ES2952048T3 - Nuevos péptidos que tienen actividad antimicrobiana y nueva enzima capaz de convertir un resto de configuración L en un aminoácido de configuración D en un péptido - Google Patents

Nuevos péptidos que tienen actividad antimicrobiana y nueva enzima capaz de convertir un resto de configuración L en un aminoácido de configuración D en un péptido Download PDF

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Abstract

La presente invención se refiere a una nueva clase de péptidos que tienen actividad antibacteriana y están presentes en D-aminoácidos y sus usos. También se refiere a una nueva enzima que presenta actividad de epímeras peptídicas in vitro e in vivo, siendo útil para modificar péptidos con el fin de cambiar la configuración de aminoácidos de L a D. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Nuevos péptidos que tienen actividad antimicrobiana y nueva enzima capaz de convertir un resto de configuración L en un aminoácido de configuración D en un péptido
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente descripción se refiere a la medicina, en particular a la actividad antimicrobiana de los péptidos y a la enzimología.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La resistencia antimicrobiana amenaza a la prevención y el tratamiento eficaces de una gama cada vez mayor de infecciones causadas por bacterias, parásitos, virus y hongos. Es una amenaza cada vez más grave para la salud pública mundial que requiere una acción en todos los sectores del gobierno y la sociedad. La resistencia antimicrobiana está presente en todas partes del mundo. Nuevos mecanismos de resistencia emergen y se extienden a nivel mundial.
Teniendo en cuenta los constantes problemas debidos a la resistencia antimicrobiana, existe una fuerte necesidad de nuevas clases de agentes antimicrobianos. En particular, los péptidos antimicrobianos son de gran interés. Estos péptidos son generalmente potentes. Además, a menudo ofrecen una mejor selectividad y especificidad que las moléculas pequeñas utilizadas generalmente como agentes terapéuticos.
No obstante, una importante limitación a su uso y desarrollo terapéutico se asocia con su semivida. De hecho, habitualmente disminuye por la acción de las proteasas y peptidasas que están presentes en los organismos.
Por lo tanto, se han desarrollado numerosas estrategias con el fin de reducir la degradación de péptidos, tales como C-amidación y N-acetilación contra exopeptidasa, la introducción de aminoácidos no naturales o de aminoácidos de configuración D. Sin embargo, estas estrategias solo se pueden utilizar en el contexto de los péptidos sintetizados y no son adecuadas para la producción recombinante de péptidos. En particular, no hay una manera fácil para introducir aminoácidos con configuración D en un péptido, a pesar del interés de tal modificación. De hecho, el aminoácido con configuración D presenta las mismas propiedades que los aminoácidos naturales, pero por lo general es más resistente a las proteasas y podría incluso ser menos inmunógeno.
En conclusión, cualquier nueva clase de agentes antimicrobianos es de gran interés, especialmente los péptidos antimicrobianos. Además, cualquier procedimiento adecuado para modificar los aminoácidos de configuración L en aminoácidos de configuración D en un péptido sería muy valiosa en este contexto.
Butcher et al. (2007, J. Bacterio!., 189, 8676) identificaron un operón YydFGHIJ que parecía inducir la expresión de LiaRS. En Uniprot:Q45596 se describen las secuencias de aminoácidos de un péptido yydF. Feitelson et al. (2006, Cáncer Letters, 239, 10-20) se refieren a cambios epigenéticos y genéticos.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
El alcance de la presente invención viene definido por las reivindicaciones y cualquier información que no esté incluida en las reivindicaciones se proporciona solo con fines informativos.
Los inventores identificaron un péptido antimicrobiano derivado de bacterias, a saber, de Bacillus subtilis que posee restos de aminoácido D. Por lo tanto, los inventores han descubierto una nueva clase de bacteriocinas. Este péptido tiene la especificidad para presentar el efecto antimicrobiano sólo cuando algunos de sus aminoácidos están en configuración D. Este péptido se puede preparar mediante una enzima derivada de las mismas bacterias que presenta la propiedad de cambiar la configuración de los aminoácidos en un péptido a partir de una configuración L a una configuración D. Por lo tanto, esta enzima puede ser útil para la conversión de los aminoácidos de configuración L en aminoácidos de configuración D en los péptidos, en particular los preparados mediante producción recombinante.
Por consiguiente, la presente descripción se refiere a un péptido antimicrobiano que tiene al menos dos aminoácidos con configuración D, que comprende una secuencia de 17 restos que tiene al menos 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 33 a 49 de la SEC ID n.° 1 y comprendiendo dicha secuencia las secuencias W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID N.° 71) y W-[lN/A]-X4-G-S (SEC ID N.° 69), en las que X4 es cualquier aminoácido, y una secuencia de unión entre la SEC iD N.° 69 y la SEC iD n.° 71 de 4-8 aminoácidos, en la que los restos [V/I/A] de las SEC ID n.os 69 y 71 tienen una configuración D.
Preferentemente, el péptido comprende, esencialmente consiste en o consiste en una secuencia de W-Y-F-[V/I/A]-[K/R]-Xa-Xb-Xc-N-R-W-[V/I/A]-Xd-G-S-Xe-H (SEC ID n.° 72), en la que Xa, Xb y Xc son un aminoácido polar, Xd es un aminoácido alifático y Xe cualquier aminoácido. Más preferentemente, el péptido comprende, esencialmente consiste en o consiste en una secuencia de W-Y-F-[V/I/A]-[K/R]-[S/N]-[S/Q/K]-[E/K/S/Q]-N-R-W-[V/I/A]-[LN/A]-G-S-[NG]-H (SEC ID n.° 73).
En un aspecto preferido, el péptido comprende, esencialmente consiste en o consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID n.° 61-68
En un aspecto, el péptido comprende una secuencia de 24 restos que tiene al menos 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 26 a 49 de la SEC ID n.° 1 y comprendiendo dicha secuencia las secuencias N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21) y W-[lN/A]-X4-G-S (SEC ID n.° 69), en la que X4 es cualquier aminoácido y una secuencia de unión entre la SEC ID n.° 21 y la SEC ID n.° 69 de 4-7 aminoácidos.
Preferentemente, el péptido comprende las secuencias de L-X1-X2-X3-N-D-L-W-Y-F-V/I (SEC ID n.° 23) y la W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 22), en la que X1, X2, X3 y X4 son cualquier aminoácido. Más preferentemente, X1 es alanina, ácido aspártico o ácido glutámico, X2 es lisina, asparagina o ácido aspártico y X3 es valina, isoleucina o glutamina.
Preferentemente, el péptido comprende las secuencias L-A-K-V-N-D-L-W-Y-F-V (SEC ID n.° 24) y W-lN-X4-G-S (SEC ID n.° 22), en las que X4 es un aminoácido hidrofóbico, preferentemente leucina, valina, alanina o metionina.
Preferentemente, la valina o isoleucina en la secuencia de N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21) tiene una configuración D y la isoleucina o valina en la secuencia W -IN -X4-G-S (SEC ID n.° 22) tiene una configuración D.
En un aspecto preferido, el péptido comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de SEC ID n.° 20 y la valina en la posición 19 está en configuración D y la isoleucina en la posición 27 está en configuración D.
La presente descripción se refiere también a una composición farmacéutica que comprende un péptido de acuerdo con la presente descripción.
La presente descripción además se refiere a un péptido de acuerdo con la presente descripción para su uso como un medicamento, preferible como antimicrobiano, más preferentemente como antibacteriano. Se refiere al uso de un péptido según la presente descripción para la fabricación de un medicamento, preferentemente un agente antimicrobiano, más preferentemente un antibacteriano. La presente descripción se refiere a un método para tratar a un sujeto que lo necesite, que comprende administrar una cantidad terapéutica de un péptido de acuerdo con la presente descripción.
La presente descripción se refiere a un método in vitro para preparar un péptido de acuerdo con la presente descripción, en el que el procedimiento comprende una etapa de poner en contacto un péptido que comprende una secuencia de 17 restos que tiene al menos un 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 33 a 49 de la SEC ID n.° 1 y comprendiendo dicha secuencia las secuencias W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 71) y W-[lN/A]-X4-G-S (SEC ID n.° 69), en la que X4 es cualquier aminoácido y una secuencia de unión entre la SEC ID n.° 69 y la SEC ID n.° 71 de 4-8 aminoácidos, con una epimerasa del péptido SAM radical que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 30 % de identidad con la SEC ID n.° 25 y en la que el 70 % de las posiciones 14-15, 18, 20-24, 27, 58-60, 63, 83, 84, 87-90, 112, 115, 117, 120, 150, 152, 169, 176, 180, 181, 183, 204, 206-208, 214, 217, 220-225, 228, 230, 252, 254, 262, 289, 292, 296 y 309 de la SEC ID n.° 25 están conservadas.
En un aspecto, el péptido comprende una secuencia de 24 restos que tiene al menos 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 26 a 49 de la SEC ID n.° 1 y comprendiendo dicha secuencia las secuencias N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21) y W-lN-X4-G-S (SEC ID n.° 22), en la que X4 es cualquier aminoácido y una secuencia de unión entre la SEC ID n.° 21 y la SEC ID n.° 22 de 4-7 aminoácidos.
Se refiere además al uso de una epimerasa del péptido SAM radical que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 30 % de identidad con la SEC ID n.° 25 y en la que el 70 % de las posiciones 14-15, 18, 20-24, 27, 58-60, 63, 83, 84, 87-90, 112, 115, 117, 120, 150, 152, 169, 176, 180, 181, 183, 204, 206-208, 214, 217, 220-225, 228, 230, 252, 254, 262, 289, 292, 296, y 309 de la SEC ID n.° 25 están conservadas para la preparación de un péptido de acuerdo con la presente descripción.
La presente descripción también se refiere a una célula huésped recombinante que comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica un péptido que comprende una secuencia de 17 restos que tiene al menos un 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 33 a 49 de la SEC ID n.° 1 a y comprendiendo dicha secuencia las secuencias W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 71) y W-[lN/A]-X4-G-S (SEC ID n.° 69), en las que X4 es cualquier aminoácido y una secuencia de unión entre la SEC ID n.° 69 y la SEC ID n.° 71 de 4-8 aminoácidos y un ácido nucleico heterólogo que codifica una epimerasa que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 30 % de identidad con la SEC ID n.° 25 y en la que el 70 % de las posiciones 14-15, 18, 20-24, 27, 58-60, 63, 83, 84, 87-90, 112, 115, 117, 120, 150, 152, 169, 176, 180, 181, 183, 204, 206-208, 214, 217, 220-225, 228, 230, 252, 254, 262, 289, 292, 296 y 309 de la SEC ID n.° 25 y que es capaz de coexpresar el péptido y la epimerasa. En un aspecto, el péptido comprende una secuencia de 24 restos que tiene al menos 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 26 a 49 de la SEC ID n.° 1 y dicha secuencia comprende las secuencias N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21) y W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 22), en el que X4 es cualquier aminoácido, y una secuencia de unión entre la SEC ID n.° 21 y SEC ID n.° 22, de 4­ 7 aminoácidos.
Para finalizar, la presente descripción se refiere a un método para preparar un péptido de acuerdo con la presente descripción, en el que el método comprende cultivar una célula huésped recombinante de acuerdo con la presente descripción en condiciones adecuadas para la coexpresión del péptido y la epimerasa y recuperar el péptido que tiene al menos un aminoácido con configuración D o métodos sintéticos utilizados para la síntesis de péptidos, que permiten el ensamblaje de aminoácidos con configuración L y D
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Al estudiar el operón yydFGHIJ de Bacillus subtilis, los inventores identificaron en primer lugar una nueva clase de péptidos antimicrobianos y, en segundo lugar, una epimerasa capaz de convertir in vitro un aminoácido de configuración L en un resto de configuración D en el péptido. Por lo tanto, esta epimerasa es útil para la ingeniería de péptidos.
Péptido antimicrobiano
En una búsqueda de genes implicados en la regulación del sistema de dos componentes LiaRS presumiblemente involucrado en la detección de la integridad de la pared celular bacteriana, Butcher et al. (2007, J. Bacteriol., 189, 8616) identificaron un operón YydFGHIJ que parecía inducir la expresión de LiaRS. Sin embargo, ningún componente de este operón se pudo aislar o investigar in vitro.
Los inventores mostraron que el operón produce un péotido YydF y que este péptido es modificado postraduccionalmente por la enzima YydG que, muy sorprendentemente, codifica una nueva clase de epimerasa SAM radical. Además, los inventores descubrieron que el péptido YydF tiene actividad antimicrobiana pero solo si comprende los aminoácidos de configuración D. En ausencia de aminoácidos de configuración D, el péptido está desprovisto de esta actividad antimicrobiana, una característica desconocida hasta la fecha en los péptidos bioactivos. Más particularmente, se requieren dos aminoácidos de configuración D para esta actividad antimicrobiana.
Por consiguiente, en un aspecto, la presente descripción se refiere a un péptido que tiene al menos un aminoácido con configuración D, preferentemente dos aminoácidos con configuración D, que comprende una secuencia de 17 restos que tienen al menos un 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 33 a 49 de la SEC ID n.° 1. En particular, el péptido puede comprender una secuencia de 17 restos que tienen al menos un 45, 50, 55, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % de identidad con la secuencia en las posiciones 33 a 49 de la SEC ID n.° 1. Como alternativa, el péptido puede comprender una secuencia de 17 restos en las posiciones 33 a 49 de la SEC ID n.° 1, y 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones, adiciones o deleciones.
En un aspecto preferido, el péptido comprende una secuencia en la que se conservan los restos en las posiciones 33­ 35, 40-43, 46 y 47 de la SEC ID n.° 1. En un aspecto adicional, los restos en las posiciones 36 y 44 de la SEC ID n.° 1 se seleccionan del grupo que consiste en V, I y A, preferentemente V e I.
En un aspecto preferido, la presente descripción se refiere a un péptido que tiene al menos dos aminoácidos con configuración D, que comprende una secuencia de 17 restos que tiene al menos un 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 33 a 49 de la SEC ID n.° 1 y que incluye la secuencia W-[lN/A]-X4-G-S (SEC ID n.° 69), en la que X4 es un aminoácido hidrófobo, preferentemente leucina, valina o alanina. En particular, el péptido puede comprender una secuencia de 17 restos que tienen al menos un 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 85, 90 o 95 % de identidad con la secuencia en las posiciones 33 a 49 de la SEC ID n.° 1. Opcionalmente, el péptido comprende además la secuencia de W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 71). Preferentemente, los aminoácidos [V/I/A] de las SEC ID n.os 69 y 71 son aminoácidos de configuración D. En la secuencia peptídica, cuando se considera la orientación desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal, la secuencia W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 71) está antes que la secuencia W-[lN/A]-X4-G-S (SEC ID n.° 69), preferentemente W-[lN]-X4-G-S (SEC ID n.° 22). En un aspecto preferido, el motivo W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 71) está separado del motivo W-[lN/A]-X4-G-S (SEC ID n.° 69), preferentemente W-[lN]-X4-G-S (SEC ID n.° 22), por una secuencia de unión que comprende de cuatro a ocho aminoácidos, preferentemente, una secuencia de unión de cinco o siete aminoácidos, preferentemente de seis aminoácidos. En un aspecto más preferido, el péptido comprende una secuencia de W-Y-F-[V/I/A]-[K/R]-Xa-Xb-Xc-N-R-W-[V/I/A]-Xd-G-S-Xe-H (SEC ID n.° 72), en la que Xa, Xb y Xc son un aminoácido polar, Xd es un aminoácido alifático y Xe es cualquier aminoácido. Preferentemente, Xa se selecciona del grupo que consiste en S, N, C y T, más preferentemente es S o N. Preferentemente, Xb se selecciona del grupo que consiste en S, N, T, Q, D, E, K, R y H, más preferentemente se selecciona del grupo que consiste en S, N, Q y K, aún más preferentemente S, Q y K. Preferentemente, Xc se selecciona entre el grupo que consiste en S, N, T, Q, D, E, K, R y H, más preferentemente se selecciona del grupo que consiste en S, N, Q, E, R y K, aún más preferentemente E, K, S y Q. Preferentemente, Xd se selecciona entre el grupo que consiste en L, I, V A, más preferentemente L, V y A. Preferentemente, Xe se selecciona entre el grupo que consiste en A, G o S, más preferentemente A o G.
En un aspecto muy específico, el péptido consiste esencialmente o consiste en una secuencia de W-Y-F-[V/I/A]-[K/R]-[S/N]-[S/Q/K]-[E/K/S/Q]-N-R-W-[V/I/A]-[LN/A]-G-S-[NG]-H (SEC ID n.° 73).
En un aspecto de la descripción, el péptido comprende, esencialmente consiste en o consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las s Ec ID n.° 61-68.
En un aspecto, la presente descripción se refiere a un péptido que tiene al menos un aminoácido con configuración D, preferentemente dos aminoácidos con configuración D, que comprende una secuencia de 24 restos que tienen al menos un 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 26 a 49 de la SEC ID n.° 1. En particular, el péptido puede comprender una secuencia de 24 restos que tienen al menos un 45, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % de identidad con la secuencia en las posiciones 26 a 49 de la SEC ID n.° 1. Como alternativa, el péptido puede comprender una secuencia de 24 restos en las posiciones 26 a 49 de la SEC ID n.° 1, y 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones, adiciones o deleciones.
En un aspecto preferido, el péptido comprende una secuencia en la que se conservan los restos en las posiciones 26, 31-35, 43, 46 y 47 de la SEC ID n.° 1. En un aspecto adicional, uno o varios restos en las posiciones 23, 25, 27-30, 36, 37, 38, 41, 42, 44, 48 y 49 de la SEC ID n.° 1 también se conservan. Por ejemplo, 1-11 restos en las posiciones 23, 25, 27-30, 36, 37, 38, 41, 42, 44, 48 y 49 de la SEC ID n.° 1 se pueden conservar, especialmente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 restos. Más preferentemente, los restos en las posiciones 23, 25, 27-30, 36, 37, 38, 41, 42, 44, 48 y 49 de la SEC ID n.° 1 se conservan. Aún más preferentemente, los restos en las posiciones 25, 29, y 38 de la SEC iD n.° 1 se conservan.
Después, un péptido de acuerdo con la presente descripción comprende las secuencias N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21), en particular L-X1-X2-X3-N-D-L-W-Y-F-V/I (SEC ID n.° 23), o/y W-IN/A-X4-G-S (SEC ID n.° 22), en las que X1, X2, X3 y X4 son cualquier aminoácido. Opcionalmente, el péptido comprende ambas secuencias. Opcionalmente, la secuencia W-IN/A-X4-G-S (SEC ID n.° 69) es la secuencia de W-lN-X4-G-S (SEC ID n.° 22). Preferentemente, X1 es alanina, ácido aspártico o ácido glutámico, preferentemente alanina y ácido aspártico, más preferentemente alanina. Preferentemente, X2 es lisina, asparagina o ácido aspártico, preferentemente lisina o asparagina, más preferentemente lisina. Preferentemente, X3 es valina, isoleucina o glutamina, preferentemente valina o isoleucina, más preferentemente valina. Preferentemente, X4 es un aminoácido hidrófobo, preferentemente leucina, valina, alanina o metionina. En un aspecto particular, X1 es alanina y ácido aspártico, preferentemente alanina, X2 es lisina o asparagina, preferentemente lisina, X3 es valina o isoleucina, preferentemente valina, y X4 es un aminoácido hidrófobo, preferentemente leucina, valina o alanina. En un aspecto preferido, el péptido comprende las secuencias L-A-K-V-N-D-L-W-Y-F-V (SEC ID n.° 24), y W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 22), en las que X4 es un aminoácido hidrófobo, preferentemente leucina, valina o alanina. “IN” o “V/l” significa en el presente documento isoleucina o valina. “N/D” significa en el presente documento asparagina o ácido aspártico. “IN/A” significa en el presente documento isoleucina, valina o alanina.
En un aspecto preferido, en la secuencia W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 22), lN es una isoleucina (SEC ID n.° 57). Como alternativa, en la secuencia W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 22), lN es una valina (SEC ID n.° 58). En otro aspecto, W-IN/A-X4-G-S (SEC ID n.° 69) es W-A-X4-G-S (SEC ID n.° 70). Preferentemente, X4 es un aminoácido hidrófobo, más preferentemente leucina, valina, alanina o metionina, aún más preferentemente leucina, valina o alanina.
En un aspecto preferente, en la secuencia N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21) y N/D es asparagina e lN es valina. Como alternativa, en la secuencia de N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21) y N/D es ácido aspártico e IN es isoleucina.
En la secuencia peptídica, cuando se considera la orientación desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal, la secuencia N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21), en particular L-X1-X2-X3-N-D-L-W-Y-F-V/I (SEC ID n.° 23), es antes de la secuencia W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 22).
En un aspecto preferido, el motivo N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21) está separado del motivo W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 22) por una secuencia de unión que comprende de cuatro a siete aminoácidos, preferentemente, una secuencia de unión de cinco o seis aminoácidos, preferentemente de cinco aminoácidos. En el aspecto más preferido, el péptido comprende una secuencia de N/D-D-L-W-Y-F-V/I-(X)5-W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 59) o N/D-D-L-W-Y-F-V/I-(x )6-W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 60), X4 tiene el mismo significado que antes.
Por tanto, en un aspecto preferido, la presente descripción se refiere a un péptido que tiene al menos un aminoácido con configuración D, que comprende una secuencia de 24 restos que tiene al menos un 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 26 a 49 de la SEC ID n.° 1 e incluye las secuencias L-A-K-V-N-D-L-W-Y-F-V (SEC ID n.° 24) y/o W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 22), en las que X4 es un aminoácido hidrófobo, preferentemente leucina, valina o alanina. En particular, el péptido puede comprender una secuencia de 24 restos que tienen al menos 45, 50, 60, 70, 80, 85, 90 o 95 % de identidad con la secuencia en las posiciones 26 a 49 de la SEC ID n.° 1. En un aspecto preferido, uno o varios restos en las posiciones 23, 25, 27-30, 36, 37, 38, 41, 42, 44, 48 y 49 de la SEC ID n.° 1 también se conservan, especialmente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 restos.
El péptido comprende al menos un aminoácido con configuración D, preferentemente dos aminoácidos con configuración D. Por ejemplo, puede comprender 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos con configuración D. Opcionalmente, los aminoácidos con configuración D pueden ser cualquier aminoácido, preferentemente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, V, A, N, S y T, más preferentemente seleccionado entre el grupo que consiste en I, V y A, aún más preferentemente seleccionado entre el grupo que consiste en I y V.
En un aspecto particular, el aminoácido valina, isoleucina o alanina en la secuencia N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21) tiene una configuración D y/o la isoleucina, valina o alanina en la secuencia W-[lN/A]-X4-G-S (SEC ID n.° 69), preferentemente W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 22), tiene una configuración D. En un aspecto preferido, los aminoácidos valina, isoleucina o alanina en la secuencia N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21) y la isoleucina, valina o alanina en la secuencia W-[lN/A]-X4-G-S (SEC ID n.° 69), preferentemente W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 22), tienen una configuración D. En un aspecto preferido, la valina o isoleucina en la secuencia de N/D-D-L-W-Y-F-V/l-(X)5-W-lN-X4-G-S (SEC ID n.° 59) o N/D-D-L-W-Y-F-V/l-(X)6-W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 60) tienen una configuración D.
Opcionalmente, el péptido puede comprender un aminoácido adicional con configuración D.
Preferentemente, la longitud del péptido no es superior a aproximadamente 65 aminoácidos, más preferentemente no superior a 50 aminoácidos, en particular puede ser de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 aminoácidos, por ejemplo, de aproximadamente 17 a aproximadamente 50 aminoácidos, de aproximadamente 18 a aproximadamente 50 aminoácidos, de aproximadamente 17 a aproximadamente 40, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 o de aproximadamente 25 a aproximadamente 35 aminoácidos.
El péptido puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC ID n.° 1-19 o un fragmento funcional de las mismas que comprende las secuencias N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21), en particular L-X1-X2-X3-N-D-L-W-Y-F-V/I (SEC ID n.° 23), y/o W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 22), más preferentemente L-A-K-V-N-D-L-W-Y-F-V (SEC ID n.° 24), and W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 22). Por funcional se quiere decir que tenga una actividad antimicrobiana, especialmente una actividad antibacteriana.
En un aspecto muy particular, el péptido comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de SEC ID n.° 20 y la valina en la posición 19 está en configuración D y/o la isoleucina en la posición 27 está en configuración D. Preferentemente, tanto la valina en la posición 19 como la isoleucina en la posición 27 están en configuración D.
En otro aspecto muy particular, el péptido tiene la secuencia de SEC ID n.° 1 y la valina en la posición 36 está en configuración D y/o la isoleucina en la posición 44 está en configuración D. Preferentemente, tanto la valina en la posición 36 como la isoleucina en la posición 44 están en configuración D.
En un aspecto particular, el péptido no se encuentra en la naturaleza. El péptido es un péptido no natural.
Los extremos N y C de los péptidos descritos en el presente documento pueden estar opcionalmente protegidos contra la proteólisis. En un aspecto preferido, el extremo N-terminal puede estar en forma de un grupo acetilo, y/o el extremo C-terminal puede estar en forma de un grupo amida. En un aspecto preferido, el péptido tiene un extremo C-terminal libre.
Como alternativa o además, también se incluyen modificaciones internas de los péptidos que sean resistentes a la proteólisis, por ejemplo en las que al menos un enlace peptídico -CONH- está modificado y reemplazado por un enlace reducido (CH2NH), un enlace retroinverso (NHCO), un enlace metileno-oxi (CH2-O), un enlace tiometileno (CH2-S), un enlace carba (CH2CH2), un enlace cetometileno (CO-CH2), un enlace hidroxietileno (CHOH-CH2)), un enlace (N-N), un enlace E-alceno o también un enlace -CH=CH-.
Por ejemplo, el péptido puede modificarse mediante acetilación, acilación, amidación, reticulación, ciclación, formación de enlaces disulfuro, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glucosilación, formación de anclaje a GPI, hidroxilación, yodinación, metilación, miristilación, oxidación, fosforilación, y similares.
El péptido de acuerdo con la descripción puede comprender uno o más aminoácidos que son aminoácidos raros, en particular hidroxiprolina, hidroxilisina, alohidroxilisina, 6-N-metilisina, N-etilglicina, N-metilglicina, N-etilasparagina, aloisoleucina, N-metilisoleucina, N-metilvalina, piroglutamina, ácido aminobutírico; o aminoácidos sintéticos, en particular, ornitina, norleucina, norvalina y cyiclohexil-alanina.
Opcionalmente, el péptido puede estar unido a un resto adicional, opcionalmente a través de un enlazador o espaciador (por ejemplo, diglicina). Opcionalmente, el péptido puede ser parte de una proteína de fusión. El resto adicional puede ser un resto que facilita su captación o entrada en la célula, en particular un PTD (dominio de transducción de proteína) o péptido de penetración celular; un péptido localizador; un agente estabilizante, tal como PEG (polietilenglicol), oligo-N-metoxi-etilglIcina (NMEG), albúmina, una proteína de unión a albúmina o un dominio Fc de inmunoglobulina; un marcador de afinidad, tal como un marcador inmune, biotina, lectina o quelante; un marcador de purificación, tal como un marcador de His; un marcador detectable, tal como un marcador óptico, una lantamida quelada, un colorante fluorescente o un aceptor/donante FRET; un resto de direccionamiento; un péptido señal de secreción; o una combinación de los mismos. El resto adicional puede añadirse ya sea en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal del péptido. Preferentemente, se añade el resto adicional, ya sea en el extremo N-terminal del péptido.
En otro aspecto de la descripción, los péptidos están unidos covalentemente a una molécula de polietilenglicol (PEG) por su extremo C-terminal o un resto de lisina, en particular un PEG de 1.500 o 4.000 PM, para una disminución del aclaramiento urinario y en dosis terapéuticas utilizadas y para un aumento de la semivida en el plasma sanguíneo. En aún otro aspecto, la semivida del péptido se incrementa mediante la inclusión del péptido en un material polímero biodegradable y biocompatible para el sistema de administración de fármacos con formación de microesferas. Los polímeros y copolímeros son, por ejemplo, poli(D,L-lactida-co-glicólido) (PLGA) (como se ilustra en el documento US2007/0184015, SoonKap Hahn et al.).
La descripción también abarca las sales farmacéuticamente aceptables de un péptido de acuerdo con la descripción. Las sales farmacéuticamente aceptables pueden, por ejemplo, ser sales con ácidos minerales farmacéuticamente aceptables, tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico; sales de ácidos orgánicos farmacéuticamente aceptables, tales como ácido acético, ácido cítrico, ácido maleico, ácido málico, ácido succínico, ácido ascórbico y ácido tartárico; sales con bases minerales farmacéuticamente aceptables, tales como sales de sodio, potasio, calcio, magnesio o amonio; o sales de bases orgánicas que contienen un nitrógeno salificable, habitualmente utilizados en la técnica farmacéutica. Los métodos para preparar dichas sales son bien conocidos para un experto en la técnica.
En un aspecto preferido, el péptido está aislado.
Uso del péptido antimicrobiano
La presente descripción se refiere a una composición farmacéutica que comprende un péptido como se ha definido anteriormente. La composición farmacéutica puede comprender además un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable. Por uso farmacéutico también se contempla el uso veterinario. Opcionalmente, La composición farmacéutica puede comprender además otro ingrediente activo, preferentemente otro agente antimicrobiano, más preferentemente otro antibacteriano o un antiinflamatorio.
La composición farmacéutica que comprende la molécula se formula de acuerdo con la práctica farmacéutica estándar (Lippincott Williams & Wilkins, 2000 y Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick y J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, Nueva York) conocida por un experto en la técnica.
La presente descripción también se refiere a un péptido como se ha definido anteriormente para su uso como un medicamento, en particular como un agente antimicrobiano, más preferentemente como un antibacteriano. Se refiere además a la utilización de un péptido como se ha definido anteriormente para la fabricación de un medicamento para su uso como un agente antimicrobiano, más preferentemente como un antibacteriano. Además, se refiere a un método para tratar o prevenir una infección, especialmente una infección bacteriana, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido como se ha definido anteriormente, tratando o previniendo de este modo una infección.
En un aspecto preferido, el péptido como se ha definido anteriormente es tal que la valina, isoleucina o alanina en la secuencia N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21) y la isoleucina, valina o alanina en la secuencia W-[lN/A]-X4-G-S (SEC ID n.° 69), preferentemente W-IN-X4-G-S (Se C ID n.° 22), tienen una configuración D. En un aspecto muy específico, el péptido comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de SEC ID n.° 20 y la valina en la posición 19 y la isoleucina en la posición 27 están en configuración D. En otro aspecto muy particular, el péptido tiene la secuencia de SEC ID n.° 1 y la valina en la posición 36 y la isoleucina en la posición 44 están en configuración D. En otro aspecto muy particular, el péptido comprende, esencialmente consiste en o consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID n.° 61-68, en las que los restos en las posiciones 4 y 12 están en configuración D.
Opcionalmente, el péptido como se ha definido anteriormente se puede usar en combinación con otro fármaco, preferentemente otro antimicrobiano, más preferentemente otro antibacteriano o un agente antiinflamatorio.
Por “tratar” o “tratamiento” se entiende que la enfermedad se cura, alivia o retrasa. Incluye el tratamiento preventivo o curativo.
La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” como se usa en la presente solicitud quiere decir una cantidad de agente terapéutico, administrada a un paciente que es suficiente para constituir un tratamiento de la infección.
La forma de las composiciones farmacéuticas, la vía de administración, la dosis y el régimen naturalmente dependerán de la afección a tratar, la gravedad de la enfermedad, la edad, el peso y el sexo del paciente, etc.
Las composiciones farmacéuticas de la descripción se pueden formular para administración tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea o intraocular y similares.
Para administración oral, la composición se puede formular en formas de dosificación orales convencionales, tales como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos y preparaciones líquidas, tales como jarabes, elixires y gotas concentradas. Se pueden usar vehículos o diluyentes sólidos no tóxicos que incluyen, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, magnesio, carbonato y similares. Para comprimidos, también son necesarios aglutinantes, que son agentes que confieren cualidades de cohesión a los materiales en polvo. Por ejemplo, almidón, gelatina, azúcares, tales como lactosa o dextrosa, y gomas naturales o sintéticas se pueden usar como aglutinantes. Los disgregantes son también necesarios en los comprimidos para facilitar la disgregación del comprimido. Los disgregantes incluyen almidones, arcillas, celulosas, alginas, gomas y polímeros reticulados. Además, lubricantes y deslizantes también están incluidos en los comprimidos para evitar la adhesión del material del comprimido a las superficies en el proceso de fabricación y para mejorar las características de flujo del material en polvo durante la fabricación. El dióxido de silicio coloidal se utiliza más habitualmente como deslizante y compuestos tales como talco o ácido esteárico son los más utilizados como lubricantes.
Para administración transdérmica, la composición se puede formular en forma de pomada, crema o gel y se podrían usar penetrantes o detergentes apropiados para facilitar la permeación, tal como dimetilsulfóxido, acetamida de dimetilo y dimetilformamida.
Para administración transmucosa, se pueden usar aerosoles nasales, supositorios rectales o vaginales. El compuesto activo se puede incorporar en cualquiera de las bases de supositorios conocidas mediante métodos conocidos en la técnica. Los ejemplos de dichas bases incluyen manteca de cacao, polietilenglicoles (carboceras), monoestearato de sorbitán polietileno y mezclas de estos con otros materiales compatibles para modificar el punto de fusión o la velocidad de disolución.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la descripción se pueden formular para liberar el fármaco activo de modo sustancialmente inmediato tras la administración o en cualquier momento o periodo de tiempo predeterminado tras la administración.
En un aspecto particular, la composición farmacéutica de acuerdo con la descripción comprende de 0,001 mg a 10 g de la molécula de la descripción. Preferentemente, la composición farmacéutica de acuerdo con la descripción comprende de 0,01 mg a 1 g de la molécula de la descripción.
En otro aspecto adicional, la presente descripción se refiere al uso de un péptido de acuerdo con la descripción como desinfectante, conservante o plaguicida. El término “desinfectante” se refiere a una actividad antimicrobiana del péptido sobre una superficie (por ejemplo, paredes, puertas, equipos médicos), un líquido (por ejemplo, agua) o un gas (por ejemplo, un gas anestésico). De acuerdo con un aspecto, el péptido de acuerdo con la descripción se utiliza para la eliminación de biopelículas bacterianas. De acuerdo con un aspecto preferido, el péptido de acuerdo con la descripción se utiliza en particular para la desinfección de un equipo quirúrgico o protésico.
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un dispositivo médico o implante que comprende un cuerpo que tiene al menos una superficie recubierta con o que incluye un péptido de acuerdo con la descripción. La presente descripción también se refiere a un método para preparar un dispositivo médico o implante que comprende aplicar un recubrimiento de péptido de acuerdo con la descripción, o poner en contacto, con al menos una superficie del dispositivo o implante.
Este tipo de dispositivo o implante médico y los usos y métodos de preparación de los mismos se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente WO 2005/006938.
La superficie recubierta con o que incluye un péptido de acuerdo con la descripción puede estar compuesta por materiales termoplásticos o poliméricos tales como polietileno, dacrón, nailon, poliésteres, politetrafluoroetileno, poliuretano, látex, elastómeros de silicona y similares, o de materiales metálicos tales como oro. En un aspecto particular, el péptido de la descripción está unido covalentemente a una superficie funcionalizada, preferentemente una superficie metálica, a través de su extremo N-terminal o C-terminal. Opcionalmente, el péptido puede estar unido a la superficie a través de un brazo espaciador.
Preferentemente, la superficie puede estar recubierta con un péptido a una densidad de 0,4 a 300 mg/cm2.
Como alternativa, el dispositivo o implante, en particular, el dispositivo protésico óseo y articular, se pueden recubrir con una mezcla de cemento que comprende un péptido de acuerdo con la descripción.
El péptido se puede combinar con otra molécula activa, preferentemente un antibiótico.
El dispositivo o implante puede ser, por ejemplo, catéteres intravasculares, peritoneales, pleurales y urológicos; válvulas cardíacas; marcapasos; derivaciones vasculares; derivaciones coronarias; implantes dentales o prótesis ortopédicas o intraoculares.
Preparación del péptido
Los péptidos descritos en el presente documento se pueden sintetizar utilizando métodos sintéticos estándar conocidos para los expertos en la técnica, para la síntesis de ejemplo química o recombinación genética. En particular, los péptidos pueden sintetizarse de acuerdo con el método descrito originalmente por Merrifield.
Ejemplos de tecnologías de síntesis química son la síntesis en fase sólida y la síntesis en fase líquida. Como síntesis en fase sólida, por ejemplo, el aminoácido correspondiente al extremo C-terminal del péptido que se va a sintetizar se une a un soporte que es insoluble en disolventes orgánicos, y mediante repetición alterna de reacciones, una en la que los aminoácidos con sus grupos amino y grupos funcionales de cadena lateral protegidos con grupos protectores apropiados se condensan uno a uno en orden desde el extremo C-terminal al extremo N-, y una donde los aminoácidos unidos a la resina o el grupo protector de los grupos amino de los péptidos son liberados, así, de esta manera la cadena peptídica se extiende. Los métodos de síntesis en fase sólida se clasifican principalmente mediante el método tBoc y el método Fmoc, dependiendo del tipo de grupo protector utilizado. Los grupos protectores utilizados habitualmente incluyen tBoc (t-butoxicarbonilo), Cl-Z (2-clorobenciloxicarbonilo), Br-Z (2-bromobenciloxicarbonilo), Bzl (bencilo), Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo), Mbh (4,4'-dimetoxidibenzhidrilo), Mtr (4-metoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonilo), Trt (tritilo), Tos (tosilo), Z (benciloxicarbonilo) y Clz-Bzl (2,6-diclorobencilo) para los grupos amino; NO2 (nitro) y Pmc (2,2,5,7,8-pentametilcromano-6-sulfonilo) para los grupos guanidino); y tBu (t-butilo) para los grupos hidroxilo). Después de la síntesis del péptido deseado, se somete a la reacción de desprotección y se corta del soporte sólido. Tal reacción de corte peptídico puede llevarse a cabo con fluoruro de hidrógeno o ácido trifluorometanosulfónico para el método Boc y con TFA para el método Fmoc.
Como alternativa, el péptido se puede sintetizar utilizando técnicas recombinantes. En este caso, se usa un ácido nucleico y/o una construcción genética que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de acuerdo con la descripción. Por lo tanto, la presente descripción se refiere a un ácido nucleico y/o una construcción genética que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de acuerdo con la descripción. La construcción genética comprende un polinucleótido que codifica un péptido de acuerdo con la descripción como se define en el presente documento y las secuencias reguladoras (tales como uno o más promotores, potenciadores, terminadores, etc., adecuados), que permite la expresión (por ejemplo, la transcripción y traducción) de un péptido de acuerdo con la descripción en una célula huésped. De este modo, en otro aspecto, la descripción se refiere a un huésped o célula huésped que expresa (o que, en circunstancias adecuadas, es capaz de expresar) un péptido de la descripción; y/o que contiene un polinucleótido de la descripción o construcción genética de la descripción.
Con el fin de obtener el péptido que contiene D-aminoácido, el péptido puede coexpresarse con la epimerasa peptídica descrita en la presente descripción.
El método para producir el péptido puede comprender, opcionalmente, las etapas de purificación de dicho péptido, modificación química de dicho péptido y/o formulación de dicho péptido en una composición farmacéutica. Por ejemplo, el péptido descrito en el presente documento se puede preparar mediante técnicas recombinantes como una proteína de fusión con un péptido señal de secreción o un marcador de purificación. Este péptido señal de secreción o marcador de purificación se puede escindir o eliminar en una etapa adicional de producción.
En un objeto particular de la presente descripción, el método para preparar el péptido comprende proporcionar o sintetizar un péptido como se ha descrito anteriormente con los aminoácidos en configuración L y poner en contacto el péptido con una enzima (es decir, una epimerasa), convirtiendo de este modo al menos un aminoácido en configuración L en aminoácido en configuración D de dicho péptido, la epimerasa es como se define a continuación.
Epimerasa SAM radical
Los inventores han identificado una epimerasa SAM radical denominada YydG en Bacillus subtilis que es capaz de modificar la configuración de los aminoácidos contenidos en un péptido desde una configuración L a una configuración D. Esta enzima es capaz de llevar a cabo la conversión, incluso en condiciones in vitro. Su secuencia se muestra en la SEC ID n.° 18. Además, esta enzima no está relacionada con otras epimerasas conocidas, incluso dentro de la superfamilia de la enzima SAM de radicales.
Por lo tanto, la presente descripción se refiere a una epimerasa capaz de modificar la configuración de los aminoácidos contenidos en un péptido de una configuración L a una configuración D y que comprende una secuencia amino que tiene al menos un 30 % de identidad con la SEC ID n.° 25. Preferentemente, la epimerasa comprende una secuencia amino que tiene una identidad de al menos un 35, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97,5 o 99 % con la SEC ID n.° 25.
YydG de Bacillus subtilis se describe en bases de datos públicas con los siguientes números de identificación: UniProt Q45595; GenelD 937720; GenBank NP_391897.1 y NC_000964.3.
Según las enseñanzas de la presente divulgación, el experto en la técnica puede identificar otras enzimas de microorganismos que tienen la epimerasa SAM radical. El polipéptido se puede identificar y obtener de otras fuentes, incluyendo microorganismos aislados de la naturaleza (por ejemplo, tierra, abonos, agua, etc.) o muestras de ADN obtenidas directamente a partir de materiales naturales (por ejemplo, tierra, abonos, agua, etc.) usando las sondas. Las técnicas para aislar microorganismos y ADN directamente a partir de hábitats naturales son bien conocidas en la materia. Por tanto, un polinucleótido que codifica el polipéptido puede obtenerse mediante detección selectiva de forma similar de un ADN genómico o biblioteca de ADNc de otro microorganismo o muestra de ADN mixto. Una vez se ha detectado un polinucleótido que codifica un polipéptido, el polinucleótido puede aislarse o clonarse utilizando técnicas que son conocidas por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989). El experto en la técnica también podría usar las secuencias de datos ya disponibles en bases de datos. Además, el experto en la técnica puede preparar variantes de la epimerasa que tengan la secuencia de aminoácidos de la SEC ID n.° 25 mediante métodos utilizados actualmente. En particular, las variantes con propiedades ventajosas tales como un aumento de la estabilidad (por ejemplo, termoestabilidad), aumento de la producción de aminoácido en configuración D, modificación de la especificidad y/o la selectividad de la epimerasa, y similares.
Se divulgan secuencias 100 % idénticas en comparación con la SEC ID n.° 25 en Uniprot AOAOC2UHS5, AOAOA1MJP5 y L8AWU7. Otras cepas de Bacillus subtilis presentan secuencias con alta identidad (de hasta el 90 % de identidad) y se describen en las SEC ID n.os 26-29 y 32. Otras cepas de Bacillus presentan secuencias con alta identidad y se desvelan en las SEC ID n.os 30 y 33-35. Las secuencias con una identidad significativa se han identificado en Salinibacillus aidiingensis, Staphylococcus equorum, Staphylococcus pseudintermedius, Staphylococcus epidermidis, Paenibacillus sp, Enterococcus caccae, Enterococcus faecalis, Corynebacterium diphtheria, Streptococcus agalactiae y Bifidobacterium bohemicum y se divulgan en las SEC ID n.os 31, y 36-52. La Figura 6 muestra un alineamiento de las secuencias de las enzimas.
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Las posiciones en negrita y subrayadas están perfectamente conservadas entre la lista de secuencias desveladas anteriormente. Las posiciones en negrita y cursiva están conservadas entre grupos de propiedades fuertemente similares en la lista de secuencias desveladas anteriormente. Por consiguiente, se puede observar que, incluso si el porcentaje de identidad es de aproximadamente el 30 %, hay un alto número de aminoácidos que están perfectamente conservados y bien conservados.
Por consiguiente, en un aspecto preferido, la epimerasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 30 % de identidad con la SEC ID n.° 25 y en la que el 70, 80 o 90 % de las posiciones en negrita y subrayadas están conservadas cuando la secuencia está alineada con la SEC ID n.° 25 (posiciones 14-15, 18, 20-24, 27, 58-60, 63, 83, 84, 87-90, 112, 115, 117, 120, 150, 152, 169, 176, 180, 181, 183, 204, 206-208, 214, 217, 220-225, 228, 230, 252, 254, 262, 289, 292, 296, y 309 de la SEC ID n.° 25). Preferentemente, el 95 % de las posiciones en negrita y subrayadas están conservadas. En un aspecto particular, todas las posiciones en negrita y subrayadas están conservadas. Más preferentemente, el 90 o 95 % de las posiciones 14-15, 18, 20-24, 27, 58-60, 63, 83, 84, 87-90, 112, 115, 117, 120, 204, 206-208, 214, 217, 220-225, 228 y 230 de la SEC ID n.° 25 están conservadas en la secuencia de la epimerasa. En un aspecto particular, todas las posiciones 14-15, 18, 20-24, 27, 58-60, 63, 83, 84, 87-90, 112, 115, 117, 120, 204, 206-208, 214, 217, 220-225, 228 y 230 de la SEC ID n.° 25 están conservadas en la secuencia de la epimerasa.
En un aspecto preferido, la epimerasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 30 % de identidad con la SEC ID n.° 25 y uno o varios segmentos seleccionados de los segmentos 13-27, 56-63, 83-90, 112-120, y 204­ 230 tienen al menos un 50 % de identidad con la secuencia de SEC ID n.° 25. En este aspecto, la epimerasa tiene además, el 90 o 95 % de las posiciones 14-15, 18, 20-24, 27, 58-60, 63, 83, 84, 87-90, 112, 115, 117, 120, 204, 206­ 208, 214, 217, 220-225, 228 y 230 de la SEC ID n.° 25 están conservadas en la secuencia de la epimerasa.
En un aspecto particular, los restos de cisteína en las posiciones 14, 18, 21, 222 y 223 de la SEC ID n.° 25 están conservadas en la secuencia de la epimerasa.
En un aspecto, la epimerasa tiene una secuencia de aminoácidos que comprende, que consiste esencialmente en, o consiste en, una secuencia que tiene al menos un 80, 85, 90 o 95 % de identidad con una secuencia seleccionada entre SEC ID n.os 25-52, preferentemente entre las SEC ID n.os 25-30, 32 y 34, más preferentemente la SEC ID n.° 25. La epimerasa puede tener una secuencia de aminoácidos que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en, una secuencia seleccionada entre las SEC ID n.° 25-52, preferentemente entre las SEC ID n.os 25-30, 32 y 34, más preferentemente la SEC ID n.° 25; y que tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones, adiciones o deleciones.
Un método para analizar la capacidad de una epimerasa para modificar la configuración de los aminoácidos contenidos en un péptido de una configuración L a una configuración D se desvela, por ejemplo, en los detalles en la sección de ejemplos. Por ejemplo, se pone en contacto la epimerasa con un péptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID n.os 1-20 en presencia del cofactor de S-adenosil-L-metionina (SAM) y se detecta la producción de péptidos, incluyendo un aminoácido de configuración D. Más específicamente, la epimerasa se pone en contacto con el péptido YydF18-49 de SEC ID n.° 20 en presencia del cofactor de S-adenosil-L-metionina (SAM) y se detecta la producción de péptidos que incluyen un aminoácido de configuración D en la posición 19 y/o 27.
También se proporciona un polipéptido híbrido o el polipéptido de fusión en el que la secuencia de aminoácidos de la enzima como se ha definido anteriormente se fusiona en el extremo N-terminal o el C-terminal de una región de otro polipéptido. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión son conocidas en la técnica e incluyen ligar las secuencias de codificación que codifican la enzima y la región de adición de otro polipéptido de modo que estén en marco y que la expresión del polipéptido de fusión esté bajo el control del mismo promotor o promotores y terminador. Los polipéptidos de fusión también se pueden construir usando tecnología intein, en la que los polipéptidos de fusión se crean después de la traducción (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).
La región de adición del polipéptido de fusión se puede seleccionar con el fin de mejorar la estabilidad de la enzima de acuerdo con la presente divulgación, para estimular la secreción (tal como un péptido señal hidrofóbico en N-terminal) de la proteína de fusión de una célula (tal como una célula bacteriana o una célula de levadura), o para ayudar en la purificación de la proteína de fusión. Más particularmente, la región adicional puede ser un marcador útil para la purificación o inmovilización de la enzima. Tal marcador es bien conocido por el experto en la técnica, por ejemplo, un marcador His (His6), un marcador FLAG, un marcador HA (epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de Influenza), una proteína de unión a maltosa (MPB), un marcador de MYC (epítopo derivado de la proto-oncoproteína humana MYC), un marcador STREP o un marcador GST (glutatión-S-transferasa pequeña).
Un polipéptido de fusión puede comprender además un sitio de escisión entre la enzima y la región de adición. Tras la secreción de la proteína de fusión, el sitio se escinde y libera los dos polipéptidos. Ejemplos de sitios de escisión incluyen, pero no se limitan a, los sitios divulgados en Martin et al., 2003, J. Ind. Microbio!. Biotechnol. 3:568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76:245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbio!. 63:3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; y Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; y Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.
Se proporciona además una construcción de ácido nucleico recombinante o vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la epimerasa como se ha definido anteriormente. Más particularmente, la construcción de ácido nucleico o vector es adecuada para expresar dicha epimerasa. Además, se proporciona una célula huésped recombinante que comprende un ácido nucleico, una construcción de ácido nucleico recombinante o un vector recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la epimerasa como se ha definido anteriormente.
Construcciones de ácido nucleico
De hecho, la presente descripción se refiere a un polinucleótido que codifica una epimerasa de la presente descripción. El ácido nucleico puede ser ADN (ADNc o ADNg), ARN, o una mezcla de los dos. Puede ser en forma de cadena simple o en forma de dúplex o una mezcla de los dos. Puede comprender nucleótidos modificados, que comprenden, por ejemplo, un enlace modificado, una base de purina o pirimidina modificada, o un azúcar modificado. Se puede preparar por cualquier método conocido para un experto en la técnica, incluyendo la síntesis química, recombinación y mutagénesis.
La presente descripción también se refiere a construcciones de ácidos nucleicos que comprenden un polinucleótido que codifica una epimerasa de acuerdo con la presente descripción unida operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia de codificación en una célula huésped adecuada en condiciones compatibles con las secuencias de control. Un polinucleótido se puede manipular de diversas maneras para proporcionar la expresión de la epimerasa. La manipulación del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar polinucleótidos utilizando métodos de ADN recombinante son bien conocidas en la técnica.
La secuencia de control puede incluir un promotor que es reconocido por una célula huésped o un sistema de expresión in vitro para la expresión de un polinucleótido que codifica una epimerasa de la presente descripción. El promotor contiene secuencias de control de la transcripción que participan en la expresión de la epimerasa. El promotor puede ser cualquier polinucleótido que muestra actividad transcripcional en la célula huésped, incluyendo promotores mutantes, truncados e híbridos, y puede obtenerse a partir de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares, bien homólogos o heterólogos de la célula huésped. Opcionalmente, el promotor puede ser inducible.
Ejemplos de promotores adecuados en una célula huésped bacteriana son los promotores obtenidos a partir del gen de la alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), el gen de la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), el gen de la penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP), el gen de la amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM), el gen de la levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB), los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, el gen crylllA de Bacillus thuringiensis (Agaisse y Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), el operón lac de E. coli, el promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), el gen de la agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA) y el gen procariótico de beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25). Otros promotores se describen en “Useful proteins from recombinant bacteria” en Gilbert et al., 1980, Scientific American 242, 74-94; y en Sambrook et al., 1989. Ejemplos de promotores en tándem se divulgan en el documento WO 99/43835.
Ejemplos de promotores adecuados en una célula huésped de hongo filamentoso son promotores obtenidos de los genes para acetamidasa de Aspergillus nidulans, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable a los ácidos de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger o Aspergillus awamori (glaA), TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, proteasa similar a tripsina de Fusarium oxysporum (WO96/00787), amilglucosidasa de Fusarium venenatum (Wo 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipasa de Rhizomucor miehei, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, así como el promotor NA2-tpi (un promotor modificado a partir de un gen de alfa-amilasa neutra de Aspergillus en el que la secuencia líder no traducida ha sido reemplazada por una secuencia líder no traducida de un gen de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus; ejemplos no limitantes incluyen promotores modificados del gen de alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, en el que la secuencia líder no traducida se ha sustituido por una secuencia líder no traducida de un gen de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae; y promotores mutantes, truncados, e híbridos de los mismos.
En un huésped de levadura, los promotores útiles se obtienen de los genes para la enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactoquinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP), triosa fosfato isomerasa de Saccharomyces cerevisiae (TPI), metalotioneína de Saccharomyces cerevisiae (CUP1), y 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para las células huésped de levadura los describen Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.
La secuencia de control también puede ser un terminador de la transcripción, que es reconocido por una célula huésped para terminar la transcripción. El terminador está unido operativamente al extremo 3' del polinucleótido que codifica el polipéptido. Cualquier terminador que sea funcional en la célula huésped se puede usar en la presente descripción.
Los terminadores preferidos para las células huésped bacterianas se obtienen de los genes para la proteasa alcalina de Bacillus clausii (aprH), alfa amilasa de Bacillus licheniformis (amyL) y ARN ribosómico de Escherichia coli (rrnB).
Los terminadores preferidos para células huésped de hongos filamentosos se obtienen a partir de los genes para antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.
Los terminadores preferidos para las células huésped de levadura se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para las células huésped de levadura los describen Romanos et al., 1992, anteriormente citado.
La secuencia de control también puede ser una región estabilizadora de ARNm aguas abajo de un promotor y aguas arriba de la secuencia de codificación de un gen que aumenta la expresión del gen.
Se obtienen ejemplos de regiones estabilizadoras de ARNm adecuadas a partir de un gen de crylllA de Bacillus thuringiensis (documento WO 94/25612) y un gen de SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).
La secuencia de control también puede ser una líder, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula huésped. La líder está unida operativamente al extremo 5' del polinucleótido que codifica la epimerasa. Se puede usar cualquier líder que sea funcional en la célula huésped.
Las líderes preferentes para las células huésped de hongos filamentosos se obtienen a partir de los genes TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.
Las líderes adecuadas para las células huésped de levadura se obtienen de los genes de la enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae, factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).
La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia unida operativamente al extremo 3' del polinucleótido que codifica la epimerasa y, cuando se transcribe, es reconocida por la célula huésped como una señal para añadir restos de poliadenosina al ARNm transcrito. Se puede usar cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula huésped.
Las secuencias de poliadenilación preferidas para células huésped de hongos filamentosos se obtienen de los genes para la antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.
Las secuencias de poliadenilación útiles para células huésped de levadura están descritas por Guo y Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.
La secuencia de control también puede ser una región de codificación del péptido señal que codifica un péptido señal unido al extremo N de la epimerasa y dirige la epimerasa dentro de la ruta secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia de codificación del polinucleótido puede contener inherentemente una secuencia de codificación del péptido señal unida naturalmente en el marco de lectura de traducción con el segmento de la secuencia de codificación que codifica la epimerasa. Como alternativa, el extremo 5' de la secuencia de codificación puede contener una secuencia de codificación del péptido señal que es extraña a la secuencia de codificación. Puede requerirse una secuencia de codificación del péptido señal extraño cuando la secuencia de codificación no contiene naturalmente una secuencia de codificación del péptido señal. Como alternativa, una secuencia de codificación del péptido señal extraño puede simplemente reemplazar la secuencia de codificación del péptido señal natural para potenciar la secreción del polipéptido. Sin embargo, puede usarse cualquier secuencia de codificación de péptido señal que dirija el polipéptido expresado a la ruta secretora de una célula huésped.
Las secuencias de codificación del péptido señal eficaz para las células huésped bacterianas son las secuencias de codificación del péptido señal obtenidas de los genes para Bacillus NCIB 11837 de la amilasa maltogénica, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, proteasas neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) y prsA de Bacillus subtilis. Otros péptidos señal están descritos por Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.
Las secuencias de codificación del péptido señal eficaces para células huésped de hongos filamentosos son las secuencias de codificación del péptido señal obtenidas de los genes para amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, celulosa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens, lipasa de Humicola lanuginosa y proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei.
Los péptidos señal útiles para las células huésped de levadura se obtienen a partir de los genes para el factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y la invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras secuencias de codificación de péptidos señal útiles están descritas por Romanos et al., 1992, anteriormente citado.
También puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que regulan la expresión del polipéptido en relación con el crecimiento de la célula huésped. Los ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que hacen que la expresión del gen se active o desactive en respuesta a un estímulo químico o físico, incluida la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en sistemas procariotas incluyen los sistemas de operador lac, tac y trp. En levaduras, se puede usar el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En hongos filamentosos, pueden usarse el promotor de la glucoamilasa de Aspergillus niger, el promotor de la alfa-amilasa TAKA de Aspergillus oryzae, y el promotor de la glucoamilasa de Aspergillus oryzae. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación génica. En los sistemas eucariotas, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de dihidrofolato reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato y los genes de metalotioneína que se amplifican con metales pesados. En estos casos, el polinucleótido que codifica el polipéptido estaría operativamente unido a la secuencia reguladora.
Vectores de expresión
La presente descripción también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden una construcción de ácido nucleico como se ha desvelado anteriormente, o un polinucleótido que codifica una epimerasa de presente descripción, un promotor y señales de terminación de la transcripción y la traducción. Las diversas secuencias de nucleótidos y de control pueden estar unidas entre sí para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido que codifica la epimerasa en tales sitios. Como alternativa, el polinucleótido puede expresarse mediante la inserción del polinucleótido o una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido en un vector apropiado para la expresión.
En un aspecto particular, el vector de expresión puede comprender además un polinucleótido que codifica un péptido de la presente descripción como se ha descrito anteriormente, unido operativamente con las secuencias de control necesarias para su expresión. Más particularmente, las secuencias de control utilizadas para la expresión de la epimerasa y el péptido de la presente descripción son adecuadas para la coexpresión en una célula huésped. Opcionalmente, el polinucleótido que codifica el péptido y el polinucleótido que codifica la epimerasa puede estar bajo el control de un único promotor (es decir, operón) o de dos promotores que pueden ser el mismo o diferente.
Como alternativa, la presente descripción se refiere a un kit que comprende un primer vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una epimerasa de la presente descripción y un segundo vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un péptido de la presente descripción. En otra alternativa, el kit puede comprender un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una epimerasa de la presente descripción y un ácido nucleico que codifica un péptido de la presente descripción.
En la creación del vector de expresión, la secuencia de codificación se localiza en el vector de modo que la secuencia de codificación está operativamente unida a las secuencias de control apropiadas para la expresión.
El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que puede ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante y puede provocar la expresión del polinucleótido. La elección del vector normalmente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que se va a introducir el vector. El vector puede ser un plásmido lineal o circular cerrado.
El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un mini-cromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Como alternativa, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica junto con el o los cromosomas en que se ha integrado. Adicionalmente, se pueden usar un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total a introducir en el genoma de la célula huésped o un transposón.
El vector contiene preferentemente uno o más marcadores seleccionables que permiten la selección fácil de células transformadas, transfectadas, transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia biocida o vírica, resistencia a metales pesados, prototrofía a auxotrofia, y similares.
Ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son genes de Bacillus licheniformis o Bacillus subtilis o marcadores que confieren resistencia a los antibióticos tales como resistencia a ampicilina, cloranfenicol, kanamicina, neomicina, espectinomicina o tetraciclina. Los marcadores adecuados para células huésped de levadura incluyen, pero no se limitan a, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 y URA3. Los marcadores seleccionables para su uso en una célula huésped de hongo filamentoso incluyen, pero no se limitan a, amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa), bar (fosfinotricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidin-5'-fosfato descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa) y trpC (antranilato sintasa), así como equivalentes de los mismos. De uso preferente en una célula de Aspergillus son los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y un gen de Streptomyces hygroscopicus.
El vector contiene, preferentemente, un elemento o elementos que permiten la integración del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.
Cuando se produce la integración en el genoma de la célula huésped, la integración de las secuencias en el genoma puede basarse en la recombinación homóloga o no homóloga. Como alternativa, el vector puede contener polinucleótidos adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped en una o más ubicaciones precisas en el o los cromosomas. Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integracionales deberían contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como de 100 a 10.000 pares de bases, de 400 a 10.000 pares de bases, y de 800 a 10.000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad de secuencia con la secuencia diana correspondiente para mejorar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga con la secuencia diana en el genoma de la célula huésped. Adicionalmente, los elementos integracionales pueden ser polinucleótidos no codificantes o codificantes. Por otro lado, el vector puede integrarse en el genoma de la célula huésped por recombinación no homóloga.
Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permite al vector replicarse de manera autónoma en la célula huésped en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador plasmídico que medie la replicación autónoma que funciona en una célula. La expresión “origen de replicación” o “replicador plasmídico” significa un polinucleótido que permite que un plásmido o vector se replique in vivo. Ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177, y pACYC184 que permiten la replicación en E. coli, y pUB1 10, pE194, pTA1060, y pAMpI que permiten la replicación en Bacillus. Ejemplos de orígenes de replicación para su uso en una célula huésped de levadura son el origen de replicación de 2 micrómetros, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6. Ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula de hongo filamentoso son AMA1 y ANSI (Gems et al., 1991, Gene 98:61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15:9163-9175; WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen se puede lograr de acuerdo con los métodos desvelados en el documento WO 00/24883.
Más de una copia de un polinucleótido de la presente descripción se puede insertar en una célula huésped para aumentar la producción de un polipéptido. Un aumento en el número de copias del polinucleótido puede obtenerse integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o incluyendo un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido donde las células que contienen copias del gen marcador seleccionable amplifican, y, de ese modo, copias adicionales del polinucleótido, pueden seleccionarse para cultivar las células en presencia del agente seleccionable apropiado.
Los procedimientos usados para enlazar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente descripción son bien conocidos para un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, citado anteriormente).
Células huésped
La presente descripción también se refiere a células huésped recombinantes que comprenden un polinucleótido que codifica una epimerasa de acuerdo con la presente divulgación unido operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la producción de la epimerasa de la presente descripción. Una construcción o vector que comprende un polinucleótido que codifica una epimerasa de acuerdo con la presente divulgación se introduce en una célula huésped de modo que la construcción o vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante como se ha descrito anteriormente.
La presente descripción se refiere además a una célula huésped recombinante que comprende además un polinucleótido que codifica un péptido de acuerdo con la presente divulgación unido operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la producción del péptido. En particular, la célula huésped puede coexpresar la epimerasa y el péptido de acuerdo con la presente divulgación. En este aspecto, la célula huésped produce tanto un péptido de la presente descripción como la epimerasa que es capaz de modificar el péptido antimicrobiano cambiando la configuración del aminoácido del péptido de una configuración L a una configuración D.
En un aspecto preferido, la célula huésped comprende un ácido nucleico que codifica una epimerasa de la presente descripción heteróloga a la célula huésped. En un aspecto preferido alternativo, la célula huésped comprende un ácido nucleico que codifica un péptido heterólogo a la célula huésped. En otro aspecto preferido, la célula huésped comprende ácidos nucleicos que codifican un péptido y una epimerasa, ambos heterólogos de la célula huésped.
La expresión “célula huésped” abarca cualquier progenie de una célula parental que no es idéntica a la célula parental debido a mutaciones que se producen durante la replicación. La elección de una célula huésped en gran parte dependerá del gen que codifica el polipéptido y su fuente.
La célula huésped puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de una epimerasa de la presente descripción, por ejemplo, un procariota o un eucariota.
La célula huésped procariota puede ser cualquier bacteria grampositiva o gramnegativa. Las bacterias Grampositivas incluyen, pero no se limitan a, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus y Streptomyces. Las bacterias Granegativas incluyen, pero no se limitan a, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella y Ureaplasma. La célula huésped bacteriana puede ser cualquier célula de Bacillus, que incluye, pero no se limita a, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis y Bacillus thuringiensis. La célula huésped bacteriana puede ser cualquier célula de Streptococcus, que incluye, pero no se limita a, Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, Streptococcus equi y Streptococcus zooepidemicus. La célula huésped bacteriana puede ser, además, cualquier célula de Streptomyces, que incluye, pero no se limita a, Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus y Streptomyces lividans.
La introducción de ADN en una célula de Bacillus puede efectuarse mediante transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Chang y Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformación de células competentes (véase, por ejemplo, Young y Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), electroporación (véase, por ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), o conjugación (véase, por ejemplo, Koehler y Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). La introducción de ADN en una célula de E. coli puede efectuarse mediante transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol.
166: 557-580), o electroporación (véase, por ejemplo, Dower et al, 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). La introducción de ADN en una célula de Streptomyces puede efectuarse mediante transformación de protoplastos, electroporación (véase, por ejemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugación (véase, por ejemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), o transducción (véase, por ejemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 6289-6294). La introducción de ADN en una célula de Pseudomonas se puede efectuar mediante electroporación (véase, por ejemplo, Choi et al 2006 J. Microbiol. Methods 64: 391-397) conjugación (véase, por ejemplo, Pinedo y Smets, 2005, Appl. Environ. Microbio!. 71: 51-57). La introducción de ADN en una célula de Streptococcus puede efectuarse mediante competencia natural (véase, por ejemplo, Perry y Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Catt y Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), electroporación (véase, por ejemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) o conjugación (véase, por ejemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45, 409-436). Sin embargo, puede usarse cualquier método conocido en la técnica para introducir ADN en una célula huésped.
La célula huésped también puede ser una célula eucariota, tal como una célula de mamífero, insecto, planta u hongo. La célula huésped puede ser una célula fúngica. “Hongos”, tal como se usa en el presente documento incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota, así como Oomycota y todos los hongos mitospóricos (como definen Hawksworth et al., en Ainsworth y Bisby's Dictionary of The Fungi, 8a edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido). La célula huésped fúngica puede ser una célula de levadura. “Levadura”, como se usa en el presente documento, incluye levadura ascoesporógena (Endomycetales), levadura basidiosporógena y levadura perteneciente a Fungi imperfecti (Blastomycetes). Dado que la clasificación de la levadura puede cambiar en el futuro, para los fines de la presente descripción, se definirá la levadura como se describe en “Biology and Activities of Yeast” (Skinner, Passmore, y Davenport, editors, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980). La célula huésped de levadura puede ser una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia, tal como una célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis o Yarrowia lipolytica. La célula huésped fúngica puede ser una célula de hongo filamentoso. Los “hongos filamentosos” incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como definen Hawksworth et al., 1995, citado anteriormente). Los hongos filamentosos generalmente se caracterizan por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. La célula huésped de hongo filamentoso puede ser una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes o Trichodermal. Por ejemplo, la célula huésped de hongo filamentoso puede ser una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium gueenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.
Las células fúngicas pueden transformarse mediante un proceso que implica la formación de protoplastos, transformación de los protoplastos y regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Los procedimientos adecuados para la transformación de células huéspedes de Aspergillus y Trichoderma se describen en el documento EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, y Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Los métodos adecuados para transformar especies de Fusarium se describen en Malardier et al, 1989, Gene 78: 147-156 y el documento WO 96/00787. La levadura puede ser transformada usando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. y Simon, M.I., editores, “Guide to Yeast Genetics y Molecular Biology, Methods in Enzymology”, Volumen 194, pág. 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1920.
La célula también puede ser una célula de mamífero, por ejemplo, COS, CHO (US 4.889.803; US 5.047.335). En un aspecto particular, la célula es no humana y no embrionaria. Además, un animal transgénico no humano podría producir la epimerasa de la descripción, por ejemplo en la leche producida por el animal.
La célula puede ser una célula vegetal. Por tanto, la epimerasa de la descripción podría ser producto de una planta transgénica.
Como alternativa, también se proporciona un método para producir una epimerasa de acuerdo con la presente descripción, que comprende cultivar la célula huésped como se ha definido anteriormente, en condiciones que conducen a la producción de la epimerasa y recuperar y/o purificar la epimerasa. Como alternativa, también se proporciona un método para producir una epimerasa de acuerdo con la presente descripción, que comprende la expresión in vitro de la epimerasa con un ácido nucleico que codifica la epimerasa como se ha definido anteriormente. Opcionalmente, el método comprende además una etapa de inmovilización de la epimerasa en un soporte sólido.
La enzima puede recuperarse usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la enzima puede recuperarse del medio nutritivo por procedimientos convencionales, que incluyen, pero no se limitan a, recolección, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación.
La enzima se puede purificar mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, hidrofóbica, cromatoenfoque y de exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, enfoque isoeléctrico preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación con sulfato amónico), SDS-PAGE o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, Janson y Ryden, editores, VCH Publishers, New York, 1989) para obtener polipéptidos sustancialmente puros. En un aspecto alternativo, la enzima no se recupera, sino más bien una célula huésped de la presente descripción que expresa la enzima se utiliza como fuente de la enzima.
También se proporciona una composición o un kit que comprende la epimerasa aislada o recombinante como se ha definido anteriormente. En particular, la composición o kit pueden incluir hierro (por ejemplo, (NH4)2Fe(SO4)2) y azufre (por ejemplo, Na2S) como aditivos enzimáticos y un agente reductor, tal como ditiotreitol o beta-mercaptoetanol. Además, la composición puede incluir S-adenosil L-metionina (SAM), el cofactor de la enzima o metionina y ATP en presencia de sintasa SAM. Opcionalmente, la epimerasa puede inmovilizarse sobre un soporte sólido.
La presente descripción se refiere también al uso de una epimerasa como se ha definido anteriormente, una composición, un kit o soporte sólido que comprende la epimerasa, o una célula huésped recombinante que comprende un ácido nucleico, una construcción de ácido nucleico recombinante o un vector recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la epimerasa como se ha definido anteriormente, para producir el péptido con aminoácidos de configuración D.
Uso de la epimerasa para convertir L-aminoácido en D-aminoácido en un péptido
Por consiguiente, la presente descripción se refiere al uso de una epimerasa de la descripción para convertir un L-aminoácido en D-aminoácido en un péptido. También se refiere a un método para convertir L-aminoácido en D-aminoácido en un péptido que comprende poner en contacto una epimerasa de la presente descripción con el péptido y, opcionalmente, recuperar el péptido con al menos un aminoácido convertido desde una configuración L a una configuración D.
En un aspecto preferido, la presente descripción se refiere a un método para preparar un péptido de acuerdo con la presente descripción, en el que el procedimiento comprende una etapa de poner en contacto un péptido de acuerdo con la presente descripción con una epimerasa como se ha definido anteriormente. Se refiere también a la utilización de una epimerasa como se ha definido anteriormente para preparar un péptido de acuerdo con la presente descripción. En particular, el péptido puede tener cualquier secuencia particular como se ha definido anteriormente. Preferentemente, el método se lleva a cabo in vitro. En un primer aspecto, el péptido comprende una secuencia de 17 restos que tiene al menos un 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 33 a 49 de la SEC ID n.° 1 y dicha secuencia comprende las secuencias W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 71) y W-[lN/A]-X4-G-S (SEC ID n.° 69), en las que X4 es cualquier aminoácido, y una secuencia de unión entre la SEC ID n.° 69 y la SEC ID n.° 71 de 4-8 aminoácidos. En un segundo aspecto, el péptido comprende una secuencia de 24 residuos que tienen al menos un 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 26 a 49 de la SEC ID n.° 1, y comprende las secuencias de N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21) and W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 22), en la que X4 es cualquier aminoácido.
Para finalizar, la presente descripción se refiere a un método para preparar un péptido de acuerdo con la presente descripción, en el que el método comprende cultivar una célula huésped recombinante de acuerdo con la presente descripción en condiciones adecuadas para la coexpresión del péptido y la epimerasa y recuperar el péptido que tiene al menos un aminoácido con configuración D. Preferentemente, el método se lleva a cabo ex vivo. También se refiere al uso de una célula huésped recombinante de acuerdo con la presente descripción para la preparación de un péptido como se ha definido anteriormente.
En un aspecto particular, las fuentes de epimerasa y péptido pueden coincidir. Por ejemplo, una epimerasa a partir de Bacillus subtilis se podría utilizar, preferentemente, para preparar un péptido a partir de Bacillus subtilis o derivado del mismo. En este aspecto concreto, si el péptido como se ha definido anteriormente comprende una secuencia que tiene al menos un 80, 85, 90 o 95 % de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEC ID n.° 1-5 o un fragmento de la misma de al menos 24 restos consecutivos, la epimerasa elegida tendrá al menos un 80, 85, 90 o 95 % de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEC ID n.os 25-35. Si el péptido como se ha definido anteriormente comprende una secuencia que tiene al menos un 80, 85, 90 o 95 % de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEC ID n.° 6-9 o un fragmento de la misma de al menos 24 restos consecutivos, la epimerasa elegida tendrá al menos un 80, 85, 90 o 95 % de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEC ID n.os 36-38. Si el péptido como se ha definido anteriormente comprende una secuencia que tiene al menos un 80, 85, 90 o 95 % de identidad con una secuencia de la SEC ID n.° 10 o un fragmento de la misma de al menos 24 restos consecutivos, la epimerasa elegida tendrá al menos un 80, 85, 90 o 95 % de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEC ID n.os 39­ 40. Si el péptido como se ha definido anteriormente comprende una secuencia que tiene al menos un 80, 85, 90 o 95 % de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEC ID n.° 11-13 y 17-18 o un fragmento de la misma de al menos 24 restos consecutivos, la epimerasa elegida tendrá al menos un 80, 85, 90 o 95 % de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEC ID n.os 41-50. Si el péptido como se ha definido anteriormente comprende una secuencia que tiene al menos un 80, 85, 90 o 95 % de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEC ID n.° 14-16 o un fragmento de la misma de al menos 24 restos consecutivos, la epimerasa elegida tendrá al menos un 80, 85, 90 o 95 % de identidad con una secuencia de la SEC ID n.° 51. Si el péptido como se ha definido anteriormente comprende una secuencia que tiene al menos un 80, 85, 90 o 95 % de identidad con una secuencia de la SEC ID n.° 19 o un fragmento de la misma de al menos 24 restos consecutivos, la epimerasa elegida tendrá al menos un 80, 85, 90 o 95 % de identidad con una secuencia de la SEC ID n.° 52.
Definiciones
Aproximadamente: Cuando se usa en el presente documento, “aproximadamente” significa más o menos 10 %, preferentemente más o menos 5 %. Por ejemplo, aproximadamente 100 significa entre 90 y 110, preferentemente entre 95 y 105.
“Consiste en”, “consiste esencialmente en” o “comprende sustancialmente”: La descripción en el presente documento de cualquier aspecto de la descripción que usa términos tales como la referencia a un elemento o elementos pretende proporcionar soporte para un aspecto similar de la descripción que “consiste en”, “consiste esencialmente en” o “comprende sustancialmente” ese elemento o elementos particulares, a menos que se establezca lo contrario o se contradiga claramente con el contexto. Por ejemplo, debe entenderse que un péptido o proteína descrito en el presente documento como que comprende una secuencia particular debe entenderse que también describe un péptido o proteína que consiste en esa secuencia, a menos que se establezca lo contrario o se contradiga claramente con el contexto. Por “consiste esencialmente en” se entiende que el péptido o proteína consiste en esa secuencia, pero también puede incluir 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones, adiciones o deleciones. En particular, por “esencialmente consiste en”, se puede pretender que el péptido pueda incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos adicionales en el extremo N o C y 1, 2 o 3 sustituciones, deleciones o adiciones.
Secuencia de codificación: la expresión “secuencia de codificación” significa un polinucleótido, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Los límites de la secuencia de codificación generalmente están determinados por un marco de lectura abierto, que comienza con un codón de iniciación, tal como ATG, GTG o TTG y termina con un codón de terminación, tal como TAA, TAG o TGA. La secuencia de codificación puede ser un ADN genómico, ADNc, ADN sintético o una combinación de los mismos.
Secuencias de control: la expresión “secuencias de control” significa secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión de un polinucleótido que codifica una epimerasa de la presente descripción. Las secuencias de control pueden ser nativas (es decir, del mismo gen) o heterólogas (es decir, de un gen diferente y/o una especie diferente) al polinucleótido que codifica la epimerasa. Preferentemente, las secuencias de control son heterólogas. Se preferirán secuencias de control bien conocidas y usadas actualmente por los expertos en la técnica. Dichas secuencias de control incluyen, pero no se limitan a, una secuencia líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de propéptido, promotor, secuencia de péptido señal y terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de terminación de la transcripción y la traducción. Las secuencias de control pueden proporcionarse con enlazadores con el fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la unión de las secuencias de control con la región de codificación del polinucleótido que codifica la epimerasa. La combinación funcional de las secuencias de control y las secuencias de codificación se puede denominar casete de expresión.
Expresión: el término “expresión” incluye cualquier etapa implicada en la producción de un polipéptido, que incluye, pero no se limita a, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción.
Vector de expresión: La expresión “vector de expresión” significa una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica la epimerasa de la descripción y está operativamente unida a las secuencias de control que proporcionan su expresión. Por tanto, el vector de expresión comprende un casete de expresión adecuado para expresar la epimerasa de la descripción.
Aislado: El término “aislado” significa una sustancia en una forma o entorno que no se produce en la naturaleza. Los ejemplos no limitantes de sustancias aisladas incluyen (1) cualquier sustancia no natural, (2) cualquier sustancia que incluye, pero no se limita a, cualquier enzima, variante, ácido nucleico, proteína, péptido o cofactor, que se extrae al menos parcialmente de uno o más o de todos los constituyentes naturales con los que está asociado en la naturaleza; (3) cualquier sustancia modificada por la mano del hombre relacionada con esa sustancia que se encuentra en la naturaleza; o (4) cualquier sustancia modificada aumentando la cantidad de la sustancia en relación con otros componentes con los que está asociada naturalmente (por ejemplo, copias múltiples de un gen que codifica la sustancia; uso de un promotor más fuerte que el promotor asociado naturalmente con el gen que codifica la sustancia).
Recombinante: Recombinante se refiere a una construcción de ácido nucleico, un vector y una proteína producidos por ingeniería genética.
Heterólogo: en el contexto de una célula huésped, un vector o una construcción de ácido nucleico, designa una secuencia de codificación para la epimerasa/péptido introducido en la célula huésped, el vector o la construcción de ácido nucleico mediante ingeniería genética. En el contexto de una célula huésped, puede significar que la secuencia de codificación para la epimerasa/péptido proviene de una fuente diferente de la célula en la que se introduce. Por ejemplo, una epimerasa de Bacillus subtilis se expresa en E. coli. Como alternativa, también puede significar que la secuencia de codificación para la epimerasa/péptido proviene de la misma especie que la célula en la que se introduce, pero se considera heteróloga debido a su entorno que no es natural, por ejemplo, porque está bajo el control de un promotor que no es su promotor natural, o se introduce en un lugar que difiere de su ubicación natural.
Construcción de ácido nucleico: La expresión “construcción de ácido nucleico” significa una molécula de ácido nucleico, ya sea de cadena sencilla o bicatenaria, que se modifica para que contenga segmentos de ácidos nucleicos de una manera que, de otro modo, no existiría en la naturaleza o que es sintética, lo cual comprende una o más secuencias de control.
Unido operativamente: La expresión “operativamente unido” significa una configuración en la que una secuencia de control se coloca en una posición apropiada con respecto a una secuencia de codificación, de tal manera que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia de codificación.
Identidad de secuencia: La identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se describe mediante el parámetro “identidad de secuencia”. Para los fines de la presente descripción, el “porcentaje de identidad” entre dos secuencias de aminoácidos (A) y (B) se determina comparando las dos secuencias alineadas de una manera óptima, a través de una ventana de comparación. Dicha alineación de secuencias puede llevarse a cabo mediante métodos bien conocidos, por ejemplo, usando el algoritmo para la alineación global de Needleman-Wunsch. El software de análisis de proteínas aparea secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluidas sustituciones conservadoras de aminoácidos. Una vez que se obtiene la alineación total, se puede obtener el porcentaje de identidad dividiendo el número completo de restos de aminoácidos idénticos alineados por el número total de restos contenidos en la secuencia más larga entre la secuencia (A) y (B).
La identidad de secuencia se determina típicamente usando un software de análisis de secuencia. Para comparar dos secuencias de aminoácidos, se puede usar, por ejemplo, la herramienta “Emboss needle” para la alineación secuencial por pares de proteínas que proporciona EMBL-EBI y disponible en:
www.ebi.ac.uk/Tools/services/web/toolform.ebi?tool=emboss_needle&context=protein,
usando las configuraciones predeterminadas: (I) Matriz: BLOSUM62, (ii) Hueco abierto: 10, (iii) extensión de hueco: 0,5, (iv) formato de salida: par, (v) penalización por hueco final: falso, (vi) apertura de hueco final: 10, (vii) extensión de hueco final: 0,5.
Como alternativa, la identidad de secuencia también puede determinarse típicamente utilizando el software de análisis de secuencias Clustal Omega utilizando el algoritmo HHalign y su configuración predeterminada como motor de alineación central. El algoritmo se describe en Soding, J. (2005) 'Protein homology detection by HMM-HMM comparison'. Bioinformatics 21, 951-960, con las configuraciones predeterminadas.
Aminoácidos: Las secuencias de aminoácidos definidas en el presente documento están representadas por un símbolo de una letra como se muestra a continuación: A, Ala, (alanina); R, Arg, (arginina); N, Asn, (asparagina); D, Asp, (ácido aspártico); C, Cys, (cisteína); Q, Gln, (glutamina); E, Glu, (ácido glutámico); G, Gly, (glicina); H, His, (histidina); I, Ile, (isoleucina); L, Leu, (leucina); K, Lys, (lisina); M, Met, (metionina); F, Phe, (fenilalanina); P, Pro, (prolina); S, Ser, (serina); T, Thr, (treonina); W, Trp, (triptófano); Y, Tyr, (tirosina); y V, Val, (valina).
Conservados: Por aminoácido conservado se entiende que una secuencia definida se alinea con la secuencia de referencia y el resto de la secuencia definida que corresponde a la posición indicada en la secuencia de referencia es idéntico al resto presente en la secuencia de referencia. La alineación puede realizarse por cualquier método disponible y, en particular, por el método desvelado para la determinación de identidad justo anteriormente, más preferentemente mediante Clustal Omega. La posición del resto se indica en la secuencia de referencia.
El término “antimicrobiano” como se emplea en el presente documento se refiere a una actividad antibacteriana, antivírica, antifúngica y/o antiparasitaria. Dicha actividad puede evaluarse midiendo diferentes parámetros, tales como la CI50 o CIM.
“CI50” o “concentración inhibidora semimáxima” es la concentración de una sustancia necesaria para reducir a la mitad el crecimiento in vitro de una población de microorganismos.
“CIM” o “concentración inhibitoria mínima” es la concentración más baja de una sustancia que inhibirá totalmente el crecimiento microbiano después de 18 horas de incubación, generalmente a 37 °C, en presencia de dicha sustancia.
La expresión “concentración letal, 50 %” o “CL 50 ” como se emplea en el presente documento se refiere a la concentración de sustancia requerida para matar a la mitad de una población. La CL 50 es un indicador cuantitativo de la toxicidad de una sustancia. En particular, la CL 50 se emplea en el presente documento para evaluar la actividad citolítica de AMP y, en este caso, corresponde a la concentración de péptidos que induce la lisis de la mitad de la población celular.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Purificación, análisis espectroscópico y actividad de YydG. (Figura 1A) (Estructura del operón yydFGHIJ. yydF: péptido putativo, yydG: enzima SAM radical, yydH: proteasa, yydlJ transportador de tipo ABC. (Figura 1B) Análisis de electroforesis en gel de YydG purificado expresado en E. coli. (Figura 1C) Espectro UV-visible de YydG reconstituido anaeróbicamente. (Figura 1D) Múltiples alineaciones de homólogos de YydF cercanos hallados, en particular, en B. subtilis y especies de Staphylococci. (Figura 1E) Análisis HPLC de escisión con SAM (257 nm) y péptidos (Figura 1F) producidos en la reacción (280 nm) después de 4 horas de incubación en condiciones anaeróbicas en presencia o ausencia de ditionito de sodio (2 mM). (Figura 1G) Curso de tiempo para la producción de 5'-dA (■, y péptidos modificados (♦ ) cuantificado mediante HPLC de fase inversa y monitorizado mediante detección de UV-visible (280 nm). YydG (100 μM) se incubó en condiciones anaeróbicas con ditionito de sodio (2 mM) en presencia de 1 mM de sustrato YydFi8-49. (Figura 1H e I) Análisis por HPLC de YydG incubado con (Figura 1H) YydF o (Figura 1I) una versión truncada de YydF18-49. YydG, después de reconstitución anaeróbica, se incubó en condiciones anaerobias en presencia de DTT (6 mM) y SAM (1 mM) con o sin ditionito de sodio (2 mM).
Figura 2 - YydG cataliza la transferencia de átomo de H a la cadena principal del péptido. El mapeo de péptidos trípticos y el análisis LC-MS de (Figura 2A) YydF18-49 o (Figura 2B) YydF18-49 tras la incubación con YydG. Los números indican el valor m/z para cada péptido. La secuencia en negrita indica el péptido relevante identificado por LC-MS (es decir, el Péptido 1: NH 2 -GLLDESQK, [M+H]+ = 931,48; Péptido 2: VNDLWYF [M+2H]2+=592,31; Péptido 3: W IlGs GH-Ac, [M+H]+ = 768,41). (Figura 2C) Análisis LC-MS del péptido YydF18-49 después de la incubación con YydG en tampón deuterado. (Figura 2D) Mapeo de péptidos trípticos y análisis de LC-MS de YydF18-49 después de la incubación con YydG en tampón deuterado.
Figura 3 - YydG cataliza epimerización de aminoácidos. Análisis LC-MS/MS de una (Figura 3A) L-Ile/D-allo-Ile y (Figura 3B) L-/D-Val (trazados superiores) en comparación con los aminoácidos obtenidos después de la incubación de YydF18-49 con la enzima rSAM YydG en tampón deuterado (trazados inferiores). Los aminoácidos se derivaron mediante W-a-(2,4-dinitro-5-fluorofenil)-L-valinamida (L-FDVA) y se detectaron por LC-MS como derivados de FDVA.
Figura 4 - Actividad de los mutantes YydG. (Figura 4A) Secuencia de YydG con los restos de cisteína resaltados. (Figura 4B) Análisis de electroforesis en gel de las enzimas mutantes purificadas. (Figura 4C) los espectros UV-visible de A3 (es decir AxxxAxxA) (trazado azul), C22A (trazado verde), C222A (trazado rojo) y C223A (trazado púrpura) mutantes después de la reconstitución anaeróbica. (Figura 4D) Análisis por HPLC de la reacción después de la incubación de YydF18-49 y los cuatro mutantes en presencia de SAM (1 mM) y ditionito de sodio. (Figura 4E) Análisis LC-MS de los péptidos producidos por el mutante C223A y sus correspondientes masas y secuencias.
Figura 5 - Actividad de YydF18-49 de YydG. (Figura 5A) Ensayo de inhibición de crecimiento en placas de B. subtilis en presencia de YydFis-49 o la YydFb producto epimerizado. (Figura 5B) Crecimiento de Bacillus subtilis en medio LB en ausencia de péptido (□) o en presencia del péptido YydFis-49 con un extremo C libre: Ac-GLLDESQKLAKVNDLWYFVKSKENRWILGSGH (SEC ID n.°20) que no contiene ninguna modificación (■), un D-alo-Ile (♦), un D-Val (O) o dos restos epimerizados: Ac-GLLDESQKLAKVNDLWYF{d-V}KSKENRW{d-l}LGSGH (SEC ID n.° 20) (A). Los valores de DO son las medias de 3 cultivos independientes.
Figura 6- Múltiples alineaciones de homólogos cercanos de YydG hallados, en particular, en B. subtilis y especies de estafilococos.
Figura 7 - Análisis de espectrometría de masas del péptido YydF aislado de B. subtilis y denominado YydF33-49. Análisis LC-MS/MS de (a) el péptido secretado por B. subtilis, (b) Péptido YydF33-49DD sintético que contiene dos restos de D-aminoácidos y (c) péptido YydF33-49 sintético. Se indican los iones relevantes. Tablas 1 para la asignación completa. En la secuencia peptídica, los aminoácidos con una configuración D se indican en gris.
Figura 8 -(A) Crecimiento de B. subtilis en medio LB líquido en presencia de YydF 33^9 o YydF33^9DD. B. subtilis se cultivó en medio LB solo (♦), en presencia de YydF33-49(ü) o YydF33-49DD (■). Cada medida es la media de tres experimentos de crecimiento con la SD indicada. Los restos epimerizados están en negrita. (b) Relación de crecimiento de B. subtilis en presencia de YydF18-49 (100 μM) o YydF18-49DD (100, 10 o 1 μM). Las relaciones se determinaron por comparación con el crecimiento en ausencia de péptido. (c) Relación de crecimiento de B. subtilis en presencia de YydF33-49 o YydF33-49DD (100, 10, 1,0.1 o 0,01 μM). Las relaciones se determinaron por comparación con el crecimiento bacteriano en ausencia de péptido.
Figura 9 - Crecimiento de B. subtilis en medio LB líquido en presencia de YydFis-49 (□) o tras la adición (Flecha) del YydFi8-49DD (■) tras 3 horas de crecimiento. Cada medida es la media de tres experimentos de crecimiento con la SD indicada.
Figura 10 - Crecimiento de B. subtilis en medio LB líquido en presencia de YydF33-49 (a), YydF33_49AA (b), YydF33_49w (c), YydF33_49II (d), Péptido-SA1 (e), Péptido-SA2 (f), Péptido-SE (g) o Péptido-SP (h) a 100 μM. En negrita, restos epimerizados.
Figura 11 - Crecimiento de Enterococcus faecalis en medio BHI líquido en presencia de YydF33-49 (a), YydF33_49AA (b), YydF33_49w (c), YydF33_49ii (d), Péptido-SA1 (e), Péptido-SA2 (f), Péptido-SE (g) o Péptido-SP (h) a 100 μM. En negrita, restos epimerizados.
Figura 12 - Crecimiento de Streptococcus agalactiae en medio BHI líquido en presencia de YydF33-49 (a), YydF33_49AA (b), YydF33_49w (c), YydF33_49ii (d), Péptido-SA1 (e), Péptido-SA2 (f), Péptido-SE (g) o Péptido-SP (h) a 100 μM. En negrita, restos epimerizados.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Los inventores mostraron en el presente documento que la cepa de laboratorio común Bacillus subtilis es capaz de producir un nuevo tipo de péptidos bioactivos que contienen D-aminoácidos a pesar de ser de origen ribosómico. Este péptido es modificado postraduccionalmente por una nueva enzima que pertenece a la superfamilia de enzimas SAM radicales. Demostraron que esta nueva enzima utiliza un mecanismo basado en radicales sin precedentes para convertir los restos de L-isoleucina y L-valina en D-alo-isoleucina y D-valina. Establecieron que esta enzima genera un radical de 5'-desoxiadenosilo para catalizar la abstracción del átomo de H de Ca que lleva a la formación de un radical centrado en carbono. Los experimentos de mutagénesis avalan que esta enzima posee dos centros esenciales [4Fe-4S] y permiten la identificación de un donante de átomos de H crítico, necesario para la terminación del ciclo catalítico. Para finalizar, de un modo único, descubrieron que la presencia de D-aminoácidos es necesaria para la actividad de este péptido bioactivo que probablemente induzca LiaRS, un componente principal de la integridad de la pared bacteriana.
El sistema Lia de Bacillus subtilis es un módulo de estrés de envoltura celular compuesto por un sistema de dos componentes (LiaRS) y una proteína inhibidora (LiaF). Este sistema genético está altamente conservado entre Firmicutes y parte de la red de regulación compleja que orquesta la respuesta al estrés de la pared celular. Aunque su regulación se ha descrito con gran detalle, su papel fisiológico preciso en B. subtilis no se entiende completamente. LiaRS es específicamente y fuertemente inducidos por los antibióticos dirigidos a la pared celular, tales como la nisina, vancomicina o bacitracina y, por lo tanto, se ha desarrollado como un biosensor y una pantalla de alto rendimiento para los antibióticos de la pared celular. Tras la detección con antibióticos, LiaRS transduce las señales de estrés de la envoltura celular que activa la expresión de genes, presumiblemente para mantener la integridad de la pared celular a pesar de que no confiere resistencia a los antibióticos.
En un intento de identificar los genes implicados en la regulación de LiaRS, se realizó un estudio de mutagénesis en B. subtilis y condujo al descubrimiento del operón yydFGHIJ (Butcher et al, 2007, J Bacteriol, 189, 8616). Este operón muestra la regulación positiva en LiaRS y posee todos los rasgos característicos de un sistema genético que codifica un péptido putativo (YydF) modificado por una enzima SAM radical y una proteasa (YydG e YydH respectivamente), después finalmente se exportó en el medio extracelular mediante un transportador de tipo ABC (YydlJ) a pesar de que ninguno de estos componentes se aisló o investigó (Figura 1A).
Las enzimas SAM radical son una familia emergente de enzimas que catalizan una gran diversidad de modificaciones de proteínas y péptidos, tales como oxidación, reacción de transferencia de metilo inusual o formación de enlace tioéter. Han surgido como actores principales de la biosíntesis de los llamados RiPP (péptidos sintetizados en el ribosoma y modificados postraduccionalmente) que están implicados en las reacciones químicamente desafiantes, que ninguna otra enzima puede realizar. Para investigar el papel biológico y la función catalítica de la enzima SAM radical putativa YydG, los inventores sobreexpresan la proteína en E. coli y ensayaron su actividad contra el péptido YydF. La proteína purificada (Figura 1B) tenía las propiedades espectroscópicas distintivas de enzima SAM radical con banda de absorción de transferencia de carga en 320 y 420 nm (Figura 1C). Basado en un coeficiente de extinción molar del clúster [4Fe-4S]2+ de £410 ~15.000 M'1 cm-1, la enzima parece poseer de uno a dos centros [4Fe-4S] después de la reconstitución anaerobia (Figura 1C).
La minería del genoma reveló que yydF y yydG también están presentes en varios patógenos Grampositivos, tales como Enterococcus faecalis y varios Streptococci y Staphylococci, incluyendo S. agalactiae y S. epidermidis. La alineación de secuencia de los homólogos de YydF indicó una secuencia líder putativa situada en la parte N-terminal y un motivo altamente conservado desde el resto 17 hasta el final del péptido (Figura 1D). Los inventores ensayaron la enzima reconstituida ya sea con el péptido YydF de longitud completa o una forma truncada, que abarca los restos de aminoácidos conservados desde la posición 18 a la 49, que denominamos YydF18-49. Como se muestra (Figura 1E), en condiciones anaeróbicas y condiciones reductoras, YydG produjo la 5'-desoxiadenosina prevista (5'-dA; eluyendo a 12,3 min) resultante de la escisión homolítica de S-adenosil-L-metionina (SAM) y también tres derivados peptídicos: YydFa, YydFb y YydFc eluyendo a 46, 47,6 y 48 min (Figura 1E, F, G y H). La formación de los tres péptidos era estrictamente dependiente de la presencia de ditionito de sodio como donante de un electrón y se obtuvieron productos similares utilizando YydF o YydF18-49 (Figura 1F, G y H). El análisis cinético de la reacción mostró que YydG producía un mol de 5'-dA por mol de producto modificado y catalizaba varios retornos en condiciones in vitro, aunque se produjo escisión de SAM desacoplada a medida que procedía la reacción (Figura 1G). Estos resultados demostraron que, in vitro, YydG utilizaba SAM para modificar YydF a través de un mecanismo basado en radicales. Dado que se demostró que YydF18-49 era un mejor sustrato y más fácil de caracterizar, los inventores decidieron identificar la modificación catalizada por YydG.
La inspección de espectrometría de masas de los tres péptidos formados no reveló ninguna diferencia de masas en comparación con el sustrato YydF18-49 [M+3H]3+= 1258,92). Esto contrastó con todas las enzimas rSAM conocidas que catalizan las modificaciones postraduccionales de péptidos o proteínas, tales como la reticulación, la oxidación o la metilación (7, 9, 14-16). El mapeo de péptidos trípticos del sustrato dio tres péptidos (Péptido 1 [M+H]+ =931,48, Péptido 2 [M+H]2+ =592,31 y Péptido 3 : [M+H]+= 768,41) eluyendo a 22, 27 y 19,2 min) como se muestra en la Figura 2A. La comparación con el péptido enzimáticamente modificado mostró la aparición de dos nuevos péptidos (es decir, el Péptido 2 * y el Péptido 3 * ) que tienen el mismo peso molecular que los Péptidos 2 y 3 pero que eluyen a 26,5 y 23,5 min, respectivamente (Figura 2B). Este resultado avaló que YydG había introducido dos modificaciones, uno situada internamente (en el Péptido 2) y uno en el extremo C-terminal del péptido (en el Péptido 3). En todos los experimentos realizados, YydFc fue el producto principal. El mapeo de péptidos trípticos reveló que esencialmente el extremo C-terminal del péptido se había modificado, ya que la relación Péptido 3 */Péptido 3 era 5 veces mayor que la relación Péptido 2 */Péptido 2 (Figura 2B), lo que indica que YydG tenía algunos sitios preferentes.
Para identificar la naturaleza y localización de las modificaciones catalizadas por YydG, los inventores repitieron la reacción en > 90 % de tampón deuterado, ya que se sabe que las enzimas rSAM restan y a veces intercambian, átomos de H durante la catálisis. En tampón deuterado, YydG produjo un patrón de producto similar con YydFc que siempre es el producto más abundante (Figura 2C). Curiosamente, el análisis LC-MS de la reacción mostró que, en estas condiciones, YydFa y YydFc tenían un peso molecular de [M+3H]3+= 1259,24 y YydFb un peso molecular de [M+3H]3+= 1259,6. Esto correspondía a una y dos unidades Dalton más que el sustrato, YydF18-49 ([M+3H]3+= 1258,92), de forma inequívoca, lo que demuestra que un átomo de deuterio se incorporó en YydFa, YydFc y dos átomos de deuterio en YydFb, respectivamente. El mapeo de péptidos trípticos de la reacción se dejó localizar la incorporación de deuterio exclusivamente en el Péptido 2* y el Péptido 3* cuyas masas moleculares variaron de una unidad Dalton (es decir, [M+2H]2+ = 593,04 y [M+2H]+= 769,52) (Figura 2D). La fragmentación de estos dos péptidos demostró incorporación de deuterio en Val36 en el Péptido 2 * (como se muestra por los iones característicos y1, y2+1 y b7, b8+1) y en Ile44 en el Péptido 3* (como se muestra mediante la identificación de los iones ys y y6+1). En total, estos resultados demostraron que YydG cataliza la sustitución de dos átomos de H de los péptidos mediante dos átomos de H intercambiables del disolvente.
Para determinar la naturaleza de la modificación, los inventores realizaron la hidrólisis ácida del péptido y analizaron su contenido de aminoácidos, después de la derivatización con W-a-(2,4-dinitro-5-fluorofenil)-L-valinamida (L-FDVA), mediante LC-MS. El péptido YydF18-49 contiene dos restos de Val y uno de Ile, pero cinco restos de Leu que no solo tienen el mismo peso molecular que Ile sino que también se eluyen en tiempos de retención similares. Las condiciones optimizadas de LC-MS/MS permitieron, como se muestra en la Figura 3A, la separación y caracterización de L-lle y L-Leu, pero también de sus homólogos con configuración D (D-allo-lle y D-Leu). El análisis de los péptidos enzimáticamente modificados mostró claramente que, además de la identificación de L-Ile y L-Leu, se formó otro producto que eluía a 27,7 minutos, correspondiente a D-allo-Ile. Asimismo, el análisis de los restos de Val (Figura 3B) mostró la presencia no solo de L-Val sino también de D-Val, eluyendo a los 26 min.
Por lo tanto, los inventores establecieron que YydG es una epimerasa SAM radical, la primera que se demostró que era activa in vitro en una estructura peptídica. La enzima catalizó la epimerización de hasta ~ 35 % de Ile y ~ 10 % de restos de Val. De acuerdo con esta conclusión, cuando se derivatizaron los aminoácidos epimerizados incubando YydG en tampón deuterado, sus análisis de masas revelaron un incremento de 1 Da (Figura 3C y D), consistente con los análisis realizados sobre el péptido intacto y sus derivados trípticos (Figura 2C y D).
Para afirmar definitivamente su identidad como aminoácidos con configuración D, los inventores sintetizaron un péptido variante de YydF18-49 que contenía una D-Val y una D-allo-lle en las posiciones 36 y 44, respectivamente. El mapeo de péptidos trípticos y el perfil de aminoácidos de este péptido sintético reprodujeron perfectamente los del péptido enzimáticamente modificado (datos no mostrados).
En base a estos análisis, los inventores pudieron asignar YydFa como un péptido que contiene un D-Val en la posición 36, YydFc como péptido que contiene una D-allo-lle en la posición 44 y YydFb como un péptido que contiene una D-Val y una D-allo-lle en posiciones en las posiciones 36 y 44, respectivamente. Por lo tanto, YydG, produjo una mezcla de péptidos que contenían aminoácidos modificados simples o dobles, siendo Ile44 el sustrato preferente (Figura 2C).
Durante la reacción de epimerización realizada en tampón deuterado, si los inventores han establecido que se incorpora un átomo de H intercambiable en disolvente en la cadena principal del péptido, el 5'-dA producido no contenía un marcado significativo como se muestra mediante análisis LC-M. Estos resultados y el análisis cinético en la Figura 1G son consistentes con YydG, produciendo un radical 5'-dA (5'-dA^) para abstraer el átomo de H de Ca de Val36 o lle44 con la formación concomitante de un mol de 5'-dA.
Las últimas preguntas que quedaban por resolver eran el origen del átomo de H intercambiable introducido durante la catálisis. De hecho, era poco probable que el radical centrado en carbono interaccione con un componente tampón, ya que tales especies altamente reactivas deben mantenerse selladas en el sitio activo de la enzima. Los inventores favorecieron un resto de aminoácido de proteína como donante de átomos de H y se requirió un desactivador de radicales para terminar la reacción. La inspección detallada de la secuencia de YydG señaló que, además de los tres restos de cisteína del motivo de SAM radical, solo estaban presentes seis cisteínas en la secuencia (Figura 4A).
Curiosamente, dos restos de cisteína (es decir, Cys22 y Cys223) estaban adyacentes a otro resto de cisteína, uno de los cuales estaba dentro del ciclo predicho que contenía el centro rSAM [4Fe-4S]. La organización de los otros cinco restos de cisteína en el extremo C-terminal de la proteína era una reminiscencia de los motivos implicados en la coordinación de los centros adicionales [4Fe-4S] en las enzimas rSAM. Para investigar su función, los inventores sustituyeron los restos de cianina del motivo SAM radical CxxxCxxC, Cys22, Cys222 o Cys223 por restos de alanina. Los cuatro mutantes diseñados (es decir, A3, C22A, C222A y C223A) se purificaron con éxito. aunque el mutante C222A demostró ser recalcitrante a la purificación y se producía parcialmente como una forma truncada (Figura 4B). El análisis espectroscópico mostró que, en base a su espectro de UV-visible, el mutante AxxxAxxA contenía ~ 1 centro [4Fe-4S], mientras que la cantidad de centro [4Fe-4S] era dos veces mayor en los mutantes C22A y C223A (Figura 4C). Es importante destacar que, el mutante AxxxAxxA aeróbicamente purificado ya contenía altas cantidades de centro de hierro y azufre, lo que demuestra que la presencia del centro [4Fe-4S] en este mutante era independiente de la reconstitución anaeróbica. Los espectros de UV-visible de los mutantes C22A y C223A se superponen perfectamente con la enzima de tipo salvaje (Figura 1B), lo que confirma el hecho de que YydG probablemente contenga dos centros [4Fe-4S]. El mutante C222A parecía no contener centro de hierro-azufre, incluso después de la reconstitución anaeróbica (Figura 4C). El máximo de absorción de C222A se desplazó hacia 250 nm, lo que indica que la proteína probablemente estaba mal plegada, ya que se ha informado repetidamente cuando los restos de cisteína implicados en la coordinación de [4Fe-4S] están mutados en enzimas con hierro-azufre, incluyendo las enzimas rSAM. Por lo tanto, es probable que Cys222 participe en la coordinación del segundo centro [4Fe-4S] presente en YydG.
La actividad de todos los mutantes se ensayó con el sustrato YydF18-49 (Figura4D). Como se esperaba, el mutante A3 no pudo convertir el sustrato peptídico y escindir SAM. El mutante C222A también estaba totalmente alterado por la actividad enzimática. Por el contrario, la mutación C22A no afectó a la actividad de la enzima y se produjeron los tres péptidos epimerizados (es decir, YydFa, YydFb y YydFc). La mutación C223A tampoco previno la actividad de epimerización. Sin embargo, esta variante enzimática produjo otros derivados peptídicos que eluyeron a los 10 min, 19,8 min y 26 min (Figura 4E). La espectrometría de masas de alta resolución mostró que estos péptidos tienen un desplazamiento de masa de -30,005 Da o -1,032 Da, en comparación con los productos hidrolíticos predichos. Todos ellos contenían en su extremo C o N un Val36 o Ile44 truncado, las dianas de la enzima YydG (Figura 4e ). Su estructura se determinó como: Ac-GLLDESQKLAKVNDLWYFVKSKENRWI* (SEC ID n.° 53) (péptido G18-I44*, [M+2H]2+= 1646,3834); y l*LGSGH-NH2 (SEC ID n.° 55) (péptido G18-I44*, [M+Na]+= 603,2851). El truncamiento se identificó como la pérdida del aminoácido carboxílico o grupo amino, como resultado de la rotura de los enlaces C a-N o Ca-CO, y la adición de un átomo de oxígeno en el átomo Ca del aminoácido. Estos resultados son una reminiscencia de la fragmentación del sustrato obtenida con otro miembro de la familia de enzimas rSAM, la piruvato formiato liasa activasa, cuando la reacción se expuso a oxígeno molecular. También establecieron definitivamente que YydG genera un radical centrado en carbono en el átomo Ca de Val36 e Ile44 y que Cys223 desempeña un papel crítico para la terminación de la reacción.
A la luz del trabajo previo de los inventores sobre otra enzima rSAM, la liasa fotoproducto de esporas (SP liasa), los inventores interpretaron el papel de Cys223 como donante crítico de átomo de H. De hecho, mientras se investiga un mutante de la Sp liasa, han demostrado que, en ausencia de un donante de átomos de H de proteína adecuado, el sustrato intermedio del radical puede reaccionar con secuestrantes de radicales adventicios que conducen a la formación de diversos aductos. En el presente caso, el radical Ca estabilizado, en ausencia del grupo tiol de Cys223, es libre de reaccionar con el oxígeno molecular, lo que conduce a estas exclusivas roturas de la cadena principal del peptidilo.
Para finalizar, dado que se demostró que el operón YydFGHIJ (Figura 1A) activa el sistema Lia en B. subtilis, los inventores ensayaron la actividad del péptido YydF18-49 antes y después de la reacción enzimática en diversas cepas bacterianas. Pusieron de manifiesto un fuerte crecimiento de inhibición de B. subtilis con el péptido epimerizado enzimáticamente o el péptido sintético que contiene D-Val36 y D-allo-Ile44. Por el contrario, el péptido YydF18-49 no modificado carecía de actividad (Figura 5A). Asimismo, en medio líquido, solo el péptido epimerizado demostró ser activo, ya que se pudo medir una inhibición fuerte y persistente (Figura 5B). Se necesitarán más estudios para descifrar las bases moleculares de esta inhibición, pero de acuerdo con el conocimiento de los inventores, es la primera vez que un péptido epimerizado de forma natural demostró ser la forma activa de un péptido bacteriano regulador o antimicrobiano.
El presente estudio demuestra que los péptidos que contienen D-aminoácidos, llamados Epipéptidos, son mucho más comunes de lo que se esperaba en organismos vivos, incluida la bacteria común de laboratorio Bacillus subtilis, pero también muchas especies patógenas como Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecails o Staphylococcus epidermidis. Inesperadamente, los inventores demostraron en este caso que los D-aminoácidos parecen no solo proporcionar resistencia a las proteasas sino que están directamente implicados en la respuesta bacteriana.
Ejemplo 2
En la bibliografía se ha propuesto que un gen, yydF codifica un péptido producido por Bacillus subtilis (SEC ID n.° 1). Sin embargo, no se ha informado de ninguna prueba de su síntesis real ni de ninguna modificación postraduccional.
Después del crecimiento de B. subtilis en un medio sintético (solución tampón 5X (Na2HP04: 17 g; KH2P04: 7,5 g, NaCl: 1,25 g; NH4CI: 2,5 g en 500 ml); Solución de oligoelementos: MnCh: 20 mg; ZnCh: 34 mg; CuCh: 8,6 mg; CoCh: 12 mg; Na2MoO4: 12 mg; en 200 ml), los inventores purificaron con éxito un péptido, que se origina a partir de YydF y que abarca los restos 33 a 49 (Figura 7), establecido por análisis de espectrometría de masas (Tabla 1). La secuencia del péptido aislado se determinó que era (SEC ID n.° 61):
Trp Tyr Phe Val Lys Ser Lys Glu Asn Arg Trp lie Leu Gly Ser Gly His
SEC ID n.° 61: Secuencia del péptido YydF33_49
Además, los inventores determinaron que el péptido YydF33-49, producido por B. subtilis, contenía 2 restos epimerizados (es decir, D-aminoácidos) localizados en la posición 36 (Val) y 44 (Ile). Por tanto, el péptido se denominó YydF_ 33-49DD. El trabajo previo de los inventores (Ejemplo 1) estableció que los restos epimerizados son el resultado de la conversión de restos de L-aminoácido por una única enzima SAM radical, YydG, cuyo objetivo es el átomo Ca de los aminoácidos. En la actualidad, no se conoce si tales péptidos cortos, que contienen epimerización discreta, son producidos por bacterias.
Debido a que se demostró que el operón YydFGHIJ inducía el sistema de dos componentes LiaRS, que, entre otros estímulos, detectaba la integridad de la pared celular bacteriana, los inventores buscaron una inhibición del crecimiento bacteriano putativa desencadenada por diversos derivados del péptido YydF. Las pruebas iniciales se realizaron con un péptido que abarcaba los restos 18-49 (YydF18-49, SEC ID n.° 20).
Como se muestra (Figura 5B), sólo en presencia del péptido YydF18-49DD que contiene dos restos epimerizados: Val36 and Ile44 (numeración de acuerdo con la SEC ID n.° 61), los inventores monitorizaron la inhibición del crecimiento bacteriano. La presencia de un resto epimerizado o la ausencia de restos epimerizados no afectó significativamente el crecimiento bacteriano. Esto demostró, por primera vez, que un péptido corto con restos epimerizados puede inhibir el crecimiento bacteriano.
Habiendo establecido que la presencia de dos restos epimerizados clave es crucial para las propiedades inhibidoras, los inventores sintetizaron dos péptidos correspondientes a la secuencia del péptido producido por B. subtilis (SEC ID n.° 61). Estos dos péptidos contenían o bien solo restos de L-aminoácidos (YydF33-49) o los dos restos epimerizados cruciales: D-Val36 y D-Ile44 (YydF33-49DD). Se demostró que solo el péptido YydF33-49DD inhibía el crecimiento bacteriano (Figura 8a). Este nuevo péptido demostró ser 100 veces más potente que el péptido YydF18-49DD analizado anteriormente (Figura 8b y c) con una CIM ≤1 μM. Además, los inventores demostraron que estos péptidos no solo inhibían el crecimiento bacteriano, sino que también inducían la muerte celular bacteriana. De hecho, si después de un crecimiento inicial de 3 horas, se añade el péptido YydF18-49 en fase exponencial media (Figura 9), se midió una ralentización clara, seguida de una disminución de la densidad celular.
Curiosamente, los homólogos de los péptidos YydF se predicen en el genoma de varias bacterias Grampositivas, tales como: Salinibacillus aidingensis, Bacillus coagulans, Paenibacillus sp y varias especies patogénicas, tales como: Enterococcus faecalis, Enterococcus caccae, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus pseudintermedius, Staphylococcus equorum, Staphylococcus condimenti y Staphylococcus epidermidis (Figura 1D, Figura 6).
Con el fin de determinar si estos péptidos son bioactivos, los inventores sintetizaron una biblioteca de péptidos basados en las secuencias identificadas en los genomas de especies de Streptococcus y Staphylococcus. Plantearon la hipótesis de que estos péptidos debían contener las mismas modificaciones postraduccionales que los identificados en B. subtilis, lo que significa un péptido procesado de 17 restos de aminoácidos con dos D-aminoácidos en las posiciones 4 y 12 (SEC ID n.os 62-65). Los restos epimerizados están en negrita.
Streptococcus agalactiae Péptido-SA1 WYFVRSSKNRWVAGSAH (SEC ID n.° 62)
Streptococcus agalactiae Péptido-SA2 WYFVRNSKNRWVAGSAH (SEC ID n.° 63)
Staphylococcus equorum Péptido-SE WYFVKSKQNRWWGSGH (SEC ID n.° 64)
Staphylococcus pseudintermedius Péptido-SP WYFVKSQSNRWIVGSGH (SEC ID n.° 65)
Además, los inventores también sintetizaron tres péptidos no naturales derivados de la secuencia de YydF33_49 de B. subtilis (SEC ID n.° 61), pero para el que los dos restos epimerizados (es decir, Val36 y Ile44) estaban ambos sustituidos por restos de Val, Ile o Ala, YydF33_49VV, YydF33_49II y YydF33_49AA, respectivamente (SEC ID n.os 66-68). Los restos epimerizados están en negrita.
YydF33_49AA WYFAKSKENRWALGSGH (SECIDn.°66)
YydF33_49VV WYFVKSKENRWVLGSGH (SECIDn.°67)
YydF33_49ii WYFIKSKENRWILGSGH (SEC ID n ° 68)
Estos 7 péptidos (SEC ID n.os 62-68) se ensayaron contra B. subtilis y los dos patógenos Grampositivos representativos: S. agalactiae y E. faecalis. Tal como se muestra, todos los péptidos fueron eficaces contra B. subtilis, incluyendo los péptidos con secuencias no naturales (Figura 10). El crecimiento de E. faecalis se retrasó significativamente con el Péptido-SA1 y el Péptido-SA2, y el crecimiento se inhibió totalmente con el Péptido-SE y el péptido YydF33_49AA no natural (Figura 11). S. agalactiae se inhibió mediante YydF33-49DD y los derivados YydF33-49AA e YydF33-49w pero no mediante YydF33-49II (Figura 12). Los péptidos: Péptido-SA1, Péptido-SA2, Péptido-SE y Péptido-SP fueron todos inhibidores.
Los inventores demostraron así que los péptidos cortos que contienen dos restos de D-aminoácidos son una nueva clase de péptidos inhibidores capaces de inhibir el crecimiento de varias bacterias Grampositivas, incluyendo patógenos relevantes. Son eficaces si se añaden al principio o después del crecimiento bacteriano a mitad de la fase exponencial. Para finalizar, algunas modificaciones pequeñas en la secuencia son capaces de ajustar las propiedades de inhibición y las características específicas a nivel de géneros y especies de estos péptidos, de modo que permiten el desarrollo de antibióticos específicos. Además, basado en el marco de 17 aminoácidos y la ubicación conservada de dos D-aminoácidos (en la posición 4 y 12) aguas abajo de los restos aromáticos (W o Y), los inventores también demostraron que es posible diseñar péptidos con secuencias no naturales que demostraron ser eficaces contra todas las bacterias grampositivas analizadas.
Se demostró que los péptidos bioactivos tenían una identidad de secuencia variable entre 100 y al 58,8 % en relación con la secuencia de YydF33-49 original que significa que al menos 7 restos de aminoácido podrían cambiarse sin alterar sus propiedades globales de inhibición. Por tanto, es posible diseñar estos péptidos en una forma sin precedentes con el objetivo de géneros bacterianos específicos y ajustar sus propiedades biológicas.
N.° Porcentaje Identidad N.° de matriz
1 Péptido-SA1 100,00 94,12 64,71 70,59 58,82 58,82 64,71 70,59 2 Péptido-SA2 94,12 100,00 58,82 64,71 52,94 52,94 58,82 64,71 3 Péptido-SP 64,71 58,82 100,00 82,35 70,59 76,47 82,35 76,47 4 Péptido-SE 70,59 64,71 82,35 100,00 76,47 76,47 82,35 88,24 5 YydF33 49AA 58,82 52,94 70,59 76,47 100,00 88,24 88,24 88,24 6 YydF33 49II 58,82 52,94 76,47 76,47 88,24 100,00 94,12 88,24 7: YydF33_49DD 64,71 58,82 82,35 82,35 88,24 94,12 100,00 94,12 8: YydF33_49VV 70,59 64,71 76,47 88,24 88,24 88,24 94,12 100,00 Materiales y procedimientos
Expresión de YydG
Los genes yydG se sintetizaron (Life Technologies) y se clonaron en un plásmido pASK. El plásmido se expresó en E. coli BL21 (DE3) estrella (Life Technologies) y la expresión de proteínas se realizó en medio LB con ampicilina (100 μg.ml-1). Después de cultivar durante la noche a 21 °C, se recogieron las células y se rompieron mediante ultrasonidos en tampón A (Tris 50 mM, KCI 300 mM, glicerol al 10 % pH 7,5). La suspensión bacteriana se centrifugó a 45.000 x g durante 1,5 horas y el sobrenadante de proteína se cargó en una columna de alta capacidad Streptactin (IBA GmbH) previamente equilibrada con tampón A. La proteína YydG se eluyó con 6 ml de tampón A que contenía destiobiotina (0,6 mg/ml) concentrada adicionalmente con el concentrador Amicon (Millipore) con un valor de corte molecular de 10 kDa.
Reconstitución de la enzima
YydG se reconstituyó en condiciones anaeróbicas en una cámara anaerobia Bactron IV. La proteína se mezcló con 3 mM de DTT a 12 °C durante 15 minutos, después se añadieron Na2S y (NH4)2Fe(SÜ4)2 y la solución se incubó a 12 °C durante 4 horas.
Ensayos enzimáticos
YydG se incubó con DTT 3 mM, SAM 1 mM y sustrato peptídico 1 mM a menos que se indicara lo contrario. Las incubaciones se realizaron a 25 °C en condiciones anaerobias estrictas y se tomaron muestras alícuotas de 10 μl con el tiempo.
Análisis por HPLC
El análisis por HPLC se realizó en Agilent 1200 serie infinity equipado con una columna de fase inversa (LiChroSphere 100 RP-18e 5 μm) (Merck Millipore). Se aplicó un gradiente de disolvente A (H2O, 0,1 % de TFA) a B (80 % de CH3CN, 19,9 % de H2O, 0,1 % de TFA) de la siguiente manera: 0-1 min: 100 % de N0 % de B; 1-45 min: un gradiente lineal con 1 % de disolvente B por minuto a un caudal de 1 ml.min-1. La detección se realizó a 257 y 278 nm con un detector de matriz de diodos y por fluorescencia (excitación a 278 nm y emisión a 350 nm).
Análisis mediante cromatografía de líquidos-espectrometría de masas/espectrometría de masas
Se realizaron análisis de cromatografía líquida de alta resolución-espectrometría de masas/espectrometría de masas usando un espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap Discovery (ThermoFisher) con una fuente de iones de nanoelectropulverización y un sistema Ultimate 3000 LC (Dionex). Se utilizó un espectrómetro de masas LTQ (ThermoFisher) con una fuente de iones de nanoelectropulverización para análisis de rutina. El análisis de péptidos se realizó en una nanocolumna Pepmap 100 C18 (0,075 por 15 cm, 100 A, 3 μm).
Ensayo de inhibición en medio sólido
Un cultivo de una noche de la cepa bacteriana para hacer un ensayo se inoculó recién obtenido en un medio líquido BHI estéril. Después de 4 horas de crecimiento bacteriano a 37 °C, el medio se diluyó a 1/1000 y se inoculó en un medio de agarosa blanda precalentado a 42 °C. El medio de agarosa que contiene las bacterias se superpuso sobre una capa de agarosa BHI estéril previamente gelificada. Se colocaron 200 μg de péptido en la placa y el crecimiento bacteriano procedió a 37 °C.
Ensayo de inhibición en medio líquido
Un cultivo de una noche de la cepa bacteriana para hacer un ensayo se inoculó recién preparado a un medio líquido LB estéril. Después de 4 horas de crecimiento bacteriano a 37 °C, el medio se diluyó a 1/10.000 y se inoculó en medio LB o BHI líquido estéril. Se añadió la solución de péptido (1/100) a una concentración final que varía desde 0,01 a 100 μM y una DO a 600 nm se registró continuamente usando un lector de microplacas Tecan (serie Infinite® 200 PRO). Tabla 1
Fragmentos de masa para el péptido YydF33-49 aislado de B. subtilis
Figure imgf000026_0001
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Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Un péptido que tiene actividad antibacteriana que tiene al menos dos aminoácidos en configuración D, que comprende una secuencia de 17 restos que tiene al menos 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 33 a 49 de la SEC ID n.° 1 y dicha secuencia comprende las secuencias W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 71) y W-[lN/A]-X4-G-S (SEC ID n.° 69), en las que X4 es cualquier aminoácido, y una secuencia de unión entre la SEC iD n.° 69 y la SEC ID n.° 71 de 4-8 aminoácidos, en la que los restos [V/I/A] de las SEC ID n.os 69 y 71 tienen una configuración D y en donde el péptido tiene una longitud de aproximadamente 17 a aproximadamente 35 aminoácidos.
2. El péptido según la reivindicación 1, en el que el péptido comprende una secuencia de W-Y-F-[V/I/A]-[K/R]-Xa-Xb-Xc-N-R-W-[V/I/A]-Xd-G-S-Xe-H (SEC ID n.° 72), en la que Xa, Xb y Xc son un aminoácido polar, Xd es un aminoácido alifático y Xe es cualquier aminoácido.
3. El péptido según la reivindicación 2, en el que el péptido comprende una secuencia de W-Y-F-[V/I/A]-[K/R]-[S/N]-[S/Q/K]-[E/K/S/Q]-N-R-W-[V/I/A]-[LN/A]-G-S-[NG]-H (SEC ID n.° 73).
4. El péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el péptido comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID n.os 61-68.
5. El péptido según la reivindicación 1, en el que el péptido comprende una secuencia de 24 restos que tiene al menos 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 26 a 49 de la SEC ID n.° 1 y comprendiendo dicha secuencia las secuencias N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21) y W-[lN/A]-X4-G-S (SEC ID n.° 69), en la que X4 es cualquier aminoácido y una secuencia de unión entre la SEC ID n.° 21 y la SEC ID n.° 69 de 4-7 aminoácidos y en donde el péptido tiene una longitud de aproximadamente 25 a aproximadamente 35 aminoácidos.
6. El péptido según la reivindicación 5, en el que el péptido comprende las secuencias de L-X1-X2-X3-N-D-L-W-Y-F-V/I (SEC ID n.° 23) y la W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 22), en la que X1, X2, X3 y X4 son cualquier aminoácido.
7. El péptido según la reivindicación 6, en el que X1 es alanina, ácido aspártico o ácido glutámico, X2 es lisina, asparagina o ácido aspártico y X3 es valina, isoleucina o glutamina.
8. El péptido según la reivindicación 5, en el que el péptido comprende las secuencias L-A-K-V-N-D-L-W-Y-F-V (SEC ID n.° 24), y W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 22), en las que X4 es un aminoácido hidrofóbico, preferentemente leucina, valina, alanina o metionina.
9. El péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 5-8, en el que el péptido comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de SEC ID n.° 20 y la valina en la posición 19 está en configuración D y la isoleucina en la posición 27 está en configuración D.
10. Una composición farmacéutica que comprende un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
11. El péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para su uso como fármaco, preferentemente como un antimicrobiano, más preferentemente como un antibacteriano.
12. Un procedimiento in vitro para preparar un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el procedimiento comprende una etapa de poner en contacto un péptido que comprende una secuencia de 17 restos que tiene al menos un 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 33 a 49 de la SEC ID n.° 1 y dicha secuencia comprende las secuencias W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 71) y W-[lN/A]-X4-G-S (SEC ID n.° 69), en la que X4 es cualquier aminoácido y una secuencia de unión entre la SEC ID n.° 69 y la SEC ID n.° 71 de 4-8 aminoácidos y en donde el péptido tiene una longitud de aproximadamente 17 a aproximadamente 35 aminoácidos, con una epimerasa que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 30 % de identidad con la SEC ID n.° 25 y en la que el 70 % de las posiciones 14-15, 18, 20-24, 27, 58-60, 63, 83, 84, 87-90, 112, 115, 117, 120, 150, 152, 169, 176, 180, 181, 183, 204, 206-208, 214, 217, 220-225, 228, 230, 252, 254, 262, 289, 292, 296 y 309 de la SEC ID n.° 25 están conservadas y todas las posiciones 14-15, 18, 20-24, 27, 58-60, 63, 83, 84, 87-90, 112, 115, 117, 120, 204, 206-208, 214, 217, 220­ 225, 228 y 230 de la SEC ID n.° 25 están conservadas.
13. El método in vitro de la reivindicación 12, en el que el péptido comprende una secuencia de 24 restos que tiene al menos 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 26 a 49 de la SEC ID n.° 1 y dicha secuencia comprende las secuencias N/D-D-L-W-Y-F-V/I (SEC ID n.° 21) y W-lN-X4-G-S (SEC ID n.° 22), en la que X4 es cualquier aminoácido y una secuencia de unión entre la SEC ID n.° 21 y la SEC ID n.° 22 de 4-7 aminoácidos, y en donde el péptido tiene una longitud de aproximadamente 25 a aproximadamente 35 aminoácidos.
14. Uso de una epimerasa del péptido SAM radical que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 30 % de identidad con la SEC ID n.° 25 y en la que el 70 % de las posiciones 14-15, 18, 20-24, 27, 58-60, 63, 83, 84, 87-90, 112, 115, 117, 120, 150, 152, 169, 176, 180, 181, 183, 204, 206-208, 214, 217, 220-225, 228, 230, 252, 254, 262, 289, 292, 296, y 309 de la SEC ID n.° 25 están conservadas y todas las posiciones 14-15, 18, 20-24, 27, 58-60, 63, 83, 84, 87-90, 112, 115, 117, 120, 204, 206-208, 214, 217, 220-225, 228 y 230 de la SEC ID n.° 25 están conservadas para preparar un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
15. Una célula huésped recombinante que comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica un péptido que comprende una secuencia de 17 restos que tiene al menos un 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 33 a 49 de la SEC ID n.° 1 y que comprende las secuencias W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 71) y W-[lN/A]-X4-G-S (SEC ID n.° 69), en las que X4 es cualquier aminoácido y una secuencia de unión entre la SEC ID n.° 69 y la SEC ID n.° 71 de 4-8 aminoácidos y en donde el péptido tiene una longitud de aproximadamente 17 a aproximadamente 35 aminoácidos, y un ácido nucleico heterólogo que codifica una epimerasa peptídica SAM radical que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 30 % de identidad con la s Ec ID n.° 25 y en la que el 70 % de las posiciones 14-15, 18, 20-24, 27, 58-60, 63, 83, 84, 87-90, 112, 115, 117, 120, 150, 152, 169, 176, 180, 181, 183, 204, 206-208, 214, 217, 220-225, 228, 230, 252, 254, 262, 289, 292, 296, y 309 de la SEC ID n.° 25 están conservadas y todas las posiciones 14-15, 18, 20-24, 27, 58-60, 63, 83, 84, 87-90, 112, 115, 117, 120, 204, 206-208, 214, 217, 220­ 225, 228 y 230 de la SEC ID n.° 25 están conservadas y que es capaz de co-expresar el péptido y la epimerasa.
16. La célula huésped recombinante de la reivindicación 15, en la que el péptido comprende una secuencia de 24 restos que tienen al menos un 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 26 a 49 de la SEC ID n.° 1 y que comprende las secuencias N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21) y W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 22), en la que X4 es cualquier aminoácido, y en donde el péptido tiene una longitud de aproximadamente 25 a aproximadamente 35 aminoácidos.
17. Un método para preparar un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el método comprende cultivar una célula huésped recombinante según la reivindicación 15 o 16 en condiciones adecuadas para la coexpresión del péptido y la epimerasa y recuperar el péptido que tiene al menos dos aminoácidos con configuración D.
18. Uso de una célula huésped recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 15 y 16 para preparar un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
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