ES2952048T3 - New peptides that have antimicrobial activity and new enzyme capable of converting an L-configuration residue to a D-configuration amino acid in a peptide - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a una nueva clase de péptidos que tienen actividad antibacteriana y están presentes en D-aminoácidos y sus usos. También se refiere a una nueva enzima que presenta actividad de epímeras peptídicas in vitro e in vivo, siendo útil para modificar péptidos con el fin de cambiar la configuración de aminoácidos de L a D. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)The present invention relates to a new class of peptides that have antibacterial activity and are present in D-amino acids and their uses. It also refers to a new enzyme that presents peptide epimer activity in vitro and in vivo, being useful for modifying peptides in order to change the amino acid configuration from L to D. (Automatic translation with Google Translate, without legal value)
Description
DESCRIPCIÓNDESCRIPTION
Nuevos péptidos que tienen actividad antimicrobiana y nueva enzima capaz de convertir un resto de configuración L en un aminoácido de configuración D en un péptidoNew peptides that have antimicrobial activity and new enzyme capable of converting an L-configuration residue into a D-configuration amino acid in a peptide
CAMPO DE LA INVENCIÓNFIELD OF THE INVENTION
La presente descripción se refiere a la medicina, en particular a la actividad antimicrobiana de los péptidos y a la enzimología.The present description relates to medicine, in particular to the antimicrobial activity of peptides and to enzymology.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓNBACKGROUND OF THE INVENTION
La resistencia antimicrobiana amenaza a la prevención y el tratamiento eficaces de una gama cada vez mayor de infecciones causadas por bacterias, parásitos, virus y hongos. Es una amenaza cada vez más grave para la salud pública mundial que requiere una acción en todos los sectores del gobierno y la sociedad. La resistencia antimicrobiana está presente en todas partes del mundo. Nuevos mecanismos de resistencia emergen y se extienden a nivel mundial. Antimicrobial resistance threatens the effective prevention and treatment of an increasing range of infections caused by bacteria, parasites, viruses and fungi. It is an increasingly serious threat to global public health that requires action across all sectors of government and society. Antimicrobial resistance is present in all parts of the world. New resistance mechanisms emerge and spread globally.
Teniendo en cuenta los constantes problemas debidos a la resistencia antimicrobiana, existe una fuerte necesidad de nuevas clases de agentes antimicrobianos. En particular, los péptidos antimicrobianos son de gran interés. Estos péptidos son generalmente potentes. Además, a menudo ofrecen una mejor selectividad y especificidad que las moléculas pequeñas utilizadas generalmente como agentes terapéuticos.Considering the continuing problems due to antimicrobial resistance, there is a strong need for new classes of antimicrobial agents. In particular, antimicrobial peptides are of great interest. These peptides are generally potent. Furthermore, they often offer better selectivity and specificity than the small molecules generally used as therapeutic agents.
No obstante, una importante limitación a su uso y desarrollo terapéutico se asocia con su semivida. De hecho, habitualmente disminuye por la acción de las proteasas y peptidasas que están presentes en los organismos.However, an important limitation to its use and therapeutic development is associated with its half-life. In fact, it usually decreases due to the action of proteases and peptidases that are present in organisms.
Por lo tanto, se han desarrollado numerosas estrategias con el fin de reducir la degradación de péptidos, tales como C-amidación y N-acetilación contra exopeptidasa, la introducción de aminoácidos no naturales o de aminoácidos de configuración D. Sin embargo, estas estrategias solo se pueden utilizar en el contexto de los péptidos sintetizados y no son adecuadas para la producción recombinante de péptidos. En particular, no hay una manera fácil para introducir aminoácidos con configuración D en un péptido, a pesar del interés de tal modificación. De hecho, el aminoácido con configuración D presenta las mismas propiedades que los aminoácidos naturales, pero por lo general es más resistente a las proteasas y podría incluso ser menos inmunógeno.Therefore, numerous strategies have been developed in order to reduce peptide degradation, such as C-amidation and N-acetylation against exopeptidase, the introduction of unnatural amino acids or D-configuration amino acids. However, these strategies only They can be used in the context of synthesized peptides and are not suitable for recombinant peptide production. In particular, there is no easy way to introduce amino acids with a D configuration into a peptide, despite the interest of such a modification. In fact, the D-configuration amino acid has the same properties as natural amino acids, but is generally more resistant to proteases and could even be less immunogenic.
En conclusión, cualquier nueva clase de agentes antimicrobianos es de gran interés, especialmente los péptidos antimicrobianos. Además, cualquier procedimiento adecuado para modificar los aminoácidos de configuración L en aminoácidos de configuración D en un péptido sería muy valiosa en este contexto.In conclusion, any new class of antimicrobial agents is of great interest, especially antimicrobial peptides. Furthermore, any suitable procedure for modifying L-configuration amino acids to D-configuration amino acids in a peptide would be very valuable in this context.
Butcher et al. (2007, J. Bacterio!., 189, 8676) identificaron un operón YydFGHIJ que parecía inducir la expresión de LiaRS. En Uniprot:Q45596 se describen las secuencias de aminoácidos de un péptido yydF. Feitelson et al. (2006, Cáncer Letters, 239, 10-20) se refieren a cambios epigenéticos y genéticos.Butcher et al. (2007, J. Bacterio!., 189, 8676) identified a YydFGHIJ operon that appeared to induce LiaRS expression. The amino acid sequences of a yydF peptide are described in Uniprot:Q45596. Feitelson et al. (2006, Cancer Letters, 239, 10-20) refer to epigenetic and genetic changes.
SUMARIO DE LA INVENCIÓNSUMMARY OF THE INVENTION
El alcance de la presente invención viene definido por las reivindicaciones y cualquier información que no esté incluida en las reivindicaciones se proporciona solo con fines informativos.The scope of the present invention is defined by the claims and any information not included in the claims is provided for informational purposes only.
Los inventores identificaron un péptido antimicrobiano derivado de bacterias, a saber, de Bacillus subtilis que posee restos de aminoácido D. Por lo tanto, los inventores han descubierto una nueva clase de bacteriocinas. Este péptido tiene la especificidad para presentar el efecto antimicrobiano sólo cuando algunos de sus aminoácidos están en configuración D. Este péptido se puede preparar mediante una enzima derivada de las mismas bacterias que presenta la propiedad de cambiar la configuración de los aminoácidos en un péptido a partir de una configuración L a una configuración D. Por lo tanto, esta enzima puede ser útil para la conversión de los aminoácidos de configuración L en aminoácidos de configuración D en los péptidos, en particular los preparados mediante producción recombinante. The inventors identified an antimicrobial peptide derived from bacteria, namely from Bacillus subtilis possessing D amino acid residues. Therefore, the inventors have discovered a new class of bacteriocins. This peptide has the specificity to present the antimicrobial effect only when some of its amino acids are in the D configuration. This peptide can be prepared using an enzyme derived from the same bacteria that has the property of changing the configuration of the amino acids in a peptide from from an L configuration to a D configuration. Therefore, this enzyme may be useful for the conversion of L configuration amino acids to D configuration amino acids in peptides, particularly those prepared by recombinant production.
Por consiguiente, la presente descripción se refiere a un péptido antimicrobiano que tiene al menos dos aminoácidos con configuración D, que comprende una secuencia de 17 restos que tiene al menos 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 33 a 49 de la SEC ID n.° 1 y comprendiendo dicha secuencia las secuencias W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID N.° 71) y W-[lN/A]-X4-G-S (SEC ID N.° 69), en las que X4 es cualquier aminoácido, y una secuencia de unión entre la SEC iD N.° 69 y la SEC iD n.° 71 de 4-8 aminoácidos, en la que los restos [V/I/A] de las SEC ID n.os 69 y 71 tienen una configuración D.Accordingly, the present description relates to an antimicrobial peptide having at least two amino acids with D configuration, comprising a sequence of 17 residues having at least 40% identity with the sequence at positions 33 to 49 of SEQ ID No. 1 and said sequence comprising the sequences WYF-[V/I/A] (SEQ ID NO. 71) and W-[l N /A]-X4-GS (SEQ ID NO. 69), in wherein Nos. 69 and 71 have a D configuration.
Preferentemente, el péptido comprende, esencialmente consiste en o consiste en una secuencia de W-Y-F-[V/I/A]-[K/R]-Xa-Xb-Xc-N-R-W-[V/I/A]-Xd-G-S-Xe-H (SEC ID n.° 72), en la que Xa, Xb y Xc son un aminoácido polar, Xd es un aminoácido alifático y Xe cualquier aminoácido. Más preferentemente, el péptido comprende, esencialmente consiste en o consiste en una secuencia de W-Y-F-[V/I/A]-[K/R]-[S/N]-[S/Q/K]-[E/K/S/Q]-N-R-W-[V/I/A]-[LN/A]-G-S-[NG]-H (SEC ID n.° 73).Preferably, the peptide comprises, essentially consists of or consists of a sequence of WYF-[V/I/A]-[K/R]-Xa-Xb-Xc-NRW-[V/I/A]-Xd-GS -Xe-H (SEQ ID NO: 72), wherein Xa, Xb and Xc are a polar amino acid, Xd is an aliphatic amino acid and Xe is any amino acid. More preferably, the peptide comprises, essentially consists of or consists of a sequence of WYF-[V/I/A]-[K/R]-[S/N]-[S/Q/K]-[E/K /S/Q]-NRW-[V/I/A]-[L N /A]-GS-[ N G]-H (SEQ ID NO: 73).
En un aspecto preferido, el péptido comprende, esencialmente consiste en o consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID n.° 61-68 In a preferred aspect, the peptide comprises, essentially consists of or consists of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO:61-68
En un aspecto, el péptido comprende una secuencia de 24 restos que tiene al menos 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 26 a 49 de la SEC ID n.° 1 y comprendiendo dicha secuencia las secuencias N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21) y W-[lN/A]-X4-G-S (SEC ID n.° 69), en la que X4 es cualquier aminoácido y una secuencia de unión entre la SEC ID n.° 21 y la SEC ID n.° 69 de 4-7 aminoácidos.In one aspect, the peptide comprises a 24-residue sequence having at least 40% identity with the sequence at positions 26 to 49 of SEQ ID NO: 1 and said sequence comprising the sequences N/DDLWYF-[V/ I/A] (SEQ ID NO: 21) and W-[l N /A]-X4-GS (SEQ ID NO: 69), wherein X4 is any amino acid and a linker sequence between SEQ ID NO: #21 and SEQ ID #69 of 4-7 amino acids.
Preferentemente, el péptido comprende las secuencias de L-X1-X2-X3-N-D-L-W-Y-F-V/I (SEC ID n.° 23) y la W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 22), en la que X1, X2, X3 y X4 son cualquier aminoácido. Más preferentemente, X1 es alanina, ácido aspártico o ácido glutámico, X2 es lisina, asparagina o ácido aspártico y X3 es valina, isoleucina o glutamina. Preferably, the peptide comprises the sequences of L-X1-X2-X3-NDLWYFV/I (SEQ ID NO: 23) and WI N -X4-GS (SEQ ID NO: 22), wherein X1, X2 , X3 and X4 are any amino acid. More preferably, X1 is alanine, aspartic acid or glutamic acid, X2 is lysine, asparagine or aspartic acid and X3 is valine, isoleucine or glutamine.
Preferentemente, el péptido comprende las secuencias L-A-K-V-N-D-L-W-Y-F-V (SEC ID n.° 24) y W-lN-X4-G-S (SEC ID n.° 22), en las que X4 es un aminoácido hidrofóbico, preferentemente leucina, valina, alanina o metionina.Preferably, the peptide comprises the sequences LAKVNDLWYFV (SEQ ID NO: 24) and Wl N -X4-GS (SEQ ID NO: 22), wherein X4 is a hydrophobic amino acid, preferably leucine, valine, alanine or methionine.
Preferentemente, la valina o isoleucina en la secuencia de N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21) tiene una configuración D y la isoleucina o valina en la secuencia W -IN -X4-G-S (SEC ID n.° 22) tiene una configuración D. Preferably, the valine or isoleucine in the sequence N/DDLWYF- [V/I/A] (SEQ ID NO: 21) has a D configuration and the isoleucine or valine in the sequence W- I N -X4-GS ( SEQ ID NO: 22) has a D configuration.
En un aspecto preferido, el péptido comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de SEC ID n.° 20 y la valina en la posición 19 está en configuración D y la isoleucina en la posición 27 está en configuración D. In a preferred aspect, the peptide comprises, consists essentially of or consists of the sequence of SEQ ID NO: 20 and the valine at position 19 is in D configuration and the isoleucine at position 27 is in D configuration.
La presente descripción se refiere también a una composición farmacéutica que comprende un péptido de acuerdo con la presente descripción.The present description also relates to a pharmaceutical composition comprising a peptide according to the present description.
La presente descripción además se refiere a un péptido de acuerdo con la presente descripción para su uso como un medicamento, preferible como antimicrobiano, más preferentemente como antibacteriano. Se refiere al uso de un péptido según la presente descripción para la fabricación de un medicamento, preferentemente un agente antimicrobiano, más preferentemente un antibacteriano. La presente descripción se refiere a un método para tratar a un sujeto que lo necesite, que comprende administrar una cantidad terapéutica de un péptido de acuerdo con la presente descripción.The present description further relates to a peptide according to the present description for use as a medicament, preferably as an antimicrobial, more preferably as an antibacterial. It refers to the use of a peptide according to the present description for the manufacture of a medicament, preferably an antimicrobial agent, more preferably an antibacterial. The present description relates to a method of treating a subject in need thereof, comprising administering a therapeutic amount of a peptide according to the present description.
La presente descripción se refiere a un método in vitro para preparar un péptido de acuerdo con la presente descripción, en el que el procedimiento comprende una etapa de poner en contacto un péptido que comprende una secuencia de 17 restos que tiene al menos un 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 33 a 49 de la SEC ID n.° 1 y comprendiendo dicha secuencia las secuencias W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 71) y W-[lN/A]-X4-G-S (SEC ID n.° 69), en la que X4 es cualquier aminoácido y una secuencia de unión entre la SEC ID n.° 69 y la SEC ID n.° 71 de 4-8 aminoácidos, con una epimerasa del péptido SAM radical que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 30 % de identidad con la SEC ID n.° 25 y en la que el 70 % de las posiciones 14-15, 18, 20-24, 27, 58-60, 63, 83, 84, 87-90, 112, 115, 117, 120, 150, 152, 169, 176, 180, 181, 183, 204, 206-208, 214, 217, 220-225, 228, 230, 252, 254, 262, 289, 292, 296 y 309 de la SEC ID n.° 25 están conservadas.The present description relates to an in vitro method for preparing a peptide according to the present description, wherein the method comprises a step of contacting a peptide comprising a sequence of 17 residues having at least 40% identity with the sequence at positions 33 to 49 of SEQ ID NO: 1 and said sequence comprising the sequences WYF-[V/I/A] (SEQ ID NO: 71) and W-[l N /A] -X4-GS (SEQ ID NO: 69), where X4 is any amino acid and a junction sequence between SEQ ID NO: 69 and SEQ ID NO: 71 of 4-8 amino acids, with an epimerase of the radical SAM peptide having an amino acid sequence that has at least 30% identity with SEQ ID NO: 25 and in which 70% of positions 14-15, 18, 20-24, 27, 58 -60, 63, 83, 84, 87-90, 112, 115, 117, 120, 150, 152, 169, 176, 180, 181, 183, 204, 206-208, 214, 217, 220-225, 228 , 230, 252, 254, 262, 289, 292, 296 and 309 of SEQ ID NO: 25 are retained.
En un aspecto, el péptido comprende una secuencia de 24 restos que tiene al menos 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 26 a 49 de la SEC ID n.° 1 y comprendiendo dicha secuencia las secuencias N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21) y W-lN-X4-G-S (SEC ID n.° 22), en la que X4 es cualquier aminoácido y una secuencia de unión entre la SEC ID n.° 21 y la SEC ID n.° 22 de 4-7 aminoácidos.In one aspect, the peptide comprises a 24-residue sequence having at least 40% identity with the sequence at positions 26 to 49 of SEQ ID NO: 1 and said sequence comprising the sequences N/DDLWYF-[V/ I/A] (SEQ ID NO: 21) and Wl N -X4-GS (SEQ ID NO: 22), wherein X4 is any amino acid and a junction sequence between SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 of 4-7 amino acids.
Se refiere además al uso de una epimerasa del péptido SAM radical que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 30 % de identidad con la SEC ID n.° 25 y en la que el 70 % de las posiciones 14-15, 18, 20-24, 27, 58-60, 63, 83, 84, 87-90, 112, 115, 117, 120, 150, 152, 169, 176, 180, 181, 183, 204, 206-208, 214, 217, 220-225, 228, 230, 252, 254, 262, 289, 292, 296, y 309 de la SEC ID n.° 25 están conservadas para la preparación de un péptido de acuerdo con la presente descripción.It further relates to the use of a radical SAM peptide epimerase having an amino acid sequence that has at least 30% identity with SEQ ID NO: 25 and in which 70% of positions 14-15, 18 , 20-24, 27, 58-60, 63, 83, 84, 87-90, 112, 115, 117, 120, 150, 152, 169, 176, 180, 181, 183, 204, 206-208, 214 , 217, 220-225, 228, 230, 252, 254, 262, 289, 292, 296, and 309 of SEQ ID NO: 25 are conserved for the preparation of a peptide according to the present description.
La presente descripción también se refiere a una célula huésped recombinante que comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica un péptido que comprende una secuencia de 17 restos que tiene al menos un 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 33 a 49 de la SEC ID n.° 1 a y comprendiendo dicha secuencia las secuencias W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 71) y W-[lN/A]-X4-G-S (SEC ID n.° 69), en las que X4 es cualquier aminoácido y una secuencia de unión entre la SEC ID n.° 69 y la SEC ID n.° 71 de 4-8 aminoácidos y un ácido nucleico heterólogo que codifica una epimerasa que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 30 % de identidad con la SEC ID n.° 25 y en la que el 70 % de las posiciones 14-15, 18, 20-24, 27, 58-60, 63, 83, 84, 87-90, 112, 115, 117, 120, 150, 152, 169, 176, 180, 181, 183, 204, 206-208, 214, 217, 220-225, 228, 230, 252, 254, 262, 289, 292, 296 y 309 de la SEC ID n.° 25 y que es capaz de coexpresar el péptido y la epimerasa. En un aspecto, el péptido comprende una secuencia de 24 restos que tiene al menos 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 26 a 49 de la SEC ID n.° 1 y dicha secuencia comprende las secuencias N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21) y W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 22), en el que X4 es cualquier aminoácido, y una secuencia de unión entre la SEC ID n.° 21 y SEC ID n.° 22, de 4 7 aminoácidos.The present disclosure also relates to a recombinant host cell comprising a heterologous nucleic acid encoding a peptide comprising a 17-residue sequence having at least 40% identity to the sequence at positions 33 to 49 of SEQ ID NO: No. 1 a and said sequence comprising the sequences WYF-[V/I/A] (SEQ ID No. 71) and W-[l N /A]-X4-GS (SEQ ID No. 69), in wherein least 30% identity with SEQ ID NO: 25 and in which 70% of positions 14-15, 18, 20-24, 27, 58-60, 63, 83, 84, 87-90, 112, 115, 117, 120, 150, 152, 169, 176, 180, 181, 183, 204, 206-208, 214, 217, 220-225, 228, 230, 252, 254, 262, 289, 292, 296 and 309 of SEQ ID NO: 25 and which is capable of co-expressing the peptide and the epimerase. In one aspect, the peptide comprises a 24-residue sequence having at least 40% identity with the sequence at positions 26 to 49 of SEQ ID NO: 1 and said sequence comprises the sequences N/DDLWYF-[V/ I/A] (SEQ ID NO: 21) and WI N -X4-GS (SEQ ID NO: 22), wherein X4 is any amino acid, and a junction sequence between SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22, of 4 7 amino acids.
Para finalizar, la presente descripción se refiere a un método para preparar un péptido de acuerdo con la presente descripción, en el que el método comprende cultivar una célula huésped recombinante de acuerdo con la presente descripción en condiciones adecuadas para la coexpresión del péptido y la epimerasa y recuperar el péptido que tiene al menos un aminoácido con configuración D o métodos sintéticos utilizados para la síntesis de péptidos, que permiten el ensamblaje de aminoácidos con configuración L y D Finally, the present description relates to a method for preparing a peptide according to the present description, wherein the method comprises culturing a recombinant host cell according to the present description under conditions suitable for co-expression of the peptide and the epimerase. and recovering the peptide that has at least one amino acid with D configuration or synthetic methods used for the synthesis of peptides, which allow the assembly of amino acids with L and D configuration
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓNDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Al estudiar el operón yydFGHIJ de Bacillus subtilis, los inventores identificaron en primer lugar una nueva clase de péptidos antimicrobianos y, en segundo lugar, una epimerasa capaz de convertir in vitro un aminoácido de configuración L en un resto de configuración D en el péptido. Por lo tanto, esta epimerasa es útil para la ingeniería de péptidos.By studying the yydFGHIJ operon of Bacillus subtilis, the inventors identified firstly a new class of antimicrobial peptides and, secondly, an epimerase capable of converting in vitro an L-configuration amino acid into a D-configuration residue in the peptide. Therefore, this epimerase is useful for peptide engineering.
Péptido antimicrobianoAntimicrobial peptide
En una búsqueda de genes implicados en la regulación del sistema de dos componentes LiaRS presumiblemente involucrado en la detección de la integridad de la pared celular bacteriana, Butcher et al. (2007, J. Bacteriol., 189, 8616) identificaron un operón YydFGHIJ que parecía inducir la expresión de LiaRS. Sin embargo, ningún componente de este operón se pudo aislar o investigar in vitro. In a search for genes involved in the regulation of the LiaRS two-component system presumably involved in sensing bacterial cell wall integrity, Butcher et al. (2007, J. Bacteriol., 189 , 8616) identified a YydFGHIJ operon that appeared to induce LiaRS expression. However, no component of this operon could be isolated or investigated in vitro.
Los inventores mostraron que el operón produce un péotido YydF y que este péptido es modificado postraduccionalmente por la enzima YydG que, muy sorprendentemente, codifica una nueva clase de epimerasa SAM radical. Además, los inventores descubrieron que el péptido YydF tiene actividad antimicrobiana pero solo si comprende los aminoácidos de configuración D. En ausencia de aminoácidos de configuración D, el péptido está desprovisto de esta actividad antimicrobiana, una característica desconocida hasta la fecha en los péptidos bioactivos. Más particularmente, se requieren dos aminoácidos de configuración D para esta actividad antimicrobiana.The inventors showed that the operon produces a YydF peptide and that this peptide is post-translationally modified by the enzyme YydG which, very surprisingly, encodes a new class of radical SAM epimerase. Furthermore, the inventors discovered that the YydF peptide has antimicrobial activity but only if it comprises D-configuration amino acids. In the absence of D-configuration amino acids, the peptide is devoid of this antimicrobial activity, a characteristic unknown to date in bioactive peptides. More particularly, two D-configuration amino acids are required for this antimicrobial activity.
Por consiguiente, en un aspecto, la presente descripción se refiere a un péptido que tiene al menos un aminoácido con configuración D, preferentemente dos aminoácidos con configuración D, que comprende una secuencia de 17 restos que tienen al menos un 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 33 a 49 de la SEC ID n.° 1. En particular, el péptido puede comprender una secuencia de 17 restos que tienen al menos un 45, 50, 55, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % de identidad con la secuencia en las posiciones 33 a 49 de la SEC ID n.° 1. Como alternativa, el péptido puede comprender una secuencia de 17 restos en las posiciones 33 a 49 de la SEC ID n.° 1, y 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones, adiciones o deleciones.Accordingly, in one aspect, the present disclosure relates to a peptide having at least one D-configuration amino acid, preferably two D-configuration amino acids, comprising a sequence of 17 residues having at least 40% identity with the sequence at positions 33 to 49 of SEQ ID NO: 1. In particular, the peptide may comprise a sequence of 17 residues having at least a 45, 50, 55, 60, 70, 80, 85, 90, 95 , 98 or 99% identity with the sequence at positions 33 to 49 of SEQ ID NO: 1. Alternatively, the peptide may comprise a sequence of 17 residues at positions 33 to 49 of SEQ ID NO: 1, and 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 substitutions, additions or deletions.
En un aspecto preferido, el péptido comprende una secuencia en la que se conservan los restos en las posiciones 33 35, 40-43, 46 y 47 de la SEC ID n.° 1. En un aspecto adicional, los restos en las posiciones 36 y 44 de la SEC ID n.° 1 se seleccionan del grupo que consiste en V, I y A, preferentemente V e I.In a preferred aspect, the peptide comprises a sequence in which residues at positions 33, 35, 40-43, 46 and 47 of SEQ ID NO: 1 are conserved. In a further aspect, residues at positions 36 and 44 of SEQ ID NO: 1 are selected from the group consisting of V, I and A, preferably V and I.
En un aspecto preferido, la presente descripción se refiere a un péptido que tiene al menos dos aminoácidos con configuración D, que comprende una secuencia de 17 restos que tiene al menos un 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 33 a 49 de la SEC ID n.° 1 y que incluye la secuencia W-[lN/A]-X4-G-S (SEC ID n.° 69), en la que X4 es un aminoácido hidrófobo, preferentemente leucina, valina o alanina. En particular, el péptido puede comprender una secuencia de 17 restos que tienen al menos un 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 85, 90 o 95 % de identidad con la secuencia en las posiciones 33 a 49 de la SEC ID n.° 1. Opcionalmente, el péptido comprende además la secuencia de W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 71). Preferentemente, los aminoácidos [V/I/A] de las SEC ID n.os 69 y 71 son aminoácidos de configuración D. En la secuencia peptídica, cuando se considera la orientación desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal, la secuencia W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 71) está antes que la secuencia W-[lN/A]-X4-G-S (SEC ID n.° 69), preferentemente W-[lN]-X4-G-S (SEC ID n.° 22). En un aspecto preferido, el motivo W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 71) está separado del motivo W-[lN/A]-X4-G-S (SEC ID n.° 69), preferentemente W-[lN]-X4-G-S (SEC ID n.° 22), por una secuencia de unión que comprende de cuatro a ocho aminoácidos, preferentemente, una secuencia de unión de cinco o siete aminoácidos, preferentemente de seis aminoácidos. En un aspecto más preferido, el péptido comprende una secuencia de W-Y-F-[V/I/A]-[K/R]-Xa-Xb-Xc-N-R-W-[V/I/A]-Xd-G-S-Xe-H (SEC ID n.° 72), en la que Xa, Xb y Xc son un aminoácido polar, Xd es un aminoácido alifático y Xe es cualquier aminoácido. Preferentemente, Xa se selecciona del grupo que consiste en S, N, C y T, más preferentemente es S o N. Preferentemente, Xb se selecciona del grupo que consiste en S, N, T, Q, D, E, K, R y H, más preferentemente se selecciona del grupo que consiste en S, N, Q y K, aún más preferentemente S, Q y K. Preferentemente, Xc se selecciona entre el grupo que consiste en S, N, T, Q, D, E, K, R y H, más preferentemente se selecciona del grupo que consiste en S, N, Q, E, R y K, aún más preferentemente E, K, S y Q. Preferentemente, Xd se selecciona entre el grupo que consiste en L, I, V A, más preferentemente L, V y A. Preferentemente, Xe se selecciona entre el grupo que consiste en A, G o S, más preferentemente A o G.In a preferred aspect, the present description relates to a peptide having at least two amino acids with a D configuration, comprising a sequence of 17 residues that has at least 40% identity with the sequence at positions 33 to 49 of the SEQ ID NO: 1 and including the sequence W-[l N /A]-X4-GS (SEQ ID NO: 69), wherein X4 is a hydrophobic amino acid, preferably leucine, valine or alanine. In particular, the peptide may comprise a sequence of 17 residues that have at least 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with the sequence at positions 33 to 49 of the SEQ ID NO: 1. Optionally, the peptide further comprises the sequence of WYF-[V/I/A] (SEQ ID NO: 71). Preferably, the amino acids [V/I/A] of SEQ ID NOs 69 and 71 are D-configuration amino acids. In the peptide sequence, when considering the orientation from the N-terminal end to the C-terminal end, the sequence WYF-[V/I/A] (SEQ ID NO: 71) is before the sequence W-[l N /A]-X4-GS (SEQ ID NO: 69), preferably W-[l N ]-X4-GS (SEQ ID NO: 22). In a preferred aspect, the WYF-[V/I/A] motif (SEQ ID NO: 71) is separated from the W-[l N /A]-X4-GS motif (SEQ ID NO: 69), preferably W-[l N ]-X4-GS (SEQ ID NO: 22), by a binding sequence comprising four to eight amino acids, preferably a binding sequence of five or seven amino acids, preferably six amino acids. In a more preferred aspect, the peptide comprises a sequence of WYF-[V/I/A]-[K/R]-Xa-Xb-Xc-NRW-[V/I/A]-Xd-GS-Xe- H (SEQ ID NO: 72), wherein Xa, Xb and Xc are a polar amino acid, Xd is an aliphatic amino acid and Xe is any amino acid. Preferably, Xa is selected from the group consisting of S, N, C and T, more preferably it is S or N. Preferably, Xb is selected from the group consisting of S, N, T, Q, D, E, K, R and H, more preferably selected from the group consisting of S, N, Q and K, even more preferably S, Q and K. Preferably, Xc is selected from the group consisting of S, N, T, Q, D, E, K, R and H, more preferably selected from the group consisting of S, N, Q, E, R and K, even more preferably E, K, S and Q. Preferably, Xd is selected from the group consisting in L, I, VA, more preferably L, V and A. Preferably, Xe is selected from the group consisting of A, G or S, more preferably A or G.
En un aspecto muy específico, el péptido consiste esencialmente o consiste en una secuencia de W-Y-F-[V/I/A]-[K/R]-[S/N]-[S/Q/K]-[E/K/S/Q]-N-R-W-[V/I/A]-[LN/A]-G-S-[NG]-H (SEC ID n.° 73).In a very specific aspect, the peptide essentially consists of or consists of a sequence of WYF-[V/I/A]-[K/R]-[S/N]-[S/Q/K]-[E/K /S/Q]-NRW-[V/I/A]-[L N /A]-GS-[ N G]-H (SEQ ID NO: 73).
En un aspecto de la descripción, el péptido comprende, esencialmente consiste en o consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las s Ec ID n.° 61-68.In one aspect of the description, the peptide comprises, essentially consists of or consists of a sequence selected from the group consisting of Ec ID Nos. 61-68.
En un aspecto, la presente descripción se refiere a un péptido que tiene al menos un aminoácido con configuración D, preferentemente dos aminoácidos con configuración D, que comprende una secuencia de 24 restos que tienen al menos un 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 26 a 49 de la SEC ID n.° 1. En particular, el péptido puede comprender una secuencia de 24 restos que tienen al menos un 45, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % de identidad con la secuencia en las posiciones 26 a 49 de la SEC ID n.° 1. Como alternativa, el péptido puede comprender una secuencia de 24 restos en las posiciones 26 a 49 de la SEC ID n.° 1, y 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones, adiciones o deleciones.In one aspect, the present disclosure relates to a peptide having at least one D-configuration amino acid, preferably two D-configuration amino acids, comprising a sequence of 24 residues having at least 40% identity with the sequence in the positions 26 to 49 of SEQ ID NO: 1. In particular, the peptide may comprise a sequence of 24 residues having at least 45, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 or 99% of identity with the sequence at positions 26 to 49 of SEQ ID NO: 1. Alternatively, the peptide may comprise a sequence of 24 residues at positions 26 to 49 of SEQ ID NO: 1, and 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 substitutions, additions or deletions.
En un aspecto preferido, el péptido comprende una secuencia en la que se conservan los restos en las posiciones 26, 31-35, 43, 46 y 47 de la SEC ID n.° 1. En un aspecto adicional, uno o varios restos en las posiciones 23, 25, 27-30, 36, 37, 38, 41, 42, 44, 48 y 49 de la SEC ID n.° 1 también se conservan. Por ejemplo, 1-11 restos en las posiciones 23, 25, 27-30, 36, 37, 38, 41, 42, 44, 48 y 49 de la SEC ID n.° 1 se pueden conservar, especialmente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 restos. Más preferentemente, los restos en las posiciones 23, 25, 27-30, 36, 37, 38, 41, 42, 44, 48 y 49 de la SEC ID n.° 1 se conservan. Aún más preferentemente, los restos en las posiciones 25, 29, y 38 de la SEC iD n.° 1 se conservan.In a preferred aspect, the peptide comprises a sequence in which residues at positions 26, 31-35, 43, 46 and 47 of SEQ ID NO: 1 are conserved. In a further aspect, one or more residues in Positions 23, 25, 27-30, 36, 37, 38, 41, 42, 44, 48 and 49 of SEQ ID NO: 1 are also retained. For example, 1-11 residues at positions 23, 25, 27-30, 36, 37, 38, 41, 42, 44, 48 and 49 of SEQ ID NO: 1 can be retained, especially 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or 11 remains. More preferably, the residues at positions 23, 25, 27-30, 36, 37, 38, 41, 42, 44, 48 and 49 of SEQ ID NO: 1 are retained. Even more preferably, the residues at positions 25, 29, and 38 of SEQ ID NO: 1 are conserved.
Después, un péptido de acuerdo con la presente descripción comprende las secuencias N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21), en particular L-X1-X2-X3-N-D-L-W-Y-F-V/I (SEC ID n.° 23), o/y W-IN/A-X4-G-S (SEC ID n.° 22), en las que X1, X2, X3 y X4 son cualquier aminoácido. Opcionalmente, el péptido comprende ambas secuencias. Opcionalmente, la secuencia W-IN/A-X4-G-S (SEC ID n.° 69) es la secuencia de W-lN-X4-G-S (SEC ID n.° 22). Preferentemente, X1 es alanina, ácido aspártico o ácido glutámico, preferentemente alanina y ácido aspártico, más preferentemente alanina. Preferentemente, X2 es lisina, asparagina o ácido aspártico, preferentemente lisina o asparagina, más preferentemente lisina. Preferentemente, X3 es valina, isoleucina o glutamina, preferentemente valina o isoleucina, más preferentemente valina. Preferentemente, X4 es un aminoácido hidrófobo, preferentemente leucina, valina, alanina o metionina. En un aspecto particular, X1 es alanina y ácido aspártico, preferentemente alanina, X2 es lisina o asparagina, preferentemente lisina, X3 es valina o isoleucina, preferentemente valina, y X4 es un aminoácido hidrófobo, preferentemente leucina, valina o alanina. En un aspecto preferido, el péptido comprende las secuencias L-A-K-V-N-D-L-W-Y-F-V (SEC ID n.° 24), y W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 22), en las que X4 es un aminoácido hidrófobo, preferentemente leucina, valina o alanina. “IN” o “V/l” significa en el presente documento isoleucina o valina. “N/D” significa en el presente documento asparagina o ácido aspártico. “IN/A” significa en el presente documento isoleucina, valina o alanina.Next, a peptide according to the present description comprises the sequences N/DDLWYF-[V/I/A] (SEQ ID NO: 21), in particular L-X1-X2-X3-NDLWYFV/I (SEQ ID NO: 23), or/and W-IN/A-X4-GS (SEQ ID NO 22), wherein X1, X2, X3 and X4 are any amino acid. Optionally, the peptide comprises both sequences. Optionally, the sequence WI N /A-X4-GS (SEQ ID NO: 69) is the sequence of W-lN-X4-GS (SEQ ID NO: 22). Preferably, X1 is alanine, aspartic acid or glutamic acid, preferably alanine and aspartic acid, more preferably alanine. Preferably, X2 is lysine, asparagine or aspartic acid, preferably lysine or asparagine, more preferably lysine. Preferably, X3 is valine, isoleucine or glutamine, preferably valine or isoleucine, more preferably valine. Preferably, X4 is a hydrophobic amino acid, preferably leucine, valine, alanine or methionine. In a particular aspect, X1 is alanine and aspartic acid, preferably alanine, X2 is lysine or asparagine, preferably lysine, X3 is valine or isoleucine, preferably valine, and In a preferred aspect, the peptide comprises the sequences LAKVNDLWYFV (SEQ ID NO: 24), and W-IN-X4-GS (SEQ ID NO: 22), wherein X4 is a hydrophobic amino acid, preferably leucine, valine or alanine. “IN” or “V/l” means herein isoleucine or valine. “N/A” means herein asparagine or aspartic acid. “IN/A” means herein isoleucine, valine or alanine.
En un aspecto preferido, en la secuencia W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 22), lN es una isoleucina (SEC ID n.° 57). Como alternativa, en la secuencia W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 22), lN es una valina (SEC ID n.° 58). En otro aspecto, W-IN/A-X4-G-S (SEC ID n.° 69) es W-A-X4-G-S (SEC ID n.° 70). Preferentemente, X4 es un aminoácido hidrófobo, más preferentemente leucina, valina, alanina o metionina, aún más preferentemente leucina, valina o alanina.In a preferred aspect, in the sequence W-IN-X4-G-S (SEQ ID NO: 22), lN is an isoleucine (SEQ ID NO: 57). Alternatively, in the sequence W-IN-X4-G-S (SEQ ID NO:22), lN is a valine (SEQ ID NO:58). In another aspect, W-IN/A-X4-G-S (SEQ ID NO: 69) is W-A-X4-G-S (SEQ ID NO: 70). Preferably, X4 is a hydrophobic amino acid, more preferably leucine, valine, alanine or methionine, even more preferably leucine, valine or alanine.
En un aspecto preferente, en la secuencia N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21) y N/D es asparagina e lN es valina. Como alternativa, en la secuencia de N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21) y N/D es ácido aspártico e IN es isoleucina.In a preferred aspect, in the sequence N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEQ ID NO: 21) and N/D is asparagine and lN is valine. Alternatively, in the sequence of N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEQ ID NO: 21) and N/D is aspartic acid and IN is isoleucine.
En la secuencia peptídica, cuando se considera la orientación desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal, la secuencia N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21), en particular L-X1-X2-X3-N-D-L-W-Y-F-V/I (SEC ID n.° 23), es antes de la secuencia W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 22).In the peptide sequence, when considering the orientation from the N-terminal end to the C-terminal end, the sequence N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEQ ID NO: 21), in particular L-X1- X2-X3-N-D-L-W-Y-F-V/I (SEQ ID NO: 23), is before the sequence W-IN-X4-G-S (SEQ ID NO: 22).
En un aspecto preferido, el motivo N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21) está separado del motivo W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 22) por una secuencia de unión que comprende de cuatro a siete aminoácidos, preferentemente, una secuencia de unión de cinco o seis aminoácidos, preferentemente de cinco aminoácidos. En el aspecto más preferido, el péptido comprende una secuencia de N/D-D-L-W-Y-F-V/I-(X)5-W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 59) o N/D-D-L-W-Y-F-V/I-(x )6-W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 60), X4 tiene el mismo significado que antes.In a preferred embodiment, the N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] motif (SEQ ID NO: 21) is separated from the W-IN-X4-G-S motif (SEQ ID NO: 22) by a linker sequence. comprising four to seven amino acids, preferably, a binding sequence of five or six amino acids, preferably five amino acids. In the most preferred aspect, the peptide comprises a sequence of N/D-D-L-W-Y-F-V/I-(X)5-W-IN-X4-G-S (SEQ ID NO: 59) or N/D-D-L-W-Y-F-V/I-(x)6- W-IN-X4-G-S (SEQ ID NO. 60), X4 has the same meaning as before.
Por tanto, en un aspecto preferido, la presente descripción se refiere a un péptido que tiene al menos un aminoácido con configuración D, que comprende una secuencia de 24 restos que tiene al menos un 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 26 a 49 de la SEC ID n.° 1 e incluye las secuencias L-A-K-V-N-D-L-W-Y-F-V (SEC ID n.° 24) y/o W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 22), en las que X4 es un aminoácido hidrófobo, preferentemente leucina, valina o alanina. En particular, el péptido puede comprender una secuencia de 24 restos que tienen al menos 45, 50, 60, 70, 80, 85, 90 o 95 % de identidad con la secuencia en las posiciones 26 a 49 de la SEC ID n.° 1. En un aspecto preferido, uno o varios restos en las posiciones 23, 25, 27-30, 36, 37, 38, 41, 42, 44, 48 y 49 de la SEC ID n.° 1 también se conservan, especialmente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 restos.Therefore, in a preferred aspect, the present description relates to a peptide having at least one amino acid with D configuration, comprising a sequence of 24 residues that has at least 40% identity with the sequence at positions 26 to 49 of SEQ ID NO: 1 and includes the sequences LAKVNDLWYFV (SEQ ID NO: 24) and/or WI N -X4-GS (SEQ ID NO: 22), wherein X4 is a hydrophobic amino acid, preferably leucine, valine or alanine. In particular, the peptide may comprise a sequence of 24 residues having at least 45, 50, 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with the sequence at positions 26 to 49 of SEQ ID NO: 1. In a preferred aspect, one or more residues at positions 23, 25, 27-30, 36, 37, 38, 41, 42, 44, 48 and 49 of SEQ ID NO: 1 are also conserved, especially 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or 11 remains.
El péptido comprende al menos un aminoácido con configuración D, preferentemente dos aminoácidos con configuración D. Por ejemplo, puede comprender 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos con configuración D. Opcionalmente, los aminoácidos con configuración D pueden ser cualquier aminoácido, preferentemente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, V, A, N, S y T, más preferentemente seleccionado entre el grupo que consiste en I, V y A, aún más preferentemente seleccionado entre el grupo que consiste en I y V.The peptide comprises at least one amino acid with D configuration, preferably two amino acids with D configuration. For example, it may comprise 1, 2, 3, 4 or 5 amino acids with D configuration. Optionally, the amino acids with D configuration can be any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of I, V, A, N, S and T, more preferably selected from the group consisting of I, V and A, even more preferably selected from the group consisting of I and V.
En un aspecto particular, el aminoácido valina, isoleucina o alanina en la secuencia N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21) tiene una configuración D y/o la isoleucina, valina o alanina en la secuencia W-[lN/A]-X4-G-S (SEC ID n.° 69), preferentemente W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 22), tiene una configuración D. En un aspecto preferido, los aminoácidos valina, isoleucina o alanina en la secuencia N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21) y la isoleucina, valina o alanina en la secuencia W-[lN/A]-X4-G-S (SEC ID n.° 69), preferentemente W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 22), tienen una configuración D. En un aspecto preferido, la valina o isoleucina en la secuencia de N/D-D-L-W-Y-F-V/l-(X)5-W-lN-X4-G-S (SEC ID n.° 59) o N/D-D-L-W-Y-F-V/l-(X)6-W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 60) tienen una configuración D. In a particular aspect, the amino acid valine, isoleucine or alanine in the sequence N/DDLWYF- [V/I/A] (SEQ ID NO: 21) has a D configuration and/or the isoleucine, valine or alanine in the sequence W-[lN/A]-X4-GS (SEQ ID NO: 69), preferably W- IN -X4-GS (SEQ ID NO: 22), has a D configuration. In a preferred aspect, the amino acids valine , isoleucine or alanine in the sequence N/DDLWYF- [V/I/A] (SEQ ID NO: 21) and isoleucine, valine or alanine in the sequence W-[lN/A]-X4-GS (SEQ ID No. 69), preferably W- IN -X4-GS (SEQ ID NO: 22), have a D configuration. In a preferred aspect, valine or isoleucine in the sequence of N / DDLWYF- V / l -( X) 5-W- L N-X4-GS (SEC ID No. 59) O N/DDLWYF- V/L- (X) 6-W- I N-X4-GS (SEC ID N. 60) They have a D configuration.
Opcionalmente, el péptido puede comprender un aminoácido adicional con configuración D.Optionally, the peptide may comprise an additional amino acid with D configuration.
Preferentemente, la longitud del péptido no es superior a aproximadamente 65 aminoácidos, más preferentemente no superior a 50 aminoácidos, en particular puede ser de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 aminoácidos, por ejemplo, de aproximadamente 17 a aproximadamente 50 aminoácidos, de aproximadamente 18 a aproximadamente 50 aminoácidos, de aproximadamente 17 a aproximadamente 40, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 o de aproximadamente 25 a aproximadamente 35 aminoácidos.Preferably, the length of the peptide is not more than about 65 amino acids, more preferably not more than 50 amino acids, in particular it may be about 15 to about 50 amino acids, for example, about 17 to about 50 amino acids, about 18 to about 50 amino acids, from about 17 to about 40, from about 20 to about 40 or from about 25 to about 35 amino acids.
El péptido puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC ID n.° 1-19 o un fragmento funcional de las mismas que comprende las secuencias N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21), en particular L-X1-X2-X3-N-D-L-W-Y-F-V/I (SEC ID n.° 23), y/o W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 22), más preferentemente L-A-K-V-N-D-L-W-Y-F-V (SEC ID n.° 24), and W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 22). Por funcional se quiere decir que tenga una actividad antimicrobiana, especialmente una actividad antibacteriana.The peptide may comprise, consist essentially of or consist of a sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1-19 or a functional fragment thereof comprising the sequences N/DDLWYF-[ V/I/A] (SEQ ID NO: 21), in particular L-X1-X2-X3-NDLWYFV/I (SEQ ID NO: 23), and/or WI N -X4-GS (SEQ ID NO: 22), more preferably LAKVNDLWYFV (SEQ ID NO 24), and W-IN-X4-GS (SEQ ID NO 22). By functional we mean that it has antimicrobial activity, especially antibacterial activity.
En un aspecto muy particular, el péptido comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de SEC ID n.° 20 y la valina en la posición 19 está en configuración D y/o la isoleucina en la posición 27 está en configuración D. Preferentemente, tanto la valina en la posición 19 como la isoleucina en la posición 27 están en configuración D. In a very particular aspect, the peptide comprises, consists essentially of or consists of the sequence of SEQ ID NO: 20 and the valine at position 19 is in D configuration and/or the isoleucine at position 27 is in D configuration. Preferably, both valine at position 19 and isoleucine at position 27 are in D configuration.
En otro aspecto muy particular, el péptido tiene la secuencia de SEC ID n.° 1 y la valina en la posición 36 está en configuración D y/o la isoleucina en la posición 44 está en configuración D. Preferentemente, tanto la valina en la posición 36 como la isoleucina en la posición 44 están en configuración D.In another very particular aspect, the peptide has the sequence of SEQ ID NO: 1 and the valine at position 36 is in D configuration and/or the isoleucine at position 44 is in D configuration. Preferably, both the valine in the position 36 and isoleucine at position 44 are in D configuration.
En un aspecto particular, el péptido no se encuentra en la naturaleza. El péptido es un péptido no natural.In a particular aspect, the peptide is not found in nature. The peptide is a non-natural peptide.
Los extremos N y C de los péptidos descritos en el presente documento pueden estar opcionalmente protegidos contra la proteólisis. En un aspecto preferido, el extremo N-terminal puede estar en forma de un grupo acetilo, y/o el extremo C-terminal puede estar en forma de un grupo amida. En un aspecto preferido, el péptido tiene un extremo C-terminal libre.The N and C termini of the peptides described herein may optionally be protected from proteolysis. In a preferred aspect, the N-terminal end may be in the form of an acetyl group, and/or the C-terminal end may be in the form of an amide group. In a preferred aspect, the peptide has a free C-terminal end.
Como alternativa o además, también se incluyen modificaciones internas de los péptidos que sean resistentes a la proteólisis, por ejemplo en las que al menos un enlace peptídico -CONH- está modificado y reemplazado por un enlace reducido (CH2NH), un enlace retroinverso (NHCO), un enlace metileno-oxi (CH2-O), un enlace tiometileno (CH2-S), un enlace carba (CH2CH2), un enlace cetometileno (CO-CH2), un enlace hidroxietileno (CHOH-CH2)), un enlace (N-N), un enlace E-alceno o también un enlace -CH=CH-.Alternatively or in addition, internal modifications of the peptides that are resistant to proteolysis are also included, for example in which at least one peptide bond -CONH- is modified and replaced by a reduced bond (CH 2 NH), a retroinverse bond (NHCO), a methylene-oxy bond (CH 2 -O), a thiomethylene bond (CH 2 -S), a carba bond (CH 2 CH 2 ), a ketomethylene bond (CO-CH 2 ), a hydroxyethylene bond ( CHOH-CH 2 )), a (NN) bond, an E-alkene bond or also a -CH=CH- bond.
Por ejemplo, el péptido puede modificarse mediante acetilación, acilación, amidación, reticulación, ciclación, formación de enlaces disulfuro, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glucosilación, formación de anclaje a GPI, hidroxilación, yodinación, metilación, miristilación, oxidación, fosforilación, y similares.For example, the peptide can be modified by acetylation, acylation, amidation, cross-linking, cyclization, disulfide bond formation, covalent cross-link formation, cysteine formation, pyroglutamate formation, formylation, gamma-carboxylation, glycosylation, GPI anchor formation, hydroxylation, iodination, methylation, myristylation, oxidation, phosphorylation, and the like.
El péptido de acuerdo con la descripción puede comprender uno o más aminoácidos que son aminoácidos raros, en particular hidroxiprolina, hidroxilisina, alohidroxilisina, 6-N-metilisina, N-etilglicina, N-metilglicina, N-etilasparagina, aloisoleucina, N-metilisoleucina, N-metilvalina, piroglutamina, ácido aminobutírico; o aminoácidos sintéticos, en particular, ornitina, norleucina, norvalina y cyiclohexil-alanina.The peptide according to the description may comprise one or more amino acids that are rare amino acids, in particular hydroxyproline, hydroxylysine, allohydroxylysine, 6-N-methyllysine, N-ethylglycine, N-methylglycine, N-ethylasparagine, alloisoleucine, N-methylisoleucine, N-methylvaline, pyroglutamine, aminobutyric acid; or synthetic amino acids, in particular, ornithine, norleucine, norvaline and cycyclohexyl-alanine.
Opcionalmente, el péptido puede estar unido a un resto adicional, opcionalmente a través de un enlazador o espaciador (por ejemplo, diglicina). Opcionalmente, el péptido puede ser parte de una proteína de fusión. El resto adicional puede ser un resto que facilita su captación o entrada en la célula, en particular un PTD (dominio de transducción de proteína) o péptido de penetración celular; un péptido localizador; un agente estabilizante, tal como PEG (polietilenglicol), oligo-N-metoxi-etilglIcina (NMEG), albúmina, una proteína de unión a albúmina o un dominio Fc de inmunoglobulina; un marcador de afinidad, tal como un marcador inmune, biotina, lectina o quelante; un marcador de purificación, tal como un marcador de His; un marcador detectable, tal como un marcador óptico, una lantamida quelada, un colorante fluorescente o un aceptor/donante FRET; un resto de direccionamiento; un péptido señal de secreción; o una combinación de los mismos. El resto adicional puede añadirse ya sea en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal del péptido. Preferentemente, se añade el resto adicional, ya sea en el extremo N-terminal del péptido.Optionally, the peptide may be linked to an additional moiety, optionally through a linker or spacer (e.g., diglycine). Optionally, the peptide may be part of a fusion protein. The additional residue may be a residue that facilitates its uptake or entry into the cell, in particular a PTD (protein transduction domain) or cell penetrating peptide; a localizing peptide; a stabilizing agent, such as PEG (polyethylene glycol), oligo-N-methoxy-ethylglycine (NMEG), albumin, an albumin binding protein or an immunoglobulin Fc domain; an affinity marker, such as an immune marker, biotin, lectin or chelator; a purification tag, such as a His tag; a detectable label, such as an optical label, a chelated lantamide, a fluorescent dye or a FRET acceptor/donor; a rest of addressing; a secretion signal peptide; or a combination thereof. The additional residue can be added either at the N-terminus or at the C-terminus of the peptide. Preferably, the additional residue is added either at the N-terminal end of the peptide.
En otro aspecto de la descripción, los péptidos están unidos covalentemente a una molécula de polietilenglicol (PEG) por su extremo C-terminal o un resto de lisina, en particular un PEG de 1.500 o 4.000 PM, para una disminución del aclaramiento urinario y en dosis terapéuticas utilizadas y para un aumento de la semivida en el plasma sanguíneo. En aún otro aspecto, la semivida del péptido se incrementa mediante la inclusión del péptido en un material polímero biodegradable y biocompatible para el sistema de administración de fármacos con formación de microesferas. Los polímeros y copolímeros son, por ejemplo, poli(D,L-lactida-co-glicólido) (PLGA) (como se ilustra en el documento US2007/0184015, SoonKap Hahn et al.). In another aspect of the description, the peptides are covalently linked to a polyethylene glycol (PEG) molecule by its C-terminal end or a lysine residue, in particular a PEG of 1,500 or 4,000 MW, for a decrease in urinary clearance and in therapeutic doses used and for an increase in the half-life in blood plasma. In yet another aspect, the half-life of the peptide is increased by inclusion of the peptide in a biodegradable and biocompatible polymeric material for the microsphere-forming drug delivery system. The polymers and copolymers are, for example, poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) (as illustrated in US2007/0184015, SoonKap Hahn et al.).
La descripción también abarca las sales farmacéuticamente aceptables de un péptido de acuerdo con la descripción. Las sales farmacéuticamente aceptables pueden, por ejemplo, ser sales con ácidos minerales farmacéuticamente aceptables, tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico; sales de ácidos orgánicos farmacéuticamente aceptables, tales como ácido acético, ácido cítrico, ácido maleico, ácido málico, ácido succínico, ácido ascórbico y ácido tartárico; sales con bases minerales farmacéuticamente aceptables, tales como sales de sodio, potasio, calcio, magnesio o amonio; o sales de bases orgánicas que contienen un nitrógeno salificable, habitualmente utilizados en la técnica farmacéutica. Los métodos para preparar dichas sales son bien conocidos para un experto en la técnica.The description also encompasses pharmaceutically acceptable salts of a peptide according to the description. Pharmaceutically acceptable salts may, for example, be salts with pharmaceutically acceptable mineral acids, such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid and phosphoric acid; salts of pharmaceutically acceptable organic acids, such as acetic acid, citric acid, maleic acid, malic acid, succinic acid, ascorbic acid and tartaric acid; salts with pharmaceutically acceptable mineral bases, such as sodium, potassium, calcium, magnesium or ammonium salts; or salts of organic bases containing a salifiable nitrogen, usually used in pharmaceutical technology. Methods for preparing said salts are well known to one skilled in the art.
En un aspecto preferido, el péptido está aislado.In a preferred embodiment, the peptide is isolated.
Uso del péptido antimicrobianoUse of antimicrobial peptide
La presente descripción se refiere a una composición farmacéutica que comprende un péptido como se ha definido anteriormente. La composición farmacéutica puede comprender además un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable. Por uso farmacéutico también se contempla el uso veterinario. Opcionalmente, La composición farmacéutica puede comprender además otro ingrediente activo, preferentemente otro agente antimicrobiano, más preferentemente otro antibacteriano o un antiinflamatorio.The present description relates to a pharmaceutical composition comprising a peptide as defined above. The pharmaceutical composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient. For pharmaceutical use, veterinary use is also contemplated. Optionally, the pharmaceutical composition may further comprise another active ingredient, preferably another antimicrobial agent, more preferably another antibacterial or an anti-inflammatory.
La composición farmacéutica que comprende la molécula se formula de acuerdo con la práctica farmacéutica estándar (Lippincott Williams & Wilkins, 2000 y Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick y J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, Nueva York) conocida por un experto en la técnica.The pharmaceutical composition comprising the molecule is formulated in accordance with standard pharmaceutical practice (Lippincott Williams & Wilkins, 2000 and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York) known to an expert in the technique.
La presente descripción también se refiere a un péptido como se ha definido anteriormente para su uso como un medicamento, en particular como un agente antimicrobiano, más preferentemente como un antibacteriano. Se refiere además a la utilización de un péptido como se ha definido anteriormente para la fabricación de un medicamento para su uso como un agente antimicrobiano, más preferentemente como un antibacteriano. Además, se refiere a un método para tratar o prevenir una infección, especialmente una infección bacteriana, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido como se ha definido anteriormente, tratando o previniendo de este modo una infección.The present description also relates to a peptide as defined above for use as a medicament, in particular as an antimicrobial agent, more preferably as an antibacterial. It further relates to the use of a peptide as defined above for the manufacture of a medicament for use as an antimicrobial agent, more preferably as an antibacterial. Furthermore, it relates to a method of treating or preventing an infection, especially a bacterial infection, comprising administering a therapeutically effective amount of a peptide as defined above, thereby treating or preventing an infection.
En un aspecto preferido, el péptido como se ha definido anteriormente es tal que la valina, isoleucina o alanina en la secuencia N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21) y la isoleucina, valina o alanina en la secuencia W-[lN/A]-X4-G-S (SEC ID n.° 69), preferentemente W-IN-X4-G-S (Se C ID n.° 22), tienen una configuración D. En un aspecto muy específico, el péptido comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de SEC ID n.° 20 y la valina en la posición 19 y la isoleucina en la posición 27 están en configuración D. En otro aspecto muy particular, el péptido tiene la secuencia de SEC ID n.° 1 y la valina en la posición 36 y la isoleucina en la posición 44 están en configuración D. En otro aspecto muy particular, el péptido comprende, esencialmente consiste en o consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID n.° 61-68, en las que los restos en las posiciones 4 y 12 están en configuración D.In a preferred aspect, the peptide as defined above is such that valine, isoleucine or alanine in the sequence N/DDLWYF- [V/I/A] (SEQ ID NO: 21) and isoleucine, valine or alanine in the sequence W-[lN/A]-X4-GS (SEQ ID NO: 69), preferably W- IN -X4-GS (SE C ID NO: 22), have a D configuration. In a very specific, the peptide comprises, consists essentially of or consists of the sequence of SEQ ID NO: 20 and the valine at position 19 and isoleucine at position 27 are in D configuration. In another very particular aspect, the peptide has the sequence of SEQ ID NO: 1 and valine at position 36 and isoleucine at position 44 are in D configuration. In another very particular aspect, the peptide comprises, essentially consists of or consists of a sequence selected from the group that consists of SEQ ID NO: 61-68, in which the residues at positions 4 and 12 are in D configuration.
Opcionalmente, el péptido como se ha definido anteriormente se puede usar en combinación con otro fármaco, preferentemente otro antimicrobiano, más preferentemente otro antibacteriano o un agente antiinflamatorio.Optionally, the peptide as defined above may be used in combination with another drug, preferably another antimicrobial, more preferably another antibacterial or an anti-inflammatory agent.
Por “tratar” o “tratamiento” se entiende que la enfermedad se cura, alivia o retrasa. Incluye el tratamiento preventivo o curativo.By “treat” or “treatment” it is understood that the disease is cured, alleviated or delayed. Includes preventive or curative treatment.
La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” como se usa en la presente solicitud quiere decir una cantidad de agente terapéutico, administrada a un paciente que es suficiente para constituir un tratamiento de la infección.The term "therapeutically effective amount" as used in the present application means an amount of therapeutic agent, administered to a patient that is sufficient to constitute a treatment of the infection.
La forma de las composiciones farmacéuticas, la vía de administración, la dosis y el régimen naturalmente dependerán de la afección a tratar, la gravedad de la enfermedad, la edad, el peso y el sexo del paciente, etc.The form of the pharmaceutical compositions, the route of administration, the dosage and the regimen will naturally depend on the condition to be treated, the severity of the disease, the age, weight and sex of the patient, etc.
Las composiciones farmacéuticas de la descripción se pueden formular para administración tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea o intraocular y similares.The pharmaceutical compositions of the description can be formulated for topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous or intraocular administration and the like.
Para administración oral, la composición se puede formular en formas de dosificación orales convencionales, tales como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos y preparaciones líquidas, tales como jarabes, elixires y gotas concentradas. Se pueden usar vehículos o diluyentes sólidos no tóxicos que incluyen, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, magnesio, carbonato y similares. Para comprimidos, también son necesarios aglutinantes, que son agentes que confieren cualidades de cohesión a los materiales en polvo. Por ejemplo, almidón, gelatina, azúcares, tales como lactosa o dextrosa, y gomas naturales o sintéticas se pueden usar como aglutinantes. Los disgregantes son también necesarios en los comprimidos para facilitar la disgregación del comprimido. Los disgregantes incluyen almidones, arcillas, celulosas, alginas, gomas y polímeros reticulados. Además, lubricantes y deslizantes también están incluidos en los comprimidos para evitar la adhesión del material del comprimido a las superficies en el proceso de fabricación y para mejorar las características de flujo del material en polvo durante la fabricación. El dióxido de silicio coloidal se utiliza más habitualmente como deslizante y compuestos tales como talco o ácido esteárico son los más utilizados como lubricantes.For oral administration, the composition can be formulated in conventional oral dosage forms, such as tablets, capsules, powders, granules and liquid preparations, such as syrups, elixirs and concentrated drops. Non-toxic solid carriers or diluents may be used including, for example, pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharin, talc, cellulose, glucose, sucrose, magnesium, carbonate and the like. For tablets, binders are also necessary, which are agents that impart cohesive qualities to powder materials. For example, starch, gelatin, sugars, such as lactose or dextrose, and natural or synthetic gums can be used as binders. Disintegrants are also necessary in tablets to facilitate tablet disintegration. Disintegrants include starches, clays, celluloses, algins, gums and cross-linked polymers. In addition, lubricants and glidants are also included in the tablets to prevent adhesion of the tablet material to surfaces in the manufacturing process and to improve the flow characteristics of the powder material during manufacturing. Colloidal silicon dioxide is most commonly used as a glidant and compounds such as talc or stearic acid are most commonly used. as lubricants.
Para administración transdérmica, la composición se puede formular en forma de pomada, crema o gel y se podrían usar penetrantes o detergentes apropiados para facilitar la permeación, tal como dimetilsulfóxido, acetamida de dimetilo y dimetilformamida.For transdermal administration, the composition can be formulated in the form of an ointment, cream or gel and appropriate penetrants or detergents could be used to facilitate permeation, such as dimethyl sulfoxide, dimethyl acetamide and dimethylformamide.
Para administración transmucosa, se pueden usar aerosoles nasales, supositorios rectales o vaginales. El compuesto activo se puede incorporar en cualquiera de las bases de supositorios conocidas mediante métodos conocidos en la técnica. Los ejemplos de dichas bases incluyen manteca de cacao, polietilenglicoles (carboceras), monoestearato de sorbitán polietileno y mezclas de estos con otros materiales compatibles para modificar el punto de fusión o la velocidad de disolución.For transmucosal administration, nasal sprays, rectal or vaginal suppositories can be used. The active compound can be incorporated into any of the known suppository bases by methods known in the art. Examples of such bases include cocoa butter, polyethylene glycols (carboceras), polyethylene sorbitan monostearate, and mixtures of these with other compatible materials to modify the melting point or dissolution rate.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la descripción se pueden formular para liberar el fármaco activo de modo sustancialmente inmediato tras la administración o en cualquier momento o periodo de tiempo predeterminado tras la administración.Pharmaceutical compositions according to the disclosure may be formulated to release the active drug substantially immediately upon administration or at any predetermined time or period of time upon administration.
En un aspecto particular, la composición farmacéutica de acuerdo con la descripción comprende de 0,001 mg a 10 g de la molécula de la descripción. Preferentemente, la composición farmacéutica de acuerdo con la descripción comprende de 0,01 mg a 1 g de la molécula de la descripción.In a particular aspect, the pharmaceutical composition according to the description comprises from 0.001 mg to 10 g of the molecule of the description. Preferably, the pharmaceutical composition according to the description comprises 0.01 mg to 1 g of the molecule of the description.
En otro aspecto adicional, la presente descripción se refiere al uso de un péptido de acuerdo con la descripción como desinfectante, conservante o plaguicida. El término “desinfectante” se refiere a una actividad antimicrobiana del péptido sobre una superficie (por ejemplo, paredes, puertas, equipos médicos), un líquido (por ejemplo, agua) o un gas (por ejemplo, un gas anestésico). De acuerdo con un aspecto, el péptido de acuerdo con la descripción se utiliza para la eliminación de biopelículas bacterianas. De acuerdo con un aspecto preferido, el péptido de acuerdo con la descripción se utiliza en particular para la desinfección de un equipo quirúrgico o protésico.In yet another aspect, the present description relates to the use of a peptide according to the description as a disinfectant, preservative or pesticide. The term “disinfectant” refers to an antimicrobial activity of the peptide on a surface (e.g., walls, doors, medical equipment), a liquid (e.g., water), or a gas (e.g., an anesthetic gas). According to one aspect, the peptide according to the description is used for the removal of bacterial biofilms. According to a preferred aspect, the peptide according to the description is used in particular for the disinfection of surgical or prosthetic equipment.
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un dispositivo médico o implante que comprende un cuerpo que tiene al menos una superficie recubierta con o que incluye un péptido de acuerdo con la descripción. La presente descripción también se refiere a un método para preparar un dispositivo médico o implante que comprende aplicar un recubrimiento de péptido de acuerdo con la descripción, o poner en contacto, con al menos una superficie del dispositivo o implante.In another aspect, the present description relates to a medical device or implant comprising a body having at least one surface coated with or including a peptide according to the description. The present description also relates to a method of preparing a medical device or implant comprising applying a peptide coating according to the description, or contacting, with at least one surface of the device or implant.
Este tipo de dispositivo o implante médico y los usos y métodos de preparación de los mismos se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente WO 2005/006938.This type of medical device or implant and the uses and preparation methods thereof are described, for example, in patent application WO 2005/006938.
La superficie recubierta con o que incluye un péptido de acuerdo con la descripción puede estar compuesta por materiales termoplásticos o poliméricos tales como polietileno, dacrón, nailon, poliésteres, politetrafluoroetileno, poliuretano, látex, elastómeros de silicona y similares, o de materiales metálicos tales como oro. En un aspecto particular, el péptido de la descripción está unido covalentemente a una superficie funcionalizada, preferentemente una superficie metálica, a través de su extremo N-terminal o C-terminal. Opcionalmente, el péptido puede estar unido a la superficie a través de un brazo espaciador.The surface coated with or including a peptide according to the description may be composed of thermoplastic or polymeric materials such as polyethylene, dacron, nylon, polyesters, polytetrafluoroethylene, polyurethane, latex, silicone elastomers and the like, or of metallic materials such as gold. In a particular aspect, the peptide of the invention is covalently linked to a functionalized surface, preferably a metallic surface, through its N-terminal or C-terminal end. Optionally, the peptide may be attached to the surface via a spacer arm.
Preferentemente, la superficie puede estar recubierta con un péptido a una densidad de 0,4 a 300 mg/cm2.Preferably, the surface may be coated with a peptide at a density of 0.4 to 300 mg/cm2.
Como alternativa, el dispositivo o implante, en particular, el dispositivo protésico óseo y articular, se pueden recubrir con una mezcla de cemento que comprende un péptido de acuerdo con la descripción.Alternatively, the device or implant, in particular the bone and joint prosthetic device, may be coated with a cement mixture comprising a peptide according to the description.
El péptido se puede combinar con otra molécula activa, preferentemente un antibiótico.The peptide can be combined with another active molecule, preferably an antibiotic.
El dispositivo o implante puede ser, por ejemplo, catéteres intravasculares, peritoneales, pleurales y urológicos; válvulas cardíacas; marcapasos; derivaciones vasculares; derivaciones coronarias; implantes dentales o prótesis ortopédicas o intraoculares.The device or implant can be, for example, intravascular, peritoneal, pleural and urological catheters; Heart valves; pacemaker; vascular bypasses; coronary bypasses; dental implants or orthopedic or intraocular prostheses.
Preparación del péptidoPeptide preparation
Los péptidos descritos en el presente documento se pueden sintetizar utilizando métodos sintéticos estándar conocidos para los expertos en la técnica, para la síntesis de ejemplo química o recombinación genética. En particular, los péptidos pueden sintetizarse de acuerdo con el método descrito originalmente por Merrifield.The peptides described herein can be synthesized using standard synthetic methods known to those skilled in the art, for example chemical synthesis or genetic recombination. In particular, peptides can be synthesized according to the method originally described by Merrifield.
Ejemplos de tecnologías de síntesis química son la síntesis en fase sólida y la síntesis en fase líquida. Como síntesis en fase sólida, por ejemplo, el aminoácido correspondiente al extremo C-terminal del péptido que se va a sintetizar se une a un soporte que es insoluble en disolventes orgánicos, y mediante repetición alterna de reacciones, una en la que los aminoácidos con sus grupos amino y grupos funcionales de cadena lateral protegidos con grupos protectores apropiados se condensan uno a uno en orden desde el extremo C-terminal al extremo N-, y una donde los aminoácidos unidos a la resina o el grupo protector de los grupos amino de los péptidos son liberados, así, de esta manera la cadena peptídica se extiende. Los métodos de síntesis en fase sólida se clasifican principalmente mediante el método tBoc y el método Fmoc, dependiendo del tipo de grupo protector utilizado. Los grupos protectores utilizados habitualmente incluyen tBoc (t-butoxicarbonilo), Cl-Z (2-clorobenciloxicarbonilo), Br-Z (2-bromobenciloxicarbonilo), Bzl (bencilo), Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo), Mbh (4,4'-dimetoxidibenzhidrilo), Mtr (4-metoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonilo), Trt (tritilo), Tos (tosilo), Z (benciloxicarbonilo) y Clz-Bzl (2,6-diclorobencilo) para los grupos amino; NO2 (nitro) y Pmc (2,2,5,7,8-pentametilcromano-6-sulfonilo) para los grupos guanidino); y tBu (t-butilo) para los grupos hidroxilo). Después de la síntesis del péptido deseado, se somete a la reacción de desprotección y se corta del soporte sólido. Tal reacción de corte peptídico puede llevarse a cabo con fluoruro de hidrógeno o ácido trifluorometanosulfónico para el método Boc y con TFA para el método Fmoc.Examples of chemical synthesis technologies are solid phase synthesis and liquid phase synthesis. As a solid phase synthesis, for example, the amino acid corresponding to the C-terminal end of the peptide to be synthesized is attached to a support that is insoluble in organic solvents, and by alternating repetition of reactions, one in which the amino acids with its amino groups and side chain functional groups protected with appropriate protecting groups are condensed one by one in order from the C-terminus to the N-terminus, and one where the amino acids attached to the resin or the protecting group of the amino groups of The peptides are released, thus, in this way the peptide chain extends. Solid phase synthesis methods are mainly classified by the tBoc method and the Fmoc method, depending on the type of protecting group used. Commonly used protecting groups include tBoc (t-butoxycarbonyl), Cl-Z (2-chlorobenzyloxycarbonyl), Br-Z (2-bromobenzyloxycarbonyl), Bzl (benzyl), Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl), Mbh (4,4'-dimethoxydibenzhydryl), Mtr (4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl), Trt (trityl), Tos (tosyl), Z (benzyloxycarbonyl) and Clz-Bzl (2,6-dichlorobenzyl) for the amino groups; NO 2 (nitro) and Pmc (2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl) for guanidino groups); and tBu (t-butyl) for hydroxyl groups). After synthesis of the desired peptide, it is subjected to the deprotection reaction and cut from the solid support. Such peptide cleavage reaction can be carried out with hydrogen fluoride or trifluoromethanesulfonic acid for the Boc method and with TFA for the Fmoc method.
Como alternativa, el péptido se puede sintetizar utilizando técnicas recombinantes. En este caso, se usa un ácido nucleico y/o una construcción genética que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de acuerdo con la descripción. Por lo tanto, la presente descripción se refiere a un ácido nucleico y/o una construcción genética que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de acuerdo con la descripción. La construcción genética comprende un polinucleótido que codifica un péptido de acuerdo con la descripción como se define en el presente documento y las secuencias reguladoras (tales como uno o más promotores, potenciadores, terminadores, etc., adecuados), que permite la expresión (por ejemplo, la transcripción y traducción) de un péptido de acuerdo con la descripción en una célula huésped. De este modo, en otro aspecto, la descripción se refiere a un huésped o célula huésped que expresa (o que, en circunstancias adecuadas, es capaz de expresar) un péptido de la descripción; y/o que contiene un polinucleótido de la descripción o construcción genética de la descripción.Alternatively, the peptide can be synthesized using recombinant techniques. In this case, a nucleic acid and/or a genetic construct is used comprising a nucleotide sequence encoding a peptide according to the description. Therefore, the present description relates to a nucleic acid and/or a genetic construct comprising a nucleotide sequence encoding a peptide according to the description. The genetic construct comprises a polynucleotide encoding a peptide according to the description as defined herein and regulatory sequences (such as one or more suitable promoters, enhancers, terminators, etc.), allowing expression (e.g. example, transcription and translation) of a peptide according to the description in a host cell. Thus, in another aspect, the invention relates to a host or host cell that expresses (or, in suitable circumstances, is capable of expressing) a peptide of the invention; and/or containing a polynucleotide of the description or genetic construct of the description.
Con el fin de obtener el péptido que contiene D-aminoácido, el péptido puede coexpresarse con la epimerasa peptídica descrita en la presente descripción.In order to obtain the D-amino acid containing peptide, the peptide can be co-expressed with the peptide epimerase described herein.
El método para producir el péptido puede comprender, opcionalmente, las etapas de purificación de dicho péptido, modificación química de dicho péptido y/o formulación de dicho péptido en una composición farmacéutica. Por ejemplo, el péptido descrito en el presente documento se puede preparar mediante técnicas recombinantes como una proteína de fusión con un péptido señal de secreción o un marcador de purificación. Este péptido señal de secreción o marcador de purificación se puede escindir o eliminar en una etapa adicional de producción.The method for producing the peptide may optionally comprise the steps of purification of said peptide, chemical modification of said peptide and/or formulation of said peptide in a pharmaceutical composition. For example, the peptide described herein can be prepared by recombinant techniques as a fusion protein with a secretion signal peptide or a purification marker. This secretion signal peptide or purification marker can be cleaved or removed in a further production step.
En un objeto particular de la presente descripción, el método para preparar el péptido comprende proporcionar o sintetizar un péptido como se ha descrito anteriormente con los aminoácidos en configuración L y poner en contacto el péptido con una enzima (es decir, una epimerasa), convirtiendo de este modo al menos un aminoácido en configuración L en aminoácido en configuración D de dicho péptido, la epimerasa es como se define a continuación.In a particular object of the present description, the method of preparing the peptide comprises providing or synthesizing a peptide as described above with the amino acids in L configuration and contacting the peptide with an enzyme (i.e., an epimerase), converting thus at least one amino acid in L configuration in amino acid in D configuration of said peptide, the epimerase is as defined below.
Epimerasa SAM radicalradical SAM epimerase
Los inventores han identificado una epimerasa SAM radical denominada YydG en Bacillus subtilis que es capaz de modificar la configuración de los aminoácidos contenidos en un péptido desde una configuración L a una configuración D. Esta enzima es capaz de llevar a cabo la conversión, incluso en condiciones in vitro. Su secuencia se muestra en la SEC ID n.° 18. Además, esta enzima no está relacionada con otras epimerasas conocidas, incluso dentro de la superfamilia de la enzima SAM de radicales.The inventors have identified a radical SAM epimerase called YydG in Bacillus subtilis that is capable of modifying the configuration of the amino acids contained in a peptide from an L configuration to a D configuration. This enzyme is capable of carrying out the conversion, even under conditions in vitro. Its sequence is shown in SEQ ID NO: 18. Furthermore, this enzyme is not related to other known epimerases, even within the radical SAM enzyme superfamily.
Por lo tanto, la presente descripción se refiere a una epimerasa capaz de modificar la configuración de los aminoácidos contenidos en un péptido de una configuración L a una configuración D y que comprende una secuencia amino que tiene al menos un 30 % de identidad con la SEC ID n.° 25. Preferentemente, la epimerasa comprende una secuencia amino que tiene una identidad de al menos un 35, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97,5 o 99 % con la SEC ID n.° 25. Therefore, the present description refers to an epimerase capable of modifying the configuration of the amino acids contained in a peptide from an L configuration to a D configuration and comprising an amino sequence that has at least 30% identity with the SEC ID NO: 25. Preferably, the epimerase comprises an amino sequence that has at least 35, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97.5 or 99% identity with SEQ ID #25.
YydG de Bacillus subtilis se describe en bases de datos públicas con los siguientes números de identificación: UniProt Q45595; GenelD 937720; GenBank NP_391897.1 y NC_000964.3.YydG from Bacillus subtilis is described in public databases with the following identification numbers: UniProt Q45595; GenelD 937720; GenBank NP_391897.1 and NC_000964.3.
Según las enseñanzas de la presente divulgación, el experto en la técnica puede identificar otras enzimas de microorganismos que tienen la epimerasa SAM radical. El polipéptido se puede identificar y obtener de otras fuentes, incluyendo microorganismos aislados de la naturaleza (por ejemplo, tierra, abonos, agua, etc.) o muestras de ADN obtenidas directamente a partir de materiales naturales (por ejemplo, tierra, abonos, agua, etc.) usando las sondas. Las técnicas para aislar microorganismos y ADN directamente a partir de hábitats naturales son bien conocidas en la materia. Por tanto, un polinucleótido que codifica el polipéptido puede obtenerse mediante detección selectiva de forma similar de un ADN genómico o biblioteca de ADNc de otro microorganismo o muestra de ADN mixto. Una vez se ha detectado un polinucleótido que codifica un polipéptido, el polinucleótido puede aislarse o clonarse utilizando técnicas que son conocidas por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989). El experto en la técnica también podría usar las secuencias de datos ya disponibles en bases de datos. Además, el experto en la técnica puede preparar variantes de la epimerasa que tengan la secuencia de aminoácidos de la SEC ID n.° 25 mediante métodos utilizados actualmente. En particular, las variantes con propiedades ventajosas tales como un aumento de la estabilidad (por ejemplo, termoestabilidad), aumento de la producción de aminoácido en configuración D, modificación de la especificidad y/o la selectividad de la epimerasa, y similares.According to the teachings of the present disclosure, the person skilled in the art can identify other enzymes from microorganisms that have the radical SAM epimerase. The polypeptide can be identified and obtained from other sources, including microorganisms isolated from nature (for example, soil, fertilizers, water, etc.) or DNA samples obtained directly from natural materials (for example, soil, fertilizers, water , etc.) using the probes. Techniques for isolating microorganisms and DNA directly from natural habitats are well known in the art. Therefore, a polynucleotide encoding the polypeptide can be obtained by similarly screening a genomic DNA or cDNA library from another microorganism or mixed DNA sample. Once a polynucleotide encoding a polypeptide has been detected, the polynucleotide can be isolated or cloned using techniques that are known to those skilled in the art (see, for example, Sambrook et al., 1989). The person skilled in the art could also use data sequences already available in databases. Furthermore, one skilled in the art can prepare epimerase variants having the amino acid sequence of SEQ ID NO:25 by currently used methods. In particular, variants with advantageous properties such as increased stability (e.g., thermostability), increased D-configuration amino acid production, modification of the specificity and/or selectivity of the epimerase, and the like.
Se divulgan secuencias 100 % idénticas en comparación con la SEC ID n.° 25 en Uniprot AOAOC2UHS5, AOAOA1MJP5 y L8AWU7. Otras cepas de Bacillus subtilis presentan secuencias con alta identidad (de hasta el 90 % de identidad) y se describen en las SEC ID n.os 26-29 y 32. Otras cepas de Bacillus presentan secuencias con alta identidad y se desvelan en las SEC ID n.os 30 y 33-35. Las secuencias con una identidad significativa se han identificado en Salinibacillus aidiingensis, Staphylococcus equorum, Staphylococcus pseudintermedius, Staphylococcus epidermidis, Paenibacillus sp, Enterococcus caccae, Enterococcus faecalis, Corynebacterium diphtheria, Streptococcus agalactiae y Bifidobacterium bohemicum y se divulgan en las SEC ID n.os 31, y 36-52. La Figura 6 muestra un alineamiento de las secuencias de las enzimas.100% identical sequences compared to SEQ ID NO: 25 are disclosed in Uniprot AOAOC 2 UHS5, AOAOA1MJP5 and L8AWU7. Other strains of Bacillus subtilis have sequences with high identity (up to 90% identity) and are described in SEQ ID NOs 26-29 and 32. Other strains of Bacillus have sequences with high identity and are disclosed in SEQ ID NO: 26-29 and 32. ID Nos. 30 and 33-35. Sequences with significant identity have been identified in Salinibacillus aidiingensis, Staphylococcus equorum, Staphylococcus pseudintermedius, Staphylococcus epidermidis, Paenibacillus sp, Enterococcus caccae, Enterococcus faecalis, Corynebacterium diphtheria, Streptococcus agalactiae and Bifidobacterium bohemicum and are disclosed in SEQ ID NOs 31, and 36-52. Figure 6 shows an alignment of the enzyme sequences.
Las posiciones en negrita y subrayadas están perfectamente conservadas entre la lista de secuencias desveladas anteriormente. Las posiciones en negrita y cursiva están conservadas entre grupos de propiedades fuertemente similares en la lista de secuencias desveladas anteriormente. Por consiguiente, se puede observar que, incluso si el porcentaje de identidad es de aproximadamente el 30 %, hay un alto número de aminoácidos que están perfectamente conservados y bien conservados.The positions in bold and underlined are perfectly preserved among the list of sequences revealed above. The positions in bold and italics are conserved among groups of strongly similar properties in the list of sequences disclosed above. Therefore, it can be seen that even if the percentage of identity is approximately 30%, there are a high number of amino acids that are perfectly conserved and well conserved.
Por consiguiente, en un aspecto preferido, la epimerasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 30 % de identidad con la SEC ID n.° 25 y en la que el 70, 80 o 90 % de las posiciones en negrita y subrayadas están conservadas cuando la secuencia está alineada con la SEC ID n.° 25 (posiciones 14-15, 18, 20-24, 27, 58-60, 63, 83, 84, 87-90, 112, 115, 117, 120, 150, 152, 169, 176, 180, 181, 183, 204, 206-208, 214, 217, 220-225, 228, 230, 252, 254, 262, 289, 292, 296, y 309 de la SEC ID n.° 25). Preferentemente, el 95 % de las posiciones en negrita y subrayadas están conservadas. En un aspecto particular, todas las posiciones en negrita y subrayadas están conservadas. Más preferentemente, el 90 o 95 % de las posiciones 14-15, 18, 20-24, 27, 58-60, 63, 83, 84, 87-90, 112, 115, 117, 120, 204, 206-208, 214, 217, 220-225, 228 y 230 de la SEC ID n.° 25 están conservadas en la secuencia de la epimerasa. En un aspecto particular, todas las posiciones 14-15, 18, 20-24, 27, 58-60, 63, 83, 84, 87-90, 112, 115, 117, 120, 204, 206-208, 214, 217, 220-225, 228 y 230 de la SEC ID n.° 25 están conservadas en la secuencia de la epimerasa.Accordingly, in a preferred embodiment, the epimerase has an amino acid sequence that has at least 30% identity with SEQ ID NO: 25 and in which 70, 80 or 90% of the bold and underlined positions are conserved when the sequence is aligned to SEQ ID NO: 25 (positions 14-15, 18, 20-24, 27, 58-60, 63, 83, 84, 87-90, 112, 115, 117, 120 , 150, 152, 169, 176, 180, 181, 183, 204, 206-208, 214, 217, 220-225, 228, 230, 252, 254, 262, 289, 292, 296, and 309 of the SEC ID #25). Preferably, 95% of the bold and underlined positions are preserved. In a particular aspect, all bold and underlined positions are preserved. More preferably, 90 or 95% of positions 14-15, 18, 20-24, 27, 58-60, 63, 83, 84, 87-90, 112, 115, 117, 120, 204, 206-208 , 214, 217, 220-225, 228 and 230 of SEQ ID NO: 25 are conserved in the epimerase sequence. In a particular aspect, all positions 14-15, 18, 20-24, 27, 58-60, 63, 83, 84, 87-90, 112, 115, 117, 120, 204, 206-208, 214, 217, 220-225, 228 and 230 of SEQ ID NO: 25 are conserved in the epimerase sequence.
En un aspecto preferido, la epimerasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 30 % de identidad con la SEC ID n.° 25 y uno o varios segmentos seleccionados de los segmentos 13-27, 56-63, 83-90, 112-120, y 204 230 tienen al menos un 50 % de identidad con la secuencia de SEC ID n.° 25. En este aspecto, la epimerasa tiene además, el 90 o 95 % de las posiciones 14-15, 18, 20-24, 27, 58-60, 63, 83, 84, 87-90, 112, 115, 117, 120, 204, 206 208, 214, 217, 220-225, 228 y 230 de la SEC ID n.° 25 están conservadas en la secuencia de la epimerasa.In a preferred aspect, the epimerase has an amino acid sequence that has at least 30% identity with SEQ ID NO: 25 and one or more segments selected from segments 13-27, 56-63, 83-90, 112-120, and 204,230 have at least 50% identity with the sequence of SEQ ID NO: 25. In this aspect, the epimerase also has 90 or 95% of positions 14-15, 18, 20 -24, 27, 58-60, 63, 83, 84, 87-90, 112, 115, 117, 120, 204, 206 208, 214, 217, 220-225, 228 and 230 of SEQ ID NO: 25 are conserved in the epimerase sequence.
En un aspecto particular, los restos de cisteína en las posiciones 14, 18, 21, 222 y 223 de la SEC ID n.° 25 están conservadas en la secuencia de la epimerasa.In a particular aspect, cysteine residues at positions 14, 18, 21, 222 and 223 of SEQ ID NO: 25 are conserved in the epimerase sequence.
En un aspecto, la epimerasa tiene una secuencia de aminoácidos que comprende, que consiste esencialmente en, o consiste en, una secuencia que tiene al menos un 80, 85, 90 o 95 % de identidad con una secuencia seleccionada entre SEC ID n.os 25-52, preferentemente entre las SEC ID n.os 25-30, 32 y 34, más preferentemente la SEC ID n.° 25. La epimerasa puede tener una secuencia de aminoácidos que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en, una secuencia seleccionada entre las SEC ID n.° 25-52, preferentemente entre las SEC ID n.os 25-30, 32 y 34, más preferentemente la SEC ID n.° 25; y que tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones, adiciones o deleciones. In one aspect, the epimerase has an amino acid sequence comprising, essentially consisting of, or consisting of, a sequence that has at least 80, 85, 90, or 95% identity with a sequence selected from SEQ ID NOs. 25-52, preferably between SEQ ID NO: 25-30, 32 and 34, more preferably SEQ ID NO: 25. The epimerase may have an amino acid sequence comprising, consisting essentially of, or consisting of , a sequence selected from SEQ ID NO: 25-52, preferably from SEQ ID NO: 25-30, 32 and 34, more preferably SEQ ID NO: 25; and that has 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 substitutions, additions or deletions.
Un método para analizar la capacidad de una epimerasa para modificar la configuración de los aminoácidos contenidos en un péptido de una configuración L a una configuración D se desvela, por ejemplo, en los detalles en la sección de ejemplos. Por ejemplo, se pone en contacto la epimerasa con un péptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID n.os 1-20 en presencia del cofactor de S-adenosil-L-metionina (SAM) y se detecta la producción de péptidos, incluyendo un aminoácido de configuración D. Más específicamente, la epimerasa se pone en contacto con el péptido YydF18-49 de SEC ID n.° 20 en presencia del cofactor de S-adenosil-L-metionina (SAM) y se detecta la producción de péptidos que incluyen un aminoácido de configuración D en la posición 19 y/o 27.A method for analyzing the ability of an epimerase to modify the configuration of the amino acids contained in a peptide from an L configuration to a D configuration is disclosed, for example, in the details in the examples section. For example, the epimerase is contacted with a peptide having a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-20 in the presence of the S-adenosyl-L-methionine (SAM) cofactor and the production of peptides, including a D-configuration amino acid. More specifically, the epimerase is contacted with the peptide YydF18-49 of SEQ ID NO: 20 in the presence of the S-adenosyl-L-methionine (SAM) cofactor and is detects the production of peptides that include a D-configuration amino acid at position 19 and/or 27.
También se proporciona un polipéptido híbrido o el polipéptido de fusión en el que la secuencia de aminoácidos de la enzima como se ha definido anteriormente se fusiona en el extremo N-terminal o el C-terminal de una región de otro polipéptido. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión son conocidas en la técnica e incluyen ligar las secuencias de codificación que codifican la enzima y la región de adición de otro polipéptido de modo que estén en marco y que la expresión del polipéptido de fusión esté bajo el control del mismo promotor o promotores y terminador. Los polipéptidos de fusión también se pueden construir usando tecnología intein, en la que los polipéptidos de fusión se crean después de la traducción (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).Also provided is a hybrid polypeptide or fusion polypeptide in which the amino acid sequence of the enzyme as defined above is fused to the N-terminus or the C-terminus of a region of another polypeptide. Techniques for producing fusion polypeptides are known in the art and include ligating the coding sequences that encode the enzyme and the addition region of another polypeptide so that they are in frame and that the expression of the fusion polypeptide is under the control of the same promoter or promoters and terminator. Fusion polypeptides can also be constructed using intein technology, in which fusion polypeptides are created after translation (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).
La región de adición del polipéptido de fusión se puede seleccionar con el fin de mejorar la estabilidad de la enzima de acuerdo con la presente divulgación, para estimular la secreción (tal como un péptido señal hidrofóbico en N-terminal) de la proteína de fusión de una célula (tal como una célula bacteriana o una célula de levadura), o para ayudar en la purificación de la proteína de fusión. Más particularmente, la región adicional puede ser un marcador útil para la purificación o inmovilización de la enzima. Tal marcador es bien conocido por el experto en la técnica, por ejemplo, un marcador His (His6), un marcador FLAG, un marcador HA (epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de Influenza), una proteína de unión a maltosa (MPB), un marcador de MYC (epítopo derivado de la proto-oncoproteína humana MYC), un marcador STREP o un marcador GST (glutatión-S-transferasa pequeña).The addition region of the fusion polypeptide can be selected in order to improve the stability of the enzyme according to the present disclosure, to stimulate the secretion (such as an N-terminal hydrophobic signal peptide) of the fusion protein. a cell (such as a bacterial cell or a yeast cell), or to assist in the purification of the fusion protein. More particularly, the additional region may be a useful marker for purification or immobilization of the enzyme. Such a marker is well known to the person skilled in the art, for example, a His tag (His6), a FLAG tag, an HA tag (epitope derived from Influenza hemagglutinin protein), a maltose binding protein (MPB), a MYC marker (epitope derived from the human MYC proto-oncoprotein), a STREP marker or a GST (small glutathione-S-transferase) marker.
Un polipéptido de fusión puede comprender además un sitio de escisión entre la enzima y la región de adición. Tras la secreción de la proteína de fusión, el sitio se escinde y libera los dos polipéptidos. Ejemplos de sitios de escisión incluyen, pero no se limitan a, los sitios divulgados en Martin et al., 2003, J. Ind. Microbio!. Biotechnol. 3:568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76:245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbio!. 63:3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; y Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; y Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.A fusion polypeptide may further comprise a cleavage site between the enzyme and the addition region. Upon secretion of the fusion protein, the site cleaves and releases the two polypeptides. Examples of cleavage sites include, but are not limited to, the sites disclosed in Martin et al., 2003, J. Ind. Microbio!. Biotechnol. 3:568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76:245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbe!. 63:3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; and Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; and Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.
Se proporciona además una construcción de ácido nucleico recombinante o vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la epimerasa como se ha definido anteriormente. Más particularmente, la construcción de ácido nucleico o vector es adecuada para expresar dicha epimerasa. Además, se proporciona una célula huésped recombinante que comprende un ácido nucleico, una construcción de ácido nucleico recombinante o un vector recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la epimerasa como se ha definido anteriormente.Further provided is a recombinant nucleic acid construct or vector comprising a nucleic acid sequence encoding epimerase as defined above. More particularly, the nucleic acid or vector construct is suitable for expressing said epimerase. Additionally, there is provided a recombinant host cell comprising a nucleic acid, a recombinant nucleic acid construct, or a recombinant vector comprising a nucleic acid sequence encoding epimerase as defined above.
Construcciones de ácido nucleicoNucleic acid constructs
De hecho, la presente descripción se refiere a un polinucleótido que codifica una epimerasa de la presente descripción. El ácido nucleico puede ser ADN (ADNc o ADNg), ARN, o una mezcla de los dos. Puede ser en forma de cadena simple o en forma de dúplex o una mezcla de los dos. Puede comprender nucleótidos modificados, que comprenden, por ejemplo, un enlace modificado, una base de purina o pirimidina modificada, o un azúcar modificado. Se puede preparar por cualquier método conocido para un experto en la técnica, incluyendo la síntesis química, recombinación y mutagénesis.In fact, the present description relates to a polynucleotide encoding an epimerase of the present description. The nucleic acid can be DNA (cDNA or gDNA), RNA, or a mixture of the two. It can be in the form of a single chain or in the form of a duplex or a mixture of the two. It may comprise modified nucleotides, comprising, for example, a modified linker, a modified purine or pyrimidine base, or a modified sugar. It can be prepared by any method known to one skilled in the art, including chemical synthesis, recombination and mutagenesis.
La presente descripción también se refiere a construcciones de ácidos nucleicos que comprenden un polinucleótido que codifica una epimerasa de acuerdo con la presente descripción unida operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia de codificación en una célula huésped adecuada en condiciones compatibles con las secuencias de control. Un polinucleótido se puede manipular de diversas maneras para proporcionar la expresión de la epimerasa. La manipulación del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar polinucleótidos utilizando métodos de ADN recombinante son bien conocidas en la técnica.The present description also relates to nucleic acid constructs comprising a polynucleotide encoding an epimerase according to the present description operably linked to one or more control sequences that direct expression of the coding sequence in a suitable host cell under conditions compatible with control sequences. A polynucleotide can be manipulated in various ways to provide expression of the epimerase. Manipulation of the polynucleotide prior to insertion into a vector may be desirable or necessary depending on the expression vector. Techniques for modifying polynucleotides using recombinant DNA methods are well known in the art.
La secuencia de control puede incluir un promotor que es reconocido por una célula huésped o un sistema de expresión in vitro para la expresión de un polinucleótido que codifica una epimerasa de la presente descripción. El promotor contiene secuencias de control de la transcripción que participan en la expresión de la epimerasa. El promotor puede ser cualquier polinucleótido que muestra actividad transcripcional en la célula huésped, incluyendo promotores mutantes, truncados e híbridos, y puede obtenerse a partir de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares, bien homólogos o heterólogos de la célula huésped. Opcionalmente, el promotor puede ser inducible. The control sequence may include a promoter that is recognized by a host cell or an in vitro expression system for the expression of a polynucleotide encoding an epimerase of the present disclosure. The promoter contains transcription control sequences that participate in the expression of the epimerase. The promoter can be any polynucleotide that shows transcriptional activity in the host cell, including mutant, truncated and hybrid promoters, and can be obtained from genes that encode extracellular or intracellular polypeptides, either homologous or heterologous to the host cell. Optionally, the promoter may be inducible.
Ejemplos de promotores adecuados en una célula huésped bacteriana son los promotores obtenidos a partir del gen de la alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), el gen de la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), el gen de la penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP), el gen de la amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM), el gen de la levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB), los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, el gen crylllA de Bacillus thuringiensis (Agaisse y Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), el operón lac de E. coli, el promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), el gen de la agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA) y el gen procariótico de beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25). Otros promotores se describen en “Useful proteins from recombinant bacteria” en Gilbert et al., 1980, Scientific American 242, 74-94; y en Sambrook et al., 1989. Ejemplos de promotores en tándem se divulgan en el documento WO 99/43835.Examples of suitable promoters in a bacterial host cell are promoters obtained from the alpha-amylase gene of Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), the alpha-amylase gene of Bacillus licheniformis (amyL), the penicillinase gene of Bacillus licheniformis (penP), the maltogenic amylase gene of Bacillus stearothermophilus (amyM), the levansucrase gene of Bacillus subtilis (sacB), the xylA and xylB genes of Bacillus subtilis, the crylllA gene of Bacillus thuringiensis (Agaisse and Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), the lac operon of E. coli, the trc promoter of E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), the agarase gene of Streptomyces coelicolor (dagA) and the prokaryotic beta-lactamase gene (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), as well as the tac promoter (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25). Other promoters are described in “Useful proteins from recombinant bacteria” in Gilbert et al., 1980, Scientific American 242, 74-94; and in Sambrook et al., 1989. Examples of tandem promoters are disclosed in WO 99/43835.
Ejemplos de promotores adecuados en una célula huésped de hongo filamentoso son promotores obtenidos de los genes para acetamidasa de Aspergillus nidulans, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable a los ácidos de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger o Aspergillus awamori (glaA), TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, proteasa similar a tripsina de Fusarium oxysporum (WO96/00787), amilglucosidasa de Fusarium venenatum (Wo 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipasa de Rhizomucor miehei, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, así como el promotor NA2-tpi (un promotor modificado a partir de un gen de alfa-amilasa neutra de Aspergillus en el que la secuencia líder no traducida ha sido reemplazada por una secuencia líder no traducida de un gen de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus; ejemplos no limitantes incluyen promotores modificados del gen de alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, en el que la secuencia líder no traducida se ha sustituido por una secuencia líder no traducida de un gen de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae; y promotores mutantes, truncados, e híbridos de los mismos.Examples of suitable promoters in a filamentous fungal host cell are promoters obtained from the genes for acetamidase from Aspergillus nidulans, neutral alpha-amylase from Aspergillus niger, acid-stable alpha-amylase from Aspergillus niger, glucoamylase from Aspergillus niger or Aspergillus awamori ( glaA), TAKA amylase from Aspergillus oryzae, alkaline protease from Aspergillus oryzae, triose phosphate isomerase from Aspergillus oryzae, trypsin-like protease from Fusarium oxysporum (WO96/00787), amylglucosidase from Fusarium venenatum (Wo 00/56900), Daria from Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn from Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipase from Rhizomucor miehei, aspartic proteinase from Rhizomucor miehei, beta-glucosidase from Trichoderma reesei, cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei, cellobiohydrolase II from Trichoderma reesei, endoglucanase I of Trichoderma reesei, endoglucanase II of Trichoderma reesei, endoglucanase III of Trichoderma reesei, endoglucanase IV of Trichoderma reesei, endoglucanase V of Trichoderma reesei, xylanase I of Trichoderma reesei, xylanase II of Trichoderma reesei, beta-xylosidase of Trichoderma reesei, as well as the NA2-tpi promoter (a promoter modified from an Aspergillus neutral alpha-amylase gene in which the untranslated leader sequence has been replaced by an untranslated leader sequence from an Aspergillus triose phosphate isomerase gene; non-limiting examples include modified promoters of the neutral alpha-amylase gene of Aspergillus niger, in which the untranslated leader sequence has been replaced by an untranslated leader sequence of a triose phosphate isomerase gene of Aspergillus nidulans or Aspergillus oryzae; and mutant, truncated, and hybrid promoters thereof.
En un huésped de levadura, los promotores útiles se obtienen de los genes para la enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactoquinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP), triosa fosfato isomerasa de Saccharomyces cerevisiae (TPI), metalotioneína de Saccharomyces cerevisiae (CUP1), y 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para las células huésped de levadura los describen Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.In a yeast host, useful promoters are derived from the genes for Saccharomyces cerevisiae enolase (ENO-1), Saccharomyces cerevisiae galactokinase (GAL1), Saccharomyces cerevisiae alcohol dehydrogenase/glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (ADH1, ADH 2 /GAP), Saccharomyces cerevisiae triose phosphate isomerase (TPI), Saccharomyces cerevisiae metallothionein (CUP1), and Saccharomyces cerevisiae 3-phosphoglycerate kinase. Other promoters useful for yeast host cells are described by Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.
La secuencia de control también puede ser un terminador de la transcripción, que es reconocido por una célula huésped para terminar la transcripción. El terminador está unido operativamente al extremo 3' del polinucleótido que codifica el polipéptido. Cualquier terminador que sea funcional en la célula huésped se puede usar en la presente descripción.The control sequence may also be a transcription terminator, which is recognized by a host cell to terminate transcription. The terminator is operably linked to the 3' end of the polynucleotide encoding the polypeptide. Any terminator that is functional in the host cell can be used in the present description.
Los terminadores preferidos para las células huésped bacterianas se obtienen de los genes para la proteasa alcalina de Bacillus clausii (aprH), alfa amilasa de Bacillus licheniformis (amyL) y ARN ribosómico de Escherichia coli (rrnB). Preferred terminators for bacterial host cells are derived from the genes for Bacillus clausii alkaline protease (aprH), Bacillus licheniformis alpha amylase (amyL), and Escherichia coli ribosomal RNA (rrnB).
Los terminadores preferidos para células huésped de hongos filamentosos se obtienen a partir de los genes para antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum. Preferred terminators for host cells of filamentous fungi are obtained from the genes for anthranilate synthase of Aspergillus nidulans, glucoamylase of Aspergillus niger, alpha-glucosidase of Aspergillus niger, TAKA amylase of Aspergillus oryzae and trypsin-like protease of Fusarium oxysporum.
Los terminadores preferidos para las células huésped de levadura se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para las células huésped de levadura los describen Romanos et al., 1992, anteriormente citado.Preferred terminators for yeast host cells are derived from the genes for Saccharomyces cerevisiae enolase, Saccharomyces cerevisiae cytochrome C (CYC1), and Saccharomyces cerevisiae glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Other useful terminators for yeast host cells are described by Romanos et al., 1992, cited above.
La secuencia de control también puede ser una región estabilizadora de ARNm aguas abajo de un promotor y aguas arriba de la secuencia de codificación de un gen que aumenta la expresión del gen.The control sequence may also be an mRNA stabilizing region downstream of a promoter and upstream of the coding sequence of a gene that increases expression of the gene.
Se obtienen ejemplos de regiones estabilizadoras de ARNm adecuadas a partir de un gen de crylllA de Bacillus thuringiensis (documento WO 94/25612) y un gen de SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).Examples of suitable mRNA stabilizing regions are obtained from a crylllA gene from Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) and an SP82 gene from Bacillus subtilis (Hue et al. , 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471 ).
La secuencia de control también puede ser una líder, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula huésped. La líder está unida operativamente al extremo 5' del polinucleótido que codifica la epimerasa. Se puede usar cualquier líder que sea funcional en la célula huésped.The control sequence can also be a leader, an untranslated region of an mRNA that is important for translation by the host cell. The leader is operably linked to the 5' end of the polynucleotide encoding the epimerase. Any leader that is functional in the host cell can be used.
Las líderes preferentes para las células huésped de hongos filamentosos se obtienen a partir de los genes TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans. Preferential leaders for host cells of filamentous fungi are obtained from the TAKA amylase genes of Aspergillus oryzae and triose phosphate isomerase of Aspergillus nidulans.
Las líderes adecuadas para las células huésped de levadura se obtienen de los genes de la enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae, factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).Suitable leaders for yeast host cells are derived from the Saccharomyces cerevisiae enolase (ENO-1), Saccharomyces cerevisiae 3-phosphoglycerate kinase, Saccharomyces cerevisiae alpha factor, and Saccharomyces cerevisiae alcohol dehydrogenase/glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase genes. Saccharomyces cerevisiae (ADH 2 /GAP).
La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia unida operativamente al extremo 3' del polinucleótido que codifica la epimerasa y, cuando se transcribe, es reconocida por la célula huésped como una señal para añadir restos de poliadenosina al ARNm transcrito. Se puede usar cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula huésped.The control sequence may also be a polyadenylation sequence, a sequence operably linked to the 3' end of the polynucleotide that encodes the epimerase and, when transcribed, is recognized by the host cell as a signal to add polyadenosine residues to the transcribed mRNA. Any polyadenylation sequence that is functional in the host cell can be used.
Las secuencias de poliadenilación preferidas para células huésped de hongos filamentosos se obtienen de los genes para la antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum. The preferred polyadenylation sequences for host cells of filamentous fungi are obtained from the genes for anthranilate synthase of Aspergillus nidulans, glucoamylase of Aspergillus niger, alpha-glucosidase of Aspergillus niger, TAKA amylase of Aspergillus oryzae and trypsin-like protease of Fusarium oxysporum.
Las secuencias de poliadenilación útiles para células huésped de levadura están descritas por Guo y Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.Polyadenylation sequences useful for yeast host cells are described by Guo and Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol 15:5983-5990.
La secuencia de control también puede ser una región de codificación del péptido señal que codifica un péptido señal unido al extremo N de la epimerasa y dirige la epimerasa dentro de la ruta secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia de codificación del polinucleótido puede contener inherentemente una secuencia de codificación del péptido señal unida naturalmente en el marco de lectura de traducción con el segmento de la secuencia de codificación que codifica la epimerasa. Como alternativa, el extremo 5' de la secuencia de codificación puede contener una secuencia de codificación del péptido señal que es extraña a la secuencia de codificación. Puede requerirse una secuencia de codificación del péptido señal extraño cuando la secuencia de codificación no contiene naturalmente una secuencia de codificación del péptido señal. Como alternativa, una secuencia de codificación del péptido señal extraño puede simplemente reemplazar la secuencia de codificación del péptido señal natural para potenciar la secreción del polipéptido. Sin embargo, puede usarse cualquier secuencia de codificación de péptido señal que dirija el polipéptido expresado a la ruta secretora de una célula huésped.The control sequence may also be a signal peptide coding region that encodes a signal peptide attached to the N terminus of the epimerase and directs the epimerase into the secretory pathway of the cell. The 5' end of the polynucleotide coding sequence may inherently contain a signal peptide coding sequence naturally linked in translational reading frame to the segment of the coding sequence that encodes the epimerase. Alternatively, the 5' end of the coding sequence may contain a signal peptide coding sequence that is foreign to the coding sequence. A foreign signal peptide coding sequence may be required when the coding sequence does not naturally contain a signal peptide coding sequence. Alternatively, a foreign signal peptide coding sequence may simply replace the natural signal peptide coding sequence to enhance secretion of the polypeptide. However, any signal peptide coding sequence can be used that directs the expressed polypeptide to the secretory pathway of a host cell.
Las secuencias de codificación del péptido señal eficaz para las células huésped bacterianas son las secuencias de codificación del péptido señal obtenidas de los genes para Bacillus NCIB 11837 de la amilasa maltogénica, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, proteasas neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) y prsA de Bacillus subtilis. Otros péptidos señal están descritos por Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.The signal peptide coding sequences effective for bacterial host cells are the signal peptide coding sequences obtained from the genes for Bacillus NCIB 11837 of maltogenic amylase, Bacillus licheniformis subtilisin, Bacillus licheniformis beta-lactamase , Bacillus licheniformis alpha-amylase. Bacillus stearothermophilus, neutral proteases from Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) and prsA from Bacillus subtilis. Other signal peptides are described by Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.
Las secuencias de codificación del péptido señal eficaces para células huésped de hongos filamentosos son las secuencias de codificación del péptido señal obtenidas de los genes para amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, celulosa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens, lipasa de Humicola lanuginosa y proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei. The signal peptide coding sequences effective for host cells of filamentous fungi are the signal peptide coding sequences obtained from the genes for Aspergillus niger neutral amylase, Aspergillus niger glucoamylase, Aspergillus oryzae TAKA amylase, Humicola insolens cellulose, endoglucanase V from Humicola insolens, lipase from Humicola lanuginosa and aspartic proteinase from Rhizomucor miehei.
Los péptidos señal útiles para las células huésped de levadura se obtienen a partir de los genes para el factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y la invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras secuencias de codificación de péptidos señal útiles están descritas por Romanos et al., 1992, anteriormente citado.Signal peptides useful for yeast host cells are derived from the genes for Saccharomyces cerevisiae alpha factor and Saccharomyces cerevisiae invertase. Other useful signal peptide coding sequences are described by Romanos et al., 1992, cited above.
También puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que regulan la expresión del polipéptido en relación con el crecimiento de la célula huésped. Los ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que hacen que la expresión del gen se active o desactive en respuesta a un estímulo químico o físico, incluida la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en sistemas procariotas incluyen los sistemas de operador lac, tac y trp. En levaduras, se puede usar el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En hongos filamentosos, pueden usarse el promotor de la glucoamilasa de Aspergillus niger, el promotor de la alfa-amilasa TAKA de Aspergillus oryzae, y el promotor de la glucoamilasa de Aspergillus oryzae. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación génica. En los sistemas eucariotas, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de dihidrofolato reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato y los genes de metalotioneína que se amplifican con metales pesados. En estos casos, el polinucleótido que codifica el polipéptido estaría operativamente unido a la secuencia reguladora.It may also be desirable to add regulatory sequences that regulate expression of the polypeptide in relation to host cell growth. Examples of regulatory systems are those that cause gene expression to be turned on or off in response to a chemical or physical stimulus, including the presence of a regulatory compound. Regulatory systems in prokaryotic systems include the lac, tac, and trp operator systems. In yeast, the ADH 2 system or the GAL1 system can be used. In filamentous fungi, the Aspergillus niger glucoamylase promoter, the Aspergillus oryzae TAKA alpha-amylase promoter, and the Aspergillus oryzae glucoamylase promoter can be used. Other examples of regulatory sequences are those that allow gene amplification. In eukaryotic systems, these regulatory sequences include the dihydrofolate reductase gene that is amplified in the presence of methotrexate and the metallothionein genes that are amplified by heavy metals. In these cases, the polynucleotide encoding the polypeptide would be operably linked to the regulatory sequence.
Vectores de expresiónexpression vectors
La presente descripción también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden una construcción de ácido nucleico como se ha desvelado anteriormente, o un polinucleótido que codifica una epimerasa de presente descripción, un promotor y señales de terminación de la transcripción y la traducción. Las diversas secuencias de nucleótidos y de control pueden estar unidas entre sí para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido que codifica la epimerasa en tales sitios. Como alternativa, el polinucleótido puede expresarse mediante la inserción del polinucleótido o una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido en un vector apropiado para la expresión. The present disclosure also relates to recombinant expression vectors comprising a nucleic acid construct as disclosed above, or a polynucleotide encoding an epimerase of the present disclosure, a promoter, and transcription and translation termination signals. The various nucleotide and control sequences may be linked together to produce a recombinant expression vector which may include one or more convenient restriction sites to allow insertion or substitution of the polynucleotide encoding the epimerase at such sites. Alternatively, the polynucleotide may be expressed by inserting the polynucleotide or a nucleic acid construct comprising the polynucleotide into a vector appropriate for expression.
En un aspecto particular, el vector de expresión puede comprender además un polinucleótido que codifica un péptido de la presente descripción como se ha descrito anteriormente, unido operativamente con las secuencias de control necesarias para su expresión. Más particularmente, las secuencias de control utilizadas para la expresión de la epimerasa y el péptido de la presente descripción son adecuadas para la coexpresión en una célula huésped. Opcionalmente, el polinucleótido que codifica el péptido y el polinucleótido que codifica la epimerasa puede estar bajo el control de un único promotor (es decir, operón) o de dos promotores que pueden ser el mismo o diferente.In a particular aspect, the expression vector may further comprise a polynucleotide encoding a peptide of the present invention as described above, operably linked to the control sequences necessary for its expression. More particularly, the control sequences used for expression of the epimerase and the peptide of the present disclosure are suitable for co-expression in a host cell. Optionally, the polynucleotide encoding the peptide and the polynucleotide encoding the epimerase may be under the control of a single promoter (i.e., operon) or two promoters that may be the same or different.
Como alternativa, la presente descripción se refiere a un kit que comprende un primer vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una epimerasa de la presente descripción y un segundo vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un péptido de la presente descripción. En otra alternativa, el kit puede comprender un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una epimerasa de la presente descripción y un ácido nucleico que codifica un péptido de la presente descripción.Alternatively, the present description relates to a kit comprising a first expression vector comprising a nucleic acid encoding an epimerase of the present description and a second expression vector comprising a nucleic acid encoding a peptide of the present description. . In another alternative, the kit may comprise an expression vector comprising a nucleic acid encoding an epimerase of the present description and a nucleic acid encoding a peptide of the present description.
En la creación del vector de expresión, la secuencia de codificación se localiza en el vector de modo que la secuencia de codificación está operativamente unida a las secuencias de control apropiadas para la expresión.In creating the expression vector, the coding sequence is located in the vector such that the coding sequence is operatively linked to the control sequences appropriate for expression.
El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que puede ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante y puede provocar la expresión del polinucleótido. La elección del vector normalmente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que se va a introducir el vector. El vector puede ser un plásmido lineal o circular cerrado.The recombinant expression vector can be any vector (for example, a plasmid or virus) that can be conveniently subjected to recombinant DNA procedures and can cause expression of the polynucleotide. The choice of vector will usually depend on the compatibility of the vector with the host cell into which the vector is to be introduced. The vector can be a linear or closed circular plasmid.
El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un mini-cromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Como alternativa, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica junto con el o los cromosomas en que se ha integrado. Adicionalmente, se pueden usar un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total a introducir en el genoma de la célula huésped o un transposón.The vector may be an autonomously replicating vector, that is, a vector that exists as an extrachromosomal entity, whose replication is independent of chromosomal replication, for example, a plasmid, an extrachromosomal element, a mini-chromosome or an artificial chromosome. The vector may contain any means to ensure self-replication. Alternatively, the vector may be one that, when introduced into the host cell, integrates into the genome and replicates along with the chromosome(s) into which it has integrated. Additionally, a single vector or plasmid or two or more vectors or plasmids that together contain the total DNA to be introduced into the genome of the host cell or a transposon can be used.
El vector contiene preferentemente uno o más marcadores seleccionables que permiten la selección fácil de células transformadas, transfectadas, transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia biocida o vírica, resistencia a metales pesados, prototrofía a auxotrofia, y similares.The vector preferably contains one or more selectable markers that allow easy selection of transformed, transfected, transduced or similar cells. A selectable marker is a gene whose product provides biocidal or viral resistance, resistance to heavy metals, prototrophy to auxotrophy, and the like.
Ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son genes de Bacillus licheniformis o Bacillus subtilis o marcadores que confieren resistencia a los antibióticos tales como resistencia a ampicilina, cloranfenicol, kanamicina, neomicina, espectinomicina o tetraciclina. Los marcadores adecuados para células huésped de levadura incluyen, pero no se limitan a, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 y URA3. Los marcadores seleccionables para su uso en una célula huésped de hongo filamentoso incluyen, pero no se limitan a, amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa), bar (fosfinotricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidin-5'-fosfato descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa) y trpC (antranilato sintasa), así como equivalentes de los mismos. De uso preferente en una célula de Aspergillus son los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y un gen de Streptomyces hygroscopicus. Examples of bacterial selectable markers are genes from Bacillus licheniformis or Bacillus subtilis or markers that confer resistance to antibiotics such as resistance to ampicillin, chloramphenicol, kanamycin, neomycin, spectinomycin or tetracycline. Suitable markers for yeast host cells include, but are not limited to, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 and URA3. Markers selectable for use in a filamentous fungal host cell include, but are not limited to, amdS (acetamidase), argB (ornithine carbamoyltransferase), bar (phosphinothricin acetyltransferase), hph (hygromycin phosphotransferase), niaD (nitrate reductase), pyrG (orotidine-5'-phosphate decarboxylase), sC (sulfate adenyltransferase) and trpC (anthranilate synthase), as well as equivalents thereof. Preferably used in an Aspergillus cell are the amdS and pyrG genes from Aspergillus nidulans or Aspergillus oryzae and a gene from Streptomyces hygroscopicus.
El vector contiene, preferentemente, un elemento o elementos que permiten la integración del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.The vector preferably contains an element or elements that allow integration of the vector into the genome of the host cell or autonomous replication of the vector in the cell independent of the genome.
Cuando se produce la integración en el genoma de la célula huésped, la integración de las secuencias en el genoma puede basarse en la recombinación homóloga o no homóloga. Como alternativa, el vector puede contener polinucleótidos adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped en una o más ubicaciones precisas en el o los cromosomas. Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integracionales deberían contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como de 100 a 10.000 pares de bases, de 400 a 10.000 pares de bases, y de 800 a 10.000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad de secuencia con la secuencia diana correspondiente para mejorar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga con la secuencia diana en el genoma de la célula huésped. Adicionalmente, los elementos integracionales pueden ser polinucleótidos no codificantes o codificantes. Por otro lado, el vector puede integrarse en el genoma de la célula huésped por recombinación no homóloga.When integration occurs into the genome of the host cell, the integration of the sequences into the genome can be based on homologous or non-homologous recombination. Alternatively, the vector may contain additional polynucleotides to direct integration by homologous recombination into the host cell genome at one or more precise locations on the chromosome(s). To increase the probability of integration at a precise location, the integration elements should contain a sufficient number of nucleic acids, such as 100 to 10,000 base pairs, 400 to 10,000 base pairs, and 800 to 10,000 base pairs. that have a high degree of sequence identity with the corresponding target sequence to improve the probability of homologous recombination. Integrational elements can be any sequence that is homologous to the target sequence in the host cell genome. Additionally, the integrational elements may be non-coding or coding polynucleotides. On the other hand, the vector can integrate into the host cell genome by non-homologous recombination.
Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permite al vector replicarse de manera autónoma en la célula huésped en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador plasmídico que medie la replicación autónoma que funciona en una célula. La expresión “origen de replicación” o “replicador plasmídico” significa un polinucleótido que permite que un plásmido o vector se replique in vivo. Ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177, y pACYC184 que permiten la replicación en E. coli, y pUB1 10, pE194, pTA1060, y pAMpI que permiten la replicación en Bacillus. Ejemplos de orígenes de replicación para su uso en una célula huésped de levadura son el origen de replicación de 2 micrómetros, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6. Ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula de hongo filamentoso son AMA1 y ANSI (Gems et al., 1991, Gene 98:61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15:9163-9175; WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen se puede lograr de acuerdo con los métodos desvelados en el documento WO 00/24883.For autonomous replication, the vector may further comprise an origin of replication that allows the vector to replicate autonomously in the host cell in question. The origin of replication can be any plasmid replicator that mediates autonomous replication functioning in a cell. The term "origin of replication" or "plasmid replicator" means a polynucleotide that allows a plasmid or vector to replicate in vivo . Examples of bacterial origins of replication are the replication origins of plasmids pBR322, pUC19, pACYC177, and pACYC184 that allow replication in E. coli, and pUB1 10, pE194, pTA1060, and pAMpI that allow replication in Bacillus. Examples of replication origins for use in a yeast host cell are the 2 micron origin of replication, ARS1, ARS4, the combination of ARS1 and CEN3, and the combination of ARS4 and CEN6. Examples of useful replication origins in a filamentous fungal cell are AMA1 and ANSI (Gems et al., 1991, Gene 98:61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15:9163-9175; WO 00/24883). Isolation of the AMA1 gene and construction of plasmids or vectors comprising the gene can be achieved according to the methods disclosed in WO 00/24883.
Más de una copia de un polinucleótido de la presente descripción se puede insertar en una célula huésped para aumentar la producción de un polipéptido. Un aumento en el número de copias del polinucleótido puede obtenerse integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o incluyendo un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido donde las células que contienen copias del gen marcador seleccionable amplifican, y, de ese modo, copias adicionales del polinucleótido, pueden seleccionarse para cultivar las células en presencia del agente seleccionable apropiado.More than one copy of a polynucleotide of the present disclosure can be inserted into a host cell to increase production of a polypeptide. An increase in the number of copies of the polynucleotide can be obtained by integrating at least one additional copy of the sequence into the genome of the host cell or by including an amplifiable selectable marker gene with the polynucleotide where cells containing copies of the selectable marker gene amplify, and Thus, additional copies of the polynucleotide can be selected for culturing the cells in the presence of the appropriate selectable agent.
Los procedimientos usados para enlazar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente descripción son bien conocidos para un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, citado anteriormente).The procedures used to link the elements described above to construct the recombinant expression vectors of the present description are well known to one skilled in the art (see, for example, Sambrook et al., 1989, supra).
Células huéspedHost cells
La presente descripción también se refiere a células huésped recombinantes que comprenden un polinucleótido que codifica una epimerasa de acuerdo con la presente divulgación unido operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la producción de la epimerasa de la presente descripción. Una construcción o vector que comprende un polinucleótido que codifica una epimerasa de acuerdo con la presente divulgación se introduce en una célula huésped de modo que la construcción o vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante como se ha descrito anteriormente.The present description also relates to recombinant host cells comprising a polynucleotide encoding an epimerase according to the present disclosure operatively linked to one or more control sequences that direct production of the epimerase of the present description. A construct or vector comprising a polynucleotide encoding an epimerase according to the present disclosure is introduced into a host cell such that the construct or vector is maintained as a chromosomal integrant or as a self-replicating extrachromosomal vector as described above.
La presente descripción se refiere además a una célula huésped recombinante que comprende además un polinucleótido que codifica un péptido de acuerdo con la presente divulgación unido operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la producción del péptido. En particular, la célula huésped puede coexpresar la epimerasa y el péptido de acuerdo con la presente divulgación. En este aspecto, la célula huésped produce tanto un péptido de la presente descripción como la epimerasa que es capaz de modificar el péptido antimicrobiano cambiando la configuración del aminoácido del péptido de una configuración L a una configuración D.The present description further relates to a recombinant host cell further comprising a polynucleotide encoding a peptide according to the present disclosure operatively linked to one or more control sequences that direct production of the peptide. In particular, the host cell may coexpress the epimerase and the peptide according to the present disclosure. In this aspect, the host cell produces both a peptide of the present disclosure and epimerase that is capable of modifying the antimicrobial peptide by changing the amino acid configuration of the peptide from an L configuration to a D configuration.
En un aspecto preferido, la célula huésped comprende un ácido nucleico que codifica una epimerasa de la presente descripción heteróloga a la célula huésped. En un aspecto preferido alternativo, la célula huésped comprende un ácido nucleico que codifica un péptido heterólogo a la célula huésped. En otro aspecto preferido, la célula huésped comprende ácidos nucleicos que codifican un péptido y una epimerasa, ambos heterólogos de la célula huésped. In a preferred aspect, the host cell comprises a nucleic acid encoding an epimerase of the present invention heterologous to the host cell. In an alternative preferred aspect, the host cell comprises a nucleic acid encoding a peptide heterologous to the host cell. In another preferred aspect, the host cell comprises nucleic acids encoding a peptide and an epimerase, both heterologous to the host cell.
La expresión “célula huésped” abarca cualquier progenie de una célula parental que no es idéntica a la célula parental debido a mutaciones que se producen durante la replicación. La elección de una célula huésped en gran parte dependerá del gen que codifica el polipéptido y su fuente.The term "host cell" encompasses any progeny of a parental cell that is not identical to the parental cell due to mutations that occur during replication. The choice of a host cell will largely depend on the gene encoding the polypeptide and its source.
La célula huésped puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de una epimerasa de la presente descripción, por ejemplo, un procariota o un eucariota.The host cell may be any cell useful in the recombinant production of an epimerase of the present disclosure, for example, a prokaryote or a eukaryote.
La célula huésped procariota puede ser cualquier bacteria grampositiva o gramnegativa. Las bacterias Grampositivas incluyen, pero no se limitan a, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus y Streptomyces. Las bacterias Granegativas incluyen, pero no se limitan a, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella y Ureaplasma. La célula huésped bacteriana puede ser cualquier célula de Bacillus, que incluye, pero no se limita a, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis y Bacillus thuringiensis. La célula huésped bacteriana puede ser cualquier célula de Streptococcus, que incluye, pero no se limita a, Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, Streptococcus equi y Streptococcus zooepidemicus. La célula huésped bacteriana puede ser, además, cualquier célula de Streptomyces, que incluye, pero no se limita a, Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus y Streptomyces lividans. The prokaryotic host cell can be any gram-positive or gram-negative bacteria. Gram-positive bacteria include, but are not limited to, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus and Streptomyces. Grannegative bacteria include, but are not limited to, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella and Ureaplasma. The bacterial host cell may be any Bacillus cell, including, but not limited to, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis. The bacterial host cell may be any Streptococcus cell, including, but not limited to, Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, Streptococcus equi and Streptococcus zooepidemicus . The bacterial host cell may further be any Streptomyces cell, including, but not limited to, Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus and Streptomyces lividans.
La introducción de ADN en una célula de Bacillus puede efectuarse mediante transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Chang y Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformación de células competentes (véase, por ejemplo, Young y Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), electroporación (véase, por ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), o conjugación (véase, por ejemplo, Koehler y Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). La introducción de ADN en una célula de E. coli puede efectuarse mediante transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. The introduction of DNA into a Bacillus cell can be carried out by protoplast transformation (see, for example, Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), competent cell transformation (see, for example, Young and Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, or Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), electroporation (see, for example, Shigekawa and Dower, 1988 , Biotechniques 6: 742-751), or conjugation (see, for example, Koehler and Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). The introduction of DNA into an E. coli cell can be carried out by protoplast transformation (see, for example, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol.
166: 557-580), o electroporación (véase, por ejemplo, Dower et al, 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). La introducción de ADN en una célula de Streptomyces puede efectuarse mediante transformación de protoplastos, electroporación (véase, por ejemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugación (véase, por ejemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), o transducción (véase, por ejemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 6289-6294). La introducción de ADN en una célula de Pseudomonas se puede efectuar mediante electroporación (véase, por ejemplo, Choi et al 2006 J. Microbiol. Methods 64: 391-397) conjugación (véase, por ejemplo, Pinedo y Smets, 2005, Appl. Environ. Microbio!. 71: 51-57). La introducción de ADN en una célula de Streptococcus puede efectuarse mediante competencia natural (véase, por ejemplo, Perry y Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Catt y Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), electroporación (véase, por ejemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) o conjugación (véase, por ejemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45, 409-436). Sin embargo, puede usarse cualquier método conocido en la técnica para introducir ADN en una célula huésped.166: 557-580), or electroporation (see, for example, Dower et al, 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). The introduction of DNA into a Streptomyces cell can be carried out by protoplast transformation, electroporation (see, for example, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugation (see, for example, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), or transduction (see, for example, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 6289-6294). The introduction of DNA into a Pseudomonas cell can be carried out by electroporation (see, for example, Choi et al 2006 J. Microbiol. Methods 64: 391-397) conjugation (see, for example, Pinedo and Smets, 2005, Appl. Environ. Microbio!. 71: 51-57). The introduction of DNA into a Streptococcus cell can be effected by natural competition (see, for example, Perry and Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), protoplast transformation (see, for example, Catt and Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), electroporation (see, for example, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) or conjugation (see, for example, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45, 409-436). However, any method known in the art can be used to introduce DNA into a host cell.
La célula huésped también puede ser una célula eucariota, tal como una célula de mamífero, insecto, planta u hongo. La célula huésped puede ser una célula fúngica. “Hongos”, tal como se usa en el presente documento incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota, así como Oomycota y todos los hongos mitospóricos (como definen Hawksworth et al., en Ainsworth y Bisby's Dictionary of The Fungi, 8a edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido). La célula huésped fúngica puede ser una célula de levadura. “Levadura”, como se usa en el presente documento, incluye levadura ascoesporógena (Endomycetales), levadura basidiosporógena y levadura perteneciente a Fungi imperfecti (Blastomycetes). Dado que la clasificación de la levadura puede cambiar en el futuro, para los fines de la presente descripción, se definirá la levadura como se describe en “Biology and Activities of Yeast” (Skinner, Passmore, y Davenport, editors, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980). La célula huésped de levadura puede ser una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia, tal como una célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis o Yarrowia lipolytica. La célula huésped fúngica puede ser una célula de hongo filamentoso. Los “hongos filamentosos” incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como definen Hawksworth et al., 1995, citado anteriormente). Los hongos filamentosos generalmente se caracterizan por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. La célula huésped de hongo filamentoso puede ser una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes o Trichodermal. Por ejemplo, la célula huésped de hongo filamentoso puede ser una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium gueenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride. The host cell may also be a eukaryotic cell, such as a mammalian, insect, plant or fungal cell. The host cell may be a fungal cell. “Fungi” as used herein includes the phyla Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota and Zygomycota, as well as Oomycota and all mitosporic fungi (as defined by Hawksworth et al., in Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition , 1995, CAB International, University Press, Cambridge, United Kingdom). The fungal host cell may be a yeast cell. “Yeast,” as used herein, includes ascosporogenic yeast (Endomycetales), basidiosporogenic yeast, and yeast belonging to Fungi imperfecti (Blastomycetes). Since the classification of yeast may change in the future, for the purposes of this description, yeast will be defined as described in “Biology and Activities of Yeast” (Skinner, Passmore, and Davenport, editors, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980). The yeast host cell may be a cell of Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces or Yarrowia , such as a cell of Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces ccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis or Yarrowia lipolytica . The fungal host cell may be a filamentous fungal cell. “Filamentous fungi” include all filamentous forms of the subdivision Eumycota and Oomycota (as defined by Hawksworth et al., 1995, cited above). Filamentous fungi are generally characterized by a mycelial wall composed of chitin, cellulose, glucan, chitosan, mannan, and other complex polysaccharides. The filamentous fungal host cell may be a cell of Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete , Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes or Trichodermal. For example, the filamentous fungal host cell may be a cell of Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium gueenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hir sutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum , Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola la nuginosa, Mucor Miehei, Myceliophthora Thermophila, Neurospora Crassa, Penicillium Purpurogenum, Phanerochaete Chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Villosa tramets, Versicolor tramets, trichoderma hazianum, trichoderma koningii, trichoderma longibrachiatum , Trichoderma Reesei or Viride Trichoderma.
Las células fúngicas pueden transformarse mediante un proceso que implica la formación de protoplastos, transformación de los protoplastos y regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Los procedimientos adecuados para la transformación de células huéspedes de Aspergillus y Trichoderma se describen en el documento EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, y Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Los métodos adecuados para transformar especies de Fusarium se describen en Malardier et al, 1989, Gene 78: 147-156 y el documento WO 96/00787. La levadura puede ser transformada usando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. y Simon, M.I., editores, “Guide to Yeast Genetics y Molecular Biology, Methods in Enzymology”, Volumen 194, pág. 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1920.Fungal cells can be transformed by a process involving protoplast formation, protoplast transformation and cell wall regeneration in a manner known per se. Suitable procedures for the transformation of Aspergillus and Trichoderma host cells are described in EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Academic Sci. USA 81: 1470-1474, and Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Suitable methods for transforming Fusarium species are described in Malardier et al, 1989, Gene 78: 147-156 and WO 96/00787. Yeast can be transformed using the procedures described by Becker and Guarente, in Abelson, JN and Simon, MI, editors, “Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology”, Volume 194, p. 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; and Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Academic Sci. USA 75:1920.
La célula también puede ser una célula de mamífero, por ejemplo, COS, CHO (US 4.889.803; US 5.047.335). En un aspecto particular, la célula es no humana y no embrionaria. Además, un animal transgénico no humano podría producir la epimerasa de la descripción, por ejemplo en la leche producida por el animal.The cell may also be a mammalian cell, for example, COS, CHO (US 4,889,803; US 5,047,335). In a particular aspect, the cell is non-human and non-embryonic. Furthermore, a non-human transgenic animal could produce the epimerase of the disclosure, for example in the milk produced by the animal.
La célula puede ser una célula vegetal. Por tanto, la epimerasa de la descripción podría ser producto de una planta transgénica.The cell may be a plant cell. Therefore, the epimerase of the description could be the product of a transgenic plant.
Como alternativa, también se proporciona un método para producir una epimerasa de acuerdo con la presente descripción, que comprende cultivar la célula huésped como se ha definido anteriormente, en condiciones que conducen a la producción de la epimerasa y recuperar y/o purificar la epimerasa. Como alternativa, también se proporciona un método para producir una epimerasa de acuerdo con la presente descripción, que comprende la expresión in vitro de la epimerasa con un ácido nucleico que codifica la epimerasa como se ha definido anteriormente. Opcionalmente, el método comprende además una etapa de inmovilización de la epimerasa en un soporte sólido. Alternatively, there is also provided a method for producing an epimerase according to the present description, comprising culturing the host cell as defined above, under conditions conducive to the production of the epimerase and recovering and/or purifying the epimerase. Alternatively, a method for producing an epimerase according to the present description is also provided, comprising in vitro expression of the epimerase with a nucleic acid encoding the epimerase as defined above. Optionally, the method further comprises a step of immobilizing the epimerase on a solid support.
La enzima puede recuperarse usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la enzima puede recuperarse del medio nutritivo por procedimientos convencionales, que incluyen, pero no se limitan a, recolección, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación.The enzyme can be recovered using methods known in the art. For example, the enzyme can be recovered from the nutrient medium by conventional procedures, including, but not limited to, harvesting, centrifugation, filtration, extraction, spray drying, evaporation or precipitation.
La enzima se puede purificar mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, hidrofóbica, cromatoenfoque y de exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, enfoque isoeléctrico preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación con sulfato amónico), SDS-PAGE o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, Janson y Ryden, editores, VCH Publishers, New York, 1989) para obtener polipéptidos sustancialmente puros. En un aspecto alternativo, la enzima no se recupera, sino más bien una célula huésped de la presente descripción que expresa la enzima se utiliza como fuente de la enzima.The enzyme can be purified by various procedures known in the art, including, but not limited to, chromatography (e.g., ion exchange, affinity, hydrophobic, chromatofocusing and size exclusion), electrophoretic procedures (e.g. preparative isoelectric focusing), differential solubility (e.g., ammonium sulfate precipitation), SDS-PAGE, or extraction (see, e.g., Protein Purification, Janson and Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989) to obtain substantially pure polypeptides . In an alternative aspect, the enzyme is not recovered, but rather a host cell of the present disclosure that expresses the enzyme is used as a source of the enzyme.
También se proporciona una composición o un kit que comprende la epimerasa aislada o recombinante como se ha definido anteriormente. En particular, la composición o kit pueden incluir hierro (por ejemplo, (NH4)2Fe(SO4)2) y azufre (por ejemplo, Na2S) como aditivos enzimáticos y un agente reductor, tal como ditiotreitol o beta-mercaptoetanol. Además, la composición puede incluir S-adenosil L-metionina (SAM), el cofactor de la enzima o metionina y ATP en presencia de sintasa SAM. Opcionalmente, la epimerasa puede inmovilizarse sobre un soporte sólido.Also provided is a composition or a kit comprising the isolated or recombinant epimerase as defined above. In particular, the composition or kit may include iron (e.g., (NH4) 2Fe ( SO4 ) 2 ) and sulfur (e.g., Na2S ) as enzyme additives and a reducing agent, such as dithiothreitol or beta-mercaptoethanol. . Additionally, the composition may include S-adenosyl L-methionine (SAM), the cofactor of the enzyme, or methionine and ATP in the presence of SAM synthase. Optionally, the epimerase can be immobilized on a solid support.
La presente descripción se refiere también al uso de una epimerasa como se ha definido anteriormente, una composición, un kit o soporte sólido que comprende la epimerasa, o una célula huésped recombinante que comprende un ácido nucleico, una construcción de ácido nucleico recombinante o un vector recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la epimerasa como se ha definido anteriormente, para producir el péptido con aminoácidos de configuración D.The present description also relates to the use of an epimerase as defined above, a composition, a kit or solid support comprising the epimerase, or a recombinant host cell comprising a nucleic acid, a recombinant nucleic acid construct or a vector recombinant comprising a nucleic acid sequence encoding the epimerase as defined above, to produce the peptide with D configuration amino acids.
Uso de la epimerasa para convertir L-aminoácido en D-aminoácido en un péptidoUsing epimerase to convert L-amino acid to D-amino acid in a peptide
Por consiguiente, la presente descripción se refiere al uso de una epimerasa de la descripción para convertir un L-aminoácido en D-aminoácido en un péptido. También se refiere a un método para convertir L-aminoácido en D-aminoácido en un péptido que comprende poner en contacto una epimerasa de la presente descripción con el péptido y, opcionalmente, recuperar el péptido con al menos un aminoácido convertido desde una configuración L a una configuración D.Accordingly, the present disclosure relates to the use of an epimerase of the disclosure to convert an L-amino acid to a D-amino acid in a peptide. It also relates to a method for converting L-amino acid to D-amino acid in a peptide comprising contacting an epimerase of the present description with the peptide and, optionally, recovering the peptide with at least one amino acid converted from an L configuration to a D configuration.
En un aspecto preferido, la presente descripción se refiere a un método para preparar un péptido de acuerdo con la presente descripción, en el que el procedimiento comprende una etapa de poner en contacto un péptido de acuerdo con la presente descripción con una epimerasa como se ha definido anteriormente. Se refiere también a la utilización de una epimerasa como se ha definido anteriormente para preparar un péptido de acuerdo con la presente descripción. En particular, el péptido puede tener cualquier secuencia particular como se ha definido anteriormente. Preferentemente, el método se lleva a cabo in vitro. En un primer aspecto, el péptido comprende una secuencia de 17 restos que tiene al menos un 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 33 a 49 de la SEC ID n.° 1 y dicha secuencia comprende las secuencias W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 71) y W-[lN/A]-X4-G-S (SEC ID n.° 69), en las que X4 es cualquier aminoácido, y una secuencia de unión entre la SEC ID n.° 69 y la SEC ID n.° 71 de 4-8 aminoácidos. En un segundo aspecto, el péptido comprende una secuencia de 24 residuos que tienen al menos un 40 % de identidad con la secuencia en las posiciones 26 a 49 de la SEC ID n.° 1, y comprende las secuencias de N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A] (SEC ID n.° 21) and W-IN-X4-G-S (SEC ID n.° 22), en la que X4 es cualquier aminoácido.In a preferred aspect, the present description relates to a method for preparing a peptide according to the present description, wherein the method comprises a step of contacting a peptide according to the present description with an epimerase as set forth defined above. It also refers to the use of an epimerase as defined above to prepare a peptide according to the present description. In particular, the peptide may have any particular sequence as defined above. Preferably, the method is carried out in vitro. In a first aspect, the peptide comprises a 17-residue sequence that has at least 40% identity with the sequence at positions 33 to 49 of SEQ ID NO: 1 and said sequence comprises the sequences WYF-[V/ I/A] (SEQ ID NO: 71) and W-[l N /A]-X4-GS (SEQ ID NO: 69), wherein X4 is any amino acid, and a linker sequence between SEQ ID NO: ID NO: 69 and SEQ ID NO: 71 of 4-8 amino acids. In a second aspect, the peptide comprises a sequence of 24 residues having at least 40% identity with the sequence at positions 26 to 49 of SEQ ID NO: 1, and comprises the sequences of N/DDLWYF-[ V/I/A] (SEQ ID NO: 21) and WI N -X4-GS (SEQ ID NO: 22), where X4 is any amino acid.
Para finalizar, la presente descripción se refiere a un método para preparar un péptido de acuerdo con la presente descripción, en el que el método comprende cultivar una célula huésped recombinante de acuerdo con la presente descripción en condiciones adecuadas para la coexpresión del péptido y la epimerasa y recuperar el péptido que tiene al menos un aminoácido con configuración D. Preferentemente, el método se lleva a cabo ex vivo. También se refiere al uso de una célula huésped recombinante de acuerdo con la presente descripción para la preparación de un péptido como se ha definido anteriormente.Finally, the present description relates to a method for preparing a peptide according to the present description, wherein the method comprises culturing a recombinant host cell according to the present description under conditions suitable for co-expression of the peptide and the epimerase. and recovering the peptide having at least one amino acid with D configuration. Preferably, the method is carried out ex vivo. It also relates to the use of a recombinant host cell according to the present description for the preparation of a peptide as defined above.
En un aspecto particular, las fuentes de epimerasa y péptido pueden coincidir. Por ejemplo, una epimerasa a partir de Bacillus subtilis se podría utilizar, preferentemente, para preparar un péptido a partir de Bacillus subtilis o derivado del mismo. En este aspecto concreto, si el péptido como se ha definido anteriormente comprende una secuencia que tiene al menos un 80, 85, 90 o 95 % de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEC ID n.° 1-5 o un fragmento de la misma de al menos 24 restos consecutivos, la epimerasa elegida tendrá al menos un 80, 85, 90 o 95 % de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEC ID n.os 25-35. Si el péptido como se ha definido anteriormente comprende una secuencia que tiene al menos un 80, 85, 90 o 95 % de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEC ID n.° 6-9 o un fragmento de la misma de al menos 24 restos consecutivos, la epimerasa elegida tendrá al menos un 80, 85, 90 o 95 % de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEC ID n.os 36-38. Si el péptido como se ha definido anteriormente comprende una secuencia que tiene al menos un 80, 85, 90 o 95 % de identidad con una secuencia de la SEC ID n.° 10 o un fragmento de la misma de al menos 24 restos consecutivos, la epimerasa elegida tendrá al menos un 80, 85, 90 o 95 % de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEC ID n.os 39 40. Si el péptido como se ha definido anteriormente comprende una secuencia que tiene al menos un 80, 85, 90 o 95 % de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEC ID n.° 11-13 y 17-18 o un fragmento de la misma de al menos 24 restos consecutivos, la epimerasa elegida tendrá al menos un 80, 85, 90 o 95 % de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEC ID n.os 41-50. Si el péptido como se ha definido anteriormente comprende una secuencia que tiene al menos un 80, 85, 90 o 95 % de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEC ID n.° 14-16 o un fragmento de la misma de al menos 24 restos consecutivos, la epimerasa elegida tendrá al menos un 80, 85, 90 o 95 % de identidad con una secuencia de la SEC ID n.° 51. Si el péptido como se ha definido anteriormente comprende una secuencia que tiene al menos un 80, 85, 90 o 95 % de identidad con una secuencia de la SEC ID n.° 19 o un fragmento de la misma de al menos 24 restos consecutivos, la epimerasa elegida tendrá al menos un 80, 85, 90 o 95 % de identidad con una secuencia de la SEC ID n.° 52.In a particular aspect, the sources of epimerase and peptide may coincide. For example, an epimerase from Bacillus subtilis could preferably be used to prepare a peptide from Bacillus subtilis or derivative thereof. In this particular aspect, if the peptide as defined above comprises a sequence that has at least 80, 85, 90 or 95% identity with a sequence selected from SEQ ID NO: 1-5 or a fragment of the same of at least 24 consecutive residues, the chosen epimerase will have at least 80, 85, 90 or 95% identity with a sequence selected from SEQ ID NOs 25-35. If the peptide as defined above comprises a sequence that has at least 80, 85, 90 or 95% identity with a sequence selected from SEQ ID NO: 6-9 or a fragment thereof of at least 24 consecutive residues, the chosen epimerase will have at least 80, 85, 90 or 95% identity with a sequence selected from SEQ ID NOS 36-38. If the peptide as defined above comprises a sequence that has at least 80, 85, 90 or 95% identity with a sequence of SEQ ID NO: 10 or a fragment thereof of at least 24 consecutive residues, the epimerase chosen will have at least 80, 85, 90 or 95% identity with a sequence selected from SEQ ID NO: 39 40. If the peptide as defined above comprises a sequence that has at least 80, 85 , 90 or 95% identity with a sequence selected from SEQ ID NO: 11-13 and 17-18 or a fragment thereof of at least 24 consecutive residues, the chosen epimerase will have at least 80, 85, 90 o 95% identity with a sequence selected from SEQ ID NOS 41-50. If the peptide as defined above comprises a sequence that has at least 80, 85, 90 or 95% identity with a sequence selected from SEQ ID NO: 14-16 or a fragment thereof of at least 24 consecutive residues, the epimerase chosen will have at least 80, 85, 90 or 95% identity with a sequence of SEQ ID NO: 51. If the peptide as defined above comprises a sequence that has at least 80, 85, 90 or 95% identity with a sequence of SEQ ID NO: 19 or a fragment thereof of at least 24 consecutive residues, the epimerase chosen will have at least 80, 85, 90 or 95% identity with a sequence of SEQ ID NO:52.
DefinicionesDefinitions
Aproximadamente: Cuando se usa en el presente documento, “aproximadamente” significa más o menos 10 %, preferentemente más o menos 5 %. Por ejemplo, aproximadamente 100 significa entre 90 y 110, preferentemente entre 95 y 105. Approximately: When used herein, “approximately” means plus or minus 10%, preferably plus or minus 5%. For example, about 100 means between 90 and 110, preferably between 95 and 105.
“Consiste en”, “consiste esencialmente en” o “comprende sustancialmente”: La descripción en el presente documento de cualquier aspecto de la descripción que usa términos tales como la referencia a un elemento o elementos pretende proporcionar soporte para un aspecto similar de la descripción que “consiste en”, “consiste esencialmente en” o “comprende sustancialmente” ese elemento o elementos particulares, a menos que se establezca lo contrario o se contradiga claramente con el contexto. Por ejemplo, debe entenderse que un péptido o proteína descrito en el presente documento como que comprende una secuencia particular debe entenderse que también describe un péptido o proteína que consiste en esa secuencia, a menos que se establezca lo contrario o se contradiga claramente con el contexto. Por “consiste esencialmente en” se entiende que el péptido o proteína consiste en esa secuencia, pero también puede incluir 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones, adiciones o deleciones. En particular, por “esencialmente consiste en”, se puede pretender que el péptido pueda incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos adicionales en el extremo N o C y 1, 2 o 3 sustituciones, deleciones o adiciones. “Consists of”, “consists essentially of” or “substantially comprises”: The description herein of any aspect of the description that uses terms such as reference to an element or elements is intended to provide support for a similar aspect of the description that “consists of,” “consists essentially of,” or “substantially comprises” that particular element or elements, unless otherwise stated or clearly contradicted by the context. For example, a peptide or protein described herein as comprising a particular sequence should be understood to also describe a peptide or protein consisting of that sequence, unless otherwise stated or clearly contradicted by the context. . By “consists essentially of” it is meant that the peptide or protein consists of that sequence, but may also include 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 substitutions, additions or deletions. In particular, by "essentially consists of", it can be intended that the peptide may include 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 additional amino acids at the N or C terminus and 1, 2 or 3 substitutions, deletions or additions.
Secuencia de codificación: la expresión “secuencia de codificación” significa un polinucleótido, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Los límites de la secuencia de codificación generalmente están determinados por un marco de lectura abierto, que comienza con un codón de iniciación, tal como ATG, GTG o TTG y termina con un codón de terminación, tal como TAA, TAG o TGA. La secuencia de codificación puede ser un ADN genómico, ADNc, ADN sintético o una combinación de los mismos. Coding sequence: The term “coding sequence” means a polynucleotide, which directly specifies the amino acid sequence of a polypeptide. The boundaries of the coding sequence are generally determined by an open reading frame, which begins with a start codon, such as ATG, GTG or TTG and ends with a stop codon, such as TAA, TAG or TGA. The coding sequence may be genomic DNA, cDNA, synthetic DNA or a combination thereof.
Secuencias de control: la expresión “secuencias de control” significa secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión de un polinucleótido que codifica una epimerasa de la presente descripción. Las secuencias de control pueden ser nativas (es decir, del mismo gen) o heterólogas (es decir, de un gen diferente y/o una especie diferente) al polinucleótido que codifica la epimerasa. Preferentemente, las secuencias de control son heterólogas. Se preferirán secuencias de control bien conocidas y usadas actualmente por los expertos en la técnica. Dichas secuencias de control incluyen, pero no se limitan a, una secuencia líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de propéptido, promotor, secuencia de péptido señal y terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de terminación de la transcripción y la traducción. Las secuencias de control pueden proporcionarse con enlazadores con el fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la unión de las secuencias de control con la región de codificación del polinucleótido que codifica la epimerasa. La combinación funcional de las secuencias de control y las secuencias de codificación se puede denominar casete de expresión. Control Sequences: The term “control sequences” means nucleic acid sequences necessary for the expression of a polynucleotide encoding an epimerase of the present disclosure. Control sequences may be native (i.e., from the same gene) or heterologous (i.e., from a different gene and/or a different species) to the polynucleotide encoding the epimerase. Preferably, the control sequences are heterologous. Control sequences well known and currently used by those skilled in the art will be preferred. Such control sequences include, but are not limited to, a leader sequence, a polyadenylation sequence, a propeptide sequence, promoter, signal peptide sequence and transcription terminator. At a minimum, control sequences include a promoter and transcription and translation termination signals. The control sequences may be provided with linkers in order to introduce specific restriction sites that facilitate binding of the control sequences to the coding region of the polynucleotide encoding the epimerase. The functional combination of the control sequences and the coding sequences can be called an expression cassette.
Expresión: el término “expresión” incluye cualquier etapa implicada en la producción de un polipéptido, que incluye, pero no se limita a, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción. Expression: The term “expression” includes any step involved in the production of a polypeptide, including, but not limited to, transcription, post-transcriptional modification, translation, post-translational modification and secretion.
Vector de expresión: La expresión “vector de expresión” significa una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica la epimerasa de la descripción y está operativamente unida a las secuencias de control que proporcionan su expresión. Por tanto, el vector de expresión comprende un casete de expresión adecuado para expresar la epimerasa de la descripción. Expression vector: The term “expression vector” means a linear or circular DNA molecule comprising a polynucleotide that encodes the epimerase of the description and is operatively linked to control sequences that provide for its expression. Therefore, the expression vector comprises an expression cassette suitable for expressing the epimerase of the description.
Aislado: El término “aislado” significa una sustancia en una forma o entorno que no se produce en la naturaleza. Los ejemplos no limitantes de sustancias aisladas incluyen (1) cualquier sustancia no natural, (2) cualquier sustancia que incluye, pero no se limita a, cualquier enzima, variante, ácido nucleico, proteína, péptido o cofactor, que se extrae al menos parcialmente de uno o más o de todos los constituyentes naturales con los que está asociado en la naturaleza; (3) cualquier sustancia modificada por la mano del hombre relacionada con esa sustancia que se encuentra en la naturaleza; o (4) cualquier sustancia modificada aumentando la cantidad de la sustancia en relación con otros componentes con los que está asociada naturalmente (por ejemplo, copias múltiples de un gen que codifica la sustancia; uso de un promotor más fuerte que el promotor asociado naturalmente con el gen que codifica la sustancia). Isolated: The term “isolated” means a substance in a form or environment that does not occur in nature. Non-limiting examples of isolated substances include (1) any non-natural substance, (2) any substance including, but not limited to, any enzyme, variant, nucleic acid, protein, peptide or cofactor, which is at least partially extracted of one or more or all of the natural constituents with which it is associated in nature; (3) any substance modified by man related to that substance found in nature; or (4) any modified substance by increasing the amount of the substance relative to other components with which it is naturally associated (e.g., multiple copies of a gene encoding the substance; use of a promoter stronger than the promoter naturally associated with the gene that codes for the substance).
Recombinante: Recombinante se refiere a una construcción de ácido nucleico, un vector y una proteína producidos por ingeniería genética. Recombinant: Recombinant refers to a nucleic acid construct, a vector and a protein produced by genetic engineering.
Heterólogo: en el contexto de una célula huésped, un vector o una construcción de ácido nucleico, designa una secuencia de codificación para la epimerasa/péptido introducido en la célula huésped, el vector o la construcción de ácido nucleico mediante ingeniería genética. En el contexto de una célula huésped, puede significar que la secuencia de codificación para la epimerasa/péptido proviene de una fuente diferente de la célula en la que se introduce. Por ejemplo, una epimerasa de Bacillus subtilis se expresa en E. coli. Como alternativa, también puede significar que la secuencia de codificación para la epimerasa/péptido proviene de la misma especie que la célula en la que se introduce, pero se considera heteróloga debido a su entorno que no es natural, por ejemplo, porque está bajo el control de un promotor que no es su promotor natural, o se introduce en un lugar que difiere de su ubicación natural. Heterologous: In the context of a host cell, vector or nucleic acid construct, designates a coding sequence for the epimerase/peptide introduced into the host cell, vector or nucleic acid construct by genetic engineering. In the context of a host cell, it may mean that the coding sequence for the epimerase/peptide comes from a different source than the cell into which it is introduced. For example, an epimerase from Bacillus subtilis is expressed in E. coli. Alternatively, it may also mean that the coding sequence for the epimerase/peptide comes from the same species as the cell into which it is introduced, but is considered heterologous due to its unnatural environment, for example because it is under the control of a promoter that is not its natural promoter, or is introduced in a location that differs from its natural location.
Construcción de ácido nucleico: La expresión “construcción de ácido nucleico” significa una molécula de ácido nucleico, ya sea de cadena sencilla o bicatenaria, que se modifica para que contenga segmentos de ácidos nucleicos de una manera que, de otro modo, no existiría en la naturaleza o que es sintética, lo cual comprende una o más secuencias de control. Nucleic acid construct: The term “nucleic acid construct” means a nucleic acid molecule, whether single-stranded or double-stranded, that is modified to contain segments of nucleic acids in a manner that would not otherwise exist in nature or that is synthetic, which comprises one or more control sequences.
Unido operativamente: La expresión “operativamente unido” significa una configuración en la que una secuencia de control se coloca en una posición apropiada con respecto a una secuencia de codificación, de tal manera que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia de codificación. Operationally linked: The term “operatively linked” means a configuration in which a control sequence is placed in an appropriate position with respect to a coding sequence, such that the control sequence directs the expression of the coding sequence.
Identidad de secuencia: La identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se describe mediante el parámetro “identidad de secuencia”. Para los fines de la presente descripción, el “porcentaje de identidad” entre dos secuencias de aminoácidos (A) y (B) se determina comparando las dos secuencias alineadas de una manera óptima, a través de una ventana de comparación. Dicha alineación de secuencias puede llevarse a cabo mediante métodos bien conocidos, por ejemplo, usando el algoritmo para la alineación global de Needleman-Wunsch. El software de análisis de proteínas aparea secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluidas sustituciones conservadoras de aminoácidos. Una vez que se obtiene la alineación total, se puede obtener el porcentaje de identidad dividiendo el número completo de restos de aminoácidos idénticos alineados por el número total de restos contenidos en la secuencia más larga entre la secuencia (A) y (B). Sequence identity: The sequence identity between two amino acid sequences is described by the parameter “sequence identity”. For the purposes of the present description, the "percent identity" between two amino acid sequences (A) and (B) is determined by comparing the two optimally aligned sequences, across a comparison window. Such sequence alignment can be carried out by well-known methods, for example, using the Needleman-Wunsch global alignment algorithm. The protein analysis software matches similar sequences using similarity measures mapped to various substitutions, deletions, and other modifications, including conservative amino acid substitutions. Once the full alignment is obtained, the percent identity can be obtained by dividing the complete number of identical amino acid residues aligned by the total number of residues contained in the longest sequence between sequence (A) and (B).
La identidad de secuencia se determina típicamente usando un software de análisis de secuencia. Para comparar dos secuencias de aminoácidos, se puede usar, por ejemplo, la herramienta “Emboss needle” para la alineación secuencial por pares de proteínas que proporciona EMBL-EBI y disponible en: Sequence identity is typically determined using sequence analysis software. To compare two amino acid sequences, one can use, for example, the “Emboss needle” tool for pairwise sequential alignment of proteins provided by EMBL-EBI and available at:
www.ebi.ac.uk/Tools/services/web/toolform.ebi?tool=emboss_needle&context=protein,www.ebi.ac.uk/Tools/services/web/toolform.ebi?tool=emboss_needle&context=protein,
usando las configuraciones predeterminadas: (I) Matriz: BLOSUM62, (ii) Hueco abierto: 10, (iii) extensión de hueco: 0,5, (iv) formato de salida: par, (v) penalización por hueco final: falso, (vi) apertura de hueco final: 10, (vii) extensión de hueco final: 0,5.using default settings: (I) Array: BLOSUM62, (ii) Open Gap: 10, (iii) Gap Extent: 0.5, (iv) Output Format: Even, (v) Final Gap Penalty: False, (vi) final gap opening: 10, (vii) final gap extension: 0.5.
Como alternativa, la identidad de secuencia también puede determinarse típicamente utilizando el software de análisis de secuencias Clustal Omega utilizando el algoritmo HHalign y su configuración predeterminada como motor de alineación central. El algoritmo se describe en Soding, J. (2005) 'Protein homology detection by HMM-HMM comparison'. Bioinformatics 21, 951-960, con las configuraciones predeterminadas.Alternatively, sequence identity can also typically be determined using Clustal Omega sequence analysis software using the HHalign algorithm and its default settings as the core alignment engine. The algorithm is described in Soding, J. (2005) 'Protein homology detection by HMM-HMM comparison'. Bioinformatics 21, 951-960, with default settings.
Aminoácidos: Las secuencias de aminoácidos definidas en el presente documento están representadas por un símbolo de una letra como se muestra a continuación: A, Ala, (alanina); R, Arg, (arginina); N, Asn, (asparagina); D, Asp, (ácido aspártico); C, Cys, (cisteína); Q, Gln, (glutamina); E, Glu, (ácido glutámico); G, Gly, (glicina); H, His, (histidina); I, Ile, (isoleucina); L, Leu, (leucina); K, Lys, (lisina); M, Met, (metionina); F, Phe, (fenilalanina); P, Pro, (prolina); S, Ser, (serina); T, Thr, (treonina); W, Trp, (triptófano); Y, Tyr, (tirosina); y V, Val, (valina). Amino Acids: The amino acid sequences defined herein are represented by a one-letter symbol as shown below: A, Ala, (alanine); R, Arg, (arginine); N, Asn, (asparagine); D, Asp, (aspartic acid); C, Cys, (cysteine); Q, Gln, (glutamine); E, Glu, (glutamic acid); G, Gly, (glycine); H, His, (histidine); I, Ile, (isoleucine); L, Leu, (leucine); K, Lys, (lysine); M, Met, (methionine); F, Phe, (phenylalanine); P, Pro, (proline); S, Ser, (serine); T, Thr, (threonine); W, Trp, (tryptophan); Y, Tyr, (tyrosine); and V, Val, (valine).
Conservados: Por aminoácido conservado se entiende que una secuencia definida se alinea con la secuencia de referencia y el resto de la secuencia definida que corresponde a la posición indicada en la secuencia de referencia es idéntico al resto presente en la secuencia de referencia. La alineación puede realizarse por cualquier método disponible y, en particular, por el método desvelado para la determinación de identidad justo anteriormente, más preferentemente mediante Clustal Omega. La posición del resto se indica en la secuencia de referencia. Conserved: Conserved amino acid means that a defined sequence aligns with the reference sequence and the remainder of the defined sequence corresponding to the position indicated in the reference sequence is identical to the remainder present in the reference sequence. The alignment can be carried out by any available method and, in particular, by the method disclosed for identity determination just above, more preferably by Clustal Omega. The position of the remainder is indicated in the reference sequence.
El término “antimicrobiano” como se emplea en el presente documento se refiere a una actividad antibacteriana, antivírica, antifúngica y/o antiparasitaria. Dicha actividad puede evaluarse midiendo diferentes parámetros, tales como la CI50 o CIM.The term "antimicrobial" as used herein refers to antibacterial, antiviral, antifungal and/or antiparasitic activity. Said activity can be evaluated by measuring different parameters, such as IC 50 or MIC.
“CI50” o “concentración inhibidora semimáxima” es la concentración de una sustancia necesaria para reducir a la mitad el crecimiento in vitro de una población de microorganismos.“IC 50 ” or “half-maximal inhibitory concentration” is the concentration of a substance necessary to reduce the in vitro growth of a population of microorganisms by half.
“CIM” o “concentración inhibitoria mínima” es la concentración más baja de una sustancia que inhibirá totalmente el crecimiento microbiano después de 18 horas de incubación, generalmente a 37 °C, en presencia de dicha sustancia. “MIC” or “minimum inhibitory concentration” is the lowest concentration of a substance that will completely inhibit microbial growth after 18 hours of incubation, generally at 37°C, in the presence of that substance.
La expresión “concentración letal, 50 %” o “CLThe expression “lethal concentration, 50%” or “LC 50fifty ” como se emplea en el presente documento se refiere a la concentración de sustancia requerida para matar a la mitad de una población. La CL” as used herein refers to the concentration of substance required to kill half of a population. The CL 50 fifty es un indicador cuantitativo de la toxicidad de una sustancia. En particular, la CLIt is a quantitative indicator of the toxicity of a substance. In particular, the CL 50 fifty se emplea en el presente documento para evaluar la actividad citolítica de AMP y, en este caso, corresponde a la concentración de péptidos que induce la lisis de la mitad de la población celular.is used herein to evaluate the cytolytic activity of AMP and, in this case, corresponds to the concentration of peptides that induces the lysis of half of the cell population.
Breve descripción de las figurasBrief description of the figures
Figura 1. Purificación, análisis espectroscópico y actividad de YydG. (Figura 1A) (Estructura del operón yydFGHIJ. yydF: péptido putativo, yydG: enzima SAM radical, yydH: proteasa, yydlJ transportador de tipo ABC. (Figura 1B) Análisis de electroforesis en gel de YydG purificado expresado en E. coli. (Figura 1C) Espectro UV-visible de YydG reconstituido anaeróbicamente. (Figura 1D) Múltiples alineaciones de homólogos de YydF cercanos hallados, en particular, en B. subtilis y especies de Staphylococci. (Figura 1E) Análisis HPLC de escisión con SAM (257 nm) y péptidos (Figura 1F) producidos en la reacción (280 nm) después de 4 horas de incubación en condiciones anaeróbicas en presencia o ausencia de ditionito de sodio (2 mM). (Figura 1G) Curso de tiempo para la producción de 5'-dA (■, y péptidos modificados (♦ ) cuantificado mediante HPLC de fase inversa y monitorizado mediante detección de UV-visible (280 nm). YydG (100 μM) se incubó en condiciones anaeróbicas con ditionito de sodio (2 mM) en presencia de 1 mM de sustrato YydFi8-49. (Figura 1H e I) Análisis por HPLC de YydG incubado con (Figura 1H) YydF o (Figura 1I) una versión truncada de YydF18-49. YydG, después de reconstitución anaeróbica, se incubó en condiciones anaerobias en presencia de DTT (6 mM) y SAM (1 mM) con o sin ditionito de sodio (2 mM). Figure 1. Purification, spectroscopic analysis, and activity of YydG. (Figure 1A) (Structure of the yydFGHIJ operon. yydF: putative peptide, yydG: radical SAM enzyme, yydH: protease, yydlJ ABC-type transporter. (Figure 1B) Gel electrophoresis analysis of purified YydG expressed in E. coli. (Figure 1B) Gel electrophoresis analysis of purified YydG expressed in E. coli . (Figure 1B) Figure 1C) UV-visible spectrum of anaerobically reconstituted YydG (Figure 1D) Multiple alignments of close YydF homologues found, in particular, in B. subtilis and Staphylococci species (Figure 1E) HPLC analysis of cleavage with SAM (257 nm ) and peptides (Figure 1F) produced in the reaction (280 nm) after 4 hours of incubation under anaerobic conditions in the presence or absence of sodium dithionite (2 mM). (Figure 1G) Time course for the production of 5' -dA (■, and modified peptides (♦) quantified by reverse-phase HPLC and monitored by UV-visible detection (280 nm). YydG (100 μM) was incubated under anaerobic conditions with sodium dithionite (2 mM) in the presence of 1 mM YydF substrate i8-49 .(Figure 1H and I) HPLC analysis of YydG incubated with (Figure 1H) YydF or (Figure 1I) a truncated version of YydF18-49. YydG, after anaerobic reconstitution, was incubated under anaerobic conditions in the presence of DTT (6 mM) and SAM (1 mM) with or without sodium dithionite (2 mM).
Figura 2 - YydG cataliza la transferencia de átomo de H a la cadena principal del péptido. El mapeo de péptidos trípticos y el análisis LC-MS de (Figura 2A) YydF18-49 o (Figura 2B) YydF18-49 tras la incubación con YydG. Los números indican el valor m/z para cada péptido. La secuencia en negrita indica el péptido relevante identificado por LC-MS (es decir, el Péptido 1: NH 2 -GLLDESQK, [M+H]+ = 931,48; Péptido 2: VNDLWYF [M+2H]2+=592,31; Péptido 3: W IlGs GH-Ac, [M+H]+ = 768,41). (Figura 2C) Análisis LC-MS del péptido YydF18-49 después de la incubación con YydG en tampón deuterado. (Figura 2D) Mapeo de péptidos trípticos y análisis de LC-MS de YydF18-49 después de la incubación con YydG en tampón deuterado. Figure 2 - YydG catalyzes the transfer of H atom to the peptide backbone. Tryptic peptide mapping and LC-MS analysis of (Figure 2A) YydF 18-49 or (Figure 2B) YydF 18-49 following incubation with YydG. The numbers indicate the m/z value for each peptide. The sequence in bold indicates the relevant peptide identified by LC-MS (i.e., Peptide 1: NH 2 -GLLDESQK, [M+H] + = 931.48; Peptide 2: VNDLWYF [M+2H] 2+ =592 .31; Peptide 3: W IlGs GH-Ac, [M+H] + = 768.41). (Figure 2C) LC-MS analysis of YydF 18-49 peptide after incubation with YydG in deuterated buffer. (Figure 2D) Tryptic peptide mapping and LC-MS analysis of YydF 18-49 after incubation with YydG in deuterated buffer.
Figura 3 - YydG cataliza epimerización de aminoácidos. Análisis LC-MS/MS de una (Figura 3A) L-Ile/D-allo-Ile y (Figura 3B) L-/D-Val (trazados superiores) en comparación con los aminoácidos obtenidos después de la incubación de YydF18-49 con la enzima rSAM YydG en tampón deuterado (trazados inferiores). Los aminoácidos se derivaron mediante W-a-(2,4-dinitro-5-fluorofenil)-L-valinamida (L-FDVA) y se detectaron por LC-MS como derivados de FDVA. Figure 3 - YydG catalyzes amino acid epimerization. LC-MS/MS analysis of a (Figure 3A) L-Ile/D-allo-Ile and (Figure 3B) L-/D-Val (upper traces) in comparison with the amino acids obtained after incubation of YydF 18- 49 with the rSAM enzyme YydG in deuterated buffer (lower traces). Amino acids were derived by Wa-(2,4-dinitro-5-fluorophenyl)-L-valinamide (L-FDVA) and detected by LC-MS as FDVA derivatives.
Figura 4 - Actividad de los mutantes YydG. (Figura 4A) Secuencia de YydG con los restos de cisteína resaltados. (Figura 4B) Análisis de electroforesis en gel de las enzimas mutantes purificadas. (Figura 4C) los espectros UV-visible de A3 (es decir AxxxAxxA) (trazado azul), C22A (trazado verde), C222A (trazado rojo) y C223A (trazado púrpura) mutantes después de la reconstitución anaeróbica. (Figura 4D) Análisis por HPLC de la reacción después de la incubación de YydF18-49 y los cuatro mutantes en presencia de SAM (1 mM) y ditionito de sodio. (Figura 4E) Análisis LC-MS de los péptidos producidos por el mutante C223A y sus correspondientes masas y secuencias.Figure 4 - Activity of YydG mutants. (Figure 4A) Sequence of YydG with the cysteine residues highlighted. (Figure 4B) Gel electrophoresis analysis of the purified mutant enzymes. (Figure 4C) UV-visible spectra of A3 (i.e. AxxxAxxA) (blue trace), C 2 2A (green trace), C 2 22A (red trace) and C 2 23A (purple trace) mutants after anaerobic reconstitution . (Figure 4D) HPLC analysis of the reaction after incubation of YydF18-49 and the four mutants in the presence of SAM (1 mM) and sodium dithionite. (Figure 4E) LC-MS analysis of the peptides produced by the C 2 23A mutant and their corresponding masses and sequences.
Figura 5 - Actividad de YydF18-49 de YydG. (Figura 5A) Ensayo de inhibición de crecimiento en placas de B. subtilis en presencia de YydFis-49 o la YydFb producto epimerizado. (Figura 5B) Crecimiento de Figure 5 - YydF18-49 activity of YydG. (Figure 5A) Growth inhibition assay on B. subtilis plates in the presence of YydFis-49 or the epimerized product YydFb. (Figure 5B) Growth of Bacillus subtilis Bacillus subtilis en medio LB en ausencia de péptido (□) o en presencia del péptido YydFis-49 con un extremo C libre: Ac-GLLDESQKLAKVNDLWYFVKSKENRWILGSGH (SEC ID n.°20) que no contiene ninguna modificación (■), un D-alo-Ile (♦), un D-Val (O) o dos restos epimerizados: Ac-GLLDESQKLAKVNDLWYF{d-V}KSKENRW{d-l}LGSGH (SEC ID n.° 20) (A). Los valores de DO son las medias de 3 cultivos independientes.in LB medium in the absence of peptide (□) or in the presence of the YydFis-49 peptide with a free C terminus: Ac-GLLDESQKLAKVNDLWYFVKSKENRWILGSGH (SEQ ID NO:20) containing no modification (■), a D-allo-Ile (♦), one D-Val (O) or two epimerized residues: Ac-GLLDESQKLAKVNDLWYF{d-V}KSKENRW{d-l}LGSGH (SEQ ID NO: 20) (A). OD values are the means of 3 independent cultures.
Figura 6- Múltiples alineaciones de homólogos cercanos de YydG hallados, en particular, en Figure 6- Multiple alignments of close homologs of YydG found, in particular, in B. subtilis B. subtilis y especies de estafilococos.and staphylococcus species.
Figura 7 - Análisis de espectrometría de masas del péptido YydF aislado de B. subtilis y denominado YydF33-49. Análisis LC-MS/MS de (a) el péptido secretado por B. subtilis, (b) Péptido YydF33-49DD sintético que contiene dos restos de D-aminoácidos y (c) péptido YydF33-49 sintético. Se indican los iones relevantes. Tablas 1 para la asignación completa. En la secuencia peptídica, los aminoácidos con una configuración D se indican en gris. Figure 7 - Mass spectrometry analysis of the YydF peptide isolated from B. subtilis and called YydF 33-49 . LC-MS/MS analysis of (a) the peptide secreted by B. subtilis, (b) synthetic YydF33-49DD peptide containing two D-amino acid residues, and (c) synthetic YydF33-49 peptide. Relevant ions are indicated. Tables 1 for the full assignment. In the peptide sequence, amino acids with a D configuration are indicated in gray.
Figura 8 -(A) Crecimiento de B. subtilis en medio LB líquido en presencia de YydFFigure 8 -(A) Growth of B. subtilis in liquid LB medium in the presence of YydF 33^9 33^9 o YydF33^9DD. or YydF33^9DD. B. subtilis B. subtilis se cultivó en medio LB solo (♦), en presencia de YydF33-49(ü) o YydF33-49DD (■). Cada medida es la media de tres experimentos de crecimiento con la SD indicada. Los restos epimerizados están en negrita. (b) Relación de crecimiento de B. subtilis en presencia de YydF18-49 (100 μM) o YydF18-49DD (100, 10 o 1 μM). Las relaciones se determinaron por comparación con el crecimiento en ausencia de péptido. (c) Relación de crecimiento de B. subtilis en presencia de YydF33-49 o YydF33-49DD (100, 10, 1,0.1 o 0,01 μM). Las relaciones se determinaron por comparación con el crecimiento bacteriano en ausencia de péptido.was cultured in LB medium alone (♦), in the presence of YydF33-49(ü) or YydF33-49DD (■). Each measurement is the mean of three growth experiments with the indicated SD. Epimerized remains are in bold. (b) Growth rate of B. subtilis in the presence of YydF18-49 (100 μM) or YydF18-49DD (100, 10, or 1 μM). The ratios were determined by comparison with growth in the absence of peptide. (c) Growth ratio of B. subtilis in the presence of YydF33-49 or YydF33-49DD (100, 10, 1.0.1 or 0.01 μM). The ratios were determined by comparison with bacterial growth in the absence of peptide.
Figura 9 - Crecimiento de Figure 9 - Growth of B. subtilis B. subtilis en medio LB líquido en presencia de YydFis-49 (□) o tras la adición (Flecha) del YydFi8-49DD (■) tras 3 horas de crecimiento. Cada medida es la media de tres experimentos de crecimiento con la SD indicada. in liquid LB medium in the presence of YydFis-49 (□) or after the addition (Arrow) of YydFi8-49DD (■) after 3 hours of growth. Each measurement is the mean of three growth experiments with the indicated SD.
Figura 10 - Crecimiento de B. subtilis en medio LB líquido en presencia de YydF33-49 (a), YydF33_49AA (b), YydF33_49w (c), YydF33_49II (d), Péptido-SA1 (e), Péptido-SA2 (f), Péptido-SE (g) o Péptido-SP (h) a 100 μM. En negrita, restos epimerizados. Figure 10 - Growth of B. subtilis in liquid LB medium in the presence of YydF33-49 (a), YydF33_49AA (b), YydF33_49w (c), YydF33_49II (d), Peptide-SA1 (e), Peptide-SA2 (f) , Peptide-SE (g) or Peptide-SP (h) at 100 μM. In bold, epimerized remains.
Figura 11 - Crecimiento de Enterococcus faecalis en medio BHI líquido en presencia de YydF33-49 (a), YydF33_49AA (b), YydF33_49w (c), YydF33_49ii (d), Péptido-SA1 (e), Péptido-SA2 (f), Péptido-SE (g) o Péptido-SP (h) a 100 μM. En negrita, restos epimerizados. Figure 11 - Growth of Enterococcus faecalis in liquid BHI medium in the presence of YydF33-49 (a), YydF33_49AA (b), YydF33_49w (c), YydF33_49ii (d), Peptide-SA1 (e), Peptide-SA2 (f), Peptide-SE (g) or Peptide-SP (h) at 100 μM. In bold, epimerized remains.
Figura 12 - Crecimiento de Streptococcus agalactiae en medio BHI líquido en presencia de YydF33-49 (a), YydF33_49AA (b), YydF33_49w (c), YydF33_49ii (d), Péptido-SA1 (e), Péptido-SA2 (f), Péptido-SE (g) o Péptido-SP (h) a 100 μM. En negrita, restos epimerizados. Figure 12 - Growth of Streptococcus agalactiae in liquid BHI medium in the presence of YydF33-49 (a), YydF33_49AA (b), YydF33_49w (c), YydF33_49ii (d), Peptide-SA1 (e), Peptide-SA2 (f), Peptide-SE (g) or Peptide-SP (h) at 100 μM. In bold, epimerized remains.
EJEMPLOSEXAMPLES
Ejemplo 1Example 1
Los inventores mostraron en el presente documento que la cepa de laboratorio común Bacillus subtilis es capaz de producir un nuevo tipo de péptidos bioactivos que contienen D-aminoácidos a pesar de ser de origen ribosómico. Este péptido es modificado postraduccionalmente por una nueva enzima que pertenece a la superfamilia de enzimas SAM radicales. Demostraron que esta nueva enzima utiliza un mecanismo basado en radicales sin precedentes para convertir los restos de L-isoleucina y L-valina en D-alo-isoleucina y D-valina. Establecieron que esta enzima genera un radical de 5'-desoxiadenosilo para catalizar la abstracción del átomo de H de Ca que lleva a la formación de un radical centrado en carbono. Los experimentos de mutagénesis avalan que esta enzima posee dos centros esenciales [4Fe-4S] y permiten la identificación de un donante de átomos de H crítico, necesario para la terminación del ciclo catalítico. Para finalizar, de un modo único, descubrieron que la presencia de D-aminoácidos es necesaria para la actividad de este péptido bioactivo que probablemente induzca LiaRS, un componente principal de la integridad de la pared bacteriana.The inventors herein showed that the common laboratory strain Bacillus subtilis is capable of producing a new type of bioactive peptides containing D-amino acids despite being of ribosomal origin. This peptide is post-translationally modified by a new enzyme that belongs to the radical SAM superfamily of enzymes. They showed that this new enzyme uses an unprecedented radical-based mechanism to convert L-isoleucine and L-valine residues to D-allo-isoleucine and D-valine. They established that this enzyme generates a 5'-deoxyadenosyl radical to catalyze the abstraction of the H atom from Ca leading to the formation of a carbon-centered radical. Mutagenesis experiments support that this enzyme has two essential centers [4Fe-4S] and allow the identification of a critical H atom donor, necessary for the completion of the catalytic cycle. Finally, in a unique way, they discovered that the presence of D-amino acids is necessary for the activity of this bioactive peptide that likely induces LiaRS, a major component of bacterial wall integrity.
El sistema Lia de Bacillus subtilis es un módulo de estrés de envoltura celular compuesto por un sistema de dos componentes (LiaRS) y una proteína inhibidora (LiaF). Este sistema genético está altamente conservado entre Firmicutes y parte de la red de regulación compleja que orquesta la respuesta al estrés de la pared celular. Aunque su regulación se ha descrito con gran detalle, su papel fisiológico preciso en B. subtilis no se entiende completamente. LiaRS es específicamente y fuertemente inducidos por los antibióticos dirigidos a la pared celular, tales como la nisina, vancomicina o bacitracina y, por lo tanto, se ha desarrollado como un biosensor y una pantalla de alto rendimiento para los antibióticos de la pared celular. Tras la detección con antibióticos, LiaRS transduce las señales de estrés de la envoltura celular que activa la expresión de genes, presumiblemente para mantener la integridad de la pared celular a pesar de que no confiere resistencia a los antibióticos.The Lia system from Bacillus subtilis is a cell envelope stress module composed of a two-component system (LiaRS) and an inhibitory protein (LiaF). This genetic system is highly conserved among Firmicutes and part of the complex regulatory network that orchestrates the cell wall stress response. Although its regulation has been described in great detail, its precise physiological role in B. subtilis is not fully understood. LiaRS is specifically and strongly induced by cell wall-targeting antibiotics such as nisin, vancomycin or bacitracin and has therefore been developed as a high-throughput biosensor and screen for cell wall antibiotics. Upon detection with antibiotics, LiaRS transduces cell envelope stress signals that activate gene expression, presumably to maintain cell wall integrity even though it does not confer antibiotic resistance.
En un intento de identificar los genes implicados en la regulación de LiaRS, se realizó un estudio de mutagénesis en B. subtilis y condujo al descubrimiento del operón yydFGHIJ (Butcher et al, 2007, J Bacteriol, 189, 8616). Este operón muestra la regulación positiva en LiaRS y posee todos los rasgos característicos de un sistema genético que codifica un péptido putativo (YydF) modificado por una enzima SAM radical y una proteasa (YydG e YydH respectivamente), después finalmente se exportó en el medio extracelular mediante un transportador de tipo ABC (YydlJ) a pesar de que ninguno de estos componentes se aisló o investigó (Figura 1A).In an attempt to identify the genes involved in the regulation of LiaRS, a mutagenesis study was performed in B. subtilis and led to the discovery of the yydFGHIJ operon (Butcher et al, 2007, J Bacteriol, 189 , 8616). This operon shows positive regulation in LiaRS and possesses all the characteristic features of a genetic system that encodes a putative peptide (YydF) modified by a radical SAM enzyme and a protease (YydG and YydH respectively), then finally exported into the extracellular medium. by an ABC-type transporter (YydlJ) despite the fact that none of these components were isolated or investigated (Figure 1A) .
Las enzimas SAM radical son una familia emergente de enzimas que catalizan una gran diversidad de modificaciones de proteínas y péptidos, tales como oxidación, reacción de transferencia de metilo inusual o formación de enlace tioéter. Han surgido como actores principales de la biosíntesis de los llamados RiPP (péptidos sintetizados en el ribosoma y modificados postraduccionalmente) que están implicados en las reacciones químicamente desafiantes, que ninguna otra enzima puede realizar. Para investigar el papel biológico y la función catalítica de la enzima SAM radical putativa YydG, los inventores sobreexpresan la proteína en E. coli y ensayaron su actividad contra el péptido YydF. La proteína purificada (Figura 1B) tenía las propiedades espectroscópicas distintivas de enzima SAM radical con banda de absorción de transferencia de carga en 320 y 420 nm (Figura 1C). Basado en un coeficiente de extinción molar del clúster [4Fe-4S]2+ de £410 ~15.000 M'1 cm-1, la enzima parece poseer de uno a dos centros [4Fe-4S] después de la reconstitución anaerobia (Figura 1C). Radical SAM enzymes are an emerging family of enzymes that catalyze a wide diversity of protein and peptide modifications, such as oxidation, unusual methyl transfer reaction, or thioether bond formation. They have emerged as major players in the biosynthesis of so-called RiPPs (ribosome-synthesized and post-translationally modified peptides) that are involved in chemically challenging reactions that no other enzyme can perform. To investigate the biological role and catalytic function of the putative radical SAM enzyme YydG, the inventors overexpressed the protein in E. coli and tested its activity against the YydF peptide. The purified protein (Figure 1B) had the distinctive spectroscopic properties of radical SAM enzyme with charge transfer absorption band at 320 and 420 nm (Figure 1C). Based on a molar extinction coefficient of the [4Fe-4S]2+ cluster of £ 410 ~15,000 M'1 cm-1, the enzyme appears to possess one to two [4Fe-4S] centers after anaerobic reconstitution (Figure 1C ).
La minería del genoma reveló que yydF y yydG también están presentes en varios patógenos Grampositivos, tales como Enterococcus faecalis y varios Streptococci y Staphylococci, incluyendo S. agalactiae y S. epidermidis. La alineación de secuencia de los homólogos de YydF indicó una secuencia líder putativa situada en la parte N-terminal y un motivo altamente conservado desde el resto 17 hasta el final del péptido (Figura 1D). Los inventores ensayaron la enzima reconstituida ya sea con el péptido YydF de longitud completa o una forma truncada, que abarca los restos de aminoácidos conservados desde la posición 18 a la 49, que denominamos YydF18-49. Como se muestra (Figura 1E), en condiciones anaeróbicas y condiciones reductoras, YydG produjo la 5'-desoxiadenosina prevista (5'-dA; eluyendo a 12,3 min) resultante de la escisión homolítica de S-adenosil-L-metionina (SAM) y también tres derivados peptídicos: YydFa, YydFb y YydFc eluyendo a 46, 47,6 y 48 min (Figura 1E, F, G y H). La formación de los tres péptidos era estrictamente dependiente de la presencia de ditionito de sodio como donante de un electrón y se obtuvieron productos similares utilizando YydF o YydF18-49 (Figura 1F, G y H). El análisis cinético de la reacción mostró que YydG producía un mol de 5'-dA por mol de producto modificado y catalizaba varios retornos en condiciones in vitro, aunque se produjo escisión de SAM desacoplada a medida que procedía la reacción (Figura 1G). Estos resultados demostraron que, in vitro, YydG utilizaba SAM para modificar YydF a través de un mecanismo basado en radicales. Dado que se demostró que YydF18-49 era un mejor sustrato y más fácil de caracterizar, los inventores decidieron identificar la modificación catalizada por YydG.Genome mining revealed that yydF and yydG are also present in several Gram-positive pathogens, such as Enterococcus faecalis and various Streptococci and Staphylococci, including S. agalactiae and S. epidermidis. Sequence alignment of YydF homologs indicated a putative leader sequence located in the N-terminal part and a highly conserved motif from residue 17 to the end of the peptide (Figure 1D). We tested the reconstituted enzyme with either the full-length YydF peptide or a truncated form, spanning the conserved amino acid residues from position 18 to 49, which we termed YydF18-49. As shown (Figure 1E), under anaerobic conditions and reducing conditions, YydG produced the predicted 5'-deoxyadenosine (5'-dA; eluting at 12.3 min) resulting from the homolytic cleavage of S-adenosyl-L-methionine ( SAM) and also three peptide derivatives: YydFa, YydFb and YydFc eluting at 46, 47.6 and 48 min (Figure 1E, F, G and H). The formation of the three peptides was strictly dependent on the presence of sodium dithionite as an electron donor and similar products were obtained using YydF or YydF18-49 (Figure 1F, G and H). Kinetic analysis of the reaction showed that YydG produced one mole of 5'-dA per mole of modified product and catalyzed several returns under in vitro conditions, although uncoupled SAM cleavage occurred as the reaction proceeded (Figure 1G). These results demonstrated that, in vitro, YydG utilized SAM to modify YydF through a radical-based mechanism. Since YydF18-49 was shown to be a better substrate and easier to characterize, the inventors decided to identify the modification catalyzed by YydG.
La inspección de espectrometría de masas de los tres péptidos formados no reveló ninguna diferencia de masas en comparación con el sustrato YydF18-49 [M+3H]3+= 1258,92). Esto contrastó con todas las enzimas rSAM conocidas que catalizan las modificaciones postraduccionales de péptidos o proteínas, tales como la reticulación, la oxidación o la metilación (7, 9, 14-16). El mapeo de péptidos trípticos del sustrato dio tres péptidos (Péptido 1 [M+H]+ =931,48, Péptido 2 [M+H]2+ =592,31 y Péptido 3 : [M+H]+= 768,41) eluyendo a 22, 27 y 19,2 min) como se muestra en la Figura 2A. La comparación con el péptido enzimáticamente modificado mostró la aparición de dos nuevos péptidos (es decir, el Péptido 2 * y el Péptido 3 * ) que tienen el mismo peso molecular que los Péptidos 2 y 3 pero que eluyen a 26,5 y 23,5 min, respectivamente (Figura 2B). Este resultado avaló que YydG había introducido dos modificaciones, uno situada internamente (en el Péptido 2) y uno en el extremo C-terminal del péptido (en el Péptido 3). En todos los experimentos realizados, YydFc fue el producto principal. El mapeo de péptidos trípticos reveló que esencialmente el extremo C-terminal del péptido se había modificado, ya que la relación Péptido 3 */Péptido 3 era 5 veces mayor que la relación Péptido 2 */Péptido 2 (Figura 2B), lo que indica que YydG tenía algunos sitios preferentes.Mass spectrometry inspection of the three peptides formed did not reveal any mass differences compared to the substrate YydF18-49 [M+3H]3+= 1258.92). This was in contrast to all known rSAM enzymes that catalyze posttranslational modifications of peptides or proteins, such as cross-linking, oxidation, or methylation (7, 9, 14-16). Tryptic peptide mapping of the substrate gave three peptides ( Peptide 1 [M+H]+ =931.48, Peptide 2 [M+H]2+ =592.31 and Peptide 3 : [M+H]+= 768, 41) eluting at 22, 27 and 19.2 min) as shown in Figure 2A . Comparison with the enzymatically modified peptide showed the appearance of two new peptides (i.e., Peptide 2* and Peptide 3* ) that have the same molecular weight as Peptides 2 and 3 but elute at 26.5 and 23, 5 min, respectively (Figure 2B). This result supported that YydG had introduced two modifications, one located internally (in Peptide 2 ) and one at the C-terminal end of the peptide (in Peptide 3 ). In all experiments carried out, YydFc was the main product. Tryptic peptide mapping revealed that essentially the C-terminus of the peptide had been modified, as the Peptide 3*/Peptide 3 ratio was 5-fold greater than the Peptide 2*/Peptide 2 ratio (Figure 2B) , indicating that YydG had some preferred sites.
Para identificar la naturaleza y localización de las modificaciones catalizadas por YydG, los inventores repitieron la reacción en > 90 % de tampón deuterado, ya que se sabe que las enzimas rSAM restan y a veces intercambian, átomos de H durante la catálisis. En tampón deuterado, YydG produjo un patrón de producto similar con YydFc que siempre es el producto más abundante (Figura 2C). Curiosamente, el análisis LC-MS de la reacción mostró que, en estas condiciones, YydFa y YydFc tenían un peso molecular de [M+3H]3+= 1259,24 y YydFb un peso molecular de [M+3H]3+= 1259,6. Esto correspondía a una y dos unidades Dalton más que el sustrato, YydF18-49 ([M+3H]3+= 1258,92), de forma inequívoca, lo que demuestra que un átomo de deuterio se incorporó en YydFa, YydFc y dos átomos de deuterio en YydFb, respectivamente. El mapeo de péptidos trípticos de la reacción se dejó localizar la incorporación de deuterio exclusivamente en el Péptido 2* y el Péptido 3* cuyas masas moleculares variaron de una unidad Dalton (es decir, [M+2H]2+ = 593,04 y [M+2H]+= 769,52) (Figura 2D). La fragmentación de estos dos péptidos demostró incorporación de deuterio en Val36 en el Péptido 2 * (como se muestra por los iones característicos y1, y2+1 y b7, b8+1) y en Ile44 en el Péptido 3* (como se muestra mediante la identificación de los iones ys y y6+1). En total, estos resultados demostraron que YydG cataliza la sustitución de dos átomos de H de los péptidos mediante dos átomos de H intercambiables del disolvente.To identify the nature and location of the modifications catalyzed by YydG, the inventors repeated the reaction in >90% deuterated buffer, since rSAM enzymes are known to subtract, and sometimes exchange, H atoms during catalysis. In deuterated buffer, YydG produced a similar product pattern with YydFc always being the most abundant product (Figure 2C). Interestingly, LC-MS analysis of the reaction showed that, under these conditions, YydFa and YydFc had a molecular weight of [M+3H]3+= 1259.24 and YydFb a molecular weight of [M+3H]3+= 1259.6. This corresponded to one and two Dalton units more than the substrate, YydF18-49 ([M+3H]3+= 1258.92), unequivocally, demonstrating that one deuterium atom was incorporated into YydFa, YydFc and two deuterium atoms in YydFb, respectively. Tryptic peptide mapping of the reaction allowed deuterium incorporation to be located exclusively in Peptide 2* and Peptide 3* whose molecular masses varied from one Dalton unit (i.e., [M+2H]2+ = 593.04 and [M+2H]+= 769.52) (Figure 2D). Fragmentation of these two peptides demonstrated deuterium incorporation at Val 36 in Peptide 2* (as shown by the characteristic ions y 1 , y2+1 and b7, b8+1) and at Ile 44 in Peptide 3* (as shown by identifying the ions ys and y6+1). Altogether, these results demonstrated that YydG catalyzes the substitution of two H atoms of the peptides by two exchangeable H atoms of the solvent.
Para determinar la naturaleza de la modificación, los inventores realizaron la hidrólisis ácida del péptido y analizaron su contenido de aminoácidos, después de la derivatización con W-a-(2,4-dinitro-5-fluorofenil)-L-valinamida (L-FDVA), mediante LC-MS. El péptido YydF18-49 contiene dos restos de Val y uno de Ile, pero cinco restos de Leu que no solo tienen el mismo peso molecular que Ile sino que también se eluyen en tiempos de retención similares. Las condiciones optimizadas de LC-MS/MS permitieron, como se muestra en la Figura 3A, la separación y caracterización de L-lle y L-Leu, pero también de sus homólogos con configuración D (D-allo-lle y D-Leu). El análisis de los péptidos enzimáticamente modificados mostró claramente que, además de la identificación de L-Ile y L-Leu, se formó otro producto que eluía a 27,7 minutos, correspondiente a D-allo-Ile. Asimismo, el análisis de los restos de Val (Figura 3B) mostró la presencia no solo de L-Val sino también de D-Val, eluyendo a los 26 min.To determine the nature of the modification, the inventors performed acid hydrolysis of the peptide and analyzed its amino acid content, after derivatization with Wa-(2,4-dinitro-5-fluorophenyl)-L-valinamide (L-FDVA). , by LC-MS. The YydF18-49 peptide contains two Val residues and one Ile residue, but five Leu residues that not only have the same molecular weight as Ile but also elute at similar retention times. The optimized LC-MS/MS conditions allowed, as shown in Figure 3A, the separation and characterization of L-lle and L-Leu, but also their counterparts with D configuration (D-allo-lle and D-Leu ). Analysis of the enzymatically modified peptides clearly showed that, in addition to the identification of L-Ile and L-Leu, another product was formed that eluted at 27.7 minutes, corresponding to D-allo-Ile. Likewise, the analysis of the Val residues (Figure 3B) showed the presence of not only L-Val but also D-Val, eluting at 26 min.
Por lo tanto, los inventores establecieron que YydG es una epimerasa SAM radical, la primera que se demostró que era activa in vitro en una estructura peptídica. La enzima catalizó la epimerización de hasta ~ 35 % de Ile y ~ 10 % de restos de Val. De acuerdo con esta conclusión, cuando se derivatizaron los aminoácidos epimerizados incubando YydG en tampón deuterado, sus análisis de masas revelaron un incremento de 1 Da (Figura 3C y D), consistente con los análisis realizados sobre el péptido intacto y sus derivados trípticos (Figura 2C y D). Therefore, the inventors established that YydG is a radical SAM epimerase, the first to be shown to be active in vitro on a peptide structure. The enzyme catalyzed the epimerization of up to ~35% Ile and ~10% Val residues. Consistent with this conclusion, when epimerized amino acids were derivatized by incubating YydG in deuterated buffer, their mass analyzes revealed an increase of 1 Da (Figure 3C and D) , consistent with the analyzes performed on the intact peptide and its tryptic derivatives (Figure 2C and D).
Para afirmar definitivamente su identidad como aminoácidos con configuración D, los inventores sintetizaron un péptido variante de YydF18-49 que contenía una D-Val y una D-allo-lle en las posiciones 36 y 44, respectivamente. El mapeo de péptidos trípticos y el perfil de aminoácidos de este péptido sintético reprodujeron perfectamente los del péptido enzimáticamente modificado (datos no mostrados).To definitively affirm their identity as D-configuration amino acids, the inventors synthesized a variant peptide of YydF18-49 containing a D-Val and a D-allo-lle at positions 36 and 44, respectively. The tryptic peptide mapping and amino acid profile of this synthetic peptide perfectly reproduced those of the enzymatically modified peptide (data not shown).
En base a estos análisis, los inventores pudieron asignar YydFa como un péptido que contiene un D-Val en la posición 36, YydFc como péptido que contiene una D-allo-lle en la posición 44 y YydFb como un péptido que contiene una D-Val y una D-allo-lle en posiciones en las posiciones 36 y 44, respectivamente. Por lo tanto, YydG, produjo una mezcla de péptidos que contenían aminoácidos modificados simples o dobles, siendo Ile44 el sustrato preferente (Figura 2C). Based on these analyses, the inventors were able to assign YydFa as a peptide containing a D-Val at position 36, YydFc as a peptide containing a D-allo-lle at position 44, and YydFb as a peptide containing a D-Val. Val and a D-allo-lle in positions at positions 36 and 44, respectively. YydG, therefore, produced a mixture of peptides containing single or double modified amino acids, with Ile44 being the preferred substrate (Figure 2C).
Durante la reacción de epimerización realizada en tampón deuterado, si los inventores han establecido que se incorpora un átomo de H intercambiable en disolvente en la cadena principal del péptido, el 5'-dA producido no contenía un marcado significativo como se muestra mediante análisis LC-M. Estos resultados y el análisis cinético en la Figura 1G son consistentes con YydG, produciendo un radical 5'-dA (5'-dA^) para abstraer el átomo de H de Ca de Val36 o lle44 con la formación concomitante de un mol de 5'-dA. During the epimerization reaction performed in deuterated buffer, if the inventors have established that a solvent-exchangeable H atom is incorporated into the peptide backbone, the 5'-dA produced did not contain significant labeling as shown by LC-analysis. M. These results and the kinetic analysis in Figure 1G are consistent with YydG producing a 5'-dA radical (5'-dA^) to abstract the Ca H atom from Val36 or lle44 with concomitant formation of one mole of 5 '-gives.
Las últimas preguntas que quedaban por resolver eran el origen del átomo de H intercambiable introducido durante la catálisis. De hecho, era poco probable que el radical centrado en carbono interaccione con un componente tampón, ya que tales especies altamente reactivas deben mantenerse selladas en el sitio activo de la enzima. Los inventores favorecieron un resto de aminoácido de proteína como donante de átomos de H y se requirió un desactivador de radicales para terminar la reacción. La inspección detallada de la secuencia de YydG señaló que, además de los tres restos de cisteína del motivo de SAM radical, solo estaban presentes seis cisteínas en la secuencia (Figura 4A). The last questions that remained to be resolved were the origin of the exchangeable H atom introduced during catalysis. In fact, the carbon-centered radical was unlikely to interact with a buffer component, since such highly reactive species must remain sealed in the active site of the enzyme. The inventors favored a protein amino acid residue as the donor of H atoms and a radical quencher was required to terminate the reaction. Close inspection of the YydG sequence noted that, in addition to the three cysteine residues of the radical SAM motif, only six cysteines were present in the sequence (Figure 4A).
Curiosamente, dos restos de cisteína (es decir, Cys22 y Cys223) estaban adyacentes a otro resto de cisteína, uno de los cuales estaba dentro del ciclo predicho que contenía el centro rSAM [4Fe-4S]. La organización de los otros cinco restos de cisteína en el extremo C-terminal de la proteína era una reminiscencia de los motivos implicados en la coordinación de los centros adicionales [4Fe-4S] en las enzimas rSAM. Para investigar su función, los inventores sustituyeron los restos de cianina del motivo SAM radical CxxxCxxC, Cys22, Cys222 o Cys223 por restos de alanina. Los cuatro mutantes diseñados (es decir, A3, C22A, C222A y C223A) se purificaron con éxito. aunque el mutante C222A demostró ser recalcitrante a la purificación y se producía parcialmente como una forma truncada (Figura 4B). El análisis espectroscópico mostró que, en base a su espectro de UV-visible, el mutante AxxxAxxA contenía ~ 1 centro [4Fe-4S], mientras que la cantidad de centro [4Fe-4S] era dos veces mayor en los mutantes C22A y C223A (Figura 4C). Es importante destacar que, el mutante AxxxAxxA aeróbicamente purificado ya contenía altas cantidades de centro de hierro y azufre, lo que demuestra que la presencia del centro [4Fe-4S] en este mutante era independiente de la reconstitución anaeróbica. Los espectros de UV-visible de los mutantes C22A y C223A se superponen perfectamente con la enzima de tipo salvaje (Figura 1B), lo que confirma el hecho de que YydG probablemente contenga dos centros [4Fe-4S]. El mutante C222A parecía no contener centro de hierro-azufre, incluso después de la reconstitución anaeróbica (Figura 4C). El máximo de absorción de C222A se desplazó hacia 250 nm, lo que indica que la proteína probablemente estaba mal plegada, ya que se ha informado repetidamente cuando los restos de cisteína implicados en la coordinación de [4Fe-4S] están mutados en enzimas con hierro-azufre, incluyendo las enzimas rSAM. Por lo tanto, es probable que Cys222 participe en la coordinación del segundo centro [4Fe-4S] presente en YydG.Interestingly, two cysteine residues (i.e., Cys22 and Cys223 ) were adjacent to another cysteine residue, one of which was within the predicted loop containing the rSAM [4Fe-4S] center. The organization of the other five cysteine residues at the C-terminus of the protein was reminiscent of the motifs involved in the coordination of the additional [4Fe-4S] centers in rSAM enzymes. To investigate its function, the inventors replaced the cyanine residues of the radical SAM motif CxxxCxxC, Cys22, Cys222 or Cys223 with alanine residues. The four designed mutants (i.e., A3, C 2 2A, C 2 22A, and C 2 23A ) were successfully purified. although the C 2 22A mutant proved to be recalcitrant to purification and was partially produced as a truncated form (Figure 4B) . Spectroscopic analysis showed that, based on its UV-visible spectrum, the AxxxAxxA mutant contained ~1 [4Fe-4S] center, while the amount of [4Fe-4S] center was twofold higher in the C 2 2A mutants. and C 2 23A (Figure 4C) . Importantly, the aerobically purified AxxxAxxA mutant already contained high amounts of iron-sulfur center, demonstrating that the presence of the [4Fe-4S] center in this mutant was independent of anaerobic reconstitution. The UV-visible spectra of the C 2 2A and C 2 23A mutants overlap perfectly with the wild-type enzyme ( Figure 1B) , confirming the fact that YydG likely contains two [4Fe-4S] centers. The C 2 22A mutant appeared to contain no iron-sulfur center, even after anaerobic reconstitution (Figure 4C ). The absorption maximum of C 2 22A shifted towards 250 nm, indicating that the protein was probably misfolded, as it has been repeatedly reported when cysteine residues involved in [4Fe-4S] coordination are mutated in enzymes. with iron-sulfur, including rSAM enzymes. Therefore, Cys222 is likely involved in the coordination of the second [4Fe-4S] center present in YydG.
La actividad de todos los mutantes se ensayó con el sustrato YydF18-49 (Figura4D). Como se esperaba, el mutante A3 no pudo convertir el sustrato peptídico y escindir SAM. El mutante C222A también estaba totalmente alterado por la actividad enzimática. Por el contrario, la mutación C22A no afectó a la actividad de la enzima y se produjeron los tres péptidos epimerizados (es decir, YydFa, YydFb y YydFc). La mutación C223A tampoco previno la actividad de epimerización. Sin embargo, esta variante enzimática produjo otros derivados peptídicos que eluyeron a los 10 min, 19,8 min y 26 min (Figura 4E). La espectrometría de masas de alta resolución mostró que estos péptidos tienen un desplazamiento de masa de -30,005 Da o -1,032 Da, en comparación con los productos hidrolíticos predichos. Todos ellos contenían en su extremo C o N un Val36 o Ile44 truncado, las dianas de la enzima YydG (Figura 4e ). Su estructura se determinó como: Ac-GLLDESQKLAKVNDLWYFVKSKENRWI* (SEC ID n.° 53) (péptido G18-I44*, [M+2H]2+= 1646,3834); y l*LGSGH-NH2 (SEC ID n.° 55) (péptido G18-I44*, [M+Na]+= 603,2851). El truncamiento se identificó como la pérdida del aminoácido carboxílico o grupo amino, como resultado de la rotura de los enlaces C a-N o Ca-CO, y la adición de un átomo de oxígeno en el átomo Ca del aminoácido. Estos resultados son una reminiscencia de la fragmentación del sustrato obtenida con otro miembro de la familia de enzimas rSAM, la piruvato formiato liasa activasa, cuando la reacción se expuso a oxígeno molecular. También establecieron definitivamente que YydG genera un radical centrado en carbono en el átomo Ca de Val36 e Ile44 y que Cys223 desempeña un papel crítico para la terminación de la reacción.The activity of all mutants was tested with the substrate YydF18-49 (Figure 4D). As expected, the A3 mutant was unable to convert the peptide substrate and cleave SAM. The C 2 22A mutant was also completely impaired in enzymatic activity. In contrast, the C 2 2A mutation did not affect the activity of the enzyme and all three epimerized peptides (i.e., YydFa, YydFb, and YydFc) were produced. The C 2 23A mutation also did not prevent epimerization activity. However, this enzyme variant produced other peptide derivatives that eluted at 10 min, 19.8 min, and 26 min (Figure 4E). High-resolution mass spectrometry showed that these peptides have a mass shift of -30.005 Da or -1.032 Da, compared to the predicted hydrolytic products. All of them contained at their C or N terminus a truncated Val36 or Ile44, the targets of the YydG enzyme (Figure 4 e ). Its structure was determined as: Ac-GLLDESQKLAKVNDLWYFVKSKENRWI* (SEQ ID NO: 53) (peptide G 18 -I 44 *, [M+2H]2+= 1646.3834); and l *LGSGH-NH 2 (SEQ ID NO: 55) (peptide G 18 -I 44 *, [M+Na]+= 603.2851). Truncation was identified as the loss of the carboxylic amino acid or amino group, as a result of the cleavage of the C aN or Ca-CO bonds, and the addition of an oxygen atom to the Ca atom of the amino acid. These results are reminiscent of the substrate cleavage obtained with another member of the rSAM enzyme family, pyruvate formate lyase activase, when the reaction was exposed to molecular oxygen. They also definitively established that YydG generates a carbon-centered radical at the Ca atom of Val36 and Ile44 and that Cys223 plays a critical role for the termination of the reaction.
A la luz del trabajo previo de los inventores sobre otra enzima rSAM, la liasa fotoproducto de esporas (SP liasa), los inventores interpretaron el papel de Cys223 como donante crítico de átomo de H. De hecho, mientras se investiga un mutante de la Sp liasa, han demostrado que, en ausencia de un donante de átomos de H de proteína adecuado, el sustrato intermedio del radical puede reaccionar con secuestrantes de radicales adventicios que conducen a la formación de diversos aductos. En el presente caso, el radical Ca estabilizado, en ausencia del grupo tiol de Cys223, es libre de reaccionar con el oxígeno molecular, lo que conduce a estas exclusivas roturas de la cadena principal del peptidilo.In light of the inventors' previous work on another rSAM enzyme, spore photoproduct lyase (SP lyase), the inventors interpreted the role of Cys223 as a critical H atom donor. In fact, while investigating a mutant of the S p lyase, have shown that, in the absence of a suitable protein H atom donor, the radical intermediate substrate can react with adventitious radical scavengers leading to the formation of various adducts. In the present case, the stabilized Ca radical, in the absence of the thiol group of Cys223, is free to react with molecular oxygen, leading to these unique breaks of the peptidyl main chain.
Para finalizar, dado que se demostró que el operón YydFGHIJ (Figura 1A) activa el sistema Lia en B. subtilis, los inventores ensayaron la actividad del péptido YydF18-49 antes y después de la reacción enzimática en diversas cepas bacterianas. Pusieron de manifiesto un fuerte crecimiento de inhibición de B. subtilis con el péptido epimerizado enzimáticamente o el péptido sintético que contiene D-Val36 y D-allo-Ile44. Por el contrario, el péptido YydF18-49 no modificado carecía de actividad (Figura 5A). Asimismo, en medio líquido, solo el péptido epimerizado demostró ser activo, ya que se pudo medir una inhibición fuerte y persistente (Figura 5B). Se necesitarán más estudios para descifrar las bases moleculares de esta inhibición, pero de acuerdo con el conocimiento de los inventores, es la primera vez que un péptido epimerizado de forma natural demostró ser la forma activa de un péptido bacteriano regulador o antimicrobiano.Finally, since the YydFGHIJ operon (Figure 1A) was shown to activate the Lia system in B. subtilis, the inventors tested the activity of the YydF18-49 peptide before and after the enzymatic reaction in various bacterial strains. They revealed strong growth inhibition of B. subtilis with the enzymatically epimerized peptide or the synthetic peptide containing D-Val36 and D-allo-Ile44. In contrast, the unmodified YydF18-49 peptide lacked activity (Figure 5A) . Likewise, in liquid medium, only the epimerized peptide proved to be active, since a strong and persistent inhibition could be measured (Figure 5B). More studies will be needed to decipher the molecular basis of this inhibition, but to the inventors' knowledge, this is the first time that a naturally epimerized peptide was shown to be the active form of a regulatory or antimicrobial bacterial peptide.
El presente estudio demuestra que los péptidos que contienen D-aminoácidos, llamados Epipéptidos, son mucho más comunes de lo que se esperaba en organismos vivos, incluida la bacteria común de laboratorio Bacillus subtilis, pero también muchas especies patógenas como Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecails o Staphylococcus epidermidis. Inesperadamente, los inventores demostraron en este caso que los D-aminoácidos parecen no solo proporcionar resistencia a las proteasas sino que están directamente implicados en la respuesta bacteriana. The present study demonstrates that peptides containing D-amino acids, called Epipeptides, are much more common than expected in living organisms, including the common laboratory bacterium Bacillus subtilis, but also many pathogenic species such as Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecails or Staphylococcus epidermidis. Unexpectedly, the inventors demonstrated in this case that D-amino acids appear not only to provide resistance to proteases but are directly involved in the bacterial response.
Ejemplo 2Example 2
En la bibliografía se ha propuesto que un gen, yydF codifica un péptido producido por Bacillus subtilis (SEC ID n.° 1). Sin embargo, no se ha informado de ninguna prueba de su síntesis real ni de ninguna modificación postraduccional. It has been proposed in the literature that a gene, yydF encodes a peptide produced by Bacillus subtilis (SEQ ID NO: 1). However, no evidence of its actual synthesis or any post-translational modification has been reported.
Después del crecimiento de B. subtilis en un medio sintético (solución tampón 5X (Na2HP04: 17 g; KH2P04: 7,5 g, NaCl: 1,25 g; NH4CI: 2,5 g en 500 ml); Solución de oligoelementos: MnCh: 20 mg; ZnCh: 34 mg; CuCh: 8,6 mg; CoCh: 12 mg; Na2MoO4: 12 mg; en 200 ml), los inventores purificaron con éxito un péptido, que se origina a partir de YydF y que abarca los restos 33 a 49 (Figura 7), establecido por análisis de espectrometría de masas (Tabla 1). La secuencia del péptido aislado se determinó que era (SEC ID n.° 61): After growth of B. subtilis on synthetic medium (5X buffer solution (Na 2 HP04: 17 g; KH 2 P04: 7.5 g, NaCl: 1.25 g; NH4CI: 2.5 g in 500 ml); Trace element solution: MnCh: 20 mg; ZnCh: 34 mg; CuCh: 8.6 mg; CoCh: 12 mg; Na2MoO 4 : 12 mg; in 200 ml), the inventors successfully purified a peptide, which originates from of YydF and spanning residues 33 to 49 (Figure 7), established by mass spectrometry analysis (Table 1). The sequence of the isolated peptide was determined to be (SEQ ID NO:61):
Trp Tyr Phe Val Lys Ser Lys Glu Asn Arg Trp lie Leu Gly Ser Gly HisTrp Tyr Phe Val Lys Ser Lys Glu Asn Arg Trp lie Leu Gly Ser Gly His
SEC ID n.° 61: Secuencia del péptido YydF33_49 SEQ ID NO: 61: YydF 33_49 peptide sequence
Además, los inventores determinaron que el péptido YydF33-49, producido por B. subtilis, contenía 2 restos epimerizados (es decir, D-aminoácidos) localizados en la posición 36 (Val) y 44 (Ile). Por tanto, el péptido se denominó YydF_ 33-49DD. El trabajo previo de los inventores (Ejemplo 1) estableció que los restos epimerizados son el resultado de la conversión de restos de L-aminoácido por una única enzima SAM radical, YydG, cuyo objetivo es el átomo Ca de los aminoácidos. En la actualidad, no se conoce si tales péptidos cortos, que contienen epimerización discreta, son producidos por bacterias.Furthermore, the inventors determined that the YydF33-49 peptide, produced by B. subtilis, contained 2 epimerized residues (i.e., D-amino acids) located at position 36 (Val) and 44 (Ile). Therefore, the peptide was named YydF_ 33-49DD. The inventors' previous work (Example 1) established that the epimerized residues are the result of the conversion of L-amino acid residues by a single radical SAM enzyme, YydG, which targets the Ca atom of the amino acids. At present, it is not known whether such short peptides, containing discrete epimerization, are produced by bacteria.
Debido a que se demostró que el operón YydFGHIJ inducía el sistema de dos componentes LiaRS, que, entre otros estímulos, detectaba la integridad de la pared celular bacteriana, los inventores buscaron una inhibición del crecimiento bacteriano putativa desencadenada por diversos derivados del péptido YydF. Las pruebas iniciales se realizaron con un péptido que abarcaba los restos 18-49 (YydF18-49, SEC ID n.° 20).Because the YydFGHIJ operon was shown to induce the two-component system LiaRS, which, among other stimuli, sensed the integrity of the bacterial cell wall, the inventors searched for a putative inhibition of bacterial growth triggered by various derivatives of the YydF peptide. Initial tests were performed with a peptide spanning residues 18-49 (YydF18-49, SEQ ID NO:20 ).
Como se muestra (Figura 5B), sólo en presencia del péptido YydF18-49DD que contiene dos restos epimerizados: Val36 and Ile44 (numeración de acuerdo con la SEC ID n.° 61), los inventores monitorizaron la inhibición del crecimiento bacteriano. La presencia de un resto epimerizado o la ausencia de restos epimerizados no afectó significativamente el crecimiento bacteriano. Esto demostró, por primera vez, que un péptido corto con restos epimerizados puede inhibir el crecimiento bacteriano.As shown (Figure 5B), only in the presence of the YydF18-49DD peptide containing two epimerized residues: Val36 and Ile44 (numbering according to SEQ ID NO: 61), we monitored the inhibition of bacterial growth. The presence of an epimerized residue or the absence of epimerized residues did not significantly affect bacterial growth. This demonstrated, for the first time, that a short peptide with epimerized residues can inhibit bacterial growth.
Habiendo establecido que la presencia de dos restos epimerizados clave es crucial para las propiedades inhibidoras, los inventores sintetizaron dos péptidos correspondientes a la secuencia del péptido producido por B. subtilis (SEC ID n.° 61). Estos dos péptidos contenían o bien solo restos de L-aminoácidos (YydF33-49) o los dos restos epimerizados cruciales: D-Val36 y D-Ile44 (YydF33-49DD). Se demostró que solo el péptido YydF33-49DD inhibía el crecimiento bacteriano (Figura 8a). Este nuevo péptido demostró ser 100 veces más potente que el péptido YydF18-49DD analizado anteriormente (Figura 8b y c) con una CIM ≤1 μM. Además, los inventores demostraron que estos péptidos no solo inhibían el crecimiento bacteriano, sino que también inducían la muerte celular bacteriana. De hecho, si después de un crecimiento inicial de 3 horas, se añade el péptido YydF18-49 en fase exponencial media (Figura 9), se midió una ralentización clara, seguida de una disminución de la densidad celular.Having established that the presence of two key epimerized residues is crucial for the inhibitory properties, the inventors synthesized two peptides corresponding to the sequence of the peptide produced by B. subtilis (SEQ ID NO: 61). These two peptides contained either only L-amino acid residues (YydF33-49) or the two crucial epimerized residues: D-Val36 and D-Ile44 (YydF33-49DD). Only the YydF33-49DD peptide was shown to inhibit bacterial growth (Figure 8a) . This new peptide was shown to be 100 times more potent than the previously tested YydF18-49DD peptide (Figure 8b and c) with an MIC ≤1 μM. Furthermore, the inventors demonstrated that these peptides not only inhibited bacterial growth but also induced bacterial cell death. In fact, if after an initial growth of 3 hours, the YydF18-49 peptide is added in the mid-exponential phase (Figure 9) , a clear slowdown was measured, followed by a decrease in cell density.
Curiosamente, los homólogos de los péptidos YydF se predicen en el genoma de varias bacterias Grampositivas, tales como: Salinibacillus aidingensis, Bacillus coagulans, Paenibacillus sp y varias especies patogénicas, tales como: Enterococcus faecalis, Enterococcus caccae, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus pseudintermedius, Staphylococcus equorum, Staphylococcus condimenti y Staphylococcus epidermidis (Figura 1D, Figura 6).Interestingly, homologs of YydF peptides are predicted in the genome of several Gram-positive bacteria, such as: Salinibacillus aidingensis, Bacillus coagulans, Paenibacillus sp and several pathogenic species, such as: Enterococcus faecalis, Enterococcus caccae, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus pseudintermedius, Staphylococcus equorum, Staphylococcus condimenti and Staphylococcus epidermidis (Figure 1D, Figure 6) .
Con el fin de determinar si estos péptidos son bioactivos, los inventores sintetizaron una biblioteca de péptidos basados en las secuencias identificadas en los genomas de especies de Streptococcus y Staphylococcus. Plantearon la hipótesis de que estos péptidos debían contener las mismas modificaciones postraduccionales que los identificados en B. subtilis, lo que significa un péptido procesado de 17 restos de aminoácidos con dos D-aminoácidos en las posiciones 4 y 12 (SEC ID n.os 62-65). Los restos epimerizados están en negrita.In order to determine whether these peptides are bioactive, the inventors synthesized a library of peptides based on sequences identified in the genomes of Streptococcus and Staphylococcus species. They hypothesized that these peptides should contain the same post-translational modifications as those identified in B. subtilis, meaning a processed peptide of 17 amino acid residues with two D-amino acids at positions 4 and 12 (SEQ ID NO: 62) . -65) . Epimerized remains are in bold.
Streptococcus agalactiae Péptido-SA1 WYFVRSSKNRWVAGSAH (SEC ID n.° 62) Streptococcus agalactiae Peptide-SA1 WYFVRSSKNRWVAGSAH (SEQ ID NO: 62)
Streptococcus agalactiae Péptido-SA2 WYFVRNSKNRWVAGSAH (SEC ID n.° 63) Streptococcus agalactiae Peptide-SA2 WYFVRNSKNRWVAGSAH (SEQ ID NO: 63)
Staphylococcus equorum Péptido-SE WYFVKSKQNRWWGSGH (SEC ID n.° 64) Staphylococcus equorum Peptide-SE WYFVKSKQNRWWGSGH (SEQ ID NO: 64)
Staphylococcus pseudintermedius Péptido-SP WYFVKSQSNRWIVGSGH (SEC ID n.° 65) Staphylococcus pseudintermedius Peptide-SP WYFVKSQSNRWIVGSGH (SEQ ID NO: 65)
Además, los inventores también sintetizaron tres péptidos no naturales derivados de la secuencia de YydF33_49 de B. subtilis (SEC ID n.° 61), pero para el que los dos restos epimerizados (es decir, Val36 y Ile44) estaban ambos sustituidos por restos de Val, Ile o Ala, YydF33_49VV, YydF33_49II y YydF33_49AA, respectivamente (SEC ID n.os 66-68). Los restos epimerizados están en negrita.In addition, the inventors also synthesized three unnatural peptides derived from the YydF33_49 sequence of B. subtilis (SEQ ID NO: 61), but for which the two epimerized residues (i.e., Val36 and Ile44) were both replaced by residues of Val, Ile or Ala, YydF33_49VV, YydF33_49II and YydF33_49AA, respectively (SEQ ID NOS 66-68). Epimerized remains are in bold.
YydF33_49AA YydF33_49AA WYFAKSKENRWALGSGH WYFAKSKENRWALGSGH (SECIDn.°66)(SECIDn.°66)
YydF33_49VV WYFVKSKENRWVLGSGH (SECIDn.°67)YydF33_49VV WYFVKSKENRWVLGSGH (SEQIDn°67)
YydF33_49ii WYFIKSKENRWILGSGH (SEC ID n ° 68)YydF33_49ii WYFIKSKENRWILGSGH (SEQ ID No. 68)
Estos 7 péptidos (SEC ID n.os 62-68) se ensayaron contra B. subtilis y los dos patógenos Grampositivos representativos: S. agalactiae y E. faecalis. Tal como se muestra, todos los péptidos fueron eficaces contra B. subtilis, incluyendo los péptidos con secuencias no naturales (Figura 10). El crecimiento de E. faecalis se retrasó significativamente con el Péptido-SA1 y el Péptido-SA2, y el crecimiento se inhibió totalmente con el Péptido-SE y el péptido YydF33_49AA no natural (Figura 11). S. agalactiae se inhibió mediante YydF33-49DD y los derivados YydF33-49AA e YydF33-49w pero no mediante YydF33-49II (Figura 12). Los péptidos: Péptido-SA1, Péptido-SA2, Péptido-SE y Péptido-SP fueron todos inhibidores.These 7 peptides (SEQ ID NOs 62-68) were tested against B. subtilis and the two representative Gram-positive pathogens: S. agalactiae and E. faecalis. As shown, all peptides were effective against B. subtilis, including peptides with unnatural sequences (Figure 10). The growth of E. faecalis was significantly delayed by Peptide-SA1 and Peptide-SA2, and growth was totally inhibited by Peptide-SE and the unnatural peptide YydF33_49AA (Figure 11). S. agalactiae was inhibited by YydF33-49DD and the derivatives YydF33-49AA and YydF33-49w but not by YydF33-49II (Figure 12). The peptides: Peptide-SA1, Peptide-SA2, Peptide-SE and Peptide-SP were all inhibitors.
Los inventores demostraron así que los péptidos cortos que contienen dos restos de D-aminoácidos son una nueva clase de péptidos inhibidores capaces de inhibir el crecimiento de varias bacterias Grampositivas, incluyendo patógenos relevantes. Son eficaces si se añaden al principio o después del crecimiento bacteriano a mitad de la fase exponencial. Para finalizar, algunas modificaciones pequeñas en la secuencia son capaces de ajustar las propiedades de inhibición y las características específicas a nivel de géneros y especies de estos péptidos, de modo que permiten el desarrollo de antibióticos específicos. Además, basado en el marco de 17 aminoácidos y la ubicación conservada de dos D-aminoácidos (en la posición 4 y 12) aguas abajo de los restos aromáticos (W o Y), los inventores también demostraron que es posible diseñar péptidos con secuencias no naturales que demostraron ser eficaces contra todas las bacterias grampositivas analizadas.The inventors thus demonstrated that short peptides containing two D-amino acid residues are a new class of inhibitory peptides capable of inhibiting the growth of various Gram-positive bacteria, including relevant pathogens. They are effective if added at the beginning or after bacterial growth in the middle of the exponential phase. Finally, some small modifications in the sequence are capable of adjusting the inhibition properties and specific characteristics at the genus and species level of these peptides, thus allowing the development of specific antibiotics. Furthermore, based on the 17 amino acid framework and the conserved location of two D-amino acids (at position 4 and 12) downstream of the aromatic residues (W or Y), the inventors also demonstrated that it is possible to design peptides with sequences not natural that proved to be effective against all gram-positive bacteria analyzed.
Se demostró que los péptidos bioactivos tenían una identidad de secuencia variable entre 100 y al 58,8 % en relación con la secuencia de YydF33-49 original que significa que al menos 7 restos de aminoácido podrían cambiarse sin alterar sus propiedades globales de inhibición. Por tanto, es posible diseñar estos péptidos en una forma sin precedentes con el objetivo de géneros bacterianos específicos y ajustar sus propiedades biológicas.The bioactive peptides were shown to have varying sequence identity between 100 and 58.8% relative to the original YydF33-49 sequence meaning that at least 7 amino acid residues could be changed without altering their overall inhibition properties. It is therefore possible to design these peptides in an unprecedented way to target specific bacterial genera and tune their biological properties.
N.° Porcentaje Identidad N.° de matrizNo. Percentage Identity Matrix No.
1 Péptido-SA1 100,00 94,12 64,71 70,59 58,82 58,82 64,71 70,59 2 Péptido-SA2 94,12 100,00 58,82 64,71 52,94 52,94 58,82 64,71 3 Péptido-SP 64,71 58,82 100,00 82,35 70,59 76,47 82,35 76,47 4 Péptido-SE 70,59 64,71 82,35 100,00 76,47 76,47 82,35 88,24 5 YydF33 49AA 58,82 52,94 70,59 76,47 100,00 88,24 88,24 88,24 6 YydF33 49II 58,82 52,94 76,47 76,47 88,24 100,00 94,12 88,24 7: YydF33_49DD 64,71 58,82 82,35 82,35 88,24 94,12 100,00 94,12 8: YydF33_49VV 70,59 64,71 76,47 88,24 88,24 88,24 94,12 100,00 Materiales y procedimientos 1 Peptide-SA1 100.00 94.12 64.71 70.59 58.82 58.82 64.71 70.59 2 Peptide-SA2 94.12 100.00 58.82 64.71 52.94 52.94 58.82 64.71 3 Peptide-SP 64.71 58.82 100.00 82.35 70.59 76.47 82.35 76.47 4 Peptide-SE 70.59 64.71 82.35 100.00 76.47 76.47 82.35 88.24 5 YydF33 49AA 58.82 52.94 70.59 76.47 100.00 88.24 88.24 88.24 6 YydF33 49II 58.82 52.94 76. 47 76.47 88.24 100.00 94.12 88.24 7: YydF33_49DD 64.71 58.82 82.35 82.35 88.24 94.12 100.00 94.12 8: YydF33_49VV 70.59 64 .71 76.47 88.24 88.24 88.24 94.12 100.00 Materials and procedures
Expresión de YydGYydG expression
Los genes yydG se sintetizaron (Life Technologies) y se clonaron en un plásmido pASK. El plásmido se expresó en E. coli BL21 (DE3) estrella (Life Technologies) y la expresión de proteínas se realizó en medio LB con ampicilina (100 μg.ml-1). Después de cultivar durante la noche a 21 °C, se recogieron las células y se rompieron mediante ultrasonidos en tampón A (Tris 50 mM, KCI 300 mM, glicerol al 10 % pH 7,5). La suspensión bacteriana se centrifugó a 45.000 x g durante 1,5 horas y el sobrenadante de proteína se cargó en una columna de alta capacidad Streptactin (IBA GmbH) previamente equilibrada con tampón A. La proteína YydG se eluyó con 6 ml de tampón A que contenía destiobiotina (0,6 mg/ml) concentrada adicionalmente con el concentrador Amicon (Millipore) con un valor de corte molecular de 10 kDa.The yydG genes were synthesized (Life Technologies) and cloned into a pASK plasmid. The plasmid was expressed in E. coli BL21 (DE3) star (Life Technologies) and protein expression was performed in LB medium with ampicillin (100 μg.ml-1). After growing overnight at 21°C, cells were harvested and disrupted by sonication in buffer A (50 mM Tris, 300 mM KCl, 10% glycerol pH 7.5). The bacterial suspension was centrifuged at 45,000 x g for 1.5 hours and the protein supernatant was loaded onto a Streptactin high capacity column (IBA GmbH) previously equilibrated with buffer A. The YydG protein was eluted with 6 ml of buffer A containing Desthiobiotin (0.6 mg/ml) further concentrated with the Amicon concentrator (Millipore) with a molecular cutoff value of 10 kDa.
Reconstitución de la enzimaEnzyme reconstitution
YydG se reconstituyó en condiciones anaeróbicas en una cámara anaerobia Bactron IV. La proteína se mezcló con 3 mM de DTT a 12 °C durante 15 minutos, después se añadieron Na2S y (NH4)2Fe(SÜ4)2 y la solución se incubó a 12 °C durante 4 horas. YydG was reconstituted under anaerobic conditions in a Bactron IV anaerobic chamber. The protein was mixed with 3 mM DTT at 12 °C for 15 minutes, then Na 2 S and (NH4) 2 Fe(SÜ4) 2 were added and the solution was incubated at 12 °C for 4 hours.
Ensayos enzimáticosEnzymatic assays
YydG se incubó con DTT 3 mM, SAM 1 mM y sustrato peptídico 1 mM a menos que se indicara lo contrario. Las incubaciones se realizaron a 25 °C en condiciones anaerobias estrictas y se tomaron muestras alícuotas de 10 μl con el tiempo.YydG was incubated with 3 mM DTT, 1 mM SAM, and 1 mM peptide substrate unless otherwise indicated. Incubations were performed at 25°C under strict anaerobic conditions and 10 μl aliquots were sampled over time.
Análisis por HPLCHPLC analysis
El análisis por HPLC se realizó en Agilent 1200 serie infinity equipado con una columna de fase inversa (LiChroSphere 100 RP-18e 5 μm) (Merck Millipore). Se aplicó un gradiente de disolvente A (H2O, 0,1 % de TFA) a B (80 % de CH3CN, 19,9 % de H2O, 0,1 % de TFA) de la siguiente manera: 0-1 min: 100 % de N0 % de B; 1-45 min: un gradiente lineal con 1 % de disolvente B por minuto a un caudal de 1 ml.min-1. La detección se realizó a 257 y 278 nm con un detector de matriz de diodos y por fluorescencia (excitación a 278 nm y emisión a 350 nm).HPLC analysis was performed on Agilent 1200 infinity series equipped with a reversed-phase column (LiChroSphere 100 RP-18e 5 μm) (Merck Millipore). A gradient from solvent A (H 2 O, 0.1% TFA) to B (80% CH 3 CN, 19.9% H 2 O, 0.1% TFA) was applied as follows: 0-1 min: 100% N 0% B; 1-45 min: a linear gradient with 1% solvent B per minute at a flow rate of 1 ml.min-1. Detection was performed at 257 and 278 nm with a diode array detector and by fluorescence (excitation at 278 nm and emission at 350 nm).
Análisis mediante cromatografía de líquidos-espectrometría de masas/espectrometría de masasAnalysis by liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry
Se realizaron análisis de cromatografía líquida de alta resolución-espectrometría de masas/espectrometría de masas usando un espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap Discovery (ThermoFisher) con una fuente de iones de nanoelectropulverización y un sistema Ultimate 3000 LC (Dionex). Se utilizó un espectrómetro de masas LTQ (ThermoFisher) con una fuente de iones de nanoelectropulverización para análisis de rutina. El análisis de péptidos se realizó en una nanocolumna Pepmap 100 C18 (0,075 por 15 cm, 100 A, 3 μm).High-performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry analyzes were performed using an LTQ-Orbitrap Discovery mass spectrometer (ThermoFisher) with a nanoelectrospray ion source and an Ultimate 3000 LC system (Dionex). An LTQ mass spectrometer (ThermoFisher) with a nanoelectrospray ion source was used for routine analysis. Peptide analysis was performed on a Pepmap 100 C18 nanocolumn (0.075 by 15 cm, 100 A, 3 μm).
Ensayo de inhibición en medio sólidoInhibition assay in solid medium
Un cultivo de una noche de la cepa bacteriana para hacer un ensayo se inoculó recién obtenido en un medio líquido BHI estéril. Después de 4 horas de crecimiento bacteriano a 37 °C, el medio se diluyó a 1/1000 y se inoculó en un medio de agarosa blanda precalentado a 42 °C. El medio de agarosa que contiene las bacterias se superpuso sobre una capa de agarosa BHI estéril previamente gelificada. Se colocaron 200 μg de péptido en la placa y el crecimiento bacteriano procedió a 37 °C.An overnight culture of the bacterial strain for testing was inoculated freshly into sterile BHI liquid medium. After 4 h of bacterial growth at 37°C, the medium was diluted 1/1000 and inoculated into soft agarose medium prewarmed to 42°C. The agarose medium containing the bacteria was overlaid on a layer of previously gelled sterile BHI agarose. 200 μg of peptide was placed on the plate and bacterial growth proceeded at 37 °C.
Ensayo de inhibición en medio líquidoInhibition assay in liquid medium
Un cultivo de una noche de la cepa bacteriana para hacer un ensayo se inoculó recién preparado a un medio líquido LB estéril. Después de 4 horas de crecimiento bacteriano a 37 °C, el medio se diluyó a 1/10.000 y se inoculó en medio LB o BHI líquido estéril. Se añadió la solución de péptido (1/100) a una concentración final que varía desde 0,01 a 100 μM y una DO a 600 nm se registró continuamente usando un lector de microplacas Tecan (serie Infinite® 200 PRO). Tabla 1 An overnight culture of the bacterial strain for testing was inoculated freshly into sterile LB liquid medium. After 4 hours of bacterial growth at 37°C, the medium was diluted to 1/10,000 and inoculated into sterile liquid LB or BHI medium. Peptide solution (1/100) was added to a final concentration ranging from 0.01 to 100 μM and an OD at 600 nm was recorded continuously using a Tecan microplate reader (Infinite® 200 PRO series). Table 1
Fragmentos de masa para el péptido YydF33-49 aislado de B. subtilis Mass fragments for the YydF33-49 peptide isolated from B. subtilis
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