ES2954111B2 - Procedimiento para la biofabricacion de filamentos de celulosa bacteriana y biorreactor de acuerdo con el procedimiento - Google Patents
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Description
DESCRIPCIÓN
PROCEDIMIENTO PARA LA BIOFABRICACIÓN DE FILAMENTOS DE CELULOSA BACTERIANA y BIORREACTOR DE ACUERDO CON EL PROCEDIMIENTO
SECTOR DE LA TÉCNICA
La presente invención se refiere a los procesos para elaboración de celulosa bacteriana y, en especial, de filamentos de celulosa bacteriana a partir de un sustrato de té kombucha y a un biorreactor para llevar a término dicho procedimiento.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La celulosa bacteriana es un biopolímero que ha atraído un interés significativo en el ámbito científico y tecnológico en las últimas décadas, debido a sus propiedades excepcionales que incluyen alta pureza, excelente resistencia mecánica, alta capacidad de hidratación y biocompatibilidad.
La celulosa bacteriana es producida principalmente por bacterias acéticas del género Gluconacetobacter, particularmente Gluconacetobacter xylinus. Esta bacteria fermenta los medios de cultivo que contienen fuentes de carbono y produce celulosa bacteriana en forma de un hidrogel flotante en la interfaz aire-medio de cultivo.
En los últimos años, el estado de la técnica ha revelado varios procedimientos para la producción de celulosa bacteriana, los cuales generalmente involucran la fermentación de medios de cultivo a base de glucosa por bacterias acéticas en condiciones controladas.
El proceso convencional para producir celulosa bacteriana implica la fermentación estática de bacterias en un medio de cultivo que contiene una fuente de azúcar, nutrientes y agua. Durante el proceso de fermentación, las bacterias secretan celulosa que se deposita en la superficie del medio de cultivo para formar una película o un hidrogel que, después de la fermentación, se recoge y se procesa para eliminar impurezas y agua, dejando una película de celulosa pura.
Una de las formas de uso preferentes de la celulosa bacteriana es en filamentos, los cuales tienen una variedad de aplicaciones potenciales en diferentes campos gracias a sus propiedades únicas, como su alta resistencia mecánica, su biocompatibilidad y
su capacidad para formar estructuras tridimensionales porosas. Ejemplos de estas aplicaciones son:
Materiales Compuestos: Los filamentos de celulosa bacteriana se pueden usar como refuerzo en materiales compuestos, mejorando su resistencia mecánica y otras propiedades. Esto puede ser relevante en campos como la fabricación de automóviles, la construcción y la ingeniería de materiales.
Textiles: Los filamentos de celulosa bacteriana se utilizan para fabricar tejidos y fibras textiles. Estos pueden tener varias aplicaciones, desde la moda hasta los textiles médicos y técnicos.
Aplicaciones Biomédicas: Gracias a su biocompatibilidad, los filamentos de celulosa bacteriana pueden usarse en una variedad de aplicaciones biomédicas, incluyendo la ingeniería de tejidos, vendajes, suturas y vehículos de liberación de medicamentos.
Electrónica: Los filamentos de celulosa bacteriana tienen potencial para ser usados en electrónica flexible y portátil, gracias a su flexibilidad y resistencia.
Alimentos: En la industria alimentaria, los filamentos de celulosa bacteriana pueden ser utilizados como agentes espesantes, estabilizantes o emulsionantes.
Papel y Embalaje: Los filamentos de celulosa bacteriana también pueden usarse en la fabricación de papel y materiales de embalaje, proporcionando una alternativa sostenible y biodegradable a los materiales de embalaje tradicionales.
El paso de una película o hidrogel de celulosa bacteriana pura a un filamento de celulosa bacteriana es objeto de un procesado posterior o un paso intermedio en el procedimiento de elaboración de celulosa bacteriana.
Los principales métodos conocidos para elaborar filamentos de Celulosa bacteriana son:
Método de Extrusión y Secado: Este es el método más comúnmente utilizado. Primero, se produce un biomaterial de celulosa bacteriana mediante la fermentación de bacterias específicas en un medio de cultivo. Este biomaterial se procesa luego para formar una pasta, la cual se extruye a través de una boquilla para formar filamentos. Los filamentos se someten luego a un proceso de secado para eliminar el agua y endurecer los filamentos. Otra variante de este método es la extrusión en húmedo
"wet-spinning" que utiliza un proceso químico de disolución y coagulación mediante acetona o metanol.
Estos métodos han demostrado tener limitaciones, ya que los filamentos resultantes a menudo poseen una resistencia mecánica insatisfactoria y una falta de uniformidad en términos de espesor y longitud.
Método de Fermentación Modificada: En este enfoque, las condiciones de fermentación se alteran para promover la formación in situ de filamentos de celulosa bacteriana. Esto puede implicar la agitación del medio de cultivo durante la fermentación, lo que induce a las bacterias a formar filamentos en lugar de películas o hidrogeles de celulosa. Una vez completada la fermentación, los filamentos se recogen y se procesan para su uso. Este método puede proporcionar un mayor control sobre las propiedades de los filamentos, pero tiene desventajas, ya que la agitación puede interferir con el crecimiento de las bacterias y la producción de celulosa, y se requiere un control preciso de las condiciones de fermentación para obtener filamentos con las propiedades deseadas.
Método de Electrohilado: Este método implica el uso de un campo eléctrico para producir filamentos de celulosa bacteriana de alta calidad. En este proceso, una solución de celulosa bacteriana se coloca en una jeringa y se aplica un voltaje elevado entre la jeringa y un colector. La solución se extiende hacia el colector debido a la fuerza del campo eléctrico, formando filamentos extremadamente finos y de alta calidad a medida que se seca. Este método puede producir filamentos con un alto grado de uniformidad y propiedades mecánicas superiores, pero puede ser más complicado y costoso de implementar que otros métodos.
En conclusión, aunque la producción de celulosa bacteriana es un campo bien desarrollado, la producción específica de filamentos de celulosa bacteriana con propiedades mecánicas consistentes sigue siendo un desafío en el estado de la técnica actual, siendo necesario el desarrollo de nuevos procedimientos que puedan producir directamente filamentos de celulosa bacteriana con las características deseadas, evitando los problemas asociados con los métodos de producción actuales.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención consiste en un procedimiento para la biofabricación de
filamentos de celulosa bacteriana mediante el cual se consiguen filamentos de celulosa con una resistencia mecánica y simplicidad de producción equivalente a la de un cultivo de celulosa por fermentación estática y con una uniformidad en términos de espesor y longitud equivalentes a los filamentos conseguidos por electrohilado.
Este procedimiento es aplicable en esencia a la elaboración de filamentos de celulosa a partir de cualquier sustrato apropiado, pero está optimizado para elaborar filamentos de celulosa como subproducto del proceso de elaboración de Té Kombucha, concretamente por fermentación de la kombucha ya que se ha demostrado que la celulosa obtenida a partir de este sustrato posee grandes capacidades, mecánicas, térmicas, alto índice de cristalinidad y biocompatibilidad.
El té de kombucha es una bebida fermentada que se elabora a partir de té endulzado con azúcar y se fermenta con una colonia simbiótica de bacterias y levaduras, conocida como SCOBY (Symbiotic Culture Of Bacteria and Yeast). La parte superior de la colonia de bacterias se convierte en una película sólida de celulosa bacteriana, que se puede recolectar y utilizar para diversas aplicaciones.
En concreto el nuevo procedimiento comporta las siguientes fases:
1. - Preparación del medio de cultivo: El primer paso es crear un medio de cultivo nutritivo que permite el crecimiento de las bacterias y la producción de celulosa. Esto se puede hacer con base al té de kombucha con té negro, verde o blanco, dependiendo del color y la textura deseados o en base a un cultivo puro (K. xylinus). El medio de cultivo se esteriliza para matar cualquier organismo indeseable que pueda competir con las bacterias de interés y se deja enfriar a temperatura ambiente y se le añade azúcar.
2. - Carga del biorreactor: Una vez enfriado medio de cultivo, es vertido en un biorreactor de estructura espiral con pared perpendicular al plano del fondo y con un paso equivalente al grosor del filamento deseado. La altura de pared es como mínimo dos veces superior al paso de la espiral. Alternativamente, el biorreactor puede estar constituido por una cubeta en cuyo fondo se ha previsto un scaffold de estructura espiral con las características descritas anteriormente. Se realiza un vertido uniforme del medio de cultivo hasta alcanzar un nivel de aproximadamente la mitad de la altura de pared del biorreactor espiral.
3. - Inoculación: Tras cargar el medio de cultivo en el biorreactor hasta el nivel adecuado, se inocula con las bacterias adecuadas, tales como una colonia de K.xylinus o SCOBY, depositando en la superficie del medio de cultivo una matriz gelatinosa y algo viscosa que contiene la mezcla de bacterias y levaduras que fermentaran el medio de cultivo de forma estática.
4. - Cultivo: Inmediatamente realizada la inoculación del medio de cultivo con la colonia de bacterias, el biorreactor espiral se cierra con una cubierta que permite cierta circulación de aire, pero evita que otras partículas entren. De este modo se incuba el medio inoculado a una temperatura adecuada (alrededor de 25-30 grados Celsius) durante un tiempo controlado, durante el cual, las bacterias y levaduras metabolizan de forma estática los azúcares del cultivo produciendo ácido acético, gas y una matriz de celulosa como producto secundario que se deposita en la superficie del medio de cultivo, formando una película sólida que se acomodará a la forma espiral del biorreactor.
5. - Extracción del filamento: Una vez la fermentación estática ha terminado, se ha generado una matriz espesa de celulosa bacteriana en la superficie del cultivo. Esta matriz de celulosa se ha acomodado a la estructura espiral del biorreactor, por lo que, el ser extraída conforma un filamento de celulosa bacteriana con una longitud igual a la de la espiral y un diámetro igual a su paso.
6. - Purificación y tratamiento: El filamento de celulosa bacteriana extraído del biorreactor espiral es purificado para eliminar los subproductos metabólicos, los restos del medio de cultivo y las bacterias muertas. Seguidamente, el filamento puede ser sometido a un tratamiento que modifique sus características mecánicas ya que en su forma pura la celulosa bacteriana es rígida y frágil.
7. - Secado: después de la purificación y tratamiento, el filamento de celulosa bacteriana se seca total o parcialmente a temperatura ambiente o en un horno a baja temperatura. El método de secado puede afectar las propiedades finales de la celulosa, por lo que este debe elegirse en función de la aplicación final.
De esta forma se obtiene un filamento de celulosa bacteriana con una resistencia mecánica equivalente a la de un cultivo de celulosa por fermentación estática y con una uniformidad en términos de espesor y longitud equivalentes a los filamentos conseguidos por electrohilado.
Otro aspecto de la invención se refiere a un biorreactor para la biofabricación de filamentos de celulosa bacteriana que está constituido por una estructura espiral con pared perpendicular al plano del fondo y con un paso equivalente al grosor del filamento deseado, en cuyo interior se genera el filamento de celulosa bacteriana.
La altura de pared del biorreactor espiral es como mínimo dos veces superior al paso de la espiral y es cerrado mediante una cubierta que permite la recirculación de aire para facilitar la fermentación estática.
Alternativamente, el biorreactor puede estar constituido por una cubeta en cuyo fondo se ha previsto un scaffold de estructura espiral con las características descritas anteriormente.
Este biorreactor permite la biofabricación simplificada de filamentos de celulosa bacteriana por fermentación estática, evitando la necesidad de agitación o el uso de campos eléctricos durante la fermentación, lo cual modificaba las características mecánicas finales del filamento de celulosa obtenido.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, un juego de dibujos en donde con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:
Figura 1.- Muestra una vista de un biorreactor según la invención constituido por una cubeta en cuyo fondo se ha previsto un scaffold de estructura espiral.
Figura 2.- Muestra la forma de extracción del filamento de celulosa bacteriana del interior del biorreactor.
Figura 3.- Muestra una vista detallada del medio de cultivo en el biorreactor con el filamento de celulosa bacteriana antes de ser extraído.
REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓN
Ejemplo 1 Cultivo mixto Té Kombucha (SCOBY)
1.- Preparación del medio de cultivo: En este caso, el medio de cultivo consiste en una
infusión de 2 g de té verde Kombucha en 180 ml de agua destilada a la que se añade 5 g de azúcar panela.
2. - Carga del biorreactor: El té verde Kombucha azucarado, una vez frío a temperatura ambiente, es vertido en un biorreactor espiral que en el ejemplo ilustrado está constituido por una cubeta (1) en cuyo interior se dispone un scaffold de estructura espiral (2) de 100 mm de diámetro, 3000 mm de longitud, 15 mm de altura de pared (P) de y 2 mm de paso (A).
3. - Inoculación: Tras verter el medio de cultivo en el biorreactor, se inocula con 20 ml de cultivo SCOBY que se deposita en la superficie del medio de cultivo.
4. - Cultivo: Tras inocular el medio de cultivo con la colonia SCOBY, el biorreactor espiral se cierra con una cubierta (3) y se incuba a una temperatura de 28 °C durante 21 días.
5. - Extracción del filamento: Tras 21 días de fermentación estática, se ha creado una matriz de celulosa bacteriana (4) en la superficie del medio de cultivo (5) que gracias a la estructura del biorreactor espiral tiene la estructura de un filamento (6) de 3000 mm de largo y 2 mm de diámetro, el cual es extraído por tracción del biorreactor espiral.
6. - Purificación y tratamiento: El filamento de celulosa bacteriana extraído de biorreactor espiral es introducido en una incubadora agitada a 19,5 °C y 50 rpm que contiene una disolución de hidróxido de sodio (NaOH) al 20% durante 24 horas para purificar y separar los restos del medio de cultivo que pudieran haber quedado adheridos. Seguidamente es introducido en una incubadora agitada a 19,5 °C y 50 rpm que contiene una disolución de 10% de glicerol durante 24 horas para flexibilizar y mejorar las propiedades mecánicas del filamento, ya que la celulosa bacteriana en su forma pura es rígida y frágil. Al mismo tiempo, los filamentos de celulosa bacteriana tratados con glicerol muestran una mayor estabilidad frente a factores ambientales, como la humedad y los cambios de temperatura. El glicerol actúa como un agente plastificante, reduciendo la rigidez de la celulosa y ayudando a evitar su descomposición o degradación. Esto prolonga su vida útil y mejora su resistencia a la humedad.
7. - Secado: Después del tratamiento con glicerol, el filamento de celulosa bacteriana con óptimas características de flexibilidad y estabilidad frente a factores
medioambientales es totalmente secado sobre papel encerado a temperatura ambiente, para obtener un filamento de celulosa bacteriana flexible y duradero, o es parcialmente secado y bobinado en húmedo para poder tejer con el filamento húmedo.
Ejemplo 2 Cultivo puro (K.xylinus)
1. - Preparación del medio de cultivo: En este caso, el medio de cultivo consiste una mezcla de 0.4 g de Chitosan y 4 g de Peptona diluidos en 200 ml de agua destilada a la que se añade 4 g de d-glucosa.
2. - Carga del biorreactor: Este medio de cultivo a temperatura ambiente, es vertido en un biorreactor de estructura espiral de 100 mm de diámetro, 3000 mm de longitud, una altura de pared (P) de 15 mm y con un paso (A) de 5 mm.
3. - Inoculación: Tras verter el medio de cultivo en el biorreactor, se inocula con 2 g de levadura y una colonia de Komagataeibacter xylinus que se deposita en la superficie del medio de cultivo.
4. - Cultivo: Tras inocular el medio de cultivo con Komagataeibacter xylinus, el biorreactor espiral se cierra con una cubierta y se incuba a una temperatura de 28°C durante 6 días.
5. - Extracción del filamento: Tras 6 días de fermentación estática, se ha creado una matriz de celulosa bacteriana (4) en la superficie del medio de cultivo (5) que gracias a la estructura del biorreactor espiral tiene la estructura de un filamento (6) de 3000 mm de largo y 5 mm de diámetro, el cual es extraído del biorreactor.
6. - Purificación y tratamiento: El filamento de celulosa bacteriana (6) extraído de biorreactor espiral es introducido en una incubadora agitada a 19,5 °C y 50 rpm que contiene una disolución de hidróxido de sodio (NaOH) al 20% durante 24 horas para purificar y separar los restos del medio de cultivo que pudieran haber quedado adheridos. Seguidamente es introducido en una incubadora agitada a 19,5 °C y 50 rpm que contiene una disolución de 10% de glicerol durante 24 horas para flexibilizar y mejorar las propiedades mecánicas del filamento, ya que la celulosa bacteriana en su forma pura es rígida y frágil. Al mismo tiempo, los filamentos de celulosa bacteriana tratados con glicerol muestran una mayor estabilidad frente a factores ambientales, como la humedad y los cambios de temperatura. El glicerol actúa como un agente plastificante, reduciendo la rigidez de la celulosa y ayudando a evitar su
descomposición o degradación. Esto prolonga su vida útil y mejora su resistencia a la humedad.
7.- Secado: Después del tratamiento con glicerol, el filamento de celulosa bacteriana con óptimas características de flexibilidad y estabilidad frente a factores medioambientales es totalmente secado sobre papel encerado a temperatura ambiente para obtener un filamento de celulosa bacteriana flexible y duradero, o es parcialmente secado y bobinado en húmedo para poder tejer con el filamento húmedo.
Claims (3)
1. - Procedimiento para la biofabricación de filamentos de celulosa bacteriana caracterizado porque el medio de cultivo (5) es vertido en un biorreactor de estructura espiral (2) cerrado m ediante una cubierta (3) que perm ite cierta circulación de aire, cuyo paso (A) es equivalente al grosor del filamento deseado (6), y cuya pared es perpendicular al plano del fondo y presenta una altura (P) como mínimo dos veces superior al paso de la espiral (A), en el que, tras ser inoculado el medio de cultivo (5), las bacterias y levaduras metabolizan de forma estática los azúcares del cultivo produciendo ácido acético, gas y una matriz de celulosa bacteriana (4) como producto secundario que se deposita en la superficie del medio de cultivo (5), formando una película sólida que se ha acomodado a la estructura espiral (2) del biorreactor, de modo que al ser extraída de este, conforma un filamento de celulosa bacteriana (6) con una longitud igual a la de la espiral y un diámetro igual al paso (A).
2. - Biorreactor para la biofabricación de filamentos de celulosa bacteriana de acuerdo con el procedimiento de la invención, caracterizado porque presenta una estructura espiral (2) cerrada mediante una cubierta (3) que permite cierta circulación de aire, cuyo paso (A) corresponde al grosor del filamento deseado (6), y cuya pared es perpendicular al plano del fondo y presenta una altura (P) como mínimo dos veces superior al paso de la espiral (A).
3. - Biorreactor para la biofabricación de filamentos de celulosa bacteriana según reivindicación segunda, caracterizado porque está constituido por una cubeta (1) cerrada con una cubierta (3) que permite cierta circulación de aire, en cuyo fondo se ha previsto un scaffold de estructura espiral (2) cuyo paso (A) corresponde al grosor del filamento deseado (6) y cuya pared es perpendicular al plano del fondo y presenta una altura (P) como mínimo dos veces superior al paso de la espiral (A).
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