ES2959778T3 - Método para detectar tuberculosis activa - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a un método para determinar la presencia o ausencia de tuberculosis activa en una muestra, en particular, que comprende determinar los niveles de uno o más biomarcadores seleccionados entre el factor de transcripción de cremallera de leucina básico tipo ATF 2 (BATF2), grupo de diferenciación. 177 (CD177), haptoglobina (HP), cadena J de inmunoglobulina (IGJ) y galectina 10 (CLC), en dicha muestra. También se describen los usos de biomarcadores de la invención y kits para realizar el método de la invención. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Método para detectar tuberculosis activa
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al diagnóstico de tuberculosis. En particular, la invención se refiere a un método para determinar la presencia o ausencia de tuberculosis activa en un sujeto, mediante el análisis de uno o más biomarcadores en una muestra del sujeto.
ANTECEDENTES
10.5 millones de casos de tuberculosis activa (TB) provocan >1.5 millones de muertes al año. El diagnóstico de laboratorio de tuberculosis activa solo se logra en aproximadamente el 60% de los pacientes. Esto depende de la identificación microbiológica deMycobacterium tuberculosis(Mtb), comúnmente socavada por la necesidad de obtener muestras poco accesibles del sitio de la enfermedad y por su poca sensibilidad en la TB extrapulmonar (Boehmeet al., 2013;Norbiset al.,2014; Denkingeret al.,2014; Informe Mundial sobre la Tuberculosis de la<o>M<s>, 2015). Los sistemas de cultivo líquido más rápidos pueden detectar bacterias en 10-19 días y requieren seis semanas para obtener un resultado definitivamente negativo, retrasando así las decisiones clínicas (Dinneset al.,2007).
El desarrollo de nuevos diagnósticos de TB se centra en pruebas rápidas en muestras clínicas de fácil obtención. Estos tienen como objetivo dar un mejor valor predictivo negativo que las pruebas actuales, particularmente cuando el muestreo clínico del sitio de la enfermedad es difícil y en entornos de alta transmisión. También buscan proporcionar un alto valor predictivo positivo en pacientes inmunocomprometidos que están en riesgo de diversas enfermedades infecciosas y en regiones de baja incidencia de TB donde las infecciones alternativas son más probables.
La transcriptómica de sangre entera se ha adelantado de la proteómica y la metabolómica para el descubrimiento de biomarcadores de diagnóstico en TB como resultado de vías de procesamiento de muestras bien establecidas (Maertzdorfet al.,2012a). Esto ha llevado al desarrollo de plataformas de PCR múltiplex rápidas de "muestra de entrada, respuesta de salida" (McHughet al.,2015). Varios grupos han descrito firmas de expresión génica diferencial en pacientes con TB pulmonar activa en comparación con individuos saludables no infectados y aquellos con infección de TB latente (LTBI) (Berryet al.,2010; Bloomet al.,2012; Cliffet al.,2013; Maertzdorfet al.,2012b; Bloomet al.,2013; Kafourouet al.,2013; Walteret al.,2015; Maertzdorfet al.,2015).
Sin embargo, las firmas transcripcionales asociadas con la TB activa en diferentes estudios muestran una superposición modesta, probablemente debido a la variación en las metodologías técnicas y analíticas utilizadas por diferentes estudios, o a las diferencias en las cohortes de pacientes en cada estudio. Ha habido comparativamente poca evaluación de los transcriptomas sanguíneos en TB extrapulmonar y una evaluación limitada de la especificidad de las firmas transcripcionales de sangre asociadas a TB en comparación con otras enfermedades infecciosas o inflamatorias.
Se requieren nuevos diagnósticos rápidos para la tuberculosis activa (TB) para superar los retrasos y la sensibilidad inadecuada de las pruebas microbiológicas actuales que dependen críticamente del muestreo del sitio de la enfermedad. Se han descrito firmas transcriptómicas sanguíneas multiparamétricas asociadas con TB, pero el número de genes incluidos sigue siendo una barrera para su desarrollo como herramienta de diagnóstico.
Los estudios más recientes han buscado reducir el número de genes en una firma de diagnóstico, logrando tan solo 4-51 genes para discriminar la TB activa de individuos saludables con o sin LTBI, o 44-119 genes para discriminar la TB activa de otras enfermedades en adultos (Kafourouet al.,2013; Walteret al.,2015; Maertzdorfet al.,2015). Sin embargo, estos números todavía representan una barrera importante para la traducción.
Un estudio reciente identificó una firma transcripcional en sangre de cuatro genes (GBP1, ID3, P2RY14 e IFITM3) asociada con TB activa (Maertzdorfet al.,2015). Solo GBP1 y P2RY14 se incluyeron entre los genes que mostraron diferencias estadísticamente significativas y de más del doble entre TB activa y los casos posteriores a la recuperación en la cohorte del estudio AdjuVIT. La presente invención busca proporcionar una firma transcripcional en sangre alternativa para diagnosticar la tuberculosis activa usando el número mínimo posible de biomarcadores (en algunos aspectos usando solo un gen individual), y preferiblemente que sea capaz de diagnosticar tuberculosis activa con un mayor grado de confianza que las firmas transcripcionales en sangre de la técnica anterior. La presente invención busca además proporcionar una firma transcripcional en sangre con una especificidad mejorada con respecto a las conocidas en la técnica, por ejemplo, en términos de la capacidad de distinguir entre la tuberculosis activa y otras enfermedades febriles. WO2014093872, WO2014067943, WO2015170108 y WO2013190321 proporcionaron marcadores de expresión adicionales que se encuentra que están asociados con tuberculosis.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los presentes inventores buscaron dilucidar los genes que, individualmente o en combinación, discriminan a los pacientes con tuberculosis activa (TB) de todos los individuos saludables en diversas cohortes de estudio que incluyen individuos asintomáticos sin exposición previa a la TB, aquellos con infección de TB latente (LTBI) y aquellos que se han recuperado de la TB. A continuación, los presentes inventores procedieron a probar la especificidad de las firmas de expresión génica de sangre periférica asociadas con TB en comparación con un repertorio diverso de otras enfermedades infecciosas que se presentan en el hospital, y extendieron su evaluación de estos biomarcadores transcripcionales de diagnóstico a pacientes infectados por VIH y aquellos con TE extrapulmonar. La presente invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
En un aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar la presencia o ausencia de tuberculosis activa en un sujeto, el método comprende los pasos de:
determinar un nivel de un biomarcador que consiste en el factor de transcripción con cremallera de leucina básico tipo ATF 2 (BATF2) en una muestra obtenida de este sujeto,
y comparar el nivel de BATF2 en la muestra con un valor de referencia,
en donde la muestra es una muestra de sangre; y
en donde el nivel de BATF2 en la muestra en comparación con el valor de referencia es indicativo de la presencia o ausencia de tuberculosis activa, en donde un nivel aumentado de BATF2 en una muestra en comparación con el valor de referencia es indicativo de la presencia de tuberculosis activa, en donde el valor de referencia se deriva de uno o más de un sujeto:
(a) sin exposición previa a la tuberculosis;
(b) que tiene una infección de tuberculosis latente (LTBI);
(c) que se ha recuperado de la tuberculosis; o
(d) que no padece enfermedad alguna;
y opcionalmente determinar la presencia o ausencia deMycobacterium tuberculosisen una muestra usando una técnica microbiológica.
También se describe en la presente, pero no forma parte de la presente invención, una firma de biomarcador de cinco genes novedosa y robusta para determinar la presencia o ausencia de tuberculosis activa.
Por lo tanto, también se describe en la presente un método para determinar la presencia o ausencia de tuberculosis activa en una muestra, el método comprende el paso de: determinar un nivel de uno o más biomarcadores seleccionados de:
(a) factor de transcripción con cremallera de leucina básico tipo ATF 2 (BATF2)
(b) agrupación de diferenciación 177 (CD177);
(c) haptoglobina (HP);
(d) cadena J de inmunoglobulina (IGJ); y
(e) galectina 10 (CLC);
en esta muestra.
En la presente se describe el uso de uno o más de:
(a) factor de transcripción con cremallera de leucina básico tipo ATF 2 (BATF2)
(b) agrupación de diferenciación 177 (CD177);
(c) haptoglobina (HP);
(d) cadena J de inmunoglobulina (IGJ); y
(e) galectina 10 (CLC);
como biomarcador para determinar la presencia o ausencia de tuberculosis activa en una muestra.
Preferentemente, los métodos y usos descritos en la presente solo requieren el análisis de BATF2, CD177, HP, IGJ y/o CLC como biomarcadores (es decir, preferentemente, los métodos y usos de la invención no comprenden determinar los niveles de ningún biomarcador de proteína o polinucleótido que no sea BATF2, CD177, HP, IGJ y/o CLC). Aunque, para evitar dudas, los niveles de los biomarcadores se pueden estandarizar en comparación con uno o más genes, proteínas 0 marcadores de mantenimiento, como se describe en la presente.
En particular, los presentes inventores han demostrado que una transcripción individual de sangre del hospedador, BATF2, es suficiente como biomarcador sensible para TB pulmonar y extrapulmonar activa en múltiples cohortes de estudio que incluyen diversas etnias y pacientes infectados por el VIH.
En particular, los presentes inventores han identificado y validado niveles elevados de transcripción de BATF2 en sangre como un biomarcador sensible individual que discrimina TB activa de individuos saludables, con puntuaciones de área bajo la curva (AUC) de característica operativa del receptor (ROC) de 0.93-0.99 en múltiples cohortes de individuos VIH-1 negativos, y 0.85 en individuos infectados por VIH-1.
Además, los presentes inventores han identificado una nueva firma transcripcional en sangre de cuatro genes (que es un subconjunto de la firma de cinco genes mencionada anteriormente), que proporciona especificidad para discriminar TB activa de un espectro diverso de otras enfermedades infecciosas que se presentan en el hospital con fiebre. La nueva firma de sangre de cuatro genes que comprende CD177, haptoglobina (HP), cadena J de inmunoglobulina (IGJ) y galectina 10 (CLC), da un ROC AUC de 0.94-1.
Por lo tanto, la firma de cinco genes anterior se propone como el mejor candidato para el desarrollo de biomarcadores de diagnóstico de sangre periférica para la tuberculosis activa. Los niveles elevados de transcripción de BATF2 en sangre proporcionan un biomarcador sensible que discrimina TB activa de los individuos saludables, y una nueva firma transcripcional de cuatro genes diferencia la TB activa y otras enfermedades infecciosas en individuos que presentan fiebre.
También se describe en la presente un kit para determinar la presencia o ausencia de tuberculosis activa en una muestra, en donde el kit comprende uno o más pares de cebadores o sondas capaces de determinar un nivel de uno o más biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en:
(a) factor de transcripción con cremallera de leucina básico tipo ATF 2 (BATF2)
(b) agrupación de diferenciación 177 (CD177);
(c) haptoglobina (HP);
(d) cadena J de inmunoglobulina (IGJ); y
(e) galectina 10 (CLC);
en esta muestra; en donde el kit comprende opcionalmente un conjunto de instrucciones.
En aun otro aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente antituberculoso para uso en el tratamiento de la tuberculosis activa en un sujeto identificado como que requiere tratamiento de la tuberculosis activa mediante el método de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Tuberculosis (Tb)
La tuberculosis (TB) es una infección provocada por la bacteriaMycobacterium tuberculosis(Mtb), que se propaga a través de la inhalación de pequeñas gotas de la tos o los estornudos de un sujeto infectado.
La TB afecta principalmente a los pulmones. Sin embargo, puede afectar a cualquier parte del cuerpo, incluidas glándulas, huesos y sistema nervioso.
Los síntomas habituales de la TB incluyen: una tos persistente que habitual dura más de tres semanas y usualmente produce flema, que puede ser sanguinolenta; pérdida de peso; sudores nocturnos; alta temperatura (fiebre); cansancio y fatiga; pérdida de apetito; hinchazones.
Por "tuberculosis activa" se entiende que el sujeto infectado con Mtb muestra signos o síntomas de la enfermedad. Un sujeto expuesto a Mtb no necesariamente puede desarrollar la enfermedad. La mayoría de los sujetos son capaces de combatir la infección utilizando varios componentes de su sistema inmunológico. De hecho, los sujetos saludables que están infectados con TB solo tienen un 10% de posibilidades de convertirse en una enfermedad activa a lo largo de su vida. Algunos son capaces de controlar la infección, pero no son capaces de retirarla completamente de sus cuerpos. En estos casos, la infección permanece, permaneciendo en un estado inactivo o "latente".
Por lo tanto, por "infección de tuberculosis latente (LTBI)" se entiende que un sujeto infectado con Mtb no muestra ningún signo o síntoma de la enfermedad.
La LTBI se puede convertir en una enfermedad activa en algún momento, a menudo cuando el sistema inmunitario del sujeto se debilita.
En otra modalidad de la presente invención, la tuberculosis es tuberculosis pulmonar o tuberculosis extrapulmonar. La "tuberculosis pulmonar" es la tuberculosis que afecta a los pulmones. Por ejemplo, la tuberculosis pulmonar puede provocar signos o síntomas en los pulmones.
La "tuberculosis extrapulmonar" es la tuberculosis que se produce en un sitio anatómico que no es el pulmón. Por ejemplo, sujetos que sufren de tuberculosis extrapulmonar pueden mostrar signos o síntomas en el cerebro o pericardio.
Por "determinar la presencia o ausencia de tuberculosis activa" se entiende el acto de diagnóstico de tuberculosis activa en un sujeto o una muestra obtenida de un sujeto (es decir, predicción positiva), o el acto de descartar un diagnóstico de tuberculosis activa en un sujeto o una muestra obtenida de un sujeto (es decir, predicción negativa).
El nivel de uno o más biomarcadores descritos en la presente puede ser indicativo de la presencia o ausencia de tuberculosis activa. Por ejemplo, los niveles pueden ser meramente sugestivos, o pueden denotar definitivamente la presencia o ausencia de tuberculosis activa en un sujeto.
Por lo tanto, el nivel de uno o más biomarcadores descritos en la presente puede sugerir la presencia o ausencia de tuberculosis activa. En otra modalidad, el nivel de uno o más biomarcadores de la invención puede indicar la presencia o ausencia de tuberculosis activa.
Una "enfermedad febril" es aquella caracterizada por fiebre o una temperatura corporal alta. Una "enfermedad infecciosa" es aquella caracterizada por una infección, por ejemplo, una infección microbiana.
Por "una enfermedad febril no tuberculosa" o "enfermedad infecciosa no tuberculosa" se entiende una enfermedad febril o infecciosa distinta de la tuberculosis.
En una modalidad, el sujeto que padece de una enfermedad febril o infecciosa no tuberculosa se presenta al hospital. En otra modalidad, el método o uso de la presente invención es para determinar si un sujeto padece tuberculosis activa o una enfermedad infecciosa no tuberculosa. En particular, la enfermedad infecciosa no tuberculosa puede ser neumonía no tuberculosa o enfermedad febril no tuberculosa.
Como se usa en la presente, el término "técnica microbiológica" se refiere a una técnica para detectar la presencia o ausencia de, y/o medir los niveles de, un microorganismo en una muestra. Los microorganismos incluyen bacterias, protozoos, virus, hongos y algas.
Biomarcador
Los métodos y usos descritos en la presente comprenden determinar el nivel de uno o más biomarcadores.
El método o uso descrito en la presente comprende determinar los niveles de uno o más biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en: BATF2, CD 177, HP, IGJ y CLC.
El método o uso descrito en la presente comprende determinar los niveles del grupo de biomarcadores que consiste en: BATF2, CD177, HP, IGJ y CLC.
El factor de transcripción con cremallera de leucina básico tipo ATF 2 (BATF2) pertenece a la familia de factores de transcripción de la proteína activadora (AP) 1, con expresión inducible por IFN en células fagocíticas mononucleares, también favorecida en expresión por la estimulación inmune innata con lipopolisacárido o Mtb. BATF2 interactúa con el factor regulador de IFN (iRf ) 1 para mediar en las respuestas proinflamatorias posteriores, algunas de las cuales también se reconocen como componentes de la respuesta del hospedador a Mtb (Murphyet al.,2013; Royet al.,2015). Dado que la actividad sistémica de IFN es ampliamente reconocida en TB activa (Berryet al., 2010),lo más probable es que el aumento de la expresión de BATF2 se deba a las respuestas de IFN en lugar de a la estimulación directa de Mtb de las células sanguíneas circulantes.
La cadena J de inmunoglobulina (IGJ), también conocida como cadena de unión de IgA e IgM multiméricas (cadena J), es un polipéptido pequeño expresado por células plasmáticas mucosas y glandulares, que regula la formación de polímeros de IgA e IgM. La incorporación de IGJ en IgA polimérica (pIgA, principalmente dímeros) e IgM pentamérica dota a estos anticuerpos de una alta valencia de sitios de unión al antígeno (lo que los hace adecuados para la aglutinación de bacterias y virus) y poco o ningún potencial de activación del complemento (lo que les permite operar de manera no inflamatoria). Solo los polímeros que contienen IGJ muestran alta afinidad por el receptor de Ig polimérico (pIgR), también conocido como componente secretor transmembrana (SC).
La haptoglobina (HP) es una proteína plasmática que elimina la hemoglobina de fase aguda. El gen de haptoglobina codifica para una preproproteína, que se procesa para producir cadenas alfa y beta, que posteriormente se combinan como un tetrámero para producir haptoglobina. La haptoglobina funciona para unirse a la hemoglobina plasmática libre, lo que permite que las enzimas de degradación accedan a la hemoglobina, al tiempo que evita la pérdida de hierro a través de los riñones y protege a los riñones del daño por la hemoglobina. Este gen se ha relacionado con la nefropatía diabética, la incidencia de enfermedad de las arterias coronarias en la diabetes tipo 1, la enfermedad de Crohn, el comportamiento de la enfermedad inflamatoria, la colangitis esclerosante primaria, la susceptibilidad a la enfermedad de Parkinson idiopática y una incidencia reducida de malaria porPlasmodium falciparum.La proteína codificada también muestra actividad antimicrobiana contra bacterias.
La galectina 10 o galectina cristalina de Charcot-Leyden (CLC) es una proteína de unión a glicano. La proteína codificada por el gen CLC es una lisofosfolipasa expresada en eosinófilos y basófilos. Hidroliza la lisofosfatidilcolina en glicerofosfocolina y un ácido graso libre. Esta proteína puede poseer actividades de unión a carbohidratos o IgE. Está relacionada tanto estructural como funcionalmente con la familia de galectinas de las proteínas de unión a betagalactósidos. Puede estar asociada con inflamación y algunas leucemias mieloides. CLC ha sido evaluado previamente como un biomarcador para la inflamación pulmonar eosinofílica (Chuaet al.,2012).
La agrupación de diferenciación 177 (CD177) es una glicoproteína de superficie celular enlazada a glicosil-fosfatidilinositol (GPI) que desempeña un papel en la activación de neutrófilos y se expresa por subpoblaciones de neutrófilos (Gohringet al.,2004; Stronceket al.,1996; Matsuoet al.,2000). CD177 se puede unir a la molécula de adhesión de células endoteliales plaquetarias-1 (PECAM-1) y funcionar en la transmigración de neutrófilos. Las mutaciones en el gen CD 177 están asociadas con enfermedades mieloproliferativas. Se ha encontrado sobreexpresión de CD177 en pacientes con policitemia rubra vera. Los autoanticuerpos contra la proteína pueden provocar reacciones de transfusión pulmonar y pueden estar implicados en la granulomatosis de Wegener.
Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de BATF2, CD177, HP, IGJ y CLC humanas están disponibles en bases de datos de acceso público, por ejemplo, con los números de acceso que se muestran en la tabla a continuación:
Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos correspondientes a variantes y homólogos adicionales de los genes anteriores, así como los genes encontrados en otras especies, se pueden encontrar en bases de datos similares de acceso público o mediante la identificación de secuencias que muestran homología con las secuencias humanas anteriores.
Las secuencias de ARN mensajero (ARNm) de biomarcadores descritos en la presente se muestran en la presente como SEQ ID NO: 1-9. SEQ ID NO: 1 es una secuencia de ARNm de IGJ humana; SEQ ID NO: 2-4 son tres variantes de transcripción de una secuencia de ARNm de HP humana; SEQ ID NO: 5 es una secuencia de ARNm de CLC humana; SEQ ID NO: 6 es una secuencia de ARNm de CLC humana; SEQ ID NO: 7-9 son tres variantes de transcripción de una secuencia de ARNm de BATF2 humano, un biomarcador de la invención.
Los biomarcadores pueden comprender o consistir en una o más de SEQ ID NO: 7-9, o un derivado, fragmento o variante de los mismos, o una secuencia que tiene al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% de identidad a los mismos. Los cebadores o sondas descritos en la presente pueden comprender o consistir en una o más de SEQ ID NO: 1-9, un derivado, fragmento o variante de los mismos, una secuencia que tiene al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% de identidad a la misma; o el complemento inverso de SEQ ID NO: 1-9, un derivado, fragmento o variante del mismo o una secuencia que tiene identidad al mismo.
Base de timidina (T) de cualquiera de SEQ ID NO: 1-9 se puede reemplazar por base de uracilo (U). Ejemplos de secuencias de cebadores o sondas para cada uno de los biomarcadores descritos en la presente:
BATF2:
TGGAAGTTCAGTTTTGGTGTCTGCTTCAAGAGGGGGTTTTACACTCTGAT TCCAGGACAA (SEQ ID NO: 10)
CD177:
CTTGGACACCAGATTCTTTCCCATTCTGTCCATGAATCATCTTCCCCACA CACAATCATT (SEQ ID NO: 11)
HP:
GATAAGATGTGGTTTGAAGCTGATGGGTGCCAGCCCTGCATTGCTGAGT CAATCAATAAA (SEQ ID NO: 12)
IGJ:
TTGGGTGATGT AAAACC AACTCCCTGCC ACCAAAAT AATT AAAAT AGTC ACATTGTTATC (SEQ ID NO: 13)
CLC:
TCTCCCTGACC AAATTTAATGTC AGCT ATTT AAAGAGAT AACCAGACTT CATGTTGCCAA (SEQ ID NO: 14)
En la presente se describe el uso de uno o más de:
(a) factor de transcripción con cremallera de leucina básico tipo ATF 2 (BATF2)
(b) agrupación de diferenciación 177 (CD177);
(c) haptoglobina (HP);
(d) cadena J de inmunoglobulina (IGJ); y
(e) galectina 10 (CLC);
como biomarcador para determinar la presencia o ausencia de tuberculosis activa en un sujeto, o muestra del mismo. También se describe en la presente el uso de:
(a) factor de transcripción con cremallera de leucina básico tipo ATF 2 (BATF2)
(b) agrupación de diferenciación 177 (CD177);
(c) haptoglobina (HP);
(d) cadena J de inmunoglobulina (IGJ); y
(e) galectina 10 (CLC);
como biomarcadores para determinar la presencia o ausencia de tuberculosis activa en un sujeto, o muestra del mismo. Se describe adicionalmente en la presente el uso de:
(a) agrupación de diferenciación 177 (CD177);
(b) haptoglobina (HP);
(c) cadena J de inmunoglobulina (IGJ); y
(d) galectina 10 (CLC);
como biomarcadores para determinar la presencia o ausencia de tuberculosis activa en un sujeto, o muestra del mismo. Preferentemente, la muestra se obtiene de un sujeto.
La presente invención proporciona el uso del factor de transcripción con cremallera de leucina básico tipo ATF 2 (BATF2) como biomarcador para determinar la presencia o ausencia de tuberculosis activa en un sujeto o muestra del mismo. Por consiguiente, el método o uso de la presente invención puede comprender determinar el nivel de BATF2.
En una modalidad particular, se determina un nivel de BATF2 y no se determina ninguno de IGJ, CLC, HP y CD177. En una modalidad particular, se determina un nivel de BATF2, con exclusión de todos los demás biomarcadores. En otras palabras, el método o uso de la presente invención consiste en, o consiste esencialmente en, determinar el nivel de BATF2 en una muestra obtenida de un sujeto.
Como se describe en la presente, se determinan los niveles de todos de IGJ, CLC, HP y CD177, pero no se determina BATF2.
Como se describe en la presente, se determinan los niveles de todos de BATF2, CD177, HP, IGJ y CLC, con exclusión de todos los demás biomarcadores.
De acuerdo con lo anterior, una combinación particularmente preferida de biomarcadores es: BATF2 y uno de IGJ, CLC, HP y CD177.
De acuerdo con lo anterior, una combinación particularmente preferida de biomarcadores es: BATF2 y CD 177.
De acuerdo con lo anterior, una combinación particularmente preferida de biomarcadores es: BATF2 y dos cualquiera de IGJ, CLC, HP y CD177.
De acuerdo con lo anterior, una combinación particularmente preferida de biomarcadores es: BATF2 y tres cualquiera de IGJ, CLC, HP y CD177.
En una modalidad, se determina el nivel de BATF2 y un nivel aumentado de BATF2 en una muestra obtenida del sujeto en comparación con un valor de referencia es indicativo de la presencia de tuberculosis activa.
En una modalidad, se determina el nivel de BATF2 y un nivel aumentado de BATF2 en una muestra obtenida del sujeto en comparación con un valor de referencia sugiere la presencia de tuberculosis activa.
En una modalidad, se determina el nivel de BATF2 y un nivel aumentado de BATF2 en una muestra obtenida del sujeto en comparación con un valor de referencia denota la presencia de tuberculosis activa.
En una modalidad, se determina el nivel de BATF2 y un nivel inalterado de BATF2 en una muestra obtenida del sujeto en comparación con un valor de referencia es indicativo de la ausencia de tuberculosis activa.
Se describe en la presente la determinación de los niveles del grupo que consiste en: IGJ, HP, CLC y CD177.
Como se describe en la presente, se determina un nivel de IGJ, y un nivel aumentado de IGJ en una muestra obtenida del sujeto en comparación con un valor de referencia es indicativo de la presencia de tuberculosis activa.
Como se describe en la presente, se determina un nivel de CLC, y un nivel aumentado de CLC en una muestra obtenida del sujeto en comparación con un valor de referencia es indicativo de la presencia de tuberculosis activa.
Como se describe en la presente, se determina un nivel de HP, y un nivel disminuido de HP en una muestra del sujeto en comparación con un valor de referencia es indicativo de la presencia de tuberculosis activa.
Como se describe en la presente, se determina un nivel de HP, y el aumento del nivel de HP en una muestra del sujeto en comparación con un valor de referencia es indicativo de la presencia de una enfermedad no tuberculosa.
Como se describe en la presente, se determina un nivel de CD177, y un nivel disminuido de CD177 en una muestra obtenida del sujeto en comparación con un valor de referencia es indicativo de la presencia de tuberculosis activa. Como se describe en la presente, se determina un nivel de CD177, y un nivel aumentado de CD177 en una muestra obtenida del sujeto en comparación con un valor de referencia es indicativo de la presencia de una enfermedad no tuberculosa.
Como se describe en la presente, se determina un nivel de BATF2 y CD177, y un nivel aumentado de BATF2 en una muestra obtenida del sujeto en comparación con un valor de referencia junto con un nivel disminuido de CD177 en una muestra obtenida del sujeto en comparación con un valor de referencia es indicativo de la presencia de tuberculosis activa. Como se describe en la presente, se determina un nivel de BATF2 y HP, y un nivel aumentado de BATF2 en la muestra del sujeto en comparación con un valor de referencia junto con un nivel disminuido de HP en la muestra del sujeto en comparación con un valor de referencia es indicativo de la presencia de tuberculosis activa.
Como se describe en la presente, se determina un nivel de BATF2 e IGJ, y un nivel aumentado de BATF2 en una muestra obtenida del sujeto en comparación con un valor de referencia junto con un nivel aumentado de IGJ en una muestra obtenida del sujeto en comparación con un valor de referencia es indicativo de la presencia de tuberculosis activa. Como se describe en la presente, se determina un nivel de BATF2 e CLC, y un nivel aumentado de BATF2 en una muestra obtenida del sujeto en comparación con un valor de referencia junto con un nivel aumentado de CLC en una muestra obtenida del sujeto en comparación con un valor de referencia es indicativo de la presencia de tuberculosis activa. Por lo tanto, el método o uso descrito en la presente abarca determinar el nivel de cualquiera de las siguientes combinaciones de biomarcadores:
IGJ y HP;
IGJ y CLC;
IGJ y CD177;
HP y CLC;
HP y CD177;
CLC y CD177;
BATF2, IGJ y HP;
BATF2, IGJ y CLC;
BATF2, IGJ y CD177;
BATF2, HP y CLC;
BATF2, HP y CD177;
BATF2, CLC y CD177;
IGJ, HP y CLC;
IGJ, HP y CD177;
HP, CLC y CD177;
BATF2, IGJ, HP y CLC;
BATF2, HP, CLC y CD177;
BATF2, IGJ, CLC y CD177;
BATF2, IGJ, HP y CD177;
IGJ, HP, CLC y CD177;
BATF2, IGJ, HP, CLC y CD177;
preferiblemente en donde cuando se determina un nivel de IGJ y/o CLC, un nivel aumentado de IGJ y/o CLC en comparación con un valor de referencia es indicativo de la presencia de tuberculosis activa; preferiblemente en donde cuando se determina un nivel de HP y/o CD177, un nivel disminuido de HP y/o CD177 en comparación con un valor de referencia es indicativo de la presencia de tuberculosis activa; preferiblemente en donde cuando se determina un nivel de BATF2, un nivel aumentado de BATF2 en comparación con un valor de referencia es indicativo de la presencia de tuberculosis activa; o un nivel inalterado o disminuido de BATF2 en comparación con un valor de referencia es indicativo de la ausencia de tuberculosis activa. La determinación de los niveles de cada uno de los conjuntos de biomarcadores anteriores puede ser con exclusión de todos los otros biomarcadores.
El biomarcador de la invención puede ser una proteína o ácido nucleico. El ácido nucleico puede ser un ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN). El ARN puede ser un pre-ARNm o ARNm.
En una modalidad preferida, el biomarcador es un ARNm maduro.
Por lo tanto, en una modalidad, el método o uso de la invención comprende determinar el nivel de ARNm o proteína de BATF2.
El diagnóstico de la tuberculosis se realiza tradicionalmente mediante la determinación de la presencia o ausencia deMycobacterium tuberculosisen el sujeto. Por consiguiente, el método o uso de la presente invención puede comprender opcionalmente el paso de confirmar la presencia o ausencia deMycobacterium tuberculosisen el sujeto usando una técnica microbiológica convencional. Las técnicas microbiológicas convencionales para determinar la presencia o ausencia deMycobacterium tuberculosisserán familiares para un experto en la técnica.
Ventajosamente, el uso del biomarcador reivindicado en la presente permite un diagnóstico preliminar rápido y fácil de la tuberculosis activa, que puede verificarse posteriormente mediante una técnica microbiológica convencional para detectarMycobacterium tuberculosis.Un diagnóstico preliminar positivo de tuberculosis activa utilizando los biomarcadores reivindicados en la presente permite al paciente comenzar el tratamiento inmediato sin demora, mejorando de este modo el pronóstico y al mismo tiempo reduciendo la posible propagación de la enfermedad. Por otro lado, un diagnóstico preliminar negativo utilizando el biomarcador reivindicado en la presente evita el tratamiento innecesario de pacientes que no tienen tuberculosis activa, evitando de este modo posibles efectos adversos tal como toxicidad y/o resistencia a fármacos, y el inevitable desperdicio de recursos valiosos.
Nivel de biomarcador
El método de la presente invención comprende el paso de determinar un nivel de factor de transcripción con cremallera de leucina básico tipo ATF 2 (BATF2) en una muestra. Preferentemente, la muestra se obtiene de un sujeto.
El método de acuerdo con la presente invención puede comprender además el paso de comparar el nivel de este biomarcador en una muestra con un valor de referencia, en donde el nivel del biomarcador en la muestra en comparación con el valor de referencia es indicativo de la presencia o ausencia de tuberculosis activa en el sujeto.
Por "determinar un nivel" se entiende medir, ya sea cuantitativa o semicuantitativamente, la cantidad de una sustancia en particular. Habitualmente, la determinación revelará el nivel absoluto de una sustancia en una muestra de un sujeto, o el nivel de una sustancia en relación con el nivel de una muestra o valor de referencia.
Un nivel de una sustancia se puede determinar más de una vez en una muestra dada, por ejemplo, con el propósito de cálculos estadísticos. De manera alternativa o adicional, se puede determinar un nivel una o más veces en más de una muestra obtenida de un sujeto.
En una modalidad preferida, el nivel del biomarcador de la invención se determina en forma de una transcripción de ARNm.
En una modalidad, el nivel de un biomarcador de transcripción de ARNm de la invención se mide o determina con respecto al nivel de un valor de biomarcador de transcripción de ARNm de referencia.
Las técnicas aplicables para determinar el nivel de un biomarcador de acuerdo con la presente invención son conocidas por el experto en la técnica.
Estas técnicas incluyen, pero no se limitan a, análisis de transferencia Northern, ensayos de protección de nucleasa (NPA), por ejemplo, ensayos de protección de ARNasa, PCR de transcriptasa inversa (RT-PCT), PCR cuantitativa (qPCR), matriz, micromatriz, microchip de ADN, secuenciación de ADN que incluye minisecuenciación, extensión de cebadores, hibridación con oligonucleótidos específicos de alelo (ASO), ensayos de ligación de oligonucleótidos (OLA), PCR que utiliza cebadores específicos de alelo (ARMS), análisis de transferencia de puntos, enfoques de escisión de sondas flap, polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), PCR cinética y PCR-SSCP, hibridación in situ, hibridación fluorescente in situ (FISH), análisis de electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), análisis de transferencia Southern, análisis de conformación de hebra individual (SSCA), electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE), electroforesis en gel de gradiente de temperatura (TGGE), HPLC desnaturalizante (DHPLC) y combinaciones de los anteriores, todos los cuales son conocidos por el experto en la técnica.
En una modalidad preferida, el nivel de ARNm se determina mediante uno o más de RT-PCR, qPCR, microarreglo o secuenciación de ARN.
Como se usa en la presente, un "arreglo" incluye cualquier disposición bidimensional o sustancialmente bidimensional (así como una tridimensional) de regiones direccionables que portan una porción o porciones químicas particulares (por ejemplo, biopolímeros, tal como secuencias de polinucleótidos u oligonucleótidos (ácidos nucleicos), polipéptidos (por ejemplo, proteínas), carbohidratos, lípidos,etc.).El arreglo puede ser un arreglo de agentes de unión poliméricos, tal como polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos o miméticos sintéticos. Habitualmente, el arreglo es un arreglo de ácidos nucleicos, que incluye oligonucleótidos, polinucleótidos, ADNc, ARNm, miméticos sintéticos de los mismos y similares. Cuando las matrices son matrices de ácidos nucleicos, los ácidos nucleicos se pueden unir covalentemente a las matrices en cualquier punto a lo largo de la cadena de ácido nucleico, pero en general se unen en uno de sus extremos (por ejemplo, el extremo 3' o 5'). A veces, los arreglos son arreglos de polipéptidos, por ejemplo, proteínas o fragmentos de las mismas.
Una matriz o microchip para uso con la presente invención consiste habitualmente en miles de sondas de nucleótidos distintas que se construyen en una matriz en un chip de silicio. El ácido nucleico a analizar se marca con fluorescencia y se hibrida con las sondas en el chip. Este método es uno de procesamiento paralelo de miles de sondas a la vez y puede acelerar enormemente el análisis. En varias publicaciones se describe el uso de este método (Nature Genetics, 1996; 14: 441; Nature Genetics, 1996; 14: 450; Science, 1996; 274: 610; Nature Genetics, 1996; 14: 457; Genome Res, 2000;10: 853).
La determinación de biomarcadores de ARNm se puede lograr mediante transcripción inversa, amplificación, por ejemplo, por PCR, a partir del ADNc resultante y electroforesis en gel y/u opcionalmente secuenciación del ácido nucleico amplificado usando técnicas bien conocidas en la técnica.
Como tal, los biomarcadores de ARNm de acuerdo con la presente invención se pueden analizar usando uno o más pares de cebadores o sondas. En una modalidad particularmente preferida, la sonda es SEQ ID NO: 10 como se describe en la presente.
En una modalidad preferida, el nivel del biomarcador de la invención se determina mediante la detección de niveles de proteína (polipéptido).
El paso de determinar el nivel del biomarcador de la invención puede implicar la detección del polipéptido utilizando una técnica tal como citometría de flujo, arreglos basados en anticuerpos, ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA), andamios de proteínas no anticuerpos (por ejemplo, andamios de fibronectina), radioinmunoensayo (RIA), transferencia Western, aptámeros o espectrometría de masas, por ejemplo.
Se puede realizar un ELISA de acuerdo con métodos generales que se conocen en la técnica. Por ejemplo, el ELISA puede ser un ELISA sándwich o competitivo.
Varios marcadores de sustrato enzimático están disponibles para su uso con estos ELISA, por ejemplo, como se describe en US 4,275,149. La enzima en general cataliza una alteración química del sustrato cromogénico que se puede detectar. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, o puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Los ejemplos de etiquetas enzimáticas incluyen peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante (HRPO), fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tal como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares. Se conocen bien las técnicas para conjugar enzimas con anticuerpos.
La determinación usando aptámeros también se conoce en la técnica. Los aptámeros pueden ser secuencias de ADN o ARN de hebra individual que se pliegan en una estructura 3D única que tiene una combinación de tallos, bucles, cuádruples, pseudonudos, protuberancias u horquillas. El reconocimiento molecular de los aptámeros resulta de interacciones intermoleculares tal como el apilamiento de anillos aromáticos, interacciones electrostáticas y de van der Waals, o enlaces de hidrógeno con un compuesto diana. Además, la interacción específica entre un aptámero y su diana se complementa a través de un mecanismo de ajuste inducido, que requiere que el aptámero adopte una estructura plegada única para su diana. Los aptámeros se pueden modificar para unirse con moléculas de marcaje tal como colorantes, o inmovilizarse en la superficie de perlas o sustratos para diferentes aplicaciones.
Los aptámeros se pueden emparejar con nanotecnología, micromatrices, microfluidos, espectrometría de masas y otras tecnologías para la cuantificación en una muestra determinada.
El momento de la determinación del nivel de biomarcadores no está particularmente restringido. Por lo general, el nivel se determinará en una muestra de un sujeto que muestra signos o síntomas de tuberculosis activa. En una modalidad ventajosa, el nivel de biomarcadores es capaz de predecir el inicio de la tuberculosis activa en una muestra de un sujeto que aún no muestra signos o síntomas de la enfermedad. En otra modalidad ventajosa, el nivel de biomarcadores es capaz de actuar como un criterio de valoración sustituto de la respuesta al tratamiento o terapia antituberculosa.
Por lo tanto, la presente invención también proporciona métodos para predecir el inicio de la tuberculosis activa en una muestra de un sujeto que aún no muestra signos o síntomas de la enfermedad, el método comprende determinar el nivel del biomarcador de la invención. BATF2 es un biomarcador particularmente útil en este aspecto de la invención.
Por consiguiente, en una modalidad de la invención, el paso de determinar un nivel del biomarcador de la invención se lleva a cabo:
(a) antes del inicio de la tuberculosis activa en el sujeto; y/o
(b) mientras el sujeto muestra síntomas de tuberculosis activa; y/o
(c) durante y/o después del uso de un agente antituberculoso para tratar la tuberculosis activa.
Por ejemplo, el nivel se puede determinar hasta aproximadamente 12 meses, preferentemente aproximadamente 3 meses antes del inicio de la enfermedad, por ejemplo, la aparición de signos o síntomas de tuberculosis activa. El nivel también se puede determinar alrededor de 8 semanas o más después del inicio del tratamiento del sujeto con un agente antituberculoso.
Por "aumento en el nivel de un biomarcador" o "aumento en el nivel de un biomarcador", se entiende que el nivel relativo o absoluto del biomarcador es de un valor sustancialmente mayor en comparación con un valor de referencia (o de línea base).
Por "disminución en el nivel de un biomarcador" o "disminución del nivel de un biomarcador" se entiende que el nivel relativo o absoluto del biomarcador es de un valor sustancialmente menor en comparación con un valor de referencia (o de línea base).
En modalidades de la presente invención, un nivel aumentado del biomarcador en la muestra de prueba en comparación con el valor de referencia es indicativo de la presencia de tuberculosis activa en el sujeto. Como se describe en la presente, un nivel disminuido de un biomarcador en la muestra de prueba en comparación con el valor de referencia es indicativo de la presencia de tuberculosis activa en el sujeto. En estas modalidades, preferentemente el nivel de biomarcador en la muestra de prueba difiere en al menos 1%, al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 50%, al menos 75% o al menos 100% en comparación con el valor de referencia o el intervalo de valores de referencia, o la media del intervalo de valores de referencia.
Más preferentemente, el nivel de biomarcador en la muestra de ensayo difiere en al menos 2 veces, por ejemplo, al menos 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 8 veces o 10 veces en comparación con el valor de referencia o el intervalo de valores de referencia o la media del intervalo de valores de referencia.
Más preferentemente, el nivel de biomarcador en la muestra de prueba difiere en al menos 2 veces en comparación con la media del intervalo de valores de referencia.
Por "nivel inalterado de un biomarcador" se entiende que el nivel relativo o absoluto del biomarcador es sustancialmente del mismo valor en comparación con un valor de referencia, o se encuentra dentro del intervalo de valores de referencia. En una modalidad, un nivel inalterado significa un nivel que difiere en menos de 2 veces, tal como menos de 1.5 veces, en comparación con el valor de referencia, el intervalo de valores de referencia o la media del intervalo de valores de referencia.
Como será evidente para el experto en la técnica, la determinación real de si un nivel aumenta, disminuye o no cambia sustancialmente en comparación con un valor de referencia (o de referencia) puede depender del resultado de uno o más análisis estadísticos, todos los cuales son conocidos y son rutinarios para el experto en la técnica.
Valor de referencia
En ciertas modalidades de la presente invención, los niveles de biomarcadores se comparan con los valores de referencia. Los "valores de referencia" incluyen, pero no se limitan a, valores obtenidos de sujetos de referencia (y muestras obtenidas de los mismos), o valores absolutos predeterminados.
Habitualmente, un valor de referencia se deriva de un sujeto sano, un sujeto que se sabe que padece una condición o enfermedad particular, o un sujeto que se ha recuperado de una condición o enfermedad particular.
En el contexto de la presente invención, el valor de referencia se puede derivar de uno o más de:
(a) un sujeto sin exposición previa a tuberculosis;
(b) un sujeto que tiene una infección de tuberculosis latente (LTBI);
(c) un sujeto que se ha recuperado de tuberculosis;
(d) un sujeto que padece una enfermedad no tuberculosa o una enfermedad infecciosa no tuberculosa;
(e) un sujeto que padece neumonía no tuberculosa o enfermedad febril no tuberculosa.
El valor de referencia puede ser, por ejemplo, una medición predeterminada de un nivel de ICJ, HP, CLC, CD177 o BATF2 que está presente en una muestra de un sujeto normal, es decir, un sujeto que no padece tuberculosis activa o cualquiera de (a) a (e) anteriores. El valor de referencia puede, por ejemplo, basarse en un nivel medio o mediano del biomarcador en una población de control de sujetos, por ejemplo, 5, 10, 100, 1000 o más sujetos (que pueden ser de la misma edad y/o sexo o no coincidentes con el sujeto de prueba) que no muestran síntomas de tuberculosis activa.
El valor de referencia se puede determinar usando métodos correspondientes a la determinación del nivel de biomarcadores en la muestra de prueba, por ejemplo, usando una o más muestras tomadas de una población de control de sujetos. Por ejemplo, en algunas modalidades, los niveles de biomarcadores en las muestras de valores de referencia se pueden determinar en ensayos paralelos a las muestras de prueba. En modalidades alternativas, el valor de referencia se puede haber determinado previamente, o se puede calcular o extrapolar, sin tener que realizar una determinación correspondiente en un valor de referencia con respecto a cada muestra de prueba obtenida.
En una modalidad, el valor de referencia se deriva de un sujeto que padece tuberculosis activa.
En una modalidad, el valor de referencia se deriva del mismo sujeto, pero en un momento anterior. Por lo tanto, la invención puede permitir monitorear el estado de un sujeto, tal como la progresión de la enfermedad en un sujeto, a lo largo del tiempo. En particular, esta modalidad encuentra utilidad cuando se monitorea la respuesta a la terapia antituberculosa con el paso del tiempo.
Los valores de referencia de la presente invención también se pueden derivar de un sujeto VIH negativo.
En una modalidad preferida, el valor de referencia es un intervalo de valores. Por ejemplo, se puede determinar que los sujetos saludables presentan niveles de un biomarcador de la invención dentro de un intervalo "saludable" particular. Del mismo modo, los sujetos que padecen tuberculosis activa pueden presentar niveles de un biomarcador de la invención dentro de un intervalo de "enfermedad" particular. Los valores de referencia, y en particular los intervalos de valores, se pueden optimizar con el tiempo a medida que se obtienen y analizan más datos.
En una modalidad, se determina un nivel de BATF2 en una muestra obtenida de un sujeto, y un nivel más alto de BATF2 en la muestra del sujeto en comparación con un sujeto sin exposición previa a la tuberculosis es indicativo de la presencia de tuberculosis activa, por ejemplo, tuberculosis pulmonar activa o tuberculosis extrapulmonar activa.
En una modalidad relacionada, se determina un nivel de BATF2 en una muestra obtenida de un sujeto, y un nivel más alto de BATF2 en la muestra del sujeto en comparación con un sujeto que se ha recuperado de la tuberculosis es indicativo de la presencia de tuberculosis activa.
En una modalidad relacionada, se determina un nivel de BATF2 en una muestra obtenida de un sujeto, y un nivel más alto de BATF2 en la muestra del sujeto en comparación con un sujeto que tiene una infección de tuberculosis latente (LTBI) es indicativo de la presencia de tuberculosis activa. Uno o ambos sujetos en esta modalidad pueden ser niños. El sujeto, en particular el sujeto del que se obtiene la muestra, puede ser VIH positivo o VIH negativo. La tuberculosis activa puede ser tuberculosis pulmonar activa.
En una modalidad relacionada, se determina un nivel de BATF2 en una muestra obtenida de un sujeto, y un nivel más alto de BATF2 en la muestra del sujeto en comparación con un sujeto VIH negativo que tiene una infección de tuberculosis latente (LTBI) es indicativo de la presencia de tuberculosis activa.
En una modalidad relacionada, se determina un nivel de BATF2 en una muestra obtenida de un sujeto, y un nivel inalterado de BATF2 en la muestra del sujeto en comparación con uno o más de:
(a) un sujeto sin exposición previa a la tuberculosis;
(b) un sujeto que tiene una infección de tuberculosis latente (LTBI);
(c) un sujeto que se ha recuperado de tuberculosis;
(d) un sujeto que padece una enfermedad infecciosa no tuberculosa; y
(e) un sujeto que padece neumonía no tuberculosa o enfermedad febril no tuberculosa
es indicativo de la ausencia de tuberculosis activa.
En algunas modalidades en donde se determina un nivel de BATF2, el valor de referencia no se deriva de un sujeto que padece una fiebre o enfermedad febril no tuberculosa.
En una modalidad, el nivel de BATF2 es al menos 1.5 veces o al menos 2 veces mayor en una muestra obtenida de un sujeto que padece tuberculosis activa, en comparación con un valor de referencia derivado de un sujeto sin exposición previa a tuberculosis o un sujeto que padece una enfermedad infecciosa no tuberculosa. Más preferentemente, el nivel de BATF2 es al menos 3 veces mayor, o al menos 4 veces, o al menos 5 veces, o al menos 6 veces, o al menos 7 veces, o al menos 8 veces o al menos 9 veces o al menos 10 veces mayor en comparación con un valor de referencia derivado de un sujeto sin exposición previa a la tuberculosis o un sujeto que padece una enfermedad infecciosa no tuberculosa.
Como se describe en la presente, se determina un nivel de IGJ en una muestra obtenida de un sujeto, y un nivel más alto de IGJ en la muestra del sujeto en comparación con un sujeto que padece una enfermedad febril no tuberculosa es indicativo de la presencia de tuberculosis activa.
Como se describe en la presente, se determina un nivel de CLC en una muestra obtenida de un sujeto, y un nivel más alto de CLC en la muestra del sujeto en comparación con un sujeto que padece una enfermedad febril no tuberculosa es indicativo de la presencia de tuberculosis activa.
Como se describe en la presente, se determina un nivel de HP en una muestra obtenida de un sujeto, y un nivel más bajo de HP en la muestra del sujeto en comparación con un sujeto que padece una enfermedad febril no tuberculosa es indicativo de la presencia de tuberculosis activa.
Como se describe en la presente, se determina un nivel de HP en una muestra obtenida de un sujeto, y un nivel más bajo de HP en la muestra del sujeto en comparación con un sujeto que padece una enfermedad febril no tuberculosa es indicativo de la presencia de una enfermedad no tuberculosa.
Como se describe en la presente, se determina un nivel de CD177 en una muestra obtenida de un sujeto, y un nivel más bajo de CD177 en la muestra del sujeto en comparación con un sujeto que padece una enfermedad febril no tuberculosa es indicativo de la presencia de tuberculosis activa.
Como se describe en la presente, un nivel de CD177 se determina en una muestra obtenida de un sujeto, y un nivel más alto de CD177 en la muestra del sujeto en comparación con un sujeto que padece una enfermedad febril no tuberculosa es indicativo de la presencia de una enfermedad no tuberculosa.
Como se describe en la presente, los niveles de BATF2 y CD177 se determinan en una muestra obtenida de un sujeto, y un nivel más alto de BATF2 junto con un nivel más bajo de CD177 en la muestra del sujeto en comparación con un sujeto sin exposición previa a tuberculosis o un sujeto que padece una enfermedad infecciosa no tuberculosa es indicativo de la presencia de tuberculosis activa, por ejemplo, tuberculosis pulmonar activa o tuberculosis extrapulmonar activa.
Como se describe en la presente, los niveles de IGJ, HP, CLC y CD177 se determinan en una muestra obtenida de un sujeto, y un nivel más alto de IGJ y CLC acoplado con un nivel más bajo de HP y CD177 en la muestra del sujeto en comparación con un sujeto que padece una enfermedad febril no tuberculosa es indicativo de la presencia de tuberculosis activa, por ejemplo, tuberculosis pulmonar activa o tuberculosis extrapulmonar activa.
Como se describe en la presente, los niveles de BATF2, CD177, HP, IGJ y CLC se determinan en una muestra obtenida de un sujeto, y un nivel más alto de IGJ, CLC y BATF2 junto con un nivel más bajo de HP y CD177 en la muestra del sujeto en comparación con un valor de referencia, en particular un valor de referencia derivado de un sujeto que padece una enfermedad febril no tuberculosa, es indicativo de la presencia de tuberculosis activa, por ejemplo, tuberculosis pulmonar activa o tuberculosis extrapulmonar activa.
En algunas modalidades, el cambio en el nivel del biomarcador de la invención en la muestra en comparación con el valor de referencia es predictivo del inicio de la tuberculosis activa, por ejemplo, en una muestra de un sujeto que aún no muestra signos o síntomas de la enfermedad.
En una modalidad preferida, se determina un nivel de BATF2 en una muestra obtenida de un sujeto, y un nivel más alto de BATF2 en la muestra del sujeto en comparación con un valor de referencia, en particular un valor de referencia de un sujeto sin exposición previa a la tuberculosis, es predictivo del inicio de la tuberculosis activa.
De esta manera, el método o uso de la presente invención puede ser predictivo de la aparición de la tuberculosis activa hasta 12 meses, por ejemplo, hasta 3, 6 o 9 meses antes de la aparición de la enfermedad.
En una modalidad preferida, el nivel del biomarcador de la invención y/o el valor de referencia se estandariza en comparación con uno o más genes, proteínas o marcadores de mantenimiento.
Se sabe en la técnica que los niveles de genes, proteínas o marcadores de mantenimiento no fluctúan en respuesta a condiciones experimentales variables. Los genes de mantenimiento adecuados se conocen en la técnica y se describen en Silver N., et al (BMC Mol Biol. 6 de octubre de 2006; 7:33; "Selection of housekeeping genes for gene expression studies in human reticulocytes using real-time PCR")
Los ejemplos adecuados incluyen, pero no se limitan a, GAPDH (gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa), p-actina,SDHA(succinato deshidrogenasa),HPRTI(hipoxantina fosforribosil transferasa 1),HBS1L(proteína tipo HBS1),AHSP(proteína estabilizadora de hemoglobina alfa) yB2M(beta-2-microglobulina). Se prefiere particularmente GAPDH. El experto apreciará que cualquier gen, proteína o marcador de mantenimiento se podría utilizar para los fines de la invención.
Criterios de valoración sustitutos
El biomarcador de la presente invención se puede usar ventajosamente (por ejemplo,in vitro)como criterios de valoración sustitutos de una terapia exitosa con un agente antituberculoso.
De acuerdo con el método o uso como se describe en la presente, se determina el nivel de uno o más de BATF2, CD177, HP, IGJ y CLC, y un nivel disminuido de BATF2 y/o IGJ y/o CLC, y/o un nivel aumentado de HP y/o CD177 en una muestra en comparación con un valor de referencia es indicativo de la ausencia de tuberculosis activa y/o terapia exitosa/efectiva con un agente antituberculoso.
En una modalidad particular, se determina el nivel de BATF2, y un nivel disminuido de BATF2 en la muestra en comparación con un valor de referencia es indicativo de la ausencia de tuberculosis activa y/o terapia exitosa/efectiva con un agente antituberculoso.
La muestra y el valor de referencia se pueden derivar del mismo sujeto, por ejemplo, en diferentes momentos. En esta modalidad, el valor de referencia se puede derivar del sujeto en un punto de tiempo anterior (punto de tiempo "A"), por ejemplo, cuando el sujeto padece de tuberculosis activa y/o no se está sometiendo a terapia antituberculosa y/o concurrente con el inicio de la terapia antituberculosa. La muestra (de prueba) se puede tomar del sujeto en un punto de tiempo posterior (punto de tiempo "B"), por ejemplo, cuando la terapia antituberculosa ha comenzado, se ha completado y/o los signos y síntomas de tuberculosis activa han disminuido o ya no están presentes.
El período de tiempo entre el punto de tiempo "A" y el punto de tiempo "B" puede ser de cualquier longitud. Ventajosamente, el periodo de tiempo es de alrededor de 8 semanas o más de 8 semanas. Por ejemplo, puede haber alrededor o más de 8 semanas entre el inicio de la terapia antituberculosa (momento en el que se deriva el valor de referencia) y la toma de la muestra (de prueba) del sujeto.
Kit
En la presente se describe un kit para determinar la presencia o ausencia de tuberculosis activa en un sujeto, en donde el kit comprende uno o más pares de cebadores o sondas capaces de determinar un nivel de uno o más biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en:
(a) factor de transcripción con cremallera de leucina básico tipo ATF 2 (BATF2)
(b) agrupación de diferenciación 177 (CD177);
(c) haptoglobina (HP);
(d) cadena J de inmunoglobulina (IGJ); y
(e) galectina 10 (CLC);
en una muestra obtenida del sujeto; en donde el kit comprende opcionalmente un conjunto de instrucciones.
Como se describe en la presente, el uno o más pares de cebadores o sondas se inmovilizan en un soporte sólido.
El kit descrito en la presente puede comprender una pluralidad de sondas, cada una capaz de hibridarse específicamente con uno de los biomarcadores alternativos de la invención.
Como se usa en la presente, el término "sonda" se refiere a un ácido nucleico(por ejemplo,un oligonucleótido o una secuencia de polinucleótido) que es complementario a una secuencia de ácido nucleico presente en una muestra, de modo que la sonda se hibridará específicamente con la secuencia de ácido nucleico presente en la muestra en condiciones apropiadas.
Como se describe en la presente, la sonda se selecciona de SEQ ID NO: 10-14 como se describe en la presente.
El kit también puede comprender medios para detectar la presencia de uno o más productos de hibridación, correspondientes a cada combinación de sonda/biomarcador.
Las sondas pueden ser sondas génicas, por ejemplo, secuencias de ADN oligoméricas de 15 a 50 bases que se sintetizan para detectar la presencia de un biomarcador. A continuación, la sonda se puede hibridar con el biomarcador en condiciones rigurosas.
De manera alternativa, el kit puede comprender uno o más pares de cebadores, utilizando los cuales cada biomarcador se puede detectar mediante:
a) amplificar el biomarcador de ácido nucleico potencial o las partes que contienen biomarcadores del ácido nucleico en esta muestra;
b) secuenciar, por ejemplo, minisecuenciación, los ácidos nucleicos amplificados; y
c) detectar la presencia o ausencia de los biomarcadores en esta muestra.
El kit puede comprender opcionalmente una enzima transcriptasa inversa.
El término "cebador" como se usa en la presente se refiere a un oligonucleótido que es capaz de actuar como un punto de inicio de la síntesis cuando se coloca en condiciones en las que se induce la síntesis de un producto de extensión de cebador que es complementario a una cadena de ácido nucleico,es decir,en presencia de nucleótidos y un agente inductor, tal como ADN polimerasa y a una temperatura y pH adecuados.
Los cebadores y/o sondas se pueden marcar para facilitar su detección. Estos marcadores (también conocidos como indicadores) incluyen, pero no se limitan a, isótopos radiactivos, fluoróforos, porciones quimioluminiscentes, enzimas, sustratos enzimáticos, cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, colorantes, iones metálicos, soles metálicos, otros marcadores detectables adecuados, tal como biotina o haptenos y similares. Ejemplos particulares de etiquetas que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, fluoresceína, 5(6)-carboxifluoresceína, cianina 3 (Cy3), cianina 5 (Cy5), rodamina, dansilo, umbeliferona, rojo Texas, luminal, NADPH y peroxidasa de rábano picante.
Las sondas y/o cebadores utilizados en el kit se hibridan específicamente con su secuencia de ácido nucleico diana. Pueden, por ejemplo, hibridarse en condiciones de alta rigurosidad.
La rigurosidad de la hibridación se refiere a las condiciones en las que los híbridos de ácidos polinucleicos son estables. Estas condiciones son evidentes para los expertos en el campo. Como saben los expertos en la técnica, la estabilidad de los híbridos se refleja en la temperatura de fusión (Tm) del híbrido que disminuye aproximadamente de 1 a 1.5°C con cada disminución del 1% en la homología de secuencia. En general, la estabilidad de un híbrido es una función de la concentración de iones de sodio y la temperatura.
Como se usa en la presente, alta rigurosidad se refiere a condiciones que permiten la hibridación de solo aquellas secuencias de ácido nucleico que forman híbridos estables en sodio 1 M a 65-68°C. Se pueden proporcionar condiciones de alta rigurosidad, por ejemplo, mediante hibridación en una solución acuosa que contiene 6x SSC, 5x Denhardt, SDS (dodecilsulfato de sodio) al 1 %, pirofosfato de sodio al 0.1% y 0.1 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado como competidor no específico.
Se entiende que estas condiciones se pueden adaptar y duplicar usando una variedad de amortiguadores, por ejemplo, amortiguadores a base de formamida y temperaturas. La solución de Denhardt y SSC son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica al igual que otros amortiguadores de hibridación adecuados (ver, por ejemplo, Sambrook, et al., eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York o Ausubel, et al., eds. (1990) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.). Las condiciones óptimas de hibridación se deben determinar empíricamente, ya que la longitud y el contenido de GC del par de hibridación también juegan un papel. En el kit descrito en la presente, las sondas de ácido nucleico se pueden asociar con un soporte o sustrato para proporcionar un arreglo de sondas de ácido nucleico para usarse en un ensayo de arreglo. Adecuadamente, la sonda se presintetiza u obtiene comercialmente, y luego se une al sustrato o se sintetiza en el sustrato,es decir, sesintetizain situ enel sustrato.
Un método específico de hibridación de ácidos nucleicos que se puede utilizar es la hibridación de chips/arreglos de ácidos nucleicos en la que los ácidos nucleicos están presentes en una superficie inmovilizada, como un microarreglo, y se someten a técnicas de hibridación lo suficientemente sensibles como para detectar cambios menores en las secuencias.
La tecnología de arreglo y las diversas técnicas y aplicaciones asociadas con ella son en general conocidas por el experto en la técnica.
Los kits de acuerdo con las descripciones en la presente pueden comprender adicionalmente un dispositivo de análisis para determinar el nivel de uno o más biomarcadores en la muestra usando los pares de cebadores o sondas.
El kit puede comprender un medio de almacenamiento que almacena un programa para controlar un aparato de procesamiento de datos para clasificar al sujeto con base en el nivel del uno o más biomarcadores determinados en la muestra utilizando los pares de cebadores o sondas.
El programa puede comprender instrucciones para controlar el aparato de procesamiento de datos para proporcionar una indicación de riesgo para el sujeto.
En la presente se describe un método para preparar un kit, que comprende el paso de inmovilizar el o los pares de cebadores o sondas de la invención en un soporte sólido.
En un aspecto, la presente invención proporciona el uso de un kit para determinar la presencia o ausencia de tuberculosis activa en un sujeto, en donde el kit comprende uno o más pares de cebadores o sondas capaces de determinar un nivel de un biomarcador que consiste en BATF2 en una muestra obtenida de este sujeto,
en donde la muestra es una muestra de sangre; y
en donde un nivel aumentado de BATF2 en comparación con un valor de referencia es indicativo de la presencia de tuberculosis activa, en donde el valor de referencia se deriva de uno o más de un sujeto:
(a) sin exposición previa a la tuberculosis;
(b) que tiene una infección de tuberculosis latente (LTBI);
(c) que se ha recuperado de la tuberculosis; o
(d) que no padece enfermedad alguna;
en donde el kit comprende opcionalmente un conjunto de instrucciones,
preferiblemente en donde el uno o más pares de cebadores o sondas están inmovilizados en un soporte sólido, y/o
preferentemente, que comprende además un dispositivo de análisis para determinar el nivel de BATF2 en la muestra utilizando los pares de cebadores o sondas, y/o
preferiblemente, que comprende además un medio de almacenamiento que almacena un programa para controlar un aparato de procesamiento de datos para clasificar al sujeto con base en el nivel de BATF2 determinado en la muestra utilizando los pares de cebadores o sondas, y/o
preferiblemente en donde el programa comprende instrucciones para controlar el aparato de procesamiento de datos para proporcionar una indicación de riesgo para el sujeto del cual se obtiene la muestra.
Muestra
La muestra puede ser o se puede derivar de una muestra biológica, tal como una muestra de sangre, hisopo de la mejilla, una muestra de biopsia, un extracto de tejido, un cultivo de órganos o cualquier otro tejido o preparación celular de un sujeto.
En teoría, la presencia de un biomarcador de transcripción de ARNm de acuerdo con la presente invención se puede determinar mediante la extracción de ARNm de cualquier tejido del cuerpo.
La muestra puede ser o se puede derivar de una muestraex vivo.
Preferentemente, la muestra es, o se deriva de sangre, en particular sangre periférica.
Preferentemente, la muestra es, o se deriva de, sangre entera o una fracción de sangre entera.
En modalidades en donde el biomarcador de la invención es un polipéptido (por ejemplo, polipéptido BATF2), la muestra puede ser, o se puede derivar de, células sanguíneas.
Sujeto
El sujeto puede ser un humano. El sujeto puede ser de cualquier edad, género u origen étnico. El sujeto puede ser un humano adulto o un humano niño. En el contexto de la presente invención, un "adulto humano" es un sujeto humano de 15 años de edad o más en el momento del muestreo, y un "niño humano" es un sujeto humano de menos de 15 años de edad en el momento del muestreo
El sujeto puede mostrar uno o más signos o síntomas de tuberculosis. El sujeto se puede haber caracterizado previamente por tener tuberculosis mediante otros métodos de diagnóstico. Cuando los resultados de las pruebas anteriores son ambiguos o no concluyentes, el método de la presente invención se puede utilizar para confirmar el diagnóstico.
El sujeto puede tener una predisposición a desarrollar tuberculosis activa. Por ejemplo, puede haber un mayor riesgo o probabilidad de que el sujeto desarrolle tuberculosis activa en algún momento en el futuro. Una predisposición se puede deber a un diagnóstico de LTBI.
En la presente se describen métodos para calcular una "indicación de riesgo" para proporcionar un análisis cuantitativo de la probabilidad de un sujeto de tener tuberculosis activa.
La indicación de riesgo se puede proporcionar como una medida cuantitativa continua, por ejemplo, como una estimación de probabilidad de 0 a 1, donde "0" representa una imposibilidad de que un sujeto esté sufriendo de tuberculosis activa, y "1" representa una certeza absoluta de que un sujeto está sufriendo de tuberculosis activa.
Por "un sujeto que se ha recuperado de la tuberculosis", se entiende que el sujeto sufrió previamente de tuberculosis activa, pero en el momento del muestreo no mostró signos o síntomas de tuberculosis. Por ejemplo, el sujeto recuperado puede ser de dos años o más después de la recuperación, o puede ser de dos a cuatro años después de la finalización de la terapia de TB.
Por "sujeto sano", se entiende, por ejemplo, que:
(i) el sujeto no ha tenido exposición previa a Mtb o tuberculosis; o
(ii) el sujeto tiene LTBI; o
(ii) el sujeto se ha recuperado de la tuberculosis; o
(iv) el sujeto no padece ninguna enfermedad.
En algunas modalidades, el sujeto es VIH negativo.
Terapia de tuberculosis
La presente invención proporciona composiciones que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente antituberculoso para uso en el tratamiento de la tuberculosis activa en un sujeto identificado como que requiere tratamiento de la tuberculosis activa mediante un método de la presente invención.
En la presente se describen solo con fines ilustrativos métodos para tratar la tuberculosis activa en un sujeto identificado como que requiere tratamiento de la tuberculosis activa mediante el método para determinar la presencia o ausencia de tuberculosis activa de acuerdo con la invención, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente antituberculoso al sujeto.
En particular, en la presente se describe un método para tratar la tuberculosis activa en un sujeto, que comprende:
(a) determinar la presencia de tuberculosis activa, mediante un método como se describe en la presente;
(b) administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente antituberculoso al sujeto.
El método para tratar la tuberculosis activa en un sujeto puede comprender además (c) repetir el paso (a) después de la administración del agente antituberculoso. Si la tuberculosis activa todavía está presente (en comparación con la determinada en el paso (a)), el método para tratar la tuberculosis activa en un sujeto puede comprender además un paso (d) que comprende administrar un agente antituberculoso alternativo al sujeto, en donde el agente antituberculoso alternativo difiere del agente antituberculoso administrado en el paso (b).
El agente antituberculoso puede ser cualquier agente adecuado que pueda tratar o aliviar los signos y/o síntomas de la tuberculosis activa. El agente puede ser uno o más agentes antituberculosos que se pueden administrar durante un transcurso de tiempo y/o simultáneamente o en diferentes momentos.
El agente antituberculoso es uno o más seleccionados del grupo que consiste en: un antibiótico, un corticosteroide, un agente quimioterapéutico y un inhibidor de TNF.
El agente antibiótico o quimioterapéutico se puede seleccionar del grupo que consiste de: isoniazida, rifampicina, pirazinamida, estreptomicina, ácido para-aminosalicílico (PAS), moxifloxacina, ciprofloxacina, etambutol y combinaciones de los mismos. El corticosteroide se puede seleccionar del grupo que consiste de: prednisolona, dexametasona y combinaciones de las mismas. El inhibidor de TNF se puede seleccionar del grupo que consiste en infliximab, adalimumbab, certolizumab, etanercept y combinaciones de los mismos.
El experto en la técnica puede determinar adecuadamente las cantidades de dosificación y los regímenes adecuados de agentes antituberculosos que se utilizarán junto con la presente invención.
Por ejemplo, un agente antituberculoso se puede formular y administrar a un sujeto en cualquier composición adecuada para el tratamiento de la tuberculosis activa. Como se describe en la presente, se administra una cantidad eficaz del agente antituberculoso al sujeto. En este contexto, el término "cantidad eficaz" significa una cantidad eficaz, a las dosis y durante los períodos de tiempo necesarios para lograr el resultado deseado, por ejemplo, para tratar la tuberculosis activa.
El agente antituberculoso se puede administrar a un sujeto utilizando una variedad de técnicas. Por ejemplo, el agente se puede administrar sistémicamente, lo que incluye mediante inyección que incluye intramuscular o intravenosa, oral, sublingual, transdérmica, subcutánea, interna. De manera alternativa, el agente se puede administrar directamente en un sitio afectado por la tuberculosis activa.
La concentración y cantidad del agente antituberculoso a administrar variará habitualmente, dependiendo de, por ejemplo, la gravedad de la tuberculosis activa, los tejidos asociados y afectados por la tuberculosis activa, el tipo de agente que se administra, el modo de administración, la edad y la salud del sujeto, y similares.
El agente antituberculoso se puede formular en una composición farmacéutica junto con un portador, vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden contener rutinariamente concentraciones farmacéuticamente aceptables de sal, agentes amortiguadores, conservantes y diversos portadores compatibles. Por ejemplo, el agente antituberculoso se puede formular en una solución amortiguadora fisiológica.
La proporción e identidad del portador, vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable se puede determinar por la ruta de administración elegida, la compatibilidad con células vivas y la práctica farmacéutica estándar. En general, la composición farmacéutica se formulará con componentes que no afectarán significativamente las propiedades biológicas del agente. Los portadores, vehículos, excipientes y diluyentes adecuados se describen, por ejemplo, en Remington 's Pharmaceutical Sciences (Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., EUA 1985).
En un aspecto relacionado, la presente invención también proporciona un método para determinar si un sujeto será susceptible al tratamiento con un agente antituberculoso, este método comprende el paso de determinar un nivel de un biomarcador que consiste en BATF2 en una muestra obtenida del sujeto;
en donde la muestra es una muestra de sangre; y
en donde el nivel de BATF2 en la muestra en comparación con un valor de referencia es indicativo de la susceptibilidad del sujeto al tratamiento con un agente antituberculoso, en donde un nivel aumentado de BATF2 en comparación con el valor de referencia es indicativo de la presencia de tuberculosis activa, en donde el valor de referencia se deriva de uno o más de un sujeto:
(a) sin exposición previa a la tuberculosis;
(b) que tiene una infección de tuberculosis latente (LTBI);
(c) que se ha recuperado de la tuberculosis; o
(d) que no padece enfermedad alguna.
Aspectos adicionales
La presente invención también proporciona los siguientes aspectos adicionales.
Todas las modalidades y características opcionales descritas en la presente se aplican igualmente a los siguientes aspectos adicionales.
Por consiguiente, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para determinar la presencia o ausencia de tuberculosis activa en una muestra, este método comprende los pasos de:
(i) determinar un nivel del siguiente biomarcador en esta muestra:
(a) factor de transcripción con cremallera de leucina básico tipo ATF 2 (BATF2)
(ii) comparar el nivel de este biomarcador en la muestra con un valor de referencia, en donde el nivel del biomarcador en la muestra en comparación con el valor de referencia es indicativo de la presencia o ausencia de tuberculosis activa.
En la presente se describe además un método para determinar si un sujeto padece tuberculosis activa o una enfermedad infecciosa no tuberculosa, el método que comprende los pasos de:
(i) determinar un nivel de BATF2 en una muestra obtenida del sujeto;
(ii) comparar el nivel de BATF2 en la muestra con un valor de referencia;
en donde un nivel inalterado de BATF2 en la muestra del sujeto en comparación con el valor de referencia es indicativo de la ausencia de tuberculosis activa; o
en donde un mayor nivel de BATF2 en la muestra del sujeto en comparación con el valor de referencia requiere la ejecución de los siguientes pasos adicionales del método:
(iii) determinar los niveles del grupo de biomarcadores que consiste en: IGJ, HP, CLC y CD177;
(iv) comparar los niveles de IGJ, HP, CLC y CD177 en la muestra con los valores de referencia;
en donde los niveles de IGJ, HP, CLC y CD177 en la muestra en comparación con los valores de referencia son indicativos de:
(a) la presencia de tuberculosis activa y la ausencia de una enfermedad infecciosa no tuberculosa en el sujeto; o
(b) la presencia de una enfermedad infecciosa no tuberculosa y la ausencia de tuberculosis activa en el sujeto.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para determinar la presencia o ausencia de tuberculosis activa en un sujeto, el método comprende el paso de: determinar un nivel de un biomarcador que consiste en:
(a) factor de transcripción con cremallera de leucina básico tipo ATF 2 (BATF2);
en una muestra obtenida del sujeto.
Ventajas Adicionales
Los presentes inventores han identificado la menor cantidad posible de transcripciones de sangre que pueden discriminar a los pacientes con TB activa de individuos sanos y de aquellos con otras enfermedades infecciosas.
La identificación de la menor cantidad posible de transcripciones significa que el análisis y el procesamiento son menos costosos y requieren menos tiempo, lo que a su vez conduce a un tiempo reducido para iniciar el tratamiento de la tuberculosis activa o excluir un diagnóstico de tuberculosis activa.
La presente invención también reduce la necesidad de pruebas de diagnóstico microbiológicas innecesarias para la tuberculosis activa y reduce la terapia antituberculosa innecesaria. El tratamiento farmacológico innecesario de pacientes que no tienen tuberculosis activa puede conducir a posibles problemas de toxicidad y/o resistencia a los medicamentos, así como a considerables costos/recursos desperdiciados.
La presente invención es particularmente ventajosa para distinguir clínicamente entre la TB activa y otras enfermedades febriles.
La presente invención muestra que BATF2 es suficiente como un biomarcador individual para distinguir la TB activa de los individuos sanos. Esto puede ser cierto independientemente del estado serológico del VIH. En los casos infectados por el VIH, los niveles de transcripción de BATF2 ofrecen un valor predictivo negativo como biomarcador de TB activa.
Como se describe en la presente, una firma transcripcional que comprende cuatro genes (IGJ, HP, CLC y CD177) se puede resumir en una puntuación individual de probabilidad para discriminar entre TB activa y pacientes que se presentan en el hospital con enfermedad infecciosa no tuberculosa o enfermedad febril no tuberculosa.
La presente invención se puede utilizar para determinar la presencia o ausencia de tuberculosis activa, independientemente de la edad, el género o la etnia del sujeto.
La firma de cuatro genes funciona igualmente bien para discriminar la TB extrapulmonar de los casos de neumonía no tuberculosa en conjuntos de datos independientes, lo que demuestra que las firmas transcripcionales discriminatorias no fueron confundidas por el sitio de la enfermedad.
La capacidad de la firma de cuatro genes para discriminar la TB de otras infecciones ofrece el mayor valor clínico en individuos que presentan enfermedades febriles en el contexto de una incidencia relativamente baja de TB, pero cuya presentación es compatible con TB pulmonar o extrapulmonar.
Por lo tanto, la presente invención es igualmente válida para diagnosticar la tuberculosis tanto pulmonar como extrapulmonar y no distingue entre ellas.
La invención se describirá ahora adicionalmente por medio de Ejemplos, que se propone que sirvan para ayudar a un experto en la técnica a llevar a cabo la invención y no se propone de ninguna manera limitar el alcance de la invención.
Variantes, derivados, análogos, homólogos y fragmentos
Además de las proteínas y nucleótidos específicos mencionados en la presente, la invención también abarca el uso de variantes, derivados, análogos, homólogos y fragmentos de los mismos.
En el contexto de la invención, una variante de cualquier secuencia dada es una secuencia en la que la secuencia específica de residuos (ya sean residuos de aminoácidos o de ácidos nucleicos) se ha modificado de tal manera que el polipéptido o polinucleótido en cuestión retiene sustancialmente su función. Se puede obtener una secuencia variante por adición, deleción, sustitución, modificación, reemplazo y/o variación de al menos un residuo presente en la proteína o polinucleótido de origen natural.
El término "derivado" como se usa en la presente, en relación con proteínas o polipéptidos de la invención incluye cualquier sustitución, variación, modificación, reemplazo, deleción y/o adición de uno (o más) residuos de aminoácidos de o a la secuencia, siempre que la proteína o polipéptido resultante retenga sustancialmente al menos una de sus funciones endógenas.
El término "análogo" como se usa en la presente, en relación con polipéptidos o polinucleótidos incluye cualquier mimético, es decir, un compuesto químico que posee al menos una de las funciones endógenas de los polipéptidos o polinucleótidos que imita.
Habitualmente, las sustituciones de aminoácidos se pueden hacer, por ejemplo, de 1,2 o 3 a 10 o 20 sustituciones siempre que la secuencia modificada retenga sustancialmente la actividad o capacidad requerida. Las sustituciones de aminoácidos pueden incluir el uso de análogos de origen no natural.
Las proteínas utilizadas en la invención también pueden tener deleciones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoácidos que producen un cambio silencioso y dan como resultado una proteína funcionalmente equivalente. Las sustituciones de aminoácidos deliberadas se pueden hacer con base en la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos siempre que se conserve la función endógena. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polares no cargados que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen asparagina, glutamina, serina, treonina y tirosina.
Se pueden realizar sustituciones conservadoras, por ejemplo, de acuerdo con la tabla a continuación. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferiblemente en la misma línea en la tercera columna se pueden sustituir entre sí:
El término "homólogo" como se usa en la presente significa una entidad que tiene una cierta homología con la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre y la secuencia de nucleótidos de tipo silvestre. El término "homología" se puede equiparar con "identidad".
Una secuencia homóloga puede incluir una secuencia de aminoácidos que puede ser al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% o 90% idéntica, preferentemente al menos 95% o 97% o 99% idéntica a la secuencia de la presente. Habitualmente, los homólogos comprenderán los mismos sitios activos, etc., que la secuencia de aminoácidos de la presente. Aunque la homología también se puede considerar en términos de similitud (es decir, residuos de aminoácidos que tienen propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la invención se prefiere expresar homología en términos de identidad de secuencia.
Una secuencia homóloga puede incluir una secuencia de nucleótidos que puede ser al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% o 90% idéntica, preferentemente al menos 95% o 97% o 99% idéntica a la secuencia de la presente. Aunque la homología también se puede considerar en términos de similitud, en el contexto de la invención se prefiere expresar la homología en términos de identidad de secuencia.
Preferentemente, la referencia a una secuencia que tiene un porcentaje de identidad a cualquiera de las SEQ ID NO detalladas en la presente se refiere a una secuencia que tiene el porcentaje de identidad indicado sobre la longitud completa de la s Eq ID NO a la que se hace referencia.
Las comparaciones de homología se pueden realizar a simple vista o, más usualmente, con la ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas informáticos disponibles comercialmente pueden calcular el porcentaje de homología o identidad entre dos o más secuencias.
El porcentaje de homología se puede calcular sobre secuencias contiguas, es decir, una secuencia se alinea con la otra secuencia y cada aminoácido en una secuencia se compara directamente con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un residuo a la vez. Esto se denomina alineación "sin separaciones". Habitualmente, estas alineaciones sin separaciones se realizan solo sobre un número relativamente corto de residuos.
Aunque este es un método muy simple y consistente, no se tiene en cuenta que, por ejemplo, en un par de secuencias por lo demás idénticas, una inserción o deleción en la secuencia de nucleótidos puede hacer que los siguientes codones se desalineen, lo que potencialmente da como resultado una gran reducción en el porcentaje de homología cuando se realiza una alineación global. En consecuencia, la mayoría de los métodos de comparación de secuencias se diseñan para producir alineamientos óptimos que toman en consideración posibles inserciones y deleciones sin penalizar indebidamente la puntuación de homología general. Esto se logra insertando "separaciones" en el alineamiento de secuencias para tratar de maximizar la homología local.
Sin embargo, estos métodos más complejos asignan "penalizaciones por separación" a cada separación que se produce en el alineamiento de modo que, para el mismo número de aminoácidos idénticos, un alineamiento de secuencia con el menor número de separaciones posible, lo que refleja una mayor relación entre las dos secuencias comparadas, logrará una puntuación más alta que una con muchas separaciones. Normalmente se utilizan "costos de separaciones afines" que cobran un costo relativamente alto por la existencia de una separación y una penalización menor por cada residuo posterior en la separación. Este es el sistema de puntuación de separación más comúnmente utilizado. Las penalizaciones por separación altas producirán, por supuesto, alineaciones optimizadas con menos separaciones. La mayoría de los programas de alineación permiten modificar las penalizaciones por separación. Sin embargo, se prefiere usar los valores predeterminados cuando se usa este software para comparaciones de secuencias. Por ejemplo, cuando se utiliza el paquete GCG Wisconsin Bestfit, la penalización por separación predeterminada para las secuencias de aminoácidos es -12 para una separación y -4 para cada extensión.
Por lo tanto, el cálculo del porcentaje máximo de homología requiere en primer lugar la producción de una alineación óptima, teniendo en cuenta las penalizaciones por separación. Un programa informático adecuado para llevar a cabo esta alineación es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Universidad de Wisconsin, EUA; Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 387). Ejemplos de otro software que puede realizar comparaciones de secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete<b>L<a>S<t>(ver Ausubelet al.(1999) ibid - Ch. 18), FASTA (Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 403-410) y el conjunto de herramientas de comparación GENEWORKS. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para la búsqueda fuera de línea y en línea (ver Ausubelet al.(1999) ibid, páginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, para algunas aplicaciones, se prefiere utilizar el programa GCG Bestfit. Otra herramienta, llamada BLAST 2 Sequences, también está disponible para comparar secuencias de proteínas y nucleótidos (ver FEMS Microbiol. Lett. (1999) 174: 247-50; FEMS Microbiol. Lett. (1999) 177: 187-8).
Aunque el porcentaje de homología final se puede medir en términos de identidad, el proceso de alineación en sí mismo habitualmente no se basa en una comparación de pares de todo o nada. En cambio, en general se utiliza una matriz de puntuación de similitud a escala que asigna puntuaciones a cada comparación por pares con base en la similitud química o la distancia evolutiva. Un ejemplo de esta matriz de uso común es la matriz BLOSUM62, la matriz predeterminada para el conjunto de programas BLAST. Los programas GCG Wisconsin en general utilizan los valores predeterminados públicos o una tabla de comparación de símbolos personalizados si se proporciona (consulte el manual del usuario para obtener más detalles). Para algunas aplicaciones, se prefiere utilizar los valores predeterminados públicos para el paquete GCG, o en el caso de otro software, la matriz predeterminada, tal como BLOSUM62.
Una vez que el software ha producido una alineación óptima, es posible calcular el porcentaje de homología, preferentemente el porcentaje de identidad de secuencia. El software habitualmente hace esto como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico.
Los "fragmentos" de una proteína o polinucleótido de longitud completa también son variantes y el término se refiere habitualmente a una región seleccionada del polipéptido o polinucleótido que es de interés ya sea funcionalmente o, por ejemplo, en un ensayo. "Fragmento», por lo tanto, se refiere a una secuencia de aminoácidos o ácido nucleico que es una porción de un polipéptido o polinucleótido de longitud completa.
La presente invención se describe adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos no limitantes, y con referencia a las siguientes figuras.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1- Firmas transcripcionales de sangre asociadas con TB activa.(A)Diferencias estadísticamente significativas >2 veces en la abundancia de transcripción en los perfiles transcripcionales de sangre de todo el genoma de pacientes con TB activa en comparación con las muestras posteriores a la recuperación en la cohorte AdjuVIT.(B)Análisis de ontología génica de los genes en A que se expresaron a niveles más altos en muestras de TB activa AdjuVIT que en las muestras posteriores a la recuperación.(C)Comparación de diferencias significativas en la expresión de genes sanguíneos en la TB activa y diferentes estados de salud de tres estudios diferentes: TB después de la recuperación (AdjuVIT), voluntarios saludables (Berry) o personas con TB latente (Bloom).
Figura 2 -Clasificación transcriptómica de TB activa y casos saludables utilizando SVM para identificar las características más discriminatorias.(A)Rendimiento de la curva operativa del receptor (ROC) de la clasificación de la máquina de vectores de soporte (SVM) de TB activa en conjuntos de datos publicados que comparan pacientes VIH negativos con TB activa con voluntarios saludables (Berry) o TB latente (Bloom y Kaforou), después de la capacitación en pacientes con TB activa AdjuVIT en el momento del diagnóstico versus la recuperación posterior utilizando 51 transcripciones de sangre identificadas en la Figura 1C. El área bajo la curva ROC (AUC) se muestra para cada cohorte entre paréntesis.(B)Orden de clasificación de las ponderaciones para cada gen en los pacientes del modelo de entrenamiento SVM con TB activa o después de la recuperación.
(C)ROC AUC de la clasificación SVM de TB en el momento del diagnóstico versus la recuperación posterior utilizando un número acumulativo de genes en orden de clasificación de ponderaciones. En B-C, los puntos de datos muestran intervalos de confianza medios de ±95% de los resultados de SVM obtenidos de 100 iteraciones en las que el conjunto de datos se dividió aleatoriamente en conjuntos de entrenamiento y prueba iguales.
Figura 3- Clasificación de TB activa y casos saludables utilizando los niveles de expresión de transcripción de BATF2 en sangre. (A) Expresión génica relativa de BATF2 en muestras de sangre de cohortes separadas de pacientes VIH negativos y VIH positivos que comparan TB activa con pacientes posteriores a la recuperación (AdjuVIT), LTBI (Bloom y Kaforou) o voluntarios saludables (Berry). Las gráficas de caja y bigotes representan la mediana, el intercuartil y el intervalo completo de puntos de datos. *denota p<0.0001 (prueba U de Mann-Whitney)(B)Análisis ROC para la discriminación de TB activa en cada una de estas cohortes utilizando solo los niveles sanguíneos de expresión de BATF2.(C)Rendimiento ROC de la discriminación SVM de TB activa de LTBI en pacientes VIH positivos utilizando perfiles transcripcionales de sangre de todo el genoma después de la capacitación en pacientes con TB activa o después de la recuperación. En B-C, el área ROC bajo la curva se muestra entre paréntesis para cada cohorte. ;;Figura 4 -Clasificación transcriptómica de TB activa y otros casos de cohorte de fiebre utilizando SVM para identificar las características más discriminatorias.(A)Expresión génica relativa de BATF2 y(B)niveles en suero de proteína C reactiva (CRP) en muestras de sangre de pacientes con TB activa en la cohorte AdjuVIT en comparación con pacientes con un espectro de otras enfermedades infecciosas que se presentan en el hospital con fiebre.(C)Análisis ROC para la discriminación de TB activa de otros casos de fiebre utilizando niveles sanguíneos de expresión génica de BATF2 o solo PCR en suero. ROC AUC se muestran entre paréntesis para cada prueba.(D)Orden de clasificación de ponderaciones para cada gen en el modelo de entrenamiento SVM de pacientes con TB activa u otra fiebre.(E)ROC AUC de la clasificación SVM de TB activa u otra fiebre utilizando un número acumulativo de genes en orden de clasificación de ponderaciones. En D-E, los puntos de datos muestran (media ±95% de intervalos de confianza) obtenidos de 100 iteraciones en las que la mitad del conjunto de datos se separó aleatoriamente en conjuntos de entrenamiento y prueba para el SVM. ;;Figura 5- Clasificación transcriptómica de TB activa y otros casos de cohorte de fiebre con cuatro genes.(A)Expresión relativa de cada uno de los genes indicados en sangre periférica de pacientes con TB activa (AdjuVIT) y cohortes de otra fiebre.(B)Análisis ROC de la discriminación de SVM de TB activa (AdjuVIT) de pacientes con otra fiebre utilizando los niveles de expresión del gen CD 177 solo o los cuatro genes indicados, entrenando la mitad de los datos utilizados para derivar el orden de clasificación de ponderaciones de SVM y luego probando en la segunda mitad de los datos. ROC AUC se muestran entre paréntesis para cada prueba.(C)T ransformación de la distancia de cada caso de prueba en (B) desde el hiperplano de separación de SVM derivado de la mitad de entrenamiento, utilizando los cuatro genes indicados, para dar una probabilidad caso por caso de TB.(D)Análisis ROC de la discriminación de SVM de TB activa AdjuVIT de pacientes de la cohorte AdjuVIT después de la recuperación y fiebre utilizando los niveles de expresión de los genes indicados al entrenar la mitad de los datos utilizados para derivar el orden de clasificación de ponderaciones de SVM y luego probar en la segunda mitad de los datos. ROC AUC se muestran entre paréntesis para cada prueba.(E)Transformación de la distancia de cada caso de prueba en (D) desde el hiperplano de separación de sVm derivado de la mitad de entrenamiento, utilizando los cinco genes indicados, para dar una probabilidad caso por caso de TB. ;;Figura 6- Discriminación de TB pulmonar y extrapulmonar de casos saludables y neumonía no TB.(A)Expresión génica relativa de BATF2 en muestras de sangre de una nueva cohorte independiente de pacientes con TB pulmonar (PTB), TB extrapulmonar (EPTB) o de voluntarios saludables.(B)Análisis ROC de la discriminación SVM de PTB y ETB de voluntarios saludables basados en los niveles de BATF2 en (A).(C)Análisis ROC de la discriminación de SVM de nuevos PTB y ETB de una nueva cohorte de nuevos casos de neumonía no TB después de entrenar el modelo SVM en<t>B activa (AdjuVIT) y casos deotra fiebre utilizando niveles de expresión relativos de CD177/HP/IGJ/CLC.(D)Transformación de la distancia de cada caso de prueba en (C) desde el hiperplano de separación de SVM, utilizando los cuatro genes indicados, para dar una probabilidad caso por caso de TB. ;;Figura 7- Gráficas de dispersión de sangre(A)BATF2 y PCR en suero en pacientes con TB activa (cohorte AdjuVIT),(B)CD177 y recuentos de neutrófilos en sangre, y(C)transcripciones de haptoglobina en sangre y concentraciones de<p>C<r>en suero en cohortes de TB activa AdjuVIT y fiebre. ;;Figura 8- Expresión relativa de cada uno de los genes indicados en sangre periférica de pacientes de etnia específica, sexo masculino o edad <40 años, dentro de las cohortes de TB activa AdjuVIT y otras cohortes de fiebre. ;;Figura 9 - (A-C)Análisis ROC de la discriminación de SVM de TB activa (AdjuVIT) de otros pacientes con fiebre utilizando los niveles de expresión de CD177, HP, IGJ y CLC en cada una de las etnias indicadas, mediante capacitación en(A)pacientes europeos y americanos (EURAM),(B)pacientes negros africanos (BLAF) y(C)pacientes asiaticos sureños (SASIA) en cada cohorte.(D-F)Análisis RO<c>para la discriminación de TB activa de otros casos de fiebre utilizando neutrófilos en sangre(D), recuentos de linfocitos (E)o edad(F). ROC AUC se muestran entre paréntesis para cada prueba. ;;Figura 10- Niveles relativos de transcripción de BATF2 en sangre derivados de perfiles transcripcionales de todo el genoma de sangre entera (paneles de la izquierda) y análisis de la curva característica operativa del receptor (Roc) utilizando niveles de BATF2 (paneles de la derecha) para discriminar entre,(A-B) adultos con TB pulmonar activa (PTB) y controles saludables (HC) (doi: 10.1371/journal.pone.0070630),(C-D)adultos con PTB activa y TB extrapulmonar activa (EPTB) y HC (doi: 10.1371/journal.pone.0162220),(E-F)adultos con TB activa e infección de TB latente (LTBI) (doi: 10.1128/JCM.01990-15.) y(G-H)niños con TB activa con y sin coinfección por VIH, o LTBI. AUC= área bajo la curva para cada análisis ROC. ;;Figura 11 - (A)Niveles relativos de transcripción de BATF2 en sangre derivados de perfiles transcripcionales de todo el genoma de sangre completa y(B)análisis de la curva característica operativa del receptor (ROC) utilizando los niveles de BATF2 para discriminar entre adultos con y sin TB activa en una cohorte sudafricana no publicada previamente, todos los cuales están siendo investigados por TB activa.(C)El análisis ROC para discriminar TB activa en los pacientes de la cohorte anterior de pacientes que acuden al hospital con neumonía no TB (AUC= área bajo la curva) con un modelo de máquina de vectores de soporte utilizó niveles de transcripción sanguínea de CD177, haptoglobina, cadena J de inmunoglobulina y galectina 10.(D)Probabilidad específica del caso de TB utilizando una función de regresión logística para trazar la distancia desde el hiperplano discriminante dentro del modelo SVM en C. ;Figura 12 - (A)Niveles relativos de transcripción de BATF2 en sangre derivados de perfiles transcripcionales de todo el genoma de sangre completa en control saludable y pacientes que desarrollan TB activa >12 meses, 2=3-12 meses o <3 meses después del muestreo de sangre.(B)Análisis de la curva característica de funcionamiento del receptor (ROC) utilizando niveles de BATF2 para discriminar entre controles saludables y casos que desarrollan TB activa en cada uno de los intervalos de tiempo indicados en A. (AUC= área bajo la curva).(C-D)Niveles relativos de transcripción de BATF2 en sangre derivados de perfiles transcripcionales de todo el genoma de sangre completa de pacientes con TB activa en diferentes puntos de tiempo después del inicio del tratamiento de TB. Los valores P indicados se derivan de las pruebas de Mann-Whitney.(E-F)Niveles de transcripción de BATF2 en sangre emparejados donde estén disponibles de pacientes individuales muestreados a las 0 y 8 semanas de tratamiento de TB. Los datos en C y E se derivan de doi: 10.1016/80140-6736(10)61889-2, y los datos en D y F se derivan de doi: 0.1371/joumal.pone.0046191. ;;Figura 13-(A)Expresión relativa de BATF2 y GAPDH en células Thp1 duplicadas ± estimulación con interferón (IFN)p o IFNy durante 24 horas medida por arreglos de expresión de genes.(B)Inmunotinción relativa de BATF2: p--actina en análisis de transferencia Western de células Thp1 ± estimulación de IFNp o IFNy durante 24 horas (N=4). ;;EJEMPLOS;;Métodos experimentales;;Participantes del estudio;;Se recolectaron muestras de sangre en tubos Tempus o Paxgene de voluntarios saludables, pacientes con frotis positivo para TB pulmonar reclutados para el ensayo AdjuVIT (Martineauet al.,2011) en el momento del diagnóstico y >2 años después de la recuperación, pacientes con TB pulmonar o extrapulmonar en el servicio de TB de North Central London, y de pacientes que se presentaron en el departamento de emergencias del University College London Hospital con fiebre >38 ° C o un diagnóstico clínico de neumonía (basado en fiebre >38 ° C y cambios radiográficos en el tórax) antes de recibir tratamiento antimicrobiano. ;;Perfilado transcripcional de sangre periférica;;El ARN se extrajo usando el kit de aislamiento de ARN Tempus™ Spin (Applied Biosystems) o el kit de ARN sanguíneo PAXgene 96 (PreAnalytiX). El ADN genómico se retiró con el kit TURBO DNA-free™ (Ambion). Se utilizó el kit de limpieza RNeasy MinElute (Qiagen) para concentrar el ARN antes del agotamiento del ARNm de globina con el kit GLOBINclear™ (Ambion) y se evaluó el control de calidad del ARN utilizando el bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies). Luego se generó ARNc marcado con fluoróforo usando el kit de marcaje Quick Amp de baja entrada y se hibridó con SurePrint G3 Human Gene Expression v38x60K o Human Gene Expression v24x44K microarreglos de genoma completo (Agilent Technologies). Las imágenes de arreglo se adquirieron con el escáner de microarreglo de láser dual G2565BA de Agilent y se analizaron con el software de extracción de características de Agilent (v9.5.1). Las intensidades de señal medianas Cy3 y Cy5 transformadas log2 se normalizaron utilizando regresión lineal local LOESS contra la señal media de todas las muestras utilizando el paquete R agilp (Chain, paquete de procesamiento de arreglo de expresión Agilent; Chain et al., 2010). ;;Análisis de datos;;El análisis de todos los datos de microarreglos se realizó en datos transformados de log2 (Chainet al.,2010) y se restringió a sondas anotadas con símbolos génicos expresadas por encima de los niveles de control negativo de fondo en al menos una muestra. Se identificaron diferencias significativas de expresión génica entre conjuntos de datos utilizando pruebas de Mann Whitney para datos no paramétricos en MultiExperiment Viewer v4.9 (http://www.tm4.org/mev.html) con una tasa de descubrimiento falso de 0.05 y un filtro para una diferencia de >dos veces en la mediana de los valores de expresión normalizados. Se realizaron análisis de ontología génica y de vías en innateDB (Breueret al.,2013). Los gráficos de red de asociación de genes y vías se generaron utilizando Gephi (http://gephi.github.io/). ;;Las máquinas de vectores de soporte (SVM), que aprenden un hiperplano óptimo que separa dos conjuntos de datos en un espacio de alta dimensión, se utilizaron para clasificar los datos del transcriptoma de diferentes muestras (Cristianiniet al.,2000). Se utilizó la plataforma de computación estadística R (v3.0.2) para implementar los algoritmos SVM utilizando el paquete kernlab con un kernel lineal. El SVM fue entrenado y probado en conjuntos de datos independientes. El paquete produce una clasificación binaria o una puntuación de probabilidad para cada muestra al ajustar un modelo de regresión logística a la distancia euclidiana de cada caso desde el hiperplano (Plattet al.,1999). El paquete también genera una ponderación de la importancia de cada transcripción para determinar la clasificación general. El rendimiento de la clasificación se evaluó utilizando curvas de características operativas del receptor (ROC), con el área bajo la curva (AUC) como estadística de resumen. Las curvas ROC se construyeron a partir de la salida de la SVM utilizando el paquete R pROC. ;Ejemplo 1: Comparación de los transcriptomas sanguíneos en TB activa y después de la recuperación a largo plazo;;La población del estudio AdjuVIT comprendió pacientes VIH negativos con frotis y cultivo positivos para TB pulmonar, en quienes buscamos identificar la firma transcripcional de sangre periférica de TB activa en comparación con los sujetos muestreados de la misma cohorte después de la recuperación, de dos a cuatro años después de la finalización del tratamiento de TB (Tabla 1). Este análisis reveló diferencias de expresión génica estadísticamente significativas y mayores de dos veces en 204 transcripciones codificantes de proteínas únicas (Figura 1A). De acuerdo con otros datos publicados, la TB activa en esta cohorte se asoció con una mayor expresión de genes asociados con respuestas inmunes (Figura 1B). Con el fin de evaluar la generalización de esta firma transcripcional en otras cohortes de pacientes con TB activa, comparamos la lista de genes expresados diferencialmente en casos de TB activa AdjuVIT con otras dos firmas transcripcionales de sangre publicadas en pacientes adultos con TB pulmonar activa en comparación con voluntarios saludables (Berryet al.,2010) o sujetos con LTBI (Bloomet al.,2012). 51 transcripciones codificantes de proteínas únicas fueron comunes a los tres estudios a pesar de las diferencias en las características demográficas en cada población de estudio y el uso de diferentes plataformas de microarreglos para evaluar el transcriptoma (Figura 1C). De acuerdo con estudios previos (Berryet al.,2010), estas transcripciones mostraron un enriquecimiento significativo de los componentes de las vías asociadas al interferón (IFN). ;;Table 1. AdjuVIT cohort;; ;;
Median age, years (IQR) 30.8 (24 33.8 (26.7-39.5) ;;Male gender, N (%) 38(83) 28 (90) ;;Black/Black African 13 (28) 8 (26) ;;South Asian 22 (48) 14 (45) ;ütnmcity, JN{ /o);East Asian 4(9) 1(3) ;;European/American 7(15) 8 (26) ;;Median serum 25(OH) vit D (nM) (IQR) 14 (0-22 17 (11-33) ;;Scanty or 1+<C>op<, .>u<, ,>t<*>l<,>i<, ,>m<. .>A<A T>r<7T>o<T>load,<A>1N<T>(</T>y<)>o</>\j<28 (61) 12 (39)>
2+ or 3+ 18 (39) 19(61)
Cavitation on chest radiograph, N (%) 28 (61) 17(55)
Median TB treatment, days (IQR) 2(0-4) N/A
(N= number, SD= standard deviation, AFB= acid fast bacilli.)
Ejemplo 2: Clasificación de máquina de vectores de soporte de TB activa en comparación con estados saludables
Con el fin de discriminar casos individuales por su transcriptoma sanguíneo, utilizamos SVM para derivar modelos discriminatorios a partir de datos de entrenamiento y clasificar casos de prueba posteriores. Utilizando las 51 transcripciones expresadas diferencialmente en TB activa en comparación con otros estados saludables en múltiples cohortes (Figura 1C), entrenamos a un SVM para discriminar entre TB activa y casos posteriores a la recuperación utilizando el conjunto de datos del estudio AdjuVIT. Luego evaluamos el rendimiento de este modelo de SVM en la clasificación de muestras de tres estudios publicados separados en sujetos VIH negativos, incluidos un total de 325 casos. Estos comprendieron los dos estudios anteriores descritos anteriormente, incluidos los datos de TB activa y voluntarios saludables (cohorte Berry) (Berryet al.,2010) o TB activa y latente (cohorte Bloom) (Bloomet al.,2012), y datos adicionales de un estudio africano multicéntrico (cohorte Kaforou) de pacientes adultos con TB activa y latente (Kafourouet al.,2013). Se usaron curvas ROC para describir la compensación entre sensibilidad y especificidad. Estos mostraron AUC de 0.93-1.00, lo que representa excelentes precisiones de clasificación (Figura 2A).
El modelo SVM calcula una 'ponderación' para cada dimensión de los datos, en relación con su influencia en el modelo de clasificación. Clasificamos los 51 genes en orden de ponderaciones promedio de SVM, después del entrenamiento en múltiples muestras aleatorias de la mitad de los datos transcripcionales de la cohorte AdujVIT de TB activa y casos posteriores a la recuperación (Figura 2B). Nuestro objetivo fue identificar la menor cantidad de transcripciones que se pueden usar como biomarcador de diagnóstico para TB activa. Por lo tanto, probamos un número acumulativo de genes en orden de clasificación de sus ponderaciones para determinar su capacidad de discriminar entre la TB activa y los casos posteriores a la recuperación, utilizando los datos restantes que no se habían utilizado para el entrenamiento. Con el fin de mitigar el error de muestreo, realizamos 100 secuencias de entrenamiento/prueba aleatorias para dar puntuaciones promedio de ROC AUC (Figura 2C). Sorprendentemente, este análisis mostró que la transcripción sola clasificada más alta, que representa la expresión del gen inducible por IFN para el factor de transcripción con cremallera de leucina básico (BATF)2, logró consistentemente puntuaciones de ROC AUC >0.95.
Ejemplo 3: BATF2 discrimina la TB activa de los estados saludables en múltiples cohortes de estudio
Habiendo identificado los niveles de transcripción de BATF2 en sangre periférica como biomarcador de TB activa en la cohorte AdjuVIT, buscamos probar su rendimiento en múltiples cohortes independientes. La expresión de BATF2 en pacientes con TB activa fue significativamente mayor que la de voluntarios saludables (cohorte Berry) (Berryet al.,2010) y pacientes con LTBI (cohortes Bloom y Kaforou) (Bloomet al.,2012; Kafourouet al.,2013) independientemente del estado de VIH, lo que representa datos de 402 pacientes en total (Figura 3A). Entre los pacientes VIH negativos en estos estudios, la expresión de BATF2 en sangre periférica discriminó entre TB activa y los diversos casos saludables descritos en cada cohorte con puntuaciones de ROC AUC de 0.93-0.99 (Figura 3B). Los niveles de BATF2 discriminaron menos bien entre los casos activos de TB y LTBI entre los pacientes infectados por el VIH en la cohorte Kaforou (Roc AUC de 0.84). En esta cohorte, la alta expresión de BATF2 en pacientes con TB activa no se vio afectada significativamente por la coinfección por VIH, pero los casos de LTBI con coinfección por VIH tuvieron niveles de BATF2 significativamente más altos que los casos VIH negativos (Figura 3A), lo que confunde parcialmente la discriminación precisa entre TB activa y latente en pacientes infectados por VIH por esta medición. Un modelo SVM entrenado utilizando datos de todo el genoma del ensayo AdjuVIT para discriminar casos de TB activa y posteriores a la recuperación, también logró un ROC AUC de 0.85 para la clasificación de TB activa y latente entre pacientes infectados por VIH de la cohorte Kaforou (Figura 3C).
En conclusión, la discriminación de los casos activos de TB y LTBI en personas infectadas por el VIH utilizando datos transcripcionales de todo el genoma no produjo un mejor ROC AUC que BATF2 por sí mismo, lo que sugiere que incluso las combinaciones de otras transcripciones no permitirán una mejor precisión de clasificación utilizando SVM. Por lo tanto, en el contexto de la infección por VIH-1, la inclusión de parámetros adicionales incluso hasta el nivel de todo el genoma, puede no lograr una mejor precisión de clasificación que BATF2 solo.
Ejemplo 4: Clasificación de la máquina de vectores de soporte de TB activa en comparación con otras enfermedades febriles
Comparamos los niveles de expresión de BATF2 en los transcriptomas sanguíneos de la cohorte AdjuVIT de casos de TB activa con los de pacientes que se presentan en el hospital con enfermedades febriles (cohorte de fiebre), lo que representa un espectro diverso de enfermedades infecciosas no TB (Tabla 2). Los niveles de BATF2 entre las muestras de cohorte de fiebre mostraron un amplio intervalo que se superpuso con los de los casos activos de TB (Figura 4A, C). Proteína C-reactiva (CRP) en suero que se usa ampliamente como biomarcador para infección y tampoco fue significativamente diferente entre los dos grupos (Figura 4B, C). Los niveles de BATF2 y CRP entre estos pacientes mostraron un coeficiente de correlación relativamente bajo, lo que sugiere que los dos parámetros no estaban corregulados (Figura 7A).
Table 2. Fever cohort case mix
System Syndrome N (%)
Urinary T Urinary tract infection10(14.3
Pyelonephritis12(17.1
Epi di dy mo-orchiti s 1 (14)
Respiratory7 .Pneumonia10(14.3)
- -(COPD= chronic obstructive pulmonary disease, LRTI= lower respiratory tract infection,
CXR= chest x-ray)
A continuación, probamos la hipótesis de que las transcripciones de sangre periférica alternativas pueden diferenciar TB activa de otras infecciones representadas en la cohorte de fiebre. Utilizamos la mitad de los conjuntos de datos transcripcionales de la cohorte TB activa AdjuVIT y fiebre combinados para el entrenamiento de sV m en múltiples submuestras aleatorias para identificar su orden de clasificación de ponderaciones promedio para discriminar los casos de TB activa de los casos de fiebre (Figura 4D). Luego probamos un número acumulativo de genes en orden de clasificación de sus ponderaciones para determinar su capacidad de discriminar entre los casos de cohorte de TB activa y fiebre para determinar su precisión de clasificación. Llevamos a cabo 100 secuencias aleatorias de entrenamiento/prueba en cada caso utilizando la mitad de los datos para el entrenamiento y la otra mitad para las pruebas, y luego calculamos las puntuaciones promedio de ROC AUC . Las puntuaciones de AUC aumentaron de aproximadamente 0.8 usando el gen mejor clasificado solo, a 0.95 usando los cuatro genes principales conjuntamente, con solo ganancias adicionales modestas por la inclusión de genes adicionales (Figura 4E). Cada uno de los cuatro genes en esta firma discriminante mostró niveles de transcripción sanguínea significativamente diferentes en TB activa en comparación con las muestras de cohorte de fiebre (Figura 5A). CD177 y haptoglobina (HP) se expresaron a niveles más altos en las muestras de cohorte de fiebre, mientras que la cadena J de inmunoglobulina (IGJ) y la galectina 10 (CLC) se expresaron a niveles más altos en las muestras de t B activa.
Con el fin de validar su potencial para discriminar entre los casos activos de TB y fiebre, se entrenó un modelo de SVM con datos transcripcionales para estos cuatro genes utilizando la primera mitad de los casos de cohorte de TB activa AdjuVIT y fiebre, y se probó en la segunda mitad de los casos que no se habían incluido en la identificación de estos genes (Figura 5B). La firma de cuatro genes proporcionó una clasificación casi perfecta de las muestras de prueba con un ROC AUC de 0.99. A modo de comparación, también probamos el gen mejor clasificado, CD177, que discriminaba entre los casos de prueba de cohorte de TB activa y fiebre con un ROC AUC de 0.94. CD177 se caracteriza mejor como glicoproteína de superficie expresada por subpoblaciones de neutrófilos ( Gohringet al.,2004; Stronceket al.,1996; Matsuoet al.,2000), pero el coeficiente de correlación con los recuentos de neutrófilos en las muestras de cohorte de TB activa AdjuVIT y fiebre fue de solo 0.23. Esto sugirió que el aumento de los niveles de CD177 en las muestras de la cohorte de fiebre no es simplemente un sustituto de la mayor frecuencia de neutrófilos circulantes, sino que puede representar la favoración en expresión transcripcional de CD177 en estos casos en comparación con la TB activa. También observamos que HP se reconoce como un reactivo de fase aguda y probamos la correlación de los niveles de transcripción de HP con los niveles de CRP circulante, pero también encontramos una correlación muy modesta entre estos dos parámetros. Estos datos sugirieron que el aumento de los niveles de transcripciones de Hp en casos de enfermedades infecciosas no TB reflejó la favoración en expresión transcripcional específica del contexto en lugar de un sustituto para las respuestas de fase aguda no específicas.
Hubo diferencias significativas en el origen étnico, la edad y el género entre los pacientes de la cohorte TB activa AdjuVIT y fiebre. Sin embargo, los diferentes patrones de expresión génica que discriminan entre las dos cohortes fueron evidentes en todos los grupos étnicos y no se confundieron por edad o género (Figura 8). Además, el entrenamiento del modelo SVM de firma de cuatro genes utilizando datos de cada grupo étnico permitió una clasificación precisa de los casos en todos los demás grupos étnicos (Figura 9A-C). Además, las diferencias significativas en la edad y los recuentos de neutrófilos o linfocitos en sangre discriminaron poco entre los casos de TB activa y fiebre (Figura 9D-F).
Ejemplo 5: Derivación de una puntuación de riesgo individual para casos de prueba
Para lograr la confianza caso por caso en la precisión de la clasificación, ajustamos la distancia de cada caso de prueba desde el hiperplano de separación de SVM a una función de regresión logística sigmoidea para dar una estimación de probabilidad entre 0 y 1 (Plattet al.,1999), generando de este modo una puntuación de riesgo para cada uno de los casos de prueba basada en el modelo de SVM derivado de nuestra firma de cuatro genes (Figura 5C). Dado que BATF2 puede discriminar entre TB activa y los casos saludables, y que cuatro genes adicionales pueden discriminar la TB activa de una amplio intervalo de otras enfermedades infecciosas que presentan fiebre, buscamos combinar los niveles de expresión de BATF2 con CD177, HP, IGJ y CLC en un solo modelo SVM para discriminar la TB activa de los casos posteriores a la recuperación en la cohorte AdjuVIT y de otras enfermedades en la cohorte de fiebre. El modelo SVM se entrenó utilizando la firma de cinco genes en la mitad de los casos de TB activa AdjuVIT en un grupo y la mitad de los casos de TB posteriores a la recuperación de AdjuVIT agrupados con la mitad de los casos de cohorte de fiebre en un segundo grupo. Este modelo se utilizó para clasificar la segunda mitad restante de los casos en los tres grupos, proporcionando una puntuación individual de riesgo de TB activa para cada caso y dando un ROC AUC de 0.95 (Figura 5D-E).
Ejemplo 6: Las firmas transcripcionales de sangre para TB activa son independientes del sitio de la enfermedad
Todos los casos de TB activa en las cohortes AdjuVIT, Berry y Bloom fueron de TB pulmonar. Los nuevos biomarcadores de diagnóstico para la TB son particularmente necesarios para la TB extrapulmonar en la que los diagnósticos microbiológicos existentes tienen la menor sensibilidad. Por lo tanto, obtuvimos nuevos datos transcriptómicos de sangre de casos adicionales para evaluar la utilidad de BATF2 y la firma transcripcional específica de TB de cuatro genes descrita anteriormente mediante la comparación de individuos saludables, tuberculosis pulmonar o extrapulmonar activa y neumonía no TB antes de cualquier tratamiento con antibióticos. En comparación con voluntarios saludables, los niveles de transcripción de BATF2 en sangre fueron significativamente mayores en casos de TB tanto pulmonar como extrapulmonar (Figura 6A). Casos clasificados BATF2 elevados de TB pulmonar con ROC AUC de 1 y casos extrapulmonares con ROC AUC de 0.98 (Figura 6B). Finalmente, un modelo de SVM entrenado con TB activa AdjuVIT y todos los casos de cohorte de fiebre utilizando la firma específica de TB de cuatro genes de CD177, HP, IGJ y CLC, discriminó entre nuevos casos de TB pulmonar o extrapulmonar y neumonía febril no TB con ROC AUC de 0.98 y 1 respectivamente (Figura 6C-D). Por lo tanto, concluimos que BATF2 y las firmas transcripcionales de sangre de los cuatro genes de TB funcionaron igualmente bien en la clasificación de la<t>B tanto pulmonar como extrapulmonar.
En resumen, los estudios anteriores muestran que los niveles elevados de transcripción sanguínea de BATF2 discriminan la enfermedad de TB pulmonar y extrapulmonar activa de los estados saludables y que los niveles de transcripción sanguínea de CD177, haptoglobina, cadena J de inmunoglobulina y galectina 10 discriminan la enfermedad de TB pulmonar y extrapulmonar activa de otras enfermedades infecciosas, resumidas en la Tabla 3.
Tabla 3
PTB= TB pulmonar, EPTB= TB extrapulmonar, LTBI= infección de TB latente, HC= controles saludables.
Reino Unido=Reino Unido, SA= África del Sur, EUA= Estados Unidos de América, Números entre paréntesis= Número de sujetos en cada grupo, ROC AUC= área característica de operación del receptor
bajo la curva.
Ejemplo 7: Validación extendida de biomarcadores para tuberculosis activa
Este ejemplo es una validación extendida del uso de los niveles de transcripción de BATF2 en sangre para discriminar la tuberculosis activa (TB) de la infección de TB latente y los controles saludables. Estos incluyen datos en niños y personas con y sin coinfección por VIH.
Mostramos que los niveles significativamente elevados de BATF2 son evidentes hasta 3 meses antes del inicio de TB activa y se reducen después de 8 semanas de tratamiento de TB. Por lo tanto, los niveles de transcripción de BATF2 se pueden usar para predecir el inicio de TB activa dentro de los 3 meses y predecir el tratamiento exitoso a los 2 meses de terapia.
Los cambios en los niveles transcripcionales de BATF2 son detectables a nivel de proteína, lo que indica que los ensayos cuantitativos de proteína BATF2 se pueden utilizar como una alternativa a los ensayos transcripcionales.
Además, hemos llevado a cabo una validación extendida del uso de CD177 en sangre, haptoglobina, cadena J de inmunoglobulina y galectina 10 para discriminar el activo de otras enfermedades infecciosas no TB, incluidos los pacientes con y sin coinfección por VIH.
Métodos experimentales
Muestras de pacientes
Los datos presentados se derivaron de conjuntos de datos de perfiles transcripcionales de todo el genoma publicados previamente y secuenciación de ARN de muestras de nuevas cohortes de pacientes (Tabla 4).
Análisis de expresión génica en muestras clínicas
Todos los datos de expresión génica crudos se normalizaron como se describió anteriormente, antes de extraer los datos de expresión de los genes diana. La expresión de BATF2 se usó para distinguir los casos de TB activa de los saludables y la expresión de CD177, haptoglobina, cadena J de inmunoglobulina y galectina 10 se usó como una firma de cuatro genes para discriminar TB activa de neumonía. En este último, se utilizó un modelo de máquina de vectores de soporte derivado de casos previamente publicados de tuberculosis activa y diversas enfermedades infecciosas que se presentan en el hospital con fiebre, para clasificar nuevos casos de TB activa y neumonía no TB como se describe en Roeet al.,2016.
Tabla 4
PTB= TB pulmonar, EPTB= TB extrapulmonar, LTBI= infección de TB latente, HC=
controles saludables. Reino Unido=Reino Unido, SA= África del Sur, EUA= Estados
Unidos de América, Números entre paréntesis= Número de sujetos en cada grupo,
ROC AUC= área característica de operación del receptor bajo la curva.
Transcripción de BATF2 y mediciones de proteínas en células Thp1
Las células Thp1 se incubaron ±IFNp o IFNy a 10 ng/mL durante 24 horas antes de recolectar lisados celulares para extracciones de ARN y proteínas como se describió anteriormente (Noursadeghiet al.,2009; Tomlinsonet al.,2013). A contuación, el ARN se sometió a un perfil transcripcional de todo el genoma como se describió anteriormente (Noursadeghiet al., 2009; Tomlinson et al.,2013), y las proteínas celulares se sometieron a transferencia Western para p actina (AC-15, abcam) y BATF2 (EPR10667, abcam) como se describió anteriormente (Noursadeghiet al.,2009; Tomlinsonet al.,2013). Las bandas inmunorreactivas se cuantificaron con el sistema de imágenes Odyssey (LI-COR). La expresión relativa de la proteína BATF2 se normalizó con respecto a la expresión de p actina.
Ejemplo 7a: Validación extendida de los niveles de transcripción de BATF2, CD177, haptoglobina, cadena J de inmunoglobulina y galectina 10 para discriminar a los individuos con TB activa de los pacientes de control saluadables con infección latente de TB (LTBI) y otras enfermedades infecciosas.
En datos derivados de dos estudios publicados anteriormente (Bloomet al.,2013; Blankleyet al.,2014), los niveles de transcripción de BATF2 en sangre en el momento del diagnóstico en pacientes adultos con T<b>pulmonar y extrapulmonar activa fueron significativamente mayores que los de los controles saludables. En el análisis de la curva característica de funcionamiento del receptor (ROC), los niveles de transcripción de BATF2 discriminaron con precisión entre los casos de TB activa y los controles saludables con un área bajo la curva (AUC) de 0.960.99 (Figura 10A-D).
En los datos derivados de otro estudio publicado en adultos (Walteret al.,2015), los niveles de transcripción de BATF2 en sangre en el momento del diagnóstico en pacientes adultos con TB pulmonar activa fueron significativamente mayores que los de adultos con LTBI, y discriminaron entre TB activa y LTBI con ROC AUC de 0.91 (Figura 10E-F). Del mismo modo, en un estudio publicado previamente en niños (Andersonet al.,2014), los niveles de transcripción de BATF2 en sangre en el momento del diagnóstico de TB pulmonar activa fueron significativamente más altos en niños VIH positivos y VIH negativos en comparación con los de niños con LTBI. En estos datos, los niveles de transcripción de BATF2 en sangre discriminaron entre TB activa y LTBI con un ROC AUC de 0.870.92 (Figura 10G-H).
En nuevos datos (no publicados) de pacientes adultos VIH positivos y VIH negativos que están siendo investigados por TB activa, los niveles de BATF2 en sangre en el momento de la investigación se compararon en pacientes con y sin evidencia de TB activa sobre la base de diagnósticos microbiológicos existentes y criterios clínicos. Los niveles de transcripción de BATF2 en sangre fueron significativamente mayores en pacientes con TB activa en comparación con aquellos que no demostraron tener TB activa, y discriminaron entre estos grupos con un ROC AUC de 0.9 (Figura 11A-B).
Ya hemos demostrado que la TB activa se puede diferenciar utilizando un modelo de aprendizaje de máquina de vectores de soporte (SVM) basado en niveles de CD177, haptoglobina, cadena J de inmunoglobulina y galectina 10. Para validar aún más nuestras observaciones anteriores, probamos el rendimiento de este modelo de SVM en la discriminación de los nuevos pacientes adultos VIH positivos y VIH negativos, descritos anteriormente, de otra nueva cohorte de pacientes adultos con infecciones del tracto respiratorio inferior no TB (neumonía). Esta firma de cuatro genes discriminó entre TB activa y neumonía con ROC AUC de 1 (Figura 11C-D).
Tomados conjuntamente, estos datos proporcionan un nuevo análisis de los datos derivados de 626 pacientes en total. Es importante destacar que nuestra validación extendida incluye datos de tuberculosis pulmonar y extrapulmonar tanto de niños, como adultos y pacientes con y sin coinfección por VIH.
Ejemplo 7b: Los niveles elevados de transcripción de BATF2 en sangre pueden predecir la TB activa 3 meses antes del inicio de la enfermedad
Zak et al., 2016 muestran que las transcripciones de sangre pueden cambiar antes de la aparición de TB activa. Por lo tanto, probamos la hipótesis en estos datos de que los niveles de transcripción de BATF2 en sangre específicamente, se elevan antes del inicio de TB activa. En una cohorte longitudinal de pacientes muestreados durante 2 años, comparamos los niveles de transcripción de BATF2 en sangre en varios puntos de tiempo antes del inicio de la enfermedad de TB activa en una proporción que desarrolló TB activa, con todas las mediciones realizadas en individuos que permanecieron saludables. Un aumento significativo en los niveles de transcripción de BATF2 en sangre fue evidente en las muestras obtenidas a los 3-12 meses antes del diagnóstico de TB activa y un aumento significativo adicional fue evidente en las muestras obtenidas dentro de los 3 meses de la presentación con TB activa (Figura 12A). Los niveles elevados de transcripción de BATF2 en sangre discriminaron a los pacientes que desarrollaron TB activa dentro de los 3 meses de aquellos que permanecieron saludables con un ROC a Uc de 0.83 (Figura 12B).
Ejemplo 7c: Reducción de los niveles de transcripción de BATF2 en sangre después de 8 semanas de tratamiento de TB activa
El tratamiento de TB conduce a una reducción en los niveles de transcripción de BATF2 en sangre (Roeet al.,2016). Ahora hemos ampliado este análisis para investigar el punto de tiempo más temprano en el que podemos detectar una caída en los niveles de transcripción de BATF2 en sangre. Identificamos datos de dos cohortes de pacientes con TB activa sensible a los medicamentos, que combinaron el muestreo de sangre longitudinal y el seguimiento más allá de los 6 meses de tratamiento de TB sin recurrencia temprana de enfermedad activa que sugiera fracaso terapéutico (Bloomet al.,2012; Martineauet al.,2011). En comparación con los niveles previos al tratamiento, los niveles de transcripción de BATF2 en sangre se redujeron significativamente en ambos estudios a las 8 semanas de tratamiento de TB. En los pacientes de estos estudios para los que se disponía de datos emparejados del pretratamiento y muestras de sangre de 8 semanas, el 95% mostró una caída en sus niveles de transcripción de BATF2 en sangre (Figura 12E-F). Estos datos sugieren que los niveles de transcripción de BATF2 en sangre se pueden utilizar como un biomarcador sustituto de la respuesta al tratamiento a las 8 semanas de tratamiento. Esto es particularmente importante porque no se dispone de datos de susceptibilidad a los medicamentos en aproximadamente el 50% de los pacientes que comenzaron el tratamiento de TB. En este contexto, nuestros datos sugieren que la caída en los niveles de transcripción de BATF2 se puede usar como evidencia de respuestas terapéuticas al tratamiento farmacológico empírico.
Ejemplo 7d: Los niveles elevados de transcripción de BATF2 se asocian con niveles aumentados de proteína BATF2.
BATF2 exhibe transcripción inducible por interferón (IFN) en células fagocíticas mononucleares (Murphyet al.,2013). La actividad sistémica de IFN es ampliamente reconocida en la TB activa (Berry et al., 2010). Buscamos probar la hipótesis de que la favoración de la expresión inducible por IFN de BATF2 en células fagocíticas mononucleares Thp1 se asoció con una mayor expresión a nivel de proteína. Primero confirmamos que la estimulación con IFN de las células Thp1 indujo la favoración en expresión transcripcional de BATF2 en células Thp1 (Figura 13A) y, posteriormente, que también pudimos detectar un aumento inducible por IFN en los niveles de proteína BATF2 en estas células mediante análisis cuantitativo de transferencia Western (Figura 13B). Estos datos sugieren que el aumento de los niveles de transcripciones de BATF2 en sangre en TB activa también se puede asociar con un aumento de los niveles de proteína BATF2 en las células sanguíneas.
SECUENCIAS
SEQ ID NO: 1 (ARNm IGJHomo sapiens)
i ttgtgattgt ttttagtttg ttagctgcct ggagtgttat tttaagaaag cagaagcacc 61 atcatttgca cactccttat agatcacaca ccttaaccct gacttttttt gctccagttt 121 ttcagaagaa gtgaagtcaa gatgaagaac catttgcttt tctggggagt cctggcggtt 181 tttattaagg ctgttcatgt gaaagcccaa gaagatgaaa ggattgttct tgttgacaac 241 aaatgtaagt gtgcccggat tacttccagg atcatccgtt cttccgaaga tcctaatgag 301 gacattgtgg agagaaacat ccgaattatt gttcctctga acaacaggga gaatatctct 361 gatcccacct caccattgag aaccagattt gtgtaccatt tgtctgacct ctgtaaaaaa 421 tgtgatccta cagaagtgga gctggataat cagatagtta ctgctaccca gagcaatatc 481 tgtgatgaag acagtgctac agagacctgc tacacttatg acagaaacaa gtgctacaca 541 gctgtggtcc cactcgtata tggtggtgag accaaaatgg tggaaacagc cttaacccca 601 gatgcctgct atcctgacta atttaagtca ttgctgactg catagctctt tttcttgaga 661 ggctctccat tttgattcag aaagttagca tatttattac caatgaattt gaaaccaggg 721 cttttttttt tttttgggtg atgtaaaacc aactccctgc caccaaaata attaaaatag 781 tcacattgtt atctttatta ggtaatcact tcttaattat atgttcatac tctaagtatc 841 aaaatcttcc aattatcatg ctcacctgaa agaggtatgc tctcttagga atacagtttc 901 tagcattaaa caaataaaca 3Q^Q^3frf3.3.3. ataaaactca aggactgaaa atcaggaggt 961 gtaataaaat gttcctcgca ttcccccccg cttttttttt tttttttgac tttgccttgg 1021 agagccagag cttccgcatt ttctttacta ttctttttaa aaaaagtttc actgtgtaga 1081 gaacatatat gcataaacat aggtcaatta tatgtctcca ttagaaaaat aataattgga 1141 aaacatgttc tagaactagt tacaaaaata atttaaggtg aaatctctaa tatttataaa 1201 agtagcaaaa taaatgcata attaaaatat atttggacat aacagacttg gaagcagatg 1261 atacagactt ctttttttca taatcaggtt agtgtaagaa attgccattt gaaacaatcc 1321 attttgtaac tgaaccttat gaaatatatg tatttcatgg tacgtattct ctagcacagt 1381 ctgagcaatt aaatagattc ataagcataa aaa
SEQ ID NO: 2 (ARNm HPHomo sapiens,variante de transcripción 1)
i agcataaaaa gaccagcaga tgccccacag cactgctctt ccagaggcaa gaccaaccaa 61 gatgagtgcc ctgggagctg tcattgccct cctgctctgg ggacagcttt ttgcagtgga 121 ctcaggcaat gatgtcacgg atatcgcaga tgacggctgc ccgaagcccc ccgagattgc 181 acatggctat gtggagcact cggttcgcta ccagtgtaag aactactaca aactgcgcac 241 agaaggagat ggagtataca ccttaaatga taagaagcag tggataaata aggctgttgg 301 agataaactt cctgaatgtg aagcagatga cggctgcccg aagccccccg agattgcaca 361 tggctatgtg gagcactcgg ttcgctacca gtgtaagaac tactacaaac tgcgcacaga 421 aggagatgga gtgtacacct taaacaatga gaagcagtgg ataaataagg ctgttggaga 481 taaacttcct gaatgtgaag cagtatgtgg gaagcccaag aatccggcaa acccagtgca 541 gcggatcctg ggtggacacc tggatgccaa aggcagcttt ccctggcagg ctaagatggt 601 ttcccaccat aatctcacca caggtgccac gctgatcaat gaacaatggc tgctgaccac 661 ggctaaaaat ctcttcctga accattcaga aaatgcaaca gcgaaagaca ttgcccctac 721 tttaacactc tatgtgggga aaaagcagct tgtagagatt gagaaggttg ttctacaccc 781 taactactcc caggtagata ttgggctcat caaactcaaa cagaaggtgt ctgttaatga 841 gagagtgatg cccatctgcc taccttcaaa ggattatgca gaagtagggc gtgtgggtta 901 tgtttctggc tgggggcgaa atgccaattt taaatttact gaccatctga agtatgtcat 961 gctgcctgtg gctgaccaag accaatgcat aaggcattat gaaggcagca cagtccccga 1021 aaagaagaca ccgaagagcc ctgtaggggt gcagcccata ctgaatgaac acaccttctg 1081 tgctggcatg tctaagtacc aagaagacac ctgctatggc gatgcgggca gtgcctttgc 1141 cgttcacgac ctggaggagg acacctggta tgcgactggg atcttaagct ttgataagag 1201 ctgtgctgtg gctgagtatg gtgtgtatgt gaaggtgact tccatccagg actgggttca 1261 gaagaccata gctgagaact aatgcaaggc tggccggaag cccttgcctg aaagcaagat 1321 ttcagcctgg aagagggcaa agtggacggg agtggacagg agtggatgcg ataagatgtg 1381 gtttgaagct gatgggtgcc agccctgcat tgctgagtca atcaataaag agctttcttt
1441 tgacccataa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa
SEQ ID NO: 3 (ARNm HPHomo sapiens,variante de transcripción 2)
l agcataaaaa gaccagcaga tgccccacag cactgctctt ccagaggcaa gaccaaccaa 61 gatgagtgcc ctgggagctg tcattgccct cctgctctgg ggacagcttt ttgcagtgga 121 ctcaggcaat gatgtcacgg atatcgcaga tgacggctgc ccgaagcccc ccgagattgc 181 acatggctat gtggagcact cggttcgcta ccagtgtaag aactactaca aactgcgcac 241 agaaggagat ggagtgtaca ccttaaacaa tgagaagcag tggataaata aggctgttgg 301 agataaactt cctgaatgtg aagcagtatg tgggaagccc aagaatccgg caaacccagt 361 gcagcggatc ctgggtggac acctggatgc caaaggcagc tttccctggc aggctaagat 421 ggtttcccac cataatctca ccacaggtgc cacgctgatc aatgaacaat ggctgctgac 481 cacggctaaa aatctcttcc tgaaccattc agaaaatgca acagcgaaag acattgcccc 541 tactttaaca ctctatgtgg ggaaaaagca gcttgtagag attgagaagg ttgttctaca 601 ccctaactac tcccaggtag atattgggct catcaaactc aaacagaagg tgtctgttaa 661 tgagagagtg atgcccatct gcctaccttc aaaggattat gcagaagtag ggcgtgtggg 721 ttatgtttct ggctgggggc gaaatgccaa ttttaaattt actgaccatc tgaagtatgt 781 catgctgcct gtggctgacc aagaccaatg cataaggcat tatgaaggca gcacagtccc 841 cgaaaagaag acaccgaaga gccctgtagg ggtgcagccc atactgaatg aacacacctt 901 ctgtgctggc atgtctaagt accaagaaga cacctgctat ggcgatgcgg gcagtgcctt 961 tgccgttcac gacctggagg aggacacctg gtatgcgact gggatcttaa gctttgataa 1021 gagctgtgct gtggctgagt atggtgtgta tgtgaaggtg acttccatcc aggactgggt 1081 tcagaagacc atagctgaga actaatgcaa ggctggccgg aagcccttgc ctgaaagcaa 1141 gatttcagcc tggaagaggg caaagtggac gggagtggac aggagtggat gcgataagat 1201 gtggtttgaa gctgatgggt gccagccctg cattgctgag tcaatcaata aagagctttc 1261 ttttgaccca taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a
SEQ ID NO: 4 (ARNm HPHomo sapiens,variante de transcripción 3)
i agcataaaaa gaccagcaga tgccccacag cactgctctt ccagaggcaa gaccaaccaa 61 gatgagtgcc ctgggagctg tcattgccct cctgctctgg ggacagcttt ttgcagtgga 121 ctcaggcaat gatgtcacgg atatcgcaga tgacggctgc ccgaagcccc ccgagattgc 181 acatggctat gtggagcact cggttcgcta ccagtgtaag aactactaca aactgcgcac 241 agaaggagat ggagtataca ccttaaatga taagaagcag tggataaata aggctgttgg 301 agataaactt cctgaatgtg aagcagtatg tgggaagccc aagaatccgg caaacccagt 361 gcagcggatc ctgggtggac acctggatgc caaaggcagc tttccctggc aggctaagat 421 ggtttcccac cataatctca ccacaggtgc cacgctgatc aatgaacaat ggctgctgac 481 cacggctaaa aatctcttcc tgaaccattc agaaaatgca acagcgaaag acattgcccc 541 tactttaaca ctctatgtgg ggaaaaagca gcttgtagag attgagaagg ttgttctaca 601 ccctaactac tcccaggtag atattgggct catcaaactc aaacagaagg tgtctgttaa 661 tgagagagtg atgcccatct gcctaccttc aaaggattat gcagaagtag ggcgtgtggg 721 ttatgtttct ggctgggggc gaaatgccaa ttttaaattt actgaccatc tgaagtatgt 781 catgctgcct gtggctgacc aagaccaatg cataaggcat tatgaaggca gcacagtccc 841 cgaaaagaag acaccgaaga gccctgtagg ggtgcagccc atactgaatg aacacacctt 901 ctgtgctggc atgtctaagt accaagaaga cacctgctat ggcgatgcgg gcagtgcctt 961 tgccgttcac gacctggagg aggacacctg gtatgcgact gggatcttaa gctttgataa 1021 gagctgtgct gtggctgagt atggtgtgta tgtgaaggtg acttccatcc aggactgggt 1081 tcagaagacc atagctgaga actaatgcaa ggctggccgg aagcccttgc ctgaaagcaa 1141 gatttcagcc tggaagaggg caaagtggac gggagtggac aggagtggat gcgataagat 1201 gtggtttgaa gctgatgggt gccagccctg cattgctgag tcaatcaata aagagctttc 1261 ttttgaccca taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a
SEQ ID NO: 5 (ARNm CLCHomo sapiens)
1 catttaaatt ctgcagctca gagattcaca cagaagtctg gacacaattc agaagagcca 61 cccagaagga gacaacaatg tccctgctac ccgtgccata cacagaggct gcctctttgt 121 ctactggttc tactgtgaca atcaaagggc gaccacttgc ctgtttcttg aatgaaccat 181 atctgcaggt ggatttccac actgagatga aggaggaatc agacattgtc ttccatttcc 241 aagtgtgctt tggtcgtcgt gtggtcatga acagccgtga gtatggggcc tggaagcagc 301 aggtggaatc caagaatatg ccctttcagg atggccaaga atttgaactg agcatctcag 361 tgctgccaga taagtaccag gtaatggtca atggccaatc ctcttacacc tttgaccata 421 gaatcaagcc tgaggctgtg aagatggtgc aagtgtggag agatatctcc ctgaccaaat 481 ttaatgtcag ctatttaaag agataaccag acttcatgtt gccaaggaat ccctgtctct 541 acgtgaactt gggattccaa agccagctaa cagcatgatc ttttctcact tcaatcctta 601 ctcctgctca ttaaaactta atcaaacttc acaaaaaaaa aaaaaaaaa
SEQ ID NO: 6 (ARNm CD177Homo sapiens)
l aaaggacttg tttcctgctg aaaaagcaga aagagattac cagccacaga cgggtcatga 61 gcgcggtatt actgctggcc ctcctggggt tcatcctccc actgccagga gtgcaggcgc 121 tgctctgcca gtttgggaca gttcagcatg tgtggaaggt gtccgacctg ccccggcaat 181 ggacccctaa gaacaccagc tgcgacagcg gcttggggtg ccaggacacg ttgatgctca 241 ttgagagcgg accccaagtg agcctggtgc tctccaaggg ctgcacggag gccaaggacc 301 aggagccccg cgtcactgag caccggatgg gccccggcct ctccctgatc tcctacacct 361 tcgtgtgccg ccaggaggac ttctgcaaca acctcgttaa ctccctcccg ctttgggccc 421 cacagccccc agcagaccca ggatccttga ggtgcccagt ctgcttgtct atggaaggct 481 gtctggaggg gacaacagaa gagatctgcc ccaaggggac cacacactgt tatgatggcc 541 tcctcaggct caggggagga ggcatcttct ccaatctgag agtccaggga tgcatgcccc 601 agccagtttg caacctgctc aatgggacac aggaaattgg gcccgtgggt atgactgaga 661 actgcgatat gaaagatttt ctgacctgtc atcgggggac caccattatg acacacggaa 721 acttggctca agaacccact gattggacca catcgaatac cgagatgtgc gaggtggggc 781 aggtgtgtca ggagacgctg ctgctcctag atgtaggact cacatcaacc ctggtgggga 841 caaaaggctg cagcactgtt ggggctcaaa attcccagaa gaccaccatc cactcagccc 901 ctcctggggt gcttgtggcc tcctataccc acttctgctc ctcggacctg tgcaatagtg 961 ccagcagcag cagcgttctg ctgaactccc tccctcctca agctgcccct gtcccaggag 1021 accggcagtg tcctacctgt gtgcagcccc ttggaacctg ttcaagtggc tccccccgaa 1081 tgacctgccc caggggcgcc actcattgtt atgatgggta cattcatctc tcaggaggtg 1141 ggctgtccac caaaatgagc attcagggct gcgtggccca accttccagc ttcttgttga 1201 accacaccag acaaatcggg atcttctctg cgcgtgagaa gcgtgatgtg cagcctcctg 1261 cctctcagca tgagggaggt ggggctgagg gcctggagtc tctcacttgg ggggtggggc 1321 tggcactggc cccagcgctg tggtggggag tggtttgccc ttcctgctaa ctctattacc 1381 cccacgattc ttcaccgctg ctgaccaccc acactcaacc tccctctgac ctcataacct 1441 aatggccttg gacaccagat tctttcccat tctgtccatg aatcatcttc cccacacaca 1501 atcattcata tctactcacc taacagcaac actggggaga gcctggagca tccggacttg 1561 ccctatggga gaggggacgc tggaggagtg gctgcatgta tctgataata cagaccctgt 1621 cctttctccc agtgctggga tttctccatg tgagggggca gcaggacacc cagggatcta 1681 gcgtggggga ggagaggagc ctaatgagaa aatgaccatc taaagcctgc ccttcattgg 1741 tctggttcac gtctccaaac cagcttggat ggtagcagag acttcagggt gctccagcca 1801 aacgtatttg ggcatcacca tgacctggga ggggaagatg cactgagacg tatgaggctt 1861 ccagcctagc agccagggcc ctagcacaaa caggaggctc gccccatctg agcaactgca 1921 ggagaggtta gtacagtcat gcattgctta acgacaggga cgtgtcgtta gaaatgtgtc 1981 gttaggtgat tttatgacca taggaacatt gtagcgtgca cttacaccaa cccagatggt 2041 acagcccaat acacacccag gatggacgct agagtcgact gctcctaggc tacaagcctg 2101 cagtgcatgt tatggtgtga atactgcagg caatcttaac accacggcaa gtatttgtgc 2161 atctacacac atctaaacat agaaaaggta cagcataaat acactattgt catctcagca
2221 gaaaaaaaaa aaaaaaaa
SEQ ID NO: 7 (ARNm BATF2Homo sapiens,variante de transcripción 1)
1 gaaactgaaa cttggccctc tgggggcgga gtggccactg gggatttaaa gagctgccac 61 ttccttaggc ctccagaggg cactgggaag tcacagctgc tgagggacca ctctgctccc 121 ccgcctaagc catgcacctc tgtgggggca atgggctgct gacccagaca gaccccaagg 181 agcaacaaag gcagctgaag aagcagaaga accgggcagc cgcccagcga agccggcaga 241 agcacacaga caaggcagac gccctgcacc agcagcacga gtctctggaa aaagacaacc 301 tcgccctgcg gaaggagatc cagtccctgc aggccgagct ggcgtggtgg agccggaccc 361 tgcacgtgca tgagcgcctg tgccccatgg attgtgcctc ctgctcagct ccagggctcc 421 tgggctgctg ggaccaggct gaggggctcc tgggccctgg cccacaggga caacatggct 481 gccgggagca gctggagctg ttccagaccc cgggttcctg ttacccagct cagccgctct 541 ctccaggtcc acagcctcat gattctccca gcctcctcca gtgccccctg ccctcactgt 601 cccttggccc cgctgtggtt gctgaacctc ctgtccagct gtcccccagc cctctcctgt 661 ttgcctcgca cactggttcc agcctgcagg ggtcttcctc taagctcagt gccctccagc 721 ccagcctcac ggcccaaact gcccctccac agcccctcga gctggagcat cccaccagag 781 ggaagctggg gtcctctccc gacaaccctt cctctgccct ggggcttgca cgtctgcaga 841 gcagggagca caaacctgct ctctcagcag ccacttggca agggctggtt gtggatccca 901 gccctcaccc tctcctggcc tttcctctgc tctcctctgc tcaagtccac ttctaacctg 961 gtcttcggag ctgggttggc cccttctttg ggctcaggaa gcagccttag cacacgggcc 1021 tctcctccct cactactggg tgctgccctg cgtggctgac cagctggccc aggatttcac 1081 agtcgaaaag gaagccacca ctgatgcctc ccactgtgac aggccctgtc accaccaata 1141 tcttatttca acctcacagt tgacctgaga aatcgagatt atcactccac tttttcagac 1201 aaggaaactg aggctcaggg aagccaagtg acaagtccaa ggtcacgaag actttcttgg 1261 agcccgaaac accaccctct gctcctcctt ctcctgtcct ggcccaggca tcctaggggc 1321 tgaaatcctg gaaaccgtgg gctggtgtga gaaggtttgc atgctcagag cagagaaggg 1381 ctctccccac tgcttcgtga ttccagggcc agagccatgc agtcccagaa accccaacct 1441 agctggggca ggtccagagt ccaagccctg gtgggtagag gccaagcaga agccctgaag 1501 tggactcttg cttcccctag tagtgttttc agtgccaaga agctgaaact gtgagctgga 1561 gttggggaga ggtctggaag aggaccatct gggatttcta cagcctgggt acccatagcc 1621 acaccaaggc ttctgggaga ttctgcaggg tcagctttcc aggctgttcc caaatagctc 1681 cctgcctccc cactgcccct aaagccacag cagaagagcc attcatctca taaacaaaaa 1741 ggaagaggaa agaatgagga aggaccctgt gcaaggttat ttgcaggcag ggatgggctt 1801 gtacctgaca gcacccaccc ctgtgtggcc cccaggccct catcaccctc agacccctcc 1861 taagcagttc cctcattgct ctttggacta ggctgacagc aggaagagca gggcccatga 1921 ccgggtggaa gttcagtttt ggtgtctgct tcaagagggg gttttacact ctgattccag 1981 gacaagcact ctgaggcggg tgggggagag aaaccctggc tcttcaccca ggtttcacac 2041 acatgtaaat gaaacactat gttagtatct aacacactcc tggatacaga acacaagtct 2101 tggcacatat gtgatggaaa taaagtgttt tgcaatcttt aa
SEQ ID NO: 8 (ARNm BATF2Homo sapiens,variante de transcripción 2)
1 agcaagaaag aaggcgagag agaggagacc ggaggtctga gctgcagcca ctacacaggc 61 ctggaattct accacaggga atttggtggg tgcctctaaa gggctttaac ctgcaattaa 121 tgacatggtt gctgaatggc tcctgtgggc aagagaatag gtggtttggg ggacacacgg 181 gttggaggcc cgtgcatatc ccagcagcac gagtctctgg aaaaagacaa cctcgccctg 241 cggaaggaga tccagtccct gcaggccgag ctggcgtggt ggagccggac cctgcacgtg 301 catgagcgcc tgtgccccat ggattgtgcc tcctgctcag ctccagggct cctgggctgc 361 tgggaccagg ctgaggggct cctgggccct ggcccacagg gacaacatgg ctgccgggag 421 cagctggagc tgttccagac cccgggttcc tgttacccag ctcagccgct ctctccaggt 481 ccacagcctc atgattctcc cagcctcctc cagtgccccc tgccctcact gtcccttggc 541 cccgctgtgg ttgctgaacc tcctgtccag ctgtccccca gccctctcct gtttgcctcg 601 cacactggtt ccagcctgca ggggtcttcc tctaagctca gtgccctcca gcccagcctc 661 acggcccaaa ctgcccctcc acagcccctc gagctggagc atcccaccag agggaagctg 721 gggtcctctc ccgacaaccc ttcctctgcc ctggggcttg cacgtctgca gagcagggag 781 cacaaacctgctctctcagc agccacttgg caagggctgg ttgtggatcc cagccctcac 841 cctctcctggcctttcctct gctctcctct gctcaagtcc acttctaacc tggtcttcgg 901 agctgggttggccccttctt tgggctcagg aagcagcctt agcacacggg cctctcctcc 961 ctcactactgggtgctgccc tgcgtggctg accagctggc ccaggatttc acagtcgaaa 1021 aggaagccaccactgatgcc tcccactgtg acaggccctg tcaccaccaa tatcttattt 1081 caacctcacagttgacctga gaaatcgaga ttatcactcc actttttcag acaaggaaac 1141 tgaggctcagggaagccaag tgacaagtcc aaggtcacga agactttctt ggagcccgaa 1201 acaccaccctctgctcctcc ttctcctgtc ctggcccagg catcctaggg gctgaaatcc 1261 tggaaaccgtgggctggtgt gagaaggttt gcatgctcag agcagagaag ggctctcccc 1321 actgcttcgtgattccaggg ccagagccat gcagtcccag aaaccccaac ctagctgggg 1381 caggtccagagtccaagccc tggtgggtag aggccaagca gaagccctga agtggactct 1441 tgcttcccctagtagtgttt tcagtgccaa gaagctgaaa ctgtgagctg gagttgggga 1501 gaggtctggaagaggaccat ctgggatttc tacagcctgg gtacccatag ccacaccaag 1561 gcttctgggagattctgcag ggtcagcttt ccaggctgtt cccaaatagc tccctgcctc 1621 cccactgcccctaaagccac agcagaagag ccattcatct cataaacaaa aaggaagagg 1681 aaagaatgaggaaggaccct gtgcaaggtt atttgcaggc agggatgggc ttgtacctga 1741 cagcacccacccctgtgtgg cccccaggcc ctcatcaccc tcagacccct cctaagcagt 1801 tccctcattgctctttggac taggctgaca gcaggaagag cagggcccat gaccgggtgg 1861 aagttcagttttggtgtctg cttcaagagg gggttttaca ctctgattcc aggacaagca 1921 ctctgaggcgggtgggggag agaaaccctg gctcttcacc caggtttcac acacatgtaa 1981 atgaaacactatgttagtat ctaacacact cctggataca gaacacaagt cttggcacat 2041 atgtgatggaaataaagtgt tttgcaatct ttaa
SEQ ID NO: 9 (ARNm BATF2 Homo sapiens, variante de transcripción 3)
i agcaagaaag aaggcgagag agaggagacc ggaggtctga gctgcagcca ctacacaggc 61 ctggaattct accacaggga atttgcagca cgagtctctg gaaaaagaca acctcgccct 121 gcggaaggag atccagtccc tgcaggccga gctggcgtgg tggagccgga ccctgcacgt 181 gcatgagcgc ctgtgcccca tggattgtgc ctcctgctca gctccagggc tcctgggctg 241 ctgggaccag gctgaggggc tcctgggccc tggcccacag ggacaacatg gctgccggga 301 gcagctggag ctgttccaga ccccgggttc ctgttaccca gctcagccgc tctctccagg 361 tccacagcct catgattctc ccagcctcct ccagtgcccc ctgccctcac tgtcccttgg 421 ccccgctgtg gttgctgaac ctcctgtcca gctgtccccc agccctctcc tgtttgcctc 481 gcacactggt tccagcctgc aggggtcttc ctctaagctc agtgccctcc agcccagcct 541 cacggcccaa actgcccctc cacagcccct cgagctggag catcccacca gagggaagct 601 ggggtcctct cccgacaacc cttcctctgc cctggggctt gcacgtctgc agagcaggga 661 gcacaaacct gctctctcag cagccacttg gcaagggctg gttgtggatc ccagccctca 721 ccctctcctg gcctttcctc tgctctcctc tgctcaagtc cacttctaac ctggtcttcg 781 gagctgggtt ggccccttct ttgggctcag gaagcagcct tagcacacgg gcctctcctc 841 cctcactact gggtgctgcc ctgcgtggct gaccagctgg cccaggattt cacagtcgaa 901 aaggaagcca ccactgatgc ctcccactgt gacaggccct gtcaccacca atatcttatt 961 tcaacctcac agttgacctg agaaatcgag attatcactc cactttttca gacaaggaaa 1021 ctgaggctca gggaagccaa gtgacaagtc caaggtcacg aagactttct tggagcccga 1081 aacaccaccc tctgctcctc cttctcctgt cctggcccag gcatcctagg ggctgaaatc 1141 ctggaaaccg tgggctggtg tgagaaggtt tgcatgctca gagcagagaa gggctctccc 1201 cactgcttcg tgattccagg gccagagcca tgcagtccca gaaaccccaa cctagctggg 1261 gcaggtccag agtccaagcc ctggtgggta gaggccaagc agaagccctg aagtggactc 1321 ttgcttcccc tagtagtgtt ttcagtgcca agaagctgaa actgtgagct ggagttgggg 1381 agaggtctgg aagaggacca tctgggattt ctacagcctg ggtacccata gccacaccaa 1441 ggcttctggg agattctgca gggtcagctt tccaggctgt tcccaaatag ctccctgcct 1501 ccccactgcc cctaaagcca cagcagaaga gccattcatc tcataaacaa aaaggaagag 1561 gaaagaatga ggaaggaccc tgtgcaaggt tatttgcagg cagggatggg cttgtacctg 1621 acagcaccca cccctgtgtg gcccccaggc cctcatcacc ctcagacccc tcctaagcag 1681 ttccctcatt gctctttgga ctaggctgac agcaggaaga gcagggccca tgaccgggtg 1741 gaagttcagt tttggtgtct gcttcaagag ggggttttac actctgattc caggacaagc 1801 actctgaggc gggtggggga gagaaaccct ggctcttcac ccaggtttca cacacatgta 1861 aatgaaacac tatgttagta tctaacacac tcctggatac agaacacaag tcttggcaca 1921 tatgtgatgg aaataaagtg ttttgcaatc tttaa
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Claims (13)
1. Un método para determinar la presencia o ausencia de tuberculosis activa en un sujeto, el método comprende los pasos de:
determinar un nivel de un biomarcador que consiste en el factor de transcripción con cremallera de leucina básico tipo ATF 2 (BATF2) en una muestra obtenida de este sujeto,
y comparar el nivel de BATF2 en la muestra con un valor de referencia,
en donde la muestra es una muestra de sangre; y
en donde el nivel de BATF2 en la muestra en comparación con el valor de referencia es indicativo de la presencia o ausencia de tuberculosis activa, en donde un nivel aumentado de BATF2 en una muestra en comparación con el valor de referencia es indicativo de la presencia de tuberculosis activa, en donde el valor de referencia se deriva de uno o más de un sujeto:
(a) sin exposición previa a la tuberculosis;
(b) que tiene una infección de tuberculosis latente (LTBI);
(c) que se ha recuperado de la tuberculosis; o
(d) que no padece enfermedad alguna;
y opcionalmente determinar la presencia o ausencia deMycobacterium tuberculosisen una muestra usando una técnica microbiológica.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la tuberculosis activa es tuberculosis pulmonar o tuberculosis extrapulmonar.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde el valor de referencia es de un sujeto que es VIH negativo.
4. El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el nivel de biomarcador BATF2 en la muestra de prueba difiere en al menos 2 veces, por ejemplo, al menos 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 8 veces o 10 veces en comparación con el valor de referencia.
5. El método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que comprende determinar el nivel de ARNm o proteína de BATF2, preferentemente en donde el nivel de ARNm se determina mediante RT-PCR, qPCR, microarreglo o secuenciación de ARN,
6. El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la muestra es una muestra de sangre periférica.
7. El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el valor de referencia es un intervalo de valores.
8. El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde un cambio en el nivel de BATF2 en la muestra es predictivo del inicio de tuberculosis activa.
9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el nivel de BATF2 en la muestra en comparación con un valor de referencia es indicativo de la ausencia de tuberculosis activa y/o terapia exitosa con un agente antituberculoso, preferiblemente en donde la muestra y el valor de referencia se derivan del mismo sujeto.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en donde el paso de determinar un nivel de BATF2 se lleva a cabo:
(a) antes del inicio de la tuberculosis activa en el sujeto; y/o
(b) mientras el sujeto muestra síntomas de tuberculosis activa; y/o
(c) durante y/o después del uso de un agente antituberculoso para tratar la tuberculosis activa.
11. Una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente antituberculoso para uso en el tratamiento de la tuberculosis activa en un sujeto identificado como que requiere tratamiento de tuberculosis activa mediante el método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, preferentemente en donde el agente antituberculoso es uno o más seleccionados del grupo que consiste en: un antibiótico, un corticosteroide, un agente quimioterapéutico y un inhibidor de TNF, más preferentemente en donde el antibiótico es uno o más seleccionados del grupo que consiste en: isoniazida, rifampicina, pirazinamida y etambutol.
12. Un método para determinar si un sujeto será susceptible al tratamiento con un agente antituberculoso, este método comprende el paso de determinar un nivel de un biomarcador que consiste en BATF2 en una muestra obtenida del sujeto; en donde la muestra es una muestra de sangre; y
en donde el nivel de BATF2 en la muestra en comparación con un valor de referencia es indicativo de la susceptibilidad del sujeto al tratamiento con un agente antituberculoso, en donde un nivel aumentado de BATF2 en comparación con el valor de referencia es indicativo de la presencia de tuberculosis activa, en donde el valor de referencia se deriva de uno o más de un sujeto:
(a) sin exposición previa a la tuberculosis;
(b) que tiene una infección de tuberculosis latente (LTBI);
(c) que se ha recuperado de la tuberculosis; o
(d) que no padece enfermedad alguna.
13. Uso de un kit para determinar la presencia o ausencia de tuberculosis activa en un sujeto, en donde el kit comprende uno o más pares de cebadores o sondas capaces de determinar un nivel de un biomarcador que consiste en BATF2 en una muestra obtenida de este sujeto,
en donde la muestra es una muestra de sangre; y
en donde un nivel aumentado de BATF2 en comparación con un valor de referencia es indicativo de la presencia de tuberculosis activa, en donde el valor de referencia se deriva de uno o más de un sujeto:
(a) sin exposición previa a la tuberculosis;
(b) que tiene una infección de tuberculosis latente (LTBI);
(c) que se ha recuperado de la tuberculosis; o
(d) que no padece enfermedad alguna;
en donde el kit comprende opcionalmente un conjunto de instrucciones,
preferiblemente en donde el uno o más pares de cebadores o sondas están inmovilizados en un soporte sólido, y/o preferentemente, que comprende además un dispositivo de análisis para determinar el nivel de BATF2 en la muestra utilizando los pares de cebadores o sondas, y/o
preferiblemente, que comprende además un medio de almacenamiento que almacena un programa para controlar un aparato de procesamiento de datos para clasificar al sujeto con base en el nivel de BATF2 determinado en la muestra utilizando los pares de cebadores o sondas, y/o
preferiblemente en donde el programa comprende instrucciones para controlar el aparato de procesamiento de datos para proporcionar una indicación de riesgo para el sujeto del cual se obtiene la muestra.
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