JP6807833B2 - アルコール使用および断酒のバイオマーカーとしてのｄｎａメチル化状態 - Google Patents
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Description
関連出願の相互参照
本願は、2014年5月30日に出願された米国仮出願第62/005,408号の恩典を主張する。先行出願の開示は、本願の開示の一部とみなされる（かつ参照により本願の開示に組み入れられる）。
本願は、2014年5月30日に出願された米国仮出願第62/005,408号の恩典を主張する。先行出願の開示は、本願の開示の一部とみなされる（かつ参照により本願の開示に組み入れられる）。
政府の支援を受けた研究または開発
本発明は、National Institutes of Healthにより授与された助成金第R43AA022041号の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有している。
本発明は、National Institutes of Healthにより授与された助成金第R43AA022041号の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有している。
背景
アルコール依存症は、全世界で数千万の個体に対して深刻な社会経済的および個人的影響を及ぼしている。残念ながら、診断を行う能力は、自己申告の信頼性によって妨げられることが多く、一方で堅牢かつ信頼性のあるバイオマーカーが存在しないため、処置応答を監視する能力は疑問視されている。
アルコール依存症は、全世界で数千万の個体に対して深刻な社会経済的および個人的影響を及ぼしている。残念ながら、診断を行う能力は、自己申告の信頼性によって妨げられることが多く、一方で堅牢かつ信頼性のあるバイオマーカーが存在しないため、処置応答を監視する能力は疑問視されている。
要旨
本開示は、個体がアルコールを使用しているかどうかを決定するため、また個体がアルコールの使用を停止したかどうかを決定するために使用することができる方法および材料を提供する。
本開示は、個体がアルコールを使用しているかどうかを決定するため、また個体がアルコールの使用を停止したかどうかを決定するために使用することができる方法および材料を提供する。
1つの局面において、個体がアルコールを使用しているかどうかを決定する方法が提供される。そのような方法は典型的に、個体由来の生物学的サンプルにおいて少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態を決定する工程、および個体がアルコールを使用しているかどうかを決定するために、少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態を相関付ける工程を含む。
いくつかの態様において、少なくとも1つのCpGジヌクレオチドは、第10染色体の第71389896位を含む。例えば、第10染色体の第71389896位の脱メチル化は、過去または現在のアルコール使用を示し、第10染色体の第71389896位の再メチル化は、アルコール使用の減少またはアルコール不使用（例えば、断酒）を示す。
いくつかの態様において、少なくとも1つのCpGジヌクレオチドは、第12染色体の第54677008位を含む。例えば、第12染色体の第54677008位の脱メチル化は、過去または現在のアルコール使用を示し、第12染色体の第54677008位の再メチル化は、アルコール使用の減少またはアルコール不使用（例えば、断酒）を示す。
いくつかの態様において、少なくとも1つのCpGジヌクレオチドは、第8染色体の第75262522位を含む。例えば、第8染色体の第75262522位の脱メチル化は、過去または現在のアルコール使用を示し、第8染色体の第75262522位の再メチル化は、アルコール使用の減少またはアルコール不使用（例えば、断酒）を示す。
いくつかの態様において、少なくとも1つのCpGジヌクレオチドは、第9染色体の第92137791位を含む。例えば、第9染色体の第92137791位の脱メチル化は、過去または現在のアルコール使用を示し、第9染色体の第92137791位の再メチル化は、アルコール使用の減少またはアルコール不使用（例えば、断酒）を示す。
いくつかの態様において、決定工程は、生物学的サンプル中のDNAをアルカリ条件下でバイサルファイトと接触させて、バイサルファイト処理DNAを生成すること；任意で、バイサルファイト処理DNAを増幅させて、増幅されたバイサルファイト処理DNAを生成すること；バイサルファイト処理DNAまたは増幅されたバイサルファイト処理DNAを、少なくとも1つのCpGジヌクレオチドを含む配列に対して相補的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチドと接触させること；および少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態を検出することを含む。
いくつかの態様において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドは、非メチル化状態にあるバイサルファイト処理DNA内のCpGジヌクレオチドを検出する。いくつかの態様において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドは、メチル化状態にあるバイサルファイト処理DNA内のCpGジヌクレオチドを検出する。代表的な生物学的サンプルは、非限定的に、末梢血、リンパ球、尿、唾液および口腔細胞を含む。いくつかの態様において、少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態は、バイサルファイト処理DNAを用いて決定される。いくつかの態様において、そのような方法は、個体がアルコール使用者であるかどうかに関する自己申告データを個体から入手する工程をさらに含む。
別の局面において、個体がアルコールを使用しているかどうかを決定する、コンピュータにより実行される方法が提供される。そのような方法は典型的に、使用者に関連する測定データを入手する工程であって、測定データが1つまたは複数の測定されたCpGメチル化状態を含む工程、入手された測定データに基づき予測スコアを生成する工程、および予測スコアに基づき使用者によるアルコール使用の可能性を提供する工程を含む。
いくつかの態様において、そのような方法は、使用者のCpGメチル化状態を決定する工程をさらに含み、メチル化状態の変化がアルコール使用を示す。いくつかの態様において、そのような方法は、予測スコアに基づき予測されるアルコール使用レベルを出力する工程をさらに含む。
1つの局面において、少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態を決定するためのキットが提供される。そのようなキットは典型的に、少なくとも1つのCpGジヌクレオチドを含むバイサルファイト変換核酸配列に相補的な少なくとも8ヌクレオチド長の少なくとも1つの第1の核酸プライマーを含み、少なくとも1つの第1の核酸プライマーは、メチル化CpGジヌクレオチドを検出する。いくつかの態様において、キットは、少なくとも1つのCpGジヌクレオチドを含むバイサルファイト変換核酸配列に相補的な少なくとも8ヌクレオチド長の少なくとも1つの第2の核酸プライマーをさらに含み、少なくとも1つの第2の核酸プライマーは、非メチル化CpGジヌクレオチドを検出する。
いくつかの態様において、第1の核酸プライマーは、第10染色体の第71389896位のメチル化CpGジヌクレオチドを含むバイサルファイト変換配列に相補的である。いくつかの態様において、第1の核酸プライマーは、第10染色体の第71389896位の非メチル化CpGジヌクレオチドを含むバイサルファイト変換配列に相補的である。いくつかの態様において、第1の核酸プライマーは、第12染色体の第54677008位のメチル化CpGジヌクレオチドを含むバイサルファイト変換配列に相補的である。いくつかの態様において、第1の核酸プライマーは、第12染色体の第54677008位の非メチル化CpGジヌクレオチドを含むバイサルファイト変換配列に相補的である。いくつかの態様において、第1の核酸プライマーは、第8染色体の第75262522位のメチル化CpGジヌクレオチドを含むバイサルファイト変換配列に相補的である。いくつかの態様において、第1の核酸プライマーは、第8染色体の第75262522位の非メチル化CpGジヌクレオチドを含むバイサルファイト変換配列に相補的である。いくつかの態様において、第1の核酸プライマーは、第9染色体の第92137791位のメチル化CpGジヌクレオチドを含むバイサルファイト変換配列に相補的である。いくつかの態様において、第1の核酸プライマーは、第9染色体の第92137791位の非メチル化CpGジヌクレオチドを含むバイサルファイト変換配列に相補的である。
いくつかの態様において、本明細書に記載されるキットは、CpGジヌクレオチドの上流の核酸配列に相補的な少なくとも8ヌクレオチド長の少なくとも第3の核酸プライマーを含み得る。いくつかの態様において、本明細書に記載されるキットは、CpGジヌクレオチドの下流の核酸配列に相補的な少なくとも8ヌクレオチド長の少なくとも第4の核酸プライマーを含み得る。いくつかの態様において、少なくとも第3の核酸プライマーは、バイサルファイト変換核酸配列に相補的である。いくつかの態様において、少なくとも第4の核酸プライマーは、バイサルファイト変換核酸配列に相補的である。
いくつかの態様において、少なくとも1つの第1の核酸プライマー、少なくとも1つの第2の核酸プライマー、少なくとも1つの第3の核酸プライマーおよび／または少なくとも1つの第4の核酸プライマーは、1つまたは複数のヌクレオチドアナログを含む。いくつかの態様において、少なくとも1つの第1の核酸プライマー、少なくとも1つの第2の核酸プライマー、少なくとも1つの第3の核酸プライマーおよび／または少なくとも1つの第4の核酸プライマーは、1つまたは複数の合成または非天然ヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、キットは、少なくとも1つの第1の核酸プライマーが結合された固体基材をさらに含む。代表的な固体基材は、非限定的に、ポリマー、ガラス、半導体、紙、金属、ゲルおよび／またはヒドロゲルを含む。いくつかの態様において、固体基材は、マイクロアレイまたはマイクロ流体カードである。いくつかの態様において、キットは検出標識をさらに含む。いくつかの態様において、そのようなキットは、1つまたは複数のCpG位におけるメチル化状態の変化をアルコール使用と相関付けるための指示をさらに含む。
[本発明1001]
個体がアルコールを使用しているかどうかを決定する方法であって、
個体由来の生物学的サンプルにおいて少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態を決定する工程；および
個体がアルコールを使用しているかどうかを決定するために、少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態を相関付ける工程
を含む、方法。
[本発明1002]
少なくとも1つのCpGジヌクレオチドが、第10染色体の第71389896位を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
第10染色体の第71389896位の脱メチル化が、過去または現在のアルコール使用を示す、本発明1002の方法。
[本発明1004]
第10染色体の第71389896位の再メチル化が、アルコール使用の減少またはアルコール不使用を示す、本発明1003の方法。
[本発明1005]
少なくとも1つのCpGジヌクレオチドが、第12染色体の第54677008位を含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
第12染色体の第54677008位の脱メチル化が、過去または現在のアルコール使用を示す、本発明1005の方法。
[本発明1007]
第12染色体の第54677008位の再メチル化が、アルコール使用の減少またはアルコール不使用を示す、本発明1006の方法。
[本発明1008]
少なくとも1つのCpGジヌクレオチドが、第8染色体の第75262522位を含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
第8染色体の第75262522位の脱メチル化が、過去または現在のアルコール使用を示す、本発明1008の方法。
[本発明1010]
第8染色体の第75262522位の再メチル化が、アルコール使用の減少またはアルコール不使用を示す、本発明1009の方法。
[本発明1011]
少なくとも1つのCpGジヌクレオチドが、第9染色体の第92137791位を含む、本発明1001の方法。
[本発明1012]
第9染色体の第92137791位の脱メチル化が、過去または現在のアルコール使用を示す、本発明1011の方法。
[本発明1013]
第9染色体の第92137791位の再メチル化が、アルコール使用の減少またはアルコール不使用を示す、本発明1012の方法。
[本発明1014]
決定する工程が、
生物学的サンプル中のDNAをアルカリ条件下でバイサルファイトと接触させて、バイサルファイト処理DNAを生成すること；
任意で、バイサルファイト処理DNAを増幅させて、増幅されたバイサルファイト処理DNAを生成すること；
バイサルファイト処理DNAを、少なくとも1つのCpGジヌクレオチドを含む配列に対して相補的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチドと接触させること；および
少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態を検出すること
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1015]
少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが、非メチル化状態にあるバイサルファイト処理DNA内のCpGジヌクレオチドを検出する、本発明1014の方法。
[本発明1016]
少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが、メチル化状態にあるバイサルファイト処理DNA内のCpGジヌクレオチドを検出する、本発明1014の方法。
[本発明1017]
生物学的サンプルが、末梢血、リンパ球、尿、唾液および口腔細胞からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1018]
少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態が、バイサルファイト処理DNAを用いて決定される、本発明1001の方法。
[本発明1019]
個体がアルコール使用者であるかどうかに関する自己申告データを個体から入手する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1020]
個体がアルコールを使用しているかどうかを決定するためにコンピュータにより実行される方法であって、以下の工程を含む、方法：
使用者に関連する測定データを入手する工程であって、測定データが1つまたは複数の測定されたCpGメチル化状態を含む、工程；
入手された測定データに基づき予測スコアを生成する工程；および
予測スコアに基づき使用者によるアルコール使用の可能性を提供する工程。
[本発明1021]
使用者のCpGメチル化状態を決定する工程をさらに含み、メチル化状態の変化がアルコール使用を示す、本発明1020の方法。
[本発明1022]
予測スコアに基づき予測されるアルコール使用レベルを出力する工程をさらに含む、本発明1020の方法。
そうでないことが定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本方法および組成物が属する技術の分野における通常の知識を有する者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本方法および組成物を実施および試験する際には本明細書に記載されているのと同様または同等の方法および材料を使用することができるが、以下には適当な方法および材料が記載されている。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定を意図したものではない。本明細書で言及されているすべての刊行物、特許出願、特許およびその他の参考文献は、それらの全体が参照により組み入れられる。
個体がアルコールを使用しているかどうかを決定する方法であって、
個体由来の生物学的サンプルにおいて少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態を決定する工程；および
個体がアルコールを使用しているかどうかを決定するために、少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態を相関付ける工程
を含む、方法。
[本発明1002]
少なくとも1つのCpGジヌクレオチドが、第10染色体の第71389896位を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
第10染色体の第71389896位の脱メチル化が、過去または現在のアルコール使用を示す、本発明1002の方法。
[本発明1004]
第10染色体の第71389896位の再メチル化が、アルコール使用の減少またはアルコール不使用を示す、本発明1003の方法。
[本発明1005]
少なくとも1つのCpGジヌクレオチドが、第12染色体の第54677008位を含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
第12染色体の第54677008位の脱メチル化が、過去または現在のアルコール使用を示す、本発明1005の方法。
[本発明1007]
第12染色体の第54677008位の再メチル化が、アルコール使用の減少またはアルコール不使用を示す、本発明1006の方法。
[本発明1008]
少なくとも1つのCpGジヌクレオチドが、第8染色体の第75262522位を含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
第8染色体の第75262522位の脱メチル化が、過去または現在のアルコール使用を示す、本発明1008の方法。
[本発明1010]
第8染色体の第75262522位の再メチル化が、アルコール使用の減少またはアルコール不使用を示す、本発明1009の方法。
[本発明1011]
少なくとも1つのCpGジヌクレオチドが、第9染色体の第92137791位を含む、本発明1001の方法。
[本発明1012]
第9染色体の第92137791位の脱メチル化が、過去または現在のアルコール使用を示す、本発明1011の方法。
[本発明1013]
第9染色体の第92137791位の再メチル化が、アルコール使用の減少またはアルコール不使用を示す、本発明1012の方法。
[本発明1014]
決定する工程が、
生物学的サンプル中のDNAをアルカリ条件下でバイサルファイトと接触させて、バイサルファイト処理DNAを生成すること；
任意で、バイサルファイト処理DNAを増幅させて、増幅されたバイサルファイト処理DNAを生成すること；
バイサルファイト処理DNAを、少なくとも1つのCpGジヌクレオチドを含む配列に対して相補的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチドと接触させること；および
少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態を検出すること
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1015]
少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが、非メチル化状態にあるバイサルファイト処理DNA内のCpGジヌクレオチドを検出する、本発明1014の方法。
[本発明1016]
少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが、メチル化状態にあるバイサルファイト処理DNA内のCpGジヌクレオチドを検出する、本発明1014の方法。
[本発明1017]
生物学的サンプルが、末梢血、リンパ球、尿、唾液および口腔細胞からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1018]
少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態が、バイサルファイト処理DNAを用いて決定される、本発明1001の方法。
[本発明1019]
個体がアルコール使用者であるかどうかに関する自己申告データを個体から入手する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1020]
個体がアルコールを使用しているかどうかを決定するためにコンピュータにより実行される方法であって、以下の工程を含む、方法：
使用者に関連する測定データを入手する工程であって、測定データが1つまたは複数の測定されたCpGメチル化状態を含む、工程；
入手された測定データに基づき予測スコアを生成する工程；および
予測スコアに基づき使用者によるアルコール使用の可能性を提供する工程。
[本発明1021]
使用者のCpGメチル化状態を決定する工程をさらに含み、メチル化状態の変化がアルコール使用を示す、本発明1020の方法。
[本発明1022]
予測スコアに基づき予測されるアルコール使用レベルを出力する工程をさらに含む、本発明1020の方法。
そうでないことが定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本方法および組成物が属する技術の分野における通常の知識を有する者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本方法および組成物を実施および試験する際には本明細書に記載されているのと同様または同等の方法および材料を使用することができるが、以下には適当な方法および材料が記載されている。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定を意図したものではない。本明細書で言及されているすべての刊行物、特許出願、特許およびその他の参考文献は、それらの全体が参照により組み入れられる。
詳細な説明
ゲノムワイドアプローチを用いて、本開示は、断酒対照との比較で、アルコール使用がDNAメチル化の幅広い変化に関連することを示す。本開示はまた、DNAメチル化の変化が断酒の関数として逆戻りする傾向を有することを示す。したがって、DNAのメチル化は、アルコール使用状態を評価するためおよび／またはアルコール処置応答を監視するために臨床的に使用することができる。
ゲノムワイドアプローチを用いて、本開示は、断酒対照との比較で、アルコール使用がDNAメチル化の幅広い変化に関連することを示す。本開示はまた、DNAメチル化の変化が断酒の関数として逆戻りする傾向を有することを示す。したがって、DNAのメチル化は、アルコール使用状態を評価するためおよび／またはアルコール処置応答を監視するために臨床的に使用することができる。
核酸のメチル化および核酸のメチル化状態の決定
CpGアイランドは、CpG配列の出現率が他の領域よりも高いDNAのストレッチである。CpGという用語における「p」は、システイン（「C」）ヌクレオチドとグアニン（「G」）ヌクレオチドを結合するホスホジエステル結合を表す。CpGアイランドは、多くの場合、プロモーター付近に位置し、かつ多くの場合、遺伝子（例えば、ハウスキーピング遺伝子）の発現の調節に関与する。一般に、CpGアイランドは、配列が発現される際にはメチル化されず、発現を抑制する（またはその遺伝子を「不活性化」する）ためにメチル化される。
CpGアイランドは、CpG配列の出現率が他の領域よりも高いDNAのストレッチである。CpGという用語における「p」は、システイン（「C」）ヌクレオチドとグアニン（「G」）ヌクレオチドを結合するホスホジエステル結合を表す。CpGアイランドは、多くの場合、プロモーター付近に位置し、かつ多くの場合、遺伝子（例えば、ハウスキーピング遺伝子）の発現の調節に関与する。一般に、CpGアイランドは、配列が発現される際にはメチル化されず、発現を抑制する（またはその遺伝子を「不活性化」する）ためにメチル化される。
ゲノムDNA内または特定の核酸配列（例えば、CpGアイランド）内での1つまたは複数のCpGジヌクレオチドのメチル化状態は、任意の数の生物学的サンプル、例えば血液、尿（例えば、尿に含まれる膀胱および／もしくは尿道由来の細胞）、唾液または口腔細胞を用いて決定され得る。特定の態様において、特定の細胞型、例えばリンパ球、好塩基球または単球が（例えば、血液サンプルから）取得され、そしてそのDNAがそのメチル化状態に関して評価され得る。
ゲノムDNA、CpGアイランドまたは1つもしくは複数の特定のCpGジヌクレオチドのメチル化状態は、当業者により、任意の多くの方法を用いて決定され得る。DNAのメチル化状態を評価する最も一般的な方法は、DNAに対するバイサルファイトベースの反応から開始される（例えば、Frommer et al., 1992, PNAS USA, 89(5): 1827-31を参照のこと）。DNAのバイサルファイト修飾に関しては、市販のキットが入手可能である。例えば、EpiTect BisulfiteまたはEpiTect Plus Bisulfite Kits（Qiagen）を参照のこと。
バイサルファイト修飾後、核酸は増幅され得る。バイサルファイトによるDNAの処理は非メチル化シトシンヌクレオチドを脱アミノ化してウラシルにするため、かつウラシルはアデノシンと対を形成するため、その後のPCR増幅の間に、非メチル化シトシンヌクレオチドの位置でチミジンがDNA鎖に組み込まれる。
いくつかの態様において、DNAのメチル化状態は、1つまたは複数の核酸ベースの方法を用いて決定され得る。例えば、バイサルファイト処理DNAの増幅産物が当技術分野で一般的な組み換え分子生物学技術を用いてクローニングされ直接配列決定され得る。バイサルファイト処理DNAの1つまたは複数のヌクレオチドのメチル化状態を含む元の配列の決定を支援するためにソフトウェアプログラムが利用可能である（例えば、CpG Viewer（Carr et al., 2007, Nucl. Acids Res., 35:e79））。また、例えば、バイサルファイト処理DNAの増幅産物は、例えばメチル化されたバイサルファイト処理DNA配列に特異的なまたは非メチル化バイサルファイト処理DNA配列に特異的な1つまたは複数のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされ得る。
いくつかの態様において、DNAのメチル化状態は、非核酸ベースの方法を用いて決定され得る。代表的な非核酸ベースの方法は、バイサルファイト処理DNAの配列特異的な切断およびその後の質量分析（例えば、MALDI-TOF MS）によるメチル化比（メチルCpG/総CpG）の決定に基づく（例えば、Ehrich et al., 2005, PNAS USA, 102: 15785-90を参照のこと）。そのような方法は、商業的に利用可能である（例えば、MassARRAY Quantitative Methylation Analysis（Sequenom, San Diego, CA））。
メチル化状態がアルコール使用と関連する核酸配列
特定のゲノムDNAのメチル化状態が、アルコールを使用する個体において（非使用者との比較で）変化することが示されている。例えば、各々その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Philibert et al. (2008, Am. J. Med. Genet. B Neuropsychiatr. Genet., 147B; 565-70); Philibert et al. (2008, Am. J. Med. Genet. B Neuropsychiatr. Genet., 147B: 543-9); Philibert et al. (2009, Psychiatr. Genet., 19: 91-8); Philibert et al. (2012, Front Genet., 3:54); および米国特許第8,637,652号を参照のこと。
特定のゲノムDNAのメチル化状態が、アルコールを使用する個体において（非使用者との比較で）変化することが示されている。例えば、各々その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Philibert et al. (2008, Am. J. Med. Genet. B Neuropsychiatr. Genet., 147B; 565-70); Philibert et al. (2008, Am. J. Med. Genet. B Neuropsychiatr. Genet., 147B: 543-9); Philibert et al. (2009, Psychiatr. Genet., 19: 91-8); Philibert et al. (2012, Front Genet., 3:54); および米国特許第8,637,652号を参照のこと。
本開示は、アルコール使用（例えば、重度のアルコール使用）と相関する1つまたは複数のCpGアイランドおよび／または特定のCpGジヌクレオチドのメチル化状態のさらなる変化について説明する。例えば、非飲酒者との比較でアルコール使用者のメチル化状態の変化に最も有意に関連した上位30個のプローブを示す表II、およびアルコール使用者と非飲酒者との間で示差的に調節される上位30個の遺伝子経路を示す表IIIを参照のこと。メチル化状態がアルコール使用と関連したCpGジヌクレオチドの任意の1つまたは複数が、（例えば、アルコール使用の可能性を表す）予測値を決定するために、本明細書の方法において使用され得る。特にアルコール使用を決定するために、より多くのCpGジヌクレオチド（すなわち、メチル化状態がアルコール使用と関連したCpGジヌクレオチド）が評価されるほど、より正確な予測値となるであろうことが理解されるであろう。
加えて、1つまたは複数の隣接するCpGジヌクレオチドのメチル化状態は、アルコール使用に関して有意性を有するCpGジヌクレオチドのメチル化状態（例えば、Philibert et al., 2009, Am. J. Med. Genet. B. Neuropsychiatr. Genet., 153B: 619-28を参照のこと）と連鎖不平衡な関係にあり得、したがってそれらの隣接するCpGジヌクレオチド（例えば、アルコール使用に関して有意性を有するCpGジヌクレオチドの上流および／または下流の約200ヌクレオチド（例えば、上流および／もしくは下流の約100ヌクレオチド；上流および／もしくは下流の約50ヌクレオチド；上流および／もしくは下流の約25ヌクレオチド；上流および／もしくは下流の約20ヌクレオチド；上流および／もしくは下流の約10ヌクレオチド；または上流および／もしくは下流の約5ヌクレオチド））が本明細書に記載される方法において使用され得ることも理解されるであろう。さらに、いくつかの例において、メチル化状態の変化が大きいほど（またはより有意であるほど）、アルコール使用度がより高いことが理解されるであろう。例えば、Philibert et al., 2012, Epigenetics, 7:1-8を参照のこと。
核酸およびそれに関連する方法
本明細書で使用される場合、核酸は、DNAおよびRNAを含み得、かつ1つまたは複数のヌクレオチドアナログまたは骨格修飾を含む核酸を含む。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得、それは通常その意図される用途に依存する。
本明細書で使用される場合、核酸は、DNAおよびRNAを含み得、かつ1つまたは複数のヌクレオチドアナログまたは骨格修飾を含む核酸を含む。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得、それは通常その意図される用途に依存する。
本明細書で使用される場合、「単離」された核酸分子は、その単離された核酸分子の由来となった生物のゲノムにおいて自然状態ではその核酸の一方または両方の末端に隣接する配列を含まない核酸分子（例えば、cDNAまたはPCRもしくは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成されるゲノムDNAフラグメント）である。そのような単離された核酸分子は、通常、操作上の利便性のためにまたは以下でより詳細に議論されている融合核酸分子を生成するために、ベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）に導入される。加えて、単離された核酸分子は、人工核酸分子、例えば組み換えまたは合成核酸分子を含み得る。
核酸は、当技術分野で一般的な技術を用いて単離され得る。例えば、核酸は、非限定的に、組み換え核酸技術および／またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を含む任意の方法を用いて単離され得る。一般的なPCR技術は、例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995に記載されている。組み換え核酸技術は、例えば、制限酵素消化および連結を含み、これらは核酸を単離するために使用され得る。単離された核酸はまた、単一の核酸分子としてまたは一連のオリゴヌクレオチドとしてのいずれかで化学的に合成され得る。
核酸（例えば、ポリペプチドをコードする核酸）を含むベクターも提供される。発現ベクターを含むベクターは、市販されており、また当技術分野で一般的な組み換えDNA技術によって作製され得る。核酸を含むベクターは、そのような核酸に機能的に連結された発現エレメントを有し得、さらに、選択マーカーをコードする配列等の配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を含み得る。核酸を含むベクターは、キメラまたは融合ポリペプチド（すなわち、そのポリペプチドのN末端またはC末端のいずれかにおいてであり得る、異種ポリペプチドに機能的に連結されたポリペプチド）をコードし得る。代表的な異種ポリペプチドは、コードされるポリペプチドの精製に使用され得るもの（例えば、6xHisタグ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST））である。
発現エレメントは、核酸コード配列の発現を誘導および調節する核酸配列を含む。発現エレメントの1つの例は、プロモーター配列である。発現エレメントはまた、イントロン、エンハンサー配列、応答エレメントまたは核酸の発現を調整する誘導エレメントを含み得る。発現エレメントは、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物またはウイルス起源のものであり得、ベクターは異なる起源由来のエレメントの組み合わせを含み得る。本明細書で使用される場合、機能的に連結は、プロモーターまたは他の発現エレメントが、ベクター内で、核酸に対して、その核酸の発現を誘導または調節するように（例えば、インフレームとなるように）配置されることを意味する。インビボおよびインビトロの両方で核酸を宿主細胞に導入する多くの方法が当業者に周知であり、非限定的に、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、ポリエチレングリコール（PEG）形質転換、熱ショック、リポフェクション、マイクロインジェクションおよびウイルス媒介核酸移入を含む。
本明細書に記載されるベクターは、宿主細胞に導入され得る。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」は、核酸が導入される特定の細胞を表し、そのような細胞の子孫または潜在的子孫も含む。宿主細胞は、任意の原核生物または真核生物細胞であり得る。例えば、核酸は、細菌細胞、例えば大腸菌（E.coli）、または昆虫細胞、または酵母もしくは哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）もしくはCOS細胞）において発現され得る。他の適当な宿主細胞は、当業者に公知である。
増幅またはハイブリダイゼーションのためのオリゴヌクレオチドは、例えば、コンピュータプログラム、例えばOLIGO（Molecular Biology Insights, Inc., Cascade, CO）を用いて設計され得る。増幅プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドを設計する際に重要な特徴は、（例えば、電気泳動による）検出を容易にする適当なサイズの増幅産物、プライマー対のメンバー間での類似の融解温度、および各プライマーの長さ（すなわち、プライマーは、配列特異性をもってアニールし合成を開始するのに十分長い必要があるが、オリゴヌクレオチド合成の間に忠実性が低下するほど長くてはいけない）を含むがこれらに限定されない。典型的に、オリゴヌクレオチドプライマーは、15〜30（例えば、16、18、20、21、22、23、24または25）ヌクレオチド長である。ハイブリダイゼーションプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドの設計は、増幅プライマーの設計と同様の様式で実施され得る。いくつかの態様において、ハイブリダイゼーションプローブは、異なる配列（例えば、多型または変異、例えばバイサルファイト処理DNA内のメチル化対非メチル化配列）を含む2つの標的を区別するよう設計され得る。
核酸間のハイブリダイゼーションは、Sambrook et al.（1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; 第7.37〜7.57, 9.47〜9.57, 11.7〜11.8および11.45〜11.57節）で詳細に議論されている。Sambrook et al.は、約100ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチドプローブに対する適当なサザンブロット条件を開示している（第11.45〜11.46節）。100ヌクレオチド長未満の配列と第2の配列の間のTmは、第11.46節に提供される式を用いて計算され得る。Sambrook et al.はさらに、約100ヌクレオチド超のオリゴヌクレオチドプローブに対するサザンブロット条件を開示している（第9.47〜9.54節を参照のこと）。100ヌクレオチド長超の配列と第2の配列の間のTmは、Sambrook et al.の第9.50〜9.51節に提供される式を用いて計算され得る。
核酸を含むメンブレンをプレハイブリダイズおよびハイブリダイズさせる条件ならびに過剰なおよび非特異的に結合したプローブを除去するために核酸を含むメンブレンを洗浄する条件は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに関して重要な役割を果たし得る。そのようなハイブリダイゼーションおよび洗浄は、適当な場合、中程度または高度なストリンジェンシー条件下で行われ得る。例えば、洗浄条件は、洗浄溶液内の塩濃度を減少させることによっておよび／または洗浄を行う温度を上昇させることによってよりストリンジェントにすることができる。例にすぎないが、高いストリンジェンシー条件は、典型的に、0.2X SSC中、65℃でのメンブレンの洗浄を含む。
加えて、ハイブリダイゼーションの量の解釈は、例えば、標識されたオリゴヌクレオチドプローブの比活性によって、プローブがハイブリダイズしたテンプレート核酸上のプローブ結合部位の数によって、およびオートラジオグラフまたは他の検出媒体の露光の量によって、影響され得る。固定された標的核酸に対するプローブ核酸分子のハイブリダイゼーションを試験するために任意の多くのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を使用することができるが、同一のハイブリダイゼーション、洗浄および露光条件下で標的核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションを試験することがより重要であることが当業者に直ちに理解されるであろう。好ましくは、標的核酸は、同一メンブレン上に存在する。
核酸分子は、ある核酸に対するハイブリダイゼーションが別の核酸に対するハイブリダイゼーションよりも少なくとも5倍（例えば、少なくとも6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍または100倍）高い場合、ある核酸にハイブリダイズするが別の核酸にはハイブリダイズしないとみなされる。ハイブリダイゼーションの量は、例えば、PhosphorImagerまたはDensitometer（Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA）を用いて、メンブレン上で直接またはオートラジオグラフから定量され得る。
核酸配列またはポリペプチド配列は、パーセント配列同一性を用いて、それぞれ、1つまたは複数の関連する核酸配列またはポリペプチド配列と比較され得る。パーセント配列同一性を計算する際、2つの配列がアラインメントされ、その2つの配列間でヌクレオチドまたはアミノ酸残基の完全一致数が決定される。完全一致数を、アラインメントさせた領域の長さ（すなわち、アラインメントさせたヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数）で割り、100をかけることで、パーセント配列同一性値が得られる。アラインメントさせた領域の長さは、最大で最も短い配列の全長サイズである一方または両方の配列の一部であり得ることが理解されるであろう。単一の配列を2つ以上の他の配列とアラインメントさせることができること、したがって、各々のアラインメントさせた領域に対して異なるパーセント配列同一性値を有し得ることも理解されるであろう。
パーセント配列同一性値を決定するための2つまたはそれ以上の配列のアラインメントは、核酸またはポリペプチド配列のアラインメントをそれらの全長にわたって実施することができる（グローバルアラインメント）、コンピュータプログラムClustalWおよびデフォルトパラメータを用いて実施され得る。Chenna et al., 2003, Nucleic Acids Res., 31(13): 3497-500。ClustalWは、クエリーと1つまたは複数の対象配列の間の最良の一致を計算し、同一性、類似性および差を決定できるようそれらをアラインメントさせる。配列のアラインメントを最大化するために、1つまたは複数の残基のギャップがクエリー配列、対象配列または両方に挿入され得る。核酸配列のファストペアワイズアラインメント（fast pairwise alignment）の場合、デフォルトパラメータが使用され得（すなわち、ワードサイズ：2；ウィンドウサイズ：4；スコア法：百分率；トップダイアゴナル数：4；およびギャップペナルティ：5）；複数の核酸配列のアラインメントの場合、以下のパラメータが使用され得る：ギャップオープンペナルティ：10.0；ギャップエクステンションペナルティ：5.0；およびウェイトトランジション：イエス。ポリペプチド配列のファストペアワイズアラインメントの場合、以下のパラメータが使用され得る：ワードサイズ：1；ウィンドウサイズ：5；スコア法：百分率；トップダイアゴナル数：5；およびギャップペナルティ：3。ポリペプチド配列の多アラインメントの場合、以下のパラメータが使用され得る：ウェイトマトリクス：blosum；ギャップオープンペナルティ：10.0；ギャップエクステンションペナルティ：0.05；親水性ギャップ：オン；親水性残基；Gly、Pro、Ser、Asn、Asp、Gln、Glu、ArgおよびLys；ならびに残基特異的ギャップペナルティ：オン。Clustal Wは、例えば、ワールドワイドウェブ上の、Baylor College of Medicine Search LauncherのウェブサイトまたはEuropean Bioinformatics Instituteウェブサイトにおいて実施することができる。
変化は、例えば、変異誘発（例えば、部位特異的変異誘発、PCR媒介変異誘発）を用いて、またはそのような変化を有する核酸分子を化学的に合成することによって核酸コード配列に導入され得る。そのような核酸変化は、1つまたは複数のアミノ酸残基において保存的および／または非保存的アミノ酸置換をもたらし得る。「保存的アミノ酸置換」は、1つのアミノ酸残基が類似の側鎖を有する異なるアミノ酸残基で置換されるものであり（例えば、アミノ酸置換の頻度表を提供するDayhoff et al. (1978, in Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(Suppl. 3):345-352を参照のこと）、非保存的置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有さないアミノ酸残基で置換されるものである。
核酸は、適当なオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）対を用いる任意の多くの増幅技術（例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual, 1995, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYならびに米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号、同第4,800,159号および同第4,965,188号を参照のこと）を用いて検出され得る。元祖のPCRに対する多くの改良版が開発されており、これらを核酸を検出するために使用することができる。（例えば、増幅産物、ハイブリダイゼーション複合体またはポリペプチドの）検出は、通常、検出標識を用いて達成される。「標識」という用語は、直接的標識および間接的標識の使用を包含することが意図されている。検出標識は、酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射活性物質を含む。
製品またはキット
本開示はまた、1つまたは複数のCpGジヌクレオチドおよび／またはCpGアイランドのメチル化状態を決定するために使用され得る製品を提供する。本明細書で提供される製品は、適当な包装材と共に、1つまたは複数のCpGジヌクレオチドおよび／またはCpGアイランドのメチル化状態を決定するための1つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含み得る。1つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、非メチル化状態またはメチル化状態にあるバイサルファイト処理DNA内のCpGジヌクレオチドを検出することができる。
本開示はまた、1つまたは複数のCpGジヌクレオチドおよび／またはCpGアイランドのメチル化状態を決定するために使用され得る製品を提供する。本明細書で提供される製品は、適当な包装材と共に、1つまたは複数のCpGジヌクレオチドおよび／またはCpGアイランドのメチル化状態を決定するための1つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含み得る。1つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、非メチル化状態またはメチル化状態にあるバイサルファイト処理DNA内のCpGジヌクレオチドを検出することができる。
製品はさらに、本明細書に開示される方法（例えば、DNAのバイサルファイト処理、増幅、配列決定、ハイブリダイゼーション）を実施するための試薬（例えば、緩衝液、酵素、補因子）を含み得る。本明細書に提供される製品はまた、生物学的サンプル中の1つもしくは複数のCpGジヌクレオチドおよび／または1つもしくは複数のCpGアイランドのメチル化状態を決定するために製品内の要素を使用するための指示を有するパッケージインサートまたはパッケージラベルを含み得る。
本発明にしたがい、当技術分野の従来的な分子生物学、微生物学、生化学および組み換えDNA技術が使用され得る。そのような技術は、文献に十分に説明されている。本発明は、以下の実施例においてさらに解説されるが、これらの実施例は特許請求の範囲に記載される方法および組成物の範囲を限定するものではない。
実施例1 - 材料および方法
この研究で使用したすべてのプロトコルおよび手順は、University of Iowa Institutional Review Boardによる承認を受けており、請求により完全な詳細が本発明者らから入手可能である。本明細書に記載される症例対象は、アイオワ大学病院およびクリニックまたはアイオワ州内の2ヶ所のアルコール治療センターから採用した。簡潔に述べると、病院またはアルコール治療センターへの入院後、および、断酒と深刻な認知機能障害が存在しないこととの両方が達成された後、候補対象に対して、施設職員が本研究への参加に関する彼らの潜在的関心について聞き取りを行った。関心を示した場合、この情報を調査チームに伝達し、その後に調査チームのメンバーが候補対象に接触して詳細な情報を提供し、本研究に関する適性について個体を選定した。参加基準は、承諾能力、タバコ以外の顕著な活性物質使用障害の非存在、DNAのメチル化に影響すると仮定される薬物治療の非存在、癌、胃腸障害、糖尿病、慢性閉塞性肺疾患または重度の心疾患を含む医学的障害の非存在、および通常、その他の点で全般的に良好な健康状態を含むものであった。除外対象とならず参加の意思がある場合、対象の同意を得て研究手順を開始した。
この研究で使用したすべてのプロトコルおよび手順は、University of Iowa Institutional Review Boardによる承認を受けており、請求により完全な詳細が本発明者らから入手可能である。本明細書に記載される症例対象は、アイオワ大学病院およびクリニックまたはアイオワ州内の2ヶ所のアルコール治療センターから採用した。簡潔に述べると、病院またはアルコール治療センターへの入院後、および、断酒と深刻な認知機能障害が存在しないこととの両方が達成された後、候補対象に対して、施設職員が本研究への参加に関する彼らの潜在的関心について聞き取りを行った。関心を示した場合、この情報を調査チームに伝達し、その後に調査チームのメンバーが候補対象に接触して詳細な情報を提供し、本研究に関する適性について個体を選定した。参加基準は、承諾能力、タバコ以外の顕著な活性物質使用障害の非存在、DNAのメチル化に影響すると仮定される薬物治療の非存在、癌、胃腸障害、糖尿病、慢性閉塞性肺疾患または重度の心疾患を含む医学的障害の非存在、および通常、その他の点で全般的に良好な健康状態を含むものであった。除外対象とならず参加の意思がある場合、対象の同意を得て研究手順を開始した。
承認から7日後までに行われ得るインデックス取得（Time 1またはT1）時に、すべての症例対象に、過去6ヶ月にわたる物質の使用を評価するための特別項目を含む改訂版のthe Semi-Structured Assessment for the Genetics of Alcoholism, Version 2 (SSAGA-II; Bucholz et al., 1994, J. Stud. Alcohol, 55:149-58)を用いてインタビューを行った。加えて、本研究のための生体物質を提供するために、対象に静脈穿刺を行った。次いで、およそ4週間後（Time 2またはT2）、医学的状態の変化を評価するために同じ対象に再度インタビューを行い、静脈穿刺を行った。
対照対象は、アイオワシティ地域から採用した。研究への参加基準は、症例対象のそれと同様であり、全般的に良好な健康状態、少なくとも6ヶ月間の完全なアルコールからの断絶、DNAのメチル化に影響すると仮定される薬物治療の非存在、およびタバコ以外の重要物質の非存在を含むものであった。すべての対照対象に、症例対象と同じ手段を用いてインタビューを行い、本研究のための生体物質を提供するために静脈穿刺を行った。
血清および単核細胞（すなわち、リンパ球）ペレットを、以前に記載されたようにして調製した（Philibert et al., 2012, Epigenetics, 7:1331-8）。自己申告の信頼性を評価する努力の一環として、Abnova（Taiwan）から供給された酵素連結免疫アッセイ（ELISA）キットを製造元の指示および以前のプロトコル（Philibert et al., 2013, Epigenetics, 5:19-26）にしたがい用いて血清中のコチニンおよびテトラヒドロカンナビノールレベルを評価した。DNAを、QiaAmpキット（Qiagen, Germany）を製造元の指示にしたがい用いてリンパ球細胞ペレットから調製した。
ゲノムワイドDNAメチル化は、以前に記載されたようにUniversity of Minnesota Genome Center（Minneapolis, MN）によって製造元に指定されたプロトコルを用いてIllumina（San Diego, CA）HumanMethylation450 Beadchipを用いて評価された（Monick et al., 2012, Am. J. Med. Genet., Part B Neuropsychiatric Genet., 159:141-51）。このチップは、（Genome Reference Consortium human genome build 37 (GRCh37)からの）少なくとも20216個の転写物、候補転写物、またはCpGアイランドを認識する、485,577個のプローブを含む。
得られたデータを、完全なバイサルファイト変換について調査し、Illumina Genome Studio Methylation Module, Version 3.2を用いて決定された各々の標的化されたCpG残基について平均ベータ値を決定した。次いで観察された配列がランダムノイズである可能性の指標である検出p値が0.05より大きいベータ値を除去して、得られたデータを、PERLベースのアルゴリズムを用いてきれいにした。次いで、完全評価成功率が＜99.5％であるアレイからのデータを除去した。
残ったデータを、MethLAB（Kilaru et al., 2012, Epigenetics, 7:225-9）にインポートし、チップおよびバッチ変数を制御する標準的な一般線形モデルアプローチを使用してアルコール使用状況に関して分析した。得られたp値を、偽発見率またはボンフェローニ補正モデルのいずれかを用いてゲノムワイド比較のために補正した（Benjamini et al., 1995, J. Royal Stat. Soc. Series B, Method., 57:289-300）。
本質的に、ゲノムワイド線形回帰、この例ではバッチおよびスライドの共変量を計上するt検定を使用した。「バッチ」は、バイサルファイト変換に関するグループ分けを表すDNAメチル化に関する用語である（例えば、「バッチ」は、バイサルファイト変換の程度またはその欠如を考慮に入れる）。「スライド」は、例えば、同一サンプルのハイブリダイゼーションの程度に関してスライド間変量が存在し得ることから、ハイブリダイゼーションが実施される個々のチップまたはアレイを表す。バッチおよびスライド変量の計上は通常より高い有意性をもたらすことが理解されるであろう。
実施例2 - 実験結果
本研究に含まれる症例および対照対象の臨床的および人口学的特徴が表Iに記載されている。簡潔に説明すると、アイオワの住民およびアルコール処置のための患者の推薦上の特徴全体を反映して、対象は40代である傾向があり、主として白人男性であった。症例対象は、極めて重度のアルコール使用者であり、典型的な対象は、承認前の少なくとも前週の間に平均消費がウォッカ5分の1ガロンおよびビール12パックである者であった。静脈穿刺の時点と彼らの最後の飲酒の間の遅延は、平均4日間であり、1〜8日の間でばらつきがあった。驚くべきことではないが、症例対象には、喫煙障害を有する者が多く含まれており、彼らの85％が毎日喫煙をする者であった。彼らはまた、THC使用率が高く、10名の対象が限界付近または明らかに陽性のヒドロキシ-THCレベルを有していた。各々およびあらゆる症例において、血清コチニンおよびTHC ELISA試験の結果は、自己申告データと一致した。本研究にいたる期間の間に確定された41名の症例Time 1（T1）対象のうち、26名のみがTime 2（T2）評価を完了した。失敗の理由は様々であった。いくつかの症例では、対象はすでに処置を止め、飲酒を開始しており、他の例では、対象はすでに処置を止め、第2段階の評価を完了することができないかまたはそれを望まないかのいずれかであった。
本研究に含まれる症例および対照対象の臨床的および人口学的特徴が表Iに記載されている。簡潔に説明すると、アイオワの住民およびアルコール処置のための患者の推薦上の特徴全体を反映して、対象は40代である傾向があり、主として白人男性であった。症例対象は、極めて重度のアルコール使用者であり、典型的な対象は、承認前の少なくとも前週の間に平均消費がウォッカ5分の1ガロンおよびビール12パックである者であった。静脈穿刺の時点と彼らの最後の飲酒の間の遅延は、平均4日間であり、1〜8日の間でばらつきがあった。驚くべきことではないが、症例対象には、喫煙障害を有する者が多く含まれており、彼らの85％が毎日喫煙をする者であった。彼らはまた、THC使用率が高く、10名の対象が限界付近または明らかに陽性のヒドロキシ-THCレベルを有していた。各々およびあらゆる症例において、血清コチニンおよびTHC ELISA試験の結果は、自己申告データと一致した。本研究にいたる期間の間に確定された41名の症例Time 1（T1）対象のうち、26名のみがTime 2（T2）評価を完了した。失敗の理由は様々であった。いくつかの症例では、対象はすでに処置を止め、飲酒を開始しており、他の例では、対象はすでに処置を止め、第2段階の評価を完了することができないかまたはそれを望まないかのいずれかであった。
（表I）研究対象の臨床的および人口学的特徴
これに対して、年齢、性別および民族性は類似しているものの、33名の対照対象は、タバコおよび大麻の両方の使用率が低かった。実際、対照対象のうちの1名のみが現在毎日喫煙する者であり、すべての対照対象がこの1年内の大麻使用を否定した。症例対象の結果とは対照的に、血清ELISA試験において１つの不一致が観察された（すなわち、THCに関して1つの陽性試験が存在した）。
ゲノムワイドメチル化データを、2つのリンパ芽球DNA標準および1つの内部複製を含む、95サンプルで取得に成功した（全プローブの＞99.5％で測定）。これは、33名の対照、33名のT1の症例対象、および26名のT2の症例対象を含むものであった。内部複製間の相関は、0.998より高かった。対照ならびにT1およびT2における対象の平均ベータ値は、それぞれ、0.4788、0.4800、および0.4833であった。
これらの実験からの結果ならびに本願で特許請求されるCpG残基、領域および遺伝子は、添付書類Aに示されている。添付書類Aに含まれるデータは、IlluminaプローブID、公的に入手可能な配列ならびに配列情報およびマッピング情報によって示される関心対象のCpGの属性を提供する。最後に、アルコール使用対象のメチル化を対照のそれと比較するt検定のp値が提供されている。p＜0.05が有意とみなされ、添付書類Aに列挙されるプローブについての完全なアノテーションファイルは公的に入手可能である。
詳細には、カラムA、「プローブ名」：プローブのIllumina名。カラムB、「標的領域」：その領域のゲノム配列、その領域の中心、CpG残基が括弧付きで示されている（例えば、［CG］）。カラムC、「CHR」：標的領域が見出される染色体。カラムD、「マップ情報」： GRCH37アッセンブリにおいてCpG残基が見出される塩基対；シトシンおよびグアニンヌクレオチドは相補的なので、CpG残基はセンスおよびアンチセンスの両鎖において見出されることに留意されたい。カラムE、「UCSC参照遺伝子名」；存在する場合、CpG残基が見出される、一般に受け入れられている遺伝子名、カラムF、「p値」：アルコール使用症例のメチル化と対照のそれを比較するt検定の有意性。
32名のT1対象および33名の健常非飲酒対照由来のDNAのメチル化状態の比較からの30の最も有意な結果の一覧が、表IIに列挙されている。全体として、偽発見率（FDR）法を用いたゲノムワイド補正の後、合計8636個のプローブが示差的にメチル化されたが、より保守的なボンフェローニ補正を用いた場合、56の比較のみが統計的に有意であった。この比較に関するQQプロットの試験は、これらの観察された差の根拠が有意であり、正の歪み（より多数のより有意なp値）が特に顕著に表れていた（図１）。
（表II）症例および対照分析における30個の最も有意に関連したプローブ
すべての平均メチル化値は、非対数変換ベータ値である。アイランドのステータスは、そのアイランドに対するプローブの位置を表す。分類は、以下を含む：(1）アイランド；(2）北（N)ショア；(3）南（S）ショア；(4）北（N）シェルフ；(5）南（S)シェルフ；および（6）プローブがアイランドにマップされないことを示す、空白。
高リスク集団、例えばこれらの症例対象において頻繁にみられる懸念事項は、共存物質の影響である。特に、喫煙はDNAのメチル化に対して強い影響を有し（例えば、Dogan et al., 2014, BMC Genomics, 15:151を参照のこと）、33名の症例対象のうち27名は現喫煙者であったので、これは、本研究の懸念事項である。これに関して、タバコ使用と強く相関することが示されている（例えば、Dogan et al., 2014, BMC Genomics, 15:151を参照のこと）cg05575921が、31位にランクされたプローブであった。しかし、全体として、アルコール消費に関するシグナルと喫煙に関するシグナルの間に有意な重複はなかった。Dogan et al. (2014, BMC Genomics, 15:151)において喫煙に関してゲノムワイドな有意性が見られた910個のプローブのうちの22個しか、本研究における上位10,000個の最も高度に関連するプローブの中にランクされなかった。逆に、Dogan et al.における喫煙に関する10,000個の最も高度に関連するプローブの総合ランクは、（485,577のうちの）302,264であり、分布の中央値は318,258番であった。したがって、アルコールを使用する対象とタバコを使用する対象の間のメチル化指標にはほとんど重複がないようである。
次の分析ステップとして、1000個の最も有意に関連したプローブの差の分布を、GoMiner（商標）アルゴリズム（Zeeberg et al., 2003, Genome Biol., 4:R28）を用いて分析した。表IIIに示されている結果は、プログラムされた細胞死（アポトーシス）またはGTPaseシグナル伝達に関係する経路への最も高度に関連したプローブの顕著な集中を示した。
多くのバイオマーカー研究の主たる目標は、そのマーカーが病理学的状態を対照状態から区別するのに使用することができるかどうかを決定することであり、本研究の二次的な目標は、DNAメチル化がアルコール断酒を監視するのに使用することができるかどうかを決定することであった。その評価の第1のステップとして、我々がT1およびT2の両方のデータを得ることに成功した25名の対象のゲノムワイドDNAメチル化パターンを比較した。これらの25名の個体から導き出されたT1およびT2の間の平均時間長は、25日であった。1つのプローブもゲノムワイド有意性のしきい値を越えず、最良の観察された非補正p値はわずか5 x 10-6であり、この分析のQQプロットは、有意な負の歪みが顕著であったことを示した（図2）。
（表III）上位３０の最も示差的に調節された遺伝子オントロジー経路
FDR = 偽発見率
T1およびT2の二次的分析は、非常に興味深いものであった。エタノールへの暴露は細胞にストレスを与え、かつ生物学的システムは変動の後にそれらの恒常的手段に回帰する傾向があるので、我々は次に、T1またはT2のどちらのエタノール摂取対象のメチル化評価が、同定された8636個のFDR有意プローブに関して対照のそれとより類似したかを調査した。明確に、全25名の対象におけるこれらのCpG残基の平均メチル化は、表IIに列挙されている全30個を含む8636個のプローブのうちの7360個で（カイ二乗p＜0.0001）、T1ドロー時間よりもT2ドロー時間で対照対象により類似した。残念ながら、対照の平均に対する平均化バージョンは、各遺伝子座でわずかであり、ベータ値の全体変化はおよそ0.005（すなわち、0.5％）であった。
実施例3 - 要旨
本明細書の実験は、アルコール使用が、アルコールを使用しない対照との比較でDNAメチル化の有意かつ広範な変化に関連することを実証している。本明細書の実験はまた、メチル化の変化度が、およそ1ヶ月の断酒後に減少する傾向があることを実証している。したがって、DNAメチル化指標は、最近のアルコール使用状況を推測するために使用することができる。本明細書に報告される結果は、アルコール処置を実施し監視する設定の選択に影響を及ぼすと考えられる。
本明細書の実験は、アルコール使用が、アルコールを使用しない対照との比較でDNAメチル化の有意かつ広範な変化に関連することを実証している。本明細書の実験はまた、メチル化の変化度が、およそ1ヶ月の断酒後に減少する傾向があることを実証している。したがって、DNAメチル化指標は、最近のアルコール使用状況を推測するために使用することができる。本明細書に報告される結果は、アルコール処置を実施し監視する設定の選択に影響を及ぼすと考えられる。
アルコール使用に関して予想された通り、アルコール使用に起因するDNAメチル化の変化の大きさは、例えばタバコ使用で観察されるものほど強くない。例えば日常的喫煙者（約60％）と非喫煙者（92％）の間のcg05575921におけるメチル化の差が30％を超え得る喫煙のそれとは対照的に、本アルコール使用研究における任意の1点での平均差は、およそ5％〜10％である傾向がある。
本明細書において方法および組成物は多くの異なる局面に関連して記載されているが、前出の様々な局面の記載は例示を意図したものであり、方法および組成物の範囲を限定しない。他の局面、利点および改良も、添付の特許請求の範囲の範囲内である。
開示される方法および組成物のために使用することができる、それらと共に使用することができる、それらの調製のために使用することができるまたはそれらの産物である方法および組成物が開示されている。これらおよび他の物質も本明細書に開示され、かつこれらの方法および組成物の組み合わせ、部分集団、相互作用、グループ等が開示されることが理解される。すなわち、これらの組成物および方法の各々の様々な個別のおよび集合的な組み合わせおよび順列に対する具体的言及は明示的には開示されていないかもしれないが、各々は本明細書において具体的に想定され記載されているのである。例えば、特定の組成物または特定の方法が開示および議論されかつ多くの組成物または方法が議論されている場合、そうでないことが具体的に示されていない限り、それらの組成物および方法の各々のかつあらゆる組み合わせおよび順列が具体的に想定されている。同様に、これらの任意の部分集団または組み合わせもまた、具体的に想定され開示されている。
Claims (10)
- 個体がエタノールを飲酒しているかどうかを決定する方法であって、
個体由来の生物学的サンプルにおいて少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態を決定する工程；および
個体がエタノールを飲酒しているかどうかを決定するために、少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態を相関付ける工程
を含み、
少なくとも1つのCpGジヌクレオチドの位置が、第10染色体の第71389896位を含み、
第10染色体の第71389896位の脱メチル化が、過去または現在のエタノール飲酒を示し、かつ
第10染色体の第71389896位の再メチル化が、エタノール飲酒の減少またはエタノール非飲酒を示す、
前記方法。 - 決定する工程が、
生物学的サンプル中のDNAをアルカリ条件下でバイサルファイトと接触させて、バイサルファイト処理DNAを生成すること；
任意で、バイサルファイト処理DNAを増幅させて、増幅されたバイサルファイト処理DNAを生成すること；
バイサルファイト処理DNAを、少なくとも1つのCpGジヌクレオチドを含む配列に対して相補的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチドと接触させること；および
少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態を検出すること
を含む、請求項1記載の方法。 - 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが、非メチル化状態にあるバイサルファイト処理DNA内のCpGジヌクレオチドを検出する、請求項2記載の方法。
- 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが、メチル化状態にあるバイサルファイト処理DNA内のCpGジヌクレオチドを検出する、請求項2記載の方法。
- 生物学的サンプルが、末梢血、リンパ球、尿、唾液および口腔細胞からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態が、バイサルファイト処理DNAを用いて決定される、請求項1記載の方法。
- 個体がエタノール飲酒者であるかどうかに関する自己申告データを個体から入手する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 個体がエタノールを飲酒しているかどうかを決定するためにコンピュータにより実行される方法であって、
飲酒者に関連する測定データを入手する工程であって、測定データが1つまたは複数の測定されたCpGメチル化状態を含む、工程；
入手された測定データに基づき予測スコアを生成する工程；および
予測スコアに基づき飲酒者によるエタノール飲酒の可能性を提供する工程
を含み、
少なくとも1つのCpGジヌクレオチドの位置が、第10染色体の第71389896位を含み、
第10染色体の第71389896位の脱メチル化が、過去または現在のエタノール飲酒を示し、かつ
第10染色体の第71389896位の再メチル化が、エタノール飲酒の減少またはエタノール非飲酒を示す、
前記方法。 - 飲酒者のCpGメチル化状態を決定する工程をさらに含む、請求項8記載の方法。
- 予測スコアに基づき予測されるエタノール飲酒レベルを出力する工程をさらに含む、請求項8記載の方法。
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