ES2966593T3 - Tratamiento del cáncer y de enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a métodos para tratar enfermedades, en particular cáncer y enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias, utilizando células modificadas genéticamente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Tratamiento del cáncer y de enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias
Campo de la invención
La presente invención se refiere a células genomanipuladas para su uso en métodos para tratar enfermedades, en particular el cáncer y enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias.
Antecedentes de la invención
La terapia con linfocitos T con receptores quiméricos para antígenos (T-CAR) es un enfoque establecido y exitoso para tratar el cáncer. En el tratamiento con T-CAR, se obtiene una población de linfocitos T de un paciente o donante y se genomanipula para expresar un receptor quimérico para el antígeno (CAR, del ingléschimeric antigen receptor).El dominio extracelular de un CAR típico consiste en los dominios VH y VL, fragmento monocatenario variable (scFv), de los sitios de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal que reconoce un antígeno asociado a un tumor. El scFv está unido a un dominio transmembrana flexible seguido de un dominio de señalización intracelular con, por ejemplo, un motivo de activación basado en tirosina como el de CD3z y, opcionalmente, dominios de activación adicionales de moléculas coestimuladoras como CD28 y CD137 (41BB), que sirven para activar los linfocitos T y mejorar su supervivencia y proliferación. Los linfocitos T-CAR se administran al paciente y el CAR reconoce y se une a las células tumorales. La unión de las células cancerosas conduce a la activación de mecanismos citolíticos en los linfocitos T, que destruyen de manera específica las células cancerosas unidas. Varios ensayos preclínicos y clínicos de fase temprana destacan la eficacia de los linfocitos T con CAR para tratar a pacientes con cáncer con tumores sólidos y neoplasias malignas hematopoyéticas.
Las dificultades para el éxito del tratamiento con T-CAR incluyen la pérdida del antígeno diana de los tumores, células inmunosupresoras, tales como Treg, y células supresoras procedentes de mieloides (MDSC, del inglésmyeloidderived suppressor cells)en el microambiente tumoral, factores en el microambiente tumoral, tales como la adenosina, el potasio extracelular, y especies reactivas de oxígeno (ROS, del inglésreactive oxygen species)que pueden inhibir la actividad citolítica de los linfocitos T, y tumores que expresan quimiocinas para las cuales los linfocitos T-CAR no tienen receptores.
Se han propuesto otras células para su uso con CAR. Los linfocitos citolíticos naturales son un tipo de linfocito citotóxico que ataca de manera natural a las células infectadas por virus y a las células tumorales y pueden genomanipularse con CAR para formar células NK-CAR. El documento WO2017019848 describe el uso de otras células fagocíticas capaces de producir citotoxicidad celular, en particular macrófagos.
Las células dendríticas plasmocitoides (pDC, del inglésplasmacytoid dendritic cell)son un tipo raro de célula inmunitaria que se considera clave para unir los sistemas inmunitarios innato y adaptativo. Se sabe que secretan grandes cantidades de interferón (iFn ) de tipo I en respuesta a una infección vírica y son efectores clave en la inmunidad celular con la capacidad no solo de iniciar respuestas inmunitarias sino también de inducir tolerancia a antígenos exógenos y endógenos. Se ha propuesto el uso de células dendríticas plasmocitoides en vacunas, donde presentan antígenos y se suministran a los ganglios linfáticos para activar los linfocitos T (Charleset al.,2020,Oncology,9(1)). El documento WO2018/206577 proporciona métodos para generar poblaciones de pDC.
Sigue existiendo una necesidad en la materia de métodos mejorados para tratar el cáncer y otras enfermedades.
Sumario de la invención
Los inventores han desarrollado una inmunoterapia que utiliza las propiedades únicas de las células dendríticas plasmocitoides (pDC) para dirigirse a células específicas, mejorar o alterar las vías inmunitarias y tratar enfermedades. De acuerdo con la invención, las pDC se genomanipulan para expresar en su superficie una construcción exógena que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que reconoce un antígeno en una célula diana. El dominio de reconocimiento de antígeno extracelular permite que las pDC se dirijan de manera específica a las células y tejidos enfermos para activar las respuestas inmunitarias y tratar la enfermedad en el microambiente de la enfermedad. La naturaleza polifacética de las pDC significa que se pueden utilizar para activar diversos efectos en las respuestas inmunitarias mediante la secreción de citocinas proinflamatorias o factores inhibidores, o el reclutamiento y activación de células inmunitarias, tales como Treg o linfocitos citotóxicos. Como consecuencia de ello, se espera que las pDC ejerzan efectos poderosos y generalizados, incluso en microambientes de enfermedades que refractan la respuesta inmunitaria deseada. Las pDC también pueden ser capaces de presentar antígenos a las células inmunitarias y pueden realizar la destrucción directa de células diana mediada por TRAIL.
En determinadas realizaciones, la construcción exógena también comprende un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que activa una respuesta inmunitaria en la célula cuando el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular se une a la célula diana. Dichas construcciones permiten que se activen respuestas inmunitarias personalizadas tras la unión del dominio de reconocimiento al antígeno diana.
Los ejemplos demuestran que las pDC pueden expresar construcciones exógenas que comprenden un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular y otros dominios. Las pDC mantienen su funcionalidad y respuesta de IFN de tipo I y se pueden utilizar para reconocer con éxito las células diana, unirse y posteriormente activar una respuesta inmunitaria.
Por consiguiente, la invención proporciona una célula dendrítica plasmocitoide genomanipulada para su uso en un método para tratar una enfermedad en un sujeto, en donde el método comprende administrar la célula genomanipulada al sujeto, en donde la célula expresa en su superficie una construcción exógena que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que reconoce un antígeno en una célula diana, y en donde la célula activa una respuesta inmunitaria cuando el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular se une a la célula diana.
La invención también proporciona una célula dendrítica plasmocitoide genomanipulada que expresa en su superficie una construcción exógena que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que reconoce un antígeno en una célula diana.
En realizaciones preferidas, la construcción exógena comprende además un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que activa una respuesta inmunitaria en la célula cuando el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular se une a la célula diana.
En realizaciones preferidas, las células de la invención se utilizan en el tratamiento del cáncer o de una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria. Se espera que la capacidad de las pDC para secretar factores inmunomoduladores y alterar entornos inflamatorios o inmunoinhibidores sea particularmente útil para tratar dichas enfermedades, donde las células que provocan la enfermedad residen y se mantienen en microambientes inmunitarios particulares. Además, las células cancerosas, los linfocitos T autorreactivos y los autoantígenos presentan antígenos específicos que se pueden reconocer por el dominio de reconocimiento de antígenos extracelular para proporcionar un tratamiento dirigido. El tratamiento de enfermedades inflamatorias y el rechazo de trasplantes también se beneficiarán de las pDC que son capaces de dirigirse de manera específica al tejido enfermo.
En realizaciones preferidas, la construcción es un receptor quimérico para el antígeno (CAR) o un receptor Notch sintético. Dichas construcciones se pueden dirigir de manera eficaz a células específicas utilizando sus dominios de reconocimiento de antígenos extracelulares y pueden proporcionar respuestas inmunitarias personalizadas con sus dominios de señalización intracelular.
En realizaciones preferidas, la respuesta inmunitaria activada comprende la secreción de citocinas, tales como citocinas proinflamatorias o antiinflamatorias.
En realizaciones preferidas adicionales, la respuesta inmunitaria comprende el reclutamiento o activación de células inmunitarias del hospedador, tales como Treg o linfocitos citotóxicos. Esto puede incluir la presentación de antígenos a las células inmunitarias del hospedador por parte de la pDC.
La pDC también puede realizar la destrucción directa de células diana mediada por TRAIL.
En realizaciones preferidas, la pDC es una célula dendrítica plasmocitoide procedente de células madre (SC-pDC, del inglésstem cell-derived plasmacytoid dendritic cell).Dichas células se pueden generar a partir de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC, del ingléshematopoietic stem and progenitor cells),que se pueden obtener de un paciente o de un donante. Las HSPC se pueden genomanipular con la construcción exógena antes de la diferenciación en SC-pDC.
En realizaciones especialmente preferidas, la invención proporciona una célula genomanipulada para su uso en un método de tratamiento del cáncer en un sujeto, en donde el método comprende administrar la célula genomanipulada al sujeto, en donde la célula expresa en su superficie un receptor quimérico para el antígeno exógeno que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que reconoce un antígeno en una célula diana, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que activa una respuesta inmunitaria en la célula cuando el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular se une a la célula diana, en donde la célula es una célula dendrítica plasmocitoide procedente de células madre.
En realizaciones especialmente preferidas adicionales, la invención proporciona una célula genomanipulada para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto, en donde el método comprende administrar la célula genomanipulada al sujeto, en donde la célula expresa en su superficie un receptor quimérico para el antígeno exógeno que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que reconoce un antígeno en una célula diana, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que activa una respuesta inmunitaria en la célula cuando el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular se une a la célula diana, en donde la célula es una célula dendrítica plasmocitoide procedente de células madre.
De modo similar, en realizaciones especialmente preferidas, la invención proporciona una célula dendrítica plasmocitoide procedente de células madre genomanipulada que expresa un receptor quimérico para el antígeno exógeno que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que reconoce un antígeno en una célula diana, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que activa una respuesta inmunitaria en la célula cuando el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular se une a la célula diana.
En realizaciones especialmente preferidas adicionales, la invención proporciona una célula genomanipulada para su uso en un método de tratamiento del cáncer en un sujeto, en donde el método comprende administrar la célula genomanipulada al sujeto, en donde la célula expresa un receptor Notch sintético exógeno que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que reconoce un antígeno en una célula diana, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, tal como un factor de transcripción, que activa una respuesta inmunitaria en la célula cuando el dominio de reconocimiento del antígeno extracelular se une a la célula diana, en donde la célula es una célula dendrítica plasmocitoide procedente de células madre.
En realizaciones especialmente preferidas adicionales, la invención proporciona una célula genomanipulada para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto, en donde el método comprende administrar la célula genomanipulada al sujeto, en donde la célula expresa un receptor Notch sintético exógeno que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que reconoce un antígeno en una célula diana, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que activa una respuesta inmunitaria en la célula cuando el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular se une a la célula diana, en donde la célula es una célula dendrítica plasmocitoide procedente de células madre.
De modo similar, en realizaciones especialmente preferidas, la invención proporciona una célula dendrítica plasmocitoide procedente de células madre genomanipulada que expresa un receptor Notch sintético exógeno que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que reconoce un antígeno en una célula diana, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que activa una respuesta inmunitaria en la célula cuando el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular se une a la célula diana.
La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de una célula dendrítica plasmocitoide genomanipulada descrita en el presente documento y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La invención también proporciona células dendríticas plasmocitoides genomanipuladas para su uso en el tratamiento de enfermedades, tal como para su uso en el tratamiento del cáncer o una enfermedad inflamatoria o autoinmunitaria.
La invención también proporciona el uso de células dendríticas plasmocitoides genomanipuladas de la invención en la preparación de un medicamento para tratar enfermedades, tal como un medicamento para tratar el cáncer o una enfermedad inflamatoria o autoinmunitaria.
En realizaciones adicionales, la invención proporciona un método para producir una célula dendrítica plasmocitoide (pDC) genomanipulada que comprende:
- proporcionar células madre progenitoras madre hematopoyéticas (HSPC)
- transformar dichas HSPC con una construcción exógena que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que reconoce un antígeno en una célula diana,
- incubar dichas HSPC en uno o más medios, medios que normalmente pueden comprender una o más citocinas, factores de crecimiento, interferones (IFN) y/o antagonistas del receptor de arilhidrocarburo (AHR, del inglésaryl hydrocarbon receptor)(tales como stemregenina-1), por lo que dichas HSPC se diferencian en pDC precursoras y en pDC.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona un método para producir una célula dendrítica plasmocitoide (pDC) genomanipulada que comprende:
- proporcionar células madre progenitoras hematopoyéticas (HSPC),
- incubar dichas HSPC en uno o más medios, medios que normalmente pueden comprender una o más citocinas, factores de crecimiento, interferones (IFN) y/o antagonistas del receptor de arilhidrocarburo (AHR) (tales como stemregenina-1), por lo que dichas HSPC se diferencian en pDC precursoras y en pDC.
- transformar dichas pDC con una construcción exógena que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que reconoce un antígeno en una célula diana.
Breve descripción de las figuras
Figura 1- SC-pDC que expresa un receptor quimérico para el antígeno (CAR) que reconoce una célula tumoral.
El CAR reconoce un antígeno asociado a tumores (TAA, del ingléstumour-associated antigen)específico a través de un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular. La unión de las SC-pDC con CAR al TAA conduce a la activación de la pDC a través de un dominio de señalización en el CAR, lo que da como resultado la secreción de citocinas proinflamatorias e interferón por parte de la pDC, lo que promueve respuestas antitumorales.
Figura 2 -SC-pDC que expresa un receptor Notch sintético (synNotch) que reconoce una célula tumoral.
Cuando el receptor se une a una molécula específica, por ejemplo, una molécula asociada a un tumor, se induce una respuesta inmunitaria sintética personalizada específica en las SC-pDC, lo que permite respuestas directamente personalizadas.
Figura 3 -Estructura de un receptor synNotch.El receptor synNotch comprende un dominio de reconocimiento extracelular personalizado (por ejemplo, scFv), una región reguladora central (controla la proteólisis/escisión) y un factor de transcripción citoplasmático personalizado (por ejemplo, Gal4-VP64). El elemento de respuesta personalizado con elementos de reconocimiento del factor de transcripción activa la expresión de un gen personalizado. El sistema proporciona control de la respuesta específica activada en la célula mediante la regulación directa de un programa transcripcional personalizado.
Figura 4 -Infusión de SC-pDC con CAR a un paciente con cáncer.Las SC-pDC que expresan un CAR se inyectan en un paciente. Las SC-pDC con CAR se alojarán en el sitio del tumor y, tras el reconocimiento del antígeno tumoral específico, se activarán y secretarán citocinas proinflamatorias e interferones. Esto, a su vez, promoverá el tráfico de linfocitos T citotóxicos (CTL) al sitio del tumor. Asimismo, el ambiente proinflamatorio suprimirá el entorno inmunoinhibidor que generan las células tumorales, transformando un tumor "frío" en uno "caliente" y promoviendo respuestas antitumorales.
Figura 5- Proceso ilustrativo para generar y administrar SC-pDC con CAR para el tratamiento dirigido contra el cáncer.El genCARse puede insertar en HSPC CD34+ mediante transducción lentivírica o mediante el sistema CRISPR con administración de donante mediada por AAV6 (como se muestra en la figura). Las HSPC CD34+ que expresan CAR se diferencian posteriormente en SC-pDC. Las SC-pDC con CAR pueden inyectarse directamente en el paciente para inducir respuestas antitumorales o crioconservarse para múltiples regímenes de vacunas.
Figura 6 -Diferentes respuestas inmunitarias se activaron en SC-pDC dependiendo del dominio intracelular en el CAR.Dependiendo del dominio intracelular en el CAR, se puede activar una amplia variedad de respuestas inmunitarias en SC-pDC. Los dominios intracelulares inmunitarios (tales como MyD88, CD137 y CD40) pueden inducir la activación de SC-pDC y, por ejemplo, la producción de IFN de tipo I o proteínas proinflamatorias, promover la supervivencia y promover la presentación de antígenos. Además, los dominios intracelulares tolerogénicos (tales como CD85g, PDL-1 y ICOS-L) pueden inducir funciones tolerogénicas de las SC-pDC, incluida la tolerancia a los linfocitos T os.
Figura 7 -Un CAR convencional se puede expresar en SC-pDC.A) Esquema de un CAR anti-CD19 convencional de 2.a generación. La construcción contiene los dominios intracelulares 4-IB<b>y CD3z. En los linfocitos T, la expresión de la construcción CAR permitirá que las células provoquen una respuesta de linfocitos T al unirse a CD19. Asimismo, los brazos de homología dirigidos contra el locus de puerto seguro CCR5 flanquean la construcción. Esto permite que el CAR se inserte de forma segura en este gen mediante la reparación dirigida por homología (HDR, del ingléshomology directed repair)mediada por CRISPR/Cas9.
B) Diagrama de flujo representativo que muestra la expresión de CAR anti-CD19 en SC-pDC. C) Diagrama de columnas que muestra el porcentaje de SC-pDC con CAR+ anti-CD19 para tres donantes.
Figura 8- Respuesta de IFN de tipo I de las SC-pDC modificadas genéticamente mediante CRISPR/Cas9 para expresar un CAR-CD19.
Las SC-pDC cebadas, donde el 30 % de las células expresan un CAR anti-CD19 (RNP donante), o las SC-pDC que no expresan la construcción (simulado donante), se estimularon durante 20 horas con agonistas dirigidos contra TLR7 (R837), TLR9 (CpGA) o permanecieron sin estimular (SE).
Posteriormente se recogieron los sobrenadantes y se evaluó el IFN de tipo I bioactivo utilizando un bioensayo de IFN de tipo I disponible comercialmente (bioensayo indicador de IFN de tipo I HEK-blue).
Figura 9 -Respuesta de citocinas de SC-pDC modificadas para expresar un CAR.
Las SC-pDC se cebaron durante tres días en medio complementado con IFN de tipo I y II (A) o se dejaron sin cebar (B). Posteriormente, las células se cultivaron conjuntamente con la estirpe celular diana CD19+ (NALM-6) en una proporción efector:diana de 1:1. También se sembraron células diana sin células efectoras (0:1) para excluir un posible ruido de fondo. Después de 20 horas, se recogieron los sobrenadantes y se cuantificaron los niveles de las citocinas IFN-p, IL-6, CXCL10 y TNF-a mediante un ensayo de citocinas múltiple de Mesoscale (MSD). Los datos son de un donante.
Figura 10 -Esquema que muestra la generación de SC-pDC con synNotch mediante cotransducción lentivírica del receptor synNotch y el elemento de respuesta synNotch en células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC), seguido de la diferenciación de las células madre en SC-pDC.T ras el reconocimiento de una célula diana por las SC-pDC con synNotch (mediante la unión del receptor synNotch a su antígeno afín), las SC-pDC con synNotch se activarán, lo que da resultado la transcripción de un gen específico de interés, por ejemplo interleucina 12 (IL-12). "U-pDC" es un término alternativo que también se utiliza para referirse a SC-pDC.
Figura 11- Esquema que muestra el receptor synNotch dirigido a CD19 y el elemento de respuesta IL-12
Figura 12 -Expresión del elemento de respuesta en SC-pDC.Niveles de expresión del receptor synNotch y del elemento de respuesta synNotch en SC-pDC. "U-pDC" es un término alternativo que también se utiliza para referirse a SC-pDC.
Figura 13- Las pDC con synNotch se unen a las células diana, lo que da como resultado la secreción de IL-12.
Cultivo conjunto de SC-pDC con synNotch cebadas o no cebadas con células diana y análisis de la actividad del receptor synNotch (secreción de IL12). Las SC-pDC con synNotch (cebadas o no cebadas) se cultivaron conjuntamente con células diana CD19+ (NALM6 o REH6) o células no diana negativas para CD19 (K562) o se cultivaron sin células (solas). La proporción de células diana:efectoras fue de 5:1 (5 veces más células diana). Los sobrenadantes se recogieron 24 horas después y se evaluó la activación del elemento de respuesta synNotch mediante el análisis de los niveles de IL-12 mediante ELISA. "U-pDC" es un término alternativo que también se utiliza para referirse a SC-pDC.
Figura 14 -Expresión del receptor synNotch y elemento de respuesta en SC-pDC cebadas.Las HSPC se descongelaron y se expandieron previamente a baja densidad. Después de 3 días de cultivo, las HSPC se transdujeron junto con construcciones synNotch y posteriormente se diferenciaron en SC-pDC. Después de 16 días de cultivo, las pDC se aislaron y se cebaron antes de que se evaluara la expresión del receptor synNotch y del elemento de respuesta en las pDC (linaje negativo, negativo para CD11c, células CD303+). Los datos mostrados son para un donante. "U-pDC" es un término alternativo que también se utiliza para referirse a SC-pDC.
Figura 15- Activación de SC-pDC tras el reconocimiento de células diana CD19+.Se cultivaron 100.000 SC-pDC cebadas junto con células diana CD19+ NALM6 o REH6, o las células no diana K562 (control), en una proporción de 1:1 y 1:3 efector:diana. Los sobrenadantes se recogieron 20 horas después de la estimulación y se analizaron los niveles de IL12 mediante ELISA. Los datos mostrados son para un donante y triplicados biológicos. "U-pDC" es un término alternativo que también se utiliza para referirse a SC-pDC.
Figura 16 -Expresión del receptor synNotch y elemento de respuesta en SC-pDC cebadas.Las HSPC se descongelaron y se expandieron previamente a baja densidad. Después de 3 días de cultivo, las HSPC se transdujeron junto con construcciones synNotch y posteriormente se diferenciaron en SC-pDC. Después de 16 días de cultivo, Las SC-pDC se aislaron y se cebaron antes de que se evaluara la expresión del receptor synNotch y del elemento de respuesta en las SC-pDC (linaje negativo, negativo para CD11c, células CD303+). Los datos mostrados son para un donante. "U-pDC" es un término alternativo que también se utiliza para referirse a SC-pDC.
Figura 17 -Activación de SC-pDC tras el reconocimiento de células diana CD19+.Se cultivaron 100.000 SC-pDC cebadas junto con células diana CD19+ NALM6 o REH6, o las células no diana K562 (control), en una proporción de 1:1, 1:2, 1:4 y 1:8 efector:diana. Los sobrenadantes se recogieron 20 horas después de la estimulación y se analizaron los niveles de IL12 mediante ELISA. Los datos mostrados son para un donante y triplicados biológicos. "U-pDC" es un término alternativo que también se utiliza para referirse a SC-pDC.
Descripción detallada de la invención
Construcciones que comprenden dominios de reconocimiento de antígenos extracelulares
La invención proporciona células dendríticas plasmocitoides genomanipuladas que expresan en su superficie una construcción exógena que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que reconoce un antígeno en una célula diana y el uso de dichas células para tratar una enfermedad, en donde la célula activa una respuesta inmunitaria cuando el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular se une a la célula diana. Las construcciones exógenas permiten que las células reconozcan y se unan a células diana específicas y activen respuestas inmunitarias al unirse. En realizaciones preferidas, la construcción exógena comprende además un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que activa una respuesta inmunitaria en la célula cuando el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular se une a la célula diana.
En algunas realizaciones, la construcción exógena es una construcción vírica. En algunas realizaciones, la construcción vírica es una construcción AAV, una construcción adenovírica, una construcción lentivírica o una construcción retrovírica.
En algunas realizaciones, la construcción exógena se integra en el genoma de la célula genomanipulada. En algunas realizaciones, la construcción exógena no está integrada en el genoma de la célula genomanipulada. En algunas realizaciones, la construcción exógena se introduce mediante una transposasa, retrotransposasa, plásmido episómico, ARNm o integración aleatoria. Preferentemente, la construcción exógena se introduce con un sistema de edición de genes, tal como TALEN, dedos de zinc o, más preferentemente, CRISPR/Cas9. En realizaciones preferidas adicionales, la construcción exógena se introduce mediante transducción con un vector vírico, tal como un vector lentivírico.
El término exógeno, tal como se utiliza en el presente documento, tiene su significado normal. En concreto, la construcción exógena es una construcción que se ha introducido en la célula y que no está presente en una célula no modificada en la misma configuración o ubicación. La construcción exógena se puede construir con secuencias endógenas (preferentemente humanas).
Cada dominio puede ser heterogéneo, es decir, compuesto por secuencias procedentes de diferentes cadenas de proteínas.
El dominio de reconocimiento de antígeno extracelular reconoce un antígeno en una célula diana y se puede genomanipular o seleccionar de acuerdo con el uso terapéutico o la célula diana deseada. En algunas realizaciones, el dominio de reconocimiento de antígeno es un anticuerpo o fragmento del mismo, por ejemplo, un Fab, Fab', Fv, F(ab')2, dAb o, preferentemente, uno o más anticuerpos de dominio único ("nanocuerpos") o uno o más fragmentos de anticuerpos de monocatenarios ("scFv"). Un scFv es un fragmento de anticuerpo monocatenario que tiene las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo unidas entre sí. Un anticuerpo de dominio único, también conocido como nanocuerpo, es un fragmento de anticuerpo que consiste en un único dominio de anticuerpo variable monomérico. Los scFv y los nanocuerpos son útiles en los receptores quiméricos para antígenos porque pueden genomanipularse para expresarse como parte de una cadena única junto con los otros componentes del<c>A<r>.
El dominio de reconocimiento de antígeno extracelular generalmente reconocerá un antígeno de la superficie celular. En determinadas realizaciones, por ejemplo, cuando se utiliza para tratar el cáncer, el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular reconocerá y se unirá de manera específica a un antígeno asociado a un tumor, que es un antígeno que se expresa exclusivamente en células tumorales o que se expresa en un nivel más elevado por las células tumorales en relación con las células sanas. En determinadas realizaciones, por ejemplo, cuando se utiliza para tratar una enfermedad autoinmunitaria, el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular reconocerá y se unirá de manera específica a un autoantígeno al que se dirigen las células inmunitarias autorreactivas patógenas subyacentes a la enfermedad autoinmunitaria. En determinadas realizaciones, por ejemplo, cuando se utiliza para tratar una enfermedad inflamatoria, el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular reconocerá y se unirá de manera específica a un antígeno que es específico de tejido y se expresa en la superficie de células de un tejido particular, tal como un tejido que está inflamado, un tejido trasplantado o tejido que está dañado o en riesgo de sufrir daño debido a la inflamación.
En determinadas realizaciones, el reconocimiento del antígeno extracelular es biespecífico o multiespecífico, con especificidad para más de una diana de interés.
El dominio de reconocimiento de antígeno extracelular reconoce un antígeno en una célula diana. Por tanto, el antígeno puede ser un antígeno diana. En determinadas realizaciones, el dominio se une de manera específica al antígeno y muestra una unión significativa a cualquier otro antígeno, o muestra una unión significativamente más fuerte al antígeno diana que cualquier otro antígeno.
En realizaciones preferidas, el antígeno reconocido por el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular es un antígeno tumoral, preferentemente un antígeno de superficie asociado a tumor. En determinadas realizaciones, el antígeno tumoral se selecciona del grupo que consiste en 5T4, alfafetoproteína (AFP), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), BCMA, gonadotropina coriónica humana B, CA-125, antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno carcinoembrionario (CEA), CD123, CD133, CD138, CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD25, CD30, CD33, CD34, CD4, CD40, CD44, C<d>56, CD70, CD8, CLL-1, c-Met, antígeno específico del CMV, CS-1, CSPG4, CTLA-4, DLL3, disialogangliósido GD2, mucina ductal-epitelial, antígeno específico del EBV, variante III de EGFR (EGFRvIII), ELF2M, endoglina, efrina B2, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), molécula de adhesión a células epiteliales (EpCAM), antígeno tumoral epitelial, ErbB2 (HER2/neu), proteína asociada a fibroblastos (fap), FLT3, proteína de unión al folato, GD2, GD3, antígeno asociado a glioma, glucoesfingolípidos, gp36, antígeno específico del HBV, antígeno específico del HCV, HER1, HER2, HER2-HER3 en combinación, HERV-K, antígeno asociado a melanoma de elevado peso molecular (HMW-MAA), glucoproteína gp41 de la envoltura del VIH-1, antígeno específico del HPV, transcriptasa inversa, telomerasa humana, receptor de IGFI, IGF-II, IL-11R a, IL-13R-a2, antígeno específico del virus de la gripe, CD38, factor de crecimiento de insulina (IGFI)-I, carboxilo esterasa intestinal, cadena kappa, LAGA-1a, cadena lambda, antígeno específico del virus Lasse, AFP sensible a lectina, antígeno específico de estirpe o específico de tejido, tal como CD3, MAGE, MAGE-A1, molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) que presenta un epítopo peptídico específico de tumor, M-CSF, antígeno asociado a melanoma, mesotelina, MN-Ca IX, MUC-1, mut hsp70-2, p53 mutado, p53 mutado, ras mutado, elastasa de neutrófilos, NKG2D, Nkp30, NY-ESO-1, p53, PAP, prostasa, antígeno específico prostático (AEP), antígeno tumoral del carcinoma de próstata 1 (PCTA-1), proteína del antígeno prostático específico, STEAP1, STEAP2, PSMA, RAGE-1, ROR1, RU1, RU2 (AS), molécula de adhesión superficial, survivina, telomerasa, TAG-72, el dominio extra A (EDA) y dominio extra B (EDB) de fibronectina y el dominio A l de tenascina C (T nC Al), tiroglobulina, antígenos tumorales del estroma, receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2), antígeno de superficie específico de virus, tal como un antígeno específico del VIH (tal como gpl20 de VIH), así como cualquier derivado o variante de estos marcadores de superficie.
En realizaciones preferidas, el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular reconoce un antígeno seleccionado del grupo que consiste en BCMA, CD19, CLL1, CS1, STEAP1, STEAP2, CD70 y CD20. En algunas realizaciones, el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular se dirige específicamente a CD19.
En realizaciones preferidas adicionales, el antígeno reconocido por el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular es un autoantígeno asociado con la enfermedad autoinmunitaria a tratar. Los antígenos ilustrativos a los que se dirigirá incluyen (con la enfermedad asociada a tratar entre paréntesis): GAD65 (diabetes de tipo 1), proteína 2 asociada a insulinoma, IA-2 (diabetes de tipo 1), peroxidasa tiroidea, TPO (enfermedades autoinmunitarias de la tiroides, Hashimoto y Graves), receptor de tirotropina, TSHR (enfermedades autoinmunitarias de la tiroides, Hashimoto y Graves), receptor de la hormona adrenocorticotrópica, ACTHR (insuficiencia suprarrenal de Addison), 21-hidroxilasa (insuficiencia suprarrenal de Addison), 17-a-hidroxilasa (ooforitis), enzima de escisión de cadena lateral P450 (ooforitis), antígenos de esperma (orquitis), proteína citosólica pituitaria (hipofisitis linfocítica), receptor sensible de calcio, CaSR (hipoparatiroidismo autoinmunitario), proteína 5 que contiene dominios NACHT LRR y PYD, NALP5 (hipoparatiroidismo autoinmune), cadena a 3 del colágeno de tipo IV (enfermedad de Goodpasture), miosina (miocarditis autoinmunitaria), receptor de fosfolipasa A2 de tipo M, PLA2R (nefropatía membranosa), citocromo P450 1A2 (hepatitis autoinmunitaria), isoforma 5 de tropomiosina, hTM5 (colitis ulcerosa), glucoproteína 2 de la membrana del gránulo del zimógeno principal, GP2 (enfermedad de Crohn), proteína básica de mielina, MBP (esclerosis múltiple), glucoproteína de oligodendrocitos de mielina, MOG (esclerosis múltiple), receptor nicotínico de acetilcolina, AChR (miastenia grave), acuaporina-4, AQP4 (neuromielitis óptica).
Cuando se utiliza para tratar una enfermedad inflamatoria, el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular en la construcción exógena se selecciona para dirigirse al órgano afectado, tal como páncreas o el islote de Langerhans, riñón, corazón, pulmón, hígado, intestino, piel o articulaciones. Los antígenos ilustrativos a los que se dirigirá incluyen (con el órgano asociado entre paréntesis): GAD65 (páncreas o islote de Langerhans), proteína 2 asociada al insulinoma, IA-2, (páncreas o islote de Langerhans), receptor A2 de tipo M de fosfolipasa, PLA2R (riñón), miosina (corazón), cadena a 3 de colágeno de tipo IV (pulmón), citocromo P4501A2 (hígado), glucoproteína 2 de la membrana del gránulo del zimógeno principal, GP2 (intestino), isoforma 5 de tropomiosina, hTM5 (intestino), antígeno carcinoembrionario, CEA (intestino).
Cuando se utiliza para tratar el rechazo de trasplantes, el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular en la construcción exógena se selecciona para dirigirse al órgano afectado, tal como páncreas o el islote de Langerhans, riñón, corazón, pulmón, hígado o intestino. Los antígenos ilustrativos a los que se dirigirá incluyen (con el órgano asociado entre paréntesis): GAD65 (páncreas o islote de Langerhans), proteína 2 asociada al insulinoma, IA-2, (páncreas o islote de Langerhans), receptor A2 de tipo M de fosfolipasa, PLA2R (riñón), miosina (corazón), cadena a 3 de colágeno de tipo IV (pulmón), citocromo P450 1A2 (hígado), glucoproteína 2 de la membrana del gránulo del zimógeno principal, GP2 (intestino), isoforma 5 de tropomiosina, hTM5 (intestino), antígeno carcinoembrionario, CEA (intestino). De manera alternativa, el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular en la construcción exógena puede dirigirse a moléculas HLA, que podría ser particularmente eficaz en el contexto del trasplante de HLA diferente, porque el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular reconocerá únicamente el órgano trasplantado.
El dominio de señalización intracelular activa una respuesta inmunitaria en la célula cuando el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular se une a la célula diana. La respuesta inmunitaria puede ser inflamatoria o antiinflamatoria, dependiendo del uso terapéutico deseado.
En realizaciones preferidas, la respuesta inmunitaria activada en la célula es la secreción de citocinas. Dependiendo del efecto terapéutico deseado y del contexto, las citocinas pueden incluir citocinas homeostáticas, quimiocinas, citocinas proinflamatorias, citocinas antiinflamatorias, efectores y/o proteínas de fase aguda. Por ejemplo, las citocinas homeostáticas, incluida la interleucina (IL) 7 y la IL-15, promueven la supervivencia y proliferación de las células inmunitarias, y las citocinas proinflamatorias pueden promover una respuesta inflamatoria, que puede ser útil en el tratamiento contra el cáncer. Ejemplos de citocinas homeostáticas incluyen, pero sin limitación, IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-15 e interferón (IFN) gamma. Ejemplos de citocinas proinflamatorias incluyen, pero sin limitación, IL-1 a, IL-1b, IL-6, IL-13, IL-17a, factor de necrosis tumoral (TNF)-a, TNF p, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) 2, factor estimulante de las colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF, del inglésgranulocyte macrophage colony-stimulating factor),molécula de adhesión intercelular soluble 1 (sICAM-1), molécula de adhesión vascular soluble 1 (sVCAM-1), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), VEGF-C, VEGF-D y factor de crecimiento placentario (PLGF). Ejemplos de efectores incluyen, pero sin limitación, granzima A, granzima B, ligando de Fas soluble (sFasL) y perforina. Los ejemplos de proteínas de fase aguda incluyen, pero sin limitación, proteína reactiva C (PCR) y amiloide A sérico (SAA). Las citocinas preferidas expresadas después de la activación del dominio de señalización intracelular incluyen IFNa, IFNp, IFNA, TNFa, IL-6, CXCL9, CXCL10 y/o CXCL11.
En determinadas realizaciones, la respuesta inmunitaria activada comprende destrucción mediada por TRAIL.
En determinadas realizaciones, la respuesta inmunitaria activada comprende la expresión de inhibidores del punto de control.
En determinadas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende uno o más dominios estimuladores o coestimuladores procedentes de una molécula seleccionada del grupo que consiste en 4-1BB/CD137, B7-H3, BAFFR, BLAME (SLAMF8), BTLA, CD33, CD45, CD100 (SEMA4D), CD103, CD134, CD137, CD154, CD16, CD160 (BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD22, CD247, CD27, CD276 (B7-H3), CD28, CD29, CD3 (a; P; 8; e;<y>; Z), CD30, CD37, CD4, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD5, CD64, CD69, CD7, CD80, ligando CD83, CD84, CD86, CD8a, CD8p, CD9, CD96 (Tactile), CD1-1a, CD1-1b, CD1-1c, GDI-1d, CDS, CEACAM1, CRT AM, DAP-10, DNAM1 (CD226), receptor Fc y, GADS, GITR, HVEM (LIGHTR), IA4, ICAM-1, ICAM-1, ICOS, Ig a (CD79a), IL2R P, IL2R y, IL7R a, integrina, 1TGA4, 1TGA4, 1TGA6, 1TGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2, LAT, LFA-1, LFA-1, LIGHT, LIGHT (miembro 14 de la superfamilia del factor de necrosis tumoral; TNFSF14), LTBR, Ly9 (CD229), antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos (LFA-1 (CD1 1a/CD18), molécula MHC de clase I, NKg 2c , NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80 (KLRF1), 0X40, PAG/Cbp, PD-1, PSGL1, SELPLG (CD162), molécula de activación linfocítica de señalización, SLAM (SLAMF1; CD150; IPO-3), SLAMF4 (CD244; 2B4), SLAMF6 (NTB-A; Lyl08), SLAMF7, SLP-76, TNF, TNFr, TNFR2, receptor de ligando Toll, TRANCE/RANKL, VLA1 y VLA-6, o fragmentos, truncamientos o combinaciones de los mismos. El dominio de señalización intracelular que comprende los dominios anteriores será particularmente útil para tratar el cáncer.
Los dominios de señalización intracelular preferidos incluyen CD3z, CD40, MyD88 (ATIR), MyD88, CD300a, CD300c, CD137 (4-1BB), DAP-10, DAP-12, FCGR2, FCERG, TLR1 (TIR), TLR7 (TIR), TLR9 (TIR), CD335 (NKp46), CD158 (KIR2DL), CD19 y FKBPv36 (inducible). .
En determinadas realizaciones, en particular para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias y enfermedades inflamatorias, el dominio de señalización intracelular activa una respuesta tolerogénica o antiinflamatoria. En dichas realizaciones, el dominio de señalización intracelular puede comprender un dominio procedente de una molécula seleccionada del grupo que consiste en CD85g, CD275, CD279, CD303, CD305 e IL10R.
En determinadas realizaciones, la respuesta inmunitaria que se activa es el reclutamiento de células inmunitarias, tales como Treg (en particular para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias) o linfocitos citotóxicos (en particular para el tratamiento del cáncer).
En realizaciones preferidas, la construcción exógena es un receptor quimérico para el antígeno (CAR). Los CAR comprenden un dominio extracelular de reconocimiento de antígeno, que generalmente es un scFv con especificidad por un antígeno de la superficie celular particular, tal como un antígeno tumoral, y que está directa o indirectamente unido a un dominio de señalización intracelular. El dominio de señalización intracelular puede comprender dominios separados, tal como uno o más dominios coestimuladores y/o uno o más dominios activadores. Los componentes pueden disponerse en cualquier orden. En algunas realizaciones, un CAR se genomanipula de manera que el dominio coestimulador se exprese como una cadena polipeptídica separada. Los CAR preferidos comprenden dominios de reconocimiento de antígenos extracelulares y dominios de señalización intracelular como se describió anteriormente.
En realizaciones preferidas adicionales, la construcción exógena es un receptor Notch sintético (synNotch, del ingléssynthetic Notch).Los receptores synNotch comprenden un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular, que puede ser un scFv con especificidad por un antígeno de la superficie celular particular, tal como un antígeno tumoral, un dominio transmembrana, que controla la proteólisis y la escisión, y un dominio de señalización intracelular, que puede ser un factor de transcripción. La unión del dominio de reconocimiento del antígeno libera el factor de transcripción, que puede dirigirse a un elemento de respuesta con elementos de reconocimiento para el factor de transcripción e impulsar la expresión de un gen o conjunto de genes, activando así una respuesta inmunitaria. Los receptores synNotch permiten personalizar la respuesta inmunitaria activada por la construcción para lograr el efecto terapéutico deseado mediante el impulso de la expresión de cualquier gen o conjunto de genes. El sistema también puede multiplexarse con múltiples dominios de factores de transcripción y/o elementos de respuesta.
En realizaciones en donde la construcción exógena es un receptor Notch sintético (synNotch), la célula genomanipulada generalmente también comprende un elemento de respuesta que se activa mediante el dominio de señalización intracelular, que preferentemente es un factor de transcripción (tal como, por ejemplo, Gal4-VP64, Gal4-VP16, TetR-VP64, LacI-VP64 y similares, o tales como Gal4-VP64, Gal4-VP16, Gal4-VPR, TetR-VP64, LacI-VP64 y similares). Un factor de transcripción preferido es Gal4-VP64. El elemento de respuesta está operativamente unido a un gen que media la respuesta inmunitaria activada por la construcción. El elemento de respuesta y el gen pueden estar integrados en el genoma o presentes en un vector, tal como un plásmido. El elemento de respuesta y el gen pueden introducirse mediante cualquier técnica adecuada, tal como por transposasa, retrotransposasa, plásmido episomal o integración aleatoria. Preferentemente, el elemento de respuesta se introduce con un sistema de edición de genes, tal como TALEN, dedos de zinc o, más preferentemente, CRISPR/Cas9. En realizaciones preferidas adicionales, el elemento de respuesta se introduce mediante transducción lentivírica. Los receptores synNotch preferidos comprenden dominios de reconocimiento de antígenos extracelulares descritos anteriormente. Los receptores synNotch preferidos comprenden dominios de señalización intracelular, tales como factores de transcripción, que activan la expresión de las citocinas descritas anteriormente, o las moléculas estimulantes descritas anteriormente. En determinadas realizaciones, el elemento de respuesta codifica TRAIL, un inhibidor del punto de control, tal como PDL1, IL-12 o IFN de tipo I. En realizaciones preferidas, se activa la expresión de PD-L1 o IL10. En realizaciones preferidas adicionales, se activa la expresión de IL12.
Un genNotchpreferido esNOTCH1.Los genesNotchalternativos incluyenNOTCH2,NOTCH3 e NOTCH4.
La construcción exógena comprende un dominio transmembrana que une el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular y el dominio de señalización intracelular. El dominio transmembrana puede proceder del dominio transmembrana de 4-1BB/CD137, una cadena a de un receptor de linfocitos T, una cadena p de un receptor de linfocitos T, una cadena<y>de un receptor de linfocitos T, una cadena 8 de un receptor de linfocitos T, CD3 £, CD3 8, CD3<y>, CD3 Z, CD4, CD5, CD8 a, CD9, CD16, CD19, CD22, CD33, CD34, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD154, o una cadena Z de un receptor de linfocitos T o cualquier combinación de los mismos.
En determinadas realizaciones, la construcción exógena comprende una bisagra o espaciador, en particular para permitir el libre movimiento del dominio de reconocimiento de antígeno extracelular. Las bisagras o espaciadores adecuados incluyen regiones de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE e IgM, o un fragmento de las mismas. En algunas realizaciones, la bisagra o espaciador es de CD8 a. Opcionalmente, los enlaces cortos pueden formar enlaces entre cualquiera o algunos de los dominios extracelulares, transmembrana e intracelular de la construcción. En algunas realizaciones, el enlazador puede proceder de repeticiones de glicina-glicina-glicina-glicina-serina. Los enlazadores también pueden utilizarse como marcador peptídico. La secuencia del enlazador peptídico puede tener cualquier longitud adecuada para conectar una o más proteínas de interés y preferentemente está genomanipulado para ser suficientemente flexible para permitir el plegamiento y/o función y/o actividad adecuados de uno o ambos de los péptidos que conecta.
En realizaciones preferidas, la construcción exógena es un receptor quimérico para el antígeno que comprende:
a) un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que es un scFv anti-CD19,
b) un dominio transmembrana de CD8,
c) un dominio de señalización intracelular 4-1BB,
d) un dominio de señalización intracelular CD3z y
e) un dominio de señalización intracelular BGH poli(A),
o dos o más de (a) a (e), tal como tres o cuatro de (a) a (e).
En realizaciones preferidas adicionales, la construcción exógena es un receptor synNotch que comprende:
a) un promotor, tal como PGK,
b) un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que es un scFv anti-CD19,
c) NOTCH1
d) un factor de transcripción Gal4-VP64 y
e) opcionalmente un elemento regulador postranscripcional (WPRE, del inglésWoodchuck Posttranscriptional Regulatory Element)del virus de la hepatitis de la marmota (WHV, del inglésWoodchuck Hepatitis Virus);
y la célula genomanipulada también comprende un elemento de respuesta que comprende:
a) un promotor que responde al factor de transcripción en el receptor synNotch, tal como el promotor CMV mínimo precedido por 5* elementos UAS, que son secuencias diana para Gal4,
b) IL-12,
c) un IRES,
d) un marcador, tal como mCherry,
e) un promotor, tal como PGK, seguido por un indicador, tal como tBFP, y
f) opcionalmente un elemento regulador postranscripcional (WPRE) del virus de la hepatitis de la marmota (WHV).
Los ejemplos demuestran que dichas construcciones se pueden expresar mediante pDC, que mantienen su funcionalidad y respuesta de IFN de tipo I, y se pueden utilizar para reconocer con éxito las células diana, unirse y posteriormente activarse para producir IFN-p y factores proinflamatorios.
En determinadas realizaciones, la construcción exógena comprende el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular y no comprende un dominio de señalización intracelular. Dichas construcciones pueden contener o no dominios transmembrana. En determinadas realizaciones de este tipo, el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular es un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) o un receptor de linfocitos T recombinante. En dichas realizaciones, la célula genomanipulada se dirige a una ubicación de la enfermedad y activa una respuesta inmunitaria. Se sabe que las pDC activan, expanden y reclutan Treg, por ejemplo, que serán útiles en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias y rechazo de trasplantes. La respuesta puede estar mediada por la señalización TCR, por ejemplo, mediante CD3Z.
En determinadas realizaciones, la construcción exógena es un receptor de linfocitos T (TCR, del inglésT cell receptor)recombinante. Los TCR son moléculas específicas de antígeno que se encargan de reconocer los péptidos antigénicos presentados en el contexto de un producto del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en la superficie de las células presentadoras de antígenos o de cualquier célula nucleada (por ejemplo, todas las células humanas del cuerpo, excepto los glóbulos rojos). Por el contrario, los anticuerpos normalmente reconocen antígenos solubles o de la superficie celular y no necesitan la presentación del antígeno por parte de un MHC. Este sistema dota a los linfocitos T, a través de sus TCR, de la capacidad potencial de reconocer toda la gama de antígenos intracelulares expresados por una célula (incluidas las proteínas víricas) que se procesan intracelularmente en péptidos cortos, se unen a una molécula de MHC intracelular y llegan a la superficie como un complejo péptido-MHC. En dichas realizaciones, la respuesta inmunitaria activada por la pDC al unirse a la diana puede estar mediada por vías de señalización endógenas del TCR.
Células dendríticas plasmocitoides (pDC) para el tratamiento de enfermedades
Las células genomanipuladas para su uso en la invención son células dendríticas plasmocitoides (pDC). Las células dendríticas plasmocitoides (pDC) tienen un papel polifacético en el sistema inmunitario, lo que las hace extremadamente adaptables para los tratamientos específicos de la invención. Las pDC son efectores clave en la inmunidad celular con la capacidad no solo de iniciar respuestas inmunitarias sino también de inducir tolerancia a antígenos exógenos y endógenos (Swiecki y Colonna,Nat Rev Immunol,2015. 15(8)). Las pDC se diferencian de las DC convencionales porque su etapa final de desarrollo ocurre dentro de la médula ósea; sus antígenos son captados mediante endocitosis mediada por receptores; expresan niveles elevados del factor regulador de interferón 7; y detectan principalmente patógenos a través de los receptores de tipo Toll (TLR) 7 y 9 (Swiecki y Colonna, Nat Rev Immunol, 2015. 15(8); y Tangand Cattral, Cell Mol Life Sci, 2016). A través de estos receptores de reconocimiento de patrones, los ácidos nucleicos de patógenos pueden activar las pDC para producir niveles elevados de interferón (IFN) de tipo I. Por lo tanto, las pDC activadas unen el sistema inmunitario innato y adaptativo mediante la producción de citocinas combinada con la actividad de las células presentadoras de antígenos (APC). De manera adicional, la funcionalidad de las pDC también es esencial para lograr un estado antivírico durante las infecciones, proporcionar una actividad adyuvante vital en el contexto de la vacunación y para promover respuestas antitumorales inmunogénicas tras la activación (Swiecki y Colonna, Nat Rev Immunol, 2015. 15(8); Tovey,et al. Biol Chem,2008.
389(5); y Rajagopal,et al.Blood, 2010. 115(10): págs. 1949-57). Sin embargo, debe mantenerse un delicado equilibrio ya que la hiperactivación de las pDC se ha asociado con la patogénesis de varias enfermedades, incluidas infecciones víricas, enfermedades autoinmunitarias y tumorigénesis (Swiecki y Colonna,Nat Rev Immunol,2015. 15(8); y Tang y Cattral, Cell Mol Life Sci, 2016).
A diferencia de los linfocitos T, las células NK, los macrófagos y otras células utilizadas normalmente con construcciones CAR para tratar el cáncer y enfermedades autoinmunitarias, los efectos terapéuticos de las pDC genomanipuladas de la invención son significativamente diferentes y utilizan la capacidad de las pDC para activar de manera indirecta respuestas inmunitarias mediante la liberación de citocinas y la activación de otras células inmunitarias.
Preferentemente, las pDC genomanipuladas expresan TRAIL. En otra realización, dichas pDC expresan CD123, CD303, CD304, CD4 y/o HLA-DR. En otra realización más, dichas pDC expresan IFN de tipo I, IFN de tipo II, IFN de tipo III y/o citocinas proinflamatorias. En una realización adicional, dichas pDC expresan IRF7, TLR7 y/o TLR9. En una realización, dichas pDC expresan CD40, CD80, CD83 y/o CD86. Por ejemplo, dichas pDC expresan TRAIL, CD123, CD303, CD304, CD4, HLA-DR, IFN de tipo I, IFN de tipo II, IFN de tipo III, IRF7, TLR7 y/o TLR9.
En una realización preferida de la presente invención, las pDC expresan el ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL, del inglésTNF-related apoptosis-inducing ligand).El TRAIL, que también se denomina CD253, es un ligando implicado en la destrucción de células cancerosas al interactuar con los receptores del TRAIL (receptor de muerte 5, DR5) en la superficie de las células cancerosas y, por lo tanto, desencadenar la apoptosis.
Las pDC genomanipuladas de la invención son preferentemente células maduras que tienen un fenotipo de superficie que se parece mucho a las pDC sanguíneas. En una realización preferida, dichas pDC expresan CD123, CD303, CD304, CD4 y/o HLA-DR.
En otra realización preferida, dichas pDC expresan IFN de tipo I, IFN de tipo II, IFN de tipo III y/o citocinas proinflamatorias.
En una realización preferida, las pDC pueden expresar receptores de tipo Toll, tales como, por ejemplo, el receptor de tipo Toll 7 (TLR7) y/o el receptor de tipo Toll 9 (TLR9).
En otra realización preferida más, dichas pDC expresan el factor regulador de interferón 7 (IRF7).
En una realización preferida, dichas pDC secretan IL-6.
En realizaciones preferidas, la célula dendrítica plasmocitoide genomanipulada es capaz de producir una respuesta de IFN de tipo I.
En otra realización preferida, dichas pDC expresan el grupo de diferenciación 80 (CD80), que es una proteína que se encuentra en las células dendríticas, linfocitos B activados y monocitos, que proporciona una señal coestimuladora necesaria para la activación y supervivencia de los linfocitos T.
En una realización preferida, las pDC también pueden expresar proteínas características de las células presentadoras de antígenos tales como, por ejemplo, el grupo de diferenciación 86 (CD86) y/o el grupo de diferenciación 40 (CD40). El CD86 es una proteína expresada en células presentadoras de antígenos que proporciona señales coestimuladoras necesarias para la activación y supervivencia de los linfocitos T, mientras que CD40 es una proteína coestimuladora que se encuentra en las células presentadoras de antígenos y es necesaria para su activación.
Preferentemente, dichas pDC expresan CD40, CD80, CD83 y/o CD86. En otra realización preferida, dichas pDC expresan interleucina 6 (IL-6).
En realizaciones preferidas, las pDC genomanipuladas de la invención son células dendríticas plasmocitoides procedentes de células madre.
En determinadas realizaciones, las pDC son autólogas. Dichos tratamientos pueden minimizar cualquier riesgo de rechazo de las células transferidas. En realizaciones alternativas, las células son alogénicas, tal como las aisladas de donantes sanos. Potencialmente, dichos tratamientos se pueden preparar más rápidamente y ofrecerse "listos para usar". En determinadas realizaciones, las células están o se han criopreservado. Asimismo, las células pueden ser xenogénicas.
Métodos para tratar enfermedades
La divulgación proporciona una célula genomanipulada para su uso en un método para tratar una enfermedad en un sujeto, en donde el método comprende administrar la célula genomanipulada al sujeto, en donde la célula expresa en su superficie una construcción exógena que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que reconoce un antígeno en una célula diana, y en donde la célula activa una respuesta inmunitaria cuando el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular se une a la célula diana. Por tanto, la invención proporciona células para una nueva terapia celular adoptiva. La terapia celular adoptiva es la transferenciaex-vivode células cultivadas, más comúnmente células procedentes del sistema inmunitario, en un hospedador con el objetivo de transferir la funcionalidad inmunológica y las características de las células transferidas. La terapia celular adoptiva está bien establecida para el tratamiento del cáncer y de enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias, aunque con diferentes células inmunitarias transferidas con diferentes efectos y actividades de regulación inmunitaria.
En determinadas realizaciones de la invención, la célula genomanipulada se utiliza en métodos de tratamiento que pueden comprender (i) recoger células madre progenitoras madre hematopoyéticas (HSPC) autólogas, ya sea del sujeto a tratar o de un donante sano; (ii) preparar las pDC genomanipuladas, por ejemplo, con un método que se analiza a continuación; (iii) opcionalmente administrar al sujeto quimioterapia productora de linfocitopenia; y (iv) administrar al sujeto las pDC genomanipuladas.
En determinadas realizaciones, la célula genomanipulada de la invención es para uso en métodos que pueden comprender administrar células que expresan más de una construcción exógena. Las células individuales pueden expresar más de una construcción, o la población de células administradas puede comprender una pluralidad de células diferentes.
En determinadas realizaciones, las células genomanipuladas se modifican aún más para expresar proteínas inmunomoduladoras, tales como citocinas (por ejemplo, IL-2, IL-12 o IL-15), que pueden estimular la activación y el reclutamiento de linfocitos T y, por lo tanto, pueden ayudar a combatir el microambiente tumoral.
Por lo tanto, las células pueden comprender una población de células que expresan la construcción exógena y que expresan además una proteína inmunomoduladora tal como, por ejemplo, IL-2, IL-12 o IL-15.
En determinadas realizaciones, las células genomanipuladas pueden aislarse de un sujeto y usarse frescas o congelarse para su uso posterior, junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después) la linfocitopenia.
En determinadas realizaciones, las células genomanipuladas pueden administrarse al sujeto mediante fraccionamiento de dosis, en donde un primer porcentaje de una dosis total se administra en un primer día de tratamiento, un segundo porcentaje de la dosis total se administra un día después del tratamiento y, opcionalmente, un tercer porcentaje de la dosis total se administra un día aún después del tratamiento.
Una dosis total ilustrativa comprende de 103 a 1011 células/kg de peso corporal del sujeto, tal como de 103 a 1010 células/kg de peso corporal, o de 103 a 109 células/kg de peso corporal del sujeto, o de 103 a 108 células/kg de peso corporal del sujeto, o de 103 a 107 células/kg de peso corporal del sujeto, o de 103 a 106 células/kg de peso corporal del sujeto, o de 103 a 105 células/kg de peso corporal del sujeto. Asimismo, una dosis total ilustrativa comprende de 104 a 1011 células/kg de peso corporal del sujeto, tal como de 105 a 1011 células/kg de peso corporal, o de 106 a 1011 células/kg de peso corporal del sujeto, o de 107 a 1011 células/kg de peso corporal del sujeto.
Se puede administrar una dosis total ilustrativa en función del área de superficie corporal del paciente en lugar del peso corporal. Así pues, la dosis total puede incluir de 103 a 1013 células por m2.
En determinadas realizaciones de la invención, la célula genomanipulada de la invención se utiliza en métodos que comprenden linfocitopenia. La linfocitopenia puede lograrse por cualquier medio adecuado. La linfocitopenia puede realizarse antes de la administración de las células genomanipuladas o después de ella. En determinadas realizaciones, la linfocitopenia se realiza antes y después de la administración de las células genomanipuladas.
En determinadas realizaciones de la invención, la célula genomanipulada de la invención se utiliza en métodos que pueden comprender la administración de uno o más agentes terapéuticos adicionales. Los agentes terapéuticos ilustrativos incluyen un agente quimioterápico, un agente antiinflamatorio, un inmunodepresor, un agente inmunomodulador o una combinación de los mismos.
Los agentes terapéuticos pueden administrarse de acuerdo con cualquier pauta de dosis convencional conocida en el campo. Los agentes quimioterápicos ilustrativos incluyen agentes antimitóticos, tales como taxanos, por ejemplo, docetaxel, paclitaxel y alcaloides de la vinca, por ejemplo, vindesina, vincristina, vinblastina y vinorelbina. Los agentes quimioterápicos ilustrativos incluyen un inhibidor de la topoisomerasa, tal como el topotecán. Los agentes quimioterápicos ilustrativos incluyen un inhibidor del factor de crecimiento, un inhibidor de la tirosina cinasa, un inhibidor de la histona desacetilasa, un inhibidor de la MAP cinasa P38a, inhibidores de la angiogénesis, la neovascularización y/u otra vascularización, un factor estimulante de colonias, un agente eritropoyético, un agente antianérgico, un agente inmunodepresor y/o inmunomodulador, un virus, proteínas víricas, inhibidores del punto de control inmunitario, inhibidores de BCR (por ejemplo, BTK, P13K, etc.), agentes inmunometabólicos (por ejemplo, IDO, arginasa, inhibidores de glutaminasa, etc.) y similares. De acuerdo con ciertos aspectos de la presente invención, uno o más agentes terapéuticos pueden comprender un agente antimieloma. Los agentes antimieloma ilustrativos incluyen dexametasona, melfalán, doxorrubicina, bortezomib, lenalidomida, prednisona, carmustina, etopósido, cisplatino, vincristina, ciclofosfamida y talidomida, varios de los cuales están indicados anteriormente como agentes quimioterápicos, agentes antiinflamatorios o agentes inmunodepresores.
El tratamiento de una enfermedad, de acuerdo con la invención, se refiere a un efecto biológico que puede presentarse como una disminución de la carga, incidencia o intensidad de la enfermedad. Por ejemplo, en relación con el tratamiento del cáncer, esto puede manifestarse como una reducción en el volumen tumoral, una disminución en la cantidad de células tumorales, una disminución en la proliferación de células tumorales, una disminución en el número de metástasis, un aumento de la supervivencia global o libre de progresión, un aumento de la esperanza de vida o una mejoría de varios síntomas fisiológicos asociados con el tumor.
Las células genomanipuladas de la invención pueden administrarse por cualquier vía adecuada. En general, las células se administrarán mediante infusión intravenosa,
Métodos para tratar el cáncer
En realizaciones preferidas de la invención, las células de la invención se utilizan en el tratamiento del cáncer. Se espera que la capacidad de las pDC para secretar factores inmunomoduladores y alterar los microambientes tumorales inmunoinhibidores sea particularmente útil para el tratamiento del cáncer. Además, las células cancerosas presentan antígenos específicos que pueden ser reconocidos por el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular para proporcionar una terapia dirigida a los sitios del tumor, evitando las células sanas.
En realizaciones preferidas, el cáncer es un tumor sólido. Las células de la invención pueden ser particularmente eficaces para dirigirse y alterar el microambiente de tumores sólidos.
En determinadas realizaciones, las células de la invención se utilizan en el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda (LLA) (incluida la LLA sin linfocitos T), leucemia mieloide aguda, leucemia prolinfocítica de linfocitos B, leucemia linfoide aguda de linfocitos B ("BALL"), neoplasia de células dendríticas plasmacitoides blásticas, linfoma de Burkitt, leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia mieloide crónica, leucemia crónica o aguda, linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG), linfoma folicular (LF), tricoleucemia, enfermedad de Hodgkin, afecciones linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfoma de células del manto, linfoma de la zona marginal, gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI), mieloma múltiple, mielodisplasia y síndrome mielodisplásico, linfoma no Hodgkin (LNH), trastorno proliferativo de células plasmáticas (incluido mieloma asintomático (mieloma múltiple latente o mieloma indolente)), linfoma plasmablástico, neoplasia de células dendríticas plasmacitoides, plasmocitomas (incluida discrasia de células plasmáticas; mieloma solitario; plasmocitoma solitario; plasmocitoma extramedular; y plasmocitoma múltiple), síndrome POEMS (también conocido como síndrome de Crow-Fukase; enfermedad de Takatsuki; y síndrome PEP), linfoma mediastínico primario de linfocitos B grandes (PMBC), linfoma folicular microcítico o macrocítico, linfoma esplénico de la zona marginal (SMZL), amiloidosis sistémica de cadenas ligeras de amiloide, leucemia linfoide aguda de linfocitos T ("TALL"), linfoma de linfocitos T, linfoma folicular transformado, o macroglobulinemia de Waldenstrom o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el cáncer es un mieloma. En una realización particular, el cáncer es mieloma múltiple. En algunas realizaciones, el cáncer es leucemia. En algunas realizaciones, el cáncer es leucemia mieloide aguda. En algunas realizaciones, el cáncer es un linfoma de linfocitos B grandes recidivante o refractario, linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG) no especificado de otra manera, linfoma mediastínico primario de linfocitos B grandes, linfoma de linfocitos B de alto grado o LDLBG que surge de un linfoma folicular.
El dominio de reconocimiento de antígeno extracelular en la construcción exógena se selecciona para unirse a un antígeno expresado en la superficie del cáncer que se va a tratar. Anteriormente se describen dominios de reconocimiento de antígenos extracelulares ilustrativos.
En algunas realizaciones, la célula genomanipulada de la invención se utiliza en métodos que comprenden además administrar un quimioterápico. En determinadas realizaciones, el quimioterápico seleccionado es un quimioterápico que agota los linfocitos (preacondicionamiento) y se administra preferentemente antes de las células de la invención. Dicha administración de un agente quimioterápico puede mejorar la supervivencia de las células trasplantadas.
En realizaciones preferidas, la célula de la invención se utiliza en el tratamiento del cáncer y la célula es una célula dendrítica plasmocitoide procedente de células madre genomanipulada que expresa un receptor quimérico para el antígeno exógeno o receptor synNotch que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que reconoce un antígeno asociado a un tumor, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que activa una respuesta inmunitaria antitumoral en la célula cuando el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular se une a la célula diana.
En la invención, se administran células genomanipuladas a un sujeto que ya padece cáncer, en una cantidad suficiente para curar, aliviar o detener parcialmente el cáncer o uno o más de sus síntomas. Dicho tratamiento terapéutico puede dar lugar a la remisión, estabilización, reducción de la metástasis o eliminación del cáncer. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como "cantidad terapéuticamente eficaz". Es posible que se haya identificado que el sujeto padece cáncer y que es apto para una inmunoterapia de transferencia celular adoptiva mediante cualquier medio adecuado.
Métodos para tratar enfermedades autoinmunitaria e inflamatorias
En realizaciones preferidas de la invención, las células de la invención se utilizan en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria. Se espera que la capacidad de las pDC para secretar factores inmunomoduladores y alterar tejidos inflamatorios o sitios de ataque autoinmunitario sea particularmente útil para tratar enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias. Además, las enfermedades autoinmunitarias a menudo son desencadenadas por autoantígenos específicos a los que se dirige el sistema inmunitario del paciente y estos autoantígenos se pueden reconocer por el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular para proporcionar una terapia dirigida a los sitios de inflamación. De modo similar, los tejidos específicos que están inflamados, o que se han trasplantado, pueden ser la diana utilizando el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular en las células de la invención.
Se espera que dirigir las pDC genomanipuladas al tejido inflamado y a los sitios de la enfermedad inflamatoria sea eficaz porque el agotamiento de las pDC (en un modelo murino de asma) conduce a una hiperreactividad mediada por linfocitos T, lo que da como resultado una ruptura de la tolerancia (véase Jan de Heer, 2004, J Exp Med, 200(1):89-98). Las pDC también son importantes para la supervivencia del injerto a largo plazo después del alotrasplante de células madre (véase Pericet al. Biol Blood Marrow Transplant,2015, 21(8), Gongalveset al. Biol Blood Marrow Transplant,21(7), y Walleret al. J Clin Oncol,2014, 32(22)). Además, la elevada expresión de PD-L1/CD86 en pDC se correlaciona con un aumento de T-reg en la tolerancia al trasplante de hígado (véase Tokitaet al., Transplantation.
2008, 85(3):369-77). Además, la transferencia adoptiva (preoperatoria) de pDC de donantes promueve en gran medida la supervivencia del trasplante de corazón (véase PMID: Bjorcket al. J Heart Lung Transplant,2005, 24(8) y Abeet al., Am J Transplant,2005, 5(8)).
En determinadas realizaciones, la enfermedad autoinmunitaria se selecciona de la lista que consiste en: diabetes de tipo 1, enfermedades autoinmunitarias de la tiroides (por ejemplo, Hashimoto y Graves), insuficiencia suprarrenal de Addison, ooforitis, orquitis, hipofisitis linfocítica, hipoparatiroidismo autoinmunitario, hipoparatiroidismo autoinmunitario, enfermedad de Goodpasture, miocarditis autoinmunitaria, nefropatía membranosa, hepatitis autoinmunitaria, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, miastenia grave, neuromielitis óptica.
En determinadas realizaciones, la enfermedad inflamatoria se selecciona de la lista que consiste en: fibrosis quística, enfermedades intestinales inflamatorias crónicas como, por ejemplo, colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn, vasculitis, en particular la enfermedad de Kawasaki, bronquitis crónica, enfermedades inflamatorias de la artritis como, por ejemplo, artritis psoriásica, osteoartritis, artritis reumatoide y artritis reumatoide juvenil de aparición sistémica (SOJRA, enfermedad de Still), enfermedad de injerto contra hospedador, asma, psoriasis, lupus eritematoso sistémico y rechazo de aloinjertos.
En determinadas realizaciones, la enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria es el rechazo de trasplantes o la enfermedad de injerto contra hospedador (EICH). Los ejemplos de trasplante de órganos a tratar de acuerdo con la invención incluyen: riñón, corazón, pulmón, hígado, intestino, páncreas e islote de Langerhans.
El dominio de reconocimiento de antígeno extracelular en la construcción exógena se selecciona para dirigirse al autoantígeno asociado con la enfermedad que se va a tratar. Los antígenos ilustrativos a los que se dirigirá incluyen (con la enfermedad asociada a tratar entre paréntesis): GAD65 (diabetes de tipo 1), proteína 2 asociada a insulinoma, IA-2 (diabetes de tipo 1), peroxidasa tiroidea, TPO (enfermedades autoinmunitarias de la tiroides, Hashimoto y Graves), receptor de tirotropina, TSHR (enfermedades autoinmunitarias de la tiroides, Hashimoto y Graves), receptor de la hormona adrenocorticotrópica, ACTHR (insuficiencia suprarrenal de Addison), 21-hidroxilasa (insuficiencia suprarrenal de Addison), 17-a-hidroxilasa (ooforitis), enzima de escisión de cadena lateral P450 (ooforitis), antígenos de esperma (orquitis), proteína citosólica pituitaria (hipofisitis linfocítica), receptor sensible de calcio, CaSR (hipoparatiroidismo autoinmunitario), proteína 5 que contiene dominios NACHT LRR y PYD, NALP5 (hipoparatiroidismo autoinmune), cadena a 3 del colágeno de tipo IV (enfermedad de Goodpasture), miosina (miocarditis autoinmunitaria), receptor de fosfolipasa A2 de tipo M, PLA2R (nefropatía membranosa), citocromo P450 1A2 (hepatitis autoinmunitaria), isoforma 5 de tropomiosina, hTM5 (colitis ulcerosa), glucoproteína 2 de la membrana del gránulo del zimógeno principal, GP2 (enfermedad de Crohn), proteína básica de mielina, MBP (esclerosis múltiple), receptor nicotínico de acetilcolina, AChR (miastenia grave), acuaporina 4, AQP4 (neuromielitis óptica).
Cuando se utiliza para tratar el rechazo de trasplantes, el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular en la construcción exógena se selecciona para dirigirse al órgano adecuado. Los antígenos ilustrativos a los que se dirigirá incluyen (con el órgano asociado entre paréntesis): GAD65 (páncreas o islote de Langerhans), proteína 2 asociada al insulinoma, IA-2, (páncreas o islote de Langerhans), receptor A2 de tipo M de fosfolipasa, PLA2R (riñón), miosina (corazón), cadena a 3 de colágeno de tipo IV (pulmón), citocromo P4501A2 (hígado), glucoproteína 2 de la membrana del gránulo del zimógeno principal, GP2 (intestino), isoforma 5 de tropomiosina, hTM5 (intestino).
En realizaciones preferidas, la célula de la invención se utiliza en el tratamiento de enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria y la célula es una célula dendrítica plasmocitoide procedente de células madre genomanipulada que expresa un receptor quimérico para el antígeno exógeno o receptor synNotch que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que reconoce un antígeno o un antígeno específico de tejido, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que activa una respuesta inmunitaria antiinflamatoria en la célula cuando el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular se une a la célula diana.
En la invención, se administran células genomanipuladas a un sujeto que ya padece una enfermedad autoinmunitaria, en una cantidad suficiente para curar, aliviar o reducir la frecuencia de uno o más síntomas. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como "cantidad terapéuticamente eficaz". Es posible que se haya identificado que el sujeto padece una enfermedad autoinmunitaria y que es apto para una inmunoterapia de transferencia celular adoptiva mediante cualquier medio adecuado.
Métodos para generar células de la invención
Las pDC genomanipuladas pueden generarse mediante cualquier método adecuado. En el documento WO2018/206577 se proporcionan métodos ilustrativos para generar pDC en cantidades significativas. La invención también proporciona métodos para generar células dendríticas plasmocitoides genomanipuladas.
En determinadas realizaciones, el método para producir una célula dendrítica plasmocitoide (pDC) genomanipulada comprende:
- proporcionar células madre progenitoras madre hematopoyéticas (HSPC)
- transformar dichas HSPC con una construcción exógena que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que reconoce un antígeno en una célula diana,
- incubar dichas HSPC en uno o más medios, medios que normalmente pueden comprender una o más citocinas, factores de crecimiento, interferones (IFN) y/o antagonistas del receptor de arilhidrocarburo (AHR) (tales como stemregenina-1), por lo que dichas HSPC se diferencian en pDC precursoras y en pDC.
En determinadas realizaciones, el método para producir una célula dendrítica plasmocitoide (pDC) genomanipulada comprende:
- proporcionar células madre progenitoras hematopoyéticas (HSPC),
- incubar dichas HSPC en uno o más medios, medios que normalmente pueden comprender una o más citocinas, factores de crecimiento, interferones (IFN) y/o antagonistas del receptor de arilhidrocarburo (AHR) (tales como stemregenina-1), por lo que dichas HSPC se diferencian en pDC precursoras y en pDC,
- transformar dichas pDC con una construcción exógena que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que reconoce un antígeno en una célula diana.
Por consiguiente, en determinadas realizaciones, el método para producir una célula dendrítica plasmocitoide (pDC) genomanipulada comprende:
- proporcionar células madre progenitoras hematopoyéticas (HSPC),
- incubar dichas HSPC en uno o más medios, medios que normalmente pueden comprender una o más citocinas, factores de crecimiento, interferones (IFN) y/o antagonistas del receptor de arilhidrocarburo (AHR) (tales como stemregenina-1), por lo que dichas HSPC se diferencian en pDC precursoras y en pDC, y
- transformar dichas HSPC antes de la diferenciación, o transformar dichas pDC después de la diferenciación, con una construcción exógena que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que reconoce un antígeno en una célula diana.
La transformación de las células se puede lograr mediante cualquier técnica adecuada.
En algunas realizaciones, la construcción exógena es una construcción vírica. En algunas realizaciones, la construcción vírica es una construcción AAV, una construcción adenovírica, una construcción lentivírica o una construcción retrovírica. La construcción puede comprender un gen indicador tal como GFP, mCherry, EGFR truncado o tNGFR truncado, o el dominio extracelular del CAR o synNotch puede contener un epítopo, para ayudar a la clasificación de las pDC con la construcción. En algunas realizaciones, la construcción vírica es una construcción lentivírica y la transducción se realiza con placas recubiertas con retronectina o con lentiBOOST y sulfato de protamina.
En realizaciones preferidas, las HSPC CD34+ se transforman y después se diferencian en pDC.
En determinadas realizaciones, el método para producir una célula dendrítica plasmocitoide (pDC) genomanipulada comprende:
- proporcionar células madre progenitoras madre hematopoyéticas (HSPC)
- transformar dichas HSPC con una construcción exógena que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que reconoce un antígeno en una célula diana,
- incubar dichas HSPC en un primer medio que comprende citocinas y factor de crecimiento de modo que dichas HSPC se diferencian en pDC precursoras
- añadir interferones (IFN) a dicho primer medio para obtener un segundo medio de modo que dichas pDC precursoras se diferencian en pDC
En determinadas realizaciones, el método para producir una célula dendrítica plasmocitoide (pDC) genomanipulada comprende:
- proporcionar células madre progenitoras madre hematopoyéticas (HSPC)
- transformar dichas HSPC con una construcción exógena que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que reconoce un antígeno en una célula diana,
- incubar dichas HSPC en un primer medio que comprende citocinas y factor de crecimiento de modo que dichas HSPC se diferencian en pDC precursoras
- añadir factor de células madre (SCF) y StemRegnin 1 (SR1) en un primer medio para obtener un rendimiento elevado de pDC precursoras
- proporcionar un segundo medio que comprende interferones (IFN)
- añadir interferones (IFN) a dicho segundo medio a dicho primer medio que comprende pDC precursoras, de modo que dichas pDC precursoras se transforman para obtener un rendimiento elevado de pDC completamente activadas y diferenciadas en un segundo medio
de modo que dichas pDC precursoras se diferencian en pDC
En realizaciones preferidas, dicho segundo medio comprende IFN-<y>y/o IFN-p. En otra realización, dicho segundo medio comprende además IL-3. Preferentemente, dicho segundo medio comprende IL-3, IFN-y e IFN-p.
Las pDC precursoras pueden incubarse, por ejemplo, durante al menos 24 horas en dicho segundo medio. Preferentemente, dichas pDC precursoras se incuban durante 24 a 72 horas en dicho segundo medio.
En una realización, dicho primer medio comprende ligando Flt3, trombopoyetina y/o interleucina 3. En otra realización, dicho primer medio comprende además factor de células madre y StemRegenin 1. En otra realización, dicho primer medio comprende además factor de células madre y UM 171. En otra realización, dicho primer medio comprende además medio RPMI complementado con suero fetal de ternera (FCS). En otra realización, dicho primer medio comprende medio sin suero (SFEM). Preferentemente, dicho primer medio comprende ligando Flt3, trombopoyetina, SCF, interleucina 3 y StemRegenin 1.
Las HSPC pueden incubarse, por ejemplo, durante 21 días en dicho primer medio.
En una realización, el método, como se describe en el presente documento, comprende además una etapa de selección inmunomagnética negativa para enriquecer pDC diferenciadas.
Las "células madre hematopoyéticas" (HSC, del ingléshematopoietic stem cells),tal como se utilizan en el presente documento, son células madre multipotentes que son capaces de dar lugar a todos los tipos de células sanguíneas, incluidas las estirpes mieloides y las estirpes linfoides. Las estirpes mieloides pueden incluir, por ejemplo, monocitos y macrófagos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, eritrocitos, megacariocitos/plaquetas y células dendríticas, mientras que las estirpes linfoides pueden incluir linfocitos T, linfocitos B y células NK.
En una realización preferida, las HSC son células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC). Las HSC o HSPC se encuentran en la médula ósea de los seres humanos, tal como en la pelvis, el fémur y el esternón. También se encuentran en la sangre del cordón umbilical y en la sangre periférica.
Se pueden tomar células madre y progenitoras de la pelvis, en la cresta ilíaca, con una aguja y una jeringa. Las células se pueden extraer en forma líquida, por ejemplo, para realizar un frotis para observar la morfología celular o se pueden extraer mediante una biopsia central, por ejemplo, para mantener la arquitectura o la relación de las células entre sí y con el hueso.
Las HSC o HSPC también se pueden extraer de la sangre periférica. Para extraer HSC o HSPC de la sangre periférica circulante, a los donantes de sangre se les puede inyectar una citocina que induce a las células a abandonar la médula ósea y circular por los vasos sanguíneos. La citocina puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y ciclofosfamida. Por lo general, se administran mediante una inyección en el tejido adiposo debajo de la piel todos los días durante aproximadamente 4 a 6 días.
Las HSC o HSPC también pueden extraerse o purificarse a partir de médula ósea. Las células madre están entre 10 y 100 veces más concentradas en la médula ósea que en la sangre periférica. El hueso de la cadera (pélvico) contiene la mayor cantidad de médula activa del cuerpo y una gran cantidad de células madre. La extracción de células madre de la médula ósea generalmente se realiza en el quirófano.
Las HSC o HSPC también pueden purificarse a partir de sangre de cordón umbilical humano (SCU). En este método, la sangre se extrae del cordón umbilical poco después del nacimiento del bebé. El volumen de células madre extraídas por donación es bastante pequeño, por lo que estas células se suelen utilizar para niños o adultos pequeños.
El primer medio es un medio de diferenciación, en donde las HSC se diferencian en pDC precursoras. Por lo tanto, el primer medio comprende factores de diferenciación.
Antes de la diferenciación de las HSC en pDC precursoras, las HSC pueden cultivarse en un medio de cultivo que no comprende factores de diferenciación. El medio de cultivo puede complementarse con componentes de cultivo celular convencionales, tales como suero, tal como, por ejemplo, suero fetal de ternera, b-mercaptoetanol, antibióticos, tales como penicilina y/o estreptomicina, nutrientes y/o aminoácidos no esenciales. Los componentes de cultivo celular convencionales también pueden sustituirse por medio convencional sin suero complementado con penicilina y/o estreptomicina convencional.
Para iniciar la diferenciación de HSC en pDC precursoras, se añaden al medio factores de diferenciación, tales como el ligando de Flt3, trombopoyetina y/o al menos una interleucina seleccionada de interleucina 3, IFN-b y PGE2. También se pueden utilizar s Cf y/o SRI.
Por lo tanto, en una realización preferida, dicho primer medio comprende ligando Flt3, trombopoyetina y/o al menos una interleucina seleccionada de interleucina 3, IFN-b y PGE2. Más preferentemente, dicho primer medio comprende ligando Flt3, trombopoyetina y/o interleucina 3. En otra realización preferida, el primer medio comprende SCF y/o SR1
El experto puede preparar medios de cultivo adecuados, por ejemplo, utilizando la guía del documento WO 2018/206577.
Las HSPC se incuban en el primer medio en condiciones que son normales de los cultivos de células humanas y bien conocidas por el experto. Las condiciones normales para la incubación de cultivos celulares son, por ejemplo, una temperatura de 37 °C, humedad del 95 % y CO2 al 5 %.
En una realización, las HSPC se incuban durante al menos 1 día, tal como al menos 2 días, al menos 3 días, tal como, por ejemplo, al menos 4 días, tal como al menos 5 días, al menos 6 días, tal como, por ejemplo, al menos 7 días, tal como al menos 8 días, al menos 9 días, tal como, por ejemplo, al menos 10 días, tal como al menos 12 días, al menos 14 días en dicho primer medio. En una realización más preferida el cultivo se incuba durante al menos 16 días, tal como al menos 18 días, al menos 20 días o tal como, por ejemplo, al menos 21 días en dicho primer medio.
Las HSC pueden incubarse, por ejemplo, durante 1 semana, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas en dicho primer medio. En una realización preferida, dichas HSPC se incuban durante 21 días en dicho primer medio.
En una realización, el primer medio se renueva durante el período de incubación. El medio puede renovarse, por ejemplo, cada dos días, cada tres días o cada cuatro días durante el período de incubación. El primer medio se renueva preferentemente con medio que contiene uno o más componentes del primer medio como se describe en el presente documento y anteriormente. Preferiblemente, el medio se renueva con medio que comprende las citocinas.
Después de la incubación de HSPC en el primer medio, en donde las HSC se diferencian en pDC precursoras, se añaden IFN al primer medio obteniendo así un segundo medio.
De manera alternativa, se proporciona un segundo medio, que comprende IFN, tal como IFN de tipo I, IFN de tipo II y/o IFN de tipo III.
En una realización, dicho segundo medio comprende IFN-a, IFN-y y/o IFN-p.
En una realización preferida, dicho segundo medio comprende IFN-y y/o IFN-p. Preferentemente, dicho segundo medio comprende IFN-y e IFN-p.
En otra realización preferida, dicho segundo medio comprende interleucina 3 (IL-3). En la realización, en donde el primer medio comprende IL-3, se puede volver a añadir IL-3 al medio, por ejemplo junto con los interferones. Se entiende que los tres componentes se pueden añadir en cualquier orden. En una realización preferida particular, dicho segundo medio comprende IFN-<y>, IFN-p e IL-3.
Las pDC precursoras se incuban en el segundo medio en condiciones que son normales de los cultivos de células humanas y bien conocidas por el experto. Las condiciones normales para la incubación de cultivos celulares son, por ejemplo, una temperatura de 37 °C, humedad del 95 % y CO2 al 5 %.
En una realización, dichas pDC precursoras se incuban en dicho segundo medio durante al menos 1 hora, tal como al menos 5 horas, tal como, por ejemplo, al menos 10 horas, tal como al menos 15 horas o tal como al menos 20 horas en dicho segundo medio. En una realización preferida, las pDC precursoras se incuban durante al menos 24 horas en dicho segundo medio.
En otra realización, dichas pDC precursoras se incuban en dicho segundo medio durante al menos 1 día, al menos dos días, al menos tres días o al menos 4 días.
General
Debe entenderse que diferentes aplicaciones de los productos y métodos divulgados pueden adaptarse a las necesidades específicas de la técnica. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento tiene únicamente el fin de describir realizaciones particulares de la invención y no se pretende que sea limitante.
Además, como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno/a" y "el/la" incluyen referencias en plural, a menos que el contenido indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un polipéptido" incluye "polipéptidos" y similares.
A menos que esté específicamente prohibido, las etapas de un método divulgado en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado y el orden en el que se enumeran las etapas no debe considerarse limitante.
Ejemplo 1
Las células madre hematopoyéticas y progenitoras, HSPC, se electroporaron con complejos de ribonucleoproteína (RNP) que consisten en ARNgu de la enzima Cas9 dirigido contra CCR5. Posteriormente, las células se transdujeron con el virus adenoasociado 6 (AAV6) que llevaba la construcción CAR flanqueada por brazos de homología CCR5 para la reparación dirigida por homología que se muestra en la figura 7A. Sucesivamente, las células se diferenciaron a SC-pDC. En la figura 7B se presenta un gráfico FACS representativo, que muestra la expresión de la construcción CAR anti-CD19 en SC-pDC (simulado = células que no recibieron el vector AAV6). En la figura 7C se presenta un diagrama de columnas que muestra el porcentaje de SC-pDC con CAR+ anti-CD19 para tres donantes.
Este ejemplo demuestra que un CAR convencional se puede expresar en pDC, en particular, en pDC diferenciadas de las HSPC transformados con la construcción CAR.
Ejemplo 2
Las SC-pDC cebadas, donde el 30 % de las células expresan el CAR anti-CD19 (RNP donante), o SC-pDC que no expresan la construcción (simulado donante), se estimularon durante 20 horas con agonistas dirigidos contra TLR7 (R837), TLR9 (CpGA) o permanecieron sin estimular (SE).
Posteriormente se recogieron los sobrenadantes y se evaluó el IFN de tipo I bioactivo utilizando un bioensayo de IFN de tipo I disponible comercialmente (bioensayo indicador de IFN de tipo I HEK-blue).
Los datos de la figura 8 muestran que la respuesta de IFN de tipo I (una de las características de la activación de pDC) no se ve afectada en una población de SC-pDC que expresan un CAR anti-CD19.
Ejemplo 3
Las SC-pDC, donde el 30 % de las células expresan un CAR anti-CD19 (RNP donante), o las SC-pDC que no expresan la construcción (simulado donante), se cebaron durante tres días en medio complementado con IFN de tipo I y II (Figura 9A) o se dejaron sin cebar (Figura 9B). Posteriormente, las células se cultivaron conjuntamente con la estirpe celular diana CD19+ (NALM-6) en una proporción efector:diana de 1:1. También se sembraron células diana sin células efectoras (0:1) para excluir un posible ruido de fondo. Después de 20 horas, se recogieron los sobrenadantes y se cuantificaron los niveles de las citocinas IFN-p, IL-6, CXCL10 y TNF-a mediante un ensayo de citocinas múltiple de Mesoscale (MSD). Los datos son de un donante.
Los datos muestran que la población de SC-pDC que expresa un CAR anti-CD19 reconoce la estirpe celular diana y posteriormente se activa para producir IFN-p y factores proinflamatorios (IL-6, CXCL10 y TNF a).
Ejemplo 4
Para confirmar que las SC-pDC se pueden transducir con componentes synNotch y expresar con éxito tanto el receptor como el elemento de respuesta, se generaron SC-pDC con synNotch, como se muestra de manera esquemática en la figura 10.
Las células madre hematopoyéticas y progenitoras (HSPC) procedentes de la sangre del cordón umbilical se descongelaron y se expandieron previamente a baja densidad durante 3 días. Después de 3 días de preexpansión, se cotransdujeron 100.000 células con lentivirus que portaban un receptor CD19-synNotch o un elemento de respuesta IL-12 synNotch, como se muestra en la figura 11. Las células se transdujeron con placas recubiertas con retronectina o con lentiBOOST y sulfato de protamina. 24 horas después de la transducción, las HSPC se lavaron y resuspendieron en medio de diferenciación de pDC y se inició la diferenciación de pDC. Después de 16 días de cultivo, se aislaron las pDC y se realizaron configuraciones de cocultivo específicas.
En la figura 12 se muestra que las SC-pDC expresan con éxito tanto el receptor synNotch como el elemento de respuesta synNotch. En función de estos datos y los datos de los otros ejemplos, se espera que las pDC también expresen con éxito construcciones exógenas alternativas con dominios de reconocimiento de antígeno extracelular, en particular construcciones T-CAR y receptores synNotch contra dianas alternativas, y también expresará con éxito elementos de respuesta alternativos, en particular aquellos con transgenes inducibles alternativos. Esto se debe a que se espera que cualquiera de dichas construcciones se transduzcan en las HSPC y se expresen en las pDC sustancialmente de la misma manera que se muestra en el presente ejemplo.
Ejemplo 5
Se analizó la activación de células SC-pDC con synNotch generadas de acuerdo con el ejemplo anterior para confirmar que los componentes synNotch expresados por SC-pDC son funcionales y que las SC-pDC con synNotch son eficaces para dirigirse y reconocer células específicas y activar una respuesta, en particular una respuesta inmunitaria, cuando reconocen células específicas.
Las SC-pDC con synNotch cebadas y no cebadas se cultivaron conjuntamente con diferentes células diana y la activación del receptor synNotch se analizó mediante la medición de la secreción de IL-12 mediante ELISA. La proporción de células diana:efectoras fue de 5:1 (es decir, había cinco veces más células diana que células efectoras). Los sobrenadantes se recogieron 24 horas después y se evaluó la activación del elemento de respuesta synNotch mediante el análisis de los niveles de IL-12 mediante ELISA. Los datos se presentan en la figura 13. Los datos se presentan como valores de DO porque las lecturas estaban fuera de la curva patrón.
En la figura 13 se muestra una fuerte activación del elemento de respuesta y la secreción de IL-12 cuando las pDC se ponen en contacto con células diana CD19+ (NALM6 o REH6), pero no cuando se ponen en contacto con células no diana negativas para CD19 (K562), o se cultivan sin células (solo). Estos datos confirman que el receptor synNotch y el elemento de respuesta son funcionales en las SC-pDC y que las SC-pDC que portan los componentes synNotch pueden reconocer las células diana y activar una respuesta inmunitaria cuando se unen a las células. En función de estos datos y los datos de los otros ejemplos, se espera que las pDC también reconozcan con éxito diferentes células cuando se utilicen dominios de reconocimiento de antígenos extracelulares alternativos o receptores synNotch contra dianas alternativas, porque su expresión en pDC será sustancialmente la misma que se muestra en el presente ejemplo. De modo similar, en función de estos datos y los datos de los otros ejemplos, se espera que las pDC también activen con éxito respuestas inmunitarias alternativas, si se utilizan construcciones alternativas o transgenes inducibles, porque la unión a células diana y la inducción de respuesta serán sustancialmente las mismas que se muestran en el presente ejemplo. Por último, en función de la expresión sólida y específica de IL-12 mostrada en el presente ejemplo, y en función de los datos de los otros ejemplos, se espera que las pDC sean eficaces para activar una respuesta inmunitaria que sea útil para tratar enfermedades.
Ejemplo 6
La transducción y activación descritas en los ejemplos 4 y 5 se repitieron con HSPC de otro donante. Después de la transducción de HSPC, la diferenciación en pDC y 16 días de cultivo, como se describe en el ejemplo 4, las SC-pDC se aislaron y se cebaron antes de que se evaluara la expresión del receptor synNotch y el elemento de respuesta en las pDC (estirpe negativa, negativo para CD11c, células CD303+), como se muestra en la figura 14. Estos datos confirman además que las pDC se transducen con éxito y pueden expresar con éxito tanto el receptor synNotch como el elemento de respuesta synNotch.
La activación de las pDC después de entrar en contacto con las células diana CD19+ se analizó mediante el análisis de la secreción de iL-12 con ELISA. Se cultivaron 100.000 pDC cebadas junto con células diana CD19+ NALM6 o REH6, o las células no diana K562 (control), en una proporción de 1:1 y 1:3 efector:diana. Los sobrenadantes se recogieron 20 horas después de la estimulación y se analizaron los niveles de IL12 mediante ELISA. Los datos se muestran en la figura 15, que presenta datos de un donante y triplicados biológicos. Estos datos muestran una fuerte activación del elemento de respuesta y la secreción de IL-12 cuando las pDC se ponen en contacto con células diana CD19+. Estos datos también muestran que la activación depende de la dosis, con mayor activación y secreción de IL-12 cuando se utilizan más células diana. Estos datos confirman además que las pDC pueden reconocer las células diana y activar una respuesta inmunitaria cuando se unen a las células.
Ejemplo 7
La transducción y activación descritas en los ejemplos 4 y 5 se repitieron con HSPC de otro donante. Después de la transducción de HSPC, la diferenciación en pDC y 16 días de cultivo, como se describe en el ejemplo 4, Las SC-pDC se aislaron y se cebaron antes de que se evaluara la expresión del receptor synNotch y del elemento de respuesta en las SC-pDC (linaje negativo, negativo para CD11c, células CD303+), como se muestra en la figura 16. Estos datos confirman además que las pDC se transducen con éxito y pueden expresar con éxito tanto el receptor synNotch como el elemento de respuesta synNotch.
Después se probó la activación de SC-pDC tras el reconocimiento de las células diana CD19+. Se sembraron 100.000 SC-pDC con synNotch o SC-pDC no transducidas (simulado) en una placa de 96 pocillos con fondo en U y posteriormente se cubrieron con células diana en diversas proporciones efector:diana, por ejemplo, 1:1 (100.000 SC-pDC:100.000 células diana), 1:2 (100.000 SC-pDC:200.000 células diana). Como células diana, se utilizaron NALM6 o REH6 CD19+. Como células no diana, se utilizó la estirpe celular K562 negativa para CD19. Después de 20 horas de cultivo conjunto, se recogieron los sobrenadantes y se evaluaron los niveles de<i>L-12 utilizando un ELISA de IL-12. Los datos se presentan en la figura 17 y muestran una respuesta sólida y específica que se induce tras el cultivo de pDC junto con células CD19+ y que aumenta con proporciones más elevadas de células efectoras:diana. Estos datos confirman además que las pDC pueden reconocer las células diana y activar una respuesta inmunitaria cuando se unen a las células.
A menos que se indique de otro modo, los métodos usados son técnicas bioquímicas y moleculares convencionales.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una célula dendrítica plasmocitoide genomanipulada para su uso en un método para tratar una enfermedad en un sujeto, en donde el método comprende administrar la célula genomanipulada al sujeto,
en donde la célula expresa en su superficie una construcción exógena que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que reconoce un antígeno en una célula diana, y
en donde la célula activa una respuesta inmunitaria cuando el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular se une a la célula diana.
2. La célula dendrítica plasmocitoide genomanipulada para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la enfermedad es un cáncer, una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad inflamatoria.
3. Una célula dendrítica plasmocitoide genomanipulada que expresa en su superficie una construcción exógena que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que reconoce un antígeno en una célula diana.
4. La célula dendrítica plasmocitoide genomanipulada para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la respuesta inmunitaria comprende la secreción de citocinas, tales como citocinas proinflamatorias o antiinflamatorias, o comprende el reclutamiento o activación de células inmunitarias del hospedador, tales como Treg o linfocitos citotóxicos.
5. La célula dendrítica plasmocitoide genomanipulada para su uso o la célula dendrítica plasmocitoide genomanipulada de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la construcción exógena comprende además un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que activa una respuesta inmunitaria en la célula cuando el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular se une a la célula diana.
6. La célula dendrítica plasmocitoide genomanipulada para su uso o la célula dendrítica plasmocitoide genomanipulada de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la construcción es un receptor quimérico para el antígeno o un receptor Notch sintético.
7. La célula dendrítica plasmocitoide genomanipulada para su uso o la célula dendrítica plasmocitoide genomanipulada de acuerdo con la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en donde el dominio de señalización intracelular comprende uno o más componentes de señalización de TCR o comprende uno o más factores de transcripción.
8. La célula dendrítica plasmocitoide genomanipulada para su uso o la célula dendrítica plasmocitoide genomanipulada de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular es un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) o un receptor de linfocitos T recombinante.
9. La célula dendrítica plasmocitoide genomanipulada para su uso o la célula dendrítica plasmocitoide genomanipulada de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular reconoce un antígeno asociado a tumor, un autoantígeno asociado con una enfermedad autoinmunitaria o un antígeno específico de tejido.
10. La célula dendrítica plasmocitoide genomanipulada para su uso o la célula dendrítica plasmocitoide genomanipulada de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la célula dendrítica plasmocitoide genomanipulada es una célula dendrítica plasmocitoide procedente de células madre.
11. La célula dendrítica plasmocitoide genomanipulada para su uso o la célula dendrítica plasmocitoide genomanipulada de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la célula dendrítica plasmocitoide genomanipulada expresa TRAIL, CD123, CD303, CD304, CD4, HLA-DR, IFN de tipo I, IFN de tipo II, IFN de tipo III, IRF7, TLR7 y/o TLR9.
12. Una composición farmacéutica que comprende la célula dendrítica plasmocitoide genomanipulada de cualquiera de las reivindicaciones 3 o 5 a 11 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
13. La célula dendrítica plasmocitoide genomanipulada de cualquiera de las reivindicaciones 3 o 5 a 11, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad.
14. La célula dendrítica plasmocitoide genomanipulada de cualquiera de las reivindicaciones 3 o 5 a 11, para su uso en el tratamiento de un cáncer, una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad inflamatoria.
15. Un método para generar una composición terapéutica que comprende una célula dendrítica plasmocitoide genomanipulada que comprende:
- proporcionar células madre progenitoras hematopoyéticas (HSPC),
- incubar dichas HSPC en uno o más medios que comprenden citocinas, factor de crecimiento y/o interferones (IFN), de modo que dichas HSPC se diferencian en pDC precursoras y en pDC que incuban dichas HSPC en uno o más medios, los cuales pueden comprender una o más citocinas, factores de crecimiento, interferones (IFN) y/o antagonistas del receptor de arilhidrocarburo (AHR) (tales como stemregenina-1), por lo que dichas HSPC se diferencian en pDC precursoras y en pDC, y
- transformar dichas HSPC antes de la diferenciación, o transformar dichas pDC después de la diferenciación, con una construcción exógena que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que reconoce un antígeno en una célula diana.
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