ES2960016T3 - Procedimientos de control de plagas - Google Patents
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Abstract
Se describen métodos para controlar plagas agrícolas. Se forma una mezcla líquida aireada a partir de una composición que contiene una fuente de nutrientes bacterianos, un compuesto que contiene nitrógeno, un compuesto que contiene fosfato, un compuesto que contiene magnesio, un tampón, un inductor de quitinasa y al menos una cepa de bacteria que produce quitinasa. . La mezcla líquida se administra al suelo y a las plantas y actúa como pesticida biológico orgánico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimientos de control de plagas
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La presente divulgación se refiere a procedimientos para controlar plagas, particularmente plagas agrícolas que infestan y reducen el rendimiento en la agricultura comercial, concretamente mediante la optimización de la producción de enzimas que degradan la quitina y otras enzimas extracelulares. También se dan a conocer composiciones para su utilización en dichos procedimientos.
Diversas plagas atacan los cultivos y son perjudiciales para la salud de las plantas. Entre los ejemplos de dichas plagas se incluyen nematodos o lombrices tales como nematodos agalladores. Otras infestaciones de cultivos pueden incluir la sigatoka negra, una enfermedad de manchas foliares de las plantas de banano causada por el hongoMycosphaerella fijiensis,que es la principal enfermedad fúngica que afecta a los cultivos de banano; y escarabajos tales comoMonochamus alternatus.Muchas otras enfermedades de las plantas son causadas por organismos fúngicos, tales como la botritis y el oídio. En términos generales, las paredes celulares de las plantas contienen celulosa, mientras que las paredes celulares de los hongos contienen quitina.
Para gestionar dichas infestaciones, las plantas se pueden rotar o tratar con antagonistas naturales, incluyendo bioplaguicidas. Los bioplaguicidas, una contracción común de “plaguicidas biológicos”, incluyen varios tipos de gestión de plagas. Comúnmente asociados con el control biológico, los bioplaguicidas se obtienen de organismos que incluyen plantas, bacterias y otros microbios, hongos, nematodos, etc. Dichos componentes han servido como sustitutos de productos fitosanitarios químicos sintéticos.
DESCRIPCIÓN BREVE
En diversas realizaciones en el presente documento se dan a conocer procedimientos para controlar plagas. Esto se logra en parte mediante la administración de una mezcla líquida aireada que actúa como bioplaguicida. La mezcla líquida aireada se puede preparar mezclando agua con una composición seca que comprende tres cepas de bacterias, según la reivindicación 1, que producen quitinasa; una fuente de nutrientes bacterianos; un compuesto que contiene nitrógeno; un compuesto que contiene fosfato; un compuesto que contiene magnesio; un tampón; y un inductor de quitinasa. La mezcla líquida aireada es un bioplaguicida más potente que la mezcla líquida no aireada. La mezcla líquida no aireada, aplicada directamente al suelo o como pulverización foliar muestra cierta eficacia, mientras que la mezcla aireada muestra una eficacia drásticamente mejorada.
El proceso de aireación para esta mezcla líquida da como resultado la producción mejorada de diversas enzimas extracelulares que promueven el crecimiento de las plantas al atacar las plagas de las plantas. Dichas enzimas incluyen quitinasa, proteasa, amilasa y lipasa, que se espera que actúen en la interfaz raíz/suelo (es decir, la rizosfera) cuando se aplican directamente al suelo. La misma mezcla aplicada como pulverización foliar actuará contra las infecciones fúngicas de las plantas. La mezcla líquida tampoco es tóxica para los animales ni para los seres humanos.
En algunos aspectos, la presente invención se refiere a composiciones secas y al procedimiento de utilización de las mismas para reducir las poblaciones de nematodos. Las composiciones secas contienen una fuente de nutrientes bacterianos, un inductor de quitinasa y, como mínimo, una cepa de bacterias que produce quitinasa. Otros ingredientes incluyen un compuesto que contiene nitrógeno; un compuesto que contiene fosfato; un compuesto que contiene magnesio; y un tampón.
La, como mínimo, una cepa de bacterias comprendeBacillus licheniformis, Bacillus pumilusyBacillus amyloliquefaciens.
El compuesto que contiene nitrógeno se puede seleccionar entre un grupo que comprende cloruro de amonio, nitrato de amonio, sulfato de amonio y fosfato de amonio. En realizaciones particulares, el compuesto que contiene nitrógeno es cloruro de amonio.
El compuesto que contiene fosfato se puede seleccionar entre un grupo que comprende fosfato dipotásico, ácido fosfórico, fosfato diamónico, fosfato disódico, fosfato monosódico y tripolifosfato sódico. En realizaciones particulares, el compuesto que contiene fosfato es fosfato dipotásico.
El compuesto que contiene magnesio se puede seleccionar entre un grupo que comprende sulfato de magnesio y cloruro de magnesio. En realizaciones particulares, el compuesto que contiene magnesio es sulfato de magnesio.
El tampón se puede seleccionar entre un grupo que comprende bicarbonato de sosa o ceniza de sosa (es decir, carbonato de sodio). En realizaciones particulares, el tampón es bicarbonato de sosa.
El inductor de quitinasa es una sustancia que promueve la producción de quitinasa a partir de las bacterias. El inductor de quitinasa puede ser quitina (por ejemplo, coloidal o finamente molida/triturada), celulosa, queratina, quitosano o un derivado de quitina tal como oligómeros de N-acetilglucosamina (GlcNAc).
Aún en otro aspecto adicional, la presente invención se refiere a procedimientos para preparar una mezcla líquida aireada para el control de plagas. Se combina agua con una composición seca como se describió anteriormente para obtener una mezcla líquida. A continuación, la mezcla líquida se airea durante un primer período de tiempo a una primera temperatura para producir una mezcla líquida aireada que contiene, como mínimo, quitinasa y potencialmente también otras enzimas extracelulares.
Se combinan aproximadamente de 453,6 a 907,2 g (1 a 2 libras) de la composición seca con de 100 litros a 400 litros de agua. El primer período de tiempo puede ser de aproximadamente 8 horas a aproximadamente 168 horas, o de aproximadamente 24 horas a aproximadamente 120 horas, o de aproximadamente 48 horas a aproximadamente 72 horas. La primera temperatura puede ser de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 40 °C, o de aproximadamente 23 °C a aproximadamente 40 °C, o de aproximadamente 23 °C a aproximadamente 30 °C. La mezcla líquida puede permanecer dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 9,5 durante la aireación.
En un tercer aspecto, la presente divulgación se refiere a mezclas líquidas aireadas preparadas utilizando las composiciones secas y los procedimientos descritos en el presente documento. Dichas mezclas líquidas aireadas pueden contener, como mínimo, 25 U/ml de quitinasa y también pueden contener otras enzimas tales como celulasa, amilasa, proteasa o lipasa.
En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a procedimientos para controlar nematodos y/o infecciones fúngicas alrededor de plantas, pulverizando una mezcla líquida aireada sobre o alrededor de las plantas, en los que la mezcla líquida aireada se produce como se describió anteriormente. Generalmente se aplican 100 litros de la mezcla líquida aireada sobre de aproximadamente 2000 metros cuadrados (m2) a aproximadamente 4000 m2 de terreno que contiene las plantas.
Las plantas tratadas mediante estas mezclas líquidas y procedimientos pueden ser flores, plantas verdes, plantas leñosas o cultivos tales como hortalizas, frutas, maíz, trigo, soja, etc. Las plagas que se controlan mediante estos procedimientos pueden incluir nematodos y hongos que contienen quitina en sus paredes celulares. De forma deseable, la administración de las mezclas líquidas aireadas es tóxica para las plagas, incluyendo nematodos y hongos patógenos de plantas.
Estas y otras características no limitantes de la presente invención se dan a conocer más particularmente a continuación.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS
El expediente de patente o solicitud contiene, como mínimo, un dibujo ejecutado en color. La Oficina proporcionará copias de esta patente o publicación de solicitud de patente con uno o más dibujos en color previa solicitud y pago de la tarifa necesaria.
Lo siguiente es una descripción breve de los dibujos, que se presentan con el propósito de ilustrar las realizaciones ejemplares dadas a conocer en el presente documento y no con el propósito de limitarlas. Lafigura 1es una representación gráfica de la actividad de quitinasa durante 180 horas después de combinar 907,2 g (dos libras) de la mezcla de polvo seco con 200 litros de agua y airear la mezcla. También se muestra el pH, que está en la misma escala que la actividad de quitinasa.
Lafigura 2es una representación gráfica de nematodos J2 inmóviles/paralizados de poblaciones deMeloidogyne spp.mezclado.
Lafigura 3es una imagen tomada con un aumento de 100x de nematodos J2 inmovilizados deMeloidogyne spp.mezclado suspendido en el producto 1.
Lafigura 4es una imagen tomada con un aumento de 100x de nematodos J2 inmovilizados deMeloidogyne spp. mezclado suspendido en el producto 2.
Lafigura 5es una imagen tomada con un aumento de 100x de nematodos J2 inmovilizados deMeloidogyne spp. mezclado suspendido en el producto 3.
Lafigura 6es una imagen tomada con un aumento de 100x de J2 tanto inmovilizados como en movimiento deMeloidogyne spp.mezclado suspendido en el producto 5.
Lafigura 7es una imagen tomada con un aumento de 100x de nematodos J2 en movimiento deMeloidogyne spp.mezclado suspendido en el producto 6 (control de agua del grifo estéril).
Lafigura 8es una imagen tomada con un aumento de 100x de nematodos J2 inmovilizados deMeloidogyne spp.mezclado suspendido en el producto 7 (control negativo de etanol al 70 %).
Lasfiguras 9A-9Fson un conjunto de seis gráficos que muestran los resultados de pruebas que utilizaron tres cantidades diferentes y dos tipos diferentes de bioplaguicida (en polvo y líquido). En cada gráfico, el eje y es la puntuación ED y va de 0 a 450 en incrementos de 50. El eje x son los días y va de 0 a 98 en incrementos de 14. Las variantes en polvo (que contenían quitina) funcionaron mejor que las variantes líquidas (que no contenían quitina ni quitinasa).
Lafigura 10es un diagrama que ilustra la disposición de los bloques de tratamiento y las celdas de tratamiento utilizadas en un experimento que compara un fungicida convencional, una versión en polvo no activada de una composición de la presente divulgación y una versión líquida activada de la composición. Lafigura 11es un gráfico que compara las puntuaciones ED para los tres tratamientos diferentes a lo largo del tiempo. El eje y es la puntuación ED y va de 0 a 350 en incrementos de 50. El eje x son los días y va de 0 a 35 en incrementos de 7. T1 (Phyton-27) está en cuadrados, T2 (PV) está en círculos y T3 (LAV) está en triángulos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La presente invención puede entenderse más fácilmente haciendo referencia a la siguiente descripción detallada de realizaciones deseadas y los ejemplos incluidos en la misma. En la siguiente memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, se hará referencia a una serie de términos que se definirán con los siguientes significados.
Aunque en la siguiente descripción se utilizan términos específicos en aras de la claridad, estos términos pretenden referirse únicamente a la estructura particular de las realizaciones seleccionadas para ilustración en los dibujos, y no pretenden definir ni limitar el alcance de la presente invención. En los dibujos y en la siguiente descripción a continuación, debe entenderse que designaciones numéricas similares se refieren a componentes de función similar. Además, debe entenderse que los dibujos no están a escala.
Las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Tal como se utiliza en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, el término “que comprende” puede incluir las realizaciones “que consiste en” y “que consiste esencialmente en”. Los términos “comprende(n)”, “incluye(n)”, “que tiene(n)”, “tiene”, “puede(n)”, “contiene(n)” y sus variantes, tal como se utilizan en el presente documento, pretenden ser frases, términos o palabras de transición abiertos que requieren la presencia de los ingredientes/etapas nombrados y permiten la presencia de otros ingredientes/etapas. Sin embargo, debe interpretarse que dicha descripción también describe composiciones o procesos como “que consisten en” y “que consisten esencialmente en” los ingredientes/etapas enumerados, lo que permite la presencia únicamente de los ingredientes/etapas nombrados, junto con cualquier impureza que pueda resultar de los mismos, y excluye otros ingredientes/etapas.
Debe entenderse que los valores numéricos en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones de esta solicitud incluyen valores numéricos que son iguales cuando se reducen al mismo número de cifras significativas y valores numéricos que difieren del valor indicado en menos que el error experimental de la técnica de medición convencional del tipo descrito en la presente solicitud para determinar el valor.
Todos los intervalos dados a conocer en el presente documento incluyen el valor extremo citado y se pueden combinar de forma independiente (por ejemplo, el intervalo de “de 2 gramos a 10 gramos” incluye los valores extremos, 2 gramos y 10 gramos, y todos los valores intermedios).
El término “aproximadamente” se puede utilizar para incluir cualquier valor numérico que pueda variar sin cambiar la función básica de ese valor. Cuando se utiliza con un intervalo, “aproximadamente” también da a conocer el intervalo definido por los valores absolutos de los dos valores extremos, por ejemplo “de aproximadamente 2 a aproximadamente 4” también da a conocer el intervalo “de 2 a 4”. El término “aproximadamente” podrá referirse a más o menos el 10 % del número indicado.
El término “rizosfera” se refiere a la región estrecha del suelo que está directamente influenciada por las secreciones radiculares y los microorganismos del suelo asociados.
La presente solicitud se refiere a procedimientos para controlar plagas utilizando mezclas líquidas que contienen altas cantidades de enzimas que degradan la quitina (es decir, quitinasa) y otras enzimas extracelulares tales como proteasa, amilasa y lipasa. Las mezclas líquidas se elaboran combinando agua con una composición seca. Las mezclas líquidas se pueden utilizar de esta forma o se pueden hacer aún más eficaces mediante aireación. Las composiciones secas contienen bacterias que producen las enzimas y también pueden incluir una mezcla de nutrientes para apoyar el crecimiento de las bacterias. Cuando estas composiciones se aplican a la rizosfera, ralentizan la motilidad de plagas no deseadas tales como los nematodos. Cuando estas composiciones se aplican a las superficies de las plantas (por encima del suelo), ralentizan el crecimiento y reducen la patogenicidad de las infecciones fúngicas. Estas mismas bacterias también pueden proporcionar beneficios que promueven el crecimiento de las plantas, ya sea que se apliquen a la rizosfera o a las superficies de las plantas por encima del suelo. La Patente US2014212376 es un consorcio de bacterias(Bacillus cereusen dos cepas diferentes yBacillus thuringiensis)y se utiliza para el control de nematodos. Las esporas se secan por pulverización y a continuación se formulan con un vehículo y se utilizan en el tratamiento de plantas/suelos contraMelodoigyne, Thylenchulus, Pratylenchus.
Las plantas que pueden tratarse incluyen verduras, frutas, flores, plantas básicas de hojas verdes y cultivos, incluyendo el maíz. Las plagas no deseadas incluyen concretamente nematodos, pero también pueden incluir otras infestaciones de cultivos, tales como la Sigatoka negra, una enfermedad de manchas foliares de las plantas de banano causada por el hongo ascomicetoMycosphaerella fijiensis,y hongos que contienen quitina en sus paredes celulares. Otras plagas no deseadas tales como escarabajos y otras plagas que incluyen quitina en su estructura en uno u otro estadio de su ciclo de vida, serán controladas por la mezcla líquida. Inicialmente, la composición bacteriana seca comprende, como mínimo, una cepa de bacterias que produce quitinasa, en la que, como mínimo, una cepa de bacterias comprendeB. licheniformis, B. pumilusyB. amyloliquefaciens;una fuente de nutrientes bacterianos; un compuesto que contiene nitrógeno; un compuesto que contiene fosfato; un compuesto que contiene magnesio; un tampón; y un inductor de quitinasa.
Otras bacterias que producen quitinasa pueden proceder de cualquiera de los génerosBacillus, Aeromonas, Serratia, Vibrio, Streptomyces, PseudomonasyKlebsiella.Cabe señalar que en la composición seca pueden estar presentes una o más cepas/especies diferentes de bacterias. En la presente invención se utilizanB. licheniformis, B. pumilusyB. amyloliquefaciens. B. licheniformisse puede utilizar para producir quitinasa o celulasa a una tasa elevada. Dichas cepas deB. licheniformispueden producirse sembrando la cepa en placas utilizando medios que dilucidan la producción de quitinasa, a continuación, creciendo y sembrando en placas repetidamente y de manera cíclica para expresar una capacidad mejorada de producción de celulosa y quitinasa. De forma deseable, las bacterias (singulares o plurales) que se utilizan deben seleccionarse para producir quitinasa, así como enzimas adicionales tales como proteasa, amilasa, lipasa y/o celulasa.
Pueden utilizarse bacterias de la misma especie o de especies diferentes en cualquier relación entre sí. Se utilizanB. licheniformis, B. pumilusyB. amyloliquefaciens. B. licheniformispuede tener una alta tasa de producción de celulosa y/o un alta tasa de producción de quitinasa. Se sabe queB. pumiluspromueve el crecimiento de las plantas.B. amyloliquefaciensproduce proteasa, amilasa y lipasa a tasas elevadas. En realizaciones particulares, la relación en peso deB. licheniformisrespecto a(B. pumilus+B. amyloliquefaciens)es de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 3:1.B. subtilistambién se contempla como un organismo útil, ya que es fácil de fabricar y es bien conocido por su capacidad de producción de enzimas extracelulares. Las bacteriasBacillustienen varios rasgos deseables. Sobreviven a la liofilización y/o al secado por pulverización, y tienen una larga vida útil una vez secas, por lo que son útiles en una mezcla de polvo seco.
Las cepas están presentes en la composición seca en una cantidad de, como mínimo, 1 x 106 UFC (es decir, 1E6 UFC) por gramo de polvo seco (en la composición seca). En realizaciones adicionales, la, como mínimo, una cepa de bacterias está presente en una cantidad de aproximadamente 1 x 1010 UFC a aproximadamente 5 x 1012 UFC por kilogramo (kg) de polvo seco, incluyendo de aproximadamente 1 x 1011 UFC a aproximadamente 1 x 1012 UFC por kg de polvo seco. Se puede utilizar una concentración más alta de bacterias en UFC por kg de polvo seco, pero cantidades más allá de los intervalos indicados en el presente documento no parecen ser más eficaces. Estos números de UFC también pueden considerarse la cantidad “total” de bacterias cuando se utiliza más de una especie de bacterias. El término “UFC” se refiere a unidades formadoras de colonias.
Las cepas reivindicadas que están presentes producen enzimas que atacarán a las plagas. Estas enzimas incluyen quitinasa, proteasa, amilasa, lipasa y/o celulasa. La quitinasa rompe los enlaces glucosídicos de la quitina. Las proteasas generalmente descomponen las proteínas hidrolizando enlaces peptídicos. Las amilasas descomponen los carbohidratos de cadena larga (es decir, el almidón) mediante hidrólisis. Las lipasas hidrolizan grasas/lípidos. Las celulasas descomponen la celulosa en azúcares simples.
La fuente de nutrientes bacterianos actúa como fuente de carbono orgánico y factores de crecimiento bacteriano tales como aminoácidos y vitaminas. Se pueden utilizar muchos compuestos diferentes, ya sea individualmente o en mezcla. Algunos ejemplos de materiales que podrían utilizarse como fuente de nutrientes bacterianos incluyen peptona, triptona, caseína, aminoácidos, vitaminas, extracto de carne y extracto de levadura. La peptona se refiere a un derivado proteico obtenido por hidrólisis parcial de proteínas y se utiliza comúnmente en medios de cultivo celular. La triptona se obtiene comúnmente mediante la digestión de caseína mediante tripsina y se utiliza comúnmente para preparar caldo de cultivo celular. En realizaciones particulares, se utiliza extracto de levadura como fuente de nutrientes bacterianos. El extracto de levadura se elabora generalmente extrayendo el contenido celular de la levadura, tal como mediante autólisis. La levadura de la que se deriva el extracto de levadura es generalmente de la claseSaccharomyces.Se contempla particularmente que la levadura seaSaccharomyces cerevisiae(comúnmente conocida como levadura de panadería). La fuente de nutrientes bacterianos (y particularmente el extracto de levadura) puede comprender de aproximadamente el 3 % en peso a aproximadamente el 95 % en peso, o de aproximadamente el 33 % en peso a aproximadamente el 93 % en peso, o más del 50 % en peso, o de aproximadamente el 70 % en peso a aproximadamente el 80 % en peso de la composición seca. La fuente de nutrientes bacterianos habitualmente es la mayoría de la composición seca.
El compuesto que contiene nitrógeno puede ser cualquier fuente que pueda proporcionar amoníaco, directa o indirectamente, para ayudar a las bacterias a crecer y reproducirse. Los compuestos que añadirían amoníaco indirectamente incluyen compuestos tales como urea o proteínas. Sin embargo, son preferentes fuentes directas de amoníaco para que no se requieran etapas intermedias para liberar el amoníaco y hacerlo disponible como fuente de alimento. En realizaciones particulares, el compuesto que contiene nitrógeno puede ser, como mínimo, uno de cloruro de amonio, nitrato de amonio, sulfato de amonio o fosfato de amonio. En realizaciones específicas, el compuesto que contiene nitrógeno es cloruro de amonio. Se contempla que el compuesto que contiene nitrógeno puede comprender de aproximadamente el 0,1 % en peso a aproximadamente el 5 % en peso, o de aproximadamente el 0,25 % en peso a aproximadamente el 3 % en peso, o de aproximadamente el 1 % en peso a aproximadamente el 2 % en peso, o de aproximadamente el 1 % en peso a aproximadamente el 1,5 % en peso de la composición seca.
El compuesto que contiene fosfato debe añadirse en la forma más biodisponible, en concreto, ortofosfato soluble. En realizaciones particulares, el compuesto que contiene fosfato puede ser, como mínimo, uno de fosfato dipotásico, ácido fosfórico, fosfato diamónico, fosfato disódico, fosfato monosódico y tripolifosfato sódico. En realizaciones específicas, el compuesto que contiene fosfato es fosfato dipotásico. Se contempla que el compuesto que contiene fosfato puede comprender de aproximadamente el 0,1 % en peso a aproximadamente el 5 % en peso, o de aproximadamente el 0,1 % en peso a aproximadamente el 1 % en peso, o de aproximadamente el 0,5 % en peso a aproximadamente el 0,75 % en peso de la composición seca.
El compuesto que contiene magnesio puede ser cualquier fuente no tóxica de magnesio divalente. Entre los posibles compuestos se incluyen sulfato de magnesio y cloruro de magnesio. En realizaciones específicas, el compuesto que contiene magnesio es sulfato de magnesio. Se contempla que el compuesto que contiene magnesio puede comprender de aproximadamente el 0,1 % en peso a aproximadamente el 5 % en peso, o de aproximadamente el 0,1 % en peso a aproximadamente el 1 % en peso, o de aproximadamente el 0,5 % en peso a aproximadamente el 0,75 % en peso de la composición seca.
El tampón está destinado a mantener el nivel de pH de la mezcla líquida una vez que la composición seca se combina con agua y se airea. El tampón debe mantener el nivel de pH de la composición entre 6,5 y 9,5 durante toda la duración del período de aireación. En realizaciones particulares, el tampón puede ser bicarbonato de sosa o ceniza de sosa (es decir, carbonato de sodio). En realizaciones específicas, el tampón es bicarbonato de sosa. Se contempla que el tampón puede comprender de aproximadamente el 5 % en peso a aproximadamente el 20 % en peso, o de aproximadamente el 7 % en peso a aproximadamente el 16 % en peso, o de aproximadamente el 12 % en peso a aproximadamente el 15 % en peso de la composición seca.
El inductor de quitinasa es una sustancia que promueve la producción de quitinasa a partir de las bacterias. El inductor de quitinasa puede ser quitina (por ejemplo, coloidal o finamente molida/triturada), celulosa, queratina, quitosano o un derivado de quitina.
Preferentemente, se utiliza quitina como inductor de quitinasa. La quitina puede provenir de una serie de sustancias, incluyendo las paredes celulares de hongos, exoesqueletos de artrópodos tales como crustáceos (por ejemplo, gambas y cangrejos) e insectos, rádulas de moluscos, picos y caparazones internos de cefalópodos, y escamas y tejidos blandos de peces y anfibios. En realizaciones particulares, la quitina proviene de caparazones de cangrejo y caparazones de gamba. La quitina se puede moler para que pase a través de una malla 325 estándar (es decir, aberturas de 0,0017 pulgadas o 44 micrómetros). La quitina se puede añadir en una cantidad de aproximadamente el 0,1 % en peso a aproximadamente el 15 % en peso, o de aproximadamente el 0,1 % en peso a aproximadamente el 5 % en peso, o de aproximadamente el 1 % en peso a aproximadamente el 2 % en peso de la composición seca.
De forma deseable, la composición seca no incluye la presencia de almidones o azúcares. La inclusión de niveles bajos de azúcares solubles o almidón ejerce un fuerte efecto represor sobre la producción de quitinasa.
La composición bacteriana es seca, es decir, no contiene agua añadida. La composición bacteriana seca se puede proporcionar en forma de polvo, gránulos o microesferas. La hidratación normal debida a la humedad atmosférica no perjudica gravemente la eficacia de la composición, pero puede acortar su vida útil. Cabe señalar que el extracto de levadura (que puede utilizarse como fuente de nutrientes bacterianos) es higroscópico y absorberá humedad del aire cuando la composición no esté completamente sellada.
La composición bacteriana seca se utiliza para preparar una mezcla líquida que posteriormente se aplica al suelo/a las plantas para el control de plagas. El agua se combina con la composición bacteriana seca para formar una mezcla líquida inicial o de partida. Esta mezcla líquida por sí sola, cuando se aplica al suelo o como pulverización foliar, tendrá cierta eficacia contra las plagas agrícolas descritas en el presente documento. Sin embargo, para aumentar espectacularmente la eficacia, a continuación se airea la mezcla de partida durante un primer período de tiempo a una primera temperatura para producir la mezcla líquida aireada. La mezcla líquida aireada contiene enzimas que incluyen quitinasa y otras tales como proteasa, amilasa, lipasa y celulasa. La mezcla líquida aireada es aproximadamente de 5 a 10 veces más eficaz que la mezcla líquida no aireada.
Para preparar la mezcla, se combinan entre 453,6 g (1 libra) y 907,2 g (2 libras) de la composición bacteriana en polvo con de 100 litros a 400 litros de agua. Dicho de otra manera, la relación peso/volumen de la composición seca respecto al agua es de aproximadamente 1,13 g/litro (0,0025 lb/litro) a aproximadamente 9,07 g/litro (0,02 lb/litro). En realizaciones específicas, se añaden 907,2 g (dos libras) de la composición bacteriana en polvo a 200 litros de agua. Cuando el contenido orgánico soluble en la mezcla líquida es demasiado alto, la síntesis de enzimas extracelulares útiles se reprime hasta demasiado tarde en el crecimiento aeróbico de la mezcla líquida para su utilización práctica en aplicaciones de control de plagas del mundo real.
A continuación, se airea la composición bacteriana y la mezcla de agua utilizando aireación por burbujas del medio suficientemente vigorosa para proporcionar oxigenación y buena mezcla. La aireación dura un primer período de tiempo de aproximadamente 8 horas a aproximadamente 168 horas, o de aproximadamente 24 horas a aproximadamente 120 horas, o de aproximadamente 48 horas a aproximadamente 72 horas, o en realizaciones específicas, aproximadamente 72 horas. En este sentido, la producción de enzimas generalmente comienza entre 12 y 24 horas y continúa a través de una tasa de producción máxima de 24 horas a 72 horas, con una tasa de producción decreciente gradual después de 72 horas.
La mezcla se puede airear a una primera temperatura de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 40 °C, o de aproximadamente 23 °C a aproximadamente 40 °C, o de aproximadamente 23 °C a aproximadamente 30 °C. En realizaciones específicas, la mezcla se airea de 48 horas a 72 horas a 27 °C. Como se mencionó anteriormente, la mezcla líquida permanece, de forma deseable, dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 9,5 durante la aireación.
La mezcla líquida aireada resultante contiene, de forma deseable, como mínimo, 25 unidades/ml (U/ml) de quitinasa. La mezcla líquida aireada también puede contener otras enzimas tales como celulasa, amilasa, proteasa o lipasa. Una unidad de actividad de quitinasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 pmol de azúcar reductor como equivalente de N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) por minuto.
La presente invención también contempla procedimientos para controlar plagas, tales como nematodos e infecciones fúngicas, en plantas, que comprenden pulverizar la mezcla líquida aireada directamente al suelo, o como pulverización foliar. Esta mezcla aireada se puede aplicar a cultivos y plantas que requieran control de plagas. Para problemas leves (es decir, hasta un 25 % de pérdida de cultivo esperada o típica), 100 litros de mezcla aireada aplicados por 4.000 m2 cada 2-4 semanas deberían controlar adecuadamente las plagas. Para problemas moderados (es decir, 25-50 % de pérdida de cultivo esperada o típica), 100 litros de mezcla aireada aplicados por 4.000 m2 cada 1-2 semanas deberían controlar adecuadamente las plagas. Para problemas graves (es decir, más del 50 % de pérdida de cultivo esperada o típica), 100 litros de mezcla aireada aplicados por 2.000 m2 cada siete días deberían controlar adecuadamente las plagas.
La presente invención se ilustra adicionalmente en los siguientes ejemplos de trabajo no limitantes, entendiéndose que estos ejemplos pretenden ser ilustrativos solamente y que la presente invención no pretende limitarse a los materiales, condiciones, parámetros de proceso y similares enumerados en el presente documento.
EJEMPLOS PRIMER CONJUNTO DE EXPERIMENTOS
Se determinó el efecto de una composición bacteriana sobre la motilidad de nematodos agalladores(Meloidogyne spp.)juveniles de segundo estadio (J2).
Materiales y procedimientos
Se preparó una mezcla de polvo seco de 34,02 kg (75 libras) de la composición bacteriana de acuerdo con la tabla 1 a continuación.
Tabla 1.
Se utilizaron dos cepas diferentes deB. licheniformis.La primera cepa tenía una alta tasa de producción de celulasa, mientras que la segunda cepa tenía una alta tasa de producción de quitinasa.B. pumiluses conocida como una excelente bacteria promotora del crecimiento vegetal.B. amyloliquefacienses conocida como una potente productora de proteasa, amilasa y lipasa.
Los caparazones de cangrejo y gamba se molieron para pasar a través de un tamiz estándar de malla 325. Se trataron cuatro parcelas de 600 m2 de mantillo de planta de mostaza en un campo de crisantemos con vapor calentado para crear una situación inicial cero de infestación.
Se inició una primera preparación y aplicación de la mezcla de polvo seco diluyendo 200 gramos de composición bacteriana en polvo con 50 litros de agua. A continuación, la mezcla se aireó vigorosamente con aire difuso a 27 °C durante 48 horas. Después de 48 horas, la mezcla aireada se aplicó a una primera parcela de 600 m2 de mantillo de planta de mostaza. La primera parcela de 600 m2 de mantillo de planta de mostaza se trató cada dos semanas con la mezcla aireada.
A modo de comparación, también se realizó una segunda preparación de la mezcla de polvo seco diluyendo 200 gramos de composición bacteriana en polvo con 50 litros de agua. Con esta segunda preparación no se realizó aireación. La segunda preparación se aplicó en una segunda parcela de 600 m2 de mantillo de planta de mostaza. La segunda parcela de 600 m2 de mantillo de planta de mostaza se trató cada dos semanas con la mezcla.
Se utilizó agua como control y etanol al 70 % como control negativo, ya que el etanol mata los nematodos, en otras dos parcelas de 600 m2 de mantillo de plantas de mostaza en un campo de crisantemos.
Resultados
Se demostró que la primera preparación (mezcla líquida aireada) mata a los nematodos J2, que se observaron inmóviles o paralizados.
Sin embargo, la segunda preparación (no aireada) no afectó a los nematodos J2, ya que la inspección del mantillo reveló actividad móvil de los nematodos J2. En este ejemplo, la preparación mezclada con agua pero sin aireación no redujo notablemente la actividad del nematodo J2.
SEGUNDO CONJUNTO DE EXPERIMENTOS
Se determinó el efecto de la quitina sobre la motilidad de los nematodos agalladores(Meloidogyne spp.)juveniles de segundo estadio (J2).
Materiales y procedimientos
Se preparó una composición bacteriana de acuerdo con la tabla 2 a continuación. Esta difiere de la composición de la tabla 1 al no incluir quitina.
Tabla 2.
Se mezclaron aproximadamente 200 gramos de la composición bacteriana con 50 litros de agua. A continuación, esta mezcla se aplicó a una parcela de 600 m2 de mantillo de planta de mostaza en un campo de crisantemos tratado con vapor calentado.
No se observó ningún efecto sobre la movilidad del nematodo J2. La inspección del mantillo reveló actividad de nematodos. En otras palabras, se necesitaba quitina para tener efecto sobre la actividad del nematodo J2.
TERCER CONJUNTO DE EXPERIMENTOS
La actividad de quitinasa se ensayó midiendo el azúcar reductor liberado de la quitina coloidal.
Materiales y procedimientos
Se añadieron 150 microlitros (pl) de enzima en bruto a una mezcla que consistía en 300 pl de quitina coloidal al 0,1 % y 150 pl de tampón fosfato 0,1 M (pH 7,0). Después de la incubación a 55 °C durante 10 minutos, la mezcla de reacción se sometió a centrifugación refrigerada a 10.000 rpm durante 5 minutos. Al sobrenadante resultante (200 pl) se le añadieron 500 ml de agua desionizada y 1.000 ml de reactivo de Schales y, a continuación, se hirvió durante 10 minutos. Después de enfriar, se midió la absorbancia de la mezcla a 420 nm. Una unidad de actividad de quitinasa se definió como la cantidad de enzima que produce 1 pmol de azúcar reductor como equivalente de N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) por minuto.
Se añadieron 907,2 g (dos libras) de composición bacteriana preparada de acuerdo con la tabla 3 siguiente a 200 litros de agua del grifo, se precalentó y, a continuación, se mantuvo a 27 °C. A continuación, se aireó vigorosamente la mezcla y se realizaron ensayos a intervalos de 6 horas.
Tabla 3.
Resultados
Lafigura 1ilustra gráficamente la actividad de quitinasa durante 180 horas de reacción aeróbica a 27 °C. Como se puede observar, la actividad de quitinasa aumentó logarítmicamente entre 0 y 60 horas, alcanzando un máximo a las 60 horas, y a continuación disminuyó uniformemente hasta casi 130 horas antes de disminuir abruptamente. La actividad de quitinasa alcanzó 25 U/ml aproximadamente a las 18 horas, alcanzó un máximo de aproximadamente 41 U/ml aproximadamente a las 60 horas y volvió a disminuir hasta 25 U/ml aproximadamente a las 115 horas.
CUARTO CONJUNTO DE EXPERIMENTOS
Materiales y procedimientos
Para obtener nematodos J2 recién nacidos de una mezcla deMeloidogyne spp.:M. incógnitayM. javanica(relación 80:20), se retiraron raíces de tomate infectadas de plántulas de 30 días de las macetas en las que se cultivaron y se lavaron bajo agua corriente del grifo. Los huevos se extrajeron por separado utilizando un procedimiento de NaOCl adaptado (Riekert, 1995). Posteriormente se obtuvieron juveniles de segundo estadio (J2) incubando los huevos extraídos de acuerdo con el procedimiento de Moura et al. (1993) a 25 ± 1 °C. Los juveniles de segundo estadio que se recuperaron después de las primeras 24 horas se descartaron y solo se utilizaron para todos los experimentos los recogidos después de las siguientes 24 horas.
Se prepararon siete tratamientos de acuerdo con las siguientes diluciones enumeradas, a continuación, en la tabla 4.
Tabla 4.
Se transfirió un ml del tratamiento a placas con pocillos de plástico y aproximadamente 100 nematodos J2 en movimiento activo delMeloidogyne spp.mezclado contenidos en 90 |j.l de agua del grifo estéril se añadieron a cada uno de los diferentes tratamientos en cada pocillo. Posteriormente, las placas de pocillos se incubaron en una cabina oscura con temperatura regulada (25 °C ± 1 °C). La motilidad de los nematodos J2 se registró después de 24 horas, 48 horas y 72 horas después de la exposición a los tratamientos contando el número de nematodos J2 móviles y no móviles. Los juveniles de segundo estadio se consideraron inmóviles cuando no se produjo ningún movimiento después de ser observados durante de 30 segundos a 1 minuto utilizando un microscopio estereoscópico con un aumento de 100x.
Los datos fueron sometidos a Anova (Statistica 13), separando las medias mediante la prueba de Tukey (P<0,05).
Resultados
Como se muestra en lasfiguras 4-10, hubo diferencias significativas en los tratamientos con respecto a sus efectos sobre la motilidad del nematodo J2, entre los tres intervalos de tiempo, y la interacción entre los intervalos de tiempo y los tratamientos.
Lafigura 2es una representación gráfica de nematodos J2 inmóviles/paralizados de poblaciones deMeloidogyne spp.mezclado. El efecto actual se observó en F(12,70)=25,1888, p=0,000. Las barras verticales indican intervalos de confianza de 0,95. Los productos 1-5 y el producto 7 (control de etanol al 70 %) mostraron números significativamente mayores de nematodos J2 inmóviles en todos los intervalos de muestreo en comparación con el producto 6 (control de agua del grifo estéril), que mostró significativamente menos nematodos J2 inmóviles. El producto 5 mostró una eficacia ligeramente menor que los productos 1-4 y el producto 7, pero sin embargo mostró un efecto significativo para paralizar los nematodos J2. El producto 5 es la mezcla líquida sin aireación.
Lafigura 3es una imagen tomada con un aumento de 100x de nematodos J2 inmovilizados suspendidos en el producto 1.
Lafigura 4es una imagen tomada con un aumento de 100x de nematodos J2 inmovilizados suspendidos en el producto 2.
Lafigura 5es una imagen tomada con un aumento de 100x de nematodos J2 inmovilizados suspendidos en el producto 3.
Lafigura 6es una imagen tomada con un aumento de 100x de nematodos J2 tanto inmovilizados como en movimiento suspendidos en el producto 5.
Lafigura 7es una imagen tomada con un aumento de 100x de nematodos J2 en movimiento suspendidos en el producto 6 (control de agua del grifo estéril).
Lafigura 8es una imagen tomada con un aumento de 100x de nematodos J2 inmovilizados suspendidos en el producto 7 (control negativo de etanol al 70 %).
DISCUSIÓN
Al principio de la aireación, las bacterias de la composición no produjeron cantidades significativas de las enzimas extracelulares clave (por ejemplo, quitinasa, proteasa, etc.). Durante las primeras 12 a 24 horas de crecimiento aeróbico (dependiendo de la relación específica de la composición con respecto al agua), quedaron suficientes nutrientes solubles y biodisponibles que apoyaron el crecimiento logarítmico de las bacterias en la composición. Después de aproximadamente 18 horas de aireación, las bacterias en la composición agotaron los nutrientes solubles disponibles. A continuación, el cultivo entró en un patrón de crecimiento de fase estacionaria/de muerte. En ese momento, las enzimas extracelulares se producían a una tasa acelerada, a medida que el cultivo pasaba del crecimiento y la reproducción a la síntesis de enzimas extracelulares que ayudaban a producir un nuevo sustrato soluble a partir de macromoléculas que podrían haber estado presentes en el medio.
La extensión de la aireación más allá del crecimiento logarítmico hasta el crecimiento en la fase de muerte es útil para producir grandes cantidades de las enzimas deseadas, mientras que estas enzimas no se producen a concentraciones significativas o útiles durante el crecimiento logarítmico.
La inclusión de quitina finamente molida induce una mayor síntesis de quitinasa. La inclusión de quitina en la presente divulgación induce la síntesis máxima de quitinasa en aquellosBacillusen fase estacionaria/de muerte capaces de producir quitinasa.
Como se vio en el primer y segundo conjunto de experimentos, mezclar la composición bacteriana seca con agua sola no mostró eficacia en el control de plagas o mostró una eficacia reducida en relación con las muestras aireadas. Además, no incluir quitina en la composición dio como resultado una pérdida de eficacia. Puede ser posible elegir selectivamente enzimas degradantes basándose en el tiempo de aireación. Por ejemplo, como se muestra en lafigura 1, la quitinasa se produce preferentemente entre 10 y 60 horas de aireación. La amilasa y la proteasa se producen preferentemente entre 18 y 48 horas de aireación, y la celulasa y la lipasa se producen preferentemente entre 48 y 96 horas de aireación.
QUINTO CONJUNTO DE EXPERIMENTOS
La eficacia de la quitinasa se evaluó en una población de plantas de maíz inoculadas con una mezcla de nematodosMeloidogyne incógnitayMeloidogyne javanica.La dosis por tratamiento y la frecuencia del tratamiento fueron las variables que se cambiaron.
Materiales y procedimientos
Se extrajeron huevos y nematodos juveniles de segundo estadio (J2) deM. incognitayM. javanica(relación 70:30) de las raíces de plantas de tomate infectadas utilizando el procedimiento de NaOCl. Los J2 se eclosionaron colocando los huevos extraídos en un tamiz de malla de 25 pm, se sumergieron en un recipiente de 5 cm de profundidad lleno de agua del grifo y se incubaron a 26 °C durante 48 horas.
Siete grupos (seis grupos de tratamiento, un grupo de control) de seis macetas de plástico, cada una con una capacidad de 10 l, se llenaron con suelo franco arenoso (5,3 % de arcilla, 93,6 % de arena, 1,1 % de limo y 0,47 % de materia orgánica) que tenía un pH de 6,8. El suelo se fumigó con Telone® II (Dow AgroSciences, sustancia activa 1,3-dicloropropeno) a una dosis de 150 l/hectárea (~15 galones/acre). Las macetas se mantuvieron a una temperatura de 21,6 °C a 29,4 °C.
Se añadió 1 kg de la mezcla de polvo seco de la tabla 1 a 200 litros de agua y se airearon vigorosamente a 27 °C durante 72 horas. El tratamiento se aplicó a 1 ml, 5 ml o 10 ml por recipiente (véase la tabla 5). 24 horas antes de la siembra, se inocularon aproximadamente 10.000 huevos y J2 (relación 50:50) y se añadieron a los 5-10 cm superiores del suelo en cada maceta. A continuación se sembró una semilla de la variedad cultivada de maíz DkC 78-79 BR (aproximadamente a 4 cm de profundidad) por maceta y se aplicó el primer tratamiento a cada maceta. Las plantas se regaron tres veces por semana con 0,5 l de agua del grifo y después de cada tratamiento. Se aplicó Nutrifeed (Startke Ayres) como fertilizante líquido (1 gramo/litro de agua) después de observar la emergencia de las plántulas y nuevamente 35 días después (se aplicaron 0,5 litros cada vez, para un total de 1 gramo de Nutrifeed por maceta). El tratamiento se aplicó en 3 aplicaciones mensuales o 9 aplicaciones semanales (véase la tabla 5).
60 días después de la siembra e inoculación, el sistema radicular de cada planta se escindió de las partes aéreas y se pesó la masa aérea. Posteriormente se extrajo de cada maceta el sistema radicular de cada planta, junto con unos 200 gramos de tierra de rizosfera, y se pesó cada sistema radicular. Los huevos y J2 deMeloidogyne spp.se extrajeron del suelo obtenido de cada maceta mediante un procedimiento adaptado de NaOCl, 1995). Los J2 se extrajeron del suelo extraído mediante un procedimiento de decantación, tamizado y flotación de azúcar. Los huevos y J2 se contaron en una placa de recuento utilizando un estereomicroscopio (aumento de 60x).
Los datos de nematodos y masa de plantas aéreas se sometieron a análisis ANOVA unidireccional con medias separadas por la prueba HSD de Tukey (* p < 0,05, * p < 0,01).
Resultados
Todos los grupos de tratamiento tendieron a una reducción de las tasas de supervivencia de huevos nematodos J2 en comparación con el grupo de control, que mostró un aumento en la población de huevos nematodos J2. Los grupos de tratamiento 4 (5 ml por cada tratamiento semanal) y 5 (10 ml por cada tratamiento mensual) tuvieron un efecto estadísticamente significativo sobre las tasas de supervivencia del huevo nematodo J2, como se ilustra en la tabla 5.
Tabla 5.
SEXTO CONJUNTO DE EXPERIMENTOS
Se evaluaron las composiciones de la presente divulgación para determinar su efecto sobre la propagación de la enfermedad fúngica de la sigatoka negra(Mycosphaerella fijiensis)en plantas de banano Cavendish(Musa paradisiaca).
Materiales y procedimientos
Las composiciones se probaron en campos de banano que contenían 2.226 plantas/hectárea ubicados en la República Dominicana durante 97 días. Se utilizaron seis parcelas de tierra, cada una de 0,14 hectáreas (ha). Las plantas de banano tenían aproximadamente 3 meses al comienzo del experimento y aproximadamente 6 meses al finalizar el experimento. Este período se considera el más crítico para el desarrollo de la sigatoka negra. El momento de la prueba también fue un período de intensas precipitaciones, lo que intensifica la progresión de la enfermedad.
Se probó una variante en polvo (PV,powder variant),que tenía la composición de la tabla 6.
Tabla 6.
Se preparó una variante líquida (LV,liquid variant) apartir de la PV de acuerdo con la tabla 6, pero no contenía quitina. Se suspendieron dos kilogramos de polvo de LV en 1.000 litros de agua, se airearon a 27 °C durante 72 horas y se almacenaron durante 28 días a temperatura ambiente antes de su utilización en el experimento. Después de 28 días, se filtró una muestra bien mezclada de la suspensión acuosa para eliminar las bacterias, y el contenido residual de carbono orgánico total restante fue inferior a 25 ppm. Se analizó la suspensión del LV para determinar la actividad de quitinasa y no se detectó ninguna. A continuación se sembró la suspensión de LV utilizando técnicas de siembra diferencial y se verificó mediante PCR 16S que contenía las siguientes cantidades de bacterias:
Las parcelas de prueba en el campo de banano se trataron los días 7, 21, 42 y 82 de acuerdo con el protocolo de dosificación de la tabla 7. Tanto la variante en polvo (PV, contiene quitina) como la suspensión líquida (LV, sin quitina) se probaron a dosis baja, media y alta. Para la LV, la cantidad indicada de suspensión líquida se mezcló con 20 litros de agua y, a continuación, se aplicó a la parcela de prueba. Para la PV, se mezcló la cantidad indicada de polvo en 20 litros de agua y, a continuación, se aplicó a la parcela de prueba.
Tabla 7.
Resultados
El sistema de medición y pronóstico estándar de la industria para la sigatoka negra se describe en Ganry et al., Fruits, 2008, vol. 63, págs. 381-387. Generalmente, los nuevos ataques de hongos sólo se detectan en hojas jóvenes. La progresión de la sigatoka negra es, de este modo, de arriba a abajo de la planta (peor en la parte superior). La esporulación comienza en las fases necróticas de la enfermedad, que es cuando la tasa de infección es máxima. Por ello, es muy importante la detección temprana y la acción preventiva/curativa. La hoja más joven manchada (en días) se combina con la tasa de emisión foliar para expresar el Desarrollo Evolutivo (ED,evolutive development)de la enfermedad como un valor de velocidad. Cuanto mayor sea este valor de ED, mayor será el peligro de alcanzar la fase necrótica. Un valor más bajo de hoja más joven manchada generalmente sugiere una mayor virulencia. La tasa de emisión foliar es la tasa de generación ajustada de hojas nuevas por día. El valor de ED se utiliza como herramienta de pronóstico para identificar cuándo aplicar fungicida. Generalmente se utiliza un valor de ED de 200 o más como umbral para el inicio de la aplicación de control de hongos en la República Dominicana.
Los valores de ED para cada una de las seis parcelas se indican en la tabla 8 siguiente y se representan como gráficos de líneas en lasfiguras 9A-9F. La línea discontinua horizontal indica el valor umbral de ED de 200. Los gráficos muestran una magnitud mucho menor y una tasa reducida de enfermedad de sigatoka negra entre las parcelas de prueba tratadas con PV, en comparación con las parcelas de prueba tratadas con LV. Los tratamientos con LV (sin quitina) no lograron mantener valores de ED aceptables. Se puede observar además una correlación inversamente proporcional entre la dosis de PV y la ED (es decir, cuanto mayor es la dosis, menor es la evolución de la enfermedad).
Tabla 8.
Siempre que el tratamiento se aplicara cada dos o cuatro semanas, las composiciones bacterianas fueron eficaces. En comparación, los tratamientos químicos fueron igualmente eficaces cuando se aplicaron cada cuatro semanas.
Cabe señalar que la variante de PV aplicada no se aireó con el tiempo como en los experimentos anteriores. Se cree que hacerlo aumentaría la potencia de la mezcla líquida, porque la síntesis de quitinasa sería mucho<mayor (aproximadamente de 5 a 10 veces). Esto permitiría controlar los valores de>eD<con una dosis más>baja, una aplicación menos frecuente o una combinación de ambas.
SÉPTIMO CONJUNTO DE EXPERIMENTOS
En el sexto conjunto de experimentos, la variante líquida (LV) no incluía quitina en polvo y solo contenía bacterias. A medida que se aumentó la dosis de LV de 500 ml a 750 ml y 1.000 ml por Ha, no fue evidente una mejor supresión de la Sigatoka negra. Por el contrario, la variante en polvo (PV) sí incluía quitina y, a medida que la dosis de PV aumentó de 226 gramos a 454 gramos y 904 gramos por hectárea, la eficacia mejoró.
Así, en el séptimo conjunto de experimentos, se preparó una variante activada líquida (LAV,liquid adtivated variant)utilizando la pV de la tabla 6. A continuación, la PV y la LAV se probaron en campos de banano que contenían 2.222 plantas/hectárea (2 plantas por 9 m2) ubicados en la República Dominicana durante el transcurso de 35 días. La dosificación se inició a los 90 días después de la siembra.
Materiales
La LAV se preparó de la siguiente manera. Se añadieron 200 litros de agua a un bidón abierto en la parte superior de 55 galones. El bidón estaba equipado con 25 litros por minuto de aire difuso y un pequeño calentador de acuario sumergible de 100 vatios para mantener la temperatura a 27°C. Antes de comenzar la aireación, los 200 litros de agua fueron clorados para esterilizarlos, luego declorados y llevados a 27 °C. Se añadieron 908 gramos (2 libras) de la PV de la tabla 6 al bidón de aireación. La aireación se mantuvo durante 72 horas, momento en el cual se consideró que el lote estaba completo. El líquido del bidón de aireación se utilizó dentro de las 24 horas posteriores a su finalización.
Tanto para la PV como para la LAV, se utilizaron 1.500 gramos por Ha como dosis elegida. Esta fue más alta que la dosis más fuerte de 908 gramos por hectárea utilizada en el sexto conjunto de experimentos.
A modo de comparación, también se aplicó el fungicida Phyton-27 (Phyton Corporation, Bloomington, MN) a parcelas separadas. Phyton-27 es un bactericida y fungicida sistémico de amplio espectro. Phyton-27 contiene sulfato de cobre pentahidratado (21,4 %), equivalente a un 5,43 % de cobre metálico. Se utiliza 1 litro de Phyton-27 para tratar 1 hectárea. 1 litro de Phyton-27 se diluye en 100 galones de agua y a continuación se aplica.
Para los experimentos se utilizaron tres bloques de tratamiento ampliamente espaciados. A continuación, cada bloque se dividió en tres celdas de tratamiento distintas, T1, T2 y T3. Cada celda de tratamiento tenía un área de 10 metros x 10 metros (100 m2). En cada bloque de tratamiento, la celda T1 se trató con Phyton-27, la celda T2 se trató con la variante en polvo (PV) y la celda T3 se trató con la variante activada líquida (LAV). Lafigura 10muestra la disposición de las celdas de tratamiento y los bloques de tratamiento.
Procedimientos
Cada celda de tratamiento recibió tres aplicaciones del producto, específicamente a los 90, 104 y 118 días después de la siembra (es decir, los días 0, 14 y 28 después de la primera dosis).
Cada celda de tratamiento T1 recibió una dosis de 10 ml de Phyton-27. Se cargó un único pulverizador de mochila de 20 litros con 54,6 ml de Phyton-27, se llenó con agua y se utilizó para dosificar cada celda de tratamiento T1. A cada celda T1 se le dosificaron 3,67 litros de solución de la mochila.
Para dosificar cada celda de tratamiento T2, se añadieron 81,7 gramos de PV a 20 litros de agua en el pulverizador de mochila. Cada celda T2 fue dosificada con 3,67 litros de solución de la mochila, lo que correspondía a 1.500 gramos de PV por hectárea. (Cabe señalar que la PV no está activada en comparación con la LAV).
Para dosificar cada celda de tratamiento T3, se añadieron 18 litros de LAV bien mezclada al pulverizador de mochila de 20 litros y se añadieron otros 2 litros de agua para llenar el pulverizador de mochila hasta el nivel de 20 litros. Una vez diluido de esta manera, el pulverizador de mochila contenía el equivalente a 81,7 gramos de PV (antes de la activación) en los 20 litros. Cada celda T3 fue dosificada con 3,67 litros de solución de la mochila, lo que correspondía a 1.500 gramos de PV por hectárea. Como se señaló, para los tratamientos T3, la PV se sometió a un procedimiento de “activación” para obtener la LAV.
Resultados
Los valores de ED promedio para cada una de las tres celdas de tratamiento se indican en la tabla 9, a continuación, y se representan en lafigura 11a lo largo del tiempo.
Tabla 9.
Phyton-27 ralentizó la progresión de la Sigatoka negra, pero la puntuación promedio de ED fue 206. Se logró el control, pero la enfermedad permaneció en el nivel de peligro (ED=200) o por encima del mismo. Después de la dosis inicial, la puntuación promedio de ED fue 152 para la variante en polvo (PV), mientras que el valor promedio para la variante activada (LAV) fue 63.
Estos datos mostraron que la inclusión de quitina triturada en la formulación de LAV aumentó su eficacia en relación con la LV de la tabla 8. Dosis crecientes de PV dieron como resultado una mayor supresión de la Sigatoka negra (compárese la tabla 8 con la tabla 9). La variante activada (LAV) superó en rendimiento tanto a la PV como a Phyton-27.
OCTAVO CONJUNTO DE EXPERIMENTOS
De las diversas plagas que afectan el césped de los campos de golf en Florida, los nematodos se encuentran entre las más difíciles de controlar. Las infestaciones de nematodos son comunes y graves en Florida, ya que el clima y los suelos arenosos proporcionan un hábitat perfecto para muchas de las especies de nematodos más destructivas. Se llevó a cabo una prueba en un campo de golf utilizando la variante de polvo (PV) de la tabla 6.
La PV se activó para optimizar su actividad. Se preparó una variante activada líquida (LAV) a partir de la PV de la siguiente manera. Se añadieron 100 litros de agua del grifo a un tanque, se cloraron para esterilizar y, a continuación, se decloraron. El tanque se llevó a una temperatura de 27 °C utilizando un calentador estilo acuario de 40 vatios. La aireación se suministró a una tasa de 20 litros por minuto a través de una piedra difusora de alúmina de burbuja media sumergida. Se añadió una libra de P<v>al tanque de aireación y se dejó airear durante 72 horas.
La dosis fue de una libra (454 gramos) de PV por acre. El área de evaluación del Green del campo de golf tenía un tamaño de aproximadamente 0,057 acres, por lo que se utilizaron 5,7 litros de LAV.
El día 0 se realizó un primer muestreo con dragas del campo de golf. La LAV se aplicó los días 25 y 39. A continuación se realizó un segundo muestreo con dragas el día 52. Los muestreos con dragas se analizaron para detectar la presencia de nematodos lanza(Hoplolaimus)y nematodos agalladores(Meloidogyne).Los resultados se muestran en la tabla 10, a continuación.
Tabla 10.
La utilización de la LAV produjo una reducción del 45 % al 75 % en la problemática población de nematodos lanza y agalladores.
Claims (15)
1. Composición seca, que comprende, como mínimo, una cepa de bacterias que produce quitinasa; una fuente de nutrientes bacterianos; un compuesto que contiene nitrógeno; un compuesto que contiene fosfato; un compuesto que contiene magnesio; un tampón; y un inductor de quitinasa;
en la que, como mínimo, una cepa de bacterias comprendeB. licheniformis, B. pumilusyB. amyloliquefaciens.
2. Composición seca, según la reivindicación 1, en la que la relación en peso deB. licheniformisrespecto a(B. pumilus+B. amyloliquefaciens)es de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 3:1, en la que el término aproximadamente se refiere a más o menos el 10 % del número indicado.
3. Composición seca, según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en la que la, como mínimo, una cepa de bacterias está presente en una cantidad de, como mínimo, 1 x 106 UFC por gramo de polvo seco, o de aproximadamente 1 x 10910 UFC a aproximadamente 5 x 1012 UFC, de aproximadamente 1 x 1011 UFC a aproximadamente 1 x 1012 UFC, en la que el término aproximadamente se refiere a más o menos el 10 % del número indicado.
4. Composición seca, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la fuente de nutrientes bacterianos comprende peptona, triptona, caseína, un aminoácido, una vitamina, extracto de carne o extracto de levadura; o
en la que la fuente de nutrientes bacterianos comprende de aproximadamente el 3 % en peso a aproximadamente el 95 % en peso, o de aproximadamente el 33 % en peso a aproximadamente el 93 % en peso, o de aproximadamente el 70 % en peso a aproximadamente el 80 % en peso de la composición seca, en la que el término aproximadamente se refiere a más o menos el 10 % del número indicado.
5. Composición seca, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el compuesto que contiene nitrógeno comprende cloruro de amonio, nitrato de amonio, sulfato de amonio o fosfato de amonio; o en la que el compuesto que contiene nitrógeno comprende de aproximadamente el 0,1 % en peso a aproximadamente el 5 % en peso, o de aproximadamente el 0,25 % en peso a aproximadamente el 3 % en peso, o de aproximadamente el 1 % en peso a aproximadamente el 2 % en peso, o de aproximadamente el 1 % en peso a aproximadamente el 1,5 % en peso de la composición seca, en la que el término aproximadamente se refiere a más o menos el 10 % del número indicado.
6. Composición seca, según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el compuesto que contiene fosfato comprende fosfato dipotásico, ácido fosfórico, fosfato diamónico, fosfato disódico, fosfato monosódico o tripolifosfato sódico; o
en la que el compuesto que contiene fosfato comprende de aproximadamente el 0,1 % en peso a aproximadamente el 5 % en peso, o de aproximadamente el 0,1 % en peso a aproximadamente el 1 % en peso, o de aproximadamente el 0,5 % en peso a aproximadamente el 0,75 % en peso de la composición seca, en la que el término aproximadamente se refiere a más o menos el 10 % del número indicado.
7. Composición seca, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el tampón comprende bicarbonato de sosa o ceniza de sosa; o
en la que el tampón comprende de aproximadamente el 5 % en peso a aproximadamente el 20 % en peso, o de aproximadamente el 7 % en peso a aproximadamente el 16 % en peso, o de aproximadamente el 12 % en peso a aproximadamente el 15 % en peso de la composición seca, en la que el término aproximadamente se refiere a más o menos el 10 % del número indicado.
8. Composición seca, según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que el inductor de quitinasa comprende de aproximadamente el 0,1 % en peso a aproximadamente el 15 % en peso, o de aproximadamente el 0,1 % en peso a aproximadamente el 5 % en peso de la composición seca, en la que el término aproximadamente se refiere a más o menos el 10 % del número indicado; o
en la que el inductor de quitinasa comprende quitina, celulosa, queratina, quitosano o un derivado de quitina; o en la que el inductor de quitinasa comprende caparazones de cangrejo molidos o caparazones de gamba molidos que pasan a través de una malla 325.
9. Composición seca, según cualquiera de las reivindicaciones 1-8,
en la que la fuente de nutrientes bacterianos es extracto de levadura y está presente en una cantidad de aproximadamente el 33 % en peso a aproximadamente el 93 % en peso de la composición seca;
en la que el compuesto que contiene nitrógeno es cloruro de amonio y está presente en una cantidad de aproximadamente el 0,1 % en peso a aproximadamente el 5 % en peso de la composición seca;
en la que el compuesto que contiene fosfato está presente en una cantidad de aproximadamente el 0,1 % en peso a aproximadamente el 5 % en peso de la composición seca;
en la que el compuesto que contiene magnesio es sulfato de magnesio y está presente en una cantidad de aproximadamente el 0,1 % en peso a aproximadamente el 5 % en peso de la composición seca;
en la que el tampón está presente en una cantidad de aproximadamente el 5 % en peso a aproximadamente el 20 % en peso de la composición seca; y
en la que el inductor de quitinasa es quitina y está presente en una cantidad de aproximadamente el 0,1 % en peso a aproximadamente el 15 % en peso de la composición seca, en la que el término aproximadamente se refiere a más o menos el 10 % del número indicado.
10. Procedimiento para preparar una mezcla líquida para el control de plagas, que comprende: combinar (A) una composición seca que comprende, como mínimo, una cepa de bacterias que produce quitinasa, en la que la, como mínimo, una cepa de bacterias comprendeB. licheniformis, B. pumilusyB. amyloliquefaciens;una fuente de nutrientes bacterianos; un compuesto que contiene nitrógeno; un compuesto que contiene fosfato; un compuesto que contiene magnesio; un tampón; y un inductor de quitinasa con (B) agua, para obtener una mezcla líquida.
11. Procedimiento, según la reivindicación 10, que comprende, además, airear la mezcla líquida durante un primer período de tiempo a una primera temperatura para producir una mezcla líquida aireada que contiene quitinasa.
12. Procedimiento, según la reivindicación 11, en el que el primer período de tiempo es de aproximadamente 8 horas a aproximadamente 168 horas, o de aproximadamente 24 horas a aproximadamente 120 horas, o de aproximadamente 48 horas a aproximadamente 72 horas, o de aproximadamente 72 horas a aproximadamente 150 horas; o
en el que la primera temperatura es de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 40 °C, o de aproximadamente 23 °C a aproximadamente 40 °C, o de aproximadamente 23 °C a aproximadamente 30 °C; o en el que la mezcla líquida permanece dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 9,5 durante la aireación, en el que el término aproximadamente se refiere a más o menos el 10 % del número indicado.
13. Mezcla líquida producida mediante cualquiera de las reivindicaciones 10-12.
14. Procedimiento para controlar nematodos y/o infecciones fúngicas alrededor de plantas, que comprende pulverizar una mezcla líquida sobre las plantas o alrededor delas mismas, en el que la mezcla líquida se produce mediante cualquiera de las reivindicaciones 10-12.
15. Procedimiento para controlar nematodos y/o infecciones fúngicas alrededor de plantas, que comprende pulverizar una mezcla líquida sobre las plantas o sobre el suelo alrededor de las plantas, en el que la mezcla líquida comprende, como mínimo, una cepa de bacterias que produce quitinasa, en el que la, como mínimo, una cepa de bacterias comprendeB. licheniformis, B. pumilusyB. amyloliquefaciens;una fuente de nutrientes bacterianos; un compuesto que contiene nitrógeno; un compuesto que contiene fosfato; un compuesto que contiene magnesio; un tampón; un inductor de quitinasa; y agua.
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