JP2022163062A - Ｃｃｒ２＋造血幹細胞は養子細胞療法におけるｔ細胞活性化を媒介する - Google Patents

Abstract

【課題】がんまたは感染症から選択される疾患を処置する方法を提供する。【解決手段】疾患を有する対象に養子細胞療法（ＡＣＴ）を投与すること、および、対象に造血幹細胞を含有する調製物を投与することを含み、ここで、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＣＣＲ２陽性（ＣＣＲ２＋）細胞（またはＣＣＲ２＋細胞の前駆体）について濃縮され、およびここで、対象は、免疫チェックポイント阻害剤を受けていない、がんまたは感染症から選択される疾患を処置する方法である。【選択図】なし

Description

関連出願
この出願は、２０１６年１２月２１日に出願された米国仮特許出願番号６２／４３７５８２の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
政府の支援
この発明は、国立衛生研究所によって授与されたＲ０１ ＣＡ１９４２３９下の政府の支援によりなされた。政府は発明において一定の権利を有する。

開示の背景
がん細胞を含む様々な細胞に対するＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞活性の増強は、がんおよび感染症を処置するために研究されているアプローチである。１つの戦略では、Ｔリンパ球を抗原で刺激し、ex vivoで増殖させ、次いで対象に輸血する。これは養子細胞療法（ＡＣＴ）の一形態である。一定のＡＣＴ戦略が早期臨床試験でがんの退行を誘導することが示されている。ＡＣＴは、免疫除去および造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）の後に生じるがんおよび／または感染症を処置するのに特に有用であり得る。

がんを処置するために研究されている別のアプローチは、骨髄から収集されるかまたは骨髄から動員され、末梢血中で収集される造血幹細胞（ＨＳＣ）を用いる造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）に続く高用量の化学療法である。ＨＳＣＴおよび／またはＨＳＣ動員は、リンパ球減少症を誘発するための処置と組み合わされると、一定の細胞ベースの免疫療法の効果を増強し得る。ＨＳＣまたはＨＳＣ動員剤単独の投与は、異なるがんを有する多くの対象において臨床効果を示さない。
発明者は以前に、ＣＣＲ２＋細胞を含む骨髄由来造血幹細胞（ＨＳＣ）が、一定の場合には免疫チェックポイント阻害剤療法を増強することができるという独自の観察を行った（ＰＣＴ／ＵＳ１６／４４７１８、その全体を参照により本明細書に組み入れる）。

開示の概要
本開示によれば、ＡＣＴと共にＣＣＲ２陽性（ＣＣＲ２^＋）ＨＳＣを投与すると、ＡＣＴ単独と比較して、腫瘍微小環境内および腫瘍流入領域リンパ節内で養子移送Ｔ細胞の活性化およびＩＦＮγ分泌が有意に増加することが発見された。発明者は、養子細胞療法（ＡＣＴ）を受けているが免疫チェックポイント阻害剤による免疫チェックポイント遮断を受けていない対象へのＣＣＲ２^＋ＨＳＣの投与がＡＣＴの生存の増加をもたらすことを驚くべきことに見出した。開示のいかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、ＣＣＲ２^＋ＨＳＣ移送とＡＣＴとの組み合わせが腫瘍微小環境内でのＩＦＮγ陽性Ｔ細胞の増加をもたらすという実証を通して、メカニズムへの洞察が提供される。

一側面において、ＡＣＴプラットフォームは、腫瘍由来の全ＲＮＡでパルスした骨髄由来樹状細胞を用いて、ex vivoで腫瘍特異的Ｔ細胞（ＴＴＲＮＡ－Ｔ細胞）を増殖させる（Flores et al., 2015）。これらの研究は、ＡＣＴとのＨＳＣ投与が、ＡＣＴ単独と比較して、腫瘍微小環境内および腫瘍流入領域リンパ節内のＴＴＲＮＡ－Ｔ細胞活性化およびＩＦＮγ分泌を有意に増加させることを実証している。本発明によれば、対象におけるがんまたは感染症から選択される疾患を処置する方法が提供される。方法は、疾患を有する対象に養子細胞療法（ＡＣＴ）を投与すること、および、疾患を処置するのに有効な量の造血幹細胞を含有する調製物を対象に投与することを含み、ここで、造血幹細胞（ＨＳＣ）はＣＣＲ２陽性（ＣＣＲ２＋）細胞（またはＣＣＲ２＋細胞の前駆体）について濃縮され、対象は免疫チェックポイント阻害剤を受けていない。

態様において、調製物におけるＨＳＣは系統枯渇している。態様において、調製物におけるＨＳＣは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％またはさらには９９％のＣＣＲ２＋細胞（またはＣＣＲ２＋細胞の前駆体）である。態様において、調製物におけるＨＳＣは、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％未満、またはさらには１％未満のＣＣＲ２陰性（ＣＣＲ２－）細胞である。態様において、調製物における５０％と１００％との間の細胞は、ＣＣＲ２＋細胞（またはＣＣＲ２＋細胞の前駆体）である。
態様において、調製物における細胞は、ＣＣＲ２＋系統陰性ＨＳＣを生じ得る、ＣＤ３４＋ＨＳＣ、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＨＳＣ、またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）ブライトＨＳＣとして定義されるようなＣＣＲ２＋細胞の前駆体である。
前述の態様のいずれかにおいて、任意に、対象は放射線療法または化学療法で処置されている。前述の態様のいずれかにおいて、任意に、対象は放射線療法または化学療法を受ける予定である。

前述の態様のいずれかにおいて、造血幹細胞の供給源は、骨髄、末梢血、臍帯血、または誘導多能性幹細胞であり得る。前述の態様のいずれかにおいて、造血幹細胞の供給源は造血前駆細胞であり得る。前述の態様のいずれかにおいて、幹細胞の供給源は自家性であり得る。前述の態様のいずれかにおいて、幹細胞の供給源は同種異系であり得、ドナー細胞はレシピエントに対してＨＬＡが一致している。
前述の態様のいずれかにおいて、養子細胞療法は、キメラ抗体受容体（ＣＡＲ）改変Ｔ細胞であり得る。いくつかの態様において、療法は、本明細書に記載の疾患または感染のいずれかを処置するために使用され得る。
前述の態様のいずれかにおいて、疾患はがんであり得、がんは、メラノーマ、有棘細胞癌、基底細胞癌、乳がん、頭頸部癌、甲状腺癌、軟部組織肉腫、骨肉腫、精巣がん、前立腺がん、卵巣がん、膀胱がん、皮膚がん、脳がん、神経膠芽腫、髄芽腫、上衣腫、血管肉腫（angiosarcoma）、血管肉腫（hemangiosarcoma）、マスト細胞腫瘍、原発性肝がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、胃腸がん、腎細胞癌、造血器新生物、リンパ腫、中皮腫、神経膠芽腫、低悪性度の神経膠腫、高悪性度の神経膠腫、小児脳がん、髄芽腫、またはその転移性のがんであり得る。

態様において、がんは、脳、肺、乳房、またはメラノーマの転移性または難治性のがんである。態様において、がんは、非小細胞肺がんからの転移性の脳がん、メラノーマからの転移性の脳がん、または乳癌からの転移性の脳がんである。態様において、がんは、神経膠芽腫、低悪性度の神経膠腫、高悪性度の神経膠腫、小児脳がん、または髄芽腫である。
前述の態様のいずれかにおいて、疾患は感染症であり得る。態様において、感染症は慢性の感染症である。態様において、感染症は、任意の肝炎、アデノウイルス、ＢＫなどのポリオーマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＹ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＹ）、インフルエンザＡ、Ｂ、および／またはＣ型、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、メチシリン耐性Staphylococcus aureus（ＭＲＳＡ）を含むStaphylococcus種、Streptococcus pneumoniaを含むStreptococcus種、または移植後感染である。態様において、感染症は、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、またはＣ型肝炎である。

発明の別の側面によれば、対象を処置するためのＡＣＴに対する改善が提供される。改善は、造血幹細胞を含有する調製物を対象に投与すること（すなわち、ＨＳＴを投与すること）を含み、ここで、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＣＣＲ２陽性（ＣＣＲ２＋）細胞（またはＣＣＲ２＋細胞の前駆体）について濃縮され、対象は、免疫チェックポイント阻害剤を受けていない。態様において、調製物におけるＨＳＣは系統枯渇している。態様において、調製物におけるＨＳＣは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％またはさらには９９％のＣＣＲ２＋細胞（またはＣＣＲ２＋細胞の前駆体）である。態様において、調製物におけるＨＳＣは、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％未満、またはさらには１％未満のＣＣＲ２陰性（ＣＣＲ２－）細胞である。態様において、調製物における５０％と１００％との間の細胞は、ＣＣＲ２＋細胞（またはＣＣＲ２＋細胞の前駆体）である。前述の態様のいずれかにおいて、ＡＣＴは、がんを有する対象または感染症を有する対象を処置することであり得る。がんおよび感染症は上記の通りであり得る。

発明の別の側面によれば、キットが提供される。キットは、ＡＣＴのためのＴ細胞を含有する第１の容器およびＨＳＣを含有する第２の容器を含有するパッケージならびに使用のための説明書であり、ここで、造血幹細胞（ＨＳＣ）はＣＣＲ２陽性（ＣＣＲ２＋）細胞（またはＣＣＲ２＋細胞の前駆体）について濃縮され、およびここで、説明書は免疫チェックポイント阻害剤なしの使用を示す。態様において、調製物におけるＨＳＣは系統枯渇している。態様において、調製物におけるＨＳＣは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％またはさらには９９％のＣＣＲ２＋細胞（またはＣＣＲ２＋細胞の前駆体）である。態様において、調製物におけるＨＳＣは、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％未満、またはさらには１％未満のＣＣＲ２陰性（ＣＣＲ２－）細胞である。態様において、調製物における５０％と１００％との間の細胞は、ＣＣＲ２＋細胞（またはＣＣＲ２＋細胞の前駆体）である。前述の態様のいずれかにおいて、Ｔ細胞およびＨＳＣは同系であってもなくてもよい。前述の態様のいずれかにおいて、Ｔ細胞はＣａｒＴ細胞であり得る。前述の態様のいずれかにおいて、Ｔ細胞およびＨＳＣは、ＨＬＡが一致し得る。
発明のこれらおよび他の側面は、以下にさらに詳細に記載される。
図面の簡単な説明

図１Ａは、ＣＣＲ２＋ＨＳＣが、悪性神経膠芽腫モデルにおいて抗ＰＤ－１と組み合わされると、流入領域リンパ節において宿主Ｔ細胞を交差抗原刺激（cross prime）することができることを示す。 図１Ｂは、ＣＣＲ２＋ＨＳＣが、髄芽腫モデルにおいて抗ＰＤ－１と組み合わされると、流入領域リンパ節において宿主Ｔ細胞を交差抗原刺激することができることを示す。 図２は、ＡＣＴとのＨＳＣ投与が、ＡＣＴ単独と比較して、腫瘍微小環境内および腫瘍流入領域リンパ節内のＴＴＲＮＡ－Ｔ細胞活性化およびＩＦＮγ分泌を有意に増加させることを示す。ＡＣＴ単独と対比して、ＡＣＴ＋ＨＳＣを受けたマウスからのＲＮＡが、Ｔ細胞活性化およびＢ細胞活性化についてＲＴ２ ＰＣＲアレイを用いて分析された。

図３Ａ～３Ｃは、ＣＣＲ２^＋ＨＳＣ移送が腫瘍微小環境内での増加したＴＴＲＮＡ－Ｔ細胞活性化と関連していることを示す。図３Ａは、ＨＳＣがさらにＣＣＲ２＋ＨＳＣまたはＣＣＲ２－ＨＳＣに単離され、ＡＣＴを受けた担腫瘍マウスに移送されたことを示す。ＡＣＴ用の腫瘍特異的Ｔ細胞は、ＧＲＥＡＴマウスを用いて作製された。ＡＣＴの１週間後、腫瘍を採取し、ＹＦＰ（ＩＦＮγ）の相対的発現を群間で定量した。図３Ｂは、移送の２４時間後に、ＣＣＲ２－ＨＳＣと比較して、より多くのＣＣＲ２＋ＨＳＣが頭蓋内腫瘍において見出されることを示す。図３Ｃは、ＣＣＲ２－ＨＳＣ由来細胞およびＣＣＲ２＋ＨＳＣ由来細胞が、ＣＣＲ２－ＨＳＣまたはＣＣＲ２＋ＨＳＣのいずれかと共にＡＣＴを受けたマウスの頭蓋内腫瘍から単離されたことを示す。ＨＳＣ由来細胞は、フローサイトメトリーを用いて表現型を決定された。

図４は、ＣＣＲ２^＋ＨＳＣがin vitroでＡＰＣに分化することを示す。ＣＣＲ２－ＨＳＣおよびＣＣＲ２＋ＨＳＣは、マウス骨髄から新たに単離され、以前に確立された樹状細胞生成プロトコルでin vitroで培養した。得られた細胞は、抗原提示細胞のマーカー、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｇｒ１－１、ＭＨＣＩＩについて表現型を決定した。次いで、ＣＣＲ２－ＨＳＣおよびＣＣＲ２＋ＨＳＣのいずれかに由来する得られた細胞は、腫瘍抗原を提示する能力について試験された。腫瘍特異的エフェクターＴ細胞を用いて、腫瘍ＲＮＡでパルスしたＣＣＲ２－ＨＳＣ由来細胞、または腫瘍ＲＮＡでパルスしたＣＣＲ２＋ＨＳＣ由来細胞のいずれかを標的とした。同種抗原のＴ細胞認識の指標としてＩＦＮγは測定された。

図５Ａ～５Ｃは、ＣＣＲ２^＋ＨＳＣ由来細胞が頭蓋内腫瘍内のＴ細胞に腫瘍抗原を提示することを示す。図５Ａは、ＨＳＣ由来細胞がＡＣＴを受けた担腫瘍マウスから単離されたことを示す。エフェクター腫瘍特異的Ｔ細胞（ＴＴＲＮＡ Ｔ細胞）を、単離されたＨＳＣ由来細胞を標的とするためのin vitro機能アッセイにおいて使用した。同種の腫瘍抗原が腫瘍特異的Ｔ細胞（ＴＴＲＮＡ Ｔ細胞）に提示されていることの指標としてＩＦＮγ分泌は測定された。図５Ｂは、ＭＨＣ Ｉ^－／－またはＭＨＣ ＩＩ^－／－マウスのいずれかから単離されたＨＳＣが、ＧＲＥＡＴマウスから生成された腫瘍特異的Ｔ細胞と共にＡＣＴを受けた後期担腫瘍マウスに移送されたことを示す。ＡＣＴの１週間後、腫瘍は切除され、ＣＤ３^＋ＹＦＰ^＋細胞の相対的発現について分析された。図５Ｃは、照射の有無に関わらず頭蓋内腫瘍から単離されたＨＳＣ由来細胞がＴＴＲＮＡ－Ｔ細胞を活性化する能力を有することを示す。

図６Ａ～６Ｂは、腫瘍内ＣＣＲ２^＋ＨＳＣ由来細胞が末梢において腫瘍特異的Ｔ細胞を交差抗原刺激することを示す。図６Ａは、確立されたＫＲ１５８Ｂ頭蓋内神経膠腫を有するマウスが養子細胞療法に加えてＧＦＰ^＋ＨＳＣ、ＧＦＰ^＋ＣＣＲ２^－ＨＳＣ、またはＧＦＰ^＋ＣＣＲ２^＋ＨＳＣのいずれかを受けたことを示す。ＡＣＴの１週間後、ＧＦＰ＋細胞は滅菌ＦＡＣＳを用いて腫瘍から単離された。次いで、これらはＤｓＲｅｄ^＋腫瘍特異的Ｔ細胞を用いてＡＣＴを受けた第２セットの担腫瘍マウスの「ワクチン」として使用された。図６Ｂは、ワクチン流入領域リンパ節が「ワクチン」の１週間後に収集され、群間のＤｓＲｅｄ^＋腫瘍特異的Ｔ細胞の相対的増殖がフローサイトメトリーを用いて評価されたことを示す。 図７Ａは、ＣＣＲ２^＋ＨＰＣ細胞が骨髄破壊した宿主を骨髄不全から救済するのに失敗したことを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、骨髄破壊的な９Ｇｙ ＴＢＩおよび新たに単離した骨髄由来ＨＳＣ、ＣＣＲ２－ＨＳＣ、またはＣＣＲ２＋ＨＳＣのいずれかを受けた（全群がマウス１匹当たり１０^５個の細胞を受けた）。図７Ｂは、養子細胞療法を用いたＣＣＲ２^＋ＨＳＣが、バルクＨＳＣ単独の使用よりも有意な生存利益をもたらしたことを示す。

図８は、担腫瘍マウスがＣＣＲ２＋ＨＳＣまたはＣＣＲ２－ＨＳＣのいずれかによる養子細胞療法を受けたことを示す。ＡＣＴの１週間後、ＨＳＣ由来細胞は腫瘍から単離され、フローサイトメトリーを用いて表現型を決定した。 図９は、担腫瘍マウスが腫瘍に直接ＤｓＲｅｄ＋ＨＳＣ、ＣＣＲ２－ＨＳＣ、またはＣＣＲ２＋ＨＳＣの注射を受けたことを示す。１週間後、腫瘍流入領域頸部リンパ節は切除され、フローサイトメトリーによってＤｓＲｅｄ＋細胞の相対量が定量され、ＨＳＣ由来細胞が腫瘍から二次リンパ器官に血管外遊出したかどうかを決定した。ＣＣＲ２－ＨＳＣと対比して、ＣＣＲ２＋ＨＳＣを受けた群は、流入領域リンパ節において有意に高い量のＤｓＲｅｄ＋細胞を有した（ｐ＝０．０４８０；独立ｔ検定）。

図１０Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスが、ＩＦＮγプロモーター上にＹＦＰを発現するＧＲＥＡＴマウスから生成された腫瘍特異的Ｔ細胞を用いてＡＣＴを受けたことを示す。ＡＣＴとＨＳＣの同時移送を受けた群では、腫瘍内でより高いＹＦＰ発現が検出された。腫瘍を含有する全脳切片にわたって平均蛍光強度を測定した。図１０Ｂは、フローサイトメトリーを用いて、腫瘍流入領域リンパ節もまた単離され、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＹＦＰ発現について分析されたことを示す。 図１１は、担腫瘍マウスが、Ｔ細胞活性化を縦方向に追跡するためにＧＲＥＡＴマウスから生成されたＴＴＲＮＡ Ｔ細胞を使用して、ＡＣＴを受けたことを示す。これに続いて、Ｓｃａ１、ｃＫｉｔ、ＣＤ１３３、ＣＤ３８、ＢＭＰＲ２、またはＣＣＲ２によって定義される骨髄由来の系統陰性ＨＳＣの同時移送がなされた。細胞移送の１週間後、腫瘍は切除され、ＹＦＰのレベルを測定して、どの亜集団が増加したＴ細胞活性化をもたらすかを決定した。

図１２は、in vitro共培養機能性アッセイにおいて遮断抗体の添加によりＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩのいずれかが遮断されたことを示す。ＨＳＣ由来群の平均ＩＦＮγは、ＨＳＣ由来＋抗ＭＨＣ Ｉ群の１６１．６と対比して、８０２．４ｐｇ／ｍＬであり、ｐ＝０．０３９０の独立ｔ検定であった。ＭＨＣ ＩＩを遮断する群では、ＩＦＮγの有意な減少は検出されなかった。 図１３Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスが小脳Ｐｔｃ髄芽腫の腫瘍を受けた後、リンパ枯渇性宿主馴化およびバルクＨＳＣまたはＣＣＲ２＋ＨＳＣのいずれかによる養子細胞療法がなされたことを示す。図１３Ｂは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスが、それらの脳幹へのＫ２脳幹神経膠腫の移植に続いて、リンパ枯渇性宿主馴化およびバルクＨＳＣまたはＣＣＲ２＋ＨＳＣのいずれかによる養子細胞療法を受けたことを示す。 図１４は、ＫＲ１５８Ｂ頭蓋内担腫瘍マウスが、養子細胞療法の前に、５Ｇｙ ＴＢＩを用いたリンパ枯渇性宿主馴化を受けたことを示す。コホートはバルクＨＳＣ、ＣＣＲ２－ＨＳＣ、またはＣＣＲ２＋ＨＳＣのいずれかを受けた。ＣＣＲ２＋ＨＳＣを受けたマウスは、バルクＨＳＣを受けたマウス（５１日）よりも生存の中央値（未定義）が増加した（ｐ＝０．０００５）。

詳細な説明
以下の詳細な説明は、開示の一定の側面の例示としてなされる。本開示の範囲または趣旨から逸脱することなく他の側面が企図され、なされ得ることを理解されたい。したがって、例を含む以下の詳細な説明は、限定的な意味で解釈されるべきではない。本明細書で使用される科学的および技術的用語は、他に特定されない限り、当該分野で一般的に使用される意味を有する。本明細書で提供される定義は、本明細書で頻繁に使用される一定の用語の理解を容易にするためのものであり、本開示の範囲を限定することを意味するものではない。単数形の「a」、「an」、および「the」は、内容が明確に指示していない限り、複数形を包含する。「または」という用語は、内容が明らかにそうではないことを示さない限り、一般に「および／または」を含む意味で用いられる。

養子細胞療法（ＡＣＴまたは養子細胞移送）。養子細胞療法は、免疫機能および他の特徴を細胞と共に移送する目的のための、細胞の患者への移送である。細胞は最も一般的には免疫由来、例えばＴ細胞であり、自家性または同種異系であり得る。同種異系の場合、それらは典型的にはＨＬＡが一致している。一般に、がん免疫療法では、Ｔ細胞は患者から抽出され、任意に遺伝的に改変され、in vitroで培養され、同じ患者に戻される。同種異系細胞ではなく自家性細胞の移送は移植片対宿主疾患の問題を最小にする。自家性細胞ではなく同種異系細胞の移送は、例えば、Ｔ細胞の調製および保存における柔軟性を最大にする。理想的には、いわゆるユニバーサルドナー細胞を使用することができる。ＡＣＴはウイルス感染および／またはがんの処置に使用され得る。
免疫抑制後の期間における対象における同種異系ＡＣＴの使用は、抗腫瘍免疫を含む免疫を増強し、免疫抑制の後の期間においてワクチン効力を増加させる可能性があるので、対象にとって有利であると考えられる。腫瘍特異的Ｔ細胞のＡＣＴは、マウスおよびヒトの系における固形腫瘍の処置に有効であることが示されている。開示の態様において、ＡＣＴはＣＣＲ２^＋ＨＳＣ注入と共に使用され、ここで、ＣＣＲ２^＋ＨＳＣの添加はＡＣＴ単独と比較して対象の免疫能力を増加させる。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）改変Ｔ細胞（ＣＡＲＴ）
いくつかの態様において、ＡＣＴと共に移送されたＴ細胞はＣＡＲＴである。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）改変Ｔ細胞（ＣＡＲＴ）は、特定の細胞型を選択的に標的化し、免疫系監視能力および腫瘍細胞に対する強力な自己増殖性細胞傷害性メカニズムを絶妙な特異性で利用することにおいて大きな可能性を有する。この技術は、モノクローナル抗体可変領域フラグメントの特異性を有する新生物細胞を標的とし、エフェクターＴ細胞機能の細胞傷害性を有する細胞死に影響を及ぼすための方法を提供する。例えば、抗原受容体はｓｃＦｖまたは任意の他のモノクローナル抗体ドメインであり得る。いくつかの態様において、抗原受容体はまた、標的細胞に結合する任意のリガンド、例えば、細胞膜タンパク質と天然に会合するタンパク質の結合ドメインであり得る。
ＣＡＲＴ療法は、他の形態の処置に難治性であったいくつかの異なる腫瘍型の処置に首尾よく適用されてきた。ＣＡＲＴ療法の鍵は、細胞特異的に標的とされ得る細胞表面抗原の利用可能性である。選択的に発現されるいくつかの細胞表面抗原がある。

いくつかの態様において、本発明は、部分的には、所望のＣＡＲを発現するように遺伝子改変されたＴ細胞（例えば、ＩＬ－１５Ｒα細胞質ドメインを含有する）の使用に関する。ＣＡＲを発現するＴ細胞は、本明細書ではＣＡＲ Ｔ細胞、ＣＡＲＴ、またはＣＡＲ改変Ｔ細胞と呼ばれる。好ましくは、細胞は、その表面上に抗体結合ドメインを発現するように遺伝子改変され得、ＭＨＣ非依存性である新規な抗原特異性を付与する。いくつかの例において、Ｔ細胞は、特異的抗体の抗原認識ドメインを膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインと組み合わせて単一のキメラタンパク質にするＣＡＲを発現するように遺伝子改変されている。いくつかの態様において、２つのＣＡＲタンパク質はin vivoで二量体化する（例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体を形成する）。

造血幹細胞。造血幹細胞（ＨＳＣ）は、血液幹細胞とも呼ばれ、自己再生することができ、白血球、赤血球、および血小板を含む血球および免疫細胞などの様々な特殊な細胞に分化することができる、血液および骨髄に見られる未成熟細胞である。ＨＳＣは骨髄から循環血に動員することができる。ＨＳＣは、血球の一定の再生を促進し、毎日何十億という新しい血球を産生する。

造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）。造血幹細胞（ＨＳＣ）移植（ＨＳＣＴまたはＨＳＣ移送）は、通常、末梢血、骨髄、または臍帯血に由来するＨＳＣの移植である。２種類のＨＳＣＴ、すなわち、対象自身の幹細胞が使用される自家性幹細胞移植、またはレシピエントと遺伝的に同様であり、ＨＬＡが一致するドナーの幹細胞が対象に移植される同種異系幹細胞移植が対象に使用され得る。開示のいくつかの態様において、自家性幹細胞がＨＳＣＴに使用される。開示のいくつかの態様において、対象とＨＬＡが一致している同種異系幹細胞がＨＳＣＴに使用される。いくつかの態様において、自家性ＨＳＣＴにおいて、幹細胞を含有する試料は、対象から除かれ、保存され、後で対象に移植して戻される。いくつかの態様において、同種異系または自家性ＨＳＣＴにおいて、ＣＣＲ２＋幹細胞を含有する試料は、対象から除かれ、保存され、その後対象に移植される。いくつかの態様において、同種異系または自家性ＨＳＣＴにおいて、ＣＣＲ２＋幹細胞を含有する試料は、対象から除かれ、培養物中でex vivo増殖させ、後で対象に移植される。いくつかの態様において、同種異系または自家性ＨＳＣＴにおいて、ＣＣＲ２＋幹細胞を含有する試料は、対象から除かれ、試料はＣＣＲ２＋細胞について選択され、次いで選択された細胞は培養物中でex vivo増殖させる。いくつかの態様において、増殖／培養細胞は再度ＣＣＲ２＋細胞について選択される。いくつかの態様において、ＣＣＲ２＋選択細胞は保存される。いくつかの態様において、ＣＣＲ２＋選択細胞は対象に移植される。ＣＣＲ２＋選択細胞はＡＣＴを受けている対象に移植される。いくつかの態様において、対象はまた、放射線療法または化学療法を受ける。

造血幹細胞（ＨＳＣ）およびそのサブセット。ＨＳＣは、試料中の血球のすべての集団のごく一部を示すため、がんまたは感染症などの対象における疾患の処置のために対象にＣＣＲ２＋幹細胞を投与する前に、自家性または同種異系ＨＳＣの数を増加させることが有利であり得る。開示のいくつかの態様において、造血幹細胞は、処置のためにそれらを対象に移植する前に、収集され増殖させる。開示のいくつかの態様において、造血幹細胞は、処置のためにそれらを対象に移植する前に、試料から収集され、増殖させ、選択される。いくつかの態様において、造血幹細胞を含有する試料は、対象に造血幹細胞を投与する前に、in vitroで、試料内の幹細胞の数を増やすために得られ、処理される。いくつかの態様において、造血幹細胞を含有する試料は、対象に造血幹細胞を投与する前に、in vitroで、試料内の幹細胞の割合を増加させるために得られ、処理される。

発明によれば、造血幹細胞またはその前駆細胞は、ＣＣＲ２＋細胞が濃縮されている。態様において、濃縮は、対象から収集された他の細胞と対比して、幹細胞の成長／増殖を選択的に刺激することによって起こり得る。別の態様において、幹細胞は、対象から収集された他の細胞から幹細胞を単離することによって濃縮され得る。かかる選択は、いわゆる陽性選択または陰性選択であり得る。いくつかの態様において、造血幹細胞を含有する試料は、対象に造血幹細胞を投与する前に、in vitroで、試料内の幹細胞の数を増やすために得られ、処理される。いくつかの態様において、造血幹細胞を含有する試料は、対象に造血幹細胞を投与する前に、in vitroで、試料内のＣＣＲ２＋幹細胞またはその前駆体の数を増やすために得られ、処理される。いくつかの態様において、造血幹細胞を対象に投与する前に、ＣＣＲ２＋幹細胞またはその前駆細胞の数を増やすために処理された試料は、ＣＣＲ２－細胞が枯渇している。

ＣＣＲ２^＋マーカーまたはその前駆細胞について単離または選択されたＨＳＣは、追加的または代替的に、ＣＤ３４^＋またはｌｉｎ－細胞の陽性選択によって単離され得ることを理解されたい。ＣＣＲ２^＋マーカーまたはその前駆細胞について単離または選択されたＨＳＣは、追加的または代替的に、陰性選択およびＣＣＲ２－細胞の除去によって単離され得ることもまた理解されるべきである。いくつかの態様において、ＣＣＲ２^＋ＨＳＣまたはその前駆体は、ＣＣＲ２^＋ＨＳＣを対象に投与する前に単離され増殖させる。いくつかの態様において、ＨＳＣは単離され、ＣＣＲ２^＋細胞またはその前駆体についてex vivoで選択され、ＣＣＲ２^＋ＨＳＣを対象に投与する前にex vivoで増殖させる。
陽性選択において、幹細胞は幹細胞上にあるが他の細胞上にはないことが知られているマーカーに基づいて単離される。いくつかの態様において、陽性選択において、幹細胞は、マーカーＣＣＲ２^＋、ＣＤ３４^＋、および／またはｌｉｎ－に基づいて単離され、それによって陽性マーカー（単数または複数）についてＨＳＣを濃縮する。態様において、幹細胞はマーカーＣＣＲ２^＋に基づいて単離される。
陰性選択において、幹細胞ではない細胞は、かかる他の細胞上のマーカーに基づいて同定および除去され、幹細胞を後に残す。陰性選択において、ＨＳＣは、ex vivoで処理され、ＣＣＲ２^＋、ＣＤ３４^＋、および／またはｌｉｎ－細胞以外を枯渇させ得る。

かかる選択手順は当業者に周知であり、フローサイトメトリー分析、マイクロビーズベース単離、磁気ビーズ分離、接着アッセイ、および／またはリガンドベースの選択を含むがこれらに限定されない。いくつかの態様において、リガンドベースの選択は、ＣＣＲ２リガンド、例えばＣＣＬ２、ＣＣＬ７、またはＣＣＬ１３の存在に基づく。
いくつかの態様において、ＣＣＲ２－ＨＳＣの出発集団の５０％未満が残存する。いくつかの態様において、ＣＣＲ２－ＨＳＣの出発集団の４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、５％、２％未満、さらには１％未満が残存する。いくつかの態様において、投与のためのＨＳＣの調製物は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％以下のＣＣＲ２－ＨＳＣを含有する。
いくつかの態様において、増殖の介在するステップを伴う陽性選択の複数ステップが使用され得る。態様において、投与のための調製物は、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＣＣＲ２^＋細胞（これはＣＤ３４^＋でもあり得る）、および／またはｌｉｎ－ＨＳＣを含有する。

本明細書における造血幹細胞の供給源は、以下を含む：Ｇ－ＣＳＦを用いて宿主骨髄から動員され、AMD3100、プレリキサホル、または分子１，１’－［１，４－フェニレンビス（メチレン）］ビス［１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン］を用いて宿主骨髄から動員された、骨髄系統枯渇細胞（ｌｉｎ－）、ｃＫｉｔ^＋精製系統陰性骨髄由来細胞、Ｓｃａ^＋精製系統陰性骨髄由来細胞、ｃＫｉｔ^＋Ｓｃａ^＋精製骨髄由来細胞、臍帯血または臍帯血由来幹細胞、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）一致血液、血液または骨髄由来の間葉系幹細胞、誘導多能性幹細胞から分化した造血幹細胞、動員末梢血、末梢血、ＣＣＲ２^＋マーカーで精製されたＬｉｎ－細胞を含む造血幹細胞サブセット、系統陰性精製末梢血、またはＣＤ３４^＋濃縮末梢血。開示のいくつかの態様において、ＨＳＣの供給源は骨髄である。開示のいくつかの態様において、ＨＳＣの供給源は自家性または同種異系であり、任意にここで、供給源は骨髄、末梢血、臍帯血、または誘導多能性幹細胞である。

造血幹細胞動員剤。開示のいくつかの態様において、造血幹細胞動員剤は、対象に投与され、対象からのＨＳＣの単離を補助し得る。ＨＳＣ動員は、対象の骨髄から対象の末梢血へのＨＳＣの補充を指す。本出願において、ＨＳＣ動員剤は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、ＰＥＧ化Ｇ－ＣＳＦ（ペグフィルグラスチム）、レノグラスチム、グリコシル化形態のＧ－ＣＳＦ、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン２（ＣＸＣＬ２）、Ｃ－Ｘ－Ｃケモカイン受容体４型（ＣＸＣＲ－４）、およびプレリキサホルを含む。
放射線療法または化学療法。ＨＳＣＴはしばしば化学療法と共に投与される。発明者は、ＡＣＴおよびＣＣＲ２^＋ＨＳＣの投与の併用処置の効果が放射線療法によって増強されることを本明細書に示す（例えば、図７Ｂ）。いくつかの態様において、ＡＣＴおよびＣＣＲ２^＋ＨＳＣを受ける対象はまた、放射線療法または化学療法を受ける。

がん。本明細書に記載の治療法は、既存のがんまたは確立されたがん、すなわち対象に存在し検出可能であるものの処置を含む。さらに、がんの発症の予防のための前がん病変（例えば、腺腫性ポリープ、または細胞異形成）の処置が想定される。本開示に従って処置可能ながんは、以下のがんを含む：メラノーマ、有棘細胞癌、基底細胞癌、乳がん、頭頸部癌、甲状腺癌、軟部組織肉腫、骨肉腫、精巣がん、前立腺がん、卵巣がん、膀胱がん、皮膚がん、脳がん、神経膠芽腫、髄芽腫、上衣腫、血管肉腫（angiosarcoma）、血管肉腫（hemangiosarcoma）、マスト細胞腫瘍、原発性肝がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、胃腸がん、腎細胞癌、造血器新生物、リンパ腫、中皮腫、またはその転移性のがん。開示の態様において、開示において処置されるがんは、神経膠芽腫、低悪性度の神経膠腫、高悪性度の神経膠腫、脳幹神経膠腫、皮質神経膠芽腫、小児脳がん、および髄芽腫を含む。開示の態様において、がんは、侵襲性頭蓋内神経膠腫である。開示の態様において、がんは、脳、肺、乳房、またはメラノーマの転移性または難治性のがんである。

感染症。開示はまた、感染症の処置に関連して有用である。一般に、日和見病原性微生物は、ウイルス、真菌、寄生虫、および細菌として分類され得る。ヒト疾患を引き起こす例示的な病原性ウイルス生物は、フィロウイルス、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、レトロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、トガウイルス、ピコルナウイルス、パポバウイルスおよび胃腸炎ウイルスを含む（が、これらに限定されない）。重篤なヒト疾患を引き起こす例示的な病原性細菌は、グラム陽性生物：Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Enterococcus faecalisおよびE. faecium、Streptococcus pneumoniaeおよびグラム陰性生物：Pseudomonas aeruginosa、Burkholdia cepacia、Xanthomonas maltophila、Escherichia coli、Enterobacter属菌、Klebsiella pneumoniaeおよびSalmonella属菌である。ヒト疾患を引き起こす例示的な病原性原生生物は、マラリア、例えばPlasmodium falciparumおよびM. ovale、トリパノソーマ症（寝眠病）、例えばTrypanosoma cruzei、ライシュマニア症、例えばLeischmania donovani、アメーバ症、例えばEntamoeba histolyticaを含む（が、これらに限定されない）。ヒト疾患を引き起こすかまたはそれと関連する例示的な病原性真菌は、Candida albicans、Histoplasma neoformans、Coccidioides immitisおよびPenicillium marneffeiを含む（が、これらに限定されない）。態様において、感染症生物は慢性感染症に関与するものである。特に重要な疾患は、肝炎、アデノウイルス、ＢＫなどのポリオーマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、インフルエンザＡ、Ｂ、およびＣ型、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、メチシリン耐性Staphylococcus aureus（ＭＲＳＡ）を含むStaphylococcus種、Streptococcus pneumoniaを含むStreptococcus種および移植後感染である。

抗体。抗体という用語は最も広い意味で使用され、具体的には、例えば、単一のモノクローナル抗体、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、一本鎖抗体、および抗体の抗原結合断片を含む。抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭなどの任意の免疫グロブリン由来の免疫グロブリン定常ドメインを含み得る。
いくつかの態様において、本明細書で使用される治療様式は単離され得る。生物製剤の文脈において、単離された手段は、生物製剤がその天然の環境から除去されたか、またはその天然の状態から改変されたことを意味する。そのように、単離されたとは、その分子がその天然の環境から除去されたか、またはその天然の状態から改変された程度を必ずしも反映していない。しかしながら、ある程度まで精製され、その意図された治療目的のために使用され得る程度まで精製された生物製剤は「単離され」ていることが理解されるであろう。
本明細書中で使用される抗体は、それらの標的、例えばＣＣＲ２、ＣＤ３４、または系統枯渇についてキット中で使用される任意の標的などに選択的に結合させるために使用され得る。

対象。「対象」は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、マウス、ラット、げっ歯類、またはヤギなどの哺乳動物を意味する。重要な態様において、対象および／または哺乳動物はヒトである。いくつかの態様において、対象は免疫チェックポイント阻害剤を受けていない。
処置。「処置する」、「処置すること」、「処置」、および「療法」は、対象がある状態を患っている間に起こる行動を包含し、これは、その状態（またはその状態に関連する症状）の重症度を低減するか、またはその状態（またはその状態に関連する症状）の進行を阻止するか、または遅らせる。これは治療的処置である。
有効量。対象は、開示の解決策の有効量で処置される。薬剤の「有効量」は、一般に、所望の生物学的応答を引き出す、すなわち状態を処置するのに十分な量を指す。当業者には理解されるように、本明細書に記載の薬剤の有効量は、処置される状態、投与の様式、および対象の年齢、体組成、および健康状態などの因子に依存して変わり得る。

治療的処置のために、有効量は、状態の処置において治療上の利益を提供するため、またはその状態に関連する１つ以上の症状を低減または排除するために十分な量である。これは、全体的な療法を改善する、状態の症状または原因を低減または回避する、または別の治療薬の治療効果を高める量を包含し得る。
一般に、有効量は、対象における免疫応答を増強するために投与される。特定の疾患または状態に関連して、「免疫応答を増強する」は、疾患または状態の１つ以上の症状、例えば、がんの１つ以上の症状、または感染症の１つ以上の症状の発症を停止させること、進行を阻害すること、発症を逆行させること、またはそうでなければ低減または改善することを意味する。さらに、有効量は、対象におけるがん細胞または感染性病原体の増殖を遅らせる、停止させる、または逆転させるような量であり得る。

いくつかの態様において、ＣＣＲ２^＋ＨＳＣの有効量は、ＡＣＴ単独、ＡＣＴおよび化学療法、またはＡＣＴおよび放射線療法の組み合わせと比較して、ＡＣＴによる治療の利益を増加させるか、またはＡＣＴによって処置される対象の状態を改善する任意の量である。
動員剤の例示的な有効量：かかる剤は、幹細胞を骨髄から末梢血に動員するのに十分な量で与えられる。特定の動員剤のかかる量は、例えば、１日当たり１μｇ／ｋｇ～２０μｇ／ｋｇのＧ－ＣＳＦ、好ましくは１日当たり５μｇ／ｋｇまたは１０μｇ／ｋｇのＧ－ＣＳＦ；１～２０ｍｇのＰＥＧ化Ｇ－ＣＳＦ、好ましくは６ｍｇまたは１２ｍｇのＰＥＧ化Ｇ－ＣＳＦ；１日当たり１～２０μｇ／ｋｇのＰＥＧ化Ｇ－ＣＳＦ；１日当たり１～２０μｇ／ｋｇのレノグラスチム；１日当たり１～４０μｇ／ｍ^２のＣ－Ｘ－Ｃケモカイン受容体４型（ＣＸＣＲ－４）；１日当たり１～４０μｇ／ｍ^２のプレリキサホルである。

細胞の投与は、当業者に周知の任意の利用可能な手段によるものである。態様において、細胞の投与は、典型的には注入（例えば、静脈内）または注射（例えば、皮下または腫瘍内）または移植によるものである
タイミング。ＣＣＲ２＋ＨＳＣは、処置に有益な影響を及ぼすように十分に近くにＡＣＴに投与される。態様において、実際には、ＣＣＲ２＋ＨＳＣは、放射線療法の完了から１～２８日後、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８日後、養子細胞療法の１～１４日前、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日前に投与される。ＣＣＲ２＋ＨＳＣの反復注入は、その後のＡＣＴの周期で、または腫瘍特異的ワクチン接種と共に、典型的には１～６ヶ月、例えば１、２、３、４、５、または６ヶ月の間隔で投与され得る。

例
例１．骨髄由来単球集団は高度に不均一であり、別個のサブセットは様々な骨髄性マーカーの差次的発現変動に基づいて定義される。
ケモカイン受容体ＣＣＲ２は、単球前駆細胞上に発現され、典型的にはＫＲ１５８Ｂ神経膠腫によって発現されるＣＣＬ２に対する走化性応答としてＣＮＳへのそれらの侵入に必要とされる（Clarkson et al., 2015；Sagar et al., 2012；Flores et al., 2015）。この研究において、ＣＣＲ２を発現するＨＳＣのサブセット（ＣＣＲ２^＋ＨＳＣ）が３時間以内に頭蓋内腫瘍に移動することを観察した（データは示さず）。ＣＣＲ２^＋ＨＳＣを単離するために、骨髄を非担腫瘍マウスから収集し、磁気ビーズ分離キット（Miltenyi Biotec, CA）を用いて系統枯渇させた。次いで、得られた系統陰性ＨＳＣを、ビオチン化抗ＣＣＲ２抗体、続いて抗ビオチンビーズコンジュゲート抗体を用いて二次磁気ビーズ枯渇によりさらに濃縮した。

例２．腫瘍中に見出されたＨＳＣ由来細胞が頭蓋内腫瘍から腫瘍流入領域リンパ節に血管外遊出し、その後末梢Ｔ細胞に腫瘍抗原を提示するかどうかの決定。
ＨＳＣを、βアクチンプロモーター上にＤｓＲｅｄレポーターを発現する非担腫瘍マウスの骨髄から単離した。ＤｓＲｅｄ^＋ＨＳＣをさらにＣＣＲ２^＋ＨＳＣまたはＣＣＲ２^－ＨＳＣに単離した。ＤｓＲｅｄ^＋ＨＳＣ、ＤｓＲｅｄ^＋ＣＣＲ２－ＨＳＣ、またはＤｓＲｅｄ^＋ＣＣＲ２^＋ＨＳＣのいずれかを、確立された頭蓋内ＫＲ１５８Ｂ腫瘍にin vivoで直接注射した。１週間後、腫瘍流入領域頸部リンパ節を採取し、ＤｓＲｅｄ^＋ＨＳＣ由来細胞の存在について分析した。ＣＣＲ２^＋ＨＳＣを受けた群はリンパ節において有意により多くのＣＣＲ２^＋ＨＳＣ由来細胞を有し（未ソートのＨＳＣ群に対してｐ＝０．０２１）、ＣＣＲ２＋ＨＳＣがリンパ節に優先的に移動する細胞を生じることを実証した。腫瘍からリンパ節へ血管外遊出したＣＣＲ２^＋ＨＳＣ由来細胞が宿主末梢Ｔ細胞を交差抗原刺激する能力を有するかどうかを決定するために、同じリンパ節を磁気ビーズベースのPan T cell Depletion Kit（Miltenyi Biotec, CA）を用いた全身性Ｔ細胞の単離のためにも処理した。次いで、これらのＴ細胞を、in vitroで腫瘍細胞標的に対してそれらを共培養することによって抗腫瘍機能について試験した（図１Ａ～１Ｂ）。驚くべきことに、我々は、ＣＣＲ２^＋ＨＳＣを受けたマウスの腫瘍流入領域リンパ節から単離されたＴ細胞は腫瘍標的に応答してＩＦＮγを分泌するが、ＣＣＲ２^－ＨＳＣまたは未ソートのＨＳＣを受けたマウスはＩＦＮγ分泌に基づく劣ったＴ細胞活性化を示すことを見出した。

例３．ＡＣＴとのＨＳＣ投与の効果。
発明者は、ＨＳＣの養子細胞療法との同時移送が、腫瘍内移動および腫瘍特異的Ｔ細胞の生着ならびにＫＲ１５８Ｂ神経膠腫における早期腫瘍増殖の抑制を媒介することを以前に実証した（Flores et al., 2015）。そのため彼らは、ＣＣＲ２^＋ＨＳＣの使用が養子細胞療法（ＡＣＴ）の有効性も高めるかどうかを評価した。このＡＣＴプラットフォームは、腫瘍由来の全ＲＮＡでパルスされた骨髄由来樹状細胞を用いてex vivoで腫瘍特異的Ｔ細胞（ＴＴＲＮＡ－Ｔ細胞）を増殖させる^１３。この研究は、ＡＣＴと共にＨＳＣ投与することによって、ＡＣＴ単独と比較して、腫瘍微小環境内および腫瘍流入領域リンパ節中のＴＴＲＮＡ－Ｔ細胞活性化およびＩＦＮγ分泌を優位に増加させることを実証する（図２）。

例４．腫瘍微小環境内でのＴＴＲＮＡ－Ｔ細胞活性化に対するＣＣＲ２^＋ＨＳＣの効果。
腫瘍微小環境内でのＴＴＲＮＡ－Ｔ細胞活性化に対するＣＣＲ２^＋ＨＳＣの影響を決定するために、確立された頭蓋内腫瘍を有するマウスは、ＧＲＥＡＴマウスから生成されたＴＴＲＮＡ－Ｔ細胞の養子移送を受け、これらのＴＴＲＮＡ－Ｔ細胞のＩＦＮγ分泌のin situ検出を可能にした。次いで、マウスは、ＣＣＲ２^＋ＨＳＣまたはＣＣＲ２^－ＨＳＣのいずれかの静脈内投与を受けた。１週間後、腫瘍を切除し、群間の腫瘍内のＹＦＰ^＋ＣＤ３^＋細胞の相対量を決定した。ＣＣＲ２^＋ＨＳＣを受けたものは、ＣＣＲ２^－ＨＳＣを受けたマウスよりも有意により多くのＹＦＰ^＋ＣＤ３^＋細胞を発現した（図３Ａ）。

例５．ＣＣＲ２^＋ＨＳＣの移動および分化。
ＣＣＲ２^＋ＨＳＣが頭蓋内腫瘍に移動したかどうかを決定するために、ＣＣＲ２^＋ＨＳＣをＤｓＲｅｄ発現マウスから単離する一方、ＣＣＲ２^－ＨＳＣをユビキチンプロモーターにＧＦＰレポーターを有するマウスから単離した。両方のＨＳＣ集団を、５グレイの全身照射（５Ｇｙ ＴＢＩ）による宿主条件付けを受けた担腫瘍マウスに、等量（５×１０^５細胞）を一緒に静脈内注射した。２４時間後、腫瘍を切除し、ＧＦＰ^＋ＣＣＲ２^－ＨＳＣと対比して、ＤｓＲｅｄ^＋ＣＣＲ２^＋ＨＳＣの相対量を決定した（図３Ｂ）。有意により多くのＤｓＲｅｄ^＋ＣＣＲ２^＋ＨＳＣが２４時間以内に頭蓋内腫瘍内に蓄積した。興味深いことに、１週間後に腫瘍内のＤｓＲｅｄ^＋ＣＣＲ２^＋ＨＳＣ由来細胞はＣＣＲ２発現を失ったが、抗原提示細胞、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＭＨＣＩＩに関連するマーカーを上方制御した（図３Ｃ）。ＣＣＲ２^＋ＨＳＣが抗原提示細胞に分化する可能性があるかどうかを決定するために、ＣＣＲ２^＋ＨＳＣおよびＣＣＲ２^－ＨＳＣをマウス骨髄から単離し、両方の集団を樹状細胞生成のために以前に確立されたプロトコルを用いてin vitroで培養した（Flores et al., 2015）。次いで、細胞を表現型決定し、抗原提示能について試験した。ＣＣＲ２^＋ＨＳＣから生成された細胞はＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＭＨＣ－ＩＩを上方制御し、その間、抗原特異的Ｔ細胞を活性化する能力を高め、同種抗原を提示するそれらの能力を示した（図４）。

例６．ＨＳＣ由来細胞による腫瘍抗原の提示。
ＨＳＣ由来細胞がin vivoの腫瘍微小環境内でＴＴＲＮＡ－Ｔ細胞に腫瘍抗原を提示できるかどうかを決定するために、担腫瘍マウスはＡＣＴを受けた後、ＧＦＰ^＋ＨＳＣの静脈内投与を受けた。ＡＣＴの３週間後、腫瘍を摘出し、ＧＦＰ^＋ＨＳＣ由来細胞を、ＦＡＣＳを用いて単離した。次いで、これらを機能性アッセイでＴＴＲＮＡ－Ｔ細胞と共培養した。ＥＬＩＳＡによって検出されたＩＦＮγ分泌は、同種抗原のＴＴＲＮＡ－Ｔ細胞認識を示した（図５Ａ）。次いで、我々は、ＨＳＣ由来細胞がＣＤ８またはＣＤ４Ｔ細胞を活性化するかどうかを決定することを目指した。担腫瘍マウスは、ＧＲＥＡＴマウスから生成したＴＴＲＮＡ－Ｔ細胞を用いてＡＣＴを受けた。次いで、ＨＳＣをＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩノックアウトマウスから単離し、ＡＣＴと同時投与した。３週間後、頭蓋内腫瘍を採取し、ＹＦＰ^＋ＣＤ３^＋細胞の相対的発現について分析した（図５Ｂ）。Ｔ細胞活性化の有意な減少をＭＨＣ－１^－／^－ＨＳＣを受けたマウスに検出し、これはＨＳＣ由来細胞が腫瘍微小環境内でＣＤ８＋ＴＴＲＮＡ－Ｔ細胞に対して腫瘍抗原を提示することを意味する。

ＨＳＣがこれらの免疫療法実験において投与されるとき、ＨＳＣは、非担腫瘍マウスから新たに単離される。そこで我々は、腫瘍のＨＳＣ由来細胞がどのようにして腫瘍抗原を獲得するのかを疑問とした。照射が腫瘍内のＨＳＣ由来細胞による腫瘍抗原の取り込みに役割を果たすかどうかを決定するために、ＡＣＴおよびＧＦＰ^＋ＨＳＣを、５Ｇｙ ＴＢＩまたは照射なしのいずれかを受けた後期担腫瘍マウスに投与した。移送の３週間後、腫瘍を切除し、ＧＦＰ^＋ＨＳＣ由来細胞をＦＡＣＳで単離した。次いで、単離したＧＦＰ^＋ＨＳＣ由来細胞をin vitroでＴＴＲＮＡ－Ｔ細胞と共培養して、交差抗原刺激するそれらの能力の検出可能な差を試験した（図５Ｃ）。非照射腫瘍と対比して、照射腫瘍から単離されたＨＳＣ由来細胞に対してＴＴＲＮＡ－Ｔ細胞を共培養したとき、有意により多くのＩＦＮγを検出した。

例７．ＣＣＲ２^＋ＨＳＣ由来細胞を受けた対象におけるＴＴＲＮＡ－Ｔ細胞の生着。
我々のグループは、腫瘍ＲＮＡパルス樹状細胞ワクチンが、末梢における養子移送されたＴＴＲＮＡ－Ｔ細胞の生着および増殖に関与していることを以前に発表した（Flores et al., 2015）。これと上記のデータを考慮して、樹状細胞などの専門的な抗原提示細胞として、ＣＣＲ２^＋ＨＰＣ由来細胞がワクチン流入領域リンパ節におけるＴＴＲＮＡ－Ｔ細胞の生着および活性化を増強することができるかどうかを決定する実験を行った。確立された腫瘍を有するマウスの群は、ＡＣＴおよびＧＦＰ^＋ＨＳＣ、ＧＦＰ^＋ＣＣＲ２^＋ＨＳＣ、またはＧＦＰ^＋ＣＣＲ２^－ＨＳＣのいずれかを受けた（図６Ａ）。養子移送の３週間後、すべての腫瘍からのＧＦＰ^＋細胞を採取し、ＦＡＣＳを用いて単離した。次いでこれらを、ＡＣＴを受けた担腫瘍マウスの別のセットにおける「ワクチン」として使用した。マウスのこれらの群において、ＤｓＲｅｄ^＋ＴＴＲＮＡ－Ｔ細胞を用いてＡＣＴを行い、次いでワクチンなし、樹状細胞ワクチン、腫瘍由来のＧＦＰ^＋ＨＳＣ、ＧＦＰ^＋ＣＣＲ２^＋ＨＳＣ由来細胞、またはＧＦＰ^＋ＣＣＲ２^－ＨＳＣ由来細胞のいずれかでワクチン接種した。１週間後、ワクチン流入領域リンパ節を採取し、ＤｓＲｅｄ^＋ＣＤ３^＋細胞について分析して、ＴＴＲＮＡ－Ｔ細胞の生着を決定した（図６Ｂ）。腫瘍から単離したＣＣＲ２^＋ＨＳＣ由来細胞を受けたマウスは、ワクチンリンパ節にＤｓＲｅｄ^＋ＣＤ３^＋ＴＴＲＮＡ^－Ｔ細胞の生着を示した。

例８．ＡＣＴの有効性に対するＣＣＲ２^＋ＨＳＣの免疫増強効果。
ＡＣＴの有効性は骨髄破壊的宿主条件付けに依存することが以前に見出された（Flores et al., 2015）。我々は、ＣＣＲ２^＋ＨＳＣが末梢および頭蓋内腫瘍の両方において抗腫瘍免疫を増強することができることを実証したので、以前に使用したＨＳＣの代わりにＣＣＲ２^＋ＨＰＣ細胞を使用することが、我々が以前観察した有効性を提供するかどうかを調べた。ＡＣＴでＣＣＲ２^＋ＨＳＣ細胞を使用する前に、ＣＣＲ２^＋ＨＳＣ細胞が骨髄破壊的宿主条件付けから骨髄を救済する能力を有する真の造血幹細胞であるかどうかを最初に決定した。ナイーブマウスは９Ｇｙ ＴＢＩを用いて骨髄破壊（ＭＡ）を受けた。群は、ＭＡのみ、ＭＡ^＋ＨＳＣ細胞、ＭＡ^＋ＣＣＲ２^＋ＨＳＣ細胞、またはＭＡ^＋ＣＣＲ２^－ＨＳＣ細胞のいずれかを受けた。ＣＣＲ２^＋ＨＰＣ細胞は骨髄破壊した宿主を骨髄不全から救済することができなかった（図７Ａ）。したがって、ＣＣＲ２^＋ＨＳＣの免疫増強効果がＡＣＴの有効性に影響を与えるかどうかを決定するために、非骨髄破壊的（ＮＭＡ）５Ｇｙ ＴＢＩ宿主条件付けを使用した。頭蓋内ＫＲ１５８Ｂ担腫瘍マウスの群は、非骨髄破壊的５Ｇｙ ＴＢＩを受け、続いてＡＣＴおよびＨＳＣ、ＣＣＲ２^＋ＨＳＣ、またはＣＣＲ２^－ＨＳＣの同時移送を受けた（図７Ｂ）。養子細胞療法と共にＣＣＲ２^＋ＨＳＣを使用すると、バルクＨＳＣ単独の使用よりも有意な生存上の利益が提供された（ｐ＝０．０００５）。我々は、このＣＣＲ２^＋ｌｉｎ－骨髄由来細胞の集団が、養子Ｔ細胞戦略との組み合わせにおいて、増加したＴ細胞活性化を媒介することを実証する。

例９．ＣＣＲ＋造血幹細胞は養子細胞療法においてＴ細胞活性化を媒介する
ＣＣＲ２^＋ＨＳＣの養子細胞療法との同時移送は、複数の脳腫瘍モデルにおいて生存利益を著しく増加させた。我々は、静脈内投与されたＣＣＲ２^＋ＨＳＣがＣＮＳ腫瘍微小環境に優先的に移動し、腫瘍部位でＣＤ１１ｃ^＋抗原提示細胞（ＡＰＣ）に分化し、免疫抑制腫瘍微小環境内で遺伝子発現を再プログラムすることを見出した。さらに、ＣＣＲ２^＋ＨＳＣに由来するＡＰＣは、腫瘍由来抗原をＣＤ８＋およびＣＤ４＋腫瘍反応性リンパ球に独自に交差提示し、長期の腫瘍内Ｔ細胞活性化および増強された腫瘍拒絶をもたらす。

我々は、ＣＣＲ２^＋ＨＳＣ由来の細胞が腫瘍内の抗原提示細胞に分化し得ることを実証した。頭蓋内腫瘍に存在するこれらの抗原提示細胞が、流入領域リンパ節においてＴ細胞に腫瘍抗原を提示する能力を有するかどうかを我々は仮定した。第一に、腫瘍中に見出されたＨＳＣ由来細胞が頭蓋内腫瘍から流入領域リンパ節に血管外遊出しているかどうかを決定するために、ＤｓＲｅｄ^＋ＨＳＣ、ＤｓＲｅｄ^＋ＣＣＲ２^－ＨＳＣ、またはＤｓＲｅｄ^＋ＣＣＲ２^＋ＨＳＣをin vivoで確立された頭蓋内ＫＲ１５８Ｂ腫瘍に直接注入した。１週間後、流入領域頸部リンパ節を採取し、ＤｓＲｅｄ^＋細胞の存在について分析した。ＣＣＲ２^＋ＨＳＣを受けた群は、リンパ節において有意により多くのＤｓＲｅｄ^＋細胞を有した（未ソートのＨＳＣ群に対してｐ＝０．０２１、ＣＣＲ２^－ＨＳＣに対してｐ＝０．０４８０）（図８）。これらの流入領域リンパ節由来のＴ細胞を、in vitroで標的腫瘍細胞に対してそれらを共培養することによって、抗腫瘍機能について試験した（図１Ａ／１Ｂ）。ＣＣＲ２^＋ＨＳＣの頭蓋内注射を受けたマウスは、腫瘍抗原に応答して末梢Ｔ細胞による増加したＩＦＮ－γ分泌を示し、これは、これらのＴ細胞が、おそらく、腫瘍において抗原提示細胞に分化し、流入領域リンパ節に血管外遊出したＣＣＲ２^＋ＨＳＣ由来の細胞によって、腫瘍抗原に対して抗原刺激されたことを示唆する。

チェックポイント遮断に加えて、養子細胞療法は固形腫瘍に対して明らかに影響力がある（Rosenberg SA. Raising the bar: the curative potential of human cancer immunotherapy. Science translational medicine. 2012;4(127):127ps8; Rosenberg SA. Cell transfer immunotherapy for metastatic solid cancer--what clinicians need to know. Nat Rev Clin Oncol. 2011;8(10):577-85.）。マウスおよびヒトの系での研究は、養子細胞療法の有効性が、リンパ枯渇性宿主条件付けとそれに続くＨＳＣ移送の後に増強されることを実証した（Wrzesinski C, Paulos CM, Gattinoni L, Palmer DC, Kaiser A, Yu Z, Rosenberg SA, and Restifo NP. Hematopoietic stem cells promote the expansion and function of adoptively transferred antitumor CD8 T cells. J Clin Invest. 2007;117(2):492-501）。我々は以前に、養子細胞療法とのｌｉｎ－ＨＳＣの同時移送が、腫瘍特異的Ｔ細胞の移動および生着ならびにＫＲ１５８Ｂ神経膠腫における腫瘍増殖の抑制を媒介することを実証した（Flores C, Pham C, Snyder D, Yang S, Sanchez-Perez L, Sayour E, Cui X, Kemeny H, Friedman H, Bigner DD, et al. Novel role of hematopoietic stem cells in immunologic rejection of malignant gliomas. Oncoimmunology. 2015;4(3):e994374）。我々は、ＣＣＲ２^＋ＨＳＣが養子細胞療法（ＡＣＴ）の増強に関与するバルクＨＳＣ集団の活性成分であるかどうかを評価した。ＡＣＴは、全腫瘍ＲＮＡでパルスされた骨髄由来樹状細胞（ＤＣ）を使用して、ex vivoで腫瘍特異的Ｔ細胞を増殖させる（Flores, C. et al. Novel role of hematopoietic stem cells in immunologic rejection of malignant gliomas. Oncoimmunology 4, e994374, doi:10.4161/2162402X.2014.994374 (2015)）。我々は、ＡＣＴとのＨＳＣ投与が、ＡＣＴ単独と比較して、腫瘍微小環境内および流入領域リンパ節中の腫瘍特異的Ｔ細胞活性化およびＩＦＮ－γ分泌を有意に増加させることを見出した（ｐ＝０．０１１）（図１０Ａ、１０Ｂ、および図２）。

腫瘍微小環境内でのＴ細胞活性化に対するＣＣＲ２＋ＨＳＣの影響を決定するために、確立された腫瘍を有するマウスは、ＧＲＥＡＴマウスから生成された腫瘍特異的Ｔ細胞の養子移送を受け、これらのＴ細胞のＩＦＮ－γ分泌のin situ検出を可能にした。マウスは、静脈内ＣＣＲ２＋ＨＳＣまたはＣＣＲ２－ＨＳＣを受けた。腫瘍を切除し、腫瘍内のＹＦＰ＋ＣＤ３＋細胞の相対的発現を決定した。ＣＣＲ２－ＨＳＣと対比して、ＣＣＲ２＋ＨＳＣを受けたものは、有意により多くのＹＦＰ＋ＣＤ３＋細胞を発現した（１９．２％対６．３％、ｐ＝０．０００２）（図３ａ）。ｌｉｎ－ＨＳＣ由来の他の前駆体サブセット（Ｓｃａ－１＋、ｃ－Ｋｉｔ＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ３８＋、ＢＭＰＲ２＋）を、腫瘍反応性リンパ球を活性化するそれらの能力について評価し、ＣＣＲ２＋ＨＳＣは抗腫瘍免疫の増強において著しく優れていた（図１１）。

これらのＨＳＣサブセットが頭蓋内腫瘍に移動するかどうかを決定するために、ＤｓＲｅｄ＋ＣＣＲ２＋ＨＳＣおよびＧＦＰ＋ＣＣＲ２－ＨＳＣを、リンパ枯渇担腫瘍マウスに等量（５×１０５個の細胞）で静脈内注射した。２４時間後、ＧＦＰ＋ＣＣＲ２－ＨＳＣと対比して、ＤｓＲｅｄ＋ＣＣＲ２＋ＨＳＣの相対量を腫瘍において測定した。有意により多くのＤｓＲｅｄ＋ＣＣＲ２＋ＨＳＣが２４時間で頭蓋内腫瘍内に蓄積した（ｐ＝０．００１０）。以前に実証されたように、１週間後、ＤｓＲｅｄ＋ＣＣＲ２＋ＨＳＣ由来細胞はＣＣＲ２発現を喪失したが、ＡＰＣ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＭＨＣ－ＩＩに関連するマーカーを上方制御した（図３Ｃおよび図８）。ＣＣＲ２＋ＨＳＣおよびＣＣＲ２－ＨＳＣを単離し、樹状細胞生成条件下（１２）でin vitroで培養し、抗原提示細胞への分化を調べた。ＣＣＲ２＋ＨＳＣ由来の抗原提示細胞は、明確な樹状細胞表現型を有していたが、ＣＣＲ２－ＨＳＣから生じた細胞は単球抑制細胞マーカーＬｙ６Ｇ（Ｇｒ１－１）の発現を上方制御した（図４）。さらに、ＣＣＲ２＋ＨＳＣ由来の細胞は、ＣＣＲ２－ＨＳＣから生じた細胞よりも、in vitroで腫瘍抗原を提示することにおいて著しく優れていた（図４）。

ＨＳＣ由来細胞が腫瘍微小環境内で腫瘍抗原を捕捉し提示するかどうかを決定するために、マウスは、同系ＧＦＰトランスジェニックマウスからＨＳＣを受けた。養子細胞療法の３週間後、ＧＦＰ＋ＨＳＣ由来細胞を、ＦＡＣＳを用いて腫瘍から単離した。次いで、これらを抗腫瘍ＴＴＲＮＡ－Ｔ細胞と共培養し、腫瘍由来抗原の特異的提示を実証した（図５Ａ）。ＨＳＣ由来細胞がＣＤ４またはＣＤ８腫瘍特異的Ｔ細胞に抗原を提示する能力を有するかどうかを決定するために、ＨＳＣ由来細胞を再度ＦＡＣＳで単離し、ＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩをエフェクター腫瘍特異的Ｔ細胞に対して培養する前に遮断抗体を用いて遮断した（図１２）。ＭＨＣ－１を遮断した後、ＩＦＮγ分泌の有意な減少を観察した。ＨＳＣ由来細胞がＴ細胞に抗原を提示する能力を高めることを確認するために、次いで、ＨＳＣをＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩノックアウトマウスから単離し、ＡＣＴと同時投与した。３週間後、腫瘍を採取し、ＹＦＰ＋ＣＤ３＋細胞の発現について分析した（図５Ｂ）。Ｔ細胞活性化の有意な減少を、野生型ＨＳＣと対比して、ＭＨＣ－１－／－ＨＳＣを受けたマウスにおいて検出し（ｐ＝０．０００２）、ＨＳＣ由来細胞によるクラスＩ経路における腫瘍抗原の交差提示が、ＣＮＳ腫瘍微小環境内でのin vivoのＴ細胞活性化に重要であることを実証した。

ＣＣＲ２＋ＨＳＣに由来する抗原提示細胞の独自の交差抗原刺激能力をさらに実証するために、我々は、養子細胞療法を受けているマウスの腫瘍から直接抗原提示細胞を単離し、ＤｓＲｅｄ＋腫瘍特異的Ｔ細胞を受けているレシピエントマウスにおける細胞ワクチンとしてそれらを用いた。担腫瘍マウスは、養子細胞療法およびＧＦＰ＋ＨＳＣ、ＧＦＰ＋ＣＣＲ２＋ＨＳＣ、またはＧＦＰ＋ＣＣＲ２－ＨＳＣのいずれかを受けた（図６Ａ）。養子細胞療法の３週間後、すべての腫瘍からＧＦＰ＋細胞を採取し、ＦＡＣＳを用いて単離した。次いで、これらを、養子細胞療法を受けた担腫瘍マウスの別のセットにおける「ワクチン」として使用した。このコホートは、ワクチンなし、ＤＣワクチン（ＴＴＲＮＡ ＤＣ）、またはＧＦＰ＋ＨＳＣ、ＧＦＰ＋ＣＣＲ２＋ＨＳＣ由来細胞、またはＧＦＰ＋ＣＣＲ２－ＨＳＣ由来細胞に由来する腫瘍微小環境から単離された抗原提示細胞のいずれかを受けた。ワクチン部位流入領域リンパ節を採取し、ＤｓＲｅｄ＋ＣＤ３＋Ｔ細胞の増殖について分析し、ＣＣＲ２＋ＨＳＣがin vivoで腫瘍反応性Ｔ細胞の増殖をもたらすことを実証した（図６Ｂ）。まとめると、これらの実験は、ＣＣＲ２＋ＨＳＣが、in vivoで腫瘍抗原を捕捉し、in vitroおよびin vivoで腫瘍抗原をＣＤ８＋Ｔ細胞に交差提示するＡＰＣを独自に生じさせることを実証する。

ｌｉｎ－ＣＣＲ２＋ＨＳＣが骨髄不全からの救済を提供する真の造血幹細胞であるかどうかを決定するために、ＣＣＲ２＋ＨＳＣまたはＣＣＲ２－ＨＳＣを骨髄破壊した宿主（９Ｇｙ ＴＢＩ）に静脈内投与した。Ｌｉｎ－ＣＣＲ２＋ＨＳＣは、致死的な照射から宿主を救済するのに効率的ではなく、前駆体集団を示唆した（図７Ａ）。ＣＣＲ２＋ＨＳＣが、脳腫瘍を標的とする養子細胞療法における幹細胞移送の向上した有効性の原因であるかどうかを決定するために、ＣＣＲ２－ＨＳＣと対比して、非骨髄破壊的条件付け（５Ｇｙ ＴＢＩ）を受けたマウスにおいて養子細胞療法と共に精製ＣＣＲ２＋ＨＳＣを移送した。ＣＣＲ２＋ＨＳＣは、神経膠腫（ｐ＝０．０００５）（図１４）および髄芽腫に対する養子細胞療法の有効性の増強において著しく優れており、脳幹神経膠腫に対する同等な生存利益を提供した（図１３）。これらの知見は、腫瘍の微小環境を変化させ、免疫チェックポイント遮断および養子細胞療法に対する応答を増強する能力を有する骨髄由来前駆細胞集団を同定する最初のものである。これらの知見は、固形悪性腫瘍の処置における幹細胞移植の役割の我々の理解を変え、がん免疫療法に対する耐性に対処するための関連性を保持する。

材料および方法：
マウス。６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Jackson Laboratories、ストック番号000664）、トランスジェニックＤｓＲｅｄマウス（Jackson Laboratories、ストック番号006051）、およびトランスジェニックＧＲＥＡＴマウス（Jackson Laboratories、ストック番号017580）を実験に使用した。研究者らは、国立研究評議会の生命科学に関する実験動物資源管理委員会の委員によって提案された「Guide for the Care and Use of Laboratory Animals」を遵守した。フロリダ大学動物管理サービスの施設は、米国実験動物管理認定協会によって完全に認定されており、すべての研究はフロリダ大学の施設内動物管理および使用委員会によって承認された。
ＲＮＡの単離。腫瘍細胞株からの全腫瘍ＲＮＡの単離は、製造者のプロトコルに従ってRNeasyミニキット（Qiagen、カタログ番号74104）を用いて行った。

腫瘍特異的Ｔ細胞。腫瘍反応性ＴＴＲＮＡ－Ｔ細胞を、以前に記載されたようにして生成した（Flores et al., 2015）。簡潔に言えば、骨髄由来樹状細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスから採取し、ＧＭ－ＣＳＦ（１８ｎｇ／ｍＬ、R&D、カタログ番号415-ML/CF）およびＩＬ－４（１８ｎｇ／ｍＬ、R&D、カタログ番号404-ML/CF）中で９日間培養した。次いで樹状細胞を、腫瘍組織から単離した２５μｇの全ＲＮＡでエレクトロポレーションした。ナイーブマウスを２．５×１０^５個の全腫瘍ＲＮＡパルス樹状細胞で抗原刺激した。１週間後、次いで脾細胞を採取し、全腫瘍ＲＮＡパルス樹状細胞およびＩＬ－２（５０Ｕ／ｍＬ、R&D、カタログ番号402-ML/CF）を用いてex vivoで５日間共培養した。養子細胞療法のために１０^７個のＴ細胞を静脈内投与した。

腫瘍モデル。担腫瘍実験を同系の性別一致Ｃ５７ＢＬ／６マウスで行った。ＫＲ１５８Ｂ（９）神経膠腫系（国立がん研究所、Karlyne M. Reilly博士により提供）を、高悪性度の神経膠腫として、適切なハプロタイプ背景および星状細胞腫関連遺伝子の発現を実証するＲＮＡＳｅｑによる遺伝子発現分析により、組織学的に検証した。正中線に対して横２ｍｍ、深さ３ｍｍに注射することによって、１０４個のＫＲ１５８Ｂ細胞を尾状核に移植した（Reilly KM, Loisel DA, Bronson RT, McLaughlin ME, and Jacks T. Nf1; Trp53 mutant mice develop glioblastoma with evidence of strain-specific effects. Nat Genet. 2000;26(1):109-13.; Flores et al., 2015）。Ｐｔｃ腫瘍細胞は、自発性腫瘍を発症しているＰｔｃ＋／－トランスジェニックマウスに直接由来した。腫瘍を野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてin vivoで連続的に継代し、Ｐｔｃ＋／－マウス髄芽腫との一貫性について遺伝子発現分析によって検証した（Pham CD, Flores C, Yang C, Pinheiro EM, Yearley JH, Sayour EJ, Pei Y, Moore C, McLendon RE, Huang J, et al. Differential Immune Microenvironments and Response to Immune Checkpoint Blockade among Molecular Subtypes of Murine Medulloblastoma. Clin Cancer Res. 2016;22(3):582-95）。Ｐｔｃ髄芽腫を用いた実験のために、１．２５×１０^５個のＰｔｃ細胞を小脳の正中線に対して横１ｍｍ、深さ３ｍｍに移植した（Pham et al., 2016; Goodrich LV, Milenkovic L, Higgins KM, and Scott MP. Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants. Science. 1997;277(5329):1109-13）。脳幹神経膠腫細胞（Oren Becher博士により提供）を用いた実験のために、１０^５個の細胞をマウスの脳幹の正中線上のテント下１ｍｍ、深さ３．５ｍｍに定位的に移植した。

養子細胞療法。担腫瘍マウスの処置は、腫瘍注射後５日目にＸ線照射（X-RAD 320, Precision X-ray）を用いて５Ｇｙリンパ枯渇または９Ｇｙ骨髄破壊で開始した。頭蓋内腫瘍注射後６日目に、マウスは、５×１０４個の系列枯渇（ｌｉｎ－）造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＣ）（MiltenyiBiotec、カタログ番号130-090-858）、ＣＣＲ２＋ｌｉｎ－ＨＳＣ、またはＣＣＲ２－ｌｉｎ－ＨＳＣのいずれかを有する１０７個の自家性ex vivo増殖ＴＴＲＮＡ Ｔ細胞で単回静脈内注射を受けた。ＣＣＲ２陽性選択を、ビオチン化抗マウスＣＣＲ２抗体、続いて抗ビオチンマイクロビーズ分離を用いて行った。腫瘍注射後７日目から始めて、２．５×１０^５個の腫瘍ＲＮＡパルス樹状細胞ワクチンを、３回の全ワクチン投与のために毎週耳介の後方に皮内注射した。
マウスリンパ節。リンパ節を処置マウスの頸部領域から両側で解剖した。リンパ節を機械的に解離し、２％コラゲナーゼ（Fisher Scientific、カタログ番号10103578001）で３０分間化学的に消化した。

脳腫瘍の消化。腫瘍切除は、注射部位の近くの腫瘍塊のすべての境界まで拡張した。腫瘍を滅菌かみそりの刃で機械的に解離し、パパイン（Worthington、カタログ番号NC9809987）で化学的に３０分間解離し、次いで抗体インキュベーションの前に７０μｍ細胞ストレーナーで濾過した。
フローサイトメトリーおよび抗体。フローサイトメトリーをFACS Canto-IIで行い、ＦＡＣＳソーティングをFACSAria IIで行った。細胞を上記のようにex vivoで調製し、ＰＢＳ（Gibco、カタログ番号10010-049）中の２％ＦＢＳ（Seradigm、カタログ番号97068-091）に懸濁した。以下の抗体を、アイソタイプコントロールを用いた製造者の推奨に従って適用した。抗ＣＤ３（BD、カタログ番号553066）、抗ＣＤ１１ｃ（Affymetrix、カタログ番号17-0114-82）、抗ＣＤ８０（Affymetrix、カタログ番号17-0801-82）、抗ＣＤ８６（Affymetrix、カタログ番号17-0862-82）、抗Ｌｙ－６Ｇ／６Ｃ（BD Biosciences、カタログ番号553129）、および抗ＭＨＣ ＩＩ ＩＡ－Ｅ（Affymetrix、カタログ番号17-5321-82）。抗マウスＭＨＣクラスＩＩ（Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ）遮断抗体（Affymetrix、カタログ番号16-5321-85）および抗マウスＭＨＣクラスＩ（Ｈ－２Ｋ）遮断抗体（Affymetrix、カタログ番号16-5957-85）。

Ｔ細胞機能アッセイ。in vitro実験では、Ｔ細胞活性の尺度としてＩＦＮ－γ放出を利用し、エフェクター細胞および標的を９６ウェルＵ底プレート中で１０：１の比率で３回共培養した。１日の共培養の後、IFN-γ Platinum ELISA（Affymetrix、カタログ番号BMS606）を、９６ウェル共培養プレートの上清由来の採取され凍結された細胞培地上で行った。
抗ＰＤ－１遮断抗体。抗ＰＤ－１遮断抗体（Merck、mDX-400）の投与を、Ｔ細胞投与の日に始め、５日毎に合計４回の１０ｍｇ／ｋｇの投与を続けた（８）。
ＰＣＲアレイ。処置マウスから切除した腫瘍についてＰＣＲ分析を行った。腫瘍を解離し、上記のようにＲＮＡを単離し、RT2 Profiler Array Cancer Inflammation and Immunity Crosstalk（Qiagen、カタログ番号PAMM-181ZD-12）またはT cell and B cell Activation（Qiagen、カタログ番号PAMM-053ZD-2）を用いて、製造者のプロトコルに従って分析した。

統計分析。統計は、ＵＦ脳神経外科の生物統計学者Paul Kubilis、MSによってレビューされた。すべての実験をPrism 7で分析し、図の説明文に記載されているように試験を適用した。担腫瘍動物の生存の中央値は、このプロトコルに記載されている実験におけるマウスについて２５～４２日である。我々は我々の実験群間の生存および／または腫瘍の大きさの有意差（４．５倍以上）に関心があるため、１群当たりわずか７匹の動物が、所与の治療法による統計的に有意な結果を検出するのに十分である。最も興味深いのは、生存のコントロールアームとのペアワイズ比較である。多数の試験または比較を説明するために、０．０１２５の有意レベルが使用されるであろう（すなわち、０．０５／４のボンフェローニ補正）。各アームに１０匹の動物を用いると、各ペアワイズ比較は、コントロールアームにおいて予想される２５日の中央値と比較して、実験アームにおける生存の中央値の４．５倍の増加を検出する８０％のパワーを有するであろう。我々の実験マウスで実証された治療効果の分散のために、一定の実験において（７匹と対比して）１０匹の動物を使用することは十分な統計分析を行うために必要とされる。この提案で概説されたすべての生存結果の実験は、この統計的検証のために７～１０匹の動物群を使用する。対数順位検定を用いて、カプラン・マイヤー生存曲線を比較した。独立マン・ホイットニー順位和検定をin vivo実験のための２群比較に適用した。独立スチューデントt検定をin vitro実験のための２群比較に適用した。データは正規分布を有し、分散は統計的に比較した群間で類似していた。有意性はｐ＜０．０５として決定される。生物学的な評価項目（endpoint）について組織を分析した動物研究では、試料の大きさを決定するために１群当たりｎ＝５のマウスを使用し、統計学的方法は使用しなかった。著者は、動物または試料を分析から除外するべきではないことを事前に確立した。動物実験の無作為化のために、１ケージ当たり５匹のマウスでマウスを飼育した。腫瘍移植後、マウスを直ちにケージに無作為化した。

参考文献

他の態様
本明細書に開示されているすべての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示されている各特徴は、同じ、同等、または類似の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられてもよい。したがって、他に明示的に述べられていない限り、開示された各特徴は、包括的な一連の同等または類似の特徴の一例にすぎない。
上記の説明から、当業者は本開示の本質的な特徴を容易に確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な使用および条件に適合させるために開示の様々な変更および修正をすることができる。したがって、他の態様も特許請求の範囲内にある。

均等物
本明細書ではいくつかの発明の態様が説明され、例示されたが、当業者は、機能を実行し、および／または結果を得るための様々な他の手段および／または構造および／または本明細書に説明した利点のうちの１つ以上を容易に想到するであろう。かかる変形および／または修正の各々は、本明細書に記載の発明の態様の範囲内にあるとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成は発明の教示が使用されている特定の用途（単数または複数）に依存することを容易に理解するであろう。当業者であれば、本明細書に記載の特定の発明の態様に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを用いて確かめることができるであろう。したがって、前述の態様は例としてのみ提示され、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、発明の態様は具体的に説明および特許請求の範囲に記載されるもの以外の方法で実施され得ることを理解されたい。本開示の発明の態様は、本明細書に記載されている個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法のそれぞれに関する。さらに、かかる特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が互いに矛盾していない場合、かかる特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の２つ以上の任意の組み合わせも本開示の発明の範囲内に含まれる。

本明細書で定義および使用されるすべての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書中の定義、および／または定義された用語の通常の意味を支配すると理解されるべきである。
本明細書に開示されているすべての参考文献、特許および特許出願は、それぞれが引用されている主題に関して参照により組み込まれており、場合によっては文書の全体を包含し得る。
本明細書および特許請求の範囲で使用される不定冠詞「a」および「an」は、そうでないことが明確に示されていない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。

本明細書および特許請求の範囲で使用される「および／または」なる句は、そのように結合された要素、すなわち場合によっては結合的に存在し、他の場合には分離的に存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および／または」で列挙された複数の要素は、同じように、すなわち、そのように結合された要素の「１つ以上」であるものと解釈されるべきである。具体的に識別された要素に関連しているかどうかにかかわらず、「および／または」なる節によって具体的に識別された要素以外の他の要素が任意に存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「含む」などのオープンエンド言語と共に使用されるときの「Ａおよび／またはＢ」への言及は、一態様において、Ａのみ（任意にＢ以外の要素を含む）を、別の態様では、Ｂのみ（任意にＡ以外の要素を含む）を、さらに別の態様では、ＡとＢの両方（任意に他の要素を含む）等を指し得る。

本明細書および特許請求の範囲で使用されるように、「または」は、上記で定義されたような「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を分離するとき、「または」または「および／または」は包括的、すなわち、少なくとも１つを含むが、複数の数またはリストの要素も含み、任意にリストに含まれていない追加の項目も含むものとして解釈されるものとする。「のうちの１つのみ」または「のうちの正確に１つ」、または、特許請求の範囲で使用される場合「からなる」などの反対に明確に示された用語のみが、正確に１つの数の要素または要素のリストの包含を指すであろう。一般に、本明細書で使用される「または」という用語は、「どちらか」、「の１つ（one of）」、「の１つのみ（only one of）」、または「の正確に１つ（exactly one of）」などの排他性の用語が先行するときに排他的な選択肢（すなわち「一方または他方、両方ではない」）を示すと解釈されるに過ぎない。「から本質的になる（consisting essentially of）」は、特許請求の範囲において使用されるとき、特許法の分野において使用されるその通常の意味を有するものとする。

明細書および特許請求の範囲で使用されるように、１つ以上の要素のリストに関する句「少なくとも１つ」は、要素のリストにおける任意の１つ以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、必ずしも要素のリスト内に具体的に列挙された各要素の少なくとも1つおよびすべての要素を含まず、要素のリストにおける要素の任意の組み合わせを除外しない。この定義はまた、「少なくとも１つ」という句が指す要素のリスト内で具体的に識別された要素以外の要素が、具体的に識別されたそれらの要素に関係するか関係しないかに関わらず、任意に存在し得ることを可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または同等に「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一態様において、少なくとも１つ（任意に１つより多いものを含む）のＡ（Ｂは存在しない（そして、任意にＢ以外の要素を含む））を、別の態様において、少なくとも１つ（任意に１つより多いものを含む）のＢ（Ａは存在しない（そして、任意にＡ以外の要素を含む））を、さらに別の態様において、少なくとも１つ（任意に１つより多いものを含む）のＡ、および、少なくとも１つ（任意に１つより多いものを含む）のＢ（そして、任意に他の要素を含む）等を指し得る。

反対に明確に示されていない限り、１つより多いステップまたは行為を含む特許請求の範囲の任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも方法のステップまたは行為が列挙されている順序に限定されないことも理解されるべきである。
特許請求の範囲ならびに上記の明細書において、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「もつ（carrying）」、「有する（having）」、「含有する（containing）」、「伴う（involving）」、「保持する（holding）」、「から構成される（composed of）などのすべての移行句は、オープンエンドである、すなわち、限定するものではないが含むことを意味すると理解されるべきである。「からなる（consisting of）」および「から本質的になる（consisting essentially of）」という移行句のみが、それぞれ、米国特許庁の特許審査手続、第2111.03節に記載されているように、クローズまたはセミクローズの移行句であるものとする。オープンエンドの移行句（例えば、「含む」）を使用してこの文書に記載されている態様もまた、代替的な態様において、オープンエンドの移行句によって記載された特徴「からなる」および「から本質的になる」ものとして企図される。例えば、開示が「ＡおよびＢを含む組成物」を記載する場合、開示はまた、代替的な態様「ＡおよびＢからなる組成物」および「ＡおよびＢから本質的になる組成物」も企図する。

Claims (33)

1. 対象におけるがんまたは感染症から選択される疾患を処置する方法であって、疾患を処置するのに有効な量で、疾患を有する対象に養子細胞療法（ＡＣＴ）を投与すること、および、対象に造血幹細胞を含有する調製物を投与することを含み、ここで、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＣＣＲ２陽性（ＣＣＲ２＋）細胞（またはＣＣＲ２＋細胞の前駆体）について濃縮され、およびここで、対象は、免疫チェックポイント阻害剤を受けていない、前記方法。
2. 調製物におけるＨＳＣが系統枯渇されている、請求項１に記載の方法。
3. 調製物におけるＨＳＣが、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％またはさらには９９％のＣＣＲ２＋細胞（またはＣＣＲ２＋細胞の前駆体）である、請求項１または２に記載の方法。
4. 調製物におけるＨＳＣが、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％未満、またはさらには１％未満のＣＣＲ２陰性（ＣＣＲ２－）細胞である、請求項１に記載の方法。
5. 調製物における５０％と１００％との間の細胞が、ＣＣＲ２＋細胞（またはＣＣＲ２＋細胞の前駆体）である、請求項１に記載の方法。
6. 対象が、放射線療法または化学療法で処置されている、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 対象が、放射線療法または化学療法を受ける予定である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 造血幹細胞の供給源が、骨髄、末梢血、臍帯血、または誘導多能性幹細胞である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 造血幹細胞の供給源が造血前駆細胞である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 幹細胞の供給源が自家性である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 幹細胞の供給源が同種異系であり、および、ドナー細胞はレシピエントとＨＬＡが一致している、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
12. 養子細胞療法が、キメラ抗体受容体（ＣＡＲ）改変Ｔ細胞を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 疾患ががんであり、および、がんが、メラノーマ、有棘細胞癌、基底細胞癌、乳がん、頭頸部癌、甲状腺癌、軟部組織肉腫、骨肉腫、精巣がん、前立腺がん、卵巣がん、膀胱がん、皮膚がん、脳がん、神経膠芽腫、髄芽腫、上衣腫、血管肉腫（angiosarcoma）、血管肉腫（hemangiosarcoma）、マスト細胞腫瘍、原発性肝がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、胃腸がん、腎細胞癌、造血器新生物、リンパ腫、中皮腫、神経膠芽腫、低悪性度の神経膠腫、高悪性度の神経膠腫、小児脳がん、髄芽腫、または、その転移性のがんである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. がんが、脳、肺、乳房、またはメラノーマの転移性または難治性のがんである、請求項１３に記載の方法。
15. がんが、非小細胞肺がんからの転移性の脳がん、メラノーマからの転移性の脳がん、または乳癌からの転移性の脳がんである、請求項１３に記載の方法。
16. がんが、神経膠芽腫、低悪性度の神経膠腫、高悪性度の神経膠腫、小児脳がん、または髄芽腫である、請求項１３に記載の方法。
17. 疾患が感染症である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
18. 感染症が慢性の感染症である、請求項１７に記載の方法。
19. 感染症が、任意の肝炎、アデノウイルス、ＢＫなどのポリオーマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＹ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＹ）、インフルエンザＡ、Ｂ、および／またはＣ型、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、メチシリン耐性Staphylococcus aureus（ＭＲＳＡ）を含むStaphylococcus種、Streptococcus pneumoniaを含むStreptococcus種、または移植後感染である、請求項１７に記載の方法。
20. 感染症が、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、またはＣ型肝炎である、請求項１９に記載の方法。
21. 養子細胞療法で対象を処置する方法における改善であって、対象に造血幹細胞を含有する調製物を投与することを含み、ここで、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＣＣＲ２陽性（ＣＣＲ２＋）細胞（またはＣＣＲ２＋細胞の前駆体）について濃縮され、およびここで、対象は、免疫チェックポイント阻害剤を受けていない、前記改善。
22. 調製物におけるＨＳＣが系統枯渇されている、請求項２１に記載の改善。
23. 調製物におけるＨＳＣが、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％またはさらには９９％のＣＣＲ２＋細胞（またはＣＣＲ２＋細胞の前駆体）である、請求項２１または２２に記載の改善。
24. 調製物におけるＨＳＣが、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％未満、またはさらには１％未満のＣＣＲ２陰性（ＣＣＲ２－）細胞である、請求項２１または２２に記載の改善。
25. 調製物における５０％と１００％との間の細胞が、ＣＣＲ２＋細胞（またはＣＣＲ２＋細胞の前駆体）である、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の改善。
26. 養子細胞療法のためのＴ細胞を含有する第１の容器および造血幹細胞（ＨＳＣ）を含有する第２の容器を含有するパッケージならびに使用のための説明書を含むキットであって、ここで、ＨＳＣは、ＣＣＲ２陽性（ＣＣＲ２＋）細胞（またはＣＣＲ２＋細胞の前駆体）について濃縮され、およびここで、説明書は、免疫チェックポイント阻害剤との使用を示さない、前記キット。
27. 調製物におけるＨＳＣが系統枯渇されている、請求項２６に記載のキット。
28. 調製物におけるＨＳＣが、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％またはさらには９９％のＣＣＲ２＋細胞（またはＣＣＲ２＋細胞の前駆体）である、請求項２６に記載のキット。
29. 調製物におけるＨＳＣが、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％未満、またはさらには１％未満のＣＣＲ２陰性（ＣＣＲ２－）細胞である、請求項２６に記載のキット。
30. 調製物における５０％と１００％との間の細胞が、ＣＣＲ２＋細胞（またはＣＣＲ２＋細胞の前駆体）である、請求項２６に記載のキット。
31. Ｔ細胞およびＨＳＣが同系である、請求項２６～３０のいずれか一項に記載のキット。
32. Ｔ細胞がＣａｒＴ細胞である、請求項２６～３１のいずれか一項に記載のキット。
33. Ｔ細胞およびＨＳＣは、ＨＬＡが一致している、請求項２６～３１のいずれか一項に記載のキット。

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