ES2955007T3 - Uso de alantoína para potenciar la resistencia a altas temperaturas en plantas - Google Patents
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Abstract
Un objetivo de la presente invención es proporcionar un medio para mejorar la resistencia a altas temperaturas en una planta. Se proporciona un agente para mejorar la resistencia a altas temperaturas en una planta, comprendiendo dicho agente alantoína como ingrediente activo. También se proporciona un método para mejorar la resistencia a altas temperaturas en una planta, comprendiendo dicho método una etapa para aplicar el agente mencionado anteriormente para mejorar la resistencia a altas temperaturas de la planta. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Uso de alantona para potenciar la resistencia a altas temperaturas en plantas
Campo técnico
La presente invención se refiere a un agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas, a un método para mejorar la resistencia al estrés por altas temperaturas, a un supresor del blanqueamiento y a un promotor de la expresión del gen de DREB2A de una planta.
Antecedentes de la técnica
Las plantas permanecen vivas mientras están expuestas a una amplia variedad de estrés ambiental, tal como alta temperatura y deshidratación. A diferencia de los animales, resulta difícil para las plantas migrar por sí solas. Por consiguiente, se ha desarrollado en las plantas un mecanismo para protegerse a sí mismas del estrés ambiental. El elemento de respuesta al estrés por deshidratación (DRE) es una secuencia cuya presencia se ha verificado como resultado de un análisis del promotor de RD29A como un gen inducible por estrés hídrico en el genoma de Arabidopsis thaliana. La proteína de unión a DRE (DREB) es un factor de transcripción aislado como una proteína que se une a DRE. Entre las DREB, DREB2A es un factor de transcripción de tipo factor de unión a elemento de respuesta a etileno/APETALA2 (de tipo AP2/ERF), que se aisló como proteína de reconocimiento de DRE (documento no de patente 3). Puesto que DREB2A se induce fuertemente por el estrés por deshidratación y estrés por alta concentración de sal, se considera que DREB2A es un factor de transcripción que funciona en condiciones de estrés por deshidratación y estrés por altas temperaturas (documento no de patente 1). La actividad de DREB2A se regula después de la traducción, y se considera que una región de 30 aminoácidos adyacente al dominio de unión a ADN de AP2/ERF desempeña un papel clave en la regulación postraduccional de proteínas. DREB2A CA derivado de DREB2A por medio de deleción de tal región tiene actividad, y Arabidopsis thaliana que sobreexpresa DREB2A CA presenta un fenotipo enano. Por tanto, se ha verificado que DREB2A cA mejora la resistencia al estrés por deshidratación en un grado significativo (documento no de patente 2).
El documento no de patente 3 y el documento de patente 1 notifican cada uno el mecanismo de una planta en la que DREB2A induce un gen diana cuando la planta recibe estrés por altas temperaturas. El documento no de patente 3 y el documento de patente 1 proponen cada uno el mecanismo, de manera que una proteína DPB3-1(o NF-YC10) interacciona con DREB2A y se promueve inducción de expresión génica de resistencia al estrés por altas temperaturas por DREB2A. Además, el documento no de patente 3 demuestra que la interacción de DPB3-1/DREB2A no afectaría a la expresión de genes inducibles por estrés por deshidratación.
El documento de patente 2 describe que se mejora la tasa de enraizamiento y se prolonga la vida de la flor cortada en una planta transgénica en la que se ha introducido el gen de DREB2A.
Mientras tanto, la alantona (5-ureidohidantona) es un producto intermedio que se genera durante el proceso de degradación de bases de ácido nucleico (bases de purina). En los cuerpos de las plantas, se genera alantona a partir de ácido 5-hidroxiisoúrico con la ayuda de alantona sintasa (AS) y luego se degrada en ácido alantoico con la ayuda de alantoinasa (ALN).
El documento no de patente 4 notifica que un mutante aln-1 derivado de Arabidopsis thaliana por deleción del gen de ALN para acumular alantona en el cuerpo de la planta tiene una mayor resistencia al estrés por deshidratación que las plantas de tipo natural.
El documento no de patente 5 notifica que el crecimiento de las plantas se promueve por medio de la aplicación de alantona a Arabidopsis thaliana.
El documento no de patente 6 describe la aplicación de ácido abscísico (ABA) a plántulas de Aradopsis sometidas a estrés térmico.
El documento de patente 3 da a conocer un método de protección de una planta del estrés por medio de la aplicación de ureido, tal como alantona, a una planta. El documento de patente 3 también da a conocer que una planta se daña por estrés oxidativo tras una alteración ambiental, tal como sequías o frío, y que una planta se protege del daño puesto que se promueve la ruta del eliminador por la alta concentración de ureido.
Lista de referencias
Documentos de patente
Documento de patente 1: WO 2013/111755
Documento de patente 2: Patente japonesa n.° 4219711
Documento de patente 3: US 2010/0333237
Documentos no de patente
Documento no de patente 1: Sakuma, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 103: 18822-18827, 2006 Documento no de patente 2: Sakuma, Y. et al., Plant Cell 18: 1292-1309, 2006
Documento no de patente 3: Sato, H., Plant Cell 26: 4954-4973, 2014
Documento no de patente 4: Watanabe, S. et al., Plant Cell Environ., 37: 1022-1036, 2014
Documento no de patente 5: Watanabe et al., Abstracts of the 55th Annual Meeting of the Japanese Society of Plant Physiologists, PF044 (0461), 2014
Documento no de patente 6: Larkindale et al., Plant Physiology 123(2): 682-695, 2002
Sumario de Invención
Problema técnico
Cuando las plantas reciben estrés por altas temperaturas, surgen problemas tales como blanqueamiento, marchitamiento o contracción de las hojas de las plantas, y ocasionalmente las plantas no pueden sobrevivir si el estrés por altas temperaturas es excesivo. Por tanto, se ha deseado una mejora en la resistencia al estrés por altas temperaturas de las plantas, tales como cultivos.
Tal como se describió anteriormente, se sabe que la alantona mejora la resistencia al estrés, tal como la resistencia al estrés por deshidratación o la resistencia al estrés por bajas temperaturas, en plantas. En el pasado, sin embargo, no se ha investigado aún la correlación entre la resistencia al estrés por altas temperaturas y la alantona.
Con respecto a la alantona, en particular, se ha estudiado la actividad de mejora de la resistencia al estrés por deshidratación en plantas.
Sin embargo, la resistencia al estrés por deshidratación es una característica diferente de la resistencia al estrés por altas temperaturas de una planta, y el mecanismo de desarrollo de la primera resistencia al estrés es diferente del mecanismo de desarrollo de la última resistencia al estrés. Por tanto, no hay correlación entre la resistencia al estrés por deshidratación y la resistencia al estrés por altas temperaturas. Según el documento no de patente 3, por ejemplo, es necesaria la interacción de DPB3-1/DREB2A con el fin de inducir resistencia al estrés por altas temperaturas por DREB2A tal como se describió anteriormente. Sin embargo, el documento no de patente 3 describe que tal interacción no está correlacionada con la inducción de resistencia al estrés por deshidratación. Tal como resulta evidente a partir de la descripción anterior, un determinado componente que es capaz de mejorar la resistencia al estrés distinto al estrés por altas temperaturas, tal como estrés por deshidratación, no siempre es capaz de mejorar la resistencia al estrés por altas temperaturas. Basándose en el hallazgo del pasado de que tal alantona tiene actividad de mejora de la resistencia a varios tipos de estrés distintos de estrés por altas temperaturas de una planta, por consiguiente, no es posible predecir la actividad de la alantona con respecto a la resistencia al estrés por altas temperaturas.
Mientras tanto, la expresión del gen de DREB2A de una planta contribuye a una mejora en la resistencia a diversos tipos de estrés, tales como resistencia al estrés por altas temperaturas o resistencia al estrés por deshidratación, tal como se describió anteriormente. Además, se sabe que la expresión del gen de DREB2A ejerce efectos ventajosos tales como una mejora de la tasa de enraizamiento o una vida prolongada de una flor cortada. A través de la aplicación de una sustancia capaz de promover la expresión del gen de DREB2A en una planta, pueden ejercerse efectos ventajosos tal como se describió anteriormente. Sin embargo, tal sustancia no se proporcionó en el pasado. Mientras que los efectos ventajosos inducidos por DREB2A pueden ejercerse en plantas transgénicas en las que se ha introducido el gen de DREB2A tal como se describe en el documento de patente 1, las plantas transgénicas no existen en la naturaleza, y la aplicación industrial de las mismas es difícil. A través de la aplicación de una sustancia existente en la naturaleza a una planta, por consiguiente, una técnica dirigida a una mejora en la expresión del gen de DREB2A en tal planta se considera que es muy útil.
En las circunstancias anteriores, un objeto de la presente invención es proporcionar un medio para mejorar la resistencia al estrés por altas temperaturas de una planta. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un medio para suprimir el blanqueamiento de una planta.
Solución al problema
Los presentes inventores encontraron efectos inesperados, de manera que se mejora la resistencia al estrés por altas temperaturas de una planta, y se suprime el blanqueamiento de una planta, al permitir que la alantαna actúe sobre la planta. Esto ha conducido a la finalización de la presente invención. Específicamente, la presente invención incluye lo siguiente.
(1) Un método para mejorar la resistencia al estrés por altas temperaturas de una planta, que comprende una etapa de aplicar a la planta el agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas que comprende alantαna como principio activo.
(2) El método según el punto (1) anterior, en el que la etapa comprende aplicar el agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas a la planta antes de que la planta reciba estrés.
(3) Un método para suprimir el blanqueamiento de una planta debido al estrés por altas temperaturas, que comprende una etapa de aplicar a una planta un supresor del blanqueamiento que comprende alantαna como principio activo.
(4) Uso de alantona para mejorar la resistencia al estrés por altas temperaturas de una planta.
(5) . El uso según la reivindicación (4), para suprimir uno o más seleccionados del grupo que consiste en el blanqueamiento de la planta debido al estrés por altas temperaturas, el marchitamiento de la planta debido al estrés por altas temperaturas y rizado de las hojas de la planta debido al estrés por altas temperaturas.
(6) Uso de alantoia para suprimir el blanqueamiento de una planta debido al estrés por altas temperaturas.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1A ilustra compartimentos en una placa de Petri usada en el experimento 1.
La figura 1B muestra fotografías de placas de Petri después de que se haya tratado Arabidopsis thaliana en diversas condiciones de choque térmico y luego hecho crecer durante 1 semana en el experimento 1.
La figura 2 muestra la viabilidad de Arabidopsis thaliana tratada en diversas condiciones de choque térmico y luego hecha crecer durante 1 semana en el experimento 1.
La figura 3 muestra fotografías de cebollas 3 días después del inicio del tratamiento de choque térmico a 45 °C durante 1,5 horas en el experimento 2. En la figura 3, la fotografía superior muestra cebollas del grupo de tratamiento con alantona (viabilidad: 33,3 %) y la fotografía inferior muestra cebollas del grupo de tratamiento con agua (viabilidad: 0 %).
La figura 4 muestra fotografías de Brassica chinensis komatsuna 7 días después del inicio del tratamiento de choque térmico a 45 °C durante 1 hora en el experimento 3. En la figura 4, la fotografía superior muestra Brassica chinensis komatsuna del grupo de tratamiento con alantona (viabilidad: 100 %) y la fotografía inferior muestra Brassica chinensis komatsuna del grupo de tratamiento con agua (viabilidad: 33,3 %).
La figura 5A ilustra compartimentos en una placa de Petri usada en el experimento 6.
La figura 5B muestra fotografías de placas de Petri en las que se había tratado Arabidopsis thaliana cultivada en medios que contenían alantona a diversas concentraciones en condiciones de choque térmico y en condiciones de control y hecho crecer durante 1 semana en el experimento 6.
La figura 6 muestra la viabilidad de Arabidopsis thaliana cultivada en medios que contenían alantona a diversas concentraciones que se habían tratado en condiciones de choque térmico y en condiciones de control y hecho crecer durante 1 semana en el experimento 6.
Descripción de realizaciones
<1. Alantona>
La alantona también se denomina “5-ureidohidantona”, y la forma libre de la misma tiene una estructura representada por la fórmula mostrada a continuación.
La alantona tiene un carbono asimétrico (indicado por “*” en la fórmula), y está o bien en forma de (R)-alantona o bien de (S)-alantona. La alantona usada en la presente invención puede ser (R)-alantona o (S)-alantona, o puede estar en forma de una mezcla de (R)-alantona y (S)-alantona.
La alantona puede estar en una forma aplicable a una planta, y puede ser una forma libre o una forma adecuada tal como un solvato (por ejemplo, un hidrato). Alternativamente, puede ser una mezcla de dos o más miembros de una forma libre, un hidrato, y similares.
<2. Plantas>
En la presente invención, las plantas diana a las que va a aplicarse alantona, una composición que contiene alantona, un agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas que comprende alantona como principio activo, un supresor del blanqueamiento que comprende alantona como principio activo, no están particularmente limitadas, y los ejemplos de las mismas incluyen diversas plantas, tales como dicotiledóneas y monocotiledóneas.
Los ejemplos de dicotiledóneas a las que va a aplicarse alantona, una composición que contiene alantona, un agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas, un supresor del blanqueamiento o un promotor de la expresión del gen de DREB2A incluyen plantas de Pharbitis, Brassica, Convolvulus, Ipomoea, Arabidopsis thaliana, Cuscuta, Dianthus, Stellaria, Minuartia, Cerastium, Sagina japonica, Arenaria, Moehringia, Pseudostellaria, Honkenya, Spergula, Silene, Lychnis, Silene firma, Caryophyllaceae, Casuarinaceae, Saururaceae, Piperaceae, Chloranthaceae, Salicaceae, Myricaceae, Juglandaceae, Betulaceae, Fagaceae, Ulmaceae, Moraceae, Urticaceae, Podostemaceae, Proteaceae, Olacaceae, Santalaceae, Loranthaceae, Aristolochiaceae, Rafflesiaceae, Balanophoraceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae, Amaranthaceae, Nyctaginaceae, Theligonaceae, Phytolaccaceae, Aizoaceae, Portulacaceae, Magnoliaceae, Trochodendraceae, Cercidiphyllaceae, Nymphaeaceae, Ceratophyllaceae, Ranunculaceae, Lardizabalaceae, Berberidaceae, Menispermaceae, Calycanthaceae, Lauraceae, Papaveraceae, Capparaceae, Brassicaceae, Droseraceae, Nepenthaceae, Crassulaceae, Saxifragaceae, Pittosporaceae, Hamamelidaceae, Platanaceae, Rosaceae, Leguminosae, Oxalidaceae, Geraniaceae, Linaceae, Zygophyllaceae, Rutaceae, Simaroubaceae, Meliaceae, Polygalaceae, Euphorbiaceae, Callitrichaceae, Buxaceae, Empetraceae, Coriariaceae, Anacardiaceae, Aquifoliaceae, Celastraceae, Staphyleaceae, Icacinaceae, Aceraceae, Hippocastanaceae, Sapindaceae, Sabiaceae, Balsaminaceae, Rhamnaceae, Vitaceae, Elaeocarpaceae, Tiliaceae, Malvaceae, Sterculiaceae, Dilleniaceae, Theaceae, Guttiferae, Elatinaceae, Tamaricaceae, Violaceae, Flacourtiaceae, Stachyuraceae, Passifloraceae, Begoniaceae, Cactaceae, Thymelaeaceae, Elaeagnaceae, Lythraceae, Punicaceae, Rhizophoraceae, Alangiaceae, Melastomataceae, Trapaceae, Onagraceae, Haloragaceae, Hippuridaceae, Araliaceae, Umbelliferae, Cornaceae, Diapensiaceae, Clethraceae, Pyrolaceae, Ericaceae, Myrsinaceae, Primulaceae, Plumbaginaceae, Ebenaceae, Symplocaceae, Styracaceae, Oleaceae, Buddlejaceae, Gentianaceae, Apocynaceae, Asclepiadaceae, Polemoniaceae, Boraginaceae, Verbenaceae, Lamiaceae, Solanaceae, Scrophulariaceae, Bignoniaceae, Pedaliaceae, Orobanchaceae, Gesneriaceae, Lentibulariaceae, Acanthaceae, Myoporaceae, Phrymaceae, Plantaginaceae, Rubiaceae, Caprifoliaceae, Adoxaceae, Valerianaceae, Dipsacaceae, Cucurbitaceae, Campanulaceae y Asteraceae.
Los ejemplos de monocotiledóneas a las que va a aplicarse alantαna, una composición que contiene alantαna, un agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas, un supresor del blanqueamiento o un promotor de la expresión del gen de DREB2A incluyen plantas de Spirodela, Lemna, Cattleya, Cymbidium, Dendrobium, Allium, Phalaenopsis, Vanda, Paphiopedilum, Orchidaceae, Typhaceae, Sparganiaceae, Potamogetonaceae, Najadaceae, Scheuchzeriaceae, Alismataceae, Hydrocharitaceae, Triuridaceae, Cyperaceae, Palmae, Araceae, Eriocaulaceae, Commelinaceae, Pontederiaceae, Juncaceae, Stemonaceae, Liliaceae, Amaryllidaceae, Dioscoreacea, Iridaceae, Musaceae, Zingiberaceae, Cannaceae y Burmanniaceae
Las plantas diana no se limitan a plantas de tipo silvestre, y mutantes, transformantes y otro tipo de planta pueden ser las dianas.
<3. Agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas y método para mejorar la resistencia al estrés por altas temperaturas>
Un aspecto de la presente invención se refiere a un agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas para mejorar la resistencia al estrés por altas temperaturas de una planta, que comprende alantαna como principio activo.
Un aspecto de la presente invención se refiere a un método para mejorar la resistencia al estrés por altas
temperaturas de una planta, que comprende una etapa de aplicar el agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas a una planta.
El término “estrés por altas temperaturas” usado en el presente documento se refiere al estrés provocado cuando una planta se expone a una temperatura superior a la temperatura de crecimiento general, tal como 25 °C o más, más específicamente 30 °C o más, y además específicamente 50 °C o menos. La duración durante la cual una planta se expone a tal temperatura en un día no está particularmente limitada. Por ejemplo, tal duración puede ser de 60 minutos o más, y específicamente 90 minutos o más, y puede ser de 600 minutos o menos.
El agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas y el método para mejorar la resistencia al estrés por altas temperaturas de una planta según la presente invención son eficaces para mejorar la resistencia al estrés por altas temperaturas. Tal agente y método son particularmente eficaces para mejorar la resistencia al estrés que una planta recibe cuando se expone a una humedad suficiente y alta temperatura.
Cuando una planta se expone a un entorno de estrés por altas temperaturas, en general, surgen daños fisiológicos, tales como blanqueamiento (clorosis) de una planta, marchitamiento de una planta o rizado de las hojas. Con el uso del agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas y el método para mejorar la resistencia al estrés por altas temperaturas de la presente invención, pueden suprimirse uno o más de tales daños fisiológicos. Como resultado de los experimentos descritos en el presente documento, entre los daños fisiológicos provocados por el estrés por altas temperaturas, se encontró que al menos uno de blanqueamiento de la planta debido a estrés por altas temperaturas (es decir, clorosis), marchitamiento de la planta debido a estrés por altas temperaturas y rizado de las hojas de la planta debido a estrés por altas temperaturas se suprimían por el agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas y el método para mejorar resistencia al estrés por altas temperaturas de la presente invención.
Con respecto al agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas y el método para mejorar resistencia al estrés por altas temperaturas de la presente invención, el mecanismo de la alantαna para mejorar la resistencia al estrés por altas temperaturas no está particularmente limitado. Por ejemplo, se predice un mecanismo, de manera que la resistencia al estrés por altas temperaturas se mejora promoviendo la expresión del gen de DREB2A en la planta. La promoción de la expresión del gen de DREB2A se describe en detalle en <5. Promotor de la expresión del gen de DREB2Ay método de promoción de la expresión del gen de DREB2A> a continuación. Con respecto al agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas y el método para mejorar la resistencia al estrés por altas temperaturas de la presente invención, otro mecanismo de la alantαna para mejorar la resistencia al estrés por altas temperaturas puede ser un mecanismo, de manera que la resistencia al estrés por altas temperaturas se mejora promoviendo la expresión del gen de DREB2A en una planta y suprimiendo la expresión del gen de factor de transcripción de choque térmico 3 (HSF3). Según el documento no de patente 1, en Arabidopsis thaliana en la que se sobreexpresa DREB2A CA, el nivel de expresión del gen de HSF3 aumenta, y la resistencia al estrés por altas temperaturas mejora entonces. Según la presente invención, el nivel de expresión del gen de DREB2A aumenta tras la aplicación de alantona a una planta mientras que el nivel de expresión del gen de HSF3 se suprime y la resistencia al estrés por altas temperaturas mejora. Por consiguiente, se deduce que la alantona mejor la resistencia al estrés por altas temperaturas de una planta debido a un mecanismo que es diferente de los mecanismos que se han conocido en el pasado. La supresión de la expresión del gen de HSF3 se describe en detalle en <5. Promotor de la expresión del gen de DREB2A y método de promoción de la expresión del gen de DREB2A> a continuación.
El agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas de la presente invención puede ser cualquier sustancia, siempre que contenga alantona y sea capaz de mejorar la resistencia al estrés por altas temperaturas de una planta. Puede ser alantona o una composición que contiene alantona que comprende alantona y otros componentes. El agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas de la presente invención puede contener alantona en una cantidad eficaz para mejorar la resistencia al estrés por altas temperaturas de una planta. El agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas de la presente invención puede estar en cualquier forma, tal como un sólido o líquido.
Cuando el agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas de la presente invención es una composición que contiene alantona, la composición puede contener además otros componentes útiles para plantas y componentes necesarios para la preparación del agente, además de alantona. Los ejemplos de otros componentes incluyen componentes fertilizantes conocidos. Los ejemplos de componentes necesarios para la preparación del agente incluyen portadores y medios líquidos.
Cuando el agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas de la presente invención es una composición que contiene alantona, el método para producir la misma no está particularmente limitado. Por ejemplo, el agente puede producirse mezclando componentes. En el caso de una composición sólida, según la necesidad, pueden realizarse operaciones tales como trituración, granulación o deshidratación. En el caso de una composición líquida, según la necesidad, pueden realizarse operaciones tales como agitación o dispersión.
El método para mejorar la resistencia al estrés por altas temperaturas de una planta de la presente invención comprende una etapa de aplicar el agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas a una planta. Se requiere que las plantas diana tengan una resistencia al estrés por altas temperaturas mejorada. Los ejemplos de las mismas incluyen plantas que se cultivan en condiciones en las que las plantas pueden recibir estrés por altas temperaturas tal como se describió anteriormente. Anteriormente se describieron especies de plantas específicas. Un método de aplicación del agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas de la presente invención a una planta no está particularmente limitado, siempre que el agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas de la presente invención o la alantαna liberada del agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas de la presente invención se ponga en contacto con una parte de una planta, tal como una raíz, tallo u hoja de una planta. El agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas de la presente invención puede aplicarse directamente a la planta, o el agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas de la presente invención puede aplicarse a un medio de cultivo, tal como suelo, en el que está fijada la planta. En la presente invención, el agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas de la presente invención puede aplicarse a una planta de una manera tal que la alantona se aplica a la planta en una cantidad eficaz para mejorar la resistencia al estrés por altas temperaturas.
Aunque el momento de la aplicación del agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas de la presente invención a una planta no está particularmente limitado, el agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas de la presente invención se aplica preferiblemente a la planta antes de que la planta reciba el estrés por altas temperaturas. El agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas de la presente invención promueve la expresión del gen de DREB2A. Tal como se describió anteriormente, se deduce que la expresión de diversos genes resistentes al estrés se induce tras la expresión del gen de DREB2A. Por consiguiente, se deduce que una planta a la que se ha aplicado el agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas de la presente invención antes de que la planta reciba el estrés por altas temperaturas ha logrado la resistencia al estrés por altas temperaturas, y se deduce que la viabilidad después de que la planta reciba el estrés por altas temperaturas es alta.
Cuando el agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas de la presente invención se aplica a la planta antes de que la planta reciba el estrés por altas temperaturas, el punto de tiempo en el que el agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas de la presente invención se aplica a la planta se designa como “T1” y el punto de tiempo en el que se inicia la exposición de la planta al estrés por altas temperaturas se designa como “T2.” En tal caso, el periodo desde T1 hasta T2 es preferiblemente de 0,5 a 10 días, más preferiblemente de 0,5 a 9 días, más preferiblemente de 0,5 a 8 días, más preferiblemente de 0,5 a 7 días, más preferiblemente de 0,5 a 6 días, más preferiblemente de 0,5 a 5 días, más preferiblemente de 0,5 a 4 días, más preferiblemente de 0,5 a 3 días, más preferiblemente de 0,5 a 2 días y más preferiblemente de 0,5 a 1,5 días. Según esta realización, la planta se expone al estrés por altas temperaturas mientras que la resistencia al estrés por altas temperaturas de la misma se ha mejorado a través de la aplicación del agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas de la presente invención. Por tanto, la viabilidad después de que se exponga al estrés por altas temperaturas es alta. El agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas de la presente invención puede aplicarse a la planta el número N de veces (N es 2 o más) antes de que la planta reciba el estrés por altas temperaturas. En tal caso, el periodo desde T1n (n es un número entero de 1 a N) en el que se aplica el agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas hasta T2 está preferiblemente dentro del intervalo descrito anteriormente. A través de la aplicación del agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas de la presente invención una pluralidad de veces, puede mejorarse adicionalmente la resistencia al estrés por altas temperaturas de la planta.
<4. Supresor del blanqueamiento y método para suprimir el blanqueamiento de plantas>
Un aspecto de la presente invención se refiere a un supresor del blanqueamiento para suprimir el blanqueamiento de una planta, que comprende alantona como principio activo.
Un aspecto de la presente invención se refiere a un método para suprimir el blanqueamiento de una planta, que comprende una etapa de aplicar el supresor del blanqueamiento a una planta.
El blanqueamiento de una planta también se denomina “clorosis”, y está provocado principalmente por el estrés por altas temperaturas.
Las plantas diana que van a someterse a la supresión del blanqueamiento en la presente invención son plantas que se requiere que se sometan a la supresión del blanqueamiento. Los ejemplos de las mismas incluyen plantas que se cultivan en el entorno en el que las plantas pueden exponerse al estrés por altas temperaturas, tales como las condiciones de temperatura tal como se describió anteriormente. Anteriormente se describieron especies de plantas específicas.
El supresor del blanqueamiento de la presente invención puede ser cualquier sustancia, siempre que contenga
alantona y sea capaz de suprimir el blanqueamiento de una planta. Puede ser alantoia o una composición que contiene alantona que comprende alantona y otros componentes. El supresor del blanqueamiento de la presente invención puede contener alantona en una cantidad eficaz para la supresión del blanqueamiento de una planta. El supresor del blanqueamiento de la presente invención puede estar en cualquier forma, tal como un sólido o líquido.
Cuando el supresor del blanqueamiento de la presente invención es una composición que contiene alantona, tal composición puede ser la misma composición que contiene alantona tal como se describió con respecto al agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas.
El método de aplicación del supresor del blanqueamiento de la presente invención a una planta no está particularmente limitado, siempre que el supresor del blanqueamiento de la presente invención o la alantona liberada del supresor del blanqueamiento de la presente invención se ponga en contacto con una parte de una planta, tal como una raíz, tallo u hoja de una planta. El supresor del blanqueamiento de la presente invención puede aplicarse directamente a la planta, o el supresor del blanqueamiento de la presente invención puede aplicarse a un medio de cultivo, tal como el suelo en el que está fijada la planta. En la presente invención, el supresor del blanqueamiento de la presente invención puede aplicarse a una planta de una manera tal que la alantona se aplica a la planta en una cantidad eficaz para la supresión del blanqueamiento.
Aunque el momento de la aplicación del supresor del blanqueamiento de la presente invención a una planta no está particularmente limitado, el supresor del blanqueamiento de la presente invención se aplica preferiblemente a la planta antes de que la planta reciba el estrés que provoca blanqueamiento (por ejemplo, estrés por altas temperaturas). El supresor del blanqueamiento de la presente invención promueve la expresión del gen de DREB2A. Tal como se describió anteriormente, se deduce que la expresión de diversos genes resistentes al estrés se induce tras la expresión del gen de DREB2A. Por consiguiente, se deduce que una planta a la que se ha aplicado el supresor del blanqueamiento de la presente invención de antemano antes de que la planta reciba estrés ha logrado la resistencia al estrés, y se deduce que el blanqueamiento provocado después de que la planta reciba el estrés se suprimirá eficazmente.
Cuando el supresor del blanqueamiento de la presente invención se aplica a la planta antes de que la planta reciba el estrés que provoca blanqueamiento, el punto de tiempo en el que se aplica el supresor del blanqueamiento de la presente invención a la planta se designa como “T1” y el punto de tiempo en el que se inicia la exposición de la planta al estrés se designa como “T2.” En tal caso, el periodo desde T1 hasta T2 es preferiblemente de 0,5 a 10 días, más preferiblemente de 0,5 a 9 días, más preferiblemente de 0,5 a 8 días, más preferiblemente de 0,5 a 7 días, más preferiblemente de 0,5 a 6 días, más preferiblemente de 0,5 a 5 días, más preferiblemente de 0,5 a 4 días, más preferiblemente de 0,5 a 3 días, más preferiblemente de 0,5 a 2 días y más preferiblemente de 0,5 a 1,5 días. Según esta realización, la planta se expone al estrés mientras que la resistencia al estrés de la misma se ha mejorado a través de la aplicación del supresor del blanqueamiento de la presente invención. Por tanto, el blanqueamiento provocado después de que la planta se exponga al estrés se suprime más eficazmente. El supresor del blanqueamiento de la presente invención puede aplicarse a la planta el número N de veces (N es 2 o más) antes de que la planta reciba el estrés. En tal caso, el periodo desde T1n (n es un número entero de 1 a N) en el que se aplica el supresor del blanqueamiento hasta T2 está preferiblemente dentro del intervalo descrito anteriormente. A través de la aplicación del supresor del blanqueamiento de la presente invención una pluralidad de veces, puede suprimirse el blanqueamiento de una planta más eficazmente.
<5. Promotor de la expresión del gen de DREB2A y método de promoción de la expresión del gen de DREB2A> Un aspecto de la presente divulgación se refiere a un promotor de la expresión del gen de DREB2A para promover la expresión del gen de DREB2A en una planta, que comprende alantona como principio activo. El alcance de protección buscado es el definido por las reivindicaciones adjuntas.
Un aspecto de la presente divulgación se refiere a un método de promoción de la expresión del gen de DREB2A gene en la planta, que comprende una etapa de aplicar el promotor de la expresión del gen de DREB2A a una planta.
Estos aspectos de la presente divulgación contribuyen a mejorar la resistencia a diversos tipos de estrés, tal como la resistencia al estrés por altas temperaturas o resistencia al estrés por deshidratación, al promover la expresión del gen de DREB2A en una planta. Estos aspectos también ejercen efectos ventajosos, tales como una tasa de enraizamiento mejorada o una vida prolongada de la flor cortada, de una planta diana.
Según el método de promoción de la expresión del gen de DREB2A en la planta de la presente divulgación, preferiblemente, se suprime la expresión del gen de HSF3.
En la presente divulgación, un proceso de expresión de ARNm usando ADN genómico como molde (es decir, transcripción) y/o un proceso de síntesis de proteínas usando el ARNm como molde (es decir, traducción) están
dentro del alcance de “expresión génica”. El término “gen” usado en la presente divulgación se refiere a un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido particular, y el término se refiere normalmente a ADN genómico de una planta o ARNm generado con el uso de ADN genómico como molde. Cuando se promueve la expresión del gen de DREB2A en la presente divulgación, el nivel de expresión del gen de DREB2A aumenta hasta un grado significativo, en comparación con una planta a la que no se le ha aplicado alantona. Si se promueve o no la expresión del gen de DREB2A en una planta puede inspeccionarse detectando un aumento en el nivel de ARNm que codifica para un polipéptido de DREB2A y/o un aumento en el nivel del polipéptido de DREB2A en una planta. El grado de promoción de la expresión del gen de DREB2A no está particularmente limitado en la presente divulgación. Cuando el nivel de expresión del gen de DREB2A en una planta a la que no se le ha aplicado el promotor de la expresión del gen de DREB2A de la presente divulgación se designa como 100, el nivel de expresión del gen de DREB2A es, por ejemplo, 120 o mayor, preferiblemente 150 o mayor y más preferiblemente 200 o mayor en una planta a la que se le ha aplicado el promotor de la expresión del gen de DREB2A de la presente divulgación.
Cuando se suprime la expresión del gen de HSF3 en la presente invención, el nivel de expresión del gen de HSF3 disminuye hasta un grado significativo, en comparación con una planta a la que no se le ha aplicado alantona. Si se suprime o no la expresión del gen de HSF3 en una planta puede inspeccionarse detectando una disminución en el nivel de ARNm que codifica para el polipéptido de HSF3 y/o una disminución en el nivel del polipéptido de HSF3 en una planta. El grado de supresión de la expresión del gen de HSF3 no está particularmente limitado en la presente invención. Cuando el nivel de expresión del gen de HSF3 en una planta a la que no se le ha aplicado el promotor de la expresión del gen de DREB2A de la presente divulgación se designa como 100, el nivel de expresión del gen de HSF3 es, por ejemplo, 90 o inferior, preferiblemente 80 o inferior y más preferiblemente 75 o inferior en una planta a la que se le ha aplicado el promotor de la expresión del gen de DREB2A de la presente divulgación.
Las plantas diana que van a someterse a la promoción de la expresión del gen de DREB2A en la presente divulgación son plantas que se requiere que experimenten promoción de la expresión génica. Los ejemplos de las mismas incluyen plantas que se cultivan en el entorno en que las plantas pueden exponerse a estrés por altas temperaturas, tales como las condiciones de temperatura tal como se describió anteriormente, y otro estrés. Anteriormente se describieron especies de plantas específicas.
El promotor de la expresión del gen de DREB2A de la presente divulgación puede ser cualquier sustancia, siempre que contenga alantona y sea capaz de promover la expresión del gen de DREB2A en una planta. Puede ser alantona o una composición que contiene alantona que comprende alantona y otros componentes. El promotor de la expresión del gen de DREB2A de la presente divulgación puede contener alantona en una cantidad eficaz para promover la expresión del gen de DREB2A en la planta. El promotor de la expresión del gen de DREB2A de la presente divulgación puede contener también alantona en una cantidad eficaz para la supresión de la expresión del gen de HSF3.
El promotor de la expresión del gen de DREB2A de la presente divulgación puede estar en cualquier forma, tal como un sólido o líquido.
Cuando el promotor de la expresión del gen de DREB2A de la presente divulgación es una composición que contiene alantona, tal composición puede ser la misma composición que contiene alantona tal como se describió con respecto al agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas.
El método de aplicación del promotor de la expresión del gen de DREB2A de la presente divulgación a una planta no está particularmente limitado, siempre que el promotor de la expresión del gen de DREB2A de la presente divulgación o la alantona liberada del promotor de la expresión del gen de DREB2A de la presente invención se ponga en contacto con una parte de una planta, tal como una raíz, tallo u hoja de una planta. El promotor de la expresión del gen de DREB2A de la presente divulgación puede aplicarse directamente a la planta, o el promotor de la expresión del gen de DREB2A de la presente divulgación puede aplicarse a un medio de cultivo, tal como el suelo en el que está fijada la planta. En la presente divulgación, el promotor de la expresión del gen de DREB2A de la presente divulgación puede aplicarse a una planta de tal manera que se aplica alantona a la planta en una cantidad eficaz para promover la expresión del gen de DREB2A en la planta. En la presente divulgación, el promotor de la expresión del gen de DREB2A de la presente divulgación puede aplicarse a una planta de tal manera que se aplica alantona a la planta en una cantidad eficaz para suprimir la expresión del gen de HSF3 en la planta.
Aunque el momento de aplicación del promotor de la expresión del gen de DREB2A de la presente divulgación a una planta no está particularmente limitado, el promotor de la expresión del gen de DREB2A de la presente divulgación se aplica preferiblemente a la planta antes de que la planta reciba estrés (por ejemplo, estrés por altas temperaturas). El promotor de la expresión del gen de DREB2A de la presente divulgación promueve la expresión del gen de DREB2A. Tal como se describió anteriormente, la expresión de diversos genes resistentes a estrés puede inducirse tras la expresión del gen de DREB2A. Por consiguiente, se deduce que una planta a la que se le ha aplicado el promotor de la expresión del gen de DREB2A de la presente divulgación de antemano antes de que la planta reciba estrés ha logrado resistencia al estrés, y se deduce que la viabilidad de la misma después de que la
planta reciba estrés es alta.
Cuando el promotor de la expresión del gen de DREB2A de la presente divulgación se aplica a la planta antes de que la planta reciba estrés, el punto de tiempo en el que el promotor de la expresión del gen de DREB2A de la presente divulgación se aplica a la planta se designa como “T1” y el punto de tiempo en el que se inicia la exposición de la planta al estrés se designa como “T2”. En tal caso, el periodo desde T1 hasta T2 es preferiblemente de 0,5 a 10 días, más preferiblemente de 0,5 a 9 días, más preferiblemente de 0,5 a 8 días, más preferiblemente de 0,5 a 7 días, más preferiblemente de 0,5 a 6 días, más preferiblemente de 0,5 a 5 días, más preferiblemente de 0,5 a 4 días, más preferiblemente de 0,5 a 3 días, más preferiblemente de 0,5 a 2 días y más preferiblemente de 0,5 a 1,5 días. Según esta realización, la planta se expone al estrés mientras que la resistencia al estrés de la misma se ha mejorado a través de la aplicación del promotor de la expresión del gen de DREB2A de la presente divulgación. Por tanto, la viabilidad después de que la planta se exponga al estrés es alta. El promotor de la expresión del gen de DREB2A de la presente divulgación puede aplicarse a la planta el número N de veces (N es 2 o más) antes de que la planta reciba estrés. En tal caso, el periodo desde T1n (n es un número entero de 1 a N) en el que se aplica el promotor de la expresión del gen de DREB2A hasta T2 está preferiblemente dentro del intervalo descrito anteriormente. A través de la aplicación del promotor de la expresión del gen de DREB2A de la presente divulgación una pluralidad de veces, la resistencia al estrés de la planta puede mejorarse adicionalmente.
En la presente invención, genes que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican para polipéptidos anotados como “proteína 2A de unión a elemento de respuesta a la deshidratación” o “similar a proteína 2A de unión a elemento de respuesta a la deshidratación” en la base de datos proporcionada por el National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) u otras bases de datos y genes que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican para polipéptidos que tienen funciones homólogas a los polipéptidos descritos anteriormente están dentro del alcance del gen de DREB2A.
Los genes que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican para polipéptidos anotados como “proteína 2A de unión a elemento de respuesta a la deshidratación” o “similar a proteína 2A de unión a elemento de respuesta a la deshidratación” en la base de datos proporcionada por el NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) pueden confirmarse basándose en los resultados de la búsqueda demostrados en el sitio web en la URL indicada a continuación: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=dehydration-responsive+element-binding+protein+2A.
Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de ADNc del gen de DREB2A de Arabidopsis thaliana (código de AGI: AT5G05410) es tal como se muestra en SEQ ID NO: 1. Una secuencia de nucleótidos parcial en la secuencia de nucleótidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 1 (es decir, una región desde los nucleótidos 189 hasta 1196) es una región que codifica para el polipéptido de DREB2A.
En algunas plantas diana, puede promoverse la expresión de un gen que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que tiene funciones homólogas a un polipéptido anotado como “proteína 2A de unión a elemento de respuesta a la deshidratación” o “similar a proteína 2A de unión a elemento de respuesta a la deshidratación”. Los ejemplos de genes que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican para polipéptidos que tienen funciones homólogas a los polipéptidos anotados como proteína 2A de unión a elemento de respuesta a la deshidratación o similar a proteína 2A de unión a elemento de respuesta a la deshidratación incluyen, pero no se limitan a:
(1) un gen que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de DREB2A de Arabidopsis thaliana codificado por una secuencia de nucleótidos parcial en las posiciones 189 a 1196 en la secuencia de nucleótidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 1 mediante sustitución, deleción, inserción y/o adición de uno o varios, tal como de 1 a 20, preferiblemente de 1 a 15, más preferiblemente de 1 a 10, todavía más preferiblemente de 1 a 5, además preferiblemente de 1 a 3 y todavía además preferiblemente 1 o 2 aminoácidos y teniendo el polipéptido funciones homólogas al polipéptido de DREB2A de Arabidopsis thaliana, y
(2) un gen que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 60 % o más, preferiblemente el 70 % o más, más preferiblemente el 80 % o más, todavía más preferiblemente el 85 % o más, además preferiblemente el 90 % o más, todavía además preferiblemente el 95 % o más, y además preferiblemente el 98 % o más con la secuencia de aminoácidos del polipéptido de DREB2A de Arabidopsis thaliana y teniendo el polipéptido funciones equivalentes al polipéptido de DREB2A de Arabidopsis thaliana.
En la presente invención, la identidad de secuencia de aminoácidos puede determinarse con el uso de, por ejemplo, técnicas o software de análisis de secuencias bien conocidos en la técnica. El término “identidad secuencia de aminoácidos” se refiere a la proporción (%) del número de residuos de aminoácido constantes en relación con el número total de residuos de aminoácido (incluido el número de huecos cuando se insertan huecos), cuando, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de DREB2A de Arabidopsis thaliana y otra secuencia de aminoácidos se alinean insertando huecos, según sea necesario, para maximizar el grado de constancia entre estas dos secuencias de aminoácidos, y la identidad de secuencia de aminoácidos puede determinarse usando sistemas
de búsqueda de proteínas, tales como BLAST o FASTA (Karlin, S. et al., 1993, Proceedings of the National Academic Sciences, U.S.A., vol. 90, págs. 5873-5877; Altschul, S. F. et al., 1990, Journal of Molecular Biology, vol.
215, págs. 403-410; Pearson, W. R. et al., 1988, Proceedings of the National Academic Sciences, U.S.A., vol. 85, págs. 2444-2448).
En la presente invención, genes que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican para polipéptidos anotados como “factor de transcripción de choque térmico A-1b” o “similar a factor de transcripción de choque térmico A-1b” en la base de datos proporcionada por el National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) u otras bases de datos y genes que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican para polipéptidos que tienen funciones homólogas a los polipéptidos descritos anteriormente están dentro del alcance del gen de HSF3.
Los genes que comprende secuencias de nucleótidos que codifican para polipéptidos anotados como “factor de transcripción de choque térmico A-1b” o “similar a factor de transcripción de choque térmico A-1b” en la base de datos proporcionada por el NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) pueden confirmarse basándose en los resultados de búsqueda demostrados en el sitio web en la URL indicada a continuación: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=heat+stress+transcription+factor+A-1b.
Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de ADNc del gen de HSF3 de Arabidopsis thaliana (código de AGI: AT5G16820) es tal como se muestra en SEQ ID NO: 2. Una secuencia de nucleótidos parcial en las posiciones 174 a 1619 en la secuencia de nucleótidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 2 es una región que codifica para el polipéptido de HSF3.
En algunas plantas diana, puede suprimirse la expresión de un gen que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que tiene funciones homólogas a un polipéptido anotado como “factor de transcripción de choque térmico A-1b” o “similar a factor de transcripción de choque térmico A-1b”.
Los ejemplos de genes que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican para polipéptidos que tienen funciones homólogas a los polipéptidos anotados como “factor de transcripción de choque térmico A-1b” o “similar a factor de transcripción de choque térmico A-1b” incluyen, pero no se limitan a:
(1) un gen que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de HSF3 de Arabidopsis thaliana codificado por una secuencia de nucleótidos parcial en las posiciones 174 a 1619 en la secuencia de nucleótidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 2 mediante sustitución, deleción, inserción y/o adición de uno o varios, tal como de 1 a 20, preferiblemente de 1 a 15, más preferiblemente de 1 a 10, todavía más preferiblemente de 1 a 5, además preferiblemente de 1 a 3 y todavía además preferiblemente 1 o 2 aminoácidos y teniendo el polipéptido funciones homólogas al polipéptido de HSF3 de Arabidopsis thaliana, y
(2) un gen que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 60 % o más, preferiblemente el 70 % o más, más preferiblemente el 80 % o más, todavía más preferiblemente el 85 % o más, además preferiblemente el 90 % o más, todavía además preferiblemente el 95 % o más, y además preferiblemente el 98 % o más con la secuencia de aminoácidos del polipéptido de HSF3 de Arabidopsis thaliana y teniendo el polipéptido funciones equivalentes al polipéptido de HSF3 de Arabidopsis thaliana.
Ejemplos
A continuación en el presente documento, se describe la presente invención con referencia a ejemplos específicos descritos a continuación.
<Experimento 1. Evaluación de la resistencia al estrés por altas temperaturas de Arabidopsis thaliana en la que se acumula alantona>
1. Material vegetal
Se usaron las 3 líneas de Arabidopsis thaliana L. Heynh., registro Columbia-0 con diferentes antecedentes genéticos indicadas a continuación.
(1) Línea de tipo natural (WT)
(2) Línea con deleción del gen de alantoinasa (aln-1)
(3) Línea con deleción del gen de alantoinasa complementada con gen de alantoinasa (aln-1 35S:ALN) Estas plantas son las mismas que las usadas en el documento no de patente 4. La línea complementada de la línea
con deleción del gen de alantoinasa (aln-1 35S:ALN) es la misma que la línea indicada como “35Spro:ALN/aln-1” en el documento no de patente 4.
La línea con deleción del gen de alantoinasa de (2) anterior (SALK_000325, Yang, J. y Han K.-H, Plant Physiology, 134: 1039-1049) se obtuvo del Arabidopsis Biological Resource Center(Ohio State University).
La línea complementada de la línea con deleción del gen de alantoinasa de (3) anterior (aln-1 35S:ALN) se obtuvo introduciendo ADN que codifica para la secuencia de alantoinasa de longitud completa derivada de la línea de Arabidopsis thaliana de tipo natural en la aln-1 usando un vector. Un método específico de preparación de la misma es tal como se describe en el documento no de patente 4.
2. Medio de cultivo
Una mezcla de sal para el medio de Murashige & Skoog de concentración media (Murashige T., F. Skoog F. 1962, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures, Physiologia Plantarum 15: 473-497), sacarosa, vitaminas y goma gellan (solidificante) se disolvieron en tampón MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico). La disolución se esterilizó en autoclave, se dispensó en cantidades de 25 ml cada una en una placa de Petri esterilizada profunda FX (90 * 20 mm, Sansei Medical Co., Ltd.), y se dejó solidificar en una mesa limpia para obtener medio sólido 1/2 MS. El medio sólido 1/2 MS resultante contiene los componentes a las concentraciones mostradas en la tabla 1.
Tabla 1
Composición Concentración final Mezcla de sal para el medio Murashige & Skoog (Wako Pure Chemical Industries, 2,3 g/l
Ltd.)
Sacarosa (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 10 g/l Vitaminas MS **
MES (50 g/l, pH 5,7 con KOH) 10 ml/l Goma gellan (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 4 g/l
**La concentración final de vitaminas MS es la siguiente: clorhidrato de tiamina 0,25 mg/l; ácido nicotínico 0,25 mg/l; clorhidrato de piridoxina 0,25 mg/l; glicina 1 mg/l; y mio-inositol 50 mg/l. Una disolución madre de la composición a una concentración 500 veces mayor que la que se usó para preparar el medio.
3. Condiciones de crecimiento y tratamiento de estrés por altas temperaturas
(1) Se introdujeron varios cientos de semillas maduras de la planta en un tubo de 1,5 ml. Se llevaron a cabo los tratamientos (2) a (6) descritos a continuación en una mesa limpia.
(2) Se introdujo hipoclorito de sodio al 2,5 % (v/v) (1 ml) en el tubo que contenía las semillas, se montó sobre una mezcladora de rotación pequeña (18 rpm) y se esterilizó durante 10 minutos.
(3) Tras la centrifugación, se descartó la disolución de hipoclorito de sodio, se añadió 1 ml de agua estéril y se llevó a cabo el tratamiento (2).
(4) Se repitió el tratamiento (3) 3 veces con el uso de agua estéril para lavar a fondo las semillas.
(5) Una placa de Petri llena con medio sólido 1/2 MS se dividió radialmente en 3 compartimentos, y se inocularon 9 semillas de cada línea en cada compartimento (27 semillas en total en una placa de Petri) (figura 1A).
(6) La placa de Petri se introdujo en la mesa limpia mientras se mantenía la tapa abierta, se permitió que se evaporara el agua en las proximidades de las semillas (durante de 20 a 30 minutos) y entonces se selló la placa de Petri con una cinta quirúrgica.
(7) Cada placa de Petri se envolvió con papel de aluminio y se sometió a tratamiento a baja temperatura (4 °C) durante 2 días para romper la latencia.
(8) El resultante se transfirió a una cámara de cultivo y se cultivó en la misma a 22 °C en condiciones de día largo (aplicación de luz durante 16 horas bajo luz fluorescente: 0,07 mmol de fotones irr1 s_1) durante 7 días. (9) Las plantas de 7 días de edad hechas crecer asépticamente en (8) se introdujeron en una incubadora preajustada a 45 °C, y se aplicó choque térmico en la oscuridad durante 75, 90 o 105 minutos. Se llevó a cabo una prueba de control haciendo crecer las plantas de manera continua a 22 °C sin la aplicación de choque térmico.
(10) Después del tratamiento de choque térmico, se enfrió la placa de Petri en una incubadora a 22 °C durante de 10 a 15 minutos, y se permitió que las plantas crecieran de nuevo en las condiciones descritas en (8) durante 1 semana. En caso de daño grave, se observaría un fenómeno de clorosis (blanqueamiento) de las hojas aproximadamente 3 días después del inicio de la prueba. Se evaluó la viabilidad basándose en tal fenómeno. La prueba descrita anteriormente se llevó a cabo dos veces.
4. Resultados
La figura 1B muestra fotografías de placas de Petri después de que las plantas se hubieran tratado en diversas condiciones de choque térmico y hecho crecer durante 1 semana. Las posiciones de las líneas de plantas en cada placa de Petri mostrada en la figura 1B son tal como se muestra en la figura 1A. Cada valor numérico en la placa de Petri indica la razón de “el número de plántulas supervivientes” en relación con “el número de plántulas germinadas” (el número de plántulas supervivientes/el número de plántulas germinadas) en cada compartimento.
La figura 2 muestra la viabilidad en diversas condiciones de choque térmico. La viabilidad mostrada en la figura 2 es el valor obtenido determinando la viabilidad (%) en diversas condiciones basándose en el número de plántulas supervivientes indicado en la figura 1B y calculando el promedio de dos pruebas.
Tal como resulta evidente a partir de los resultados de prueba mostrados en la figura 1B y la figura 2, la línea con deleción del gen de alantoinasa (aln-1) tiene resistencia al estrés por altas temperaturas. Puesto que la alantona no se metaboliza y se acumula en la línea con deleción del gen de alantoinasa (aln-1), se concluyó que la resistencia al estrés por altas temperaturas observada en este experimento se logró mediante la presencia de alantona a alta concentración en el cuerpo de la planta.
Se observó un fenómeno de clorosis (blanqueamiento) de las hojas en plantas dañadas por estrés por altas temperaturas.
<Experimento 2. Provisión de resistencia al estrés por altas temperaturas a monocotiledóneas por medio de aplicación de alantona>
Se montó una maceta de polietileno de 5 cm sobre un plato de equilibrio BD-2 (AS ONE Corporation), se introdujeron en la misma 70 ml de vermiculita (Protoleaf Inc.), se introdujeron adicionalmente en la misma 80 ml de suelo de cultivo (TAKII & CO., LTD.), se sembraron 3 semillas de cebolla (variedad: Neoearth; TAKII & CO., LTD.) en 3 posiciones y se introdujeron adicionalmente en la misma 20 ml de vermiculita, para cubrir el suelo. Después de eso, se suministraron 50 ml de agua del grifo al plato de equilibrio dos veces. La maceta de polietileno (junto con el plato de equilibrio) se montó sobre una bandeja, y entonces se introdujo el resultante en una incubadora a 22 °C y 10.000 Lux durante un periodo de luz de 12 horas y un periodo de oscuridad de 12 horas, para iniciar el cultivo. El día en que se inició el cultivo se designó como día 0 después de la siembra. Se observó germinación 5 días después de la siembra. Mientras se dejaban 3 plantas en cada maceta (es decir, una planta en cada posición), se retiraron las otras plantas de la misma 6 días después de la siembra.
Se aplicó agua del grifo o una disolución acuosa de alantona 1 mM a cada grupo de prueba (40 ml/maceta) 6 días después de la siembra (a continuación en el presente documento, denominado “grupo de tratamiento con agua” o “grupo de tratamiento con alantona”, respectivamente). Se aplicó agua del grifo a todas las macetas (40 ml/maceta) 11 días después de la siembra. Las macetas montadas sobre las bandejas se introdujeron en la incubadora 13 días después de la siembra (en el estadio de 2 hojas verdaderas en el caso de las cebollas), y las plantas se expusieron a estrés por altas temperaturas a 45 °C durante 1 hora, 1,5 horas y 2 horas. El suelo en las macetas se humedeció suficientemente antes y después de la aplicación del estrés por altas temperaturas. Tras la finalización del tratamiento de estrés por altas temperaturas, la temperatura en la incubadora se enfrió hasta 22 °C, y se continuó el cultivo. Se suministró agua 2 días después del tratamiento de choque térmico (40 ml/maceta). Después de eso, se suministró agua en una cantidad de 40 ml por maceta a intervalos de 2 días.
La viabilidad 3 días después del tratamiento de choque térmico fue tal como sigue. La viabilidad lograda por el tratamiento de 1 hora del grupo de tratamiento con agua y del grupo de tratamiento con alantona fue del 22,2 % y el 66,7 %, respectivamente, la viabilidad lograda por el tratamiento de 1,5 horas fue del 0 % y el 33,3 %, respectivamente, y la viabilidad lograda por el tratamiento de 2 horas del grupo de tratamiento con agua y del grupo de tratamiento con alantona fue del 0 % y el 11,1 %, respectivamente. Se observó la misma viabilidad 8 días después del tratamiento de choque térmico. Por consiguiente, se verificaron los efectos de conferir resistencia al estrés por altas temperaturas por medio de la aplicación de alantona.
La “viabilidad” indica la proporción del número de plantas supervivientes en relación con el número de plantas sometidas al tratamiento de choque térmico. La viabilidad se calculó considerando plantas que ya no crecerían (es decir, las plantas con las hojas más jóvenes que padecían daño físico, tal como blanqueamiento, marchitamiento o rizado de las hojas) como plantas no supervivientes.
La figura 3 muestra fotografías de plantas sometidas a tratamiento de choque térmico a 45 °C durante 1,5 horas y luego hechas crecer durante 3 días. En la figura 3, la fotografía superior muestra plantas del grupo de tratamiento con alantona (viabilidad: 33,3 %) y la fotografía inferior muestra plantas del grupo de tratamiento con agua (viabilidad: 0 %).
<Experimento 3. Provisión de resistencia al estrés por altas temperaturas a dicotiledóneas por medio de aplicación de alantona>
Se montó una maceta de polietileno de 5 cm sobre un plato de equilibrio BD-2 (AS ONE Corporation), se introdujeron en la misma 70 ml de vermiculita (Protoleaf Inc.), se introdujeron adicionalmente en la misma 80 ml de suelo de cultivo (TAKII & CO., LTD.), se sembraron 3 semillas de Brassica chinensis komatsuna (variedad: Rakuten, TAKII & CO., LTD.) en el centro de la maceta y se introdujeron adicionalmente 20 ml de vermiculita en la misma, para cubrir el suelo. Después de eso, se suministraron 50 ml de agua del grifo al plato de equilibrio dos veces. La maceta de polietileno (junto con el plato de equilibrio) se montó sobre una bandeja y se introdujo en una incubadora a 22 °C y 10.000 Lux durante un periodo de luz de 12 horas y un periodo de oscuridad de 12 horas, para iniciar el cultivo. El día en que se inició el cultivo se designó como día 0 después de la siembra.
Se observó germinación 3 días después de la siembra. Mientras se dejaba una planta en cada maceta, se retiraron las otras plantas de la misma 6 días después de la siembra. Se aplicó agua del grifo o una disolución acuosa de alantona 1 mM a cada grupo de prueba (40 ml/maceta) 6 días después de la siembra. Se aplicó agua del grifo a todas las macetas (40 ml/maceta) 11 días después de la siembra. Se aplicó agua del grifo o una disolución acuosa de alantona 1 mM a cada grupo de prueba (40 ml/maceta) 13 días después de la siembra. Las macetas montadas sobre las bandejas se introdujeron en la incubadora 14 días después de la siembra (en el estadio de 2 hojas verdaderas en el caso de Brassica chinensis komatsuna), y las plantas se expusieron a estrés por altas temperaturas a 45 °C durante 1 hora. El suelo en las macetas se humedeció suficientemente antes y después de la aplicación de estrés por altas temperaturas. Tras la finalización del tratamiento de estrés por altas temperaturas, la temperatura en la incubadora se enfrió hasta 22 °C, y se continuó el cultivo. Se suministró agua 2 días después del tratamiento de choque térmico (40 ml/maceta). Después de eso, se suministró agua en una cantidad de 40 ml por maceta a intervalos de 2 días.
La viabilidad 7 días después del tratamiento de choque térmico fue tal como sigue. La viabilidad lograda por el tratamiento de 1 hora del grupo de tratamiento con agua y del grupo de tratamiento con alantona fue del 33,3 % y el 100 %, respectivamente. Por consiguiente, se verificaron los efectos de conferir resistencia al estrés por altas temperaturas por medio de la aplicación de alantona.
La “viabilidad” indica la proporción del número de plantas supervivientes en relación con el número de plantas sometidas al tratamiento de choque térmico. La viabilidad se calculó considerando plantas que ya no crecerían (es decir, las plantas con las hojas más jóvenes que padecen daño físico, tal como blanqueamiento, marchitamiento o rizado de las hojas) como plantas no supervivientes.
La figura 4 muestra fotografías de plantas sometidas a tratamiento de choque térmico a 45 °C durante 1 hora y luego hechas crecer durante 7 días. En la figura 4, la fotografía superior muestra plantas del grupo de tratamiento con alantona (viabilidad: 100 %) y la fotografía inferior muestra plantas del grupo de tratamiento con agua (viabilidad: 33,3 %).
<Experimento 4. Promoción de la expresión del gen de DREB2A en plantas en las que se acumula alantona> 1. Resumen
Con el fin de inspeccionar con precisión la influencia de la alantona impuesta sobre la expresión génica de Arabidopsis thaliana L. Heynh., los datos de micromatrices sin procesar del mutante aln-1 que acumula alantona como resultado de la deleción del gen de alantoinasa (número de registro de NCBI Gene Expression Omnibus GSE44922) se sometieron a normalización según la técnica descrita en Konishi, T., 2004, Three-parameter long normal distribution ubiquitously found in cDNA microarray data and its application to parametric data treatment. BMC Bioinformatics 5: 5. Los datos normalizados se sometieron a análisis de la varianza de dos vías, los resultados del análisis se compararon con los de la línea de tipo natural en condiciones estrictas (P < 0,001) y se seleccionaron los genes cuyos niveles de transcritos variaron 3 veces o más (Konishi, T., 2011, Microarray test results should not be compensated for multiplicity of gene contents, BMC Syst. Biol. 5 (suμl. 2): S6). Estos genes se sometieron a análisis de procesos biológicos por ontología génica (GO) con el uso de VirtualPlant (versión 1.3; http://virtualplant.bio.nyu.edu/cgi-bin/vpweb/).
2. Procedimientos en detalle
Se extrajo ARN total de plántulas de la línea de Arabidopsis thaliana de tipo natural de 2 semanas de edad y el mutante aln-1. Se usados dos muestras biológicas independientes para cada genotipo. La transcripción inversa de ARN en ADNc, el marcaje del mismo y la hibridación del mismo con los chips génicos ATH1 de Affymetrics se
llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de que las micromatrices sometidas a hibridación se lavaran, se recogieron las señales derivadas de la hibridación usando el escáner Affymetrics GeneChip 3000 7G. Por tanto, se obtuvieron en total datos sin procesar de 4 micromatrices; es decir, datos sin procesar de 2 micromatrices de la línea de tipo natural y del mutante aln-1. Tal procedimiento se describe en Watanabe, S. et al., 2014, Plant Cell Environ., 37: 1022-1036.
Tales datos sin procesar de micromatrices se registran y se dan a conocer con los números de registro de NCBI Gene Expression Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Tales datos de micromatrices se normalizaron mediante el método paramétrico usando el modelo de distribución logarítmica normal de 3 parámetros usando el servicio SuperNORM proporcionado por Skylight Biotech, Inc., y los niveles de expresión génica se convirtieron en puntuaciones z (Konishi, T., 2004, tal como se describió anteriormente). Como resultado de la normalización, los niveles de expresión génica entre diferentes micromatrices pueden volverse comparables. Los datos normalizados están registrados con el número de registro: GSE73841.
Los niveles de expresión génica se compararon entre la línea de tipo natural y el mutante aln-1. Los genes cuyos niveles de expresión aumentaron o disminuyeron al menos 3 veces en el mutante aln-1 se seleccionaron por medio del análisis de la varianza de dos vías (ANOVA) en condiciones de prueba estrictas (P < 0,001) según el método de Konishi, 2011. Con el uso de las herramientas BioMaps de VirtualPlant (versión 1.3; http://virtualplant.bio.nyu.edu/cgi-bin/vpweb/) con configuración por defecto (la prueba exacta de Fisher con corrección de tasa de descubrimiento falso, P < 0,01), se llevó a cabo el análisis de procesos biológicos por ontología génica (GO) según la anotación genómica de Arabidopsis (versión 10 de TAIR; http://arabidopsis.org/).
3. Resultados
Como resultado del análisis, se encontró que el nivel de expresión del gen de DREB2A (código de AGI: AT5G05410; SEQ ID NO: 1) en la línea mutante aln-1 era 3,17 veces mayor que en la línea de tipo natural.
Por el contrario, se encontró que el nivel de expresión del gen del factor de transcripción de choque térmico 3 (HSF3) (código de AGI: AT5G16820, SEQ ID NO: 2) en el mutante aln-1 era 0,577 veces mayor que en la línea de tipo natural.
<Experimento 5. Promoción de la expresión del gen de DREB2A por medio de cultivo en medio que contiene alantona>
Se esterilizaron semillas de la línea de Arabidopsis thaliana de tipo natural (Columbia-0) en hipoclorito de sodio al 2,5 % (v/v), se sembraron en el medio sólido 1/2 MS descrito en el experimento 1 (tabla 1) (el medio se suplementó con alantona 1 mM; no se añadió alantona al grupo de control; una placa de Petri profunda con un diámetro de 90 mm y una altura de 20 mm) y luego se permitió que creciera en condiciones de día largo (en una incubadora a 5.000 Lux, un periodo de luz de 16 horas y un periodo de oscuridad de 8 horas, 22 °C) durante 14 días. Con el uso de un kit comercializado, se llevaron a cabo la extracción de ARN de hojas y tallos de Arabidopsis thaliana (NucleoSpin RNAII, MACHEREY-NAGEL), la transcripción inversa (ReverTra Ace qPCR RT Master Mix, TOYOBO) y la PCR cuantitativa (KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix, KAPABIOSYSTEMS). Como gen de referencia, se usó ACT2 (código de a Gi: AT3G18780). Como resultado, el nivel de expresión relativa de DREB2A (código de AGI: AT5G05410; SEQ ID NO: 1) y el de HSF3 (código de AGI: AT5G16820; SEQ ID NO: 2) fueron 2,2 veces y 0,7 veces mayores que el nivel de expresión del grupo de control, respectivamente.
<Experimento 6. Evaluación de la resistencia al estrés por altas temperaturas de Arabidopsis thaliana cultivada en medio que contiene alantona>
1. Material vegetal
Se usó la línea de tipo natural (WT) de Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., registro Columbia-0 descrita en el experimento 1.
2. Medio de cultivo
Se usó el medio sólido 1/2 MS descrito en el experimento 1 (tabla 1) (se añadió adicionalmente alantαna 10 |iM, 100 |iM o 1.000 |iM al grupo suplementado con alantαna, no se añadió alantαna al grupo libre de alantαna, una placa de Petri esterilizada profunda n.° 903 VALMARK; Ina-0ptika Corporation).
3. Condiciones de crecimiento y tratamiento de estrés por altas temperaturas
(1) Se introdujeron varios cientos de semillas maduras de la planta en un tubo de 1,5 ml. Se llevaron a cabo los tratamientos (2) a (6) descritos a continuación en una mesa limpia.
(2) Se introdujo hipoclorito de sodio al 2,5 % (v/v) (1 ml) en el tubo que contenía las semillas, se montó sobre
una mezcladora de rotación pequeña (18 rpm) y se esterilizó durante 10 minutos.
(3) Tras la centrifugación, se descartó la disolución de hipoclorito de sodio, se añadió 1 ml de agua estéril y se llevó a cabo el tratamiento (2).
(4) Se repitió el tratamiento (3) 3 veces con el uso de agua estéril para lavar a fondo las semillas.
(5) En la placa de Petri, una parte de alojamiento circular (vista plana) se dividió en 2 compartimentos semicirculares mediante un tabique extendido hacia una dirección diametral. Se introdujo el medio sólido 1/2 MS libre de alantona en uno de los compartimentos de la placa de Petri, se introdujo el medio sólido 1/2 MS suplementado con alantona en otro compartimento y se sembraron 15 semillas en cada compartimento (es decir, 30 semillas en total por placa de Petri) (figura 5A).
(6) La placa de Petri se introdujo en la mesa limpia mientras se mantenía la tapa abierta, se permitió que se evaporara el agua en las proximidades de las semillas (durante de 20 a 30 minutos) y entonces se selló la placa de Petri con una cinta quirúrgica.
(7) Cada placa de Petri se envolvió con papel de aluminio y se sometió a tratamiento a baja temperatura (4 °C) durante 2 días para romper la latencia.
(8) El resultante se transfirió a una cámara de cultivo y se cultivó en la misma a 22 °C en condiciones de día largo (aplicación de luz durante 16 horas bajo luz fluorescente: 0,07 mmol de fotones m-1 s-1) durante 7 días. (9) Las plantas de 7 días de edad hechas crecer asépticamente en (8) se introdujeron en una incubadora preajustada a 45 °C, y se aplicó choque térmico en la oscuridad durante 105 minutos. Se llevó a cabo una prueba de control haciendo crecer las plantas de manera continua a 23 °C sin la aplicación de choque térmico. (10) Después de eso, se enfrió la placa de Petri en una incubadora a 23 °C durante de 10 a 15 minutos, y entonces se permitió que las plantas crecieran de nuevo durante 1 semana en las condiciones (8). En caso de daño grave, se observaría un fenómeno de clorosis (blanqueamiento) aproximadamente 3 días después del inicio de la prueba. Se evaluó la viabilidad basándose en tal fenómeno.
La prueba descrita anteriormente se llevó a cabo dos veces.
4. Resultados
La figura 5B muestra fotografías de placas de Petri después de que se hubiera tratado Arabidopsis thaliana en diversas condiciones de choque térmico y luego hecho crecer durante 1 semana. Las posiciones de las líneas de plantas en cada placa de Petri mostrada en la figura 5B son tal como se muestra en la figura 5A. Cada valor numérico en la placa de Petri indica la razón de “el número de plántulas supervivientes” en relación con “el número de plántulas germinadas” (el número de plántulas supervivientes/el número de plántulas germinadas) en cada compartimento.
La figura 6 muestra la viabilidad en diversas condiciones de choque térmico. La viabilidad mostrada en la figura 6 es el valor obtenido determinando la viabilidad (%) en diversas condiciones basándose en el número de plántulas supervivientes indicadas en la figura 5B, determinando la viabilidad (%) de otra prueba (no mostrado) y calculando el promedio de dos pruebas.
Tal como resulta evidente a partir de los resultados de prueba mostrados en la figura 5B y la figura 6, Arabidopsis thaliana cultivada en un medio que contiene alantona tiene resistencia al estrés por altas temperaturas. Puesto que se acumula alantona en los cuerpos de las plantas de Arabidopsis thaliana cultivadas en un medio que contiene alantona, se concluyó que la resistencia al estrés por altas temperaturas observada en este experimento se debía a la presencia de alantona a una alta concentración en los cuerpos de las plantas.
Se observó un fenómeno de clorosis (blanqueamiento) de las hojas en plantas dañadas por estrés por altas temperaturas.
Claims (6)
1. Método para mejorar la resistencia al estrés por altas temperaturas de una planta, que comprende una etapa de aplicar a la planta un agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas que comprende alantona como principio activo.
2. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa comprende aplicar a la planta el agente de mejora de la resistencia al estrés por altas temperaturas antes de que la planta reciba estrés.
3. Método para suprimir el blanqueamiento de una planta debido al estrés por altas temperaturas, que comprende una etapa de aplicar a una planta un supresor del blanqueamiento que comprende alantona como principio activo.
4. Uso de alantona para mejorar la resistencia al estrés por altas temperaturas de una planta.
5. Uso según la reivindicación 4, para suprimir uno o más seleccionados del grupo que consiste en blanqueamiento de la planta debido a estrés por altas temperaturas, marchitamiento de la planta debido a estrés por altas temperaturas y rizado de las hojas de la planta debido a estrés por altas temperaturas.
6. Uso según la reivindicación 5, para suprimir el blanqueamiento de una planta debido al estrés por altas temperaturas.
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