JP6807833B2 - アルコール使用および断酒のバイオマーカーとしてのdnaメチル化状態 - Google Patents
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Description
本願は、2014年5月30日に出願された米国仮出願第62/005,408号の恩典を主張する。先行出願の開示は、本願の開示の一部とみなされる(かつ参照により本願の開示に組み入れられる)。
本発明は、National Institutes of Healthにより授与された助成金第R43AA022041号の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有している。
アルコール依存症は、全世界で数千万の個体に対して深刻な社会経済的および個人的影響を及ぼしている。残念ながら、診断を行う能力は、自己申告の信頼性によって妨げられることが多く、一方で堅牢かつ信頼性のあるバイオマーカーが存在しないため、処置応答を監視する能力は疑問視されている。
本開示は、個体がアルコールを使用しているかどうかを決定するため、また個体がアルコールの使用を停止したかどうかを決定するために使用することができる方法および材料を提供する。
個体がアルコールを使用しているかどうかを決定する方法であって、
個体由来の生物学的サンプルにおいて少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態を決定する工程;および
個体がアルコールを使用しているかどうかを決定するために、少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態を相関付ける工程
を含む、方法。
[本発明1002]
少なくとも1つのCpGジヌクレオチドが、第10染色体の第71389896位を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
第10染色体の第71389896位の脱メチル化が、過去または現在のアルコール使用を示す、本発明1002の方法。
[本発明1004]
第10染色体の第71389896位の再メチル化が、アルコール使用の減少またはアルコール不使用を示す、本発明1003の方法。
[本発明1005]
少なくとも1つのCpGジヌクレオチドが、第12染色体の第54677008位を含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
第12染色体の第54677008位の脱メチル化が、過去または現在のアルコール使用を示す、本発明1005の方法。
[本発明1007]
第12染色体の第54677008位の再メチル化が、アルコール使用の減少またはアルコール不使用を示す、本発明1006の方法。
[本発明1008]
少なくとも1つのCpGジヌクレオチドが、第8染色体の第75262522位を含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
第8染色体の第75262522位の脱メチル化が、過去または現在のアルコール使用を示す、本発明1008の方法。
[本発明1010]
第8染色体の第75262522位の再メチル化が、アルコール使用の減少またはアルコール不使用を示す、本発明1009の方法。
[本発明1011]
少なくとも1つのCpGジヌクレオチドが、第9染色体の第92137791位を含む、本発明1001の方法。
[本発明1012]
第9染色体の第92137791位の脱メチル化が、過去または現在のアルコール使用を示す、本発明1011の方法。
[本発明1013]
第9染色体の第92137791位の再メチル化が、アルコール使用の減少またはアルコール不使用を示す、本発明1012の方法。
[本発明1014]
決定する工程が、
生物学的サンプル中のDNAをアルカリ条件下でバイサルファイトと接触させて、バイサルファイト処理DNAを生成すること;
任意で、バイサルファイト処理DNAを増幅させて、増幅されたバイサルファイト処理DNAを生成すること;
バイサルファイト処理DNAを、少なくとも1つのCpGジヌクレオチドを含む配列に対して相補的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチドと接触させること;および
少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態を検出すること
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1015]
少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが、非メチル化状態にあるバイサルファイト処理DNA内のCpGジヌクレオチドを検出する、本発明1014の方法。
[本発明1016]
少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが、メチル化状態にあるバイサルファイト処理DNA内のCpGジヌクレオチドを検出する、本発明1014の方法。
[本発明1017]
生物学的サンプルが、末梢血、リンパ球、尿、唾液および口腔細胞からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1018]
少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態が、バイサルファイト処理DNAを用いて決定される、本発明1001の方法。
[本発明1019]
個体がアルコール使用者であるかどうかに関する自己申告データを個体から入手する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1020]
個体がアルコールを使用しているかどうかを決定するためにコンピュータにより実行される方法であって、以下の工程を含む、方法:
使用者に関連する測定データを入手する工程であって、測定データが1つまたは複数の測定されたCpGメチル化状態を含む、工程;
入手された測定データに基づき予測スコアを生成する工程;および
予測スコアに基づき使用者によるアルコール使用の可能性を提供する工程。
[本発明1021]
使用者のCpGメチル化状態を決定する工程をさらに含み、メチル化状態の変化がアルコール使用を示す、本発明1020の方法。
[本発明1022]
予測スコアに基づき予測されるアルコール使用レベルを出力する工程をさらに含む、本発明1020の方法。
そうでないことが定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本方法および組成物が属する技術の分野における通常の知識を有する者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本方法および組成物を実施および試験する際には本明細書に記載されているのと同様または同等の方法および材料を使用することができるが、以下には適当な方法および材料が記載されている。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定を意図したものではない。本明細書で言及されているすべての刊行物、特許出願、特許およびその他の参考文献は、それらの全体が参照により組み入れられる。
ゲノムワイドアプローチを用いて、本開示は、断酒対照との比較で、アルコール使用がDNAメチル化の幅広い変化に関連することを示す。本開示はまた、DNAメチル化の変化が断酒の関数として逆戻りする傾向を有することを示す。したがって、DNAのメチル化は、アルコール使用状態を評価するためおよび/またはアルコール処置応答を監視するために臨床的に使用することができる。
CpGアイランドは、CpG配列の出現率が他の領域よりも高いDNAのストレッチである。CpGという用語における「p」は、システイン(「C」)ヌクレオチドとグアニン(「G」)ヌクレオチドを結合するホスホジエステル結合を表す。CpGアイランドは、多くの場合、プロモーター付近に位置し、かつ多くの場合、遺伝子(例えば、ハウスキーピング遺伝子)の発現の調節に関与する。一般に、CpGアイランドは、配列が発現される際にはメチル化されず、発現を抑制する(またはその遺伝子を「不活性化」する)ためにメチル化される。
特定のゲノムDNAのメチル化状態が、アルコールを使用する個体において(非使用者との比較で)変化することが示されている。例えば、各々その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Philibert et al. (2008, Am. J. Med. Genet. B Neuropsychiatr. Genet., 147B; 565-70); Philibert et al. (2008, Am. J. Med. Genet. B Neuropsychiatr. Genet., 147B: 543-9); Philibert et al. (2009, Psychiatr. Genet., 19: 91-8); Philibert et al. (2012, Front Genet., 3:54); および米国特許第8,637,652号を参照のこと。
本明細書で使用される場合、核酸は、DNAおよびRNAを含み得、かつ1つまたは複数のヌクレオチドアナログまたは骨格修飾を含む核酸を含む。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得、それは通常その意図される用途に依存する。
本開示はまた、1つまたは複数のCpGジヌクレオチドおよび/またはCpGアイランドのメチル化状態を決定するために使用され得る製品を提供する。本明細書で提供される製品は、適当な包装材と共に、1つまたは複数のCpGジヌクレオチドおよび/またはCpGアイランドのメチル化状態を決定するための1つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含み得る。1つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、非メチル化状態またはメチル化状態にあるバイサルファイト処理DNA内のCpGジヌクレオチドを検出することができる。
この研究で使用したすべてのプロトコルおよび手順は、University of Iowa Institutional Review Boardによる承認を受けており、請求により完全な詳細が本発明者らから入手可能である。本明細書に記載される症例対象は、アイオワ大学病院およびクリニックまたはアイオワ州内の2ヶ所のアルコール治療センターから採用した。簡潔に述べると、病院またはアルコール治療センターへの入院後、および、断酒と深刻な認知機能障害が存在しないこととの両方が達成された後、候補対象に対して、施設職員が本研究への参加に関する彼らの潜在的関心について聞き取りを行った。関心を示した場合、この情報を調査チームに伝達し、その後に調査チームのメンバーが候補対象に接触して詳細な情報を提供し、本研究に関する適性について個体を選定した。参加基準は、承諾能力、タバコ以外の顕著な活性物質使用障害の非存在、DNAのメチル化に影響すると仮定される薬物治療の非存在、癌、胃腸障害、糖尿病、慢性閉塞性肺疾患または重度の心疾患を含む医学的障害の非存在、および通常、その他の点で全般的に良好な健康状態を含むものであった。除外対象とならず参加の意思がある場合、対象の同意を得て研究手順を開始した。
本研究に含まれる症例および対照対象の臨床的および人口学的特徴が表Iに記載されている。簡潔に説明すると、アイオワの住民およびアルコール処置のための患者の推薦上の特徴全体を反映して、対象は40代である傾向があり、主として白人男性であった。症例対象は、極めて重度のアルコール使用者であり、典型的な対象は、承認前の少なくとも前週の間に平均消費がウォッカ5分の1ガロンおよびビール12パックである者であった。静脈穿刺の時点と彼らの最後の飲酒の間の遅延は、平均4日間であり、1〜8日の間でばらつきがあった。驚くべきことではないが、症例対象には、喫煙障害を有する者が多く含まれており、彼らの85%が毎日喫煙をする者であった。彼らはまた、THC使用率が高く、10名の対象が限界付近または明らかに陽性のヒドロキシ-THCレベルを有していた。各々およびあらゆる症例において、血清コチニンおよびTHC ELISA試験の結果は、自己申告データと一致した。本研究にいたる期間の間に確定された41名の症例Time 1(T1)対象のうち、26名のみがTime 2(T2)評価を完了した。失敗の理由は様々であった。いくつかの症例では、対象はすでに処置を止め、飲酒を開始しており、他の例では、対象はすでに処置を止め、第2段階の評価を完了することができないかまたはそれを望まないかのいずれかであった。
すべての平均メチル化値は、非対数変換ベータ値である。アイランドのステータスは、そのアイランドに対するプローブの位置を表す。分類は、以下を含む:(1)アイランド;(2)北(N)ショア;(3)南(S)ショア;(4)北(N)シェルフ;(5)南(S)シェルフ;および(6)プローブがアイランドにマップされないことを示す、空白。
本明細書の実験は、アルコール使用が、アルコールを使用しない対照との比較でDNAメチル化の有意かつ広範な変化に関連することを実証している。本明細書の実験はまた、メチル化の変化度が、およそ1ヶ月の断酒後に減少する傾向があることを実証している。したがって、DNAメチル化指標は、最近のアルコール使用状況を推測するために使用することができる。本明細書に報告される結果は、アルコール処置を実施し監視する設定の選択に影響を及ぼすと考えられる。
Claims (10)
- 個体がエタノールを飲酒しているかどうかを決定する方法であって、
個体由来の生物学的サンプルにおいて少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態を決定する工程;および
個体がエタノールを飲酒しているかどうかを決定するために、少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態を相関付ける工程
を含み、
少なくとも1つのCpGジヌクレオチドの位置が、第10染色体の第71389896位を含み、
第10染色体の第71389896位の脱メチル化が、過去または現在のエタノール飲酒を示し、かつ
第10染色体の第71389896位の再メチル化が、エタノール飲酒の減少またはエタノール非飲酒を示す、
前記方法。 - 決定する工程が、
生物学的サンプル中のDNAをアルカリ条件下でバイサルファイトと接触させて、バイサルファイト処理DNAを生成すること;
任意で、バイサルファイト処理DNAを増幅させて、増幅されたバイサルファイト処理DNAを生成すること;
バイサルファイト処理DNAを、少なくとも1つのCpGジヌクレオチドを含む配列に対して相補的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチドと接触させること;および
少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態を検出すること
を含む、請求項1記載の方法。 - 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが、非メチル化状態にあるバイサルファイト処理DNA内のCpGジヌクレオチドを検出する、請求項2記載の方法。
- 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが、メチル化状態にあるバイサルファイト処理DNA内のCpGジヌクレオチドを検出する、請求項2記載の方法。
- 生物学的サンプルが、末梢血、リンパ球、尿、唾液および口腔細胞からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態が、バイサルファイト処理DNAを用いて決定される、請求項1記載の方法。
- 個体がエタノール飲酒者であるかどうかに関する自己申告データを個体から入手する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 個体がエタノールを飲酒しているかどうかを決定するためにコンピュータにより実行される方法であって、
飲酒者に関連する測定データを入手する工程であって、測定データが1つまたは複数の測定されたCpGメチル化状態を含む、工程;
入手された測定データに基づき予測スコアを生成する工程;および
予測スコアに基づき飲酒者によるエタノール飲酒の可能性を提供する工程
を含み、
少なくとも1つのCpGジヌクレオチドの位置が、第10染色体の第71389896位を含み、
第10染色体の第71389896位の脱メチル化が、過去または現在のエタノール飲酒を示し、かつ
第10染色体の第71389896位の再メチル化が、エタノール飲酒の減少またはエタノール非飲酒を示す、
前記方法。 - 飲酒者のCpGメチル化状態を決定する工程をさらに含む、請求項8記載の方法。
- 予測スコアに基づき予測されるエタノール飲酒レベルを出力する工程をさらに含む、請求項8記載の方法。
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