ES2827241T3 - Estado de metilación del ADN como un biomarcador del consumo y la abstinencia del alcohol - Google Patents

Abstract

Un método in vitro para determinar si un individuo consume alcohol o no, que comprende las etapas de: determinar el estado de metilación de al menos un dinucleótido CpG en una muestra biológica procedente de un individuo, en el que el al menos un dinucleótido CpG comprende al menos la posición 71389896 del cromosoma 10; y correlacionar el estado de metilación del al menos un dinucleótido CpG para determinar si el individuo consume alcohol o no.

Description

DESCRIPCIÓN

Estado de metilación del ADN como un biomarcador del consumo y la abstinencia del alcohol

Antecedentes

El alcoholismo tiene un profundo impacto socioeconómico y personal sobre decenas de millones de individuos en todo el mundo. Desgraciadamente, la capacidad para realizar el diagnóstico a menudo está dificultada por la dependencia de la autoevaluación, mientras que la capacidad para controlar la respuesta al tratamiento tiene el desafío de la ausencia de biomarcadores robustos y fiables.

Robert A. Philibert y cols. describen en Frontiers in Genetics, vol. 3, 1 de enero de 2012, el impacto del consumo reciente de alcohol sobre distintivos de metilación de ADN del genoma completo.

Yunlong Liu y cols. describen en Epigentics, vol. 4, n° 7, 1 de octubre de 2009, en las páginas 500-511, que la exposición al alcohol altera los perfiles de metilación de ADN en embriones de ratón en la neurulación temprana.

Huiping Zhang y cols. describen en Alcoholism: Clinical and Experimental Reasearch, vol. 37, 24 de agosto de 2012, en las páginas E108-E115, un perfilado seriado de cambios de metilación de ADN asociados con la dependencia del alcohol.

Sumario

La presente invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas. Las reivindicaciones dependientes representan otras realizaciones de la invención.

Esta divulgación proporciona métodos y materiales que se pueden usar para determinar si un individuo está consumiendo alcohol o no, y también para determinar si el individuo ha dejado de consumir alcohol o no.

En un aspecto, se proporciona un método para determinar si un individuo consume alcohol. Típicamente, este método incluye determinar el estado de metilación de al menos un dinucleótido CpG en una muestra biológica del individuo; y correlacionar el estado de metilación del al menos un dinucleótido CpG para determinar si el individuo consume alcohol o no.

En algunas realizaciones, el al menos un dinucleótido CpG comprende la posición 71389896 del cromosoma 10. Por ejemplo, la desmetilación en la posición 71389896 del cromosoma 10 es indicativa de un consumo de alcohol previo o actual; y la remetilación en la posición 71389896 del cromosoma 10 es indicativa de un consumo menor o nulo de alcohol (p. ej., abstinencia).

En algunas realizaciones, el al menos un dinucleótido CpG comprende la posición 54677008 del cromosoma 12. Por ejemplo, la desmetilación en la posición 54677008 del cromosoma 12 es indicativa de un consumo de alcohol previo o actual; y la remetilación en la posición 54677008 del cromosoma 12 es indicativa de un consumo menor o nulo de alcohol (p. ej., abstinencia).

En algunas realizaciones, el al menos un dinucleótido CpG comprende la posición 75262522 del cromosoma 8. Por ejemplo, la desmetilación en la posición 75262522 del cromosoma 8 es indicativa de un consumo de alcohol previo o actual; y la remetilación en la posición 75262522 del cromosoma 8 es indicativa de un consumo menor o nulo de alcohol (p. ej., abstinencia).

En algunas realizaciones, el al menos un dinucleótido CpG comprende la posición 92137791 del cromosoma 9. Por ejemplo, la desmetilación en la posición 92137791 del cromosoma 9 es indicativa de un consumo de alcohol previo o actual; y la remetilación en la posición 92137791 del cromosoma 9 es indicativa de un consumo menor o nulo de alcohol (p. ej., abstinencia).

En algunas realizaciones, la etapa de determinación incluye poner en contacto ADN de la muestra biológica con bisulfito bajo condiciones alcalinas para producir ADN tratado con bisulfito; opcionalmente, amplificar el ADN tratado con bisulfito para producir ADN tratado con bisulfito amplificado; poner en contacto el ADN tratado con bisulfito o el ADN tratado con bisulfito amplificado con al menos un oligonucleótido que sea complementario con una secuencia que comprende el al menos un dinucleótido CpG; y detectar el estado de metilación del al menos un dinucleótido CpG.

En algunas realizaciones, el al menos un oligonucleótido detecta el dinucleótido CpG en el ADN tratado con bisulfito en estado desmetilado. En algunas realizaciones, el al menos un oligonucleótido detecta el dinucleótido CpG en el ADN tratado con bisulfito en estado metilado. Muestras biológicas representativas incluyen, sin limitación, sangre periférica, linfocitos, orina, saliva y células bucales. En algunas realizaciones, el estado de metilación del al menos un dinucleótido CpG se determina usando ADN tratado con bisulfito. En algunas realizaciones, este método incluye además obtener datos de autoevaluación del individuo con respecto a si el individuo es consumidor de alcohol o no.

En otro aspecto, se proporciona un método informatizado para determinar si un individuo consume alcohol. Típicamente, este método incluye obtener datos medidos asociados con el consumidor, comprendiendo los datos medidos uno o más estados de metilación de CpG medidos; generar una puntuación predictiva basada en los datos medidos obtenidos; y proporcionar una probabilidad de consumo de alcohol por el consumidor basándose en la puntuación predictiva.

En algunas realizaciones, este método incluye además determinar el estado de metilación de CpG para el consumidor, en donde un cambio en el estado de metilación es un indicador de consumo de alcohol. En algunas realizaciones, este método incluye además proporcionar un nivel predicho de consumo de alcohol basándose en la puntuación predictiva.

En un aspecto, se proporciona un estuche para determinar el estado de metilación de al menos un dinucleótido CpG. Típicamente, este estuche incluye al menos un primer cebador de ácido nucleico de al menos 8 nucleótidos de longitud que es complementario a una secuencia de ácido nucleico convertida con bisulfito que incluye al menos un dinucleótido CpG, donde el al menos un primer cebador de ácido nucleico detecta el dinucleótido CpG metilado. En algunas realizaciones, el estuche incluye además al menos un segundo cebador de ácido nucleico de al menos 8 nucleótidos de longitud que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico convertida con bisulfito que incluye el al menos un dinucleótido CpG, donde el al menos un segundo cebador de ácido nucleico detecta el dinucleótido CpG desmetilado.

En algunas realizaciones, el primer cebador de ácido nucleico es complementario a una secuencia convertida con bisulfito que incluye un dinucleótido CpG metilado en la posición 71389896 del cromosoma 10. En algunas realizaciones, el primer cebador de ácido nucleico es complementario a una secuencia convertida con bisulfito que incluye un dinucleótido CpG desmetilado en la posición 71389896 del cromosoma 10. En algunas realizaciones, el primer cebador de ácido nucleico es complementario a una secuencia convertida con bisulfito que incluye un dinucleótido CpG metilado en la posición 54677008 del cromosoma 12. En algunas realizaciones, el primer cebador de ácido nucleico es complementario a una secuencia convertida con bisulfito que incluye un dinucleótido CpG desmetilado en la posición 54677008 del cromosoma 12. En algunas realizaciones, el primer cebador de ácido nucleico es complementario a una secuencia convertida con bisulfito que incluye un dinucleótido CpG metilado en la posición 75262522 del cromosoma 8. En algunas realizaciones, el primer cebador de ácido nucleico es complementario a una secuencia convertida con bisulfito que incluye un dinucleótido CpG desmetilado en la posición 75262522 del cromosoma 8. En algunas realizaciones, el primer cebador de ácido nucleico es complementario a una secuencia convertida con bisulfito que incluye un dinucleótido CpG metilado en la posición 92137791 del cromosoma 9. En algunas realizaciones, el primer cebador de ácido nucleico es complementario a una secuencia convertida con bisulfito que incluye un dinucleótido CpG desmetilado en la posición 92137791 del cromosoma 9.

En algunas realizaciones, un estuche como el descrito en la presente puede incluir al menos un tercer cebador de ácido nucleico de al menos 8 nucleótidos de longitud que es complementario a una secuencia de ácido nucleico aguas arriba del dinucleótido CpG. En algunas realizaciones, un estuche como el descrito en la presente puede incluir al menos un cuarto cebador de ácido nucleico de al menos 8 nucleótidos de longitud que es complementario a una secuencia de ácido nucleico aguas abajo del dinucleótido CpG. En algunas realizaciones, el al menos un tercer cebador de ácido nucleico es complementario a una secuencia de ácido nucleico convertida con bisulfito. En algunas realizaciones, el al menos un cuarto cebador de ácido nucleico es complementario a una secuencia de ácido nucleico convertida con bisulfito.

En algunas realizaciones, el al menos un primer cebador de ácido nucleico, el al menos un segundo cebador de ácido nucleico, el al menos un tercer cebador de ácido nucleico y/o el al menos un cuarto cebador de ácido nucleico incluye uno o más análogos nucleotídicos. En algunas realizaciones, el al menos un primer cebador de ácido nucleico, el al menos un segundo cebador de ácido nucleico, el al menos un tercer cebador de ácido nucleico y/o el al menos un cuarto cebador de ácido nucleico incluye uno o más nucleótidos sintéticos o artificiales.

En algunas realizaciones, el estuche incluye además un sustrato sólido al que está unido el al menos un primer cebador de ácido nucleico. Sustratos sólidos representativos incluyen, sin limitación, polímeros, vidrio, semiconductores, papeles, metales, geles y/o hidrogeles. En algunas realizaciones, el sustrato sólido es una tarjeta micromatricial o microfluídica. En algunas realizaciones, el estuche incluye además un marcador detectable. En algunas realizaciones, este estuche incluye además instrucciones para correlacionar un cambio en el estado de metilación en una o más posiciones del CpG con el consumo de alcohol.

A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que es entendido comúnmente por un experto normal en la especialidad a la que pertenecen los métodos y las composiciones de interés. Aunque métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria se pueden usar en la práctica o las pruebas de los métodos y las composiciones de interés, se describen posteriormente métodos y materiales adecuados. Además, los materiales, los métodos y los ejemplos son solamente ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

Descripción de los dibujos

La Figura 1 es una gráfica que muestra representaciones cuantil-cuantil (QQ) de la comparación entre el estado de metilación de ADN de los 32 sujetos del caso (en el momento T1) y el estado de metilación de ADN de los 33 controles abstemios.

La Figura 2 es una gráfica que muestras representaciones QQ de la comparación entre el estado de metilación de ADN de 25 sujetos del caso en el momento T1 y el estado de metilación de ADN de los mismos 25 sujetos del caso en el momento T2.

Descripción detallada

Usando un enfoque de genoma completo, esta divulgación muestra que, en comparación con controles abstemios, el consumo de alcohol está asociado con cambios amplios en la metilación de ADN. Esta divulgación también muestra que los cambios en la metilación de ADN tienen una tendencia a invertirse como una función de la abstinencia. Así, la metilación de ADN se puede usar clínicamente para determinar el estado de consumo de alcohol y/o para comprobar la respuesta al tratamiento del alcoholismo.

Metilación de Ácidos Nucleicos y Determinación del Estado de Metilación de Ácidos Nucleicos

Las islas de CpG son tramos de ADN en los que la frecuencia de la secuencia de CpG es superior que otras regiones. La "p" en el término CpG indica el enlace fosfodiéster que une el nucleótido cisteína ("C") y el nucleótido guanina ("G"). A menudo, las islas de CpG están situadas alrededor de promotores y a menudo están implicadas en la regulación de la expresión de un gen (p. ej., genes constitutivos). Generalmente, las islas de CpG no se metilan cuando se expresa una secuencia, y se metilan para suprimir la expresión (o "inactivar" el gen).

El estado de metilación de uno o más dinucleótidos CpG en ADN genómico o en una secuencia de ácido nucleico particular (p. ej., una isla de CpG) se puede determinar usando cualquier número de muestras biológicas, tales como sangre, orina (p. ej., células de la vejiga urinaria y/o la uretra contenidas en la orina), saliva o células bucales. En ciertas realizaciones, se puede obtener (p. ej., de una muestra de sangre) un tipo de célula particular, p. ej., linfocitos, basófilos o monocitos, y el ADN se puede evaluar con respecto a su estado de metilación.

El estado de metilación del ADN genómico, de una isla de CpG, o de uno o más dinucleótidos CpG específicos puede ser determinado por el experto usando cualquier número de métodos. El método más común para evaluar el estado de metilación de ADN comienza con una reacción basada en bisulfito sobre el ADN (véase, por ejemplo, Frommer y cols., 1992, PNAS USA, 89(5):1827-31). Están disponibles estuches comerciales para la modificación con bisulfito de ADN. Véanse, por ejemplo, los estuches EpiTect Bisulfite o EpiTect Plus Bisulfite (Qiagen).

Después de la modificación con bisulfito, el ácido nucleico se puede amplificar. Puesto que el tratamiento del ADN con bisulfito desamina nucleótidos de citosina desmetilados hasta uracilo, y puesto que el uracilo se aparea con adenosina, se incorporan timidinas en cadenas de ADN en las posiciones de nucleótidos de citosina desmetilados durante las posteriores amplificaciones por PCR.

En algunas realizaciones, el estado de metilación del ADN se pude determinar usando uno o más métodos basados en ácidos nucleicos. Por ejemplo, un producto de amplificación de ADN tratado con bisulfito se puede clonar y secuenciar directamente usando técnicas de biología molecular recombinantes habituales en la especialidad. Están disponibles programas de software para ayudar a determinar la secuencia original, que incluye el estado de metilación de uno o más nucleótidos, de un ADN tratado con bisulfito (p. ej., CpG Viewer (Carr y cols., 2007, Nucl. Acids Res., 35:e79)). Además, por ejemplo, los productos de amplificación de ADN tratado con bisulfito se pueden hibridar con uno o más oligonucleótidos que, por ejemplo, son específicos para la secuencia de ADN tratada con bisulfito metilada o específicos para la secuencia de ADN tratada con bisulfito desmetilada.

En algunas realizaciones, el estado de metilación del ADN se puede determinar usando un método no basado en ácidos nucleicos. Un método no basado en ácidos nucleicos representativo se basa en una escisión específica de la secuencia de ADN tratada con bisulfito seguido por espectrometría de masas (p. ej., MALDI-TOF MS) para determinar la relación de metilación (metil-CpG/CpG total) (véase, por ejemplo, Ehrich y cols., 2005, PNAS USA, 102:15785-90). Este método está disponible comercialmente (p. ej., MassARRAY Quantitative Methylation Analysis (Sequenom, San Diego, CA)).

Secuencias de Ácido Nucleico en las que el Estado de Metilación está Asociado al Consumo de Alcohol

Se ha observado que el estado de metilación de cierto ADN genómico está alterado en individuos que consumen alcohol (con relación a los no consumidores). Véanse, por ejemplo, Philibert y cols. (2008, Am. J. Med. Genet. B Neuropsychiatr. Genet., 147B:565-70); Philibert y cois. (2008, Am. J. Med. Genet. B Neuropsychiatr. Genet., 147B:543-9); Philibert y cois. (2009, Psychiatr. Genet., 19:91-8); Philibert y cois. (2012, Front Genet., 3:54); y también en la Patente de EE. UU. N28.637.652.

La presente divulgación describe cambios adicionales en el estado de metilación de una o más islas de CpG y/o dinucleótidos CpG particulares que se correlacionan con el consumo de alcohol (p. ej., consumo de alcohol intensivo). Véase, por ejemplo, la Tabla II, que muestra las 30 sondas principales que estaban asociadas más significativamente con cambios en el estado de metilación de consumidores de alcohol en comparación con no bebedores; y la Tabla III, que muestra las 30 rutas génicas reguladas diferencialmente entre consumidores de alcohol y no bebedores. Uno cualquiera de los dinucleótidos CpG en los que el estado de metilación se ha asociado al consumo de alcohol se puede usar en los métodos de la presente para determinar el valor predictivo (p. ej., representando la probabilidad de consumo de alcohol). Se entenderá que, particularmente para determinar el consumo de alcohol, cuantos más dinucleótidos CpG (es decir, dinucleótidos CpG en los que el estado de metilación se ha asociado con el consumo de alcohol) se evalúen, más exacto será el valor predictivo.

Además, se apreciará que el estado de metilación de uno o más dinucleótidos CpG vecinos puede estar en desequilibrio de conexión con el estado de metilación de un dinucleótido CpG que tiene significación con el consumo de alcohol (véanse, por ejemplo, Philibert y cols., 2009, Am. J. Med. Genet. B. Neuropsychiatr. Genet., 153B:619-28) y, por lo tanto, el estado de metilación de los dinucleótidos CpG vecinos (p. ej., aproximadamente 200 nucleótidos aguas arriba y/o aguas abajo de un dinucleótido CpG que tiene significación con el consumo de alcohol (p. ej., aproximadamente 100 nucleótidos aguas arriba y/o aguas abajo; aproximadamente 50 nucleótidos aguas arriba y/o aguas abajo; aproximadamente 25 nucleótidos aguas arriba y/o aguas abajo; aproximadamente 20 nucleótidos aguas arriba y/o aguas abajo; aproximadamente 10 nucleótidos aguas arriba y/o aguas abajo; o aproximadamente 5 nucleótidos aguas arriba y/o aguas abajo)) se puede usar en los métodos descritos en la presente. Además, se apreciará que, en algunos casos, cuanto mayores (o más significativos) sean los cambios en el estado de metilación, mayor será el consumo de alcohol. Véase, por ejemplo, Philibert y cols., 2012, Epigenetics, 7:1-8.

Ácidos nucleicos y Métodos Relacionados con los Mismos

Según se usa en la presente, ácidos nucleicos puede incluir ADN y ARN, e incluye ácidos nucleicos que contienen uno o más análogos nucleotídicos o modificaciones en el esqueleto. Un ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario, lo que habitualmente depende de su uso pretendido.

Según se usa en la presente, una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que está libre de secuencias que flanquean naturalmente uno o ambos extremos del ácido nucleico en el genoma del organismo del que se deriva la molécula de ácido nucleico aislada (p. ej., un fragmento de ADNc o ADN genómico producido mediante PCR o digestión con endonucleasas de restricción). Esta molécula de ácido nucleico aislada se introduce generalmente en un vector (p. ej., un vector de clonación o un vector de expresión) por comodidad de manipulación o para generar una molécula de ácido nucleico fusionada, analizado con más detalle posteriormente. Además, una molécula de ácido nucleico aislada puede incluir una molécula de ácido nucleico manipulada tal como una molécula de ácido nucleico recombinante o sintética.

Los ácidos nucleicos se pueden aislar usando técnicas habituales en la especialidad. Por ejemplo, los ácidos nucleicos se pueden aislar usando cualquier método incluyendo, sin limitación, tecnología de ácidos nucleicos recombinantes y/o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Técnicas de PCR generales se describen, por ejemplo en PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. Técnicas de ácidos nucleicos recombinantes incluyen, por ejemplo, digestión con enzimas de restricción y ligación, que se pueden usar para aislar un ácido nucleico. Los ácidos nucleicos aislados también se pueden sintetizar químicamente, bien como una sola molécula de ácido nucleico o bien como una serie de oligonucleótidos.

También se proporciona un vector que contiene un ácido nucleico (p. ej., un ácido nucleico que codifica un polipéptido). Los vectores, incluyendo vectores de expresión, están disponibles comercialmente o se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante habituales en la especialidad. Un vector que contiene un ácido nucleico puede tener elementos de expresión conectados operativamente a este ácido nucleico, y además puede incluir secuencias tales como las que codifican un marcador seleccionable (p. ej., un gen de resistencia a antibióticos). Un vector que contiene un ácido nucleico puede codificar un polipéptido quimérico o de fusión (es decir, un polipéptido conectado operativamente a un polipéptido heterólogo, que puede estar tanto en el extremo N como en el extremo C del polipéptido). Polipéptidos heterólogos representativos son los que se pueden usar en la purificación del polipéptido codificado (p. ej., etiqueta 6xHis, glutationa S-transferasa (GST))

Elementos de expresión incluyen secuencias de ácido nucleico que dirigen y regulan la expresión de secuencias codificantes de ácido nucleico. Un ejemplo de un elemento de expresión es una secuencia promotora. Los elementos de expresión también pueden incluir intrones, secuencias potenciadoras, elementos de respuesta o elementos inducibles que modulan la expresión de un ácido nucleico. Los elementos de expresión pueden ser de origen bacteriano, de levadura, de insecto, de mamífero o viral, y los vectores pueden contener una combinación de elementos de diferentes orígenes. Según se usa en la presente, conectado operativamente significa que un promotor u otro elemento o elementos de expresión están situados en un vector con relación a un ácido nucleico de tal modo que dirija o regule la expresión del ácido nucleico (p. ej., en el marco). Muchos métodos para introducir ácidos nucleicos en células hospedadoras, tanto in vivo como in vitro, son muy conocidos por los expertos en la especialidad e incluyen, sin limitación, electroporación, precipitación con fosfato cálcico, transformación con polietilenglicol (PEG), choque térmico, lipofección, microinyección y transferencia de ácidos nucleicos mediada viralmente.

Los vectores que se describen en la presente se pueden introducir en una célula hospedadora. Según se usa en la presente, "célula hospedadora" se refiere a la célula particular en la que se introduce el ácido nucleico y también incluye la descendencia o la descendencia potencial de esta célula. Una célula hospedadora puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, los ácidos nucleicos se pueden expresar en células bacterianas tales como E. coli, o en células de insecto, células de levadura o mamífero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS). Otras células hospedadoras adecuadas son conocidas por los expertos en la especialidad.

Oligonucleótidos para amplificación o hibridación se pueden diseñar usando, por ejemplo, un programa informático tal como OLIGO (Molecular Biology Insights, Inc., Cascade, CO). Características importantes cuando se diseñan oligonucleótidos que se van a usar como cebadores de amplificación incluyen, pero no se limitan a, un producto de amplificación de tamaño apropiado para facilitar la detección (p. ej., mediante electroforesis), temperaturas de fusión similares para los miembros de un par de cebadores y la longitud de cada cebador (es decir, los cebadores necesitan ser suficientemente largos para renaturalizarse con especificidad de secuencia y para iniciar la síntesis pero no tan largos que se reduzca la fidelidad durante la síntesis de oligonucleótidos). Típicamente, los cebadores oligonucleotídicos tienen una longitud de 15 a 30 (p. ej., 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24 o 25) nucleótidos. El diseño de oligonucleótidos para ser usados como sondas de hibridación se puede realizar de un modo similar al diseño de cebadores de amplificación. En algunas realizaciones, las sondas de hibridación se pueden diseñar para distinguir entre dos dianas que contienen diferentes secuencias (p. ej., un polimorfismo o una mutación, p. ej., la secuencia metilada frente a la desmetilada en el ADN tratado con bisulfito).

La hibridación entre ácidos nucleicos se analiza con detalle en Sambrook y cols. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Secciones 7.37-7.57, 9.47­ 9.57, 11.7-11.8 y 11.45-11.57). Sambrook y cols. divulga condiciones de transferencia Southern adecuadas para sondas oligonucleotídicas de menos de aproximadamente 100 nucleótidos (Secciones 11.45-11.46). La Tm entre una secuencia que tiene menos de 100 nucleótidos de longitud y una segunda secuencia se puede calcular usando la fórmula proporcionada en la Sección 11.46. Sambrook y cols. divulga adicionalmente condiciones de transferencia Southern para sondas oligonucleotídicas mayores de aproximadamente 100 nucleótidos (véanse las Secciones 9.47­ 9.54). La Tm entre una secuencia de más de 100 nucleótidos de longitud y una segunda secuencia se puede calcular usando la fórmula proporcionada en las Secciones 9.50-9.51 de Sambrook y cols.

Las condiciones bajo las que las membranas que contienen ácidos nucleicos se prehibridan e hibridan, así como las condiciones bajo las que las membranas que contienen ácidos nucleicos se lavan para retirar sonda en exceso y unida inespecíficamente, pueden representar un papel significativo en la restricción de la hibridación. Estas hibridaciones y lavados se pueden realizar, cuando sea apropiado, bajo condiciones de restricción moderada o alta. Por ejemplo, las condiciones de lavado se pueden hacer más restrictivas al disminuir la concentración de sal en las soluciones de lavado y/o al incrementar la temperatura a la que se realizan los lavados. Simplemente a modo de ejemplo, condiciones de alta restricción incluyen típicamente un lavado de las membranas en 0,2X SSC a 65°C.

Además, la interpretación de la cantidad de hibridación puede verse afectada, por ejemplo, por la actividad específica de la sonda oligonucleotídica marcada, por el número de sitios de unión a la sonda sobre el ácido nucleico de plantilla al que se ha hibridado la sonda, y por la cantidad de exposición de una autorradiografía u otro medio de detección. Se apreciará fácilmente por los expertos normales en la especialidad que aunque se pueda usar cualquier número de condiciones de hibridación y lavado para examinar la hibridación de una molécula de ácido nucleico de sonda a ácidos nucleicos diana inmovilizados, es más importante examinar la hibridación de una sonda a ácidos nucleicos diana bajo condiciones idénticas de hibridación, lavado y exposición. Preferiblemente, los ácidos nucleicos diana están sobre la misma membrana.

Se considera que una molécula de ácido nucleico se hibrida a un ácido nucleico pero no a otro ácido nucleico si la hibridación a un ácido nucleico es al menos 5 veces (p. ej., al menos 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces o 100 veces) mayor que la hibridación a otro ácido nucleico. La cantidad de hibridación se puede cuantificar directamente a una membrana o desde un autorradiógrafo usando, por ejemplo, un PhosphorImager o un Densitometer (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).

Una secuencia de ácido nucleico, o una secuencia a polipeptídica, se puede comparar con una o más secuencias de ácido nucleico o secuencias polipeptídicas relacionadas, respectivamente, usando el porcentaje de identidad de secuencia. Al calcular el porcentaje de identidad de secuencia, se alinean dos secuencias y se determina el número de coincidencias idénticas de nucleótidos o residuos de aminoácido entre las dos secuencias. El número de coincidencias idénticas se divide por la longitud de la región alineada (es decir, el número de nucleótidos o residuos de aminoácido alineados) y se multiplica por 100 para llegar a un valor del porcentaje de identidad de secuencia. Se apreciará que la longitud de la región alineada puede ser una porción de una o ambas secuencias hasta el tamaño de la longitud completa de la secuencia más corta. También se apreciará que una sola secuencia se puede alinear con más de otra secuencia y, de ahí, puede tener diferentes valores del porcentaje de identidad de secuencia a lo largo de cada región alineada.

El alineamiento de dos o más secuencias para determinar el porcentaje de identidad de secuencia se puede realizar usando el programa informático ClustalW y los parámetros por defecto, que permite que los alineamientos de secuencias de ácido nucleico o polipeptídicas se lleven a cabo a través de toda su longitud (alineamiento global). Chenna y cols., 2003, Nucleic acids Res., 31 (13):3497-500. ClustalW calcula la mejor coincidencia entre una secuencia interrogante y una o más secuencias de referencia, y las alinea de modo que se puedan determinar identidades, similitudes y diferencias. Huecos de uno o más residuos se pueden insertar en una secuencia interrogante, una secuencia de referencia o ambas, para maximizar los alineamientos de secuencias. Para el alineamiento por pares de secuencias de ácido nucleico, se pueden usar los parámetros por defecto (es decir, tamaño de palabra: 2; tamaño de ventana: 4; método de puntuación: porcentaje; número de diagonales superiores: 4; y penalización por hueco: 5); para un alineamiento de múltiples secuencias de ácido nucleico, se pueden usar los siguientes parámetros: penalización por apertura de hueco: 10,0; penalización por extensión del hueco: 5,0; y transiciones de peso: sí. Para el alineamiento por pares rápido de secuencias polipeptídicas, se pueden usar los siguientes parámetros: tamaño de palabra: 1; tamaño de ventana: 5; método de puntuación: porcentaje; número de diagonales superiores: 5; y penalización por hueco: 3. Para el alineamiento múltiple de secuencias polipeptídicas, se pueden usar los siguientes parámetros: matriz de peso: blosum; penalización por apertura de hueco: 10,0; penalización por extensión de hueco: 0,05; huecos hidrófilos: activos; residuos hidrófilos: Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gln, Glu, Arg y Lys; y penalizaciones por hueco específicas del residuo: activas. ClustalW se puede ejecutar, por ejemplo, en el cibersitio del Baylor College of Medicine Search Launcher o en el cibersitio de the European Bioinformatics Institute o en Internet.

Se pueden introducir cambios en las secuencias codificantes de ácido nucleico usando, por ejemplo, mutagénesis (p. ej., mutagénesis dirigida localmente, mutagénesis mediada por PCR) o al sintetizar químicamente una molécula de ácido nucleico que tiene estos cambios. Estos cambios de ácidos nucleicos pueden conducir a sustituciones de aminoácidos conservativas y/o no conservativas en uno o más residuos de aminoácido. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es una en la que un residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido diferente que tiene una cadena lateral similar (véase, por ejemplo, Dayhoff y cols. (1978, en Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(Supl. 3):345-352), que proporciona tablas de frecuencia para sustituciones de aminoácidos) y una sustitución no conservativa es una en la que un residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que no tenga una cadena lateral similar.

Los ácidos nucleicos se pueden detectar usando cualquier número de técnicas de amplificación (véanse, p. ej., PCR Primer: A Laboratory Manual, 1995, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; y las Patentes de EE. UU. N° 4.683.195, 4.683.202, 4.800.159 y 4.965.188) con un par apropiado de oligonucleótidos (p. ej., cebadores). Se ha desarrollado un número de modificaciones en la PCR original y se pueden usar para detectar un ácido nucleico. La detección (p. ej., de un producto de amplificación, un complejo de hibridación o un polipéptido) se efectúa habitualmente usando marcadores detectables. El término "marcador" está destinado a abarcar el uso de marcadores directos así como marcadores indirectos. Marcadores detectables incluyen enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos.

Artículos de Fabricación o Estuches

Esta divulgación también proporciona artículos de fabricación que se pueden usar para determinar el estado de metilación de uno o más dinucleótidos CpG y/o islas de CpG. Un artículo de fabricación según se proporciona en la presente puede incluir uno o más oligonucleótidos para determinar el estado de metilación de uno o más dinucleótidos CpG y/o islas de CpG, junto con materiales de envasado adecuados. El uno o más oligonucleótidos pueden detectar el dinucleótido CpG en el ADN tratado con bisulfito en estado desmetilado o en estado metilado.

Adicionalmente, los artículos de fabricación pueden incluir reactivos (p. ej., tampones, enzimas, cofactores) para llevar a cabo los métodos divulgados en la presente (p. ej., tratamiento de ADN con bisulfito, amplificación, secuenciación, hibridación). Los artículos de fabricación proporcionados en la presente también pueden contener un prospecto o una etiqueta que tenga instrucciones en la misma para usar los componentes del interior del artículo de fabricación para determinar el estado de metilación de uno o más dinucleótidos CpG y/o una o más islas de CpG en una muestra biológica.

Según la presente invención, se pueden emplear técnicas de biología molecular, microbiología, bioquímica y ADN recombinante convencionales dentro de la experiencia de la especialidad. Estas técnicas se explican a fondo en la bibliografía. La invención se describirá adicionalmente en los siguientes ejemplos,

EJEMPLOS

Ejemplo 1-Materiales y Métodos

Todos los protocolos y procedimientos usados en este estudio estaban aprobados por the University of lowa Institutional Review Board y los detalles completos están disponibles de los inventores a petición. Los sujetos del caso descritos en la presente se incorporaron desde los hospitales y las clínicas de the University of Iowa o dos centros de tratamiento del alcoholismo del Estado de Iowa. En resumen, después de la admisión en un hospital o un centro de tratamiento del alcoholismo y el logro tanto de sobriedad como de ausencia de deterioro cognitivo significativo, los sujetos potenciales fueron abordados por personal de las instalaciones en cuanto a su interés potencial en participar en el estudio actual. Si estaban interesados, esta información se pasó al equipo de investigación, con los sujetos potenciales puestos en contacto a continuación con un miembro del equipo de investigación que proporcionaba una información detallada y cribaba a los individuos por la idoneidad para el estudio. Los criterios de inclusión incluían la capacidad de consentimiento, una ausencia de trastornos significativos por consumo de sustancias activas distintas al tabaco, una ausencia de medicaciones que afecten hipotéticamente a la metilación de ADN, la ausencia de trastornos médicos incluyendo el cáncer, trastornos gastrointestinales, diabetes, enfermedad pulmonar obstructiva crónica o cardiopatía grave, y, en general, por lo demás, buena salud general global. Si no se excluían y todavía deseaban participar, los sujetos expresaban su consentimiento y el procedimiento de estudio se iniciaba.

En la toma inicial (Momento 1 o T1), que se podría producir hasta siete días después de la admisión, todos los sujetos del caso se entrevistaron con una versión modificada de the Semi-Structured Assessment for the Genetics of Alcoholism, Versión 2 (SSAGA-II; Bucholz y cols., 1994, J. Stud. Alcohol, 55:149-58), que incluía elementos específicos para determinar el consumo de sustancias a lo largo de los seis últimos meses. Además, los sujetos fueron flebotomizados para proporcionar biomaterial para el estudio actual. A continuación, aproximadamente 4 semanas más tarde (Momento 2 o T2), los mismos sujetos fueron entrevistados una vez más para determinar cambios en el estado médico y fueron flebotomizados.

Los sujetos de control se incorporaron desde la región de la ciudad de Iowa. Los criterios de inclusión para el estudio eran similares a los de los sujetos del caso e incluían buena salud general global, una abstinencia completa de alcohol durante al menos seis meses, una ausencia de medicaciones que influyan hipotéticamente en la metilación de ADN y una ausencia significativa de consumo de sustancias aparte del tabaco. Todos los sujetos de control fueron entrevistados con los mismos instrumentos que los sujetos del caso y fueron flebotomizados para proporcionar biomaterial para el estudio actual.

Se prepararon sueros y pellas de células mononucleares (es decir linfocitos) según se describe previamente (Philibert y cols., 2012, Epigenetics, 7:1331-8). Como parte de un esfuerzo para determinar la fiabilidad autoevaluada, se determinaron los niveles de cotinina y tetrahidrocannabinol en sueros usando estuches de inmunoensayo con enzimas ligadas (ELISA) suministrados por Abnova (Taiwán) según las directrices del fabricante y protocolos previos (Philibert y cols., 2013, Epigenetics, 5:19-26). El ADN se preparó a partir de las pellas de linfocitos usando un estuche QiaAmp (Qiagen, Alemania) según las directrices del fabricante.

La metilación de ADN del genoma completo se determinó usando el Illumina (San Diego, CA) HumanMethylation450 Beadchip de the University of Minnesota Genome Center (Minneapolis, MN) usando el protocolo especificado por el fabricante según se describe previamente (Monick y cols., 2012, Am. J. Med. Genet., Parte B Neuropsychiatric Genet., 159:141-51). Este chip contiene 485.577 sondas que reconocen al menos 20216 transcritos, transcritos potenciales o islas de CpG (de the Genome Reference Consortium human genome build 37 (GRCh37)).

Los datos resultantes se inspeccionaron con respecto a la conversión completa con bisulfito y los valores de beta medios se determinaron para cada residuo de CpG elegido determinado usando the Illumina Genome Studio Methylation Module, Versión 3.2. A continuación, los datos resultantes se limpiaron usando un algoritmo basado en PERL para retirar los valores de beta cuyos valores p de detección, un índice de la probabilidad de que la secuencia observada represente ruido aleatorio, fueran mayores de 0,05. A continuación, los datos procedentes de micromatrices con un éxito de determinación completa < 99,5% se retiraron.

Los datos de supervivencia se importaron en MethLAB (Kilaru y cols., 2012, Epigenetics, 7 :225-9) y se analizaron con respecto al estado de consumo de alcohol usando un enfoque de modelos lineales generales estándar que controla variables del chip y el lote. Los valores p resultantes se corrigieron con respecto a comparaciones de genoma completo usando los métodos bien del grado de descubrimientos falsos o bien de corrección de Bonferroni (Benjamini y cols., 1995, J. Royal Stat. Soc. Series B, Method, 57:289-300).

Esencialmente, se usó un genoma de regresión lineal del genoma completo; en este caso, una prueba de la t que explica covariables del lote y el portaobjetos. "Lote" es un término en la metilación de ADN que se refiere al agrupamiento con respecto a la conversión con bisulfito (p. ej., el "lote" tiene en cuenta el grado de conversión con bisulfito o la falta de la misma). "Portaobjetos" se refiere al chip o los chips o la micromatriz o las micromatrices individuales sobre los que se realizan las hibridaciones, puesto que, por ejemplo, puede haber una variación de portaobjetos a portaobjetos con respecto al grado de hibridación de la misma muestra. Se entenderá que tener en cuenta la variación por lotes y portaobjetos da como resultado habitualmente un mayor grado de significación.

Ejemplo 2-Resultados Experimentales

Las características clínicas y demográficas de los sujetos del caso y de control incluidas en el estudio se describen en la Tabla 1. En resumen, de acuerdo con la población de Iowa y las características de remisión de pacientes remitidos para el tratamiento del alcoholismo, los sujetos tendían a tener entre 40 y 50 años y principalmente eran varones blancos. Los sujetos del caso eran consumidores de alcohol extremadamente intensivos, describiendo el sujeto típico el consumo medio de una botella de vodka o un paquete de 12 cervezas durante al menos la última semana antes de la admisión. El retraso entre el momento de la flebotomía y su última bebida promediaba cuatro días y variaba entre uno y ocho días. No sorprendentemente, los sujetos del caso sumaban trastornos derivados del consumo de tabaco, siendo 85% de ellos fumadores diarios. También tendían a tener un grado superior de consumo de THC, teniendo 10 sujetos niveles de hidroxi-THC bien marginales o bien notablemente positivos. En todos y cada uno de los casos, los resultados de las pruebas de ELISA para cotinina y THC en suero estaban de acuerdo con los datos autoevaluados. De los 41 sujetos del caso del Momento 1 (T1) comprobados durante el período previo a este estudio, solo 26 completaban las determinaciones del Momento 2 (T2). Las razones del fallo variaban. En algunos casos, el sujeto ya había dejado el tratamiento y había empezado a beber, mientras que en otros casos, el sujeto ya había dejado el tratamiento y bien no estaba disponible o bien no quería completar la segunda fase de la determinación.

Tabla I. Características clínicas y demográficas de los sujetos de estudio

En contraste, aunque similares en edad, sexo y etnia, los 33 sujetos de control tenían grados inferiores de consumo tanto de tabaco como de cannabis. De hecho, solo uno de los sujetos de control era fumador diario actual y todos los sujetos de control negaron consumo de cannabis el último año. En contraste con los resultados procedentes de los sujetos del caso, se observaba una discrepancia en la prueba de ELISA en suero (es decir, había una prueba positiva para THC).

Los datos de metilación del genoma completo se obtuvieron satisfactoriamente (medidas para >99,5% de todas las sondas) para 95 muestras, incluyendo dos patrones de ADN de linfoblastos y una réplica interna. Estos incluían 33 controles, 33 sujetos del caso en T1 y 26 sujetos del caso en T2. La correlación entre la réplica interna era mayor de 0,998. El valor de beta medio para los controles y los sujetos en T1 y T2 era 0,4788, 0,4800 y 0,4833, respectivamente.

Los resultados procedentes de estos experimentos y los residuos, las regiones y el gen de CpG reivindicados en esta solicitud se dan en el Apéndice A. Los datos contenidos en el Apéndice A proporcionan la identificación de la sonda Illumina, cuyas secuencias están disponibles públicamente, y la identidad del CpG en cuestión indicada por la información de secuencia y la información cartográfica. Finalmente, se proporciona el valor de p para la prueba de la t que compara la metilación de los sujetos alcohólicos con la de los controles. Una p < 0,05 se considera significativa, y los archivos de anotación completos para las sondas listadas en el Apéndice A están disponibles públicamente.

Específicamente, la Columna A, "Nombre de la sonda": la denominación de Illumina para la sonda. Columna B, "Región diana": la secuencia genómica de la región; el centro de la región, el residuo de CpG, se indica mediante corchetes (p. ej. [CG]). Columna C, "CHR": el cromosoma en el que se encuentra la región diana. Columna D, "Información cartográfica": el par de bases en el que se encuentra el residuo de CpG en el ensamblaje GRCH37; nótese que puesto que los nucleótidos citosina y guanina son complementarios, el residuo de CpG se encuentra en la cadena tanto de sentido como antisentido. Columna E, "Nombre del Gen de Referencia UCSC": los nombres de los genes generalmente aceptados, cuando están presentes, en los que se encuentra el residuo de CpG. Columna F, "valor de p": la significación de la prueba de la t comparando la metilación de los casos alcohólicos con la de los controles.

La lista de los 30 resultados más significativos procedentes de la comparación del estado de metilación del ADN de los 32 sujetos T1 y los 33 controles abstinentes se lista en la Tabla II. En general, después de la corrección del genoma completo usando el método del grado de falsos descubrimientos (FDR), se metilaban diferencialmente un total de 8636 sondas mientras que, cuando se usaba la corrección de Bonferroni más conservadora, solo 56 comparaciones eran estadísticamente significativas. El examen de la representación QQ para la comparación revela que la base para estas diferencias observadas es significativa, siendo marcadamente prominente un sesgo positivo (mayores números de valores de p más significativos) (Figura 1).

Tabla II. Las 30 Sondas Más Significativamente Asociadas en el Análisis de Casos y Controles

Valores de Beta Medios Corregidos Identificación Sonda GEN Situación Estado de la Isla Caso Control Prueba de la t Valor de cg23193759 C10orf35 TSS200 Isla 0,128 0,168 4,66E-12 2,26E-06 cg02583484 HNRNPA1 Cuerpo Plataforma S 0,250 0,319 1,42E-11 3,46E-06 cg23779890 GDAP1 TSS200 Isla 0,194 0,243 1,30E-10 2,10E-05 cg13415831 0,073 0,098 3,18E-10 3,87E-05 cg09935388 GFI1 Cuerpo Isla 0,647 0,799 1,35E-09 0,0001 cg01432120 Isla 0,660 0,720 1,86E-09 0,0002 cg12655542 0,225 0,282 2,18E-09 0,0002 cg11832281 CUGBP2 Cuerpo Plataforma S 0,070 0,097 4,20E-09 0,0003 cg06126421 0,643 0,750 5,34E-09 0,0003 cg12895631 C11orf75 5'UTR 0,161 0,192 7,07E-09 0,0003 cg25998745 0,588 0,666 8,43E-09 0,0003 cg08352774 TMEM181 Cuerpo Plataforma S 0,110 0,149 8,46E-09 0,0003 cg19939077 PPIF Cuerpo Costa S 0,147 0,184 8,85E-09 0,0003 cg13126206 Plataforma S 0,468 0,521 1,11 E-08 0,0004 cg22888484 SNHG11 TSS200 Costa N 0,043 0,056 1,21 E-08 0,0004 cg00159243 SELPLG 5'UTR 0,397 0,474 1,76E-08 0,0005 cg24046474 RPL12 Cuerpo Costa N 0,221 0,296 1,89E-08 0,0005 cg00957665 TRIM8 Cuerpo Costa S 0,097 0,125 1,93E-08 0,0005 cg06093152 0,572 0,654 2,03E-08 0,0005 cg12126344 0,795 0,835 2,13E-08 0,0005 cg17485265 FAM50B TSS1500 Costa N 0,677 0,744 2,29E-08 0,0005 cg16854826 ZMIZ1 5'UTR 0,603 0,654 2,42E-08 0,0005 cg23028436 STK38L TSS200 Isla 0,064 0,094 2,89E-08 0,0006 Valores de Beta Medios Corregidos Identificación Sonda GEN Situación Estado de la Isla Caso Control Prueba de la t Valor de p cg00690082 STAT5A TSS1500 Costa N 0,309 0,376 3,00E-08 0,0006 cg06285727 ATG16L2 TSS1500 Costa N 0,152 0,216 3,68E-08 0,0007 cg09267773 Costa N 0,517 0,433 4,00E-08 0,0007 cg21475150 RPL31 TSS1500 Isla 0,794 0,849 4,30E-08 0,0007 cg21416692 PHC2 5'UTR 0,742 0,792 4,41 E-08 0,0007 cg02348119 TBC1D16 5'UTR 0,598 0,647 4,48E-08 0,0007 cg10691866 TPST1 Cuerpo 0,419 0,491 4,55E-08 0,0007

Todos los valores de metilación medios son valores beta no transformados logarítmicamente. Estado de la isla se refiere a la posición de la sonda con relación a la isla.

Las clases incluyen: 1) Isla, 2) costa norte (N), 3) costa sur (S), 4) plataforma norte (N), 5) plataforma sur (S) y 6) blanco que indica que la sonda no se cartografía a una isla.

Un problema frecuente en cohortes de alto riesgo tales como estos sujetos del caso es el efecto de sustancias comórbidas. En particular, este es un problema para los resultados actuales debido a que el tabaquismo tiene efectos profundos sobre la metilación de ADN (véase, por ejemplo, Dogan y cols., 2014, BMC Genomics, 15:151), y 27 de los 33 sujetos del caso eran fumadores activos. A este respecto, cg05575921, que se ha observado que está intensamente correlacionado con el consumo de tabaco (véase, por ejemplo, Dogan y cols., 2014, BMC Genomics, 15:151), era la sonda clasificada 31°. Sin embargo, en general, no había un solapamiento significativo entre la señal para el consumo de alcohol y la señal para el tabaquismo. Solo 22 de las 910 sondas que alcanzaban una significación del genoma completo con respecto al tabaquismo en Dogan y cols. (2014, BMC Genomics, 15:151) se clasificaban entre las 10.000 sondas más altamente asociadas principales en el estudio actual. A la inversa, la clasificación global de las 10.000 sondas más altamente asociadas con respecto al tabaquismo en Dogan y cols. era 302.264 (de 485.577), siendo la mediana de la distribución 318.258°. De ahí que parezca haber poco solapamiento en los distintivos de metilación entre sujetos que consumen alcohol y sujetos que consumen tabaco.

Como la siguiente etapa de los análisis, se analizó la distribución diferencial de las 1000 sondas más significativamente asociadas usando el algoritmo GoMiner™ (Zeeberg y cols., 2003, Genome Biol., 4:R28). Los resultados, mostrados en la Tabla III, demuestran un marcado enriquecimiento de las sondas más altamente asociadas para rutas implicadas en la muerte celular programada (apoptosis) o la señalización de GTPasa.

Aunque el principal objetivo de muchos estudios de biomarcadores es determinar si se puede usar un marcador dado para diferenciar estados patológicos de estados de control, un objetivo secundario del presente estudio era determinar si la metilación de ADN se podía usar para comprobar la abstinencia de alcohol. Como una primera etapa en esa determinación, se compararon los patrones de metilación de ADN del genoma completo de 25 sujetos para los que se obtenían satisfactoriamente los datos tanto de T1 como de T2. El espacio de tiempo medio entre los dibujos de T1 y T2 para estos 25 individuos era 25 días. Ninguna sonda individual cruzaba el umbral de significación del genoma completo, siendo el mejor valor de p no corregido observado solamente 5 x 10-6, demostrando las representaciones QQ del análisis que era prominente un sesgo negativo significativo (Figura 2).

Tabla III. Las 30 rutas ontológicas génicas más reguladas diferencialmente principales

Genes Log10 Categoría de GO Nombre de la Categoría Totales Cambiados Valor de p FDR GO:0005515 unión a proteínas 6815 286 -7,37 0 GO:0005737 citoplasma 7845 312 -5,75 0 GO:0008219 muerte celular 1392 78 -5,69 0 GO:0016265 muerte 1395 78 -5,66 0 GO:0005829 citosol 1884 98 -5,63 0 GO:0012501 muerte celular programada 1278 72 -5,36 0 GO:0007264 transducción de señales mediada por GTPasa pequeña 566 40 -5,33 0 GO:0043067 regulación de la muerte celular programada 981 59 -5,30 0 GO:0010941 regulación de la muerte celular 989 59 -5,20 0 GO:0006915 apoptosis 1271 71 -5,16 0 Genes Log10 Categoría de GO Nombre de la Categoría Totales Cambiados Valor de p FDR GO:0042981 regulación de la apoptosis 974 57 -4,79 0 GO:0023033 ruta de señalización 2812 130 -4,73 0 GO:0019899 unión a enzimas 671 43 -4,63 0 GO:0048523 regulación negativa del proceso celular 2069 101 -4,61 0 GO:0002376 proceso del sistema inmunitario 1256 68 -4,52 0 GO:0023034 ruta de señalización intracelular 1707 86 -4,44 0,01 GO:0023052 señalización 3787 164 -4,36 0,01 GO:0065007 regulación biológica 7226 283 -4,33 0,01 GO:0048519 regulación negativa del proceso biológico 2235 106 -4,31 0,01 GO:0035556 transducción de señalización intracelular 1454 75 -4,24 0,01 GO:0005622 intracelular 11231 411 -4,22 0,01 GO:0060548 regulación negativa de la muerte celular 441 31 -4,21 0,01 GO:0044464 parte de la célula 14663 511 -4,14 0,02 GO:0005623 célula 14664 511 -4,13 0,01 GO:0035466 regulación de la ruta de señalización 1158 62 -4,02 0,02 GO:0009987 proceso celular 11702 424 -3,98 0,02 GO:0043069 regulación negativa de la muerte celular 434 30 -3,96 0,02 GO:0007265 transducción de señales de proteína Ras 335 25 -3,91 0,02 GO:0051056 regulación de la transducción de señales de GTPasa 339 25 -3,83 0,03 GO:0050794 regulación del proceso celular 6319 249 -3,81 0,03 FDR = grado de descubrimientos falsos

El análisis secundario de los T1 y T2 resultaba muy interesante. Puesto que la exposición a etanol es estresante para las células y los sistemas biológicos tienden a invertir su medio homeostático después de la perturbación, los presentes inventores se preguntaron qué determinación de la metilación para los sujetos que beben etanol, T1 o T2, era más similar a la de los controles para las 8636 sondas significativas para FDR identificadas. Notablemente, la metilación media de estos residuos de CpG para los 25 sujetos era más similar a los sujetos de control en el tiempo del gráfico de T2 que en el tiempo del gráfico de T1 en 7360 de 8636 sondas (Chi cuadrado p<0,0001) incluyendo los 30 de los listados en la Tabla II. Desgraciadamente, la versión promedio para la media de los controles era bastante modesta en cada sitio, siendo el cambio global en el valor beta aproximadamente 0,005 (es decir 0,5%).

Ejemplo 3-Sumario

Los presentes experimentos demuestran que el consumo de alcohol está asociado con cambios significativos y amplios en la metilación de ADN en comparación con controles que no consumen alcohol. Los presentes experimentos también demuestran que el grado de los cambios en la metilación tiende a disminuir después de aproximadamente un mes de abstinencia. Así, el distintivo de metilación de ADN se puede usar para inferir el estado reciente de consumo de alcohol. Probablemente, los resultados presentados aquí impactarán en la elección de entornos en los que se efectúa y se comprueba el tratamiento del alcoholismo.

Como se esperaría con el consumo de alcohol, la magnitud de los cambios en la metilación de ADN debida al consumo de alcohol no es tan fuerte como la observada con, por ejemplo, el consumo de tabaco. En contraste con las del tabaquismo, por ejemplo, donde las diferencias de metilación en cg05575921 entre fumadores crónicos (~60%) y no fumadores (92%) pueden superar 30%, las diferencias medias en un punto cualquiera en el estudio de consumo de alcohol actual tienden a ser de alrededor de 5% a 10%.

Se entenderá que, aunque los métodos y las composiciones de interés se describen en la presente junto con un número de diferentes aspectos, la descripción precedente de los diversos aspectos está destinada a ilustrar y no limitar el alcance de los métodos y las composiciones de interés. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Se divulgan métodos y composiciones que se pueden usar para, se pueden usar junto con, se pueden usar en la preparación para, o son productos de los métodos y las composiciones divulgados. Estos y otros materiales se divulgan en la presente y se entiende que se divulgan combinaciones, subgrupos, interacciones, grupos, etc. de estos métodos y composiciones. Esto es, aunque pueda no divulgarse una referencia específica a cada una de las combinaciones y permutaciones individuales y colectivas de estas composiciones y métodos, cada una se contempla específicamente y se describe en la presente. Por ejemplo, si una composición particular de interés o un método particular se divulga y se analiza y se analiza un número de composiciones o métodos, todas y cada una de las combinaciones y permutaciones de las composiciones y los métodos se contemplan específicamente a menos que se indique específicamente lo contrario. Asimismo, también se contempla y divulga específicamente cualquier subgrupo o combinación de estos.

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método in vitro para determinar si un individuo consume alcohol o no, que comprende las etapas de: determinar el estado de metilación de al menos un dinucleótido CpG en una muestra biológica procedente de un individuo,

en el que el al menos un dinucleótido CpG comprende al menos la posición 71389896 del cromosoma 10; y correlacionar el estado de metilación del al menos un dinucleótido CpG para determinar si el individuo consume alcohol o no.

2. El método según la reivindicación 1, en el que la desmetilación en la posición 71389896 del cromosoma 10 es indicativa de consumo de alcohol en los últimos 6 meses, en el que, opcionalmente, la remetilación en la posición 71389896 del cromosoma 10 es indicativa de un consumo menor o nulo de alcohol.

3. El método según la reivindicación 1, en el que el al menos un dinucleótido CpG comprende además la posición 54677008 del cromosoma 12, en el que, opcionalmente, la desmetilación en la posición 54677008 del cromosoma 12 es indicativa de consumo de alcohol en los últimos 6 meses, en el que, opcionalmente, la remetilación en la posición 54677008 del cromosoma 12 es indicativa de un consumo menor o nulo de alcohol.

4. El método según la reivindicación 1, en el que el al menos un dinucleótido CpG comprende además la posición 75262522 del cromosoma 8, en el que, opcionalmente, la desmetilación en la posición 75262522 del cromosoma 8 es indicativa de un consumo de alcohol previo o actual en los últimos 6 meses, en el que, opcionalmente, la remetilación en la posición 75262522 del cromosoma 8 es indicativa de un consumo menor o nulo de alcohol.

5. El método según la reivindicación 1, en el que el al menos un dinucleótido CpG comprende la posición 92137791 del cromosoma 9, en el que, opcionalmente, la desmetilación en la posición 92137791 del cromosoma 9 es indicativa de consumo de alcohol en los últimos 6 meses, en el que, opcionalmente, la remetilación en la posición 92137791 del cromosoma 9 es indicativa de un consumo menor o nulo de alcohol.

6. El método según la reivindicación 1, en el que la etapa de determinación comprende:

poner en contacto ADN de la muestra biológica con bisulfito bajo condiciones alcalinas para producir ADN tratado con bisulfito;

opcionalmente, amplificar el ADN tratado con bisulfito para producir ADN tratado con bisulfito amplificado; poner en contacto el ADN tratado con bisulfito con al menos un oligonucleótido que es complementario a una secuencia que comprende el al menos un dinucleótido CpG; y

detectar el estado de metilación del al menos un dinucleótido CpG.

7. El método según la reivindicación 6, en el que el al menos un oligonucleótido detecta el dinucleótido CpG en el ADN tratado con bisulfito en estado desmetilado o en estado metilado.

8. El método según la reivindicación 1, en el que la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en sangre periférica, linfocitos, orina, saliva y células bucales, y/o en el que el estado de metilación del al menos un dinucleótido CpG se determina usando ADN tratado con bisulfito.

9. El método según la reivindicación 1, que comprende además obtener datos autoevaluados del individuo relativos a si el individuo es consumidor de alcohol o no.

10. Un método ejecutado informáticamente para determinar si un individuo consume alcohol o no, comprendiendo el método:

obtener datos medidos asociados con el consumidor, comprendiendo los datos medidos uno o más estados de metilación de CpG medidos,

en el que el uno o más estados de metilación de CpG medidos comprenden al menos la posición 71389896 del cromosoma 10;

generar una puntuación predictiva basada en los datos medidos obtenidos; y

proporcionar una probabilidad de consumo de alcohol por el consumidor basándose en la puntuación predictiva.

11. El método según la reivindicación 10, en el que el estado de metilación de CpG comprende además la posición 54677008 del cromosoma 12, la posición 75262522 del cromosoma 8 y/o la posición 92137791 del cromosoma 9.

12. El método según la reivindicación 10, que comprende además:

determinar el estado de metilación de CpG para el consumidor, en donde un cambio en el estado de metilación es un indicador de consumo de alcohol.

13. El método según la reivindicación 10, que comprende además:

obtener un nivel de consumo de alcohol predicho basándose en la puntuación predictiva.

14. Un estuche para determinar el estado de metilación de al menos un dinucleótido CpG, comprendiendo el estuche: al menos un primer cebador de ácido nucleico de al menos 8 nucleótidos de longitud que es complementario a una secuencia de ácido nucleico convertida con bisulfito que incluye al menos un dinucleótido CpG,

en el que el al menos un primer cebador de ácido nucleico detecta el dinucleótido CpG metilado o el dinucleótido CpG desmetilado en la posición 71389896 del cromosoma 10; e

instrucciones para correlacionar un cambio en el estado de metilación en una o más posiciones de CpG con el consumo de alcohol.

15. El estuche según la reivindicación 14, que comprende además

un sustrato sólido al que se une el al menos un primer cebador de ácido nucleico, en el que, opcionalmente, el sustrato sólido se selecciona de polímero, vidrio, semiconductor, papel, metal, gel e hidrogel.