ES2953362T3 - Péptidos de unión bacteriana para el tratamiento de enfermedades infecciosas y procesos inflamatorios relacionados - Google Patents

Péptidos de unión bacteriana para el tratamiento de enfermedades infecciosas y procesos inflamatorios relacionados Download PDF

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Abstract

La presente invención se relaciona con el campo de la medicina y proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos aisladas que comprenden o, alternativamente, que consisten en, SEQ. ID No.: 3, y/o SEQ. ID No.: 1, y/o SEQ ID No.: 2, kits y conjugados que comprenden una o más de las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente. Además, la presente invención se refiere al uso de las composiciones farmacéuticas, kits y conjugados de la presente invención como medicamento, en particular en el tratamiento de una enfermedad infecciosa, o de una afección inflamatoria relacionada con una enfermedad infecciosa, o de una Enfermedad inflamatoria relacionada con la presencia de un producto derivado de un agente infeccioso. La presente invención también proporciona un dispositivo para la unión selectiva y la separación de al menos un componente de una solución acuosa en el que el dispositivo comprende una o más de las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Péptidos de unión bacteriana para el tratamiento de enfermedades infecciosas y procesos inflamatorios relacionados
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la medicina, y específicamente a péptidos de unión bacteriana del receptor linfocitario humano CD6 de tipo scavenger, que son útiles en el tratamiento terapéutico y/o preventivo de enfermedades infecciosas y de afecciones inflamatorias relacionadas con las mismas, así como a dispositivos que comprenden los péptidos.
Antecedentes de la invención
La sepsis es una enfermedad potencialmente mortal causada por la respuesta del huésped a un agente infeccioso, generalmente bacteriano, pero también fúngico, vírico o parasitario. La sepsis se considera un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) desregulado causado por una infección, que conduce a un estado proinflamatorio abrumador y sostenido. La incapacidad del sistema inmunitario para controlar dicha respuesta puede acabar en disfunción multiorgánica (MOD) y colapso cardiovascular (shock séptico) y, si no se resuelve, en la muerte (Delano MJ y Ward PA, 2016, Sepsis-induced immune dysfunction: can immune therapies reduce mortality? J Clin Invest 126:23-31). Esta respuesta inflamatoria disfuncional del huésped es desencadenada por estructuras conservadas presentes en las paredes celulares microbianas denominadas patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP). Los PAMP son compuestos esenciales para la fisiología microbiana, entre ellos el LPS de las bacterias Gram negativas (G-), el ácido lipoteicoico (LTA) y el peptidoglicano (PGN) de las bacterias Gram positivas (G+), el p-glucano y el manano de los hongos, o los ácidos nucleicos de cadena simple o doble de los virus (Janeway CA y Medzhitov R, 2002, Innate immune recognition, Annu Rev Immunol 20:197-216).
La sepsis puede deberse a muchas causas, pero suele desencadenarse por infecciones locales no diagnosticadas y/o no tratadas (por ejemplo, neumonía o peritonitis) inducidas espontáneamente o como consecuencia de traumatismos, intervenciones quirúrgicas, quemaduras o por enfermedades debilitantes como el cáncer o el sida. La sepsis suele comenzar con temblores, fiebre, descenso de la tensión arterial (shock séptico), respiración rápida, frecuencia cardiaca acelerada y lesiones cutáneas. En cuestión de horas, la sepsis puede provocar la coagulación espontánea de los vasos sanguíneos, hipotensión grave, fallo multiorgánico, shock, gangrena y, finalmente, la muerte.
La detección de los PAMP se lleva a cabo mediante receptores de reconocimiento de patrones (PRR) codificados en la línea germinal, no clonalmente distribuidos y no polimórficos, presentes en las células inmunitarias. Los PRR pertenecen a diferentes familias de receptores proteicos estructurales y funcionales (por ejemplo, receptores tipo Toll, receptores Scavenger o lectinas de tipo C), y contribuyen no solo a la detección de patógenos, sino también a la activación y modulación de respuestas inmunitarias innatas y adaptativas (Palm NW y Medzhitov R, 2009, Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity, Immunol Rev 227:221-33).
La superfamilia de receptores scavenger ricos en cisteína (Scavenger Receptor Cysteine-Rich superfamily, SRCR-SF) es un grupo antiguo y altamente conservado de receptores proteicos caracterizados por la presencia de una o varias repeticiones de un dominio globular rico en cisteína de 90-110 aminoácidos de longitud (Sarrias MR et al., 2004, The Scavenger Receptor Cysteine-Rich (SRCR) Domain: An Ancient and Highly Conserved Protein Module of the Innate Immune System, Crit Rev Immunol 24:1-38). En los mamíferos, los miembros del SRCR-SF se expresan en células derivadas de células hemopoyéticas y no hemopoyéticas, donde despliegan múltiples capacidades funcionales. Aunque no existe un papel unificador para todos los miembros de SRCR-SF, algunos de ellos funcionan como PRRs. Este grupo incluye receptores de macrófagos (SR-AI, MARCO, CD163 y Spa), epiteliales (SCARA5, DMBT1 y S5D-SRCRB) o de linfocitos (CD5 y CD6) (Martínez VG et al., 2011, The conserved scavenger receptor cysteine-rich superfamily in therapy and diagnosis, Pharmacol Rev 63:967-1000).
Hoy en día, la sepsis, la sepsis grave y el shock séptico siguen siendo una necesidad clínica insatisfecha con un aumento previsto de su incidencia y una enorme carga socioeconómica como resultado del envejecimiento de la población, el aumento de los procedimientos médicos invasivos, la aparición de bacterias multirresistentes (MDR) y el aumento de la prevalencia de enfermedades crónicas (Okeke EB y Uzonna JE, 2016, In Search of a Cure for Sepsis: Taming the Monsterin Critical Care Medicine, J Innate Immun 8:156-70). La mortalidad global de la sepsis y el choque séptico sigue siendo alta (35% y 60%, respectivamente) a pesar de los importantes avances en los cuidados de apoyo y la disponibilidad de potentes antibióticos de amplio espectro.
Aunque los antibióticos constituyen una parte necesaria del tratamiento de la sepsis, probablemente no basten para reducir sustancialmente la mortalidad asociada a la MOD a la sepsis grave y el shock séptico, en particular en vista del aumento de las bacterias MDR. Por lo tanto, se necesitan urgentemente desarrollos innovadores en tratamientos biológicos y/o dispositivos médicos rentables, alternativos o complementarios a los antibióticos y los cuidados de apoyo.
Las terapias complementarias/alternativas a los antibióticos incluyen enfoques dirigidos al huésped para potenciar los mecanismos de defensa innatos y/o revertir la disfunción de las células inmunitarias asociada a la mortalidad por sepsis (Delano MJ y Ward PA, 2016, Sepsis-induced immune dysfunction: can immune therapies reduce mortality? J Clin Invest 126:23-31). La neutralización de factores microbianos patógenos con componentes inmunitarios endógenos del huésped representa uno de estos enfoques. En este sentido, algunos miembros de la superfamilia de receptores scavenger ricos en cisteína (SRCR-SF) interactúan con PAMPs tanto de bacterias Gram negativas (lipopolisacárido, LPS) como Gram positivas (ácido lipoteicoico, LTA; y peptidoglicano, PGN) (Martínez VG, et al., 20l1, The conserved scavenger receptor cysteine-rich superfamily in therapy and diagnosis. Pharmacol Rev 63:967-1000).
El miembro prototípico del SRCR-SF que muestra propiedades de unión a PAMPs bacterianos es la proteína Deleted in Malignant Brain Tumors-1 (DMBT-1), también conocida como aglutinina salival (SAG) o gp340 (Ligtenberg AJM, et al., 2010, Deleted in malignant brain tumors-1 protein (DMBT1): a pattern recognition receptor with multiple binding sites, Int J Mol Sci 11:5212-33; Madsen J, et al., 2010, Gp-340/DMBT1 in mucosal innate immunity, Innate Immun 16:160-7). DMBT-1/SAG es una glicoproteína soluble que contiene 14 SRCR, una zona pelúcida y dos dominios C1r/C1s Uegf Bmp1. Las propiedades de unión bacteriana de DMBT-1/SAG se han mapeado con precisión dentro de sus dominios Sr Cr a una secuencia peptídica consenso de 11-mer (DMBT-1/SAG.pbs1, GRVEVLYRGSW) de la que se identificó un motivo de 9-mer (VEVLxxxxW) presente en 13 de 14 de ellos (Bikker FJ, et al., 2004, Bacteria binding by DMBT1/SAG/gp-340 is confined to the VEVLXXXXWmotif in its scavenger receptor cysteine-rich domains. J Biol Chem 279:47699-703).
Otros miembros de la SRCR-SF con propiedades de unión bacteriana incluyen el Class A macrophage Scavenger Receptor type I (Peiser L, et al., 2000, Macrophage class A scavenger receptor-mediated phagocytosis of Escherichia coli: role of cell heterogeneity, microbial strain, and culture conditions in vitro Infect Immun 68:1953-63), Macrophage Receptor with Collagenous structure (MARCO) (Brannstrom A, et al., 2002, Arginine residues in domain V have a central role for bacteria-binding activity of macrophage scavenger receptor MARCO. Biochem Biophys Res Commun 290:1462-9), Soluble protein a (Spa) (Sarrias MR, et al., 2005, A role for human Sp alpha as a pattern recognition receptor, J Biol Chem 280:35391-8), Cd 6 (Sarrias MR et al., 2007, CD6 binds to pathogen-associated molecular patterns and protects from LPS-induced septic shock, Proc Natl Acad Sci USA 104:11724-9), CD163 (Fabriek BO, et al., 2009, The macrophage scavenger receptor CD163 functions as an innate immune sensor for bacteria, Blood 113:887-92), Scavenger Receptor Class A Member 5 (Jiang Y, et al., 2006, Identification and characterization of murine SCARA5, a novel class A scavenger receptor that is expressed by populations of epithelial cells. J Biol Chem 281:11834-45), y Soluble Scavenger Receptor Cysteine-Rich group B member with 5 domains (Miró-Juliá C, et al., 2011, Molecular and functional characterization of mouse S5D-SRCRB: a new group B member of the scavenger receptor cysteine-rich superfamily, J Immunol 186(4):2344-54; Bessa Pereira C, et al., 2016, The Scavenger Receptor SSc5D Physically Interacts with Bacteria through the SRCR-Containing N-Terminal Domain, Front Immunol 7:416), incluso si las regiones de unión bacteriana solo se han mapeado funcionalmente para MARCO (Brannstrom A, et al., 2002, Arginine residues in domain V have a central role for bacteria-binding activity of macrophage scavenger receptor MARCO, Biochem Biophys Res Commun 290:1462-9), y CD163 (Fabriek BO, et al., 2009, The macrophage scavenger receptor CD163 functions as an innate immune sensor for bacteria, Blood 113:887-92).
El CD6 es un receptor de superficie linfocitaria altamente homólogo al CD5, otro miembro linfocítico del SRCR-SF. Ambos receptores derivan probablemente por duplicación de un gen ancestral común (Lecomte O, et al., 1996, Molecular linkage of the mouse CD5 and c D6 genes, Immunogenetics 44:385-90) y son expresados principalmente por las células T y el subconjunto de células B1a implicado en la producción de anticuerpos naturales. CD6 y CD5 comparten una región extracelular similar compuesta por tres dominios SRCR en tándem y una cola citoplasmática adecuada para la transducción de señales. De hecho, CD6 y CD5 están asociados físicamente al complejo del receptor de células T (TCR) (Gimferrer I, et al., 2004, Relevance of CD6-mediated interactions in T cell activation and proliferation, J Immunol 173:2262-70), y desempeñan funciones relevantes en la regulación de los procesos de desarrollo y activación de las células T (Santos RF, et al., 2016, Tuning T Cell Activation: The Function of CD6 at the Immunological Synapse and in T Cell Responses, Curr Drug Targets 17:630-9; Soldevila G, et al., 2011, The immunomodulatory properties of the CD5 lymphocyte receptor in health and disease, Curr Opin Immunol 23:310-8). La unión de rshCD6 a PAMP bacterianos como LPS, LTA o PGN tiene lugar con afinidades Kd en el rango nM, similar a la afinidad de unión de CD14 a los mismos PAMP (Dziarski R, et al., 1998, Binding of bacterial peptidoglycan to CD14, J Biol Chem 273:8680-90; Tobias PS, et al., 1995, Lipopolysaccharide binding protein-mediated complexation of lipopolysaccharide with soluble CD14, J Biol Chem 270:10482-8). Además, rshCD6 modula a la baja la liberación de citocinas proinflamatorias (IL-1p, IL-6, TNF-a) desencadenada por LPS o LTAP/GN (Martínez-Florensa M, et al., 2014, Targeting of key pathogenic factors from gram-positive bacteria by the soluble ectodomain of the scavenger-like lymphocyte receptor CD6, J Infect Dis 209:1077-86).
La infusión profiláctica de una forma soluble recombinante de CD6 humana (rshCD6) reduce significativamente la mortalidad y los niveles séricos de citocinas proinflamatorias (IL-1p, IL-6 y TNF-a) en modelos de ratón de shock séptico inducido por endotoxinas bacterianas G+ y G-(LTA+PGN, y LPS, respectivamente), bacterias vivas enteras (Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii) independientemente de su fenotipo MDR (S. aureus, A. baumanii resistente a la colistina), así como modelos monomicrobianos y polimicrobianos de peritonitis (Martínez-Florensa M, et al., 2017, Effects of Human and Mouse Soluble Scavenger-Like CD6 Lymphocyte Receptor in a Lethal Model of Polymicrobial Sepsis, Antimicrob Agents Chemother 61:e01391-16; Martínez-Florensa M, et al., 2014. Targeting of key pathogenic factors from gram-positive bacteria by the soluble ectodomain of the scavenger-like lymphocyte receptor CD6, J Infect Dis 209:1077-1086; Sarrias MR, et al., 2007, CD6 binds to pathogen-associated molecular patterns and protects from LPS-induced septic shock, Proc Natl Acad Sci USA 104:11724-9).
El documento EP 2143436 revela que la administración intraperitoneal (i.p.) de rshCD6 contrarresta los efectos letales causados por el shock séptico inducido por LPS en ratones, y que CD6 tiene potencial terapéutico para la intervención del síndrome de shock séptico y de otras enfermedades inflamatorias relacionadas con enfermedades infecciosas.
Sin embargo, la producción de proteínas recombinantes de mamíferos es un proceso relativamente complejo, que idealmente debería producir una proteína con el plegamiento y las modificaciones postraduccionales correctas, si las hubiera. El proceso suele implicar la clonación del gen deseado en un vector de expresión de mamíferos, la transferencia del gen recombinante en un sistema celular de mamíferos (por ejemplo, células CHO) y la purificación de la proteína mediante procedimientos cromatográficos. Este proceso tiene ciertas limitaciones, como una baja eficiencia de producción y costes elevados. Por lo tanto, parece conveniente proporcionar compuestos y composiciones eficaces para la prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas y de afecciones inflamatorias relacionadas con estas enfermedades infecciosas, como la sepsis, que sean más fáciles y, por lo tanto, más baratos de producir.
Resumen de la invención
La presente invención se define en las reivindicaciones y se refiere a una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en SEQ ID No.: 3, y/o SEQ ID No.: 1, y/o SEQ ID No.: 2, o un derivado de la misma, en la que dicho derivado comprende una o varias modificaciones de dicha secuencia de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en N-acilación y/o C-amidación o C-esterificación, N-alquilación, sustitución de uno o más L-aminoácidos por D-aminoácidos, conjugación con una biomolécula tal como polietilenglicol o albúmina, y bloqueo del extremo N- o C-terminal con residuos de Cys.
En el presente documento se describe un proceso para la preparación de las secuencias de aminoácidos y/o péptidos.
El proceso se lleva a cabo mediante síntesis de péptidos en fase sólida o mediante síntesis de péptidos en solución. La síntesis de péptidos en fase sólida incluye los siguientes pasos:
a) síntesis del péptido en fase sólida,
b) escisión del péptido del soporte polimérico,
c) opcionalmente, ciclación del péptido en solución, y
d) eliminación de los grupos protectores
o alternativamente
i) síntesis del péptido en fase sólida,
ii) opcionalmente, ciclación del péptido en fase sólida, y
iii) escisión del péptido del soporte polimérico y eliminación simultánea de los grupos protectores.
En el presente documento se describe una composición que comprende una o más de las secuencias de aminoácidos.
En otra realización, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la composición aquí descrita, junto con vehículos farmacéuticamente aceptables, sales farmacéuticamente aceptables, adyuvantes y/o excipientes adecuados.
En otra realización, la presente invención se refiere a un conjugado que comprende las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento, preferiblemente un conjugado en el que una o más de las secuencias de aminoácidos están conjugadas (preferiblemente unidas covalentemente) a un soporte, preferiblemente un soporte insoluble, más preferiblemente un polímero insoluble.
En otra realización, la presente invención se refiere a un kit de partes que comprende una o más de las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento y un antibiótico, preferiblemente Imipenem.
La presente solicitud proporciona además una o más secuencias de aminoácidos tal como se describen en el presente documento, la composición farmacéutica de la presente invención o el kit de partes de la presente invención para su uso como medicamento, en particular para su uso en un método de tratamiento terapéutico y/o preventivo, en un mamífero incluido un humano, de una enfermedad infecciosa, o de una afección inflamatoria relacionada con una enfermedad infecciosa, o de una enfermedad inflamatoria relacionada con la presencia de un producto derivado de un agente infeccioso.
Se describe también en el presente documento un dispositivo para la unión selectiva y separación de al menos un componente de una solución acuosa, en el que el dispositivo comprende una o más de las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento.
Además, se describe en el presente documento un método para la eliminación de al menos un componente de una solución acuosa, donde dicho método comprende:
- proporcionar una solución acuosa que contenga potencialmente al menos dicho componente, - hacer pasar la solución acuosa a través del dispositivo de la presente invención en condiciones que efectúen la unión de dicho componente a una o más de las secuencias de aminoácidos comprendidas en el dispositivo, eliminando así dicho componente de la solución acuosa.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Características estructurales y conservación de aminoácidos de los péptidos CD6. (A ) Secuencia de aminoácidos, peso molecular (M.W.) y punto isoeléctrico (pI) de los péptidos y proteínas CD5, CD6 y DMBT-1 analizados. (B) Representaciones tridimensionales de la superficie de la región extracelular de la CD6 humana que muestran la posición relativa de los péptidos CD6 en estudio (coloreados en gris oscuro). (C) Alineación de la secuencia de aminoácidos de los péptidos derivados de CD6 en estudio de primates (Homo sapiens, Macaca mulatta, Nomascus Leucogenys, Pan troglodytes, Tarsius syrichta) roedores (Mus musculus, Rattus norvegicus, Oryctolagus cuniculus, Mesocricetus auratus), peces (Poeciliopsis prolifica, Salmo salar), bovinos (Bos Taurus), cerdos (Sus scrofa) y reptiles (Alligatormississippiensis). Las identidades de los aminoácidos aparecen resaltadas en gris.
Figura 2. Propiedades de aglutinación bacteriana de péptidos derivados de CD6. Se incubaron concentraciones crecientes (5, 50 y 200 μg/mL) de los péptidos indicados derivados de CD6 (PD1, PD2 y PD3), DMBT-1 (pbsl; C+) y CD5 (PD2; C-) durante 2 h a temperatura ambiente en placas de 96 pocillos con fondo en U con suspensiones de células bacterianas vivas (75 x106 CFU/mL) en tampón Tt C (50 mM Tris pH 7.5 más 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20 y 1 mM Ca2+). La aglutinación bacteriana fue puntuada y consensuada por dos observadores independientes como -, /-, , + o ++. (A ) Resumen de los resultados de aglutinación obtenidos con el panel indicado de cepas bacterianas Gram negativas (Acinetobacter baumanii aislado clínico multirresistente; Enterobacter cloacae ATCC 23355; Escherichia coli At CC 25922; Klebsiella pneumoniae ATCC 13883; Listeria monocytogenes ATCC 19111; Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853) y Gram positivas (Staphyloccocus aureus ATCC 25923; Staphylococus aureus resistente a la meticilina (MRSA) aislado clínico). (B) Resultados de aglutinación representativos obtenidos para el aislado clínico de MRSA.
Figura 3. Unión de péptidos derivados de CD6 marcados con biotina a PAMPs inmovilizados de origen Gramy Gram+. Se añadieron concentraciones crecientes (5-20 μg/mL) de péptidos CD6-(PD1, PD2, PD3 y cons), DMBT1-(pbs1) y CD5-(PD1) marcados con biotina a placas ELISA de 96 pocillos sensibilizadas con LPS de E. coli O111:B4 (A ) o lTa de S. aureus (B) (5 μg/mL de cada uno en PBS). Tras una incubación de una noche a 4 °C, los péptidos o proteínas unidos se revelaron mediante la adición de estreptavidina marcada con peroxidasa de rábano (HRP) y sustrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) y nuevas lecturas a una DO de 405-620 nm. Los resultados se expresan como media ± SD de duplicados de un experimento representativo de tres realizados. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de dos vías (*, P<0,05; **, P<0,01; ***, P<0,001).
Figura 4. Kd análisis de la interacción de LPS y LTA con péptidos y proteínas derivados de CD6. Se muestran los valores aparentes de Kd para la unión de los péptidos y proteínas en estudio con LPS y LTA, determinados por emisión de fluorescencia de residuos de triptófano. Los péptidos/proteínas (10 μg/mL) se valoraron con o sin concentraciones crecientes de Re-LPS o LTA en PBS. Las muestras de péptidos (con y sin Re-LPS o LTA) y las muestras en blanco (sólo Re-LPS o LTA) fueron excitados a 295 nm, y los espectros de emisión se registraron de 300 a 400 nm. Los resultados se expresan como el cambio en la fluorescencia del péptido (AF) a la longitud de onda de emisión máxima (353 nm para los péptidos y 337 nm para la proteína rshCD6) en presencia y ausencia de Re-LPS o LTA. Los resultados son medias ± SD de 3 experimentos. Los cambios de fluorescencia de los péptidos a 353 nm se ajustaron a la ecuación de Hill.
Figura 5. Análisis del tamaño hidrodinámico de los péptidos derivados de CD6 en solución. Se muestra el análisis de dispersión dinámica de luz (DLS) del diámetro hidrodinámico de péptidos derivados de CD6 (PD1, PD2, PD3 y Pcons) y DMBT-1/SAG (pbs1) (10 μg/mL) en PBS. El eje Y representa la intensidad relativa de la luz dispersada; el ejeX denota el diámetro hidrodinámico de las partículas presentes en la solución. Se muestra un experimento representativo de los cuatro realizados (izquierda). También se muestran los valores numéricos obtenidos para cada péptido (derecha).
Figura 6. Efecto de los péptidos derivados de CD6 sobre la liberación de citocinas inducida in vitro por LPS por esplenocitos de ratón. Se estimularon suspensiones celulares totales de bazo (2x105) de ratones C57BL/6 (n=7) por triplicado durante 48 h con LPS (0,5 μg/mL), en presencia o ausencia de concentraciones crecientes (0.5, 5 y 20 μg/mL) de péptidos derivados de CD6 (PD1, PD2, PD3 y Pcons). Los niveles de citocinas en los sobrenadantes de cultivo se determinaron mediante ELISA y los resultados se expresaron en μg/mL como media ± SD de triplicados. La viabilidad fue >75% a las 48 h en todas las condiciones experimentales. El análisis estadístico se realizó mediante una prueba de Mann-Whitney de 2 colas, con intervalos de confianza del 95% (*, P<0,05; **, P<0,01; ***, P<0,001).
Figura 7. Efectos terapéuticos comparativos de la infusión i.v. de péptidos derivados de CD6 en la supervivencia de ratones tras una sepsis inducida por ligadura y punción cecal (CLP). (A, B) A los ratones C57BL/6J se les infundió i.v. solución salina (n=25) o dosis únicas de 6 mg/kg de péptidos derivados de CD6 no marcados (PD1, n=8; PD2, n=16; PD3, n=15; Pcons, n=12) o DMBT1 (pbs1, n=13) a 1 h después de la inducción de CLP. Se incluyó un grupo simulado (n=3). En todos los casos se analizó el porcentaje medio de supervivencia a lo largo del tiempo para cada grupo y se comparó con el grupo tratado con solución salina mediante la prueba t de rango logarítmico (*, P<0,05; **, P<0,01; ***, P<0,001).
Figura 8. Efectos dependientes de la dosis, el tiempo y la vía de la infusión de CD6.PD3 en la supervivencia de ratones tras la sepsis inducida por CLP. (A) Los ratones C57BL/6 recibieron una infusión i.v. a 1 h después de la CLP con solución salina (n=26) o dosis únicas crecientes (3 mg/kg, n=13; 6 mg/kg, n=15; y 12 mg/kg, n=8) del péptido CD6.PD3. (B) Los ratones C57BL/6 recibieron una infusión i.v. de solución salina (n=4) o 6 mg/kg de CD6.PD3 en diferentes momentos tras la CLP (+1h, n=5; 3h, n=5; 6h, n=6). (C) Los ratones C57BL/6J recibieron una infusión i.v. (n=11) o i.p. (n=9) de 6 mg/kg de péptido CD6.PD3 o solución salina (n=9) a 1 h post CLP. En todos los casos, se analizó el porcentaje medio de supervivencia a lo largo del tiempo y se comparó con el grupo tratado con solución salina mediante una prueba t de rango logarítmico (n.s., no significativo; *, P<0,05. **, P<0,01; ***, P<0,001).
Figura 9. Efecto terapéutico de la infusión de CD6.PD3 sobre los niveles de citocinas y carga bacteriana tras la sepsis inducida por CLP. (A) Los ratones C57BL/6J recibieron una infusión i.v. de solución salina (n=7) o del péptido CD6.PD3 (6 mg/kg; n=9) a 1 h después de la CLP, y los niveles plasmáticos de citocinas se monitorizaron mediante ELISA en diferentes momentos (4 h y 20 h). Los datos se expresan como media ± SD. (B) Se controló la carga bacteriana en sangre y bazo de los mismos grupos de ratones que en (A) a las 20 h de la inducción de CLP. Los datos se expresan como media ± SD de UFC/mg (bazo) o UFC/μl (sangre). En todos los casos, las diferencias estadísticas se evaluaron mediante una prueba t de Student de 2 colas (*, P<0,05).
Figura 10. Efectos aditivos de la administración combinada de CD6.PD3 más Imipenem/Cilastatina en la supervivencia de ratones tras sepsis inducida por CLP. Los ratones C57BL/6J fueron infundidos terapéuticamente a 1 h post CLP con solución salina (n = 36), CD6.PD3 (6 mg/kg i.v.; n=25), Imipenem/Cilastatina (I/C, 5o mg/kg/12h i.p.; n = 9) o una combinación de los dos últimos (I/C+PD3, n=11). En todos los casos se analizó el porcentaje medio de supervivencia a lo largo del tiempo para cada grupo y se comparó con el grupo I/C más CD6.PD3 mediante la prueba t de rango logarítmico (**, P<0,o2; ***, P<0,002).
Figura 11. Ensayos de adsorción de endotoxinas en péptidos y proteínas derivados de CD6 inmovilizados.
Las perlas Eupergit® recubiertas con diferentes péptidos derivados de CD6 (PD2, PD3 y Pcons) (A) o proteínas (rshCD5 y rshCD6) (B) se incubaron durante diferentes periodos de tiempo (0, 30, 90 y 150 min) con una solución de endotoxina de 50 UI/mL. A continuación, se monitorizó la actividad activadora del lisado de amebocitos de Limulus (actividad LAL) de los sobrenadantes a lo largo del tiempo y se representó la DO 405-620 nm. Las microesferas recubiertas con albúmina de suero humano (HSA) se utilizaron como controles negativos. Se muestran los triplicados de un experimento representativo de dos realizados de forma independiente. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba T pareada de 2 colas con un intervalo de confianza del 95% (***, P <0,001).
Descripción detallada de la invención
Secuencias de aminoácidos y péptidos
En un primer aspecto, la presente invención proporciona una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en una o más de las siguientes secuencias ("las secuencias de aminoácidos de la presente invención"), o un derivado de las mismas, en donde dicho derivado comprende una o varias modificaciones de dicha secuencia de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en N-acilación y/o C-amidación o C-esterificación, N-alquilación, sustitución de uno o más L-aminoácidos por D-aminoácidos, conjugación con una biomolécula tal como polietilenglicol o albúmina, y bloqueo del extremo N- o C-terminal con residuos de Cys:
CD6.PD1: GTVEVRLEASW (SEQ ID NO.: 1);
CD6.PD2: GRVEMLEHGEW (SEQ ID NO.: 2); y
CD6.PD3: GQVEVHFRGVW (SEQ ID NO.: 3).
Preferentemente, la presente invención proporciona uno o más de los siguientes péptidos ("los péptidos de la presente invención"), o un derivado de los mismos, en donde dicho derivado comprende una o varias modificaciones de dicha secuencia de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en N-acilación y/o C-amidación o C-esterificación, N-alquilación, sustitución de uno o más L-aminoácidos por D-aminoácidos, conjugación con una biomolécula tal como el polietilenglicol o la albúmina, y bloqueo del extremo N- o C-terminal con residuos de Cys:
CD6.PD1: GTVEVRLEASW (SEQ ID NO.: 1);
CD6.PD2: GRVEMLEHGEW (SEQ ID NO.: 2); y
CD6.PD3: GQVEVHFRGVW (SEQ ID NO.: 3).
En una realización preferida, la presente invención proporciona una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en GQVEVHFRGVW (SEQ ID NO.: 3, CD6.PD3), o un derivado de la misma. En una realización preferida, la presente invención proporciona el péptido CD6.PD3 (GQVEVHFRGVW, SEQ ID NO.: 3), o un derivado del mismo.
En otra realización, la presente invención proporciona una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en GTVEVRLEASW (SEQ ID NO.: 1, CD6.PD1), o un derivado de la misma. En una realización preferida, la presente invención proporciona el péptido CD6.PD1 (GTVEVRLEASW, SEQ ID NO.: 1), o un derivado del mismo.
En otra realización, la presente invención proporciona una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en GRVEMLEHGEW (Se Q ID NO.: 2, CD6.PD2), o un derivado de la misma. En una realización preferida, la presente invención proporciona el péptido CD6.PD2 (GRVEMLEHGEW, SEQ ID NO.: 2), o un derivado del mismo.
En las realizaciones anteriores de las secuencias de aminoácidos, el derivado de las mismas comprende una o varias modificaciones de dicha secuencia de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en N-acilación y/o C-amidación o C-esterificación, N-alquilación, sustitución de uno o más L-aminoácidos por D-aminoácidos, conjugación con una biomolécula tal como polietilenglicol o albúmina, y bloqueo del extremo N- o C-terminal con residuos de Cys.
Estos péptidos son péptidos cortos conservados de 11-mer que se mapean en los dominios SRCR extracelulares delCD6 humano. El ectodominio de CD6 está compuesto por tres dominios SRCR, las secuencias intermedias y una región peduncular.
La presente invención proporciona además secuencias de aminoácidos que comprenden los péptidos CD6.PD1 (SEQ ID NO.: 1), CD6.PD2 (SEQ ID NO.: 2) y/o CD6.PD3 (SEQ ID NO.: 3). La secuencia de aminoácidos puede ser lineal o cíclica. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos está comprendida dentro del ectodominio de CD6 humano. En una realización preferida, la secuencia de aminoácidos está comprendida dentro de SEQ ID NO: 4. En una realización particular, la secuencia de aminoácidos lineal o cíclica comprende entre 12 y 17 aminoácidos adyacentes que comprenden los péptidos CD6.PD1 (SEQ ID NO.: 1), CD6.PD2 (SEQ ID NO.: 2) o CD6.PD3 (SEQ ID NO.: 3) y está comprendida preferiblemente dentro de SEQ ID NO.: 4. Ejemplos de secuencias de aminoácidos preferidas incluyen, pero no se limitan a: CSGTVEVRLEASWEPAC (SEQ ID NO.: 13), SGTVEVRLEASWEPA (SEQ ID NO.: 14), SGTVEVRLEASWEP (SEQ ID NO.: 15), SGTVEVRLEASWE (SEQ ID NO.: 16), SGTVEVRLEASW (SEQ ID NO.: 17), GTVEVRLEASWEPA (SEQ ID NO.: 18), GTVEVRLEASWEP (SEQ ID NO.: 19), GTVEVRLEASWE (SEQ ID NO.: 20), CAGRVEMLEHGEWGSVC (SEQ ID NO.: 21), AGRVEMLEHGEWGSV (SEQ ID NO.: 22), AGRVEMLEHGEWGS (SEQ ID NO.: 23), AGRVEMLEHGEWG (SEQ ID NO.: 24), AGRVEMLEHGEW (SEQ ID NO.: 25), GRVEMLEHGEWGSV (SEQ ID NO.: 26), GRVEMLEHGEWGS (SEQ ID NO.: 27), GRVEMLEHGEWG (SEQ ID NO.: 28), CEGQVEVHFRGVWNTVC (SEQ ID NO.: 29), EGQVEVHFRGVWNTV (SEQ ID NO.: 30), EGQVEVHFRGVWNT (SEQ ID NO.: 31), EGQVEVHFRGVWN (SEQ ID NO.: 32), EGQVEVHFRGVW (SEQ ID NO.: 33), GQVEVHFRGVWNTV (SEQ ID NO.: 34), GQVEVHFRGVWNT (SEQ ID NO.: 35), GQVEVHFRGVWN (SEQ ID NO.: 36).
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "derivado de una secuencia de aminoácidos o péptido de la presente invención" incluye cualquier derivado de la secuencia de aminoácidos o péptido que comprenda una o varias modificaciones de dicha secuencia de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en N-acilación y/o C-amidación o C-esterificación, N-alquilación, sustitución de uno o más L-aminoácidos por D-aminoácidos, conjugación con una biomolécula tal como polietilenglicol o albúmina, y bloqueo del extremo N- o C-terminal con residuos de Cys. En un aspecto de la presente invención, dichos derivados son capaces de realizar la función biológica, por ejemplo, cualquier derivado de la secuencia de aminoácidos o péptido de la presente invención capaz de unirse a PAMPs ampliamente distribuidos entre bacterias Gram negativas (G-) (por ejemplo, LPS) y Gram positivas (G+) (por ejemplo, LTA). Las secuencias de aminoácidos y los péptidos de la invención pueden incluir modificaciones de la secuencia dada. Tales modificaciones son bien conocidas por los expertos en la materia. Las sustituciones dentro de un residuo de aminoácido, de un átomo C a un átomo N, para producir peptoides que tengan mayor resistencia a la proteólisis, y otras modificaciones, son conocidas y se incluyen dentro del alcance de esta invención. Por ejemplo, uno o más de los L-aminoácidos de las secuencias de aminoácidos y péptidos de la presente invención pueden sustituirse por un D-aminoácido para aumentar su estabilidad. Por ejemplo, la N-acilación y/o C-amidación o C-esterificación de los péptidos y/o secuencias de aminoácidos de la presente invención puede aumentar su resistencia a la proteólisis. Por ejemplo, la ciclación de una o más de las secuencias de aminoácidos y/o péptidos de la presente invención puede aumentar su estabilidad y permeabilidad. Por ejemplo, uno o más de los aminoácidos de las secuencias de aminoácidos y/o péptidos de la presente invención pueden ser N-alquilados (generalmente N-metilados) para mejorar su estabilidad. Por ejemplo, una o más de las secuencias de aminoácidos y/o péptidos de la presente invención pueden conjugarse con una o más macromoléculas (por ejemplo, polietilenglicol (p Eg ), albúmina), para mejorar su estabilidad y/o reducir el aclaramiento renal. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos y los péptidos de la presente invención pueden incluir el extremo N o C terminal bloqueado con residuos de Cys, para su posterior unión covalente a una fase sólida (por ejemplo, perlas de polipropileno).
SEQ ID NO: 4 corresponde a una isoforma soluble madura (totalmente procesada) de CD6 humano. La secuencia del receptor CD6 humano es la identificada con el número de acceso P30203 (CD6_HUMAN, Última modificación 15 de diciembre de 2009. Versión 3 en la base de datos UniProtκΒ/Swiss-Prot), que corresponde al receptor en la isoforma unida a membrana. Aún no se ha determinado completamente si la isoforma soluble de CD6 también se genera por escisión proteolítica; la SEQ ID NO. 4 se obtiene mediante la adición de un codón de stop en la región peduncular que precede a la región transmembrana.
SEQ ID NO.: 4:
DQLNTSSAESELWEPGERLPVRLTNGSSSCSGTVEVRLEASWEPACGALWDSRAAEAVCRALGCGGAEAASQLAP PTPELPPPPAAGNTSVAANATLAGAPALLCSGAEWRLCEVVEHACRSDGRRARVTCAENRALRLVDGGGACAGRVE MLEHGEWGSVCDDTWDLEDAHVVCRQLGCGWAVQALPGLHFTPGRGPIHRDQVNCSGAEAYLWDCPGLPGQHY CGHKEDAGVVCSEHQSWRLTGGADRCEGQVEVHFRGVWNTVCDSEWYPSEAKVLCQSLGCGTAVERPKGLPHSL SGRMYYSCNGEELTLSNCSWRFNNSNLCSQSLAARVLCSASRSLHNLSTPEVPASVQTVTIESSVTVKIENKESR
SEQ ID NO: 4 es el resultado de la transcripción y traducción de secuencias de nucleótidos que comprenden SEQ ID NO: 5.
SEQ ID NO.: 5:
Figure imgf000008_0001
CD6.PD1 (también denominado en el presente documento "PD1" o "P1"), CD6.PD2 (también denominado en el presente documento "PD2" o "P2") y CD6.PD3 (también denominado en el presente documento "PD3" o "P3") son capaces de unirse a PAMP ampliamente distribuidos entre bacterias Gram negativas (G-) (por ejemplo, LPS) y Gram positivas (G+) (por ejemplo, lTa ) (véase, por ejemplo, la Figura 3). También muestran elevadas propiedades de aglutinación bacteriana. En particular, PD1 y p D2 muestran una afinidad muy alta hacia Re-LPS y LTA (véase, por ejemplo, la Figura 4). CD6.PD3 mejora la supervivencia de los ratones sometidos a sepsis polimicrobiana de forma dependiente de la dosis y del tiempo (véanse las Figuras 7, 8 y 9). Cuando se combina con el antibiótico Imipenem/Cilastatina, este péptido funciona incluso mejor (véase, por ejemplo, la Figura 10), mostrando efectos aditivos en la supervivencia de ratones sépticos.
Para producir las secuencias de aminoácidos y los péptidos, o sus derivados, de la presente invención (CD6.PD1, CD6.PD2 y CD6.PD3) puede emplearse cualquier método comúnmente utilizado en la técnica. Por ejemplo, pueden producirse mediante síntesis peptídica en fase sólida (Albericio F y Kates SA, 2000, Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide, CRC Press, ISBN 9780824703592).
Los compuestos de la invención (secuencias de aminoácidos y péptidos, y derivados de los mismos como se ha descrito anteriormente), sus estereoisómeros o sus sales farmacéuticamente aceptables pueden sintetizarse según métodos convencionales conocidos en el estado de la técnica. En un aspecto tal como se describe en el presente documento, los compuestos se sintetizan mediante métodos de síntesis de péptidos en solución o en fase sólida.
Los métodos de síntesis en fase sólida se describen, por ejemplo, en [Stewart J.M. y Young J.D., 1984, "Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition" Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois; Bodanzsky M., y Bodanzsky A., 1984 "The practice of Peptide Synthesis" Springer Verlag, New Cork; Lloyd-Williams -P., Albericio F. y Giralt E. (1997) "Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins" CRC, Boca Raton, FL, USA]. Los métodos de síntesis en solución y las combinaciones de los métodos de síntesis en solución y en fase sólida o la síntesis enzimática se describen en [Kullmann W. et al., J.Biol.Chem., 1980, 255, 8234-8238].
Los compuestos de la invención (secuencias de aminoácidos y péptidos, y derivados de los mismos descritos anteriormente) pueden prepararse mediante un método que comprende las etapas de:
a) Síntesis del péptido en fase sólida
b) Escisión del péptido del soporte polimérico, preferentemente mediante tratamiento ácido.
c) Opcionalmente, ciclación el péptido en solución
d) En caso necesario, eliminación de los grupos protectores, preferiblemente con ácido trifluoroacético. o alternativamente
i) Síntesis del péptido en fase sólida
ii) Opcionalmente, ciclación del péptido en fase sólida
iii) Separación del péptido del soporte polimérico y, si es necesario, eliminación simultánea de los grupos protectores, preferiblemente mediante tratamiento con ácido trifluoroacético.
Preferentemente, el extremo C-terminal está unido a un soporte sólido y el proceso se desarrolla en fase sólida, por lo que comprende el acoplamiento de un aminoácido con el extremo N-terminal protegido y el extremo C-termina/ libre a un aminoácido con el extremo N-terminal libre y el extremo C-terminal unido a un soporte polimérico; la eliminación del grupo protector del extremo N-terminal; y la repetición de esta secuencia tantas veces como sea necesario para obtener así la secuencia peptídica diana, seguida finalmente por la escisión del péptido sintetizado del soporte polimérico original. Los grupos funcionales de las cadenas laterales de aminoácidos se mantienen convenientemente protegidos con grupos protectores temporales o permanentes a lo largo de la síntesis, y pueden desprotegerse simultánea u ortogonalmente al proceso de escisión del péptido del soporte polimérico.
Alternativamente, la síntesis en fase sólida puede realizarse mediante una estrategia convergente acoplando un fragmento peptídico sobre el soporte polimérico o sobre un fragmento peptídico previamente unido al soporte polimérico. Las estrategias de síntesis convergentes son bien conocidas por los expertos en la materia y están descritas por Lloyd-Williams P. et a/. en Tetrahedron 1993, 49, 11065-11133.
El proceso puede comprender los pasos adicionales de desproteger los extremos N-terminal y C-terminal y/o escindir el péptido del soporte polimérico en un orden indistinto, utilizando procesos y condiciones estándar conocidos en la técnica, tras lo cual se pueden modificar los grupos funcionales de dichos extremos. La modificación opcional de los extremos N-terminal y C-terminal puede realizarse con el péptido de fórmula (I) anclado al soporte polimérico o una vez que el péptido se ha escindido del soporte polimérico.
El término "grupo protector" se refiere a un grupo que bloquea un grupo funcional orgánico y que puede eliminarse en condiciones controladas. Los grupos protectores, sus reactividades relativas y las condiciones en las que permanecen inertes son conocidos por el experto en la materia.
Ejemplos de grupos protectores representativos para el grupo amino son las amidas, tales como acetato de amida, benzoato de amida, pivalato de amida; carbamatos, tales como benciloxicarbonilo (Cbz o Z), 2-clorobencilo (ClZ), para-nitrobenciloxicarbonilo (pNZ), terc-butiloxicarbonilo (Boc), 2,2,2-tricloroetoxicarbonilo (Troc), 2-(trimetilsilil)etoxicarbonilo (Teoc), 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o aliloxicarbonilo (Alloc), tritilo (Trt), metoxitritilo (Mtt), 2,4-dinitrofenilo (Dnp), N-[1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-iliden)etilo] (Dde), 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexiliden)-3-metilbutilo (ivDde), 1-(1-adamantil)-1-metiletoxi-carbonilo (Adpoc), entre otros; preferentemente, Boc o Fmoc.
Ejemplos de grupos protectores representativos del grupo carboxilo son los ésteres, tales como el éster de terc-buti/o (tBu), éster de alilo (All), éster trifenilmetilo (éster de tritilo, Trt), éster de ciclohexilo (cHx), éster de bencilo (Bzl), éster de orto-nitrobencilo, éster de para-nitrobencilo, éster de para-metoxibencilo, éster de trimetilsililetilo, éster de 2-fenilisopropilo, éster de fluorenilmetilo (Fm), éster de 4-(N-[1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexiliden)-3-metilbutil]amino)bencilo (Dmab), entre otros; Los grupos protectores preferidos de la invención son los ésteres All, tBu, cHex, Bzl y Trt.
Los aminoácidos trifuncionales pueden protegerse durante el proceso sintético con grupos protectores temporales o permanentes ortogonales a los grupos protectores de los extremos N-terminal y C-terminal. Los grupos amino protectores descritos anteriormente se utilizan para proteger el grupo amino de la cadena lateral de la lisina, la cadena lateral del triptófano puede protegerse con cualquiera de los grupos amino protectores descritos anteriormente, o puede no protegerse, la cadena lateral de serina y treonina se protege con éster de terc-buti/o (tBu), la cadena lateral de cisteína se protege con un grupo protector seleccionado del grupo formado por tritilo y acetamidometilo, y la cadena lateral de asparagina puede protegerse con un grupo protector seleccionado del grupo formado por metoxitritilo, tritilo y xantilo, o puede no protegerse. Los grupos protectores de aminoácidos trifuncionales preferidos de la invención son ésteres de tBu en las cadenas laterales de serina y treonina; Boc en las cadenas laterales de lisina, Trt en las cadenas laterales de cisteína y Fmoc o Boc como grupo protector temporal del extremo N-terminal.
En la literatura se describen ejemplos de estos y otros grupos protectores adicionales, su introducción y su eliminación [Greene T.W. y Wuts P.G.M., (1999) "Protective groups in organic synthesis" John Wiley & Sons, Nueva York; Atherton B. y Sheppard R.C. (1989) "Solid Phase Peptide Synthesis: A practical approach" iRl Oxford University Press]. El término "grupos protectores" también incluye los soportes poliméricos utilizados en la síntesis en fase sólida.
Cuando la síntesis se realiza parcial o totalmente en fase sólida, pueden mencionarse como soportes sólidos a utilizar en el proceso de la invención el poliestireno, el polietilenglicol injertado en soportes de poliestireno y similares, tales como, a modo de ejemplo no limitativo, resinas de p-metilbenzhidrilamina (MBHA) [Matsueda G.R. et al., Peptides 1981, 2, 45-50], resinas de 2-clorotritilo [Barios K. et al. 1989 Tetrahedron Lett. 30:3943-3946; Barios K. et al., 1989 Tetrahedron Lett. 30, 3947-3951], resinas TentaGel® (Rapp Polymere GmbH), resinas ChemMatrix® (Matrix Innovation, Inc) y similares, que pueden incluir o no un espaciador lábil, tal como el ácido 5-(4-aminometil-3,5-dimetoxifenoxi)valérico (PAL) [Albericio F. et al., 1990, J. Org. Chem. 55, 3730-3743], el ácido 2-[4-aminometil-(2,4-dimetoxifenil)]fenoxiacético (Am ) [Rink H., 1987, Tetrahedron Lett. 28, 3787-3790], Wang [Wang S.S., 1973, J. Am. Chem. Soc. 95, 1328-1333] y similares, que permiten escindir el péptido semiprotegido y formar el ciclo en solución con un paso de desprotección en solución o ciclación en fase sólida y posteriormente desprotección y escisión simultáneas del péptido.
Combinación
Un segundo aspecto descrito en el presente documento se refiere a una combinación que comprende una o más de las secuencias de aminoácidos o los péptidos, o derivados de los mismos, de la presente invención y al menos un antibiótico. Preferiblemente, el antibiótico es un antibiótico beta-lactámico, más preferiblemente Imipenem. En una realización preferida, la combinación comprende además un inhibidor enzimático como un inhibidor de la dehidropeptidasa o un inhibidor de la beta-lactamasa, más preferiblemente Cilastatina. Aún más preferiblemente, la combinación comprende Imipenem y Cilastatina.
Pueden utilizarse otros antibióticos en la combinación aquí descrita. Ejemplos de otros antibióticos beta-lactámicos son carbapenems tales como, meropenem, ertapenem, doripenem, penicilinas tales como amoxicilina, ampicilina, propicilina, oxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, mezlocilina, piperacilina, etc. Ejemplos de otras clases de antibióticos incluyen aminoglucósidos tales como estreptomicina, gentamicina, tobramicina, netilmicina, amikacina, etc.; tetraciclinas tales como tetraciclina, doxiciclina, minociclina, clortetraciclina, oxitetraciclina, demeclociclina, limeciclina, meclociclina, metiociclina, minociclina, rolitetraciclina, etc., y quinolonas tales como flumequina (Flubactin), ácido oxolínico (Uroxin), rosoxacina (Eradacil), ciprofloxacina (Zoxan, Ciprobay, Cipro, Ciproxin), fleroxacino (Megalone, Roquinol), lomefloxacino (Maxaquin), nadifloxacino (Acuatim, Nadoxin, Nadixa), norfloxacino (Lexinor, Noroxin, Quinabic, Janacin), ofloxacino (Floxin, Oxaldin, Tarivid), pefloxacino (Peflacine), rufloxacino (Uroflox), balofloxacino (Baloxin), grepafloxacino (Raxar), levofloxacino (Cravit, Levaquin), pazufloxacino (Pasil, Pazucross), esparfloxacino (Zagam), temafloxacino (Omniflox), clinafloxacino, gatifloxacino (Zigat, Tequin) (Zymar -opth.), moxifloxacino (Avelox,Vigamox), sitafloxacino (Gracevit), prulifloxacino (Quisnon) y besifloxacino (Besivance), preferentemente fluoroquinolonas. También se contemplan antibióticos glucopéptidos tales como la vancomicina, la teicoplanina o la telavancina, o antibióticos macrólidos tales como la eritromicina, la espiramicina, la roxitromicina, la claritromicina o la azitromicina, entre otros.
La combinación también puede comprender otros inhibidores de la beta-lactamasa, tales como el ácido clavulánico, sulbactam, tebipenem, 6-Methylidene Penem2, tazobactam, avibactam o relebactam.
Las combinaciones habituales de antibióticos beta-lactámicos e inhibidores de beta-lactamasas son, por ejemplo, ampicilina/sulbactam, amoxicilina/clavulanato o piperacilina/tazobactam.
En una realización preferida, la combinación aquí descrita comprende una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD3 (Gq VeVHFRGVW, Se Q ID NO.: 3), o un derivado de la misma, y al menos un antibiótico, preferiblemente Imipenem, preferiblemente también comprende un inhibidor enzimático tal como un inhibidor de dehidropeptidasa o un inhibidor de beta-lactamasa, más preferiblemente Cilastatina.
En otra realización, la combinación aquí descrita comprende una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD1 (GTVEVRLEASW, SEQ ID NO.: 1), o un derivado de la misma, y al menos un antibiótico, preferiblemente Imipenem, preferiblemente también comprende un inhibidor enzimático tal como un inhibidor de dehidropeptidasa o un inhibidor de beta-lactamasa, más preferiblemente Cilastatina.
En otra realización, la combinación aquí descrita comprende una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD2 (GRVEMLEHGEW, SEQ ID NO.: 2), o un derivado de la misma, y al menos un antibiótico, preferiblemente Imipenem, preferiblemente también comprende un inhibidor enzimático tal como un inhibidor de dehidropeptidasa o un inhibidor de beta-lactamasa, más preferiblemente Cilastatina.
En otra realización, la combinación aquí descrita comprende una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD2 (GRVEMLEHGEW, SEQ ID NO.: 2), o un derivado de la misma, una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD1 (GTVEVRLEASW, SEQ ID NO.: 1), o un derivado de la misma, y al menos un antibiótico, preferentemente Imipenem, preferentemente también un inhibidor enzimático como un inhibidor de la dehidropeptidasa o un inhibidor de la beta-lactamasa, más preferentemente Cilastatina.
En otra realización, la combinación aquí descrita comprende una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD3 (GQVEVHFRGVW, SEQ ID NO.: 3), o un derivado de la misma, una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD1 (GTVEVRLEASW, SEQ ID NO.: 1), o un derivado de la misma, y al menos un antibiótico, preferiblemente Imipenem, preferiblemente también compuesto por un inhibidor enzimático como un inhibidor de la dehidropeptidasa o un inhibidor de la beta-lactamasa, más preferiblemente Cilastatina.
En otra realización, la combinación aquí descrita comprende una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD3 (GQVEVHFRGVW, SEQ ID NO.: 3), o un derivado de la misma, una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD2 (GRVEMLEHGEW, SEQ ID NO.: 2), o un derivado de la misma, y al menos un antibiótico, preferiblemente Imipenem, preferiblemente también compuesto por un inhibidor enzimático como un inhibidor de la dehidropeptidasa o un inhibidor de la beta-lactamasa, más preferiblemente Cilastatina.
En otra realización, la combinación aquí descrita comprende una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD3 (GQVEVHFRGVW, SEQ ID NO.: 3), o un derivado de la misma, una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD2 (GRVEMLEHGEW, SEQ ID NO.: 2), o un derivado de la misma, una secuencia de aminoácidos que comprenda o, alternativamente, consista en CD6.PD1 (GTVEVRLEASW, SEQ ID NO.: 1), o un derivado de la misma, y al menos un antibiótico, preferiblemente Imipenem, que preferiblemente comprenda también un inhibidor enzimático como un inhibidor de la dehidropeptidasa o un inhibidor de la beta-lactamasa, más preferiblemente Cilastatina.
Composición farmacéutica
La presente invención proporciona una composición farmacéutica, que comprende una o más de las secuencias de aminoácidos o los péptidos de la presente invención, o un derivado de los mismos, como se ha descrito anteriormente ("la composición de la presente invención"). Por ejemplo, la composición farmacéutica de la presente invención puede comprender la combinación descrita anteriormente.
En una realización preferida, la composición farmacéutica de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD3 (GQVEVHFRGVW, SEQ ID NO.: 3), o un derivado de la misma.
En otra realización, la composición farmacéutica de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD1 (GTVEVRLEASW, SEQ ID NO.: 1), o un derivado de la misma.
En otra realización, la composición farmacéutica de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD2 (GRVEMLEHGEW, SEQ ID NO.: 2), o un derivado de la misma.
En otra realización, la composición farmacéutica de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD2 (GRVEMLEHGEW, SEQ ID NO.: 2), o un derivado de la misma, y una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD1 (GTVEVRLEASW, SEQ ID NO.: 1), o un derivado de la misma.
En otra realización, la composición farmacéutica de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD3 (GQVEVHFRGVW, SEQ ID NO.: 3), o un derivado de la misma, y una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD1 (GTVEVRLEASW, SEQ ID NO.: 1), o un derivado de la misma.
En otra realización, la composición farmacéutica de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD3 (GQVEVHFRGVW, SEQ ID NO.: 3), o un derivado de la misma, y una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD2 (GRVEMLEHGEW, SEQ ID NO.: 2), o un derivado de la misma.
En otra realización, la composición farmacéutica de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD3 (GQVEVHFRGVW, SEQ ID NO.: 3), o un derivado de la misma, una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD2 (GRVEMLEHGEW, SEQ ID NO.: 2), o un derivado de la misma, y una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD1 (GTVEVRLEASW, SEQ ID NO.: 1), o un derivado de la misma.
La composición de la presente invención es una composición farmacéutica. Por consiguiente, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos aisladas SEQ ID NO: 3, y/o SEQ ID NO.: 1, y/o SEQ ID NO.: 2, o un derivado de las mismas.
El derivado descrito en las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprende una o varias modificaciones de dicha secuencia de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en N-acilación y/o Camidación o C-esterificación, N-alquilación, sustitución de uno o más L-aminoácidos por D-aminoácidos, conjugación con una biomolécula tal como polietilenglicol o albúmina, y bloqueo del extremo N- o C-terminal con residuos de Cys.
Como sabe el experto en la materia, una composición farmacéutica puede comprender, además de uno o más principios activos (por ejemplo, una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos de la presente invención), vehículos farmacéuticamente aceptables, sales farmacéuticamente aceptables, adyuvantes y/o excipientes adecuados. Además, la composición farmacéutica de la presente invención comprende la composición de la presente invención junto con vehículos farmacéuticamente aceptables, sales farmacéuticamente aceptables, adyuvantes y/o excipientes adecuados.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa un disolvente no tóxico, dispersante, excipiente, adyuvante u otro material que se mezcla con ingrediente(s) activo(s) para permitir la formación de una composición farmacéutica, es decir, una forma de dosificación capaz de ser administrada al paciente. Un ejemplo de tal vehículo es un aceite farmacéuticamente aceptable utilizado normalmente para la administración parenteral.
El término "sales farmacéuticamente aceptables", tal como se utiliza aquí, significa que las sales de los compuestos de la presente invención pueden utilizarse en preparaciones medicinales. Otras sales pueden, sin embargo, ser útiles en la preparación de los compuestos según la invención o de sus sales farmacéuticamente aceptables.
El término "vehículo" se refiere a un diluyente o excipiente con el que se administra(n) el(los) principio(s) activo(s). Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, como agua y aceites, incluidos los de origen petroquímico, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Como vehículos se utilizan preferentemente agua o soluciones acuosas salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol, en particular para soluciones inyectables. En la obra "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin, 1995, se describen vehículos farmacéuticos adecuados.
Un "adyuvante", tal como se utiliza en el presente documento, es una sustancia que tiene pocos o ningún efecto farmacológico por sí misma, pero que puede aumentar la eficacia o potencia de otros agentes cuando se administra (esencialmente) al mismo tiempo y, a menudo, (esencialmente) por la misma vía de administración en (esencialmente) el mismo lugar (por ejemplo, inyección en el mismo músculo) que el otro agente. Más concretamente, cuando se utiliza en el contexto de las inmunizaciones, un adyuvante es una sustancia que estimula o que puede estimular el sistema inmunitario y aumentar la respuesta a un agente inmunizante, sin tener ningún efecto antigénico específico en sí mismo. Más concretamente, un adyuvante inmunológico puede definirse como una sustancia que actúa para acelerar, prolongar o potenciar las respuestas inmunitarias específicas al antígeno cuando se utiliza en combinación con agente(s) antigénico(s) específico(s).
Los vehículos y las sustancias auxiliares necesarios para fabricar la forma farmacéutica deseada de la composición farmacéutica de la invención dependerán, entre otros factores, de la forma farmacéutica elegida. Dichas formas farmacéuticas de la composición farmacéutica de la invención se fabricarán según métodos convencionales conocidos por el experto en la materia.
Ejemplos de composiciones farmacéuticas incluyen cualquier composición sólida (comprimidos, píldoras, cápsulas, granulados, etc.) o líquida (soluciones, suspensiones o emulsiones) para administración oral, tópica o parenteral como administración intraperitoneal, intravenosa, intramuscular o subcutánea. Además, la composición farmacéutica puede contener, según proceda, estabilizantes, suspensiones, conservantes, tensioactivos y similares.
El experto en la materia adaptará la composición en función del modo de administración concreto. La composición de la presente invención puede comprender además otros agentes terapéuticos contra las enfermedades infecciosas o las afecciones inflamatorias relacionadas con ellas, o combinaciones de los mismos.
Kit de partes
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un kit de partes que comprende, o alternativamente, consiste en una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos de la presente invención (o derivados de los mismos) y al menos un antibiótico. Preferiblemente, el antibiótico es un antibiótico beta-lactámico, más preferiblemente Imipenem ("el kit de partes de la presente invención"). En una realización preferida, la combinación comprende además un inhibidor enzimático tal como un inhibidor de la dehidropeptidasa o un inhibidor de la beta-lactamasa, más preferiblemente Cilastatina. Aún más preferiblemente, el kit de partes comprende imipenem y Cilastatina.
Pueden utilizarse otros antibióticos en el kit de partes de la presente invención. Ejemplos de otros antibióticos betalactámicos son carbapenems tales como meropenem, ertapenem, doripenem, penicilinas tales como amoxicilina, ampicilina, propicilina, oxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, mezlocilina, piperacilina, etc. Ejemplos de otras clases de antibióticos incluyen aminoglucósidos tales como estreptomicina, gentamicina, tobramicina, netilmicina, amikacina, etc.; tetraciclinas tales como tetraciclina, doxiciclina, minociclina, clortetraciclina, oxitetraciclina, demeclociclina, limeciclina, meclociclina, metiociclina, minociclina, rolitetraciclina, etc., y quinolonas tales como flumequina (Flubactin), ácido oxolínico (Uroxin), rosoxacina (Eradacil), ciprofloxacina (Zoxan, Ciprobay, Cipro, Ciproxin), fleroxacino (Megalone, Roquinol), lomefloxacino (Maxaquin), nadifloxacino (Acuatim, Nadoxin, Nadixa), norfloxacino (Lexinor, Noroxin, Quinabic, Janacin), ofloxacino (Floxin, Oxaldin, Tarivid), pefloxacino (Peflacine), rufloxacino (Uroflox), balofloxacino (Baloxin), grepafloxacino (Raxar), levofloxacino (Cravit, Levaquin), pazufloxacino (Pasil, Pazucross), esparfloxacino (Zagam), temafloxacino (Omniflox), clinafloxacino, gatifloxacino (Zigat, Tequin) (Zymar -opth.), moxifloxacino (Avelox,Vigamox), sitafloxacino (Gracevit), prulifloxacino (Quisnon) y besifloxacino (Besivance), preferentemente fluoroquinolonas. También se contemplan antibióticos glucopéptidos tales como la vancomicina, la teicoplanina o la telavancina, o antibióticos macrólidos tales como la eritromicina, la espiramicina, la roxitromicina, la claritromicina o la azitromicina, entre otros.
El kit de partes también puede comprender otros inhibidores de la beta-lactamasa, como ácido clavulánico, sulbactam, tebipenem, 6-methylidene Penem2, tazobactam, avibactam o relebactam.
Las combinaciones habituales de antibióticos betalactámicos e inhibidores de beta-lactamasas son, por ejemplo, ampicilina/sulbactam, amoxicilina/clavulanato o piperacilina/tazobactam.
El kit de partes también puede denominarse en la presente descripción "producto combinado" y/o "producto farmacéutico", y se define en el contexto de la presente solicitud como un producto o sistema multicomponente que comprende dos o más componentes, que no están necesariamente presentes como una unión, por ejemplo, en composición, pero que están disponibles para su aplicación o administración simultánea, separada o secuencial. En consecuencia, los componentes del kit de partes pueden estar físicamente separados, en diferentes envases, como se describirá en detalle más adelante.
El sistema multicomponente puede utilizarse para almacenar una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos de la presente invención en un envase y el antibiótico (preferentemente Imipenem), que preferentemente también comprende un inhibidor enzimático como un inhibidor de la dehidropeptidasa o un inhibidor de la beta-lactamasa (preferentemente Cilastatina) en el otro envase. En el momento adecuado, pueden mezclarse los componentes. Alternativamente, los componentes pueden utilizarse por separado o secuencialmente, es decir, sin mezclarse antes de su administración a un sujeto que los necesite.
En particular, dicho kit de partes puede comprender o, alternativamente, consiste en, (a) un primer envase que comprende una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos de la presente invención y (b) un segundo envase que comprende un antibiótico, preferiblemente Imipenem, como se ha descrito anteriormente, preferiblemente también comprende un inhibidor enzimático tal como un inhibidor de dehidropeptidasa o un inhibidor de beta-lactamasa, preferiblemente Cilastatina, como se ha descrito anteriormente.
El kit de partes de la presente invención puede comprender o, alternativamente, consistir en una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos de la presente invención y un antibiótico, preferiblemente Imipenem, como se ha descrito anteriormente, que preferiblemente también comprende un inhibidor enzimático tal como un inhibidor de dehidropeptidasa o un inhibidor de beta-lactamasa, preferiblemente Cilastatina, como se ha descrito anteriormente, como entidades separadas (por ejemplo, comprendidas en envases separados), que pueden administrarse al sujeto (un mamífero, preferiblemente un humano) simultáneamente, secuencialmente o por separado. En una realización preferida, el kit de partes de la presente invención comprende o, alternativamente, consiste en una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos de la presente invención y un antibiótico, preferiblemente Imipenem, como se ha descrito anteriormente, preferiblemente también comprende un inhibidor enzimático tal como un inhibidor de dehidropeptidasa o un inhibidor de beta-lactamasa, preferiblemente Cilastatina, como se ha descrito anteriormente como entidades separadas (p. ej., comprendidas en envases separados), que pueden administrarse al sujeto (un mamífero, preferiblemente un humano, o un no-mamífero) simultáneamente, secuencialmente o por separado. En otra realización, los envases se combinan en un único artículo de fabricación que tiene una barrera entre los envases. Esta barrera puede retirarse o destruirse para permitir la mezcla de los componentes en el momento adecuado.
En consecuencia, la presente invención proporciona un kit de partes de la presente invención para su uso simultáneo, separado o secuencial como medicamento, en particular en un método de tratamiento terapéutico y/o preventivo, en un mamífero incluyendo un humano, y/o en un no-mamífero, de una enfermedad infecciosa, o de una afección inflamatoria relacionada con una enfermedad infecciosa, o de una enfermedad inflamatoria relacionada con la presencia de un producto derivado de un agente infeccioso, como se define a continuación.
Por ejemplo, el mamífero puede ser un roedor (tal como un ratón o una rata), un primate (tal como un simio, un mono o un lémur), un perro, un gato, un conejo y un ungulado tal como ganado vacuno, caballos o cerdos. En una realización preferida, el mamífero es un ser humano.
Por ejemplo, el no-mamífero puede ser un pollo, un pato, un ganso, un avestruz, una paloma, un pavo, etc.).
El kit de partes de la presente invención puede comprender o, alternativamente, consistir en:
a) una composición farmacéutica que comprenda una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos de la presente invención, o un derivado de los mismos, como se describe en el presente documento, y vehículos farmacéuticamente aceptables, sales farmacéuticamente aceptables, adyuvantes y/o excipientes adecuados; y
b) una composición farmacéutica que comprende un antibiótico, preferiblemente Imipenem, como se ha descrito anteriormente, preferiblemente que también comprende un inhibidor enzimático como un inhibidor de la dehidropeptidasa o un inhibidor de la beta-lactamasa, preferiblemente Cilastatina, como se ha descrito anteriormente y vehículos farmacéuticamente aceptables, sales farmacéuticamente aceptables, adyuvantes y/o excipientes adecuados. Más preferentemente, la composición farmacéutica comprende Imipenem, aún más preferentemente, junto con Cilastatina.
Ambas composiciones farmacéuticas (a) y (b) se incluyen preferiblemente en el kit de partes de la presente invención como entidades separadas (por ejemplo, como composiciones líquidas o sólidas separadas, en envases separados, como se ha descrito anteriormente), que pueden administrarse al sujeto (un mamífero, preferiblemente un humano, o un no-mamífero) simultáneamente, secuencialmente o por separado.
Como se ha mencionado anteriormente, y se describirá más adelante, la composición farmacéutica y/o el kit de partes de la presente invención pueden además comprender preferentemente un inhibidor enzimático tal como un inhibidor de la dehidropeptidasa o un inhibidor de la beta-lactamasa, preferentemente Cilastatina. Un inhibidor enzimático tal como un inhibidor de la dehidropeptidasa o un inhibidor de la beta-lactamasa, preferiblemente Cilastatina, puede estar comprendido en el kit de partes de la presente invención como una (tercera) entidad separada, en un tercer envase separado, preferiblemente en forma de una composición farmacéutica que comprende un inhibidor enzimático tal como un inhibidor de la dehidropeptidasa o un inhibidor de la beta-lactamasa, preferiblemente Cilastatina, y vehículos farmacéuticamente aceptables, sales farmacéuticamente aceptables, adyuvantes y/o excipientes adecuados. Preferiblemente, un inhibidor enzimático, tal como un inhibidor de la dehidropeptidasa o un inhibidor de la betalactamasa, preferiblemente Cilastatina, está comprendido en la misma entidad (mismo envase) que un antibiótico, preferiblemente Imipenem, como se ha descrito anteriormente (por ejemplo, una composición o composición farmacéutica que comprende Imipenem y Cilastatina).
Por ejemplo, una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos de la presente invención, o un derivado de los mismos (o la composición farmacéutica que comprende una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos de la presente invención, o un derivado de los mismos, y vehículos farmacéuticamente aceptables, sales farmacéuticamente aceptables, adyuvantes y/o excipientes adecuados) y un antibiótico, preferiblemente Imipenem, como se ha descrito anteriormente, preferiblemente junto con un inhibidor enzimático tal como un inhibidor de la dehidropeptidasa o un inhibidor de la beta-lactamasa, preferiblemente Cilastatina, como se ha descrito anteriormente (o la composición farmacéutica que comprende un antibiótico, preferentemente Imipenem, como se ha descrito anteriormente, preferentemente junto con un inhibidor enzimático como un inhibidor de la dehidropeptidasa o un inhibidor de la beta-lactamasa, preferentemente Cilastatina, como se ha descrito anteriormente, y vehículos farmacéuticamente aceptables, sales farmacéuticamente aceptables, adyuvantes y/o excipientes adecuados) comprendidos en el kit de partes de la presente invención, preferiblemente como entidades separadas, pueden administrarse simultáneamente (al mismo tiempo) al sujeto (un mamífero, preferiblemente un humano).
Alternativamente, una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos de la presente invención, o un derivado de los mismos (o la composición farmacéutica que comprende una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos de la presente invención, o un derivado de los mismos, y vehículos farmacéuticamente aceptables, sales farmacéuticamente aceptables, adyuvantes y/o excipientes adecuados) y un antibiótico, preferiblemente Imipenem, como se ha descrito anteriormente, preferiblemente junto con un inhibidor enzimático tal como un inhibidor de la dehidropeptidasa o un inhibidor de la beta-lactamasa, preferiblemente Cilastatina, como se ha descrito anteriormente (o la composición farmacéutica que comprende un antibiótico, preferiblemente Imipenem, como se ha descrito anteriormente, preferiblemente junto con un inhibidor enzimático como un inhibidor de dehidropeptidasa o un inhibidor de beta-lactamasa, preferiblemente Cilastatina, como se ha descrito anteriormente, y vehículos farmacéuticamente aceptables, sales farmacéuticamente aceptables, adyuvantes y/o excipientes adecuados) comprendidos en el kit de partes de la presente invención, preferiblemente como entidades separadas, pueden administrarse secuencialmente al sujeto (un mamífero, preferiblemente un humano); por ejemplo, una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos de la presente invención, o un derivado de los mismos (o la composición farmacéutica que comprende una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos de la presente invención, o un derivado de los mismos, y vehículos farmacéuticamente aceptables, sales farmacéuticamente aceptables, adyuvantes y/o excipientes adecuados) puede administrarse en primer lugar y, después, un antibiótico, preferiblemente Imipenem, como se ha descrito anteriormente, preferentemente junto con un inhibidor enzimático, como un inhibidor de la dehidropeptidasa o un inhibidor de la beta-lactamasa, preferentemente Cilastatina, como se ha descrito anteriormente (o la composición farmacéutica que comprende un antibiótico, preferentemente Imipenem, como se ha descrito anteriormente, preferiblemente junto con un inhibidor enzimático como un inhibidor de la dehidropeptidasa o un inhibidor de la betalactamasa, preferiblemente Cilastatina, como se ha descrito anteriormente, y vehículos farmacéuticamente aceptables, sales farmacéuticamente aceptables, adyuvantes y/o excipientes adecuados) se administra al sujeto (un mamífero, preferiblemente un humano).
Preferiblemente, un antibiótico, preferiblemente Imipenem, como se ha descrito anteriormente, preferiblemente junto con un inhibidor enzimático como un inhibidor de dehidropeptidasa o un inhibidor de beta-lactamasa, preferiblemente Cilastatina, como se ha descrito anteriormente (o la composición farmacéutica que comprende un antibiótico, preferiblemente Imipenem, como se ha descrito anteriormente, preferiblemente junto con un inhibidor enzimático como un inhibidor de dehidropeptidasa o un inhibidor de beta-lactamasa, preferiblemente Cilastatina, como se ha descrito anteriormente, y vehículos farmacéuticamente aceptables, sales farmacéuticamente aceptables, adyuvantes y/o excipientes adecuados) se administra primero al sujeto (un mamífero, preferiblemente un ser humano) y, después, se administra al sujeto una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos de la presente invención, o un derivado de los mismos (o la composición farmacéutica que comprende una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos de la presente invención, o un derivado de los mismos, y vehículos farmacéuticamente aceptables, sales farmacéuticamente aceptables, adyuvantes y/o excipientes adecuados).
Alternativamente, una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos de la presente invención, o un derivado de los mismos (o la composición farmacéutica que comprende una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos de la presente invención, o un derivado de los mismos, y vehículos farmacéuticamente aceptables, sales farmacéuticamente aceptables, adyuvantes y/o excipientes adecuados) y un antibiótico, preferiblemente Imipenem, como se ha descrito anteriormente, preferiblemente junto con un inhibidor enzimático como un inhibidor de la dehidropeptidasa o un inhibidor de la beta-lactamasa, preferiblemente Cilastatina, como se ha descrito anteriormente (o la composición farmacéutica que comprende un antibiótico, preferiblemente Imipenem, como se ha descrito anteriormente, preferiblemente junto con un inhibidor enzimático como un inhibidor de la dehidropeptidasa o un inhibidor de la beta-lactamasa, preferiblemente Cilastatina, como se ha descrito anteriormente, y vehículos farmacéuticamente aceptables, sales farmacéuticamente aceptables, adyuvantes y/o excipientes adecuados) comprendidos en el kit de partes de la presente invención, preferiblemente como entidades separadas, pueden administrarse por separado al sujeto (un mamífero, preferiblemente un humano). Por ejemplo, el sujeto (un mamífero, preferiblemente un humano) ya está tomando un antibiótico, preferiblemente Imipenem, como se ha descrito anteriormente, preferiblemente junto con un inhibidor enzimático como un inhibidor de la dehidropeptidasa o un inhibidor de la beta-lactamasa, preferiblemente Cilastatina, como se ha descrito anteriormente, (o la composición farmacéutica que comprende un antibiótico, preferentemente Imipenem, como se ha descrito anteriormente, preferentemente junto con un inhibidor enzimático como un inhibidor de la dehidropeptidasa o un inhibidor de la betalactamasa, preferentemente Cilastatina, como se ha descrito anteriormente, y vehículos farmacéuticamente aceptables, sales farmacéuticamente aceptables, adyuvantes y/o excipientes adecuados) y se administra una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos de la presente invención, o un derivado de los mismos (o la composición farmacéutica que comprende una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos de la presente invención, o un derivado de los mismos, y vehículos farmacéuticamente aceptables, sales farmacéuticamente aceptables, adyuvantes y/o excipientes adecuados), preferiblemente en una dosis única.
Por consiguiente, los componentes del kit de partes de la presente invención pueden administrarse de forma simultánea, secuencial o separadamente a un sujeto (un mamífero, incluido un ser humano), en un método de tratamiento terapéutico y/o preventivo, preferentemente, de una enfermedad infecciosa, o de una afección inflamatoria relacionada con una enfermedad infecciosa, o de una enfermedad inflamatoria relacionada con la presencia de un producto derivado de un agente infeccioso, como se describirá más adelante.
Imipenem
El imipenem es un antibiótico p-lactámico perteneciente a la clase de los carbapenems. Los carbapenems son altamente resistentes a las enzimas p-lactamasas producidas por muchas bacterias G- resistentes a múltiples fármacos. El imipenem actúa como antimicrobiano inhibiendo la síntesis de la pared celular de varias bacterias G+ y G-, reduciendo así la cantidad de PAMP liberados durante la bacteriolisis. Permanece muy estable en presencia de p-lactamasas (tanto penicilinasas como cefalosporinasas) producidas por algunas bacterias, y es un fuerte inhibidor de las p-lactamasas de algunas bacterias G- que son resistentes a la mayoría de los antibióticos p-lactámicos. El nombre sistemático IUPAC del imipenem es el ácido (5R,6S)-6-[(1R)-1-hidroxietil]-3-({2-[(iminometil)amino]etil}tio)-7-oxo-1-azabiciclo[3.2.0]hept-2-eno-2-carboxílico, su número de registro CAS es 74431-23-5 y su fórmula química es la descrita a continuación en la Fórmula 1:
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Como se describirá en detalle más adelante, el Imipenem se administra generalmente junto con Cilastatina.
Cilastatina
La cilastatina es un compuesto que inhibe la dehidropeptidasa humana, la enzima responsable de la degradación in vivo del antibiótico Imipenem. En consecuencia, la Cilastatina puede administrarse junto con el Imipenem para proteger su degradación por la dehidropeptidasa, prolongando así el tiempo de circulación y, por tanto, su efecto antibacteriano en el organismo. La Cilastatina por sí misma no tiene actividad antibiótica. Como sabe el experto en la materia, el Imipenem por sí solo es un antibiótico eficaz y puede administrarse sin Cilastatina. Sin embargo, preferiblemente, Imipenem se administra con Cilastatina, preferiblemente en una proporción Imipenem:Cilastatina de 1:1.
Efectos de las secuencias de aminoácidos, péptidos (o derivados de los mismos), composición farmacéutica y kit de partes de la invención
En un aspecto descrito en el presente documento, una o más de las secuencias de aminoácidos, péptidos o derivados de los mismos, la composición farmacéutica y/o los componentes del kit de partes de la presente invención pueden administrarse a un mamífero, preferentemente un ser humano. Alternativamente, una o más de las secuencias de aminoácidos, péptidos o derivados de los mismos, la composición farmacéutica y/o los componentes del kit de partes de la presente invención pueden administrarse a un no-mamífero, preferentemente un pollo, un pato, un ganso, un avestruz, una paloma y/o un pavo. La finalidad de la administración de una o más de las secuencias de aminoácidos, péptidos (o derivados de los mismos), composición farmacéutica y/o los componentes del kit de partes de la presente invención puede ser preventiva (para evitar el desarrollo de estas enfermedades) y/o terapéutica (para tratar estas enfermedades una vez que se han desarrollado/instalado).
Debe entenderse que una o más de las secuencias de aminoácidos, los péptidos (o derivados de los mismos), la composición farmacéutica y/o los componentes del kit de partes de la presente invención se administran en una forma farmacéuticamente aceptable. Los expertos en la materia pueden determinar la dosis adecuada mediante procedimientos estándar. Se entiende que la dosis debe ser una cantidad eficaz de una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos (o derivados de los mismos), con o sin un antibiótico, preferentemente Imipenem, como se ha descrito anteriormente (y con o sin un inhibidor enzimático como un inhibidor de la dehidropeptidasa o un inhibidor de la beta-lactamasa, preferentemente Cilastatina, como se ha descrito anteriormente) en el sentido de que se observe una respuesta inflamatoria reducida en el sujeto tratado.
La coadministración específica (simultánea, secuencial o separada) de una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos de la presente invención (o derivados de los mismos), preferentemente CD6.PD3, o un derivado del mismo, y un antibiótico, preferentemente Imipenem (preferentemente junto con un inhibidor enzimático como un inhibidor de dehidropeptidasa o un inhibidor de beta-lactamasa, preferentemente Cilastatina, como se ha descrito anteriormente) proporcionan efectos terapéuticos aditivos claramente mejorados, particularmente en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad infecciosa, o de una afección inflamatoria relacionada con una enfermedad infecciosa, o de una enfermedad inflamatoria relacionada con la presencia de un producto derivado de un agente infeccioso en un mamífero, incluido un humano, y/o en un no-mamífero, incluido un pollo, un pato, un ganso, un avestruz, una paloma y/o un pavo.
Métodos de tratamiento
Las referencias a métodos de tratamiento en los párrafos siguientes de esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).
En otro aspecto, una o más de las secuencias de aminoácidos, los péptidos (o derivados de los mismos), la composición farmacéutica y/o el kit de partes de la presente invención, en cualquiera de sus variantes, pueden utilizarse como medicamento, preferentemente en un método de tratamiento terapéutico y/o preventivo en un mamífero, incluyendo un humano, y/o en un no-mamífero, incluyendo un pollo, un pato, un ganso, un avestruz, una paloma y/o un pavo de una enfermedad infecciosa, o de una afección inflamatoria relacionada con una enfermedad infecciosa, o de una enfermedad inflamatoria relacionada con la presencia de un producto derivado de un agente infeccioso. La presente invención proporciona así una o más de las secuencias de aminoácidos, los péptidos (o derivados de los mismos), la composición farmacéutica y/o el kit de partes de la presente invención, en cualquiera de sus variantes para su uso en un método terapéutico y/o preventivo de tratamiento de una enfermedad infecciosa, o de una afección inflamatoria relacionada con una enfermedad infecciosa, o de una enfermedad inflamatoria relacionada con la presencia de un producto derivado de un agente infeccioso que comprende la administración de una o más de las secuencias de aminoácidos, péptidos (o derivados de los mismos), composición farmacéutica y/o el kit de partes de la presente invención a un mamífero y/o a un no mamífero. Por ejemplo, el mamífero puede ser un roedor (como un ratón o una rata), un primate (como un simio, mono o lémur), un perro, un gato, un conejo y un ungulado como ganado vacuno, caballos o cerdos. En una realización preferida, el mamífero es un ser humano. Por ejemplo, el nomamífero puede ser un pollo, un pato, un ganso, un avestruz, una paloma, un pavo, etc.).
Preferentemente, la presente invención proporciona una o más de las secuencias de aminoácidos, los péptidos (o derivados de los mismos), la composición farmacéutica y/o el kit de partes de la presente invención, en cualquiera de sus variantes para su uso en un método terapéutico y/o preventivo de tratamiento de una enfermedad infecciosa o de una afección inflamatoria relacionada con una enfermedad infecciosa, o de una enfermedad inflamatoria relacionada con la presencia de un producto derivado de un agente infeccioso que comprende la administración a un mamífero, preferiblemente a un humano, y/o a un no-mamífero, como se ha descrito anteriormente, de una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en GQVEVHFRGVW (CD6.PD3, SEQ ID NO.: 3), o un derivado de la misma, o de una composición farmacéutica y/o kit de partes como se ha definido anteriormente que comprenden una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en GQVEVHFRGVW (CD6.PD3, SEQ ID NO.: 3), o un derivado de la misma.
Por ejemplo, la presente invención proporciona una o más de las secuencias de aminoácidos, los péptidos (o derivados de los mismos), la composición farmacéutica y/o el kit de partes de la presente invención, en cualquiera de sus variantes para su uso en un método terapéutico y/o preventivo de tratamiento de una enfermedad infecciosa o de una afección inflamatoria relacionada con una enfermedad infecciosa, o de una enfermedad inflamatoria relacionada con la presencia de un producto derivado de un agente infeccioso que comprende la administración a un mamífero, preferiblemente a un humano, y/o a un no-mamífero, como se ha descrito anteriormente, de una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en GTVEVRLEASW (CD6.PD1, SEQ ID NO.: 1), o un derivado de la misma, o de una composición farmacéutica y/o un kit de partes como se ha definido anteriormente que comprenda una secuencia de aminoácidos que comprenda o, alternativamente, consista en GTVEVRLEASW (CD6.PD1, SEQ ID NO.: 1), o un derivado de la misma.
Por ejemplo, la presente invención proporciona una o más de las secuencias de aminoácidos, los péptidos (o derivados de los mismos), la composición farmacéutica y/o el kit de partes de la presente invención, en cualquiera de sus variantes para su uso en un método terapéutico y/o preventivo de tratamiento de una enfermedad infecciosa o de una afección inflamatoria relacionada con una enfermedad infecciosa, o de una enfermedad inflamatoria relacionada con la presencia de un producto derivado de un agente infeccioso que comprende la administración a un mamífero, preferiblemente a un humano, y/o a un no-mamífero, como se ha descrito anteriormente, de una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en GRVEMLEHGEW (CD6.PD2, SEQ ID NO.: 2), o un derivado de la misma, o de una composición farmacéutica y/o kit de partes como se ha definido anteriormente que comprenda una secuencia de aminoácidos que comprenda o, alternativamente, consista en GRVEMLEHGEW (CD6.PD2, SEQ ID NO.: 2), o un derivado de la misma.
Según la presente invención, los derivados mencionados comprenden una o varias modificaciones de dicha secuencia de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en N-acilación y/o C-amidación o C-esterificación, N-alquilación, sustitución de uno o más L-aminoácidos por D-aminoácidos, conjugación con una biomolécula tal como polietilenglicol o albúmina, y bloqueo del extremo N- o C-terminal con residuos de Cys.
Por ejemplo, la presente invención proporciona el kit de partes de la presente invención para uso simultáneo, secuencial o separado como medicamento. En particular, la presente invención proporciona el kit de partes de la presente invención para uso simultáneo, secuencial o separado en un método de tratamiento terapéutico y/o preventivo, en un mamífero incluyendo un humano, y/o a un no-mamífero, como se describe anteriormente, de una enfermedad infecciosa, o de una afección inflamatoria relacionada con una enfermedad infecciosa, o de una enfermedad inflamatoria relacionada con la presencia de un producto derivado de un agente infeccioso.
En una realización particular de la invención, la enfermedad infecciosa es una infección microbiana. En realizaciones más particulares, la infección microbiana se selecciona del grupo que consiste en una infección bacteriana (ya sean bacterias G+ o G-, saprofitas o patógenas, aerobias o anaerobias), una infección fúngica, una infección vírica, una infección parasitaria y combinaciones de las mismas (infección polimicrobiana).
En otra realización particular, la enfermedad infecciosa es una septicemia. Tal como se utiliza aquí, el término "septicemia" se refiere a la presencia de cualquier microbio en el torrente sanguíneo. En particular, la septicemia se selecciona del grupo que consiste en una bacteriemia, una fungemia, una viremia, una parasitemia y combinaciones de las mismas.
La presencia de microbios viables se encuentra en la mayoría de los casos de afecciones inflamatorias relacionadas con una enfermedad infecciosa, mientras que entre el 20% y el 30% de los pacientes no tienen microbios identificados de ninguna fuente, sino productos derivados de ellos. Así, en otra realización, la afección inflamatoria está relacionada con un producto derivado de un agente infeccioso. En particular, el agente infeccioso se selecciona del grupo que consiste en una bacteria (ya sean bacterias G+ o G-, saprofitas o patógenas, aerobias o anaerobias), un hongo, un virus, un parásito y/o combinaciones de los mismos.
La sepsis se define como la presencia o presunta presencia de una infección acompañada de manifestaciones de una respuesta sistémica denominada síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS). Para la definición de sepsis, se remite al artículo "Severe sepsis and septic shock: review of the literature and emergency department management guidelines", H.B. Nguyen et al., Ann. Emergency Med. 2006, vol. 48, pp. 28-54. La sepsis suele estar causada por infecciones bacterianas (bacterias G+ o G-), pero también puede estar provocada por otros patógenos. Sin embargo, lo más frecuente es que la sepsis esté causada por infecciones bacterianas G+ y G - . Sin embargo, las lesiones y los síntomas atribuibles a la sepsis no sólo están causados por la bacteria viva entera, sino también por un componente de la pared celular de la bacteria conocido como endotoxinas. Las endotoxinas (por ejemplo, LpS, LTA, p Gn ) son glucolípidos ubicuos en la membrana externa de las bacterias G+ y G-. Las endotoxinas se liberan cuando el sistema inmunitario destruye la bacteria invasora. Las endotoxinas liberadas se unen a las células inmunitarias (monocitos, macrófagos, granulocitos, linfocitos y células endoteliales y epiteliales) y desencadenan la producción de diversos mediadores solubles de la inflamación, como citocinas (por ejemplo, TNF-a, IL-1p e IL-6) y quimioquinas (por ejemplo, IL-8), que son una de las principales causas de las formas graves de sepsis.
En una realización particular de la invención, la afección inflamatoria es el SIRS (síndrome de respuesta inflamatoria sistémica). En otra realización particular, la afección inflamatoria es la sepsis. El SIRS se define como la presencia de dos o más de los siguientes factores: (1) temperatura superior a 38 °C o inferior a 36 °C; (2) frecuencia del pulso superior a 90 latidos/min; (3) frecuencia respiratoria superior a 20 respiraciones/min (o PCO2 inferior a 32 torr); y (4) recuento de glóbulos blancos superior a 12000/mm3 o inferior a 4000/mm3, o superior al 10% de granulocitos inmaduros.
En una realización particular, la sepsis es una sepsis polimicrobiana. La sepsis polimicrobiana se define como una infección sistémica compleja que implica la concurrencia de múltiples agentes infecciosos (por ejemplo, bacterianos y fúngicos; saprofitos y patógenos; aerobios y anaerobios, etc.).
En otra realización particular, la afección inflamatoria es una sepsis grave. La sepsis grave se define como la sepsis que va acompañada de una o más disfunciones orgánicas. La disfunción orgánica puede definirse como lesión pulmonar aguda; anomalías de la coagulación; trombocitopenia; alteración del estado mental; insuficiencia renal, hepática o cardíaca; o hipoperfusión con acidosis láctica.
En otra realización particular, la afección inflamatoria es un shock séptico. El shock séptico se define como la presencia de sepsis e hipotensión refractaria, es decir, presión sanguínea sistólica inferior a 90 mmHg, presión arterial media inferior a 65 mmHg, o una disminución de 40 mmHg en la presión sanguínea sistólica comparada con la basal que no responde a una administración de fluidos cristaloides de 20 a 40 ml/kg. Así pues, el shock séptico es efectivamente una forma de sepsis grave. Por último, el shock séptico puede ser inducido por endotoxinas.
El origen de la infección puede estar en cualquier lugar del cuerpo. Los focos habituales de infección que pueden dar lugar a sepsis son los siguientes: inflamación del apéndice (apendicitis), diverticulitis, problemas intestinales, infección de la cavidad abdominal (peritonitis) e infecciones de la vesícula biliar o el hígado; inflamación o infecciones del cerebro o de la médula espinal (meningitis, encefalitis); infecciones pulmonares tales como la neumonía; infecciones cutáneas por heridas o a través de aberturas practicadas con catéteres intravenosos, celulitis (inflamación del tejido conjuntivo de la piel); infecciones del tracto urinario, especialmente si el paciente tiene un catéter urinario para drenar la orina; exámenes o tratamientos dentales y ginecológicos; traumatismos contusos o penetrantes, cirugía y endocarditis.
La administración de una o más de las secuencias de aminoácidos, péptidos (o derivados de los mismos), combinación, composición, composición farmacéutica y/o el kit de partes de la presente invención, en cualquiera de sus variantes, a un mamífero, incluido un humano, y/o a un no-mamífero, como se ha descrito anteriormente, puede realizarse por vía intraperitoneal (i.p.) y/o intravenosa (i.v.).
En un aspecto descrito en el presente documento, una o más de las secuencias de aminoácidos, los péptidos (o derivados de los mismos), y la composición farmacéutica de la presente invención, en cualquiera de sus variantes, pueden administrarse a un mamífero, incluido un humano, y/o a un no-mamífero, como se ha descrito anteriormente, de la siguiente manera. Se administra una dosis única de una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos, preferentemente CD6.PD3, o un derivado de los mismos, (o una composición farmacéutica que comprende una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos, preferentemente CD6.PD3, o un derivado de los mismos, y vehículos farmacéuticamente aceptables, sales farmacéuticamente aceptables, adyuvantes y/o excipientes adecuados) lo antes posible, preferentemente i.v., opcionalmente durante el tratamiento antibiótico (preferiblemente Imipenem) (preferiblemente junto con un inhibidor enzimático como un inhibidor de la dehidropeptidasa o un inhibidor de la betalactamasa, preferiblemente Cilastatina, como se ha descrito anteriormente). La dosis óptima de péptido en ratones es de 3-15 mg/kg, preferiblemente de 6-12 mg/kg. Como comprenderá el experto, la dosis óptima del péptido para otros mamíferos, incluidos los seres humanos (y para los no-mamíferos), debe establecerse en ensayos clínicos.
En otro aspecto descrito en el presente documento, los componentes del kit de partes de la presente invención pueden administrarse como sigue. Se administra una dosis única de una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos, preferentemente CD6.PD3, o un derivado de los mismos (o una composición farmacéutica que comprende una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos, preferentemente CD6.PD3, o un derivado de los mismos, y vehículos farmacéuticamente aceptables, sales farmacéuticamente aceptables, adyuvantes y/o excipientes adecuados) lo antes posible, preferentemente i.v., y, posteriormente, se administra un antibiótico, preferiblemente Imipenem (o una composición farmacéutica que comprende un antibiótico, preferiblemente Imipenem y vehículos farmacéuticamente aceptables, sales farmacéuticamente aceptables, adyuvantes y/o excipientes adecuados) (preferiblemente junto con un inhibidor enzimático como un inhibidor de la dehidropeptidasa o un inhibidor de la beta-lactamasa, preferiblemente Cilastatina, como se ha descrito anteriormente) a un sujeto que lo necesite.
En otro aspecto descrito en el presente documento, los componentes del kit de partes de la presente invención pueden administrarse como sigue. En primer lugar, se administra un antibiótico, preferiblemente Imipenem (o una composición farmacéutica que comprende un antibiótico, preferiblemente Imipenem y vehículos farmacéuticamente aceptables, sales farmacéuticamente aceptables, adyuvantes y/o excipientes adecuados) (preferiblemente junto con un inhibidor enzimático como un inhibidor de dehidropeptidasa o un inhibidor de beta-lactamasa, preferiblemente Cilastatina, como se ha descrito anteriormente) a un sujeto que lo necesite. Posteriormente, se administra una dosis única de una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos, preferiblemente CD6.PD3, o un derivado de los mismos, (o una composición farmacéutica que comprende una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos, preferiblemente CD6.PD3, o un derivado de los mismos, y vehículos farmacéuticamente aceptables, sales farmacéuticamente aceptables, adyuvantes y/o excipientes adecuados), preferiblemente i.v.
Alternativamente, no sólo se administra una dosis única de una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos de la presente invención, o derivados de los mismos, como se ha descrito anteriormente, a un sujeto que lo necesite, sino que puede administrarse más de una dosis, como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más dosis a un sujeto que lo necesite. Como comprenderá el experto, pueden administrarse dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más dosis antes, durante o después de la administración de un antibiótico, preferentemente Imipenem (preferentemente junto con un inhibidor enzimático como un inhibidor de la dehidropeptidasa o un inhibidor de la beta-lactamasa, preferentemente Cilastatina). Además, una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos, o derivados de los mismos pueden no administrarse en dosis, sino como perfusión continua (preferentemente i.v.), ya sea antes, durante o después de la administración del antibiótico, preferentemente Imipenem (preferentemente junto con un inhibidor enzimático como un inhibidor de dehidropeptidasa o un inhibidor de beta-lactamasa, preferentemente Cilastatina).
Por supuesto, el sujeto que lo necesite puede estar bajo tratamiento con otros fármacos, como otros antibióticos, cuando se administren una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos (o derivados de los mismos), la combinación, la composición, la composición farmacéutica y/o los componentes del kit de partes de la presente invención, en cualquiera de sus variantes.
"Cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad del compuesto que es eficaz para tratar el trastorno o afección mencionados.
Los términos "tratamiento" o "terapia" engloban tanto los métodos profilácticos como curativos de tratar enfermedades, ya que ambos están dirigidos al mantenimiento o restablecimiento de la salud. Independientemente del origen de la noxa, malestar o incapacidad, su alivio, mediante la administración de un agente apropiado, debe interpretarse como terapia o uso terapéutico en el contexto de la presente solicitud.
Una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos (o derivados de los mismos), la composición farmacéutica y/o el kit de partes de la invención pueden así utilizarse en un método de tratamiento terapéutico (después de la manifestación clínica de la enfermedad) y/o profiláctico (antes de la manifestación clínica de la enfermedad).
Conjugado
En otra realización, la presente invención se refiere a un conjugado que comprende una o más de las secuencias de aminoácidos y/o péptidos de la presente invención. El conjugado es preferiblemente un conjugado en el que una o más de las secuencias de aminoácidos y/o péptidos de la invención están conjugados (preferiblemente unidos covalentemente) a un soporte, preferiblemente un polímero, tal como un polímero soluble o, preferiblemente, un polímero insoluble.
Un "conjugado péptido-soporte" o "conjugado" se define como una construcción híbrida que combina secuencias de aminoácidos y/o péptidos con un soporte. La unión con el soporte puede realizarse a través de los grupos NH2 o COOH de la secuencia de aminoácidos y/o del péptido o mediante cualquier otro grupo funcional de las cadenas laterales de los aminoácidos. El soporte puede ser un polímero soluble, o un polímero insoluble en el que la secuencia de aminoácidos y/o el péptido se inmovilizan en forma de material sólido o hidrogel.
Para conjugar (o fijar, o adherir, o ligar, o acoplar, o enlazar, preferentemente de forma covalente) una o más secuencias de aminoácidos o péptidos (o derivados de los mismos) al soporte, éste puede comprender preferentemente uno o más grupos funcionales con este fin. Ejemplos representativos de dichos grupos funcionales son los siguientes: grupo hidroxilo, grupo amino, grupo aldehído, grupo carboxilo, grupo tiol, un grupo silanol, un grupo amida, un grupo epoxi, un grupo halógeno, un grupo succinilimida y un grupo anhídrido de ácido.
En una realización preferida, el conjugado de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD3 (GQVEVHFRGVW, SEQ ID NO.: 3), o un derivado de la misma.
En otra realización, el conjugado de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD1 (GTVEVRLEASW, Se Q ID NO.: 1), o un derivado de la misma.
En otra realización, el conjugado de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD2 (GRVEMLEHGEW, SEQ ID NO.: 2), o un derivado de la misma.
En otra realización, el conjugado de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD2 (GRVEMLEHGEW, SEQ ID NO.: 2), o un derivado de la misma, y una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD1 (GTVEVRLEASW, SEQ ID NO.: 1), o un derivado de la misma.
En otra realización, el conjugado de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD3 (GQVEVHFRGVW, SEQ ID NO.: 3), o un derivado de la misma, y una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD1 (GTVEVRLEASW, SEQ ID NO.: 1), o un derivado de la misma.
En otra realización, el conjugado de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD3 (GQVEVHFRGVW, SEQ ID NO.: 3), o un derivado de la misma, y una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD2 (GRVEMLEHGEW, s Eq ID NO.: 2), o un derivado de la misma.
En otra realización, el conjugado de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD3 (GQVEVHFRGVW, SEQ ID NO.: 3), o un derivado de la misma, una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD2 (GRVEMLEHGEW, SEQ ID NO.: 2), o un derivado de la misma, y una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en CD6.PD1 (GTVEVRLEASW, SEQ ID NO.: 1), o un derivado de la misma.
En las realizaciones anteriores del conjugado de la presente invención, dichos derivados comprenden una o varias modificaciones de dicha secuencia de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en N-acilación y/o C-amidación o C-esterificación, N-alquilación, sustitución de uno o más L-aminoácidos por D-aminoácidos, conjugación con una biomolécula tal como polietilenglicol o albúmina, y bloqueo del extremo N- o C-terminal con residuos de Cys.
El conjugado de la presente invención puede comprender además una o más secuencias de aminoácidos que comprenden los péptidos CD6.PD1 (SEQ ID NO.: 1), CD6.PD2 (SEQ ID NO.: 2) y/o CD6.PD3 (SEQ ID NO.: 3). La secuencia de aminoácidos puede ser lineal o cíclica. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos está comprendida dentro del ectodominio de CD6 humano. En una realización preferida, la secuencia de aminoácidos está comprendida dentro de SEQ ID NO: 4. En una realización particular, la secuencia de aminoácidos lineal o cíclica comprende entre 12 y 17 aminoácidos adyacentes que comprenden los péptidos CD6.PD1 (SEQ ID NO.: 1), CD6.PD2 (SEQ ID NO.: 2) o CD6.PD3 (SEQ ID NO.: 3) y está comprendida preferiblemente dentro de SEQ ID NO.: 4. Ejemplos de secuencias de aminoácidos preferidas que pueden estar comprendidas en el dispositivo de la presente invención incluyen, pero no se limitan a: CSGTVEVRLEASWEPAC (SEQ ID NO.: 13), SGTVEVRLEASWEPA (SEQ ID NO.: 14), SGTVEVRLEASWEP (SEQ ID NO.: 15), SGTVEVRLEASWE (SEQ ID NO.: 16), SGTVEVRLEASW (SEQ ID NO.: 17), GTVEVRLEASWEPA (SEQ ID NO.: 18), GTVEVRLEASWEP (SEQ ID NO.: 19), GTVEVRLEASWE (SEQ ID NO.: 20), CAGRVEMLEHGEWGSVC (SEQ ID NO.: 21), AGRVEMLEHGEWGSV (SEQ ID NO.: 22), AGRVEMLEHGEWGS (SEQ ID NO.: 23), AGRVEMLEHGEWG (SEQ ID NO.: 24), AGRVEMLEHGEW (SEQ ID NO.: 25), GRVEMLEHGEWGSV (SEQ ID NO.: 26), GRVEMLEHGEWGS (SEQ ID NO.: 27), GRVEMLEHGEWG (SEQ ID NO.: 28), CEGQVEVHFRGVWNTVC (SEQ ID NO.: 29), EGQVEVHFRGVWNTV (SEQ ID NO.: 30), EGQVEVHFRGVWNT (SEQ ID NO.: 31), EGQVEVHFRGVWN (SEQ ID NO.: 32), EGQVEVHFRGVW (SEQ ID NO.: 33), GQVEVHFRGVWNTV (SEQ ID NO.: 34), GQVEVHFRGVWNT (SEQ ID NO.: 35), GQVEVHFRGVWN (SEQ ID NO.: 36).
Una o más de las secuencias de aminoácidos y/o péptidos de la presente invención comprendidos en el conjugado pueden conjugarse (preferiblemente unidos covalentemente) con un soporte. El soporte puede ser un soporte insoluble. El soporte insoluble puede ser un soporte sólido que puede comprender un soporte inorgánico insoluble como perlas de vidrio o gel de sílice; un polímero sintético como alcohol polivinílico reticulado, poliacrilato reticulado, polimetacrilato reticulado, poliacrilamida reticulada, policarbonato reticulado, polisulfona reticulada, poliéter sulfona reticulada o poliestireno reticulado, o un soporte orgánico que comprenda polisacáridos como celulosa cristalina, celulosa reticulada, agarosa reticulada o dextrano reticulado, o un soporte compuesto obtenido a partir de una combinación de los compuestos mencionados, como un soporte orgánico-orgánico y un soporte orgánico-inorgánico. El soporte sólido también puede ser un soporte metálico, como perlas magnéticas.
Preferiblemente, el soporte puede ser una matriz porosa que tiene un tamaño de partícula entre 50 y 300 |jm. Preferiblemente, el soporte sólido es Eupergit®, que son perlas macroporosas con un diámetro de 100-250 |jm, fabricadas por copolimerización de N,N'-metilen-bis-(metacrilamida), metacrilato de glicidilo, éter glicidílico de alilo y metacrilamida.
En una realización preferida, se obtiene un conjugado de perlas Eupergit® recubiertas de péptidos mediante el tratamiento de las perlas poliméricas con una solución de los péptidos de la invención en un tampón de pH. Preferentemente, las perlas poliméricas se incuban con los péptidos de la invención a temperatura ambiente en tampón fosfato sódico.
Una o más de las secuencias de aminoácidos y/o péptidos de la presente invención comprendidos en el conjugado pueden conjugarse (preferentemente unidos covalentemente) con un portador soluble, como la albúmina, o con un polímero soluble, como, por ejemplo, PEG, dextrano, ácidos polisiálicos, ácido hialurónico o hidroxietil-almidón.
El conjugado de la invención puede utilizarse como medicamento, preferentemente en un método de tratamiento terapéutico y/o preventivo, en un mamífero, incluido un humano, o en un no-mamífero, de una enfermedad infecciosa, o de una afección inflamatoria relacionada con una enfermedad infecciosa, o de una enfermedad inflamatoria relacionada con la presencia de un producto derivado de un agente infeccioso.
Dispositivo
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un dispositivo, preferiblemente un dispositivo médico, que puede denominarse también "adsorbente", que comprende una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos de la presente invención ("dispositivo de la presente invención").
El dispositivo de la presente invención es un dispositivo para la eliminación extracorpórea de al menos un componente químico de estructuras superficiales de bacterias Gram- y/o Gram+ tales como lipopolisacárido (LPS), ácido lipoteicoico (LTA) y/o peptidoglicano (PGN) de un fluido corporal de un animal, tal como un mamífero, preferiblemente humano, preferiblemente en el que dicho fluido corporal es sangre, plasma, suero u otras fracciones sanguíneas adecuadas, en el que el dispositivo comprende un soporte sólido, y comprende una o más de una secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, que consiste en las siguientes secuencias, o un derivado de las mismas, en el que dicho derivado comprende una o varias modificaciones de dicha secuencia de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en N-acilación y/o C-amidación o C-esterificación, N-alquilación, sustitución de uno o más L-aminoácidos por D-aminoácidos, conjugación con una biomolécula tal como polietilenglicol o albúmina, y bloqueo del extremo N- o C-terminal con residuos de Cys:
CD6.PD1: GTVEVRLEASW (SEQ ID NO.: 1);
CD6.PD2: GRVEMLEHGEW (SEQ ID NO.: 2); y/o
CD6.PD3: GQVEVHFRGVW (SEQ ID NO.: 3).
Además, el dispositivo de la presente invención puede comprender una o más secuencias de aminoácidos que comprenden los péptidos CD6.PD1 (SEQ ID NO.: 1), CD6.PD2 (SEQ ID NO.: 2) y/o CD6.PD3 (SEQ ID NO.: 3). La secuencia de aminoácidos puede ser lineal o cíclica. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos está comprendida dentro del ectodominio de CD6 humano. En una realización preferida, la secuencia de aminoácidos está comprendida dentro de SEQ ID NO: 4. En una realización particular, la secuencia de aminoácidos lineal o cíclica comprende entre 12 y 17 aminoácidos adyacentes que comprenden los péptidos CD6.PD1 (SEQ ID NO.: 1), CD6.PD2 (SEQ ID NO.: 2) o CD6.PD3 (SEQ ID NO.: 3) y preferiblemente está comprendida dentro de SEQ ID NO.: 4. Ejemplos de secuencias de aminoácidos preferidas que pueden estar comprendidas en el dispositivo de la presente invención incluyen, pero no se limitan a: CSGTVEVRLEASWEPAC (SEQ ID NO.: 13), SGTVEVRLEASWEPA (SEQ ID NO.: 14), SGTVEVRLEASWEP (SEQ ID NO.: 15), SGTVEVRLEASWE (SEQ ID NO.: 16), SGTVEVRLEASW (SEQ ID NO.: 17), GTVEVRLEASWEPA (SEQ ID NO.: 18), GTVEVRLEASWEP (SEQ ID NO.: 19), GTVEVRLEASWE (SEQ ID NO.: 20), CAGRVEMLEHGEWGSVC (SEQ ID NO.: 21), AGRVEMLEHGEWGSV (SEQ ID NO.: 22), AGRVEMLEHGEWGS (SEQ ID NO.: 23), AGRVEMLEHGEWG (SEQ ID NO.: 24), AGRVEMLEHGEW (SEQ ID NO.: 25), GRVEMLEHGEWGSV (SEQ ID NO.: 26), GRVEMLEHGEWGS (SEQ ID NO.: 27), GRVEMLEHGEWG (SEQ ID NO.: 28), CEGQVEVHFRGVWNTVC (SEQ ID NO.: 29), EGQVEVHFRGVWNTV (SEQ ID NO.: 30), EGQVEVHFRGVWNT (SEQ ID NO.: 31), EGQVEVHFRGVWN (SEQ ID NO.: 32), EGQVEVHFRGVW (SEQ ID NO.: 33), GQVEVHFRGVWNTV (SEQ ID NO.: 34), GQVEVHFRGVWNT (SEQ ID NO.: 35), GQVEVHFRGVWN (SEQ ID NO.: 36).
Preferentemente, el dispositivo de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en GTVEVRLEASW (CD6.PD1, s Eq ID NO.: 1), o un derivado de la misma.
Por ejemplo, el dispositivo de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en GRVEMLEHGEW (CD6.PD2, SEQ ID NO.: 2), o un derivado de la misma.
Por ejemplo, el dispositivo de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en GQVEVHFRGVW (CD6.PD3, SEQ ID NO.: 3), o un derivado de la misma.
En una realización preferida, el dispositivo de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en GTVEVRLEASW (CD6.PD1, SEQ ID NO.: 1), o un derivado de la misma, y la secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en GRVEMLEHGEW (CD6.PD2, SEQ ID NO.: 2), o un derivado de la misma.
En otra realización, el dispositivo de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en GTVEVRLEASW (CD6.PD1, SEQ ID NO.: 1), o un derivado de la misma, y la secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en GQVEVHFRGVW (CD6.PD3, SEQ ID NO.: 3), o un derivado de la misma.
En otra realización, el dispositivo de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en GRVEMLEHGEW (CD6.PD2, SEQ ID NO.: 2), o un derivado de la misma, y la secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en GQVEVHFRGVW (CD6.PD3, SEQ ID NO.: 3), o un derivado de la misma.
En otra realización preferida, el dispositivo de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en GRVEMLEHGEW (CD6.PD2, Se Q ID NO.2), o un derivado de la misma, la secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en GTVEVRLEASW (CD6.PD1, SEQ ID NO.: 1), o un derivado de la misma, y la secuencia de aminoácidos que comprende o, alternativamente, consiste en GQVEVHFRGVW (CD6.PD3, SEQ ID NO.: 3), o un derivado de la misma.
En las realizaciones anteriores del dispositivo de la presente invención, dicho derivado comprende una o varias modificaciones de dicha secuencia de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en N-acilación y/o C-amidación o C-esterificación, N-alquilación, sustitución de uno o más L-aminoácidos por D-aminoácidos, conjugación con una biomolécula tal como polietilenglicol o albúmina, y bloqueo del extremo N- o C-terminal con residuos de Cys.
El dispositivo de la presente invención puede comprender un conjugado que comprende una o más de las secuencias de aminoácidos y/o péptidos de la presente invención. El conjugado es preferiblemente un conjugado en el que una o más de las secuencias de aminoácidos y/o péptidos de la invención están conjugados (preferiblemente unidos covalentemente) a un soporte, preferiblemente un polímero, preferiblemente un polímero insoluble.
El dispositivo es adecuado para unir y separar selectivamente al menos un componente de una solución acuosa, preferiblemente un fluido corporal como sangre, suero plasmático u otras fracciones sanguíneas adecuadas. La solución acuosa comprende potencialmente al menos un componente que se une selectivamente y es separado por el dispositivo de la invención. Por ejemplo, el al menos un componente potencialmente comprendido en la solución acuosa (que es preferiblemente un fluido corporal como sangre, suero plasmático u otras fracciones sanguíneas adecuadas) es uno o más componentes químicos de estructuras superficiales de bacterias Gram- y/o Gram+, como una endotoxina, como LPS, LTA y/o PGN.
Los componentes químicos importantes de las estructuras superficiales de las bacterias son los siguientes (de Medical Microbiology, 4a edición, Baron S, editor; Galveston (TX): University of Texas Medical Branch at Galveston; 1996):
- Peptidoglicanos de la pared celular (PGN): Tanto las bacterias G+ como las G- poseen peptidoglicanos en la pared celular, que confieren a la célula su forma característica y le proporcionan protección mecánica. Los peptidoglicanos son exclusivos de los organismos procariotas y están formados por una columna vertebral glicana de ácido murámico y glucosamina (ambos N-acetilados), y cadenas peptídicas altamente reticuladas con puentes en las bacterias G+ (por ejemplo, Staphylococcus aureus) o parcialmente reticuladas en las bacterias G-(por ejemplo, Escherichia coli). Las enzimas transpeptidasas reticulantes son algunas de las dianas de los antibióticos p-lactámicos.
- Ácidos teicoicos (AT): Los ácidos teicoicos son polímeros de poliol fosfato con una fuerte carga negativa. Están unidos covalentemente al peptidoglicano en algunas bacterias G+. Son fuertemente antigénicos, pero generalmente están ausentes en las bacterias G-.
• Ácidos lipoteicoicos (LTA): Los ácidos lipoteicoicos como ácidos teicoicos de membrana son polímeros de glicofosfatos anfifílicos con el glicolípido lipofílico y anclados en la membrana citoplasmática. Son antigénicos, citotóxicos y adhesinas (por ejemplo, Streptococcus pyogenes).
- Lipopolisacáridos (LPS): Uno de los principales componentes de la membrana externa de las bacterias G- es el lipopolisacárido (endotoxina), una molécula compleja formada por un anclaje lipídico A, un núcleo polisacárido y cadenas de carbohidratos. Los azúcares de las cadenas de polisacáridos confieren especificidad serológica.
- Formas sin pared: Dos grupos de bacterias desprovistas de peptidoglicanos en la pared celular son las especies de Mycoplasma, que poseen una estructura de membrana superficial, y las formas L que surgen de células bacterianas G+ o G- que han perdido su capacidad de producir las estructuras de peptidoglicanos.
Preferiblemente, el dispositivo médico de la presente invención es un dispositivo médico de hemoadsorción, como un dispositivo médico para la eliminación extracorpórea de uno o más componentes químicos de estructuras superficiales de bacterias G- y/o G+, tal como una endotoxina (por ejemplo, LPS, LTA y/o PGN) durante la hemoperfusión.
Una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos, o derivados de los mismos, de la presente invención que están comprendidos en el dispositivo de la presente invención, como se describe a continuación, pueden fijarse sobre un soporte sólido. El soporte sólido puede ser un soporte inorgánico insoluble en agua, como perlas de vidrio o gel de sílice; un polímero sintético como alcohol polivinílico reticulado, poliacrilato reticulado, polimetacrilato reticulado, poliacrilamida reticulada, policarbonato reticulado, polisulfona reticulada, poliéter sulfona reticulada o poliestireno reticulado, o un soporte orgánico que comprenda polisacáridos como celulosa cristalina, celulosa reticulada, agarosa reticulada o dextrano reticulado, o un soporte compuesto obtenido a partir de una combinación de los compuestos mencionados, como un soporte orgánico-orgánico y un soporte orgánico-inorgánico. El soporte sólido también puede ser un soporte metálico, como perlas magnéticas.
El soporte sólido puede ser una matriz porosa en forma granular, en forma de perlas, fibras, membranas de fibras, películas o como gel.
El soporte sólido puede ser una matriz porosa que tiene un tamaño de partícula entre 50 y 300 μm. Preferiblemente, el soporte sólido es Eupergit®, que son perlas macroporosas con un diámetro de 100-250 μm, fabricadas por copolimerización de N,N-metilen-bis-(metacrilamida), metacrilato de glicidilo, éter glicidílico de alilo y metacrilamida.
Para fijar (o adherir, o ligar, o acoplar) una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos (o derivados de los mismos) al soporte sólido, éste puede comprender preferentemente uno o más grupos funcionales a tal fin. Ejemplos representativos de dichos grupos funcionales son los siguientes: grupo hidroxilo, grupo amino, grupo aldehído, grupo carboxilo, grupo tiol, un grupo silanol, un grupo amida, un grupo epoxi, un grupo halógeno, un grupo succinilimida y un grupo anhídrido de ácido.
El dispositivo médico de la presente invención es capaz de unir y separar eficazmente al menos un componente de una solución acuosa que potencialmente comprende al menos dicho componente. Por ejemplo, el dispositivo de la presente invención es capaz de capturar componentes químicos de estructuras superficiales de bacterias (G+ y/o G-), como endotoxinas, tales como LPS, LTA y/o PGN, ya que las toxinas se unirían a una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos (o derivados de los mismos) de la presente invención fijados en el soporte sólido del dispositivo. Preferentemente, el dispositivo de la presente invención es capaz de capturar uno o más componentes químicos de estructuras superficiales de bacterias G- y/o G+, tales como endotoxinas tales como LPS, LTA y/o PGN potencialmente presentes en una solución acuosa seleccionada a partir de agua, sangre entera o un fluido corporal tal como plasma, suero u otras fracciones sanguíneas adecuadas. Esto se consigue haciendo pasar una solución acuosa como agua, sangre u otros fluidos corporales a través del dispositivo. Cuando se utiliza clínicamente, el dispositivo puede aplicarse preferentemente de forma extracorpórea.
En un aspecto, se describe en el presente documento un método para la eliminación, preferentemente extracorpórea, de al menos un componente, preferentemente uno o más componentes químicos de estructuras superficiales de bacterias G- y/o G+, tales como endotoxinas, tales como LPS, LTA y/o PGN, de una solución acuosa que comprende potencialmente al menos dicho componente, preferiblemente fluidos corporales de un animal, tal como un mamífero y/o un no mamífero, como se ha descrito anteriormente, preferiblemente un mamífero, incluyendo un ser humano, tal como sangre, plasma, suero u otras fracciones sanguíneas adecuadas, dicho método comprende:
- proporcionar una solución acuosa, preferentemente fluidos corporales de un animal, como un mamífero y/o un no mamífero, preferentemente un mamífero, incluido un ser humano, como sangre, plasma, suero u otras fracciones sanguíneas adecuadas, que comprenda potencialmente al menos dicho componente,
- hacer pasar la solución acuosa, preferentemente fluidos corporales de un animal, como un mamífero y/o un no mamífero, preferentemente un mamífero, incluido un ser humano, como sangre, plasma, suero u otras fracciones sanguíneas adecuadas a través del dispositivo médico de la presente invención en condiciones que efectúen la unión de al menos dicho componente, preferentemente uno o más componentes químicos de estructuras superficiales de bacterias G- y/o G+, como endotoxinas, tales como LPS, LTA y/o PGN a una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos, o derivados de los mismos, fijados en el soporte sólido del dispositivo médico, eliminando así al menos dicho componente de la solución acuosa.
En consecuencia, el dispositivo de la presente invención puede utilizarse en un método para la eliminación, preferentemente extracorpórea, de al menos un componente, preferentemente al menos un componente químico de estructuras superficiales de bacterias G- y/o G+, tales como endotoxinas, tales como LPS, LTA y/o PGN de una solución acuosa, preferentemente fluidos corporales de un animal, tal como un mamífero y/o un no mamífero, preferentemente un mamífero, incluido un ser humano, tales como sangre, plasma, suero u otras fracciones sanguíneas adecuadas, tal como se describe a continuación.
Por ejemplo, el mamífero puede ser un roedor (como un ratón o una rata), un primate (como un simio, un mono o un lémur), un perro, un gato, un conejo y un ungulado como ganado vacuno, caballos o cerdos. En una realización preferida, el mamífero es un ser humano. Por ejemplo, el no-mamífero puede ser un pollo, un pato, un ganso, un avestruz, una paloma, un pavo, etc.).
El dispositivo de la invención puede así utilizarse como medicamento, preferentemente en un método de tratamiento terapéutico y/o preventivo, en un mamífero, incluido un humano, o en un no-mamífero, de una enfermedad infecciosa, o de una afección inflamatoria relacionada con una enfermedad infecciosa, o de una enfermedad inflamatoria relacionada con la presencia de un producto derivado de un agente infeccioso.
En otro aspecto, se describe en el presente documento un método de tratamiento terapéutico y/o preventivo de una enfermedad infecciosa, o de una afección inflamatoria relacionada con una enfermedad infecciosa, o de una enfermedad inflamatoria relacionada con la presencia de un producto derivado de un agente infeccioso para la eliminación extracorpórea de al menos un componente, preferiblemente uno o más componentes químicos de estructuras superficiales de bacterias G- y/o G+, tales como endotoxinas, tales como LPS, LTA y/o PGN de una solución acuosa, preferiblemente fluidos corporales de un animal, preferiblemente un mamífero, incluyendo un ser humano, o en un no-mamífero, tales como sangre, plasma, suero u otras fracciones sanguíneas adecuadas.
El método de tratamiento terapéutico y/o preventivo comprende hacer pasar la solución acuosa que comprende potencialmente al menos un componente, preferentemente fluidos corporales de un animal, preferentemente un mamífero, incluido un ser humano, o en un no mamífero, tales como sangre, plasma, suero u otras fracciones sanguíneas adecuadas a través del dispositivo médico de la presente invención en condiciones que efectúen la unión de al menos dicho componente, preferentemente uno o más componentes químicos de estructuras superficiales de bacterias G- y/o G+, como endotoxinas, tales como LPS, LTA y/o pGn , a una o más de las secuencias de aminoácidos o péptidos, o derivados de los mismos, fijados en el soporte sólido del dispositivo médico, eliminando así al menos dicho componente de la solución acuosa.
En una realización particular, la enfermedad infecciosa es una infección microbiana. En realizaciones más particulares, la infección microbiana se selecciona del grupo que consiste en una infección bacteriana (ya sean bacterias G+ o G-, saprofitas o patógenas, aerobias o anaerobias), una infección fúngica, una infección vírica, una infección parasitaria y combinaciones de las mismas (infección polimicrobiana).
En otra realización particular, la enfermedad infecciosa es una septicemia. Tal como se utiliza aquí, el término "septicemia" se refiere a la presencia de cualquier microbio en el torrente sanguíneo. En particular, la septicemia se selecciona del grupo que consiste en una bacteriemia, una fungemia, una viremia, una parasitemia y combinaciones de las mismas. En otra realización particular, la afección inflamatoria es una sepsis grave. En una realización particular, la sepsis es una sepsis polimicrobiana. En una realización particular de la invención, la afección inflamatoria es SIRS (síndrome de respuesta inflamatoria sistémica). En otra realización particular, la afección inflamatoria es sepsis. En otra realización particular, la afección inflamatoria es un shock séptico. Por último, el shock séptico puede ser un shock séptico inducido por endotoxina.
Los términos "tratamiento" o "terapia" engloban tanto los métodos profilácticos como curativos de tratar enfermedades, ya que ambos están dirigidos al mantenimiento o restablecimiento de la salud. Independientemente del origen de la noxa, malestar o incapacidad, su alivio, mediante la administración de un agente apropiado, debe interpretarse como terapia o uso terapéutico en el contexto de la presente solicitud.
Durante la descripción de las reivindicaciones, la palabra "que comprende" y sus variantes no pretende excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Además, el término "que comprende" también puede englobar el término "que consiste en".
Tal como se utiliza aquí, el término "aproximadamente" significa el valor indicado ± 1% de su valor, o el término "aproximadamente" significa el valor indicado ± 2% de su valor, o el término "aproximadamente" significa el valor indicado ± 5% de su valor, el término "aproximadamente" significa el valor indicado ± 10% de su valor, o el término "aproximadamente" significa el valor indicado ± 20% de su valor, o el término "aproximadamente" significa el valor indicado ± 30% de su valor; preferentemente, el término "aproximadamente" significa exactamente el valor indicado (± 0%).
A menos que se especifique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la materia a la que pertenece esta invención. En la práctica de la presente invención pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos. Objetos adicionales, ventajas y características de la invención se harán evidentes a los expertos en la materia tras el examen de la descripción o pueden ser aprendidos por la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a título ilustrativo y no pretenden ser limitativos de la presente invención.
EJEMPLOS
Materiales y métodos
Producción y purificación de proteínas y péptidos recombinantes
Las proteínas rshCD6 y rshCD5 se purificaron siguiendo los métodos descritos (Sarrias MR, et al., 2004, Biochemical characterization of recombinant and circulating human Sp alpha. Tissue Antigens 63:335-44; Sarrias MR, et al., 2007, CD6 binds to pathogen-associated molecular patterns and protects from LPS-induced septic shock. Proc Natl Acad Sci USA 104:11724-9) utilizando clones SURE CHO-M Cell line™ (Selexis SUREtechnology Platform™, Ginebra, Suiza) y protocolos de cromatografía de exclusión por tamaño desarrollados en PX'Therapeutics (Grenoble, Francia). La seroalbúmina humana y bovina (HAS y BSA, respectivamente) se adquirieron a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Péptidos (CD6.PD1, GTVEVRLEASW (SEQ ID NO.: 1); CD6.PD2, GRVEMLEHGEW (SEQ ID NO.: 2) y CD6.PD3, GQVEVHFRGVW (SEQ ID NO.: 3); CD5.PD1, GQLEVYLKDGW (SEQ ID NO: 6); CD5.PD2, GVVEFYSGSLG (SEQ ID NO: 7); DMBT-1.pbs1, GRVEVLYRGSW (SEQ ID NO.: 8); y el péptido CD6 Pcons (también denominado "Pcon", "CD6 con", "CD6.con", "CD6 cons", "PCons" o "CD6.cons", Gr VEVLFRGSW (SEQ ID NO.: 9) (>80% de pureza) fueron fabricados por Solid Phase Peptide Synthesis by ProteoGenix (Shiltigheim, Francia), y almacenados a 5 mg/mL con acetonitrilo diluido (1:3).
Ensayos de aglutinación bacteriana
5 x 108 unidades formadoras de colonias (UFC)/mL diluidas en tampón TTC (50 mM Tris pH 7,5 más 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20 y 1 mM Ca2+) se mezclaron (1:1) con diferentes concentraciones de péptidos (0-200 μg/mL) en placas de microtitulación de 96 pocillos con fondo en U (Biofil) (Bikker FJ, et al., 2002, Identification of the bacteria-binding peptide domain on salivary agglutinin (gp-340/DMBT1), a member of the scavenger receptor cysteine-rich superfamily, J Biol Chem 277:32109-15). Tras una incubación nocturna a 37 °C, dos observadores independientes examinaron la aglutinación bacteriana mediante microscopía óptica y la puntuaron de -(ausente) a ++ (máxima).
Cepas bacterianas
Los aislados clínicos Acinetobacter baumanii multirresistente, Enterobacer cloacae ATCC 23355, Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Listeria monocytogenes ATCC 19111, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphyloccocus aureus ATCC 25923 y Staphylococus aureus resistente a meticilina (MRSA) fueron proporcionados por el Dr. Jordi Vila (Servicio de Microbiología del Hospital Clínico de Barcelona). Jordi Vila (Departamento de Microbiología, Hospital Clínic de Barcelona) y se cultivaron en Luria Bertoni o agar con un 5% de sangre de oveja (Becton Dikinson) a 37 °C, excepto L. monocytogenes que se cultivó en medio de infusión Brain Heart (Pronadisa).
Ensayos de unión
Experimentos de fluorescencia intrínseca. Para explorar la capacidad de diferentes péptidos/proteínas para unirse a LTA (Mr = 14.000, de S. aureus) y LPS rugoso (Re-LPS, Mr = 2500, de Salmonella minnesota serotipo Re 595), se llevaron a cabo estudios de unión en un espectrofluorímetro AB2 con un soporte de cubetas termostatizado (+ 0,1 °C), utilizando cubetas de cuarzo de 5x5 mm de longitud de paso, tal como se describe (Coya JM, et al., 2015, Natural Anti-Inffective Pulmonary Proteins: In Vivo Cooperative Action of Surfactant Protein SP-A and the Lung Antimicrobial Peptide SP-BN, J Immunol 195:1628-36). La concentración de Re-LPS se evaluó mediante la cuantificación del ácido 2-keto-3-deoxioctulosónico (García-Verdugo I, et al., 2003, Effect of hydroxylation and N187-linked glycosylation on molecular and functional properties of recombinant human surfactant protein A, Biochemistry 42:9532-42). Se valoraron muestras de péptido/proteína (10|i g/mL) con diferentes cantidades de una solución madre de LTA o Re-LPS en solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,2, y se registraron los espectros de emisión de fluorescencia Trp con excitación a 295 nm. Las lecturas de intensidad de fluorescencia se corrigieron para tener en cuenta la dilución causada por la adición de péptido/proteína. Las intensidades de fondo en muestras sin péptidos/proteínas debidas a LTA o Re-PS se restaron de cada registro. La constante de disociación aparente (Kd ) de los complejos péptido/proteína-ligando se obtuvo mediante el ajuste no lineal por mínimos cuadrados a la ecuación de Hill del cambio en la fluorescencia del péptido a 353 nm con la cantidad de LTA o Re-LPS añadida (García-Verdugo I, et al., 2003, Effect of hydroxylation and N187-linked glycosylation on molecular and functional properties of recombinant human surfactant protein A, Biochemistry 42:9532-42): AF/AFmax = [L]n /([L]n Kd), dondeAF es el cambio en la intensidad de fluorescencia a 353 nm en relación con la intensidad del péptido libre; FAmax es el cambio en la intensidad de fluorescencia a concentraciones saturantes de LTA o Re-LPS; [L] es la concentración molar de ligando libre; y n es el coeficiente de Hill.
Ensayos de unión en fase sólida. Se recubrieron placas microtiter de 96 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) durante una noche a 4 °C con 5 μg/mL de LPS purificado (E. coli O111:B4, Sigma L2630) o LTA (S. aureus, Sigma L2515) en PBS, y luego se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente en solución de bloqueo (20 mM Tris-HCl pH 7,4 más 0,05% de Tween 20 y 1% de BSA). Se añadieron péptidos/proteínas marcados con biotina (2,5-20 μg/mL) y se incubaron toda la noche a 4 °C en solución de bloqueo. Tras un lavado exhaustivo, los péptidos/proteínas unidos se detectaron mediante la adición de estreptavidina marcada con peroxidasa de rábano (h Rp ) (dilución 1:5.000; DAKO) durante 1 h a temperatura ambiente. El color se desarrolló añadiendo sustrato líquido de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) (Sigma), y la densidad óptica se determinó a 405-620 nm.
Dispersión dinámica de la luz (DLS)
Los diámetros hidrodinámicos de los péptidos (10 μg/mL en PBS) se midieron a 25 °C en un Zetasizer Nano S de Malvern Instruments (Worcestershire, Reino Unido) equipado con un láser HeNe de 633 nm, tal como se describe (Sáenz A, et al., 2010, Fluidizing effects of C-reactive prntein on lung surfactant membranes: prntective role of surfactant protein A, FASEB J 24:3662-73). Se registraron cuatro barridos para cada muestra y las muestras se analizaron por triplicado.
Cultivos celulares in vitro
Los bazos de ratones C57BL/6 de 6-8 semanas de edad (Charles River) se disgregaron filtrándolos a través de un colador celular y, tras la lisis eritrocitaria, las células se resuspendieron en RPMI 1640 con L-glutamina (Lonza) más 10 % de suero fetal de ternera (BioWest), 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina y 50 μM de 2-p Mercaptoetanol (Merck). Las células (2x105) fueron estimuladas durante 48 h (a 37 °C en una atmósfera humidificada con un 5 % de CO2) en placas de 96 pocillos con fondo en U (Biofil) que contenían LPS (0,5 μg/mL; E. coli O111:B4), en presencia o ausencia de péptidos crecientes (0,5-20 μg/mL). Se recogieron los sobrenadantes de los cultivos y se midieron las citocinas de ratón mediante ELISA siguiendo las instrucciones del fabricante (BD Biosciences OptEIA sets).
Procedimiento de ligadura y punción cecal (CLP)
Los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal de la Universidad de Barcelona. Se indujo un choque séptico de alto grado de mortalidad (>90% de mortalidad en las primeras 48-72 h) inducido por CLP en ratones machos C57BL/6J de 8-10 semanas de edad (20-25 g; Charles River) como se informó anteriormente (Martínez-Florensa M, et al., 2017, Protective Effects of Human and Mouse Soluble Scavenger-Like CD6 Lymphocyte Receptor in a Lethal Model of Polymicrobial Sepsis, Antimicrob Agents Chemother 61:e01391-16).
Para evaluar la carga bacteriana, se recogieron muestras de sangre y bazo de ratones tratados con CLP, se homogeneizaron y se diluyeron asépticamente en PBS estéril. Se sembraron diluciones seriadas durante la noche en agar con un 5% de sangre de oveja (Becton Dickinson) a 37 °C. Los recuentos de bacterias viables se expresaron como UFC/mL (sangre) o por mg (bazo).
Inmovilización de proteínas/péptidos en perlas Eupergit
Las proteínas o los péptidos (2,5 mg cada uno) se inmovilizaron mediante grupos NH2 en perlas acrílicas macroporosas EUPERGIT® (0,2 g; Rohm-Pharma GmbH, Alemania) siguiendo un protocolo descrito previamente (Zimmermann M, et al., 1999, Endotoxin adsorbent based on immobilized human serum albumin. Clin Chem Lab Med 37:373-379). Las perlas Eupergit® recubiertas de péptidos o proteínas se obtienen incubando con agitación las perlas poliméricas a temperatura ambiente con una solución de los péptidos en tampón fosfato sódico 100mM pH 8 durante 24 horas. Tras la incubación, las perlas se lavaron 3 veces con cloruro sódico 3 M pH 7,0, tampón fosfato sódico 30 mM pH 4,0 y tampón fosfato sódico 30 mM pH 8,0. Por último, se añadió una solución de cloruro sódico 154 mM pH 7,0 a las perlas recubiertas de péptidos o proteínas.
Ensayo de endotoxinas
La detección de LPS se realizó utilizando el kit turbidimétrico-cinético Limulus Amebocyte Lysate (LAL)-QCL (50-650U, Lonza) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las perlas EUPERGIT® recubiertas de proteína/péptido se incubaron 1:1 (v:v) con la solución de endotoxina suministrada (50 UI/mL) durante diferentes periodos de tiempo (0­ 150 min) a temperatura ambiente siguiendo las instrucciones del fabricante.
Análisis estadístico
Los ensayos de supervivencia se analizaron mediante una prueba Log-Rankx2 utilizando el software GraphPad Prism. La significancia de las diferencias entre grupos experimentales se determinó mediante la prueba T pareada de 2 colas con intervalos de confianza (IC) del 95%. Los valores P se consideraron significativos cuando P<0,05. El análisis estadístico (media ± SEM) se realizó mediante una prueba de Mann-Whitney de 2 colas, con un IC del 95%.
Resultados
Ejemplo 1. Pruebas in vitro e in vivo que respaldan las propiedades de unión bacteriana de amplio espectro de los péptidos derivados de CD6.
Inducción de la aglutinación bacteriana por péptidos derivados de CD6
La secuencia y las propiedades fisicoquímicas de los péptidos derivados de CD6 estudiados que mapean los dominios SRCR 1 a 3 (CD6.PD1, CD6.PD2 y CD6.PD3, respectivamente), así como de los demás péptidos (CD6.cons, DMBT1.pbs1, CD5.PD1 y CD5.PD2) y proteínas (rshCD6
(DQLNTSSAESELWEPGERLPVRLTNGSSSCSGTVEVRLEASWEPACGALWDSRAAEAVCRALGCGGAEAASQLAP PTPELPPPPAAGNTSVAANATLAGAPALLCSGAEWRLCEVVEHACRSDGRRARVTCAENRALRLVDGGGACAGRVE MLEHGEWGSVCDDTWDLEDAHVVCRQLGCGWAVQALPGLHFTPGRGPIHRDQVNCSGAEAYLWDCPGLPGQHY CGHKEDAGAVCSEHQSWRLTGGADRCEGQVEVHFRGVWNTVCDSEWYPSEAKVLCQSLGCGTAVERPKGLPHSL SGRMYYSCNGEELTLSNCSWRFNNSNLCSQSLAARVLCSASRSLHNLSTPEVPASVQTVTIESSVTVKIENKESR, SEQ ID NO.: 10) y rshCD5 (RLTRSNSKCQGQLEVYLKDGWHMVCSQSWGRSSKQWEDPSQASKVCQRLNCGVPLSLGPFLVTYTPQSSIICYGQ LGSFSNCSHSRNDMCHSLGLTCLEPQKTTPPTTRPPPTTTPEPTAPPRLQLVAQSGGQHCAGVVEFYSGSLGGTISY EAQDKTQDLENFLCNNLQCGSFLKHLPETEAGRAQDPGEPREHQPLPIQWKIQNSSCTSLEHCFRKIKPQKSGRVLA LLCSGFQPKVQSRLVGGSSICEGTVEVRQGAQWAALCDSSSARSSLRWEEVCREQQCGSVNSYRVLDAGDPTSRG LFCPHQKLSQCHELWERNSYCKKVFVTCQD, SEQ ID NO.11))
utilizadas en este estudio se recopilan en la Figura 1A. Los análisis estructurales in silico representados en la Figura 1B, mostraron que todos los péptidos CD6 son accesibles en la superficie de CD6, estando CD6.PD1 (y CD6.PD3) expuestos en lados opuestos al de CD6.PD2. Como se ilustra en la Figura 1C, la conservación de aminoácidos de los péptidos derivados de CD6 entre diferentes especies animales es relativamente alta para CD6.PD2 y CD6.PD3, y menor para CD6.PD1.
Ninguno de los péptidos derivados de la CD6 coincidía plenamente con el motivo consenso mínimo de 9-mer(VEVLxxxxW) previamente descrito para la proteína DMBT-1/SAG. La funcionalidad de los péptidos derivados de CD6 se exploró en ensayos de aglutinación bacteriana, en los que se utilizaron como controles positivos los péptidos DMBT1.pbs1 (también denominado DMBT-1.pbs1, o pbs1) y CD6.cons (también denominado CD6 cons, o PCons) (Bikker FJ, et al., 2004, Bacteria binding by DMBT1/SAG/gp-340 is confined to the VEVLXXXXWmotif in its scavenger receptor cysteine-rich domains, J Biol Chem 279:47699-703). Se utilizó como control negativo una secuencia peptídica análoga (CD5.PD2) presente en el segundo dominio SRCR de CD5 -un receptor linfocitario altamente homólogo para el que no se han descrito propiedades de unión bacteriana-. Como ilustran las Figuras 2A y 2B, se observó una aglutinación dependiente de la dosis de diferentes suspensiones bacterianas G+ y G-(incluidas cepas MDR) para CD6.PD1 y CD6.PD3, pero no para CD6.PD2.
Los péptidos derivados de CD6 interactúan directamente con los PAMP constitutivos de bacterias G- y G+ con afinidades diferentes
La unión de péptidos derivados de CD6 marcados con biotina a una fase sólida adsorbida con LPS o LTA se comprobó mediante ELISA. Como muestran las Figuras 3A y 3B, todos los péptidos derivados de CD6 mostraron una unión dosis-dependiente a LPS y LTA, similar a los péptidos DMBT1.pbs1 y CD6.cons utilizados como controles positivos. Sin embargo, el péptido CD6.PD3 sobresalió en su capacidad de unirse tanto al LPS inmovilizado como al LTA en comparación con los demás péptidos ensayados. Como era de esperar, no se observó ninguna unión significativa para el péptido CD5.PD1. Estos resultados confirman que los péptidos derivados de CD6 conservan propiedades de unión a LPS y LTA.
Para validar y medir aún más la unión, se determinaron las afinidades subyacentes para la interacción de péptidos derivados de CD6 (CD6.PD1, CD6.PD2 y CD6.PD3) con LPS y LTA, y los correspondientes valores de Kd mediante emisión de fluorescencia de triptófano. También se incluyeron en este experimento las secuencias consenso DMBT1.pbs1 y CD6.Pcons descritas por Bikker FJ, et al., 2004 (Bacteria binding by DMBT1/SAG/gp-340 is confined to the VEVLXXXXW motif in its scavenger receptor cysteine-rich domains, J Biol Chem 279:47699-703) (también denominadas Pcons o Pcon, SEQ ID No.: 9, GRVEVLFRGSW). Como se resume en la Figura 4, todos los péptidos derivados de CD6 mostraron afinidades elevadas tanto para LPS como para LTA, siendo mayores para CD6.PD1 y/o CD6.PD2 en comparación con CD6.PD3 (PD1 > PD2 > PD3). Los valores de Kd para c D6.PD1 y CD6.PD2 son inferiores a los de los péptidos prototípicos DMBTI.pbsl y CD6.cons o a los de la propia proteína rshCD6. En conjunto, los resultados de la unión apoyan unívocamente la interacción directa y sustancial de los péptidos derivados de CD6 con componentes esenciales de la pared celular de cepas bacterianas G- y G+.
Para saber si las propiedades de autoagregación de los péptidos derivados de CD6 están relacionadas con sus propiedades de aglutinación, se analizó mediante DLS el tamaño hidrodinámico de los péptidos derivados de CD6 en solución. Los resultados indican que los péptidos derivados de CD6 formaron partículas de diferentes tamaños hidrodinámicos según sus propiedades de autoaglutinación (Figura 5). Las partículas CD6.PD3 mostraron dos picos, a 630 ± 3 y 5151 ± 7 nm, indicativos de autoagregación. Algo similar ocurría con CD6.PD1 (dos picos de 321 ± 5 y 1484 ± 8 nm), CD6.cons (dos picos de 1636 ± 6 y 5493 ± 7 nm) y DMBT1.pbs1 (dos picos de 169 ± 5 y 617 ± 4 nm). En cambio, CD6.PD2 mostró un único pico centrado en 379 ± 5 nm, en consonancia con sus menores propiedades de aglutinación bacteriana en comparación con los demás péptidos derivados de CD6 y DMBT1.
A continuación, se exploró ex vivo la relevancia funcional de la interacción de los péptidos derivados de CD6 con productos bacterianos patógenos clave. Para ello, se analizaron los efectos moduladores de concentraciones crecientes de péptidos CD6 sobre la liberación de citocinas por esplenocitos de ratón expuestos a LPS. Como ilustra la Figura 6, sólo los péptidos CD6.PD3 y CD6.cons mostraron efectos inhibidores dependientes de la dosis sobre la liberación de citocinas proinflamatorias IL-6 e IL-1p, que alcanzaron significación estadística en el primer caso. El mismo péptido CD6.PD3 (pero no CD6.cons) también indujo un aumento de la liberación de la citocina antiinflamatoria IL-10 no estadísticamente significativo y dependiente de la dosis.
Eficacia in vivo de los péptidos derivados de CD6 en el shock séptico inducido por CLP
Los efectos de los péptidos derivados de CD6 in vivo se probaron en ratones sometidos a un shock séptico inducido por CLP (Rittirsch D, et al., 2009, Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture, Nat Protoc 4:31-6).. Para ello, se infundió una única dosis intravenosa (i.v.) (6 mg/kg) de los diferentes péptidos a ratones C57BL/6 1 h después de la inducción de CLP, y se monitorizó la supervivencia a partir de entonces. Como se muestra en la Figura 7A, se observó un aumento significativo de la supervivencia entre los ratones infundidos con los péptidos CD6.PD2 (12,5%, P<0,0005) y CD6.PD3 (36,36%, P<0,0001) en comparación con el grupo tratado con solución salina, hecho que también se observó en los ratones infundidos con los péptidos DMBT-1.pbs1 (23,07%, P<0,0025) y CD6.cons (25%, P<0,0101) (Figura 7B). No se observaron efectos significativos sobre la supervivencia de los ratones con el péptido CD6.PD1.
Dado que las propiedades protectoras in vivo de CD6.PD3 frente al shock séptico superaron a las de CD6.PD1 y CD6.PD2, se realizaron experimentos adicionales para explorar sus efectos dependientes del tiempo, la dosis y la vía sistémica. Como se muestra en las Figuras 8A y 8B, las tasas máximas de supervivencia post CLP se obtuvieron tras la infusión de CD6.PD3 a dosis de 6 o 12 mg/kg (37,5% y 40%, respectivamente, frente a 23,08% a 3 mg/kg), y a 1 h tras la inducción del CLP (40% frente a 20% a 3h). No se observaron diferencias significativas entre las vías intravenosa (i.v.) o intraperitoneal (i.p.) cuando el péptido CD6.PD3 se infundió en condiciones óptimas (6 mg/kg a 1h post CLP) (Figura 8C).
A continuación, se analizó el efecto de las condiciones óptimas de infusión del péptido CD6.PD3 sobre los niveles séricos de citocinas y la carga bacteriana tras la CLP. Para ello, ratones C57BL/6 sometidos a shock séptico inducido por CLP fueron tratados con solución salina o péptido CD6.PD3 (infusión i.v. única de 6 mg/kg a 1 h tras CLP) y posteriormente sangrados y sacrificados a las 4 h y 20 h, respectivamente. Como se muestra en la Figura 9A, los ratones tratados con CD6.PD3 mostraron niveles significativamente más bajos (P<0,05) de las citocinas proinflamatorias IL-1p, IL-6 y TNF-a a las 20 h del CLP, en comparación con el grupo tratado con solución salina. Del mismo modo, los mismos ratones tratados con CD6.PD3 también mostraron menos UFC aisladas de la sangre y el bazo cuando fueron sacrificados a las 20 h del CLP, en comparación con el grupo de control salino (Figura 9B). Estos resultados indican que el péptido CD6.PD3 conserva las propiedades terapéuticas reportadas para la proteína rshCD6 en modelos experimentales de shock séptico (Martínez-Florensa M, et al., 2017, Protective Effects of Human and Mouse Soluble Scavenger-Like CD6 Lymphocyte Receptor in a Lethal Model of Polymicrobial Sepsis,. Antimicrob Agents Chemother 61:e01391-16). Esto también es válido para ratones sépticos tratados simultáneamente con CD6.PD3 y el antibiótico bactericida de amplio espectro Imipenem/Cilastatina (I/C). Como se ilustra en la Figura 10, la administración combinada de CD6.PD3 (6 mg/kg i.v.) e Imipenem/Cilastatina (50 mg/kg/12h i.p.) +1 h después del shock séptico inducido por CLP produjo efectos aditivos/sinérgicos estadísticamente significativos sobre la supervivencia de los ratones (90,9%), en comparación con CD6.PD3 (30,8%; P=0,018) o I/C (44,4%; P=0,0015) individualmente.
Discusión
El presente ejemplo demuestra que los péptidos intradominio cortos (11-mer de longitud) derivados de CD6 conservan las propiedades de reconocimiento bacteriano in vitro e in vivo de la proteína CD6 nativa. Tales secuencias (CD6.PD1, CD6.PD2 y CD6.PD3) se sitúan en lugares accesibles desde la superficie de los tres dominios SRCR de CD6, y son homólogas al péptido consenso de 11-mer (pbs1) identificado en la proteína DMBT-1/SAG (Bikker FJ, et al., 2004, Bacteria binding by DMBT1/SAG/gp-340 is confined to the VEVLXXXXWmotif in its scavenger receptor cysteine-rich domains, J Biol Chem 279:47699-703).
Mientras que i) secuencias homólogas similares de algunos miembros de SRCR-SF que poseen el motivo consenso VEVLxxxxW mínimo no se unen a bacterias (Bikker FJ, et al., 2004, Bacteria binding by DMBT-1/SAG/gp-340 is confined to the VEVLXXXXW motif in its scavenger receptor cysteine-rich domains, J Biol Chem 279:47699-703), y ii) ninguno de los péptidos derivados de CD6 coincidía plenamente con el motivo de consenso antes mencionado, los tres péptidos derivados de CD6 interaccionan tanto con LPS como con LTA aunque a diferentes Kd, y con propiedades funcionales in vitro e in vivo variadas (por ejemplo, aglutinación bacteriana o prevención de la mortalidad inducida por CLP).
El péptido CD6.PD3 proporcionó mejores resultados in vivo cuando se ensayó con fines terapéuticos en el modelo de ratón shock séptico inducido por CLP en comparación con los demás péptidos derivados de CD6 (P=0,04 para CD6.PD2 y P=0,0005 para CD6.PD1). El CD6.PD3 también funcionó mejor que el péptido prototípico DMBT-1.pbs1 o la secuencia CD6.cons, aunque las diferencias no alcanzaron significación estadística (P=0,1). Otro hallazgo destacable es el efecto aditivo/sinérgico estadísticamente significativo sobre la supervivencia de los ratones del péptido CD6.PD3 cuando se coadministra con imipenem/cilastatina, un miembro de la familia de los carbapenems considerado como tratamiento de primera elección en pacientes de cuidados críticos con sepsis (Verwaest C, 2000, Belgian Multicenter Study Group. Meropenem versus imipenem/cilastatin as empirical monotherapy for serious bacterial infections in the intensive care unit, Clin Microbiol Infect 6:294-302). Por lo tanto, CD6.PD3 reúne la mayoría de las propiedades antibacterianas de rshCD6, constituyendo así una buena alternativa rentable a este último, así como una buena estrategia coadyuvante a la terapia antibiótica.
En conclusión, los presentes hallazgos demuestran que las secuencias peptídicas cortas (11-mer) pueden conservar las propiedades de unión bacteriana de toda la región extracelular de c D6, lo que abre oportunidades rentables para desarrollar nuevas alternativas a los tratamientos de la sepsis actualmente disponibles. La compleja fisiología de la respuesta a la sepsis requiere un estudio multidisciplinar y simultáneo de los diversos factores dependientes del tiempo que determinan el desenlace de la sepsis a corto y largo plazo.
Ejemplo 2. Adsorción de toxinas bacterianas circulantes por péptidos derivados de CD6 acoplados covalentemente a una fase sólida.
Resultados
Los resultados obtenidos incubando una solución de endotoxina (50 UI/mL LPS) con perlas Eupergit® recubiertas con diferentes péptidos derivados de CD6 (CD6.PD2, CD6.PD3 y CD6.cons) o proteínas (HSA (UniProtκΒ - P02768, MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCV ADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDN EETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGE RAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEK SHClAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAA DPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHP EAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEK ERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL, SEQ ID NO.12), rshCD5 y rshCD6) durante diferentes periodos de tiempo se muestran en la Figura 11. Las microesferas recubiertas con CD6.PD2-, CD6.PD3- y rshCD6 redujeron los niveles de endotoxina (detectados mediante ensayos de LAL) en comparación con los controles recubiertos con HSA y rshCD5. El uso de péptidos derivados de CD6 para hemoperfusión extracorpórea tiene ventajas sobre los dispositivos existentes, como las columnas de purificación de sangre con fibra inmovilizada con polimixina B (Esteban E, et al., 2013, Immunomodulation in sepsis: the role of endotoxin removal by polymyxin B-immobilized cartridge, Mediators Inflamm 2013:507539): i) la afinidad descrita para la interacción LPS/Polimixina B (Kd 100-900 nM, dependiendo de la cepa G utilizada) (McInerney MP, et al., 2016, Quantitation of Polymyxin-Lipopolysaccharide Interactions Using an Image-Based Fluorescent Probe, J Pharm Sci; 105:1006-10) es inferior a la de c D6.PD1 y CD6.PD2 (Kd 3,5±0.3 nM y 35±2 nM, respectivamente), y ii) Polimixina B se une principalmente a LPS, mientras que CD6.PD1 y CD6.PD2 también se unen a LTA con afinidades de Kd 0,39±0,06 nM y 0,31±0,04 nM, respectivamente. En consecuencia, los péptidos derivados de CD6 también pueden utilizarse en caso de infecciones G+, que son responsables de más del 50% de las sepsis (Martin GS, 2012, Sepsis, sepsis grave y shock séptico: cambios en la incidencia, patógenos y resultados, Expert Rev Anti Infect Ther 10:701-6).

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica que comprende una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos aisladas SEQ ID No.: 3, y/o SEQ ID No.: 1, y/o SEQ ID No.: 2, o un derivado de las mismas, en la que dicho derivado comprende una o varias modificaciones de dicha secuencia de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en N-acilación y/o C-amidación o C-esterificación, N-alquilación, sustitución de uno o más L-aminoácidos por D-aminoácidos, conjugación con una biomolécula tal como polietilenglicol o albúmina, y bloqueo del extremo N- o C-terminal con residuos de Cys.
2. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que la composición farmacéutica es una composición sólida, preferentemente en forma de comprimido, píldora, cápsula o granulado, o una composición líquida, preferentemente en forma de solución, suspensión o emulsión.
3. La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que la composición farmacéutica comprende además vehículos farmacéuticamente aceptables, sales farmacéuticamente aceptables, adyuvantes y/o excipientes adecuados.
4. Un conjugado que comprende una o varias de las siguientes secuencias de aminoácidos aisladas SEQ ID No.: 3, y/o SEQ ID No.: 1, y/o SEQ ID No.: 2, o un derivado de las mismas, en el que dicho derivado comprende una o varias modificaciones de dicha secuencia de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en N-acilación y/o C-amidación o C-esterificación, N-alquilación, sustitución de uno o más L-aminoácidos por D-aminoácidos, conjugación con una biomolécula tal como polietilenglicol o albúmina, y bloqueo del extremo N- o C-terminal con residuos de Cys.
5. El conjugado según la reivindicación 4, en el que una o más de las secuencias de aminoácidos SEQ ID No.: 3, y/o SEQ ID No.: 1, y/o SEQ ID No.: 2, o un derivado de las mismas, tal como se define en la reivindicación 4, está conjugada con un polímero, tal como un polímero soluble o, preferiblemente, un polímero insoluble.
6. Un kit de partes compuesto por:
a) una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos aisladas SEQ ID No.: 3, y/o SEQ ID No.: 1, y/o SEQ ID No.: 2, o un derivado de las mismas, en el que dicho derivado comprende una o varias modificaciones de dicha secuencia de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en N-acilación y/o C-amidación o C-esterificación, N-alquilación, sustitución de uno o más L-aminoácidos por D-aminoácidos, conjugación con una biomolécula tal como polietilenglicol o albúmina, y bloqueo del extremo N- o C-terminal con residuos de Cys; y b) un antibiótico, preferentemente un inhibidor de la dehidropeptidasa o un inhibidor de la betalactamasa.
7. El kit de partes según la reivindicación 6, en el que el antibiótico es Imipenem y/o en el que el inhibidor de la dehidropeptidasa o el inhibidor de la beta-lactamasa es Cilastatina.
8. La composición farmacéutica tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el conjugado tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, o el kit de partes tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7 para su uso como medicamento.
9. La composición farmacéutica tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el conjugado tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, o el kit de partes tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7 para su uso en un método de tratamiento terapéutico y/o preventivo, en un mamífero incluyendo un humano, y/o en un no-mamífero, de una enfermedad infecciosa, o de una afección inflamatoria relacionada con una enfermedad infecciosa, o de una enfermedad inflamatoria relacionada con la presencia de un producto derivado de un agente infeccioso.
10. La composición farmacéutica, el conjugado o el kit de partes para su uso según la reivindicación 9, en los que la enfermedad infecciosa es una infección microbiana, preferiblemente una septicemia, y/o en los que la afección inflamatoria es un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica o sepsis, y/o en los que el agente infeccioso se selecciona del grupo que consiste en una bacteria, un hongo, un virus, un parásito y combinaciones de los mismos.
11. Dispositivo para la eliminación extracorpórea de al menos un componente químico de estructuras superficiales de bacterias Gram- y/o Gram+, tales como lipopolisacárido (LPS), ácido lipoteicoico (LTA) y/o peptidoglicano (PGN), de un fluido corporal de un animal, tal como un mamífero, preferentemente un humano, preferentemente en el que dicho fluido corporal es sangre, plasma, suero u otras fracciones sanguíneas adecuadas, en el que el dispositivo comprende un soporte sólido; y en el que una o más de las secuencias de aminoácidos SEQ ID No.: 3, SEQ ID No.: 1 y/o SEQ ID No.: 2, o un derivado de las mismas, en el que dicho derivado comprende una o varias modificaciones de dicha secuencia de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en N-acilación y/o C-amidación o C-esterificación, N-alquilación, sustitución de uno o más L-aminoácidos por D-aminoácidos, conjugación con una biomolécula tal como polietilenglicol o albúmina, y bloqueo del extremo N- o C-terminal con residuos de Cys , preferentemente las secuencias de aminoácidos SEQ ID No.: 3, SEQ ID No.: 1, y SEQ ID No.: 2, están fijadas a dicho soporte sólido.
12. Un dispositivo según la reivindicación 11, en el que dicho dispositivo es un dispositivo de hemoadsorción para la eliminación extracorpórea de uno o más componentes químicos de estructuras superficiales de bacterias Gram- y/o Gram+, tales como LPS, LTA, y/o PGN durante hemoperfusión.
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