ES2954480T3 - Métodos y materiales para expandir linfocitos T específicos de antígeno en cultivo - Google Patents
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Abstract
Este documento proporciona métodos y materiales para expandir células T específicas de antígeno (por ejemplo, células T CD4+ específicas de antígeno y/o células T CD8+ específicas de antígeno) en cultivo. Por ejemplo, se proporcionan métodos y materiales para realizar una etapa de estimulación policlonal durante una duración particular (por ejemplo, de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas) para aumentar la expansión de células T que tienen una especificidad de antígeno deseada. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos y materiales para expandir linfocitos T específicos de antígeno en cultivo
DECLARACIÓN EN CUANTO A LA INVESTIGACIÓN PATROCINADA FEDERALMENTE
La presente invención se hizo con el apoyo del gobierno CA136632 concedido por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.
REIVINDICACIÓN DE PRIORIDAD
La presente solicitud reivindica prioridad a la solicitud de EE. UU. n.° de serie 62/208.263, presentada el 21 de agosto de 2015.
ANTECEDENTES
1. Campo técnico
Este documento se refiere a métodos y materiales para expandir linfocitos T específicos de antígeno (por ejemplo, linfocitos T CD4+ específicos de antígeno y/o linfocitos T CD8+ específicos de antígeno) en cultivo. Por ejemplo, este documento proporciona métodos y materiales para realizar una etapa de estimulación policlonal iniciada con precisión y terminada con precisión de duración e intensidad tal que aumente selectivamente la expansión y supervivencia de linfocitos T que tienen una especificidad por antígenos deseada.
2. Información previa
Existen muchas opciones terapéuticas diferentes para tratar cáncer. Un enfoque prometedor es obtener sangre de un paciente con cáncer y expandir las poblaciones de linfocitos T activos que pueden ser reintroducidos en el paciente con cáncer. Sin embargo, históricamente ha demostrado ser un reto usar sangre periférica como fuente de linfocitos T para tratar cáncer.
El documento de patente WO 2011/146473 A1 describe métodos de mejora de la proliferación ex vivo de una población de linfocitos T que incluyen poner en contacto la población de linfocitos T con IL-7 y anticuerpo anti-CD3/CD28 para activar y expandir la población de linfocitos T.
RuiKun Zhong et al. describen en Cancer Immunology, vol. 64, n.°. 6, 21 de marzo de 2015, en las páginas 737-74, un aumento de la reactividad de linfocitos T autólogos con blastos de leucemia mieloide aguda por agonistas de receptores del tipo toll.
Mark L. Bonyhadi et al. describen en Blood, vol. 98, n.°. 11, 16 de noviembre de 2001, en las páginas 32B-33B, una expansión de linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno usando microperlas CD3/CD28 paramagnéticas para terapia celular adaptativa de melanoma.
SUMARIO
La presente invención se define por la reivindicación independiente 1. Las reivindicaciones dependientes representan realizaciones adicionales de la invención.
Este documento proporciona métodos y materiales para expandir linfocitos T específicos de antígeno (por ejemplo, linfocitos T CD4+ específicos de antígeno y/o linfocitos T CD8+ específicos de antígeno) en cultivo. Por ejemplo, este documento proporciona métodos y materiales para realizar una etapa de estimulación anti-CD3 policlonal de duración definida con precisión que termina después de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas (dependiendo de la intensidad del estímulo) para expandir adicionalmente linfocitos T que tienen una especificidad por antígeno deseada. Esto es diferente de los intentos previos, donde la estimulación anti-CD3 policlonal se inició, pero no terminó formalmente, así que condujo a la muerte en vez de a la expansión de la subpoblación de linfocitos T específicos de antígeno deseados.
Como se describe en el presente documento, las células de sangre periférica (por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica (CMSP)) pueden ser (a) obtenidas de un mamífero (por ejemplo, un paciente humano con cáncer), (b) tratadas sin fraccionamiento adicional en una primera etapa de cultivo que incluye (i) promover la presentación del antígeno y (ii) exponer uno o más antígenos deseados (por ejemplo, un antígeno de interés exógenamente añadido) a linfocitos T en condiciones que activan linfocitos T reactivos contra ese antígeno deseado, (c) tratadas sin fraccionamiento adicional en un segundo cultivo que incluye expandir el número de linfocitos T reactivos contra el antígeno deseado, y (d) tratadas en una tercera etapa de cultivo que incluye estimular policlonalmente los linfocitos T reactivos contra ese antígeno deseado de un modo que promueva muerte celular mínima, si la hay, de los linfocitos T específicos de antígeno, que promueve la expansión de los linfocitos T específicos de antígeno, y que promueve la
activación mínima, si la hay, de los linfocitos T reactivos contra antígenos irrelevantes (por ejemplo, antígenos distintos del (de los) antígeno(s) añadido(s) en la primera etapa de cultivo). Una cuarta etapa de cultivo puede implicar la expansión continua de linfocitos T específicos de antígeno después de retirar el estímulo policlonal. Por ejemplo, una población de células que incluye linfocitos T que se estimularon contrO un antígeno de interés y se expandieron para aumentar sus números se puede exponer a una etapa de estimulación policlonal de duración definida en condiciones en donde los linfocitos T específicos de antígeno se expanden adicionalmente y otros linfocitos T no reactivos contra el antígeno de interés presentan expansión mínima, si la hay. En algunos casos, la etapa de estimulación policlonal puede incluir poner en contacto las células con perlas que tienen anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 (por ejemplo, Dynabeads obtenidas de Life Technologies, Inc.). Dichos métodos se pueden usar para obtener poblaciones de células que tienen grandes números de linfocitos T reactivos contra un antígeno deseado con números mínimos de linfocitos T activos que son reactivos contra antígenos no de interés.
En otro aspecto, este documento caracteriza un método de producción de una población de células que comprenden linfocitos T que tienen especificidad por un antígeno de interés. El método comprende, o consiste esencialmente en, (a) exponer una población de células que comprenden CMSP a GM-CSF, resiquimod, lipopolisacárido de E. co i y un antígeno de interés durante un primer periodo de tiempo, (b) exponer la población de células a IL-7 durante un segundo periodo de tiempo, (c) exponer la población de células a (i) anticuerpos anti-CD3 inmovilizados y anticuerpos anti-CD28 solubles o (ii) perlas que comprenden anticuerpos anti-CD3 y anticuerpos anti-CD28 durante un tercer periodo de tiempo para formar una población de células tratadas, y (d) cultivar la población de células tratadas en ausencia de (i) los anticuerpos anti-CD3 inmovilizados y anticuerpos anti-CD28 solubles y (ii) las perlas durante un cuarto periodo de tiempo para producir una población de células final que comprende linfocitos T que tienen especificidad por el antígeno de interés. Las células de la población de células puede ser células humanas. GM-CSF puede ser un GM-CSF humano. El antígeno de interés puede ser un antígeno asociado al cáncer. El antígeno asociado al cáncer puede ser MUC1, HER2/neu, mesotelina, WT1, NYEso-1, MART1, gp100 o TRP. El antígeno de interés puede ser un antígeno asociado a patógeno. El antígeno asociado a patógeno puede ser un citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, virus del papiloma humano, Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans, Aspergillis, Mycobacterium avian intracellularis, virus del Ébola o antígeno del VIH. La IL-7 puede ser IL-7 humana. El primer periodo de tiempo puede ser entre aproximadamente 16 horas y aproximadamente 48 horas. El segundo periodo de tiempo puede ser entre aproximadamente 9 días y aproximadamente 11 días. El tercer periodo de tiempo puede ser entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 48 horas. El cuarto periodo de tiempo puede ser entre aproximadamente 6 días y aproximadamente 10 días. El método puede comprender exponer la población de células a los anticuerpos anti-CD3 inmovilizados y los anticuerpos anti-CD28 solubles. La población de células final puede comprender más de 3 x 106 linfocitos T CD4+ específicos del antígeno de interés por millón de células de la población de células. La población de células final puede comprender más de 4 x 106 linfocitos T CD4+ específicos del antígeno de interés por millón de células de la población de células. La población de células final puede comprender más de 5 x 106 linfocitos T CD4+ específicos del antígeno de interés por millón de células de la población de células. La población de células final puede comprender más de 1,5 x 106 linfocitos T CD8+ específicos del antígeno de interés por millón de células de la población de células. La población de células final puede comprender más de 2 x 106 linfocitos T CD8+ específicos del antígeno de interés por millón de células de la población de células. El método puede comprender exponer la población de células a las perlas. Los anticuerpos anti-CD3 y los anticuerpos anti-CD28 pueden unirse covalentemente a las perlas. Las perlas pueden tener un diámetro promedio entre 4 gm y 5 gm. La población de células final puede comprender más de 0,5 x 106 linfocitos T CD4+ específicos del antígeno de interés por millón de células de la población de células. La población de células final puede comprender más de 1 x 106 linfocitos T CD4+ específicos del antígeno de interés por millón de células de la población de células. La población de células final puede comprender más de 0,15 x 106 linfocitos T CD8+ específicos del antígeno de interés por millón de células de la población de células. La población de células final puede comprender más de 0,2 x 106 linfocitos T CD8+ específicos del antígeno de interés por millón de células de la población de células.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente es entendido por un experto habitual en la técnica a la que se refiere la presente invención. Aunque métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento se pueden usar para poner en práctica la invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto entre la presente memoria descriptiva y una referencia mencionada en el presente documento, controlará la presente memoria descriptiva, que incluye definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos solo y no pretenden ser limitantes.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figura 1. Se necesita IL-12 para expandir Th1 específicos de Her2 ex vivo. Se cultivaron CMSP de un paciente representativo recientemente vacunado con p776-790 15-mero, pero no p42-56, con p776-790 rIL-2, con o sin rIL-12, durante 12 días, después de lo cual los linfocitos T se reexpusieron al péptido relevante o irrelevante en un ensayo ELISPOT de IFN-g. La frecuencia de linfocitos T específicos de p776-790 aumentó
solo desde 0,0001 % hasta 0,001 %. Esta Figura 1 es como se describe en cualquier parte (Knutson y Disis, Clin. Exp. Immunol., 135:322-329 (2004)).
Figura 2. Polarización de DC1 en CMSP crioconservadas. Se cultivaron CMSP descongeladas durante la noche en GM-CSF, luego se trataron con diversos agonistas de TLR o IFN-y , seguido por ELISA. Representativo de 14 pacientes sanos y con cáncer diferentes.
La Figura 3 contiene una tabla de esquema de comparación de cultivos.
Figura 4. CMSP pulsadas con GM-CSF, luego resiquimod LPS (GM+TLR), muestran activación superior de DC. Representativo de 3 donantes y 3 pulsos de Ag diferentes por donante (Candida, dominio intracelular (ICD) de HER2 o 15mero derivado de ICD (lo último no se muestra)). A las 48 horas, todas las células CD33+ también expresaron el marcador de DC CD11c (no mostrado). Cada grupo tratado con GM+TLR ("C") presentó HLA-DR y B7.1 regulados por incremento. A diferencia, DC en grupos GM ("B") o IL12 ("A") fueron activados heterogéneamente y en algunos casos mínimamente activados para B7.1 o HLA-DR. Los números dentro de los gráficos de puntos muestran el índice fluorescente del eje Y medio de la subpoblación CD33+. Cada determinación de IL12p70 o IL23 mostrada es el promedio de todos los donantes y Ag para las condiciones de cultivo A, B o C (n=9 para cada condición). BD=por debajo de la detección (<75 μg/ml).
Figura 5. Gráficos de puntos representativos para grupos activados por CAN e ICD de CMSP de un donante sano. Se compararon condiciones de cultivo de IL12 frente a GM frente a GM+TLR por un ensayo de citocinas intracelulares (ICC) al final de la ronda uno y también con continuación de la ronda dos de los grupos "GM+TLR" (resiquimod+LPS se omitieron después de la ronda 1). Solo se muestra la ventana de CD4. El % mostrado dentro de cada gráfico de puntos es el % de todos los linfocitos T CD4+ que producen IFN-y después de la exposición a CMSP recién descongeladas, ya sean sin pulsar (UP) o pulsadas con CAN o ICD. Se observaron tendencias paralelas con respecto a la sensibilización de linfocitos T CD8+ (no mostrado).
Figura 6. Impacto de GM-CSF e IL-7 sobre el enriquecimiento del método de cultivo de GM+TLR de frecuencia específica de Ag. A. Pocillos individuales de CMSPs recibieron o no recibieron rGM-CSF en el día 0 ("GM"). Todos los grupos recibieron Candida (CAN) en el día 1, y recibieron variablemente LPS y/o R848. Todos los grupos se expandieron en IL7IL2 ("2_7"). La reestimulación ocurrió 2 semanas después. Se muestra la proliferación en veces. El gráfico muestra la frecuencia calculada de linfocitos T CD4+ (izquierda) y CD8+ (derecha) productores de IFN-y específicos de CAN. B. Todos los cultivos de CMSP recibieron GM día 0, c An , R848 y LPS día 1, y variablemente IL2, IL-7, IL-15 y/o IL-21 (2, 7, 15, 21) día 2 a 15. Se muestra la proliferación en veces.
Figura 7. Impacto de rIL-7 frente a rIL-2 sobre la proliferación de linfocitos T específicos de Ag en cultivo. CAN fue el antígeno impulsor; todos los grupos recibieron GM-CSFresiquimod/LPS, luego o rIL7 o IL2. Los cultivos se reestimularon al final de la 2.a semana con CMSP autólogas recién descongeladas pulsadas con CAN. Solo se muestran los linfocitos T específicos de CAN que producen IFN-y . Las células se cargaron previamente con CellTrace para medir la proliferación (el eje X muestra la intensidad del violeta. Un desplazamiento de derecha a izquierda indica mayor proliferación ya que el colorante violeta se diluye a la mitad cada vez que se divide un linfocito T marcado. Las células también se expusieron a una tinción LIVE/DEAD. El eje Y muestra la intensidad de la tinción LIVE/DEAD (arriba está muerta, abajo está viva). Los linfocitos T específicos de CAN en IL-7 proliferaron más con muchas menos células muertas y mayores rendimientos (por ejemplo, "grupo de IL-7" expansión macroscópica de 10,8 veces, frecuencia de linfocitos T específicos de CAN viables 81 % al final del cultivo frente a "grupo de IL-2" expansión macroscópica de 1,7 veces, frecuencia de linfocitos T específicos viables de CAN 40 % al final del cultivo, (10,8 x 0,81) / (1,7 x 0,40) es igual a un número de 12,9 veces mayor de los linfocitos T específicos de CAN presentes en "grupo de IL-7").
Figura 8. Fenotipo de CMSP cultivadas 2 semanas empleando el método de cultivo "GM+TLR". Las células se pulsaron día 1 con CAN. El gráfico de puntos superior muestra la respuesta de ICC IFN-y 2 semanas después de que las CMSP se pulsaran con CAN recién preparado. Espícula azul incluye 100 % de producción de IFN-y específico de CAN por células CD4+ sensibilizadas/expandidas (39,5 % de linfocitos T CD4+ totales mostraron especificidad por CAN). Los gráficos inferiores muestran la expresión de células CD4+ de la espícula azul de CD28, CD56 y c Cr 7. % en RUQ y RLQ muestran el porcentaje de células CD4/INF-Y+.
Figura 9. Un intervalo de producción de citocinas puede ser provocado desde el sistema de cultivo. El diagrama de sectores muestra que aproximadamente el 80 % de linfocitos T CD4+ secretaron IFN-y , IL-2 y/o IL-17 tras la exposición a Ag relevante. Los sectores muestran % de linfocitos T específicos de Ag que produjeron o IFN-y , IL-2 o IL-17; o combinaciones de dos; o los tres. Estos resultados demuestran un patrón "por defecto" de producción de citocina que abarca el fenotipo funcional T1^ T17. Esta distribución puede indicar una población altamente eficaz de inmunoterapia adaptativa.
La Figura 10-12 son gráficos de puntos de adquisición que son representativos de la capacidad de expandir selectivamente linfocitos T específicos de antígeno (tanto linfocitos T CD4+ como CD8+) cuando los cultivos son impulsados por un péptido de CMV (citomegalovirus) (Figura 10), un péptido derivado de MUC1 (Figura 11), o un péptido derivado de HER2/neu (Figura 12). En todos los casos, las CMSP se expusieron a GM-CSF en el día 1 de cultivo, al antígeno peptídico, luego a resiquimod, luego a LPS en el día 2 de cultivo, luego a IL-7 a partir del día 3. No se realizó estimulación anti-CD3 policlonal. El final del cultivo varió del día 12 al día 21. Cada figura muestra la frecuencia de linfocitos T CD4+ y CD8+ que produjeron interferón-gamma tras la reexposición al antígeno impulsor o a antígenos de control al final del cultivo (los recuadros dentro de cada gráfico de puntos muestran el % de linfocitos T que producen interferón).
La Figura 13 es un gráfico que muestra que el tratamiento con (a) perlas de anticuerpo anti-CD3/anticuerpo anti-CD28 o (b) anticuerpo anti-CD3 inmovilizado y anticuerpo anti-CD28 soluble sin retirar dejó de expandir los linfocitos T específicos de antígeno. Todos los grupos se estimularon con péptido del CMV en el día 2 (etapa 1). El grupo "No estimulado" solo recibió tratamiento habitual (GM-CSF día 1, péptido R848+LPS+CMV día 2, luego se expandió en IL7 hasta el día 21). Otros grupos también recibieron o Activator anti CD3/28 Dynabeads ("perlas") en una relación 1:1 o anti-CD3 inmovilizado/anti-CD28 soluble ("CD3 inm./CD28 sol.") cada uno a 1 μg/ml. Número de linfocitos T CD4 y CD8 específicos de Ag en la recogida del día 19 calculado por millón a partir de CMSP. Cálculo = Expansión en veces x % de CD4 o % de CD8 x % de IFN-y que se produce tras la reexposición específica al péptido de CMV.
La Figura 14 es un gráfico que muestran que retirar las perlas de anticuerpo anti-CD3/anticuerpo anti-CD28 o el tratamiento con anticuerpo anti-CD3 inmovilizado y anticuerpo anti-CD28 soluble permitió la expansión de linfocitos T específicos de antígeno. Todos los grupos se estimularon con péptido del CMV en el día 2 (etapa 1). Grupo "No estimulado" como en la Figura 13. Otros grupos también recibieron o Activator anti CD3/28 Dynabeads en una relación 1:1 o CD3 inm./28 sol. cada uno a 1 μg/ml. La retirada de perlas y CD3 inm./28 sol. ocurrió 48 horas después de la adición. El número de linfocitos T CD4 y CD8 específicos de Ag en la recogida del día 21 se calculó como en la Figura 13.
La Figura 15 es un gráfico que muestra los resultados de la reestimulación de linfocitos T específicos de CMV con tratamiento con anticuerpo anti-CD3 inmovilizado y anticuerpo anti-CD28 soluble en los días indicados. Todos los grupos se estimularon con péptido del CMV en el día 2 (etapa 1). Grupo "No estimulado" como en la Figura 13. Otros grupos también recibieron CD3 inm./28 sol. cada uno a 1 μg/ml. La retirada de CD3 inm./28 sol. ocurrió 48 horas después de la adición. El número de linfocitos T CD4 y CD8 específicos de Ag en la recogida del día 21 se calculó como en la Figura 13.
La Figura 16 es un gráfico que muestra los resultados de la reestimulación de linfocitos T específicos de MUC1 con tratamiento con anticuerpo anti-CD3 inmovilizado y anticuerpo anti-CD28 soluble en los días indicados. Todos los grupos se estimularon con el péptido MUC1 en el día 2 (etapa 1). El grupo "No estimulado" solo recibió tratamiento habitual (GM-CSF día 1, péptido R848+LPS+MUC1 día 2, luego se expandieron en IL7 hasta el día 21). Otros grupos también recibieron CD3 inm./28 sol. cada uno a 1 μg/ml. La retirada de CD3 inm./28 sol. ocurrió 48 horas después de la adición. El número de linfocitos T CD4 y CD8 específicos de Ag en la recogida del día 21 se calculó como en la Figura 13.
La Figura 17 es un gráfico que muestra los resultados de la expansión de células de la reestimulación de linfocitos T específicos de MUC1 con un tratamiento con anticuerpo anti-CD3 inmovilizado, un tratamiento con anticuerpo anti-CD28 soluble, un tratamiento con anticuerpo anti-CD3 inmovilizado y anticuerpo anti-CD28 soluble a las dosis indicadas durante los tiempos indicados. Los métodos fueron los mismos que para la Figura 16.
La Figura 18 es un gráfico que muestra los resultados de la expansión de células de la reestimulación de linfocitos T específicos de MUC1 con perlas de anticuerpo anti-CD3/anticuerpo anti-CD28 o un tratamiento con anticuerpo anti-CD3 inmovilizado y anticuerpo anti-CD28 soluble a las relaciones indicadas durante los tiempos indicados. Todos los grupos recibieron el péptido MUC1 en el día 2. Grupo "No estimulado" como en la Figura 13. CD3 inm. usó una concentración de 0,3 μg/ml. CD28 soluble usó una concentración de 1,0 μg/ml. Se usan Activator Dynabeads en la relación entre pelas y linfocitos T y para la duración de exposición a perlas mostrada. El número de linfocitos T CD4 y CD8 específicos de Ag en la recogida del día 21 se calculó como en la Figura 13.
Figura 19. CMSP de pacientes con cáncer de mama avanzado pueden ser expandidas como se describe en el presente documento para generar tanto linfocitos T naturales CD4+ como CD8+ que reconocen antígenos asociados al cáncer, tales como MUC1 y/o HER2. El resultado del cultivo para las CMSP se ensayó en el día 19, de paciente con cáncer de mama avanzado expuesto en el día 2 de cultivo a una mezcla de polipéptidos SEA1, SEA2, SEA3 y CMV. Los gráficos muestran % de linfocitos T CD4+ o CD8+ que producen IFNy al final del cultivo cuando se reestimulan con CMSP autólogas recién descongeladas ya sea sin pulsar (UP) o pulsadas con péptidos individuales.
Figura 20. Resultado del cultivo para CMSP ensayadas en el día 19, que compara paciente con cáncer de mama avanzado con tres donantes sanos, cada uno expuesto en el día de cultivo 2 a una mezcla de péptidos derivados de MUC1 (SEA1, SEA2 y SEA3).
Figura 21. Linfocitos T CD3+, linfocitos B CD19+, CD33+ células mieloides y linfocitos citolíticos naturales CD56+ antes de y después del cultivo.
Figura 22. Linfocitos T CD3+ (CD4+, CD8+ y CD56+) antes y después del cultivo.
Figura 23. Expresión del receptor coestimulante y Foxp3 en linfocitos T al final del cultivo.
Figura 24. Coexpresión de LAP, GARP y Helios en linfocitos T Foxp3+ al final del cultivo.
Figura 25. Producción de citocinas específicas de Ag al final del cultivo.
Figura 26. Expansión de cultivos de linfocitos y frecuencia específica de Ag en placas de 24 pocillos frente a recipientes de Wilson-Wolf.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Este documento proporciona métodos y materiales para producir linfocitos T específicos de antígeno (por ejemplo, linfocitos T CD4+ específicos de antígeno y/o linfocitos T CD8+ específicos de antígeno). Por ejemplo, este documento proporciona métodos y materiales para realizar una etapa de estimulación policlonal de duración definida (por ejemplo, que normalmente varía de una hora a aproximadamente 24 horas dependiendo de la intensidad del estímulo) para aumentar aún más la expansión de linfocitos T que tienen una especificidad por antígeno deseada.
Como se describe en el presente documento, se pueden obtener células de sangre periférica (por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica (CMSP) sin fraccionar) de un mamífero (por ejemplo, un humano sano o un paciente humano con cáncer, tal como un humano con cáncer avanzado). Los ejemplos de otras poblaciones de células que se pueden obtener y usar como se describe en el presente documento para preparar poblaciones de linfocitos T específicos de antígeno (por ejemplo, linfocitos T CD4+ específicos de antígeno y/o linfocitos T CD8+ específicos de antígeno) incluyen, sin limitación, muestras de tumor, ganglio linfático, bazo, médula ósea, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido peritoneal y líquido articular que contienen células. Una vez obtenidas, las células se pueden cultivar inicialmente de un modo que promueve la presentación del antígeno. Por ejemplo, las CMSP sin fraccionar se pueden exponer a GM-CSF, el agonista del receptor del tipo toll 8 resiquimod, el agonista del receptor del tipo toll 4 lipopolisacárido (LPS) de E. coIí, o combinaciones de los mismos, con o sin exposición interpolada al antígeno(s) de interés. En algunos casos, las células se pueden exponer a GM-CSF, resiquimod y lipopolisacárido de E. coIí. La cantidad de GM-CSF puede ser desde aproximadamente 10 ng/ml hasta aproximadamente 100 ng/ml (por ejemplo, aproximadamente 40 ng/ml). La cantidad de resiquimod puede ser desde aproximadamente 1 μg/ml hasta aproximadamente 9 μg/ml (por ejemplo, aproximadamente 3 μg/ml). La cantidad de lipopolisacárido de E. coIí puede ser desde aproximadamente 1 ng/ml hasta aproximadamente 50 ng/ml (por ejemplo, aproximadamente 5 ng/ml). Se pueden usar otros agonistas de TLR8 (por ejemplo, motolimod) en lugar de o además de resiquimod. Se pueden usar otros agonistas de TLR4 (por ejemplo, lipopolisacárido de salmonella) en lugar de o además de LPS de E. coIí. En algunos casos, interferón-gamma y/u otros agonistas de TLR, tales como poli I :C (agonista de TLR3), se puede sustituir por el agonista del receptor 4 u 8 de tipo toll. Las células se pueden exponer a uno o más agentes designados para promover la presentación del antígeno (por ejemplo, GM-CSF, resiquimod y lipopolisacárido de E. coIí) durante cualquier longitud de tiempo apropiada. Por ejemplo, se puede lograr la presentación eficaz de antígeno(s) añadidos al cultivo exponiendo primero las CMSP sin fraccionar a GM-CSF solo durante 18-24 horas, luego al día siguiente añadiendo el antígeno(s) de interés, luego cuatro horas después añadiendo resiquimod y 30 minutos después añadiendo el lipopolisacárido durante 16-30 horas adicionales antes de pasar a la etapa 2 de cultivo.
Aunque las CMSP sin fraccionar se tratan de un modo que promueve la presentación del antígeno, las células se pueden exponer a uno o más antígenos deseados en condiciones que activan los linfocitos T reactivos contra ese (esos) antígeno(s) deseado(s). La primera etapa de cultivo puede ser pulsada con cualquier antígeno de interés apropiado. Por ejemplo, antígenos asociados al cáncer, tales como secuencias de péptidos derivadas de MUC1, HER2/neu o mesotelina, o las propias células tumorales procesadas (por ejemplo, lisados congelados-descongelados) 0 combinaciones de los mismos se pueden poner en contacto con las células. La cantidad de antígeno de péptido puede ser desde aproximadamente 5 μg/ml hasta aproximadamente 100 μg/ml (normalmente aproximadamente 10 50 μg/ml). Las células se pueden exponer a uno o más antígenos deseados durante cualquier longitud de tiempo apropiada. Por ejemplo, las células se pueden exponer a uno o más antígenos deseados durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas. En algunos casos, las células se pueden tratar de un modo que se promueve la presentación del antígeno y la exposición a uno o más antígenos deseados simultáneamente. Por ejemplo, las células se pueden exponer a GM-CSF, un antígeno(s) de interés, resiquimod y lipopolisacárido de E. coIí en esa secuencia en las primeras 36-60 horas de cultivo de CMSP.
Después de tratar las CMSP sin fraccionar de un modo que promueve la presentación del antígeno y exponer las células a al menos un antígeno de interés, las células se pueden exponer a IL-7 como la siguiente etapa de cultivo para expandir preferentemente la subpoblación de linfocitos T dentro de CMSP sin fraccionar que reconocen el (los) antígeno(s) pulsado(s) de interés. La cantidad de IL-7 puede ser desde aproximadamente 5 ng/ml hasta aproximadamente 100 ng/ml (por ejemplo, aproximadamente 10 ng/ml cada tres días o aproximadamente 50 ng/ml en medio fresco añadido). Las células se pueden exponer a IL-7 durante cualquier longitud de tiempo apropiada. Por ejemplo, las células se pueden exponer a IL-7 durante aproximadamente 10-22 días (por ejemplo, aproximadamente 17-19 días).
Después de tratar las células de un modo que promueve la presentación del antígeno, exponer las células a al menos un antígeno de interés y exponer las células a IL-7, las células se pueden exponer a (i) anticuerpos anti-CD3 inmovilizados y anticuerpos anti-CD28 solubles y/o (ii) perlas o matriz que contiene anticuerpos anti-CD3 y anticuerpos anti-CD28. Los ejemplos de perlas o matriz que contienen anticuerpos anti-CD3 y anticuerpos anti-CD28 incluyen, sin limitación, Dynabeads (obtenidas de Life Technologies, Inc.) y matriz MACS g Mp TransAct CD3/CD28 de Miltenyi). Se pueden usar Dynabeads que contienen anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 y que tienen diámetros de aproximadamente 4,5 gm como se describe en el presente documento. La relación entre células (CMSP cultivadas) y perlas puede ser desde aproximadamente 1:1 hasta aproximadamente 6:1. Cuando se usan anticuerpos anti-CD3 inmovilizados, la cantidad de anticuerpos anti-CD3 inmovilizados puede ser desde aproximadamente 0,1 gg/ml hasta aproximadamente 10 gg/ml (por ejemplo, aproximadamente 0,3 gg/ml). Cuando se usan anticuerpos anti-CD28 solubles, la cantidad de anticuerpos anti-CD28 solubles puede ser desde aproximadamente 0,1 gg/ml hasta aproximadamente 10 gg/ml (por ejemplo, aproximadamente 1 gg/ml).
Las células se pueden exponer a (i) anticuerpos anti-CD3 inmovilizados y anticuerpos anti-CD28 solubles y/o (ii) perlas o matriz que contiene anticuerpos anti-CD3 y anticuerpos anti-CD28 a partir de cualquier día de cultivo apropiado. Por ejemplo, las células se pueden exponer a anticuerpos anti-CD3 inmovilizados y anticuerpos anti-CD28 solubles en el día 12 de cultivo. Las células se pueden exponer a (i) anticuerpos anti-CD3 inmovilizados y anticuerpos anti-CD28 solubles y/o (ii) perlas o matriz que contiene anticuerpos anti-CD3 y anticuerpos anti-CD28 durante cualquier longitud de tiempo apropiada. Por ejemplo, las células se pueden exponer a anticuerpos anti-CD3 inmovilizados y anticuerpos anti-CD28 solubles desde aproximadamente 1 horas hasta aproximadamente 48 horas. En algunos casos, las células no se exponen a anticuerpos anti-CD3 inmovilizados y anticuerpos anti-CD28 solubles durante más de 4 horas. En algunos casos, las células se pueden exponer a perlas que contienen anticuerpos anti-CD3 y anticuerpos anti-CD28 desde aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 48 horas. En algunos casos, las células no se exponen a perlas que contienen anticuerpos anti-CD3 y anticuerpos anti-CD28 durante más de 4 horas. En algunos casos, cuantas más perlas se añadan, más corta podrá ser la exposición para evitar sobreestimular letalmente la subpoblación de linfocitos T específicos de antígeno deseada.
Después de exponer las células a (i) anticuerpos anti-CD3 inmovilizados y anticuerpos anti-CD28 solubles y/o (ii) perlas que contienen anticuerpos anti-CD3 y anticuerpos anti-CD28, las células se lavan o se tratan de un modo que se retiren los anticuerpos anti-CD3 inmovilizados, anticuerpos anti-CD28 solubles y perlas que contienen anticuerpos anti-CD3 y anticuerpos anti-CD28. Por ejemplo, las perlas que son magnéticas se pueden retirar de las células usando un imán.
Después de retirar las células de la exposición a anticuerpos anti-CD3 inmovilizados, anticuerpos anti-CD28 solubles y/o perlas que contienen anticuerpos anti-CD3 y anticuerpos anti-CD28, se puede seguir cultivando las células (i) en ausencia de anticuerpos anti-CD3 inmovilizados y anticuerpos anti-CD28 solubles y (ii) en ausencia de perlas que contienen anticuerpos anti-CD3 y anticuerpos anti-CD28. Se puede seguir cultivando las células en ausencia de (i) anticuerpos anti-CD3 inmovilizados y anticuerpos anti-CD28 solubles y (ii) perlas que contienen anticuerpos anti-CD3 y anticuerpos anti-CD28 durante cualquier longitud de tiempo apropiada. Por ejemplo, las células se pueden cultivar en ausencia de (i) anticuerpos anti-CD3 inmovilizados y anticuerpos anti-CD28 solubles y (ii) perlas que contienen anticuerpos anti-CD3 y anticuerpos anti-CD28 desde aproximadamente 7 días hasta aproximadamente 11 días. En algunos casos, las células se pueden cultivar en ausencia de (i) anticuerpos anti-CD3 inmovilizados y anticuerpos anti-CD28 solubles y (ii) perlas que contienen anticuerpos anti-CD3 y anticuerpos anti-CD28 durante más de 11 días.
Una vez se obtiene una población de linfocitos T específicos de antígeno (por ejemplo, linfocitos T CD4+ específicos de antígeno y/o linfocitos T CD8+ específicos de antígeno) como se describe en el presente documento, las células se pueden administrar a un mamífero para su uso en, por ejemplo, terapias celulares adaptativas para tratar infecciones y/o cáncer. Se puede tratar cualquier mamífero apropiado con los linfocitos T específicos de antígeno (por ejemplo, linfocitos T CD4+ específicos de antígeno y/o linfocitos T CD8+ específicos de antígeno) proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, se pueden tratar seres humanos, caballos, ganado vacuno, cerdos, perros, gatos, ratones y ratas con una población de linfocitos T específicos de antígeno (por ejemplo, linfocitos T CD4+ específicos de antígeno y/o linfocitos T CD8+ específicos de antígeno). En algunos casos, cualquier número apropiado de linfocitos T específicos de antígeno (por ejemplo, linfocitos T CD4+ específicos de antígeno y/o linfocitos T CD8+ específicos de antígeno) proporcionado en el presente documento se puede administrar a un mamífero. Por ejemplo, entre aproximadamente 1 x 103 células y aproximadamente 1-2 x 1011 linfocitos T que incluyen linfocitos T específicos de antígeno se pueden administrar a un mamífero. Se puede usar cualquier vía de administración apropiada para administrar los linfocitos T específicos de antígeno proporcionados en el presente documento a un mamífero. Por
ejemplo, se pueden administrar linfocitos T específicos de antígeno por vía intravenosa, por vía intraperitoneal, por vía subcutánea, por vía intramuscular, por vía intrahepática o por vía intranodal.
La invención se describirá adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrito en las reivindicaciones.
EJEMPL0S
Ejemplo 1 - Generación de poblaciones de linfocitos T específicos de antígeno a partir de CMSP
Se mostró previamente que se necesitaba IL-12 para expandir Th1 específico de Her2 ex vivo (Figura 1). Suponiendo que la rIL-12 exógena no podría proporcionar el beneficio completo de polarización de DC1 hacia cultivos de linfocitos T, se realizó lo siguiente para lograr la polarización natural de DC1, con producción de IL12p70, dentro de los cultivos en masa de CMSP. Aún cuando una variedad de señales de peligro emparejadas pueda polarizar eficazmente por DC1 DC humanas recién purificadas (por ejemplo, LPS+IFN-y ), la mayoría de dichas señales demostraron ser sorprendentemente ineficaces para activar la robusta producción de IL-12 en CMSP sin fraccionar. Solo la exposición durante la noche a GM-CSF, seguido por exposición combinada a agonistas de TLR4+TLR8 (LPS resiquimod (R848)), fue coherentemente eficaz para polarizar por DC1 CMSP humanas sin fraccionar, tanto frescas como crioconservadas (Figura 2). Este método de cultivo "GM+TLR" se comparó con los métodos de cultivo que omiten resiquimod+LPS ("GM") y en comparación con métodos de cultivo que usan IL-12 exógena, pero sin agonistas de GM-CSF o TLR ("IL-12" como en la Figura 1) (Figura 3). Se probaron repetidamente CMSP crioconservadas sometidas a leucocitaféresis de múltiples donantes sanos para su capacidad para dar lugar a linfocitos T CD4+ y CD8+ de tipo T1, específicamente reactivos hacia el extracto de candida de calidad clínica (CAN) o proteína de dominio intracelular HER2 (ICD) después de 1 o 2 rondas de cultivo impulsado por Ag. Se observó lo siguiente.
Solo cultivos de GM+TLR presentaron regulación por incremento de DC coherente de MHC y moléculas coestimulantes (Figura 4). Solo cultivos de GM+TLR produjeron IL12p70 e IL-23 (Figura 4). Los cultivos de GM+TLR pulsados por Ag superaron significativamente a los cultivos de GM e IL-12 pulsados con Ag en: veces de expansión, frecuencia específica de Ag y rendimiento total de linfocitos T1 específicos de Ag (IFN-Y+), tanto CD4+ como CD8+, al final del cultivo de ronda 1 (Figura 5). La frecuencia de linfocitos T productores de IFN-y específicos de HER2 al final del cultivo de ronda 1 fue 9,0 % ± 2,1 de células CD4+ y 4,1 ± 1,5 % de CD8+, con un aumento adicional en la especificidad normalmente observada tras una segunda ronda de cultivo impulsado por DC pulsado por Ag (Figura 5). Este robusto enriquecimiento específico de Ag de tanto linfocitos T CD4+ como CD8+ se logró frecuentemente en los cultivos de GM+TLR incluso sin vacunación previa de CAN o Her2Neu.
Además de enriquecer en especificidad por HER2, dos rondas de cultivo optimizado impulsado por DC dieron como resultado una expansión numérica de linfocitos T de 100-400 veces, lo que permitió que se prepararan 1011 o más linfocitos T enriquecidos en especificidad por HER2 a partir de simplemente 109 CMSP.
Pareció en esta etapa que la especificidad por Ag enriquecida al máximo en cultivos de linfocitos T de CMSP requirió la exposición a agonista de GM-CSF e IL-7 y TLR (Figura 6). La omisión de los agonistas de TLR dobles dividió eficazmente a la mitad la proporción de linfocitos T CD8+ específicos de Ag y la omisión de GM-CSF cortó eficazmente a un tercio la proporción de linfocitos T CD4+ específicos de Ag. La omisión de IL-7 redujo eficazmente la especificidad en un logaritmo. Además, factores tales como IL-21, IL-15 e IL-4 alteraron relativamente el desarrollo de especificidad por linfocitos T enriquecidos en comparación con IL-7 solo.
Murió la mayoría de linfocitos T cultivados en IL-2 en vez de IL-7. Los linfocitos T supervivientes específicos de Ag liberaron IFN-y , pero presentaron proliferación mínima. A diferencia, la mayoría de los linfocitos T cultivados en IL-7 sobrevivieron y proliferaron si fueron específicos de Ag, explicando el mayor rendimiento logarítmico y la mayor frecuencia de linfocitos T específicos de Ag, tanto CD4+ como CD8+, en cultivos basados en IL-7 (Figura 7).
El fenotipo de los linfocitos T específicos de Ag propagados en cultivo de GM+TLR fue CD28+ y CD56-, un estado probablemente ideal de diferenciación "joven" para la terapia adaptativa de linfocitos T (Figura 8). Estuvieron presentes tanto subpoblaciones de CCR7bajo como CCR7alto, de acuerdo con una presencia mixta de subconjuntos efectores de memoria y de memoria central (Figura 8).
La Figura 10-12 son gráficos de puntos de adquisición que demuestran la capacidad de expandir selectivamente linfocitos T específicos de antígeno (tanto linfocitos T CD4+ como CD8+) cuando los cultivos son impulsados por un péptido de CMV (citomegalovirus) (Figura 10), un péptido derivado de MUC1 (Figura 11), o un péptido derivado de HER2/neu (Figura 12). En todos los casos, las CMSP se expusieron a GM-CSF en el día 1 de cultivo, al antígeno peptídico, luego a resiquimod, luego a LPS en el día 2 de cultivo, luego a IL-7 a partir del día 3. El final del cultivo varió del día 12 al día 21. No se realizó etapa de estimulación policlonal. Cada figura muestra la frecuencia de linfocitos T CD4+ y CD8+ que produjeron interferón-gamma tras la reexposición al antígeno impulsor o a antígenos de control al final de cultivo (los recuadros dentro de cada gráfico de puntos muestran el % de linfocitos T que producen interferóngamma). Estas figuras demuestran la capacidad de GM-CSF, resiquimod, LPS e interleucina-7 de generar el rápido enriquecimiento de linfocitos T CD4+ y CD8+ específicos de Ag incluso sin estimulación anti-CD3 policlonal. Las Figuras
13-18 demuestran cómo la estimulación anti-CD3 policlonal de duración óptima definida, seguida de cultivo adicional en ausencia de estimulación policlonal, puede aumentar sustancialmente tanto los rendimientos absolutos como frecuentemente la frecuencia de linfocitos T específicos de antígeno.
Tomados conjuntamente, estos resultados demuestran que grandes números de linfocitos T específicos de antígeno se pueden lograr a partir de CMSP en 21 días o menos.
Ejemplo 2 - Generación de poblaciones de linfocitos T específicos de antígeno a partir de CMSP
Lo siguiente se realizó para confirmar que CMSP de pacientes con cáncer de mama avanzado pueden ser expandidas como se describe en el presente documento (con la excepción de la estimulación con perlas anti-CD3 en el día 12 de cultivo) para generar tanto linfocitos T naturales CD4+ como CD8+ que reconocen antígenos asociados al cáncer, tales como MUC1 y/o HER2. Lo siguiente también se realizó para confirmar que los linfocitos T pueden ser sensibilizados satisfactoriamente incluso cuando los antígenos se proporcionan como mezclas de polipéptidos, en vez de como polipéptidos individuales.
Brevemente, se obtuvieron CMSP de una paciente de 42 años diagnosticada con cáncer de mama ER-/PR-/HER2+ del lado derecho, tratado inicialmente con quimioterapia neoadyuvante que incluye Herceptin (trastuzumab) y resección quirúrgica, y recetada con Herceptin de mantenimiento. Se identificó metástasis al hígado, y empezó a recibir ado-trastuzumab emtansina (Kadcyla). Después de cuatro ciclos, las metástasis cerebrales fueron evidentes, para lo que recibió radioterapia estereotáctica. Se recogieron CMSP y se crioconservaron antes de la administración adicional de Kadcyla. Se cultivaron CMSP descongeladas como se describe en el presente documento, exponiendo las CMSP en el día 2 a una mezcla de péptidos derivados de MUC1 (SEA1, SEA2 y SEA3), con o sin un péptido de control derivado de CMV también añadido a la mezcla (cada péptido a 10 μg/ml). Después de la expansión del cultivo en interleucina-7 hasta el día 19 de cultivo, los linfocitos T se reexpusieron a las CMSP autólogas recién descongeladas pulsadas con péptidos individuales relevantes y de control.
Los resultados se obtuvieron en el día 19 de cultivo cuando la mezcla del día 2 contuvo tanto péptidos SEA (derivados de MUC1) como péptido del citomegalovirus (CMV), lo que demuestra que tanto los linfocitos T CD4+ como CD8+ derivados por el método de cultivo estuvieron altamente enriquecidos para el reconocimiento de al menos una porción de los antígenos impulsores, en este caso tanto especificidades de CMV como de SEA1 (Figura 19). A diferencia, los linfocitos T sensibilizados a una mezcla de péptidos derivados de MUC1 que no incluyen CMV reconocieron péptidos MUC1 al final del cultivo, pero no CMV (no mostrado). Los linfocitos T específicos de MUC1 generados pueden ser terapéuticamente activos si se reinyectan como inmunoterapia adaptativa autóloga en pacientes con tumores malignos que expresan MUC1, que incluyen a la gran mayoría de pacientes con cáncer de mama, pancreático, colorrectal, y muchos otros tipos de cáncer. Debido a que las CMSP de la paciente en este ejemplo estuvieron limitadas en número (obtenidas por flebotomía periférica en vez de leucocitaféresis), el experimento se realizó como un cultivo de cribado a pequeña escala en placas de 24 pocillos. Se omitió la etapa de estimulación de cultivos anti-CD3/CD28, pero se puede incluir. Se pueden usar CMSP de pacientes con tipos adicionales de cánceres avanzados. La satisfactoria activación de linfocitos T reactivos con MUC1 y/o reactivos con HER2neu usando el sistema de cultivo descrito en el presente documento fue representativa de tres pacientes con cáncer de mama avanzado y una paciente con cáncer de mama no recurrente.
Como se demuestra en las Figuras 19 y 20, el cultivo no requirió que los polipéptidos se añadieran individualmente al cultivo. Se cultivaron CMSP descongeladas de donantes sanos o pacientes con cáncer sometidos a leucocitaféresis como se describe en el presente documento, exponiéndose las CMSP en el día 2 a mezclas de polipéptidos. Los datos muestran que los linfocitos T derivados del método de cultivo estaban altamente enriquecidos en el día 19 para el reconocimiento de al menos un subconjunto de los antígenos impulsores para tanto células CD4+ como CD8+. Es interesante señalar que, mientras que los polipéptidos pulsados individualmente generaron un enriquecimiento máximo si se pulsaron a 50 μg/ml, la pulsación en mezcla funcionó mejor a 10 μg/ml para cada polipéptido, lo que significa que las mezclas permitieron la conservación de no solo el polipéptido, sino también de CMSP y de todos los demás reactivos de cultivo celular, puesto que se requirieron muchas menos CMSP para generar el mismo número absoluto de linfocitos T reactivos con Ag cuando se emplearon las mezclas. Además, el enfoque de mezcla puede permitir que los cultivos sigan adelante para la administración terapéutica, aunque diferentes donantes presentan sensibilizaciones de linfocitos T dispares (por ejemplo, a SEA2 y/o SEA3 en vez de (o además de) SEA1).
Las Figuras 21 y 22 muestran composiciones representativas de diferentes linajes celulares antes y después del cultivo de un donante sano representativo y un paciente con cáncer. Antes del cultivo, los linfocitos T (CD3+) eran aproximadamente el 50 % de las CMSP totales, constituyendo los monocitos mieloides (CD33+), los linfocitos B (CD19+) y las células NK (CD56+) los otros linajes presentes (Figura 21). Al final del cultivo (día 19), las células CD33+ y CD19+ fueron escasas en número (Figura 21), mientras que los linfocitos T CD3+ representaron el 80-90% de las células totales (Figura 21). Como se muestra en la Figura 22, los linfocitos T CD4+ continuaron representando la mayoría de linfocitos T CD3+ entre el día 0 y 19, pero los linfocitos T CD8+ también se expandieron (Figura 22) y también se enriquecieron en reactividad específica de Ag (Figuras 19 y 20).
Tanto si procedían de un donante sano como de un paciente con cáncer, los linfocitos T generados como se describe en el presente documento expresaron de forma variable CD28, PD1, CTLA4 y Foxp3 al final del cultivo (día 19). Se analizaron los linfocitos T para la coexpresión de diversos receptores de ligandos coestimulantes (CD28, el receptor activador de B7.1; CTLA4, el receptor inhibidor de B7.1; y PD1, el receptor inhibidor de PD-L1 (también conocido como B7H1)).
Se determinó el porcentaje de linfocitos T CD4+ o CD8+ totales que expresaban estos receptores y/o Foxp3 en el día 19 de cultivo (Figura 23). La tinción representativa con mAb de isotipo (control negativo) se mostró en la Figura 23 como "Iso". Además, el subanálisis en la Figura 24 de la subpoblación Foxp3+ reveló que números triviales de linfocitos T Foxp3+ coexpresan LAP o GARP, lo que significa que la gran mayoría de los linfocitos T Foxp3+ del día 19 eran linfocitos T efectores en lugar de reguladores (Figura 23). Similarmente, la subpoblación Helios+ expresó niveles insignificantes de LAP o GARP (Figura 23), lo que significa que el subconjunto de linfocitos T Helios+ también constituía linfocitos T efectores en lugar de reguladores. Además, la expresión de PD1 y/o CTLA4 en la Figura 23 significa que es probable que la reinfusión adaptativa de estos linfocitos T se potencie terapéuticamente mediante inhibidores del punto de control que bloqueen PD1 (nivolumab y pembrolizumab) y/o CTLA4 (ipilimumab) (Topalian et al., Nat. Rev. Cancer. Rev. Cancer., 16(5):275-87 (2016)).
Los ensayos Luminex al final del cultivo demostraron que los linfocitos T cultivados secretaban muchas citocinas tras la reexposición al Ag impulsor del cultivo, dominada por la secreción de IFN-y , pero no limitada a ella (Figura 25). Los cultivos impulsados por CMV (las dos primeras barras de cada gráfico de la Figura 25) se reestimularon con CMSP autólogas recién descongeladas, sin impulsar (primera barra de cada gráfico de la Figura 25) o impulsadas por CMV (segunda barra de cada gráfico de la Figura 25). Similarmente, los cultivos impulsados por SEA2 (dos últimas barras de cada gráfico de la Figura 25) se reestimularon con CMSP autólogas recién descongeladas, sin impulsar (tercera barra de cada gráfico de la Figura 25) o impulsadas por SEA2 (cuarta barra de cada gráfico de la Figura 25). Dicho predominio de IFN-y puede indicar que la potencia terapéutica de los linfocitos T expandidos por estos métodos es alta (Schwartzentruber et al., J. Immunol., 146(10):3674-81 (1991)).
Además, la expansión en masa de CMSP impulsadas con Ag en recipientes de cultivo Wilson-Wolf funcionó mejor que los cultivos a pequeña escala en placas de 24 pocillos (Figura 26). Wilson-Wolf desarrolló los recipientes Wilson-Wolf G-Rex con membranas "base" permeables al gas para evitar que se acumulara una acidez adversa en los cultivos de linfocitos T a gran escala (Jin et al., J. Immunother., 35(3):283-92 (2012)). Esto permitió que una variedad de cultivos a gran escala se mantuviera con mejores rendimientos totales de linfocitos T y frecuencia reactiva a Ag a los 19 días de cultivo, incluso sin incorporar una etapa de reestimulación policlonal anti-CD3/CD28 en el día 12.
Estos resultados demuestran que las técnicas de cultivo proporcionadas en el presente documento rinden bien con células de pacientes con cáncer avanzado, así como donantes sanos y cuyos cultivos pueden ser pulsados con una mezcla de polipéptidos, en vez de un único polipéptido, para desarrollar subconjuntos de linfocitos T que reconocen cada uno de los polipéptidos en la mezcla. Estos resultados también demuestran que el aumento de escala con recipientes de cultivo Wilson-Wolf es eficaz para expandir linfocitos T específicos de antígeno.
Claims (10)
1. Un método in vitro de producción de una población de células que comprende linfocitos T que tienen especificidad por un antígeno de interés, en donde dicho método comprende:
(a) exponer una población de células que comprende células mononucleares de sangre periférica (CMSP) a GM-CSF, resiquimod, lipopolisacárido de E. coli y un antígeno de interés durante un primer periodo de tiempo,
(b) exponer dicha población de células a IL-7 durante un segundo periodo de tiempo,
(c) exponer dicha población de células a (i) anticuerpos anti-CD3 inmovilizados y anticuerpos anti-CD28 solubles o (ii) perlas que comprenden anticuerpos anti-CD3 y anticuerpos anti-CD28 durante un tercer periodo de tiempo para formar una población de células tratadas, y
(d) cultivar dicha población de células tratadas en ausencia de (i) dichos anticuerpos anti-CD3 inmovilizados y anticuerpos anti-CD28 solubles y (ii) dichas perlas durante un cuarto periodo de tiempo para producir una población de células final que comprende linfocitos T que tienen especificidad por dicho antígeno de interés.
2. El método de la reivindicación 1, en donde las células de dicha población de células son células humanas.
3. El método de la reivindicación 1, en donde dicho GM-CSF es un GM-CSF humano.
4. El método de la reivindicación 1, en donde dicho antígeno de interés es un antígeno asociado al cáncer, opcionalmente en donde dicho antígeno asociado al cáncer es MUC1, HER2/neu, mesotelina, WT1, NYEso-1, MART1, gp100 o TRP.
5. El método de la reivindicación 1, en donde dicho antígeno de interés es un antígeno asociado a patógeno, opcionalmente en donde dicho antígeno asociado a patógeno es un citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, virus del papiloma humano, Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans, Aspergillis, Mycobacterium avian intracellularis, virus del Ébola o antígeno del VIH.
6. El método de la reivindicación 1, en donde dicha IL-7 es una IL-7 humana.
7. El método de la reivindicación 1, en donde dicho primer periodo de tiempo es entre aproximadamente 16 horas y aproximadamente 48 horas, y/o
en donde dicho segundo periodo de tiempo es entre aproximadamente 9 días y aproximadamente 11 días, y/o en donde dicho tercer periodo de tiempo es entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 48 horas, y/o en donde dicho cuarto periodo de tiempo es entre aproximadamente 6 días y aproximadamente 10 días.
8. El método de la reivindicación 1, en donde dicho método comprende exponer dicha población de células a dichos anticuerpos anti-CD3 inmovilizados y dichos anticuerpos anti-CD28 solubles.
9. El método de la reivindicación 8, en donde dicha población de células final comprende más de 3 x 106 linfocitos T CD4+ específicos de dicho antígeno de interés por millón de células de dicha población de células.
10. El método de la reivindicación 1, en donde dicho método comprende exponer dicha población de células a dichas perlas, opcionalmente en donde dichos anticuerpos anti-CD3 y dichos anticuerpos anti-CD28 se unen covalentemente a dichas perlas.
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