgeno proteico del género Secale; un alérgeno proteico del género Triticum; un alérgeno proteico del género Cynorhodon; un alérgeno proteico del género Juniperus; un alérgeno proteico del género Dactylis; un alérgeno proteico del género Festuca; un alérgeno proteico del género Poa; un alérgeno proteico del género Lolium; un alérgeno proteico del género Avena; un alérgeno proteico del género Holcus; un alérgeno proteico del género Anthoxanthum; un alérgeno proteico del género Arrhenatherum; un alérgeno proteico del género Agrostis; un alérgeno proteico del género Phleum; un alérgeno proteico del género Phalaris; un alérgeno proteico del género Paspalum; y un alérgeno proteico del género Sorghum. "Los alérgenos oficialmente reconocidos se enumeran en el sitio web WHO/IUIS Allergen Nomenclature Sub-Committee en www.allergen.org". Ejemplos de diversos alérgenos proteicos conocidos derivados de algunos de los géneros identificados anteriormente incluyen: Betula (verrucosa) Bet v 1; Bet v 2; Blomia Blo 11; Blo t 3; Blo t 5; Blo t 12; Cynorhodon Cyn d 1; Dermatophagoides (pteronyssinus o farinae) Der p 1; Der p 2; Der p 3; Der p 7; Der f 1; Der f 2; Der f 3; Der f 7; Felis (domesticus) Fel d 1; Ambrosia (artemiisfolia) Amb a 1.1; Amb a 1.2; Amb a 1.3; Amb a 1.4; Amb a 2; Lollium (perenne) Lol p 1; Lot p 2; Lol p 3; Lote p 4; Lol p 9 (Lol p 5 o Lol p 1b); Cryptomeria (japonica) Cry j 1; Cry j 2; Canis (familiaris) Can f 1; Can f 2; Juniperus (sabinoides o virginiana) Jun s 1; Jun v 1; Juniperus (ashei) jun a 1; Jun a 2; Dactylis (glomerata) Dae g 1; Dae g 5; Poa (pratensis) Poa p 1; Phl p 1; Phl p 5; Phl p 6 y Sorghum (halepensis) Sor h 1.

"Inmunoterapia alérgica" o "AIT" pretende significar un tratamiento de una enfermedad alérgica mediante inducción, potenciación o supresión de una respuesta inmune mediante la administración de un alérgeno natural, un alergoide, un alérgeno recombinante, un alérgeno hipoalergénico o un péptido, fragmento o multímero del mismo.

"Vacuna" se refiere a una composición farmacéutica que comprende un alérgeno como un antígeno y opcionalmente un adyuvante para estimular el sistema inmunológico de un individuo para desarrollar inmunidad adaptativa a dicho antígeno. El antígeno puede ser un alérgeno natural, un alergoide, un alérgeno recombinante, un alérgeno hipoalergénico o un péptido, fragmento o multímero del mismo. Las vacunas pueden ser profilácticas (por ejemplo, para prevenir o mejorar los efectos de un contacto futuro con alérgenos naturales).

La sustancia utilizada en inmunoterapia y la vacuna se pueden administrar por vía parenteral, tal como por vía subcutánea o intravenosa, por ejemplo mediante inyección, o por vías alternativas tales como intranasal, inmunización cutánea, por ejemplo mediante administración transdérmica, epicutánea, intralinfática o mucosa (administración en superficies de mucosas, por ejemplo, una superficie sublingual, oral, nasal, bucal, ocular, rectal, urinaria, vaginal, pulmonar u otorrinolaringológica). En relación con la alergia, la inmunoterapia puede consistir, por ejemplo, en administrar un alérgeno a un paciente con el objetivo de reducir la respuesta inmune actual o futura, tal como una respuesta de IgE, y/o la manifestación de síntomas clínicos de alergia. La inmunoterapia se lleva a cabo de manera convencional administrando repetidamente una monodosis o dosis incrementales de un alérgeno a un paciente que lo necesita, dando como resultado de este modo una respuesta inmune adaptativa del paciente que se vuelve insensible al alérgeno. La inmunoterapia puede comprender la administración del alérgeno a una superficie de la mucosa, opcionalmente una superficie sublingual, oral, nasal, bucal, ocular, rectal, urinaria, vaginal, pulmonar u otorrinolaringológica. En particular, la inmunoterapia puede ser inmunoterapia sublingual. Alternativamente, la inmunoterapia puede comprender la administración por vía parenteral, tal como por vía subcutánea o intravenosa, por ejemplo mediante inyección, o por vías alternativas tales como intranasal, inmunización cutánea, por ejemplo mediante administración transdérmica o intralinfática.

El alérgeno usado para la inmunoterapia puede ser una única sustancia alergénica o una mezcla de dichas sustancias, por ejemplo una mezcla de proteínas. Puede ser un extracto parcial o totalmente purificado, tal como un extracto de polen, una proteína recombinante, un hipoalergeno o un péptido derivado del mismo. Por ejemplo, cuando la inmunoterapia se usa para tratar la alergia al polen de gramíneas, el alérgeno administrado para la inmunoterapia puede ser un extracto de polen de gramíneas, de polen de uno o varios géneros de gramíneas, tales como los géneros Dactylis, Poa, Lolium, Anthoxanthum y Phleum. El alérgeno también puede ser un alergoide, es decir, una forma químicamente modificada de un alérgeno natural que se ha modificado químicamente (por ejemplo mediante aldehidación). El alérgeno puede administrarse junto con un adyuvante.

"Paciente" como se utiliza en la presente memoria incluye cualquier individuo que sea un "paciente alérgico" o un "paciente sano", "individuo sano" o "donante sano" como se define más adelante.

"Paciente alérgico" incluye cualquier individuo que sea candidato para la inmunoterapia o vacunación alérgica, incluyendo los individuos que actualmente no reciben terapia. En cuanto a la alergia, en la mayoría de los casos, el paciente será un individuo que tiene, o ha tenido en algún momento en el pasado, síntomas clínicos de alergia y/o sensibilización a un alérgeno y/o una respuesta de IgE específica del alérgeno, o un individuo en riesgo de desarrollar dichos síntomas. La sensibilización a un alérgeno puede evaluarse detectando la IgE dirigida contra alérgenos de esta fuente en el suero del paciente o mediante pruebas cutáneas con una preparación que contenga los alérgenos correspondientes. El alérgeno puede incluir, sin limitación, cualquiera de los alérgenos descritos en la presente memoria, en particular un alérgeno de polen de gramíneas.

"Paciente sano", "individuo sano" o "donante sano" indican un sujeto que no ha tenido previamente una alergia definida anteriormente. Un paciente sano, un individuo sano o donante sano tampoco muestra síntomas de enfermedad alérgica. En otras palabras, dicho paciente sano, individuo sano o donante sano, si lo examina un profesional médico, se caracterizaría como sano y/o libre de síntomas de enfermedad alérgica.

"Tres", "seis" o "doce" "meses desde el inicio de la AIT" como se usa en la presente memoria indican que se obtuvo una muestra de plasma o muestra de fluido nasal de un paciente para la determinación in vitro de la expresión de las proteínas marcadoras de sus mRNAs según la presente invención tres, seis o doce meses desde el comienzo o iniciación de la inmunoterapia o inmunoterapia con alérgenos como se describe en la presente memoria o como se describe en el ejemplo 1.

La "respuesta" de un paciente al tratamiento indica que el paciente manifiesta una reducción de los síntomas clínicos. Los síntomas clínicos pueden evaluarse durante el curso del tratamiento, es decir, los síntomas antes del tratamiento pueden compararse con los síntomas durante y después del tratamiento. Alternativamente, se puede determinar una reducción de los síntomas en comparación con un nivel inicial establecido antes del tratamiento. En lo que respecta a la alergia, este enfoque es particularmente útil cuando, por ejemplo, la inmunoterapia se lleva a cabo en pacientes que en ese momento no presentan síntomas, como puede ser el caso de las personas alérgicas al polen de gramíneas estacionales, que pueden ser tratadas antes de la temporada de polen. Los síntomas pueden evaluarse mediante métodos estándar, tales como la autoevaluación del paciente o el registro de la cantidad de medicación necesaria. El grado de respuesta de un paciente al tratamiento se puede evaluar midiendo el grado de reducción de la gravedad de los síntomas, por ejemplo como se describe en el Ejemplo 4 a continuación.

Un sujeto "respondedor" o un paciente alérgico "que responde" al tratamiento con AIT como se define en la presente memoria es un sujeto que responde a la inmunoterapia alérgica o a la administración de vacunas con una mejora en los síntomas clínicos, preferiblemente una mejora estadísticamente significativa en comparación con los pacientes que reciben placebo o sin tratamiento. Preferiblemente, un sujeto respondedor mostrará una mejoría en los síntomas clínicos que es mayor que la mejora promedio o mediana observada en una muestra aleatoria de sujetos.

Un sujeto "no respondedor" o un paciente alérgico "que no responde" al tratamiento con AIT es un sujeto que no manifiesta ninguna mejoría en los síntomas clínicos después de la inmunoterapia alérgica o la administración de vacunas, o que muestra una mejoría estadísticamente no significativa en los síntomas, o que muestra una mejoría en los síntomas clínicos que es menor que la mejora promedio o mediana observada en una muestra aleatoria de sujetos. Por ejemplo, cuando la alergia es alergia al polen de gramíneas, la mejora en los síntomas clínicos puede detectarse mediante una reducción en la frecuencia o gravedad de la congestión nasal, prurito nasal, prurito ocular, lagrimeo, rinorrea, sinusitis, rinitis, estornudos, sibilancias y/o conjuntivitis y/o disminución en la toma de medicamentos de alivio conocidos.

En toda la presente solicitud, el término "que comprende" debe interpretarse en el sentido de que abarca todas las características específicamente mencionadas, así como otras opcionales, adicionales, no especificadas. Como se utiliza en la presente memoria, el uso del término "que comprende" también abarca la realización en donde no están presentes características distintas de las características específicamente mencionadas (es decir, "que consiste en"), así como la realización en donde están presentes características distintas de las características específicamente mencionadas siempre que las características esenciales de la composición no se vean afectadas materialmente por su presencia (es decir, "que consiste esencialmente en").

La presente invención se ilustrará con más detalle mediante las siguientes figuras y ejemplos que muestran la caracterización de marcadores de subconjuntos de células dendríticas y su papel en la evaluación de la respuesta clínica de pacientes sometidos a inmunoterapia antialérgica. Sin embargo, debe entenderse que estos ejemplos se dan únicamente a modo de ilustración de la invención y no constituyen de ninguna manera una limitación de la misma.

Incluso sin realizaciones adicionales, se supone que un experto en la técnica podrá utilizar la descripción anterior en el alcance más amplio. Por lo tanto, las realizaciones preferidas deben considerarse simplemente como divulgación descriptiva que no tiene absolutamente ningún carácter limitativo.

Por lo tanto, los siguientes ejemplos pretenden explicar la invención sin limitarla. A menos que se indique lo contrario, los datos porcentuales indican el porcentaje en peso. Todas las temperaturas se indican en grados Celsius. "Tratamiento convencional": se añade agua si es necesario, se ajusta el pH, si es necesario, a valores entre 2 y 10, dependiendo de la constitución del producto final, la mezcla se extrae con acetato de etilo o diclorometano, las fases se separan, la fase orgánica se seca sobre sulfato de sodio, se filtra, se evapora y el producto se purifica mediante cromatografía sobre gel de sílice y/o por cristalización.

Ejemplo 1 - Determinación de la expresión de proteínas marcadoras en muestras de plasma o fluido nasal (no según la invención) de pacientes alérgicos y pacientes sanos como controles.

Pacientes alérgicos y controles de pacientes sanos.

Se reclutaron 16 sujetos alérgicos al polen de gramíneas y/o abedul en la primavera/verano de 2015 en el Inselspital Bern (Berna, Suiza). El estudio se inició en diciembre de 2015/enero de 2016 cuando los pacientes recibieron inmunoterapia subcutánea con abedul y gramíneas (Allergovit). Todos los sujetos vivían en la región de Berna (Suiza), fueron diagnosticados clínicamente de rinitis alérgica al polen (prueba de punción cutánea positiva y presencia de IgE específica del alérgeno con Immunocap (Phadia AB, Uppsala, Suecia). Los participantes se evaluaron según su demografía y características clínicas y no mostraban ninguna enfermedad aguda o crónica concomitante clínicamente significativa. Otros criterios de exclusión fueron embarazo, incumplimiento, incapacidad para seguir los procedimientos del estudio, abuso de drogas o alcohol, o participación en un estudio que implicara el uso de fármacos en investigación un mes antes y durante el curso de este estudio. 10 de 13 sujetos alérgicos completaron todas las visitas del estudio (valor inicial (noviembre/diciembre), 3 meses (marzo/abril), 6 meses (junio/julio), 12 meses (noviembre/diciembre) desde el inicio de la AIT, mientras que tres pacientes abandonaron el estudio por razones no médicas. Se siguió a 12 sujetos sanos, no atópicos y no alérgicos de la misma región que los pacientes alérgicos en puntos de tiempo estacionales similares (como población de pacientes para controlar posibles riesgos estacionales en las poblaciones de células inmunes innatas).

Recogida de muestras de plasma.

Se extrajo sangre venosa de cada paciente y control sano en tubos heparinizados de 10 ml y se transportaron a temperatura ambiente desde la clínica para su posterior procesamiento inmediato dentro de las 5 horas posteriores al muestreo. A continuación, los tubos se centrifugaron durante 10 minutos a 150 g a temperatura ambiente. Se recogió cuidadosamente el plasma, se distribuyó en varias alícuotas de 1 ml en tubos micrónicos de 1,4 ml y se congelaron a -802C. Todas las muestras de plasma se sometieron a proteómica adicional dirigida y no dirigida en una sola vez y en lotes junto con las muestras nasales, después de la finalización de los puntos de tiempo en pacientes y controles.

Recogida de muestras nasales (no según la invención)

Se recogieron muestras nasales de cada paciente y control sano cepillando minuciosamente el área del meato medio (15 segundos) con el hisopo de Copán (hisopo flocado regular, aplicador de plástico, estéril en un tubo seco (Copan, Italia) ref nr 552C) y después se sumergieron en el tubo eppendorf que contiene 400 ml de PBS frío con inhibidor de proteasa, sin EDTA completo (1 comprimido en 10 ml). Las muestras se transportaron en hielo desde la clínica para su posterior procesamiento inmediato dentro de las 5 horas posteriores al muestreo. A continuación, se agitaron durante la noche en el agitador a 500 rpm a 4°C, a lo que siguió una agitación en vórtice de 30 segundos y la separación del cepillo de recogida exprimiendo cuidadosamente todo el líquido restante a través del eppendorf estéril sin fondo. A continuación, el fluido se centrifugó durante 10 min a 400 g a 4°C, el sobrenadante se transfirió al nuevo Eppendorf, al que siguió la segunda etapa de centrifugación durante 20 min a 12000 g a 4°C. El sobrenadante final se dividió en dos alícuotas de 100-150 ml y se congeló a -80°C. Todas las muestras nasales se sometieron a proteómica adicional no dirigida y dirigida en una sola vez y en lotes junto con muestras de plasma, después de la finalización de los puntos de tiempo en pacientes y controles.

Metodología proteómica

Proteómica no dirigida (Functional Genomics Center Zurich (FGCZ), Suiza)

Preparación de la muestra

Las muestras de plasma y nasales se prepararon utilizando un kit iST comercial (PreOmics, Alemania) con una versión actualizada del protocolo. Brevemente, se solubilizaron 2 gl de suero y 100 gl de muestras nasales en tampón 'Lyse', se hirvieron a 95°C durante 10 minutos y se procesaron con HIFU durante 30 segundos ajustando la amplitud ultrasónica al 85 %. Posteriormente, las muestras se transfirieron al cartucho y se digirieron añadiendo 50 gl de la solución de 'Digestión'. Después de 60 minutos de incubación a 37°C se detuvo la digestión con 100 gl de solución de parada. Las soluciones del cartucho se eliminaron mediante centrifugación a 3800 g, mientras que los péptidos quedaron retenidos por el filtro iST. Finalmente, los péptidos se lavaron, eluyeron, secaron y se volvieron a solubilizar en 20 gl de tampón (acetonitrilo al 3%, ácido fórmico al 0,1%) para análisis de LC-MS y se añadió 1 gl de péptidos de tiempo de retención indexado (iRT) (Biognosys) en cada muestra para una futura calibración del tiempo de retención.

Análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas.

El análisis de espectrometría de masas se realizó en un espectrómetro de masas Q Exactive HF-X (Thermo Scientific) equipado con una fuente Easy Spray (Thermo Scientific) y acoplado a un UPLC M-Class (Waters). La composición del disolvente en los dos canales fue 0,1 % de ácido fórmico para el canal A y 0,1 % de ácido fórmico, 99,9 % de acetonitrilo para el canal B. Para cada muestra, se cargaron 2 gL y 4 gL de péptidos del plasma y nasales, respectivamente, en una columna C18 HSS T3 comercial (1,8 gm, 300 gm X 150 mm, Waters). Los péptidos se eluyeron a un caudal de 5 gL/min mediante un gradiente de 8 a 24 % de B en 50 min, 36 % de B en 10 min y 64 % de B en 1 min. Las muestras de plasma y nasales se adquirieron en 2 lotes separados, cada uno con las muestras en un orden aleatorio. El espectrómetro de masas se hizo funcionar en modo independiente de datos (DIA). Los escaneos DIA cubrieron un intervalo de 386 a 1016 m/z en 70 ventanas de 9 m/z como lo describen Kelstrup et al (Kelstrup CD, Bekker-Jensen DB, Arrey TN, Hogrebe A, Harder A, Olsen JV. J Proteome Res 2018; 17:727-38). La resolución de las ventanas de DIA se estableció en 15000, con un valor objetivo de AGC de 3e6, el tiempo máximo de inyección se estableció en 22 ms y se fijó una energía de colisión normalizada (NCE) de 28. Cada ciclo del instrumento (3 s) se completó con una monitorización completa de escaneo MS de 385 a 1015 m/z a una resolución de 120000 (objetivo de AGC: 3e6, tiempo máximo de inyección: 200 ms).

Todas las muestras también se analizaron en modo dependiente de los datos (DDA) para la generación de bibliotecas espectrales: se realizaron escaneos de MS completos que cubrían de 350 a 1400 m/z a una resolución de 60000 (objetivo de AGC: 3e6, tiempo máximo de inyección: 45 ms) y fueron seguidos por la fragmentación HCD (disociación por colisión de mayor energía) en las seis señales más intensas por ciclo. Los espectros de HCD se adquirieron a una resolución de 30000 utilizando una energía de colisión normalizada de 28 y un tiempo máximo de inyección de 54 ms. El control automático de ganancia (AGC) se estableció en 100000 iones. Se habilitó la detección del estado de carga y se rechazaron los estados de carga individuales, superiores a siete y no asignados. Sólo se seleccionaron precursores con intensidad superior a 41000 para MS/MS. Las masas precursoras previamente seleccionadas para la medición de MS/MS se excluyeron de la selección adicional durante 30 s y la ventana de exclusión se estableció a 10 ppm. Las muestras se adquirieron mediante calibración de masa de bloqueo interno en m/z 371,1010 y 445,1200. Los datos de proteómica de espectrometría de masas se manejaron utilizando el sistema de gestión de información de laboratorio local (LIMS) (Turker C, Akal F, Joho D, Panse C, Oesterreicher B, Rehrauer H, et al. B-Fabric: The Swiss Army Knife for Life Sciences. EDBT. Lausanne, Suiza 2010).

Generación de bibliotecas espectrales y cuantificación de proteínas.

La identificación de proteínas a partir de datos de DDA se realizó utilizando MaxQuant (versión 1.4.1.2) (Cox J, Mann M. Nat Biotechnol 2008; 26:1367-72), seguido de la identificación de proteínas mediante la máquina de búsqueda integrada Andrómeda. Se buscaron espectros en una base de datos directa canónica SwissProt para humanos, concatenados en una base de datos fasta con señuelo invertido y contaminantes proteicos comunes (taxonomía de NCBI ID9606, fecha de lanzamiento 20161209). La carbamidometilación de la cisteína se estableció como modificación fija, mientras que la oxidación de la metionina y la acetilación de la proteína N-terminal se establecieron como variables. La especificidad de la enzima se fijó en tripsina/P, permitiendo una longitud mínima del péptido de 7 aminoácidos y un máximo de dos escisiones omitidas. La tolerancia de precursores y fragmentos se estableció a 10 ppm y 20 ppm, respectivamente, para la búsqueda inicial. La tasa de descubrimiento falso máxima (FDR) se estableció en 0,01 para péptidos y 0,05 para proteínas.

Las bibliotecas de espectros se generaron importando los resultados de MaxQuant y la base de datos de proteínas humanas en Spectronaut 11.0.15038.20.25720, Biognosys) utilizando la funcionalidad de generación de bibliotecas de espectros y la configuración de parámetros predeterminada. Toda la cuantificación de proteínas se realizó en Spectronaut utilizando la configuración predeterminada. Brevemente: el tipo de predicción del tiempo de retención se estableció en iRT dinámico con un factor de corrección de ventana de 1. Los señuelos se generaron utilizando un método dinámico, codificado y se habilitó la corrección de interferencia en el nivel MS2. Para la cuantificación de proteínas se utilizó un estimador de densidad de Kernel. Los datos cuantitativos se extrajeron utilizando el Informe de fábrica de BGS (predeterminado) y se utilizaron para el análisis de seguimiento. De la exportación de Spectronaut, todas las muestras de los pacientes AITB01, AITG03 y AITG08 se eliminaron de ambos conjuntos de datos. Además, las muestras nasales AITH01V05, AITH09V03 y AITB0902 se consideraron atípicas debido al bajo número de péptidos y proteínas identificados (menos de 600 péptidos).

Se aplicó un filtrado estricto de los grupos de características extraídos por el qValue reportado por Spectronaut. Para los grupos de fragmentos precursores, requerimos un valor q por muestra como máximo de 0,05 y un valor q por experimento de como máximo 0,01. El qValue por experimento es el qValue más pequeño de un precursor en todas las muestras y debe ser inferior a 0,01, lo que garantiza que en al menos una de las muestras se identificó un precursor con alta confianza. Para realizar modelos estadísticos, las intensidades de los fragmentos se añadieron en intensidades de precursores y péptidos. Para la cuantificación solo se utilizaron proteínas identificadas con al menos 2 péptidos y observadas en al menos el 60% de las muestras. Finalmente, los datos se normalizaron con una transformación robusta de puntuación Z modificada. La normalización se aplica para eliminar diferencias sistemáticas en la abundancia de proteínas debido a las diferentes concentraciones de muestra o diferentes cantidades de muestra cargadas en la columna. La normalización es importante para que se puedan detectar verdaderas proteínas expresadas diferencialmente. Para hacer esto, se calcula la puntuación Z del log2 de las intensidades transformadas, que se actualiza mediante el promedio de la desviación estándar del log2 de las intensidades transformadas en todas las muestras. Después de la normalización, todas las muestras tienen una distribución similar.

Modelado estadístico de datos proteómicos no dirigidos.

Los datos de medición del nivel de péptidos se modelaron utilizando modelos lineales de efectos mixtos utilizando el paquete RIme4(Bates D, Machler M, Bolker B, Walker S. Journal of Statistical Software 2015; 67:1-48). Se ajustaron dos modelos estadísticos diferentes: (i) el primer modelo incluía los factores "tiempo de visita" y "grupo" (alergia y salud) y se ajustó mediante la siguiente fórmula. "Intensidad transformada - 1 tiempo de visita grupo tiempo de visita * grupo (1 | péptido_Id)". Los contrastes entre los niveles de factores y las interacciones de los factores se calcularon utilizando el paquete Rmulticomp(Hothorn T, Bretz F, Westfall P. Biom J 2008; 50:346-63). ;;El segundo modelo (ii) incluyó los factores "tiempo de visita" y "respuesta" (respondedores y no respondedores) y se ajustó utilizando la siguiente fórmula: "Intensidad transformada ~ 1 tiempo de visita respuesta tiempo de visita * respuesta (1 | péptido_ld)". En ambos modelos, las correcciones de pruebas múltiples se desactivaron y no se aplicó ningún ajuste del valor p.

Proteómica dirigida (PEA, Olink AB, Uppsala, Suecia)

Los datos de proteínas del plasma y nasales (no según la invención) se generaron utilizando ensayos de extensión de proximidad (ProSeek, Olink AB, Uppsala, Suecia), como se describió previamente en detalle (Assarsson E, Lundberg M, Holmquist G, Bjorkesten J, Thorsen SB, Ekman D, et al. PLoS One 2014; 9:e95192). Se utilizaron cuatro paneles de 92 proteínas para detectar las proteínas predeterminadas de los paneles de regulación celular, inflamación, respuesta inmune y metabolismo (Tabla S1). En resumen, los anticuerpos acoplados a oligonucleótidos complementarios apareados detectaron cada proteína en la muestra. En una situación en donde los anticuerpos apareados se acercan mediante la unión a su proteína objetivo, su secuencia de oligonucleótidos complementaria formó una secuencia bicatenaria que es un objetivo para la siguiente amplificación con qPCR. La qPCR detecta la secuencia de DNA única formada cuando las etiquetas de oligonucleótidos complementarias unidas a pares de anticuerpos específicos del analito se hibridan y se extienden en presencia de DNA polimerasa.

El 82,25% de las proteínas previstas fueron detectables en muestras de plasma, lo que es mayor que la detectabilidad esperada del 77,5 % (basado en el plasma con EDTA de los donantes sanos de la prueba). Dos muestras de plasma no pasaron los controles de calidad. Primero se evaluó la concentración de proteína total en las muestras nasales usando el kit BCA (Thermo Fisher, Pierce, UK) y se ajustaron a 1000 mg/ml antes de realizar el ensayo para la normalización del procedimiento. Después de obtener los resultados, cada proteína se multiplicó por la proporción de dilución para volver a calcular su concentración original y servir como un biomarcador fácilmente obtenible. El 72,25% de las proteínas previstas fueron detectables en las muestras nasales. Todas las muestras nasales pasaron con éxito el control de calidad.

Olink PEA traduce los valores de Ct de qPCR en unidades de cuantificación relativas, expresión de proteína normalizada (NPX), utilizando una serie de normalización y transformación de datos. Estas operaciones están diseñadas para minimizar la variación técnica y mejorar la interpretabilidad de los resultados.

Modelado estadístico de los datos proteómicos dirigidos.

Los valores de NPX se modelaron utilizando un modelo lineal moderado con el paquete Bioconductorlimma(Ritchie ME, Phipson B, Wu D, Hu Y, Law CW, Shi W, et al. Nucleic Acids Res 2015; 43:e47) para identificar proteínas expresadas diferencialmente. Se utilizó información pareada en la comparación longitudinal. Se consideró que una proteína se expresaba solo cuando estaba por encima del límite de detección de Olink y del control de calidad en más de la mitad de los sujetos en cualquiera de los dos grupos comparados. El nivel de significancia del valor p fue 0,05.

Resultados Proteómicos de FGCZ y de OLINK

Los siguientes resultados también se describen en las figuras.

1.1. Respondedores versus no respondedores - Plasma

Respondedores versus no-respondedores en plasma de FGCZ: valor inicial

Respondedores versus no-respondedores en plasma de OLINK: valor inicial

Respondedores versus no respondedores en plasma de FGCZ: 3 meses de AIT

Respondedores versus no respondedores en plasma de OLINK - 3 meses de AIT

Respondedores versus no respondedores en plasma de FGCZ: 6 meses de AIT

Respondedores versus no-respondedores en plasma de OLINK - 6 meses de AIT

Respondedores versus no-respondedores en plasma de FGCZ: 12 meses de AIT

Respondedores versus no-respondedores en plasma de OLINK - 12 meses de AIT

1.1. Respondedores versus No Respondedores - Fluido nasal (no según la invención) Respondedores versus no-respondedores en nasales de FGCZ: valor inicial

Respondedores versus no-respondedores en nasales de OLINK: valor inicial (no según la invención)

Respondedores versus no-respondedores en nasales de FGCZ: 3 meses de AIT (no según la invención)

Respondedores versus no respondedores en nasales de OLINK - 3 meses de AIT (no según la invención)

Respondedores versus no-respondedores en nasales de FGCZ: 6 meses de AIT (no según la invención)

Respondedores versus no-respondedores en nasales de OLINK - 6 meses de AIT (no según la invención)

Respondedores versus no-respondedores en nasales de FGCZ - 12 meses de AIT (no según la invención)

Respondedores versus no-respondedores en nasales de OLINK - 12 meses de AIT (no según la invención)

1.2. Paciente alérgico versus Sano - Plasma (no según la invención)

Paciente alérgico versus sano en plasma de OLlNK: valor inicial

1.3. Paciente alérgico versus sano - Fluido nasal (no según la invención)

Paciente alérgico versus sano en nasales de FGCZ: valor inicial

Paciente alérgico versus sano en nasales de OLINK: valor inicial (no según la invención)

Ejemplo 2 - Ejemplos para pruebas de biomarcadores inmunológicos

ELISA tipo sándwich, ensayo de unión bilateral, ELISA de cuantificación

Se utiliza un anticuerpo frente el biomarcador como un anticuerpo de captura y se recubre una placa de microtitulación (MTP). El espacio de unión libre en la MTP se bloquea con un reactivo apropiado y en la siguiente etapa se aplica la muestra que consiste en suero/plasma o el sobrenadante de hisopos nasales. Cuando el biomarcador deseado está presente en el fluido, es capturado por el anticuerpo unido a la fase sólida. En la siguiente etapa se aplica un anticuerpo con especificidad frente a otro epítopo del biomarcador y después se aplica el anticuerpo de captura. Este anticuerpo está marcado con una enzima como la fosfatasa alcalina (AP) o la peroxidasa rojiza de caballo (HRP) o con biotina. En el caso de marcaje con biotina, es necesaria otra etapa utilizando estreptavidina conjugada con AP o HRP. Después de los componentes marcados con enzimas se sigue el sustrato apropiado. Las enzimas catalizan una reacción del sustrato que se asocia con la formación de un color que puede medirse utilizando un fotómetro (lector de microplacas) a una longitud de onda definida.

Ensayo de inhibición

La proteína biomarcadora purificada se une a la fase sólida de una MTP. El fluido con presencia/concentración desconocida de biomarcador se incuba en diluciones seriadas con un anticuerpo o antisuero marcado con la enzima frente a este biomarcador. En una curva estándar, se incuban diluciones seriadas del biomarcador puro con el mismo anticuerpo o antisuero marcado con la enzima, seguido de la reacción que conduce a un sustrato coloreado que puede medirse con un fotómetro. El antígeno/biomarcador no marcado en solución compite con el antígeno/biomarcador unido a fase sólida y el grado de inhibición es una medida de la concentración del antígeno/biomarcador.

Varilla de nivel/varilla inmune/ varilla de biomarcador

El anticuerpo específico del biomarcador está unido a una varilla de papel especial. Una varilla de este tipo se puede preparar utilizando varios anticuerpos frente a diferentes biomarcadores en secuencia y se puede ofrecer como una varilla preparada lista para usar. La varilla se incubará en un tubo pequeño que contiene plasma o sobrenadante del hisopo nasal, seguido de la incubación con un anticuerpo soluble marcado con la enzima frente al biomarcador con una especificidad de epítopo diferente a la que está unida a la fase sólida. Después de una etapa de lavado, la varilla se incubará con el sustrato de la enzima conjugada. Podría ser posible incubar el biomarcador que contiene fluido, el anticuerpo marcado con la enzima y el sustrato en una sola etapa para limitar el tiempo de realización del ensayo. Después de parar la reacción, la intensidad del color se compara visualmente con una tarjeta estándar del biomarcador. Un ensayo de este tipo permite un cálculo bastante aproximado de la concentración del biomarcador, pero podría realizarse sin necesidad de adquirir costosos equipos de laboratorio.

Tecnología Evanescente (Tecnología EVA)

La tecnología de evanescencia es una tecnología de biosensor basada en fluorescencia que explota el fenómeno óptico de la reflexión interna total para crear un campo evanescente que se utiliza para excitar selectivamente los fluoróforos unidos localizados dentro de la profundidad de penetración en el fondo de cada pocillo del chip sensor. Las moléculas fluorescentes presentes en el líquido de la muestra no reciben luz y, por tanto, no emiten fluorescencia. Como resultado, la unión se puede detectar directamente sin necesidad de retirar el líquido de muestra (sin lavado). Los ensayos se basan en la bioquímica de un ELISA, pero a diferencia de ELISA, se pueden completar en 10 minutos. En el formato de un ensayo de unión bilateral para la determinación cuantitativa del biomarcador, se inmoviliza un tipo de anticuerpo en la superficie del sensor de un pocillo, que también contiene un anticuerpo conjugado con el fluoróforo de una especificidad de epítopo diferente para el biomarcador que el unido. El biomarcador en la muestra del paciente se une tanto a los anticuerpos de la superficie del pocillo como al conjugado de anticuerpo de detección marcado con fluorescencia. El resultado de la prueba es sensible al tiempo y debe medirse inmediatamente después de la aplicación de la muestra a los pocillos. Sólo las muestras positivas para el biomarcador se unen tanto a la superficie del pocillo como al anticuerpo de detección conjugado y dan una señal fluorescente positiva. Las ventajas de la prueba EVA son un volumen de muestra pequeño (~20 pL), resultados en pocos minutos (~10 min), fácil de usar - solo una etapa de pipeteo y alta sensibilidad.

El ensayo también se puede configurar como un ensayo de inhibición, donde el biomarcador recombinante está inmovilizado en la superficie del sensor y un anticuerpo conjugado contra el biomarcador también se encuentra en los pocillos en forma seca. El biomarcador, presente en los fluidos, inhibe la unión del anticuerpo conjugado al biomarcador inmovilizado. Existe una correlación inversa entre la unión del conjugado y la concentración del biomarcador en el fluido de la muestra: cuanto más biomarcador hay en la muestra, se produce menos unión del conjugado y permite sacar conclusiones sobre la concentración del biomarcador.

Tecnología de chip

Otra tecnología similar a la prueba EVA. Trabaja bajo un principio similar al del ELISA de tipo sándwich, pero con un volumen mínimo de muestra y quizás el anticuerpo de detección y la reacción del sustrato se añaden al mismo tiempo para reducir la duración de la prueba y obtener un resultado inmediato.

Matriz de perlas fluorimétricas

El ensayo utiliza 2 conjuntos de perlas (microesferas) de diferente tamaño marcadas internamente con diferentes intensidades de un colorante fluorescente. Los dos tamaños de perlas diferentes hacen posible distinguir múltiples conjuntos de perlas (por ejemplo, 20) en un canal de fluorescencia, por lo que los diferentes conjuntos de perlas que se distinguen por la intensidad del colorante interno y el tamaño de las perlas permiten la cuantificación simultánea de, por ejemplo, 20 analitos (biomarcadores) en una única muestra de pequeño volumen utilizando el mismo principio que un ELISA.

Las perlas con diferentes intensidades del colorante fluorescente están recubiertas con anticuerpos específicos para los diferentes biomarcadores deseados que se detectarán en el sistema múltiplex. Se incuba una mezcla de perlas recubiertas para cada analito a medir con las muestras o mezclas estándar. Los analitos presentes en la muestra se unen a los anticuerpos unidos a las perlas fluorescentes. De manera simultánea se añade una mezcla de anticuerpos conjugados fluorescentes y los anticuerpos específicos se unen a los analitos capturados por los primeros anticuerpos. Los anticuerpos marcados con fluorescencia que se unen al analito emiten una señal fluorescente que es detectada por un citómetro de flujo.

Ensayo de flujo lateral

La muestra que contiene el biomarcador se aplicará sobre la almohadilla de muestra de una tira de prueba de papel poroso o polímero sinterizado. Después de añadir un fluido especial, la muestra se difunde a través de la tira de prueba debido a la fuerza capilar (cromatografía en capa fina). La muestra migra con el fluido hacia una parte de la tira donde se encuentran los inmunoconjugados secos (almohadilla de conjugado). El fluido disuelve el inmunoconjugado, lo que permite la unión al antígeno (biomarcador) en la muestra, cuando está presente. El fluido continúa migrando hacia una almohadilla de captura, que contiene un anticuerpo inmovilizado específico para otra parte del antígeno/biomarcador, que se une al anticuerpo y, por lo tanto, queda inmovilizado, mientras el fluido continúa migrando. En esta etapa, el antígeno/biomarcador inmovilizado se enriquece y se puede detectar mediante la conjugación del anticuerpo inmovilizado con una enzima o colorante fluorescente.

RT-qPCR

La PCR de transcripción inversa cuantitativa (RT-qPCR) se utiliza cuando el material de partida es RNA. En este método, el RNA se transcribe primero en DNA complementario (cDNA) mediante la transcriptasa inversa a partir del RNA total o del RNA mensajero (mRNA). Después, el cDNA se utiliza como plantilla para la reacción de qPCR. RT-qPCR se utiliza en una variedad de aplicaciones que incluyen análisis de expresión genética, validación de RNAi, validación de micromatrices, detección de patógenos, pruebas genéticas e investigación de enfermedades.

Luminex

Los inmunoensayos basados en la tecnología Luminex xMAP (perfilado de multianalitos) permiten la detección y cuantificación simultánea de múltiples proteínas secretadas (citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento, etc.). Esta tecnología de alto rendimiento produce resultados comparables a los de un ELISA, pero con mayor eficacia, velocidad y un intervalo dinámico más amplio.

La tecnología xMAP de arquitectura abierta permite la multiplexación de pruebas biológicas (ensayos), lo que reduce el tiempo, la mano de obra y los costos en comparación con los métodos tradicionales tales como ELISA, transferencia de Western, PCR y matrices tradicionales. Los sistemas que utilizan la tecnología xMAP realizan ensayos discretos en la superficie de perlas codificadas por colores conocidas como microesferas, que después se leen en un analizador compacto. Utilizando múltiples láseres o LEDs y procesadores de señales digitales de alta velocidad, el analizador lee los resultados de los ensayos múltiples reportando las reacciones que ocurren en cada microesfera individual.

Debido a su robusta multiplexación, la tecnología xMAP suministra potencialmente más datos en menos tiempo que otros productos de bioensayo, con resultados comparables a ELISA y micromatrices y, por lo tanto, es menos costosa que ELISA. La tecnología ofrece otras ventajas distintivas sobre los métodos tradicionales:

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Un método para identificar un paciente con alergia al polen de gramíneas y/o abedul que responde al tratamiento con inmunoterapia alérgica (AIT) que comprende determinar in vitro en una muestra de plasma de dicho paciente alérgico el nivel de expresión de

la proteína marcadora CCL8 sola o

en combinación con una o más proteínas marcadoras seleccionadas del grupo que consiste en ITGB3, MYL6, FLNA, ACTB, KLKB1, APOA1, ITIH1, C2, SERPINA6, SHBG, GFRA2, GKN1, CCL11, BTN3A2, SIGLEC7, IL18, CHRDL2, REG4, GHRL, CXCL11, MEP1B, GSAP, CXCL5 y METAP1 D.

2. Un método para determinar la eficacia clínica de un tratamiento con AIT usando un método según la reivindicación 1.

3. Uso de la proteína marcadora CCL8 sola o en combinación con una o más proteínas marcadoras seleccionadas del grupo que consiste en ITGB3, MYL6, FLNA, ACTB, KLKB1, APOA1, ITIH1, C2, SERPINA6, SHBG, GFRA2, GKN1, CCL11, BTN3A2, SIGLEC7, IL18, CHRDL2, REG4, GHRL, CXCL11, MEP1B, GSAP, CXCL5 y METAP1 D según la reivindicación 1 en la identificación de un paciente con alergia al polen de gramíneas y/o de abedul que responde al tratamiento con AIT que comprende la determinación in vitro en una muestra de plasma de dicho paciente el nivel de expresión de dicha proteína marcadora.

4. Uso de un dispositivo de ensayo en el método según la reivindicación 1.

5. Uso de un kit en el método según la reivindicación 1, que comprende:

a) medios para determinar el nivel de expresión de una o más proteínas marcadoras según la reivindicación 1, b) una curva de control estándar o valor de control que muestra una relación entre el nivel de expresión de las proteínas marcadoras en muestras de plasma o fluido nasal y la capacidad de respuesta a la AIT de pacientes alérgicos, y

c) una muestra de control o valor de control indicativo del nivel de expresión de las proteínas marcadoras en una muestra de plasma o fluido nasal de una persona que no responde a la AIT.