ES2945898T3

ES2945898T3 - Método de desinfección para matrices de cromatografía por afinidad

Info

Publication number: ES2945898T3
Application number: ES16706227T
Authority: ES
Inventors: Elin Monie; Tomas Bjorkman; Anna Gronberg; Anders Ljunglof; Gustav Rodrigo; Karin Torstenson; Magnus Wetterhall
Original assignee: Cytiva Bioprocess R&D AB
Current assignee: Cytiva Bioprocess R&D AB
Priority date: 2015-03-03
Filing date: 2016-02-25
Publication date: 2023-07-10
Anticipated expiration: 2036-02-25
Also published as: CN107405541A; WO2016139128A1; JP6732292B2; CN116036327A; DK3265198T3; US20180036445A1; JP2018513840A; LT3265198T; EP3265198B1; GB201503578D0; EP3265198A1; CN115998920A; CN115998919A

Abstract

La invención divulga un método para limpiar o higienizar una matriz de cromatografía de afinidad, que comprende los pasos de: a) proporcionar una matriz de cromatografía de afinidad que tiene ligandos proteicos tolerantes a la oxidación acoplados a un soporte, b) poner en contacto la matriz con una solución de higienización que comprende al menos un oxidante definido por la fórmula I, R -O -O -H (I) en la que R es hidrógeno o un grupo acilo R'-C(O)-, siendo R' un hidrógeno o un grupo metilo, etilo o propilo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método de desinfección para matrices de cromatografía por afinidad

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere al campo de la cromatografía por afinidad, y más específicamente a un método para desinfectar matrices de cromatografía por afinidad.

Antecedentes de la invención

Las inmunoglobulinas y los fragmentos de inmunoglobulinas representan los productos biofarmacéuticos más frecuentes en la fabricación o el desarrollo a nivel mundial. La alta demanda comercial y, por lo tanto, el valor de ese mercado terapéutico en particular ha llevado a que se haga hincapié en que las compañías farmacéuticas maximicen la productividad de sus respectivos procedimientos de fabricación a la vez que controlan los costos asociados y mantienen la calidad del producto.

La cromatografía por afinidad, típicamente sobre matrices que comprenden proteína A estafilocócica o variantes de la misma, se usa normalmente como uno de los pasos clave en la purificación de moléculas de inmunoglobulina intactas. La unión altamente selectiva de la proteína A con la cadena Fc de las inmunoglobulinas proporciona un paso genérico con una eliminación muy alta de impurezas y contaminantes. Del mismo modo, las matrices que comprenden la proteína L de Peptostreptococcus o variantes de la misma son útiles para purificar, p. ej., Fabs u otros fragmentos de anticuerpos como scFv, BiTEs, anticuerpos de dominio, etc., que contienen una cadena ligera kappa.

Cualquier aplicación cromatográfica en bioprocesos requiere una atención integral para una eliminación definitiva de las impurezas y los contaminantes. Tales impurezas/contaminantes pueden ser, por ejemplo, moléculas no eluidas adsorbidas en la fase estacionaria o a una matriz en un procedimiento cromatográfico, tales como biomoléculas o microorganismos no deseados, incluidos, por ejemplo, proteínas, carbohidratos, lípidos, bacterias y virus. La eliminación de esas impurezas/contaminantes de la matriz se suele realizar tras una primera elución del producto deseado con el fin de regenerar la matriz antes de un uso posterior. Esa eliminación generalmente implica un procedimiento conocido como limpieza en el sitio (del inglés “cleaning-in-place”, CIP) y generalmente implica soluciones alcalinas.

Además, existe una necesidad de desinfectar regularmente la matriz para inactivar cualquier microorganismo o espora presente en la columna. Esto generalmente se lleva a cabo como un procedimiento de desinfección en el sitio (del inglés “sanitization-in-place”, SIP), que implica hidróxido de sodio o soluciones ácidas, p. ej., mezclas de ácido fosfórico/acético que contienen agentes bacteriostáticos como el alcohol bencílico. Sin embargo, con matrices que tienen ligandos proteicos, es difícil encontrar condiciones que destruyan eficazmente los microorganismos y las esporas sin dañar los ligandos.

El documento WO 2014/092636 A1 describe un método para limpiar columnas cromatográficas de lecho empaquetado utilizando principalmente líquidos de limpieza alcalinos. El documento EP 1224 462 B1 describe un método que comprende la regeneración de una resina. El documento US 2012/301429 A1 describe, entre otros, un método para desinfectar una columna cromatográfica por afinidad con proteína A. El documento WO 2014/180852 A1 describe un método para purificar anticuerpos. El documento US 2013/344567 A1 describe un método para inmovilizar ligandos nucleicos. ROGERS M ET AL: "Development of a rapid sanitization solution for silicabased protein A affinity adsorbents" (JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY, vol. 1216, n° 21,22 de mayo de 2009 (2009-05-22), páginas 4589 4596) describen una desinfección de medios cromatográficos con Proteína A usando alcohol bencílico acidificado.

Por lo tanto, todavía existe en este campo una necesidad de métodos de SIP eficientes que no dañen los ligandos.

Compendio de la invención

Un aspecto de la invención es proporcionar un método de desinfección y/o limpieza para medios de cromatografía por afinidad con ligandos proteicos, en donde el método no impide sustancialmente la función de los ligandos. Esto se logra con un método tal y como se define en la reivindicación 1.

Una ventaja es que se puede lograr un alto grado de inactivación de las bacterias y esporas. Otra ventaja es que se pueden eliminar impurezas relacionadas con el producto, como anticuerpos no eluidos, fuertemente unidos o impurezas relacionadas con el procedimiento, como proteínas de la célula hospedadora.

Un segundo aspecto de la invención es proporcionar el uso de una solución oxidante para desinfectar y/o limpiar medios de cromatografía por afinidad. Esto se logra con un uso tal y como se define en las reivindicaciones.

Otras realizaciones adecuadas de la invención se describen en las reivindicaciones dependientes.

Definiciones

Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se usan en este documento de manera intercambiable, y se entiende que incluyen también fragmentos de anticuerpos, proteínas de fusión que comprenden anticuerpos o fragmentos de anticuerpos y conjugados que comprenden anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.

Las expresiones "polipéptido que se une a la cadena ligera kappa" y "proteína que se une a la cadena ligera kappa" en el presente documento se refieren a un polipéptido o a una proteína respectivamente, capaz de unirse a la cadena ligera kappa de un anticuerpo e incluyen, p. ej., la Proteína L y cualquier variante, fragmento o proteína de fusión de la misma que haya conservado dicha propiedad de unión.

La expresión "proteína que contiene la cadena ligera kappa" se utiliza como un sinónimo de "proteína que contiene la cadena ligera kappa de una inmunoglobulina" y en este documento significa una proteína que comprende una cadena ligera kappa obtenida a partir de un anticuerpo e incluye cualquier anticuerpo intacto, fragmento de anticuerpo, proteína de fusión, conjugado o proteína recombinante que contiene una cadena ligera kappa.

La expresión "tolerante frente a una oxidación" en el presente documento significa un material que conserva al menos el 80%, tal como al menos el 90%, de su funcionalidad después de 24 h de incubación a 22 /- 2°C con una solución acuosa de ácido peracético 0,1 M. La funcionalidad puede ser, p. ej., la capacidad de unión de una especie diana tal como una inmunoglobulina, IgG, un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo.

La expresión "matriz de cromatografía por afinidad" en el presente documento significa una matriz de separación que tiene ligandos capaces de unirse a una especie diana con una constante de disociación en equilibrio K^dmenor de aproximadamente 10-5 M, tal como entre 10-14 y 10-6 M. K^dse define en este documento como K^d= [L]*[T]/[LT], en donde [L] es la concentración de ligando libre, [T] es la concentración de especie diana libre y [LT] es la concentración del complejo ligando-especie diana. La mayoría de esos ligandos son proteínas y pueden incluir, p. ej., proteínas que se unen a inmunoglobulinas bacterianas y sus variantes, anticuerpos, estreptavidina, lectinas, etc. La especie diana puede ser una proteína tal como una inmunoglobulina.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 muestra cromatogramas (detección mediante UV) de Proteína L recombinante antes (a) y después (b) de 1 h de incubación en ácido peracético 0,1 M. Eje x es el tiempo, eje y es la absorbancia UV (280 nm).

La Fig. 2 muestra cromatogramas (detección mediante UV) de anticuerpo de camélido monocatenario contra cadenas kappa (ligando KappaSelect) antes (a) y después (b) de 1 h de incubación en ácido peracético 0,1 M. Eje x es el tiempo, eje y es la absorbancia UV (280 nm).

La Fig. 3 muestra cromatogramas (detección mediante MS) de Proteína L recombinante antes (a) y después (b) de 1 h de incubación en ácido peracético 0,1 M. Eje x es el tiempo, eje y es la respuesta de MS.

La Fig. 4 muestra cromatogramas (detección mediante MS) de anticuerpo de camélido monocatenario contra cadenas kappa (ligando KappaSelect) antes (a) y después (b) de 1 h de incubación en ácido peracético 0,1 M. Eje x es el tiempo, eje y es la respuesta de MS.

La Fig. 5 muestra curvas de presión-flujo para una matriz base de agarosa rígida, a) matriz sin tratar y b) una muestra de la misma matriz después de incubar con solución de ácido peracético 30 mM.

Descripción detallada de las realizaciones

En un aspecto, la presente invención describe un método para limpiar o desinfectar una matriz de cromatografía por afinidad. Este método comprende las etapas de:

a) proporcionar una matriz de cromatografía por afinidad que tiene ligandos proteicos tolerantes a la oxidación que comprende Proteína A de Staphylococcus o una variante que se une a inmunoglobulina estabilizada con álcali de la Proteína A de Staphylococcus acoplada a un soporte. Esas proteínas tienen una estructura monocatenaria común caracterizada por la presencia en la molécula de tres regiones diferentes: la región N-terminal que contiene un péptido señalizador responsable de la translocación de la proteína a través de la membrana citoplasmática y de desprenderla después; comprendiendo la región funcional varios dominios que determinan la actividad funcional de la proteína; y la región C-terminal indicada como una señal organizadora responsable del anclaje de la proteína en la pared celular. Las regiones funcionales se construyen basándose en un principio único: contienen repeticiones polipeptídicas de uno o varios tipos. Las repeticiones altamente homólogas del mismo tipo se pueden organizar como tándems. El número de repeticiones puede variar y determinar la heterogeneidad de la proteína en peso molecular y actividad funcional. Las variantes recombinantes de esas proteínas que se van a usar como ligandos por afinidad, a menudo carecen de la región C-terminal, ya que no es necesaria para ese fin. También pueden tener diferentes regiones N-terminales y mutaciones puntuales seleccionadas en los dominios para, p. ej., mejorar la estabilidad alcalina de las proteínas.

b) poner en contacto la matriz con una solución desinfectante que comprende al menos un oxidante tal y como se define en la fórmula I,

R - O - O - H (I)

en donde R es hidrógeno o un grupo acilo R'-C(O)-, siendo R' un hidrógeno o un grupo metilo, etilo o propilo. Esos oxidantes incluyen peróxido de hidrógeno H²O², ácido perfórmico HCO³H, ácido peracético CH³CO³H, ácido perpropiónico CH³CH²CO³H y ácido perbutírico CH³CH²CH²CO³H. El pH de la solución desinfectante puede ser, p. ej., de 2-12, tal como 2-4 o 2-3, lo cual es beneficioso para el efecto desinfectante y la concentración de al menos un oxidante puede ser, p. ej., de 0,01-1,0 mol/l, tal como 0,02-0,2 mol/l, 0,05-0,5 mol/l o 0,03-0,1 mol/l. La solución puede contener un solo oxidante o una mezcla de oxidantes según la fórmula I, p. ej., una mezcla de peróxido de hidrógeno con ácido perfórmico o peracético. En el caso de mezclas, la concentración total de oxidantes definida por la fórmula I puede ser adecuadamente de 0,01 a 1 mol/l, tal como 0,02 a 0,2 mol/l, 0,05 a 0,5 mol/l o 0,03 a 0,1 mol/l. La solución puede comprender además un ácido carboxílico tal como ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico o ácido butírico. Si la solución comprende un perácido, el ácido carboxílico puede ser adecuadamente el ácido carboxílico correspondiente, es decir, un ácido carboxílico R'-C(O)-OH que tiene el mismo grupo acilo R'-C(O)- que el perácido R'C(O)OOH. La puesta en contacto puede implicar, o consistir esencialmente en, incubar la matriz con la solución desinfectante durante, p. ej., de 1 min-24 h, tal como 5 min-24 h o 10 min-24 h. La incubación puede tener lugar adecuadamente en una columna empaquetada con la matriz, o alternativamente en un recipiente distinto con una matriz procedente de una columna sin empaquetar, y la temperatura de incubación puede ser, p. ej., la temperatura ambiente o 15-30°C. La columna puede ser una columna de acero inoxidable reutilizable, pero también puede ser una columna de un solo uso, p. ej., una columna preparada a partir de componentes termoplásticos y elastoméricos. En el último caso, los materiales termoplásticos y elastoméricos pueden seleccionarse adecuadamente de modo que no se degraden significativamente con las soluciones oxidantes. También pueden ser posibles temperaturas fuera del intervalo de 15-30°C, particularmente si se lleva a cabo algún trabajo experimental para encontrar concentraciones y tiempos de incubación adecuados. Como primera aproximación, se puede suponer que se puede aplicar la dependencia de temperatura habitual de Arrhenius, de modo que, para un aumento de temperatura de 10°C, el tiempo de incubación se puede reducir 2-3 veces. Se puede suponer que la relación entre las concentraciones adecuadas y los tiempos de incubación a temperatura constante es aproximadamente lineal.

El o los dominios de unión a inmunoglobulina se obtienen a partir de la Proteína A de Staphylococcus. En la descripción, no incluidos en el objeto reivindicado, el o los dominios de unión a inmunoglobulina también pueden obtenerse a partir de la Proteína L de Peptostreptococcus o la Proteína G de Streptococcus, tal como a partir de la Proteína L de Peptostreptococcus. El o los dominios de unión a inmunoglobulina pueden tener, p. ej., al menos un 80%, tal como al menos un 90 o 95%, de homología con el Dominio E, D, A, B o C de la Proteína A de Staphylococcus, o con la Proteína Z (una variante del Dominio B de la Proteína A). En este contexto, el(los) dominio(s) que contiene(n) inmunoglobulina puede(n) estar definido(s) o tener al menos un 80%, tal como un 90 o 95% de homología de secuencia, con una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-6. Las SEQ ID NO 7-11 se proporcionan como referencia.

SEQ ID NO: 1 - Dominio E de la Proteína A

AQQ NAFYQVLNMP NLNADQRNGF IQSLKDDPSQ SANVLGEAQK LNDSQAPK

SEQ ID NO: 2 - Dominio D de la Proteína A

ADA QQNKFNKDQQ SAFYEILNMP NLNEEQRNGF IQSLKDDPSQ STNVLGEAKK

LNESQAPK

SEQ ID NO: 3 - Dominio A de la Proteína A

A DNNFNKEQQ NAFYEILNMP NLNEEQRNGF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK

LNESQAPK

SEQ ID NO: 4 - Dominio B de la Proteína A

ADNKFNKEQQ NAFYEILHLP NLNEEQRNGF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK

LNDAQAPK

SEQ ID NO: 5 - Dominio C de la Proteína A

ADNKFNKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNGF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK

LNDAQAPK

SEQ ID NO: 6 - Proteína Z

VDNKFNKEQQ NAFYEILHLP NLNEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK

LNDAQAPK

SEQ ID NO: 7 - Dominio 1 de la Proteína L

SEEEVTIKAN LIFANGSTQT AEFKGTFEKA TSEAYAYADT LKKDNGEYTV

DVADKGYTLNIKF AGKEKTPEE SEQ ID NO: 8 - Dominio 2 de la Proteína L

PKEEVTDCAN LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADA LKKDNGEYTV

DVADKGYTLN IKF AGKEKTPEE SEQ ID NO: 9 - Dominio 3 de la Proteína L

PKEEVTDCAN LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKENGKYTV

DVADKGYTLN IKF AGKEKTPEE SEQ ID NO: 10 - Dominio 4 de la Proteína L

PKEEVTDCAN LIYADGKTQT AEFKGTFAEA TAEAYRYADL LAKENGKYTA

DLEDGGYTIN IRFAGKKVDEKPEE SEQ ID NO: 11 - Dominio 5 de la Proteína L

EKEQVTIKENIYFEDGTVQT ATFKGTFAEA TAEAYRYADL LSKEHGKYTA

DLEDGGYTIN IRFAG

En algunas realizaciones, el o los dominios de unión a inmunoglobulina se pueden obtener a partir de variantes conocidas de los dominios naturales de SEQ ID NO: 1-6, como los dominios descritos en uno o varios de los documentos WO03080655A1, WO2008039141A1, EP1992692A1, EP2157099A1, EP2202310A2, EP2412809A1, EP2557157A1, EP2157099 y WO2013109302A2. El o los dominios de unión a inmunoglobulina pueden, p. ej., estar definidos o tener al menos un 90%, tal como al menos un 95 o un 98% de homología de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12-16.

SEQ ID NO: 12 - Variante de la Proteína Z (documento WO03080655A1)

VDNKFNKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK

LNDAQAPK SEQ ID NO: 13 - Variante de la Proteína Z (documento WO03080655A1)

VDAKFDKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK

LNDAQAPK SEQ ID NO: 14 - Variante del dominio C (documento WO2008039141A1)

ADNKFNKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK

LNDAQAPK SEQ ID NO: 15 - Variante del dominio C (documento EP2557157A1)

ADNKFNKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQELKDDPSV SKEILAEAKK

LNDAQAPK SEQ ID NO:16 - Variante del dominio C (documento WO₃013109302A2)

FNKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNGF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO: 17 - Proteína A

AQQ NAFYQVLNMP NLNADQRNGF IQSLKDDPSQ SANVLGEAQK LNDSQAPK

ADA QQNKFNKDQQ SAFYEILNMP NLNEEQRNGF IQSLKDDPSQ STNVLGEAKK

LNESQAPK A DNNFNKEQQ NAFYETLNMP NLNEEQRN GF IQSLKDDPSQ

SANLLAEAKK LNESQAPK ADNKFNKEQQ NAFYEILHLP NLNEEQRN GF

IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK ADNKFNKEQQ NAFYEILHLP

NLTEEQRNGF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO: 18 - Proteína L (documento US5965390)

A VENKEETPETPETD SEEE VTIK ANLIF AN GS TQT AEFKGTFEK AT SE A Y A YADTLKKDN

GE YTVD YADKGYTLNIKF AGKEKTPEEPKEEVTIK ANLIYADGKTQT AEFKGTFEE AT A

EAYRYADALKKDNGEYTVDVADKGYTLNIKFAGKEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKT

QTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKENGKYTVDVADKGYTLNIKFAGKEKTPEEPKEE

VTIK ANLI Y ADGKT Q T AEFKGTF AE AT AE A YRY ADLL AKEN GK YT ADLEDGGYTINIRF

AGKKVDEKPEE

SEQ ID NO:19 - Proteína G

AQHDEAVDAN SRGSVDASEL TPAVTTYKLVINGKTLKGET TTEAVDAATA

EKVFKQYAND NGVDGEWTYD DATKTFTVTE KPEVIDASEL TPAVTTYKLV

INGKTLKGET TTKAVDAETA EKAFKQYAND NGVDGVWTYD DATKTFTVTE

MVTEVPLEST A

En ciertas realizaciones del método, los ligandos comprenden o consisten esencialmente en homo o heteromultímeros de dominios de unión a inmunoglobulina obtenidos a partir de una proteína bacteriana. Esto quiere decir que los ligandos comprenden una pluralidad de dominios como se ha descrito anteriormente. Los dominios en un ligando pueden ser todos iguales (un homomultímero) o uno o varios de ellos pueden diferir de los otros (un heteromultímero). Además de los dominios, los ligandos pueden comprender estructuras enlazadoras entre los dominios, una secuencia líder o señal en el extremo N-terminal y una secuencia de cola en el extremo C-terminal.

En algunas realizaciones, los ligandos comprenden la Proteína A de Staphylococcus o una variante que se une a inmunoglobulina estabilizada con álcali de la Proteína A de Staphylococcus. Como se ha indicado anteriormente, la Proteína A comprende los cinco dominios E, D, A, B, C en ese orden. Ejemplos de matrices comercialmente disponibles que comprenden ligandos de la Proteína A de Staphylococcus incluyen MabSelect™ y MabSelect Xtra (GE Healthcare), ProSep™-A y ProSep Ultra Plus (Merck-Millipore), AbSolute™ (Novasep), CaptivA™ PriMab™ (Repligen) y Protein A Diamond (Bestchrom). Las variantes de la Proteína A estabilizadas con álcali son típicamente homo- o heteromultímeros de unidades modificadas del dominio C o la Proteína Z, tal y como se describe, p. ej., en los documentos WO03080655A1, WO2008039141A1, EP1992692A1, EP2157099A1, EP2202310A2, EP2412809A1, EP2557157A1, EP2157099 y WO2013109302A2. Ejemplos de matrices comercialmente disponibles que comprenden variantes que se unen a inmunoglobulina, estabilizadas con álcali de la Proteína A de Staphylococcus, incluyen MabSelect SuRe y MabSelect SuRe LX (GE Healthcare), Eshmuno™ A (Merck-Millipore), Toyopearl™ AF-rProtein A (Tosoh Bioscience), Amsphere™ Protein A (JSR Life Sciences Inc.) y KanCapA™ (Kaneka Corp.).

De acuerdo con la presente descripción y solo a modo de referencia, los ligandos pueden comprender Proteína L de Peptostreptococcus o una variante que se une a inmunoglobulina estabilizada con álcali de la Proteína L de Peptostreptococcus. Una matriz comercialmente disponible con ligandos de la Proteína L es Capto™ L (GE Healthcare). Las variantes estabilizadas con álcali de la Proteína L se analizan en los documentos de solicitudes en trámite junto con la presente, PCT EP2015/079387 y PCT EP2015/079389. Los ligandos también pueden comprender una secuencia de aminoácidos definida por, o que tiene al menos un 90%, tal como al menos un 95 o 98% de homología de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17-19.

En contraste con los ligandos obtenidos a partir de proteínas bacterianas descritos anteriormente, se ha encontrado que los ligandos obtenidos a partir de anticuerpos son inestables frente a las soluciones desinfectantes utilizadas en el método de la invención. Este es particularmente el caso de los ligandos obtenidos a partir de anticuerpos de camélido de cadena sencilla, como se describe, p. ej., en el documento WO0144301A1. Ejemplos de matrices con esos ligandos incluyen KappaSelect™, LambdaFabSelect™, VIIISelect™ y VIISelect™ (todos de GE Healthcare).

En algunas realizaciones, el método comprende, antes de la etapa b), una etapa a') de poner en contacto la matriz con una solución que comprende una inmunoglobulina para adsorber la inmunoglobulina y posteriormente poner en contacto la matriz con una solución de elución para desorber la inmunoglobulina. La etapa a') puede repetirse, p. ej., al menos 10 veces, tal como al menos 25 veces antes de aplicar la etapa b), pero la etapa b) también puede aplicarse después de cada caso de la etapa a'). La etapa a') puede incluir además una etapa de limpieza in situ, p. ej., usando 10-500 o 10-100 mmol/l de álcali, tal como NaOH como solución de limpieza.

En ciertas realizaciones, el contenido en bacterias viables, bacterias vegetativas y/o esporas tiene reducciones de al menos 3 log¹⁰, tal como al menos 5 log¹⁰o al menos 6 log¹⁰en la etapa b).

En algunas realizaciones, la capacidad de unión a inmunoglobulina o IgG de la matriz después de la etapa b) es de al menos el 95%, tal como al menos el 97% de la capacidad de unión a inmunoglobulina o IgG de la matriz antes de la etapa b).

El soporte (también denominado matriz base) de la matriz puede ser de cualquier tipo adecuado bien conocido, en particular un soporte que tolere la oxidación, tal como un soporte cuyo rendimiento presión-flujo no cambia en más del 20% después de 24 h de incubación a 22 /- 2°C con una solución acuosa de ácido peracético 0,03 M o 0,1 M. Una matriz de separación por afinidad convencional suele ser de naturaleza orgánica y se basa en polímeros que exponen una superficie hidrófila al medio acuoso utilizado, es decir, exponen grupos hidroxi (-OH), carboxi (-COOH), carboxamido (-CONH², posiblemente en formas N-sustituidas), amino (-NH², posiblemente en forma sustituida), oligoo polietilenoxi en sus superficies externas y, si están presentes, también en las internas. El soporte sólido puede ser convenientemente poroso. La porosidad se puede expresar como un valor de Kav o Kd (la fracción del volumen de poro disponible para una molécula sonda de un tamaño particular) medida por cromatografía inversa de exclusión por tamaño, p. ej., de acuerdo con los métodos descritos en Gel Filtration Principles and Methods, Pharmacia LκΒ Biotechnology 1991, págs. 6-13. Por definición, ambos valores de Kd y Kav siempre se encuentran dentro del intervalo 0-1. El valor de Kav puede estar ventajosamente entre 0,6 - 0,95, p. ej., 0,7 - 0,90 o 0,6 - 0,8, medido con dextrano de PM 110 kDa como molécula sonda. Una ventaja de ello es que el soporte tiene una gran fracción de poros capaces de acomodar tanto los ligandos proteicos como las inmunoglobulinas que se unen a los ligandos y proporcionar un transporte masivo de inmunoglobulinas hacia y desde los sitios de unión.

Los ligandos proteicos se pueden acoplar covalentemente con el soporte, como cuando se fijan al soporte a través de técnicas de acoplamiento convencionales que utilizan, p. ej., grupos tiol, amino y/o carboxi presentes en el ligando. Bisepóxidos, epiclorhidrina, CNBr, N-hidroxisuccinimida (NHS), etc., son reactivos de acoplamiento bien conocidos. Entre el soporte y los ligandos se puede introducir una molécula conocida como espaciador, que mejora la disponibilidad del ligando y facilita el acoplamiento químico del ligando con el soporte.

En algunas realizaciones, la matriz comprende de 5 - 20, tal como de 5 - 15 mg/ml, de 5 - 11 mg/ml o de 8 - 11 mg/ml del ligando acoplado con el soporte. La cantidad de ligando acoplado se puede controlar mediante la concentración de ligando utilizada en el proceso de acoplamiento, mediante las condiciones de acoplamiento utilizadas y/o mediante la estructura de los poros del soporte utilizado. Como regla general, la capacidad de unión absoluta de la matriz aumenta con la cantidad de ligando acoplado, al menos hasta un punto en el que los poros se restringen significativamente por el ligando acoplado. La capacidad de unión relativa por mg de ligando acoplado disminuirá con altos niveles de acoplamiento, dando como resultado la mejor relación costes-beneficios dentro de los intervalos especificados anteriormente.

En algunas realizaciones, los ligandos proteicos se acoplan con el soporte a través de una fijación multipuntos. Esto se puede hacer adecuadamente usando unas condiciones de acoplamiento tales, que una pluralidad de grupos reactivos en el ligando reaccionan con grupos reactivos en el soporte. Por lo general, la fijación multipuntos puede implicar la reacción de varios grupos reactivos intrínsecos de residuos de aminoácidos en la secuencia, como las aminas en las lisinas, con los grupos reactivos en el soporte, como los epóxidos, ésteres de cianato (por ejemplo, procedentes de la activación de CNBr), ésteres de succinimidilo (p. ej., procedentes de la activación de NHS), etc. Sin embargo, también es posible introducir deliberadamente grupos reactivos en diferentes posiciones en los ligandos para afectar las características del acoplamiento. Con el fin de proporcionar un acoplamiento multipuntos a través de las lisinas, la reacción de acoplamiento se lleva a cabo adecuadamente a un pH en el que una fracción significativa de las aminas primarias de lisina se encuentra en el estado nucleofílico no protonado, p. ej., a un pH superior a 8,0, por ejemplo, mayor de 10.

En determinadas realizaciones, los ligandos se acoplan con el soporte a través de enlaces tioéter. Los métodos para realizar ese acoplamiento son bien conocidos en ese campo y los realiza fácilmente la persona experta en ese campo utilizando técnicas y equipos convencionales. Los enlaces tioéter son flexibles y estables y generalmente adecuados para un uso en la cromatografía por afinidad. En particular, cuando el enlace tioéter es a través de un residuo de cisteína terminal o casi terminal en el ligando, se potencia la movilidad del ligando acoplado, lo que proporciona una capacidad de unión y una cinética de unión mejoradas. En algunas realizaciones, el ligando se acopla a través de una cisteína C-terminal proporcionada sobre la proteína tal y como se ha descrito anteriormente. Esto permite un acoplamiento eficiente del tiol de la cisteína con grupos electrofílicos, p. ej., grupos epóxido, grupos halohidrina, etc. sobre un soporte, dando como resultado un acoplamiento en forma de puente tioéter.

En determinadas realizaciones, el soporte comprende un polímero polihidroxilado, tal como un polisacárido. Ejemplos de polisacáridos incluyen, p. ej., dextrano, almidón, celulosa, pululano, agar, agarosa, etc. Los polisacáridos son inherentemente hidrófilos con bajos grados de interacciones no específicas, proporcionan un alto contenido en grupos hidroxilo reactivos (activables) y generalmente son estables frente a las soluciones de limpieza alcalinas utilizadas en un bioprocesamiento.

En algunas realizaciones, el soporte comprende agar o agarosa. Los soportes utilizados en la presente invención se pueden preparar fácilmente de acuerdo con métodos convencionales, tales como gelificación con suspensión inversa (S Hjerten: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964)). Alternativamente, las matrices base son productos disponibles comercialmente, tales como perlas de agarosa reticulada, vendidas bajo el nombre de SEPHAROSE™ FF (GE Healthcare). En una realización, que es especialmente ventajosa para el método de desinfección, el soporte es una agarosa reticulada rígida. Esos soportes de agarosa están altamente reticulados, p. ej., de acuerdo con los métodos descritos en los documentos US6602990, US7396467 o US8309709. Un soporte de agarosa reticulada rígida en forma de perlas esféricas y empaquetadas con una altura de lecho de 20 cm en una columna de 2,6 cm de diámetro interno proporciona una velocidad de flujo de agua v (cm/h) a una contrapresión de 3 bar, que es al menos 0,14 x d2, en donde d es el diámetro medio ponderado por volumen (d50,v) de las perlas en micrómetros. La agarosa reticulada rígida es marcadamente estable frente a los oxidantes usados en los métodos de la invención.

En ciertas realizaciones, el soporte, tal como un polisacárido o un soporte de agarosa, se reticula, por ejemplo, con reticulaciones de éter hidroxialquílico. Los reactivos reticulantes que producen esas reticulaciones pueden ser, p. ej., epihalohidrinas como epiclorhidrina, diepóxidos como butanodiol diglicidil éter, reactivos de alilación como haluros de alilo o alil glicidil éter. La reticulación es beneficiosa para la rigidez del soporte y mejora la estabilidad química. Las reticulaciones de éter hidroxialquílico son estables frente a los álcalis y no provocan una adsorción inespecífica significativa.

Alternativamente, el soporte sólido se basa en polímeros sintéticos, como poli(alcohol vinílico), poli(acrilatos de hidroxialquilo), poli(metacrilatos de hidroxialquilo), poliacrilamidas, polimetacrilamidas, etc. En el caso de polímeros hidrófobos, la superficie de la matriz se hidrofiliza frecuentemente para exponer los grupos hidrofílicos tal y como se ha descrito anteriormente, a un líquido acuoso circundante. Esos polímeros se producen fácilmente de acuerdo con métodos convencionales, véase, p. ej., "Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization" (R Arshady: Chimica e L'Industria 70(9), 70-75 (1988)). Alternativamente, se utiliza un producto disponible comercialmente, como SOURCE™ (GE Healthcare). En otra alternativa, el soporte sólido según la invención comprende un soporte de naturaleza inorgánica, p. ej., sílice, vidrio, óxido de circonio, etc.

En otra realización más, el soporte sólido tiene otra forma, como una superficie, un chip, capilares o un filtro (por ejemplo, una membrana o una matriz de filtro de profundidad).

En cuanto a la forma de la matriz según la invención, en una realización la matriz tiene forma de membrana porosa. En una realización alternativa, la matriz tiene forma de perlas o partículas que pueden ser adecuadamente porosas. Las matrices en forma de perlas o de partículas se pueden usar como un lecho empaquetado o en forma suspendida. Las formas suspendidas incluyen las conocidas como lechos expandidos y suspensiones puras, en las que las partículas o perlas pueden moverse libremente.

La presente descripción también proporciona el uso de una solución que comprende un oxidante definido por la fórmula I,

R - O - O - H (I)

en donde R es hidrógeno o un grupo acilo R'-C(O)-, siendo R' un hidrógeno o un grupo metilo, etilo o propilo, para la desinfección de una matriz de cromatografía por afinidad que tiene ligandos proteicos acoplados con un soporte. Los ligandos proteicos comprenden o consisten esencialmente en uno o más dominios de unión a inmunoglobulina, obtenidos a partir de una proteína bacteriana como se ha descrito anteriormente. El uso puede comprender los métodos de cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente.

Además, la presente descripción proporciona un método para la desinfección de una matriz de cromatografía, que comprende las etapas de:

a) proporcionar una matriz de cromatografía que tiene ligandos tolerantes a la oxidación, acoplados a un soporte de agarosa reticulada rígida,

b) poner en contacto la matriz con una solución desinfectante que comprende un oxidante definido por la fórmula I,

R - O - O - H (I)

en donde R es hidrógeno o un grupo acilo R'-C(O)-, siendo R' un hidrógeno o un grupo metilo, etilo o propilo. Los ligandos pueden ser los ligandos proteicos tolerantes a la oxidación como se ha descrito anteriormente, pero también pueden ser, p. ej., ligandos de intercambio catiónico (por ejemplo, ligandos que comprenden grupos sulfopropilo, sulfoetilo o carboximetilo), ligandos de intercambio aniónico (por ejemplo, que comprenden grupos trimetilamonio o dietilaminoetilo), ligandos hidrófobos (por ejemplo, que comprenden grupos butilo, hexilo, octilo o fenilo) o grupos multimodales (por ejemplo, que comprenden grupos de intercambio catiónico o aniónico en combinación con grupos hidrofóbicos). Los ligandos pueden distribuirse homogéneamente sobre la matriz o pueden ubicarse exclusiva o principalmente en una región de la matriz, p. ej., los núcleos o envueltas de matrices en forma de perlas.

Tal y como se ha descrito anteriormente, la concentración de dicho oxidante en dicha solución de desinfección puede ser, p. ej., 0,01 - 1 mol/l y el pH puede ser, p. ej., 2-12, tal como 2-4 o 2-3. La matriz puede incubarse en la etapa b) con la solución de desinfección durante 1 min - 24 h, tal como 5 min - 24 h o 15 min - 3 h, y la matriz puede estar, p. ej., en forma de perlas esféricas que tienen un diámetro medio (d50,v) de 10-200 micrómetros, tal como 30-100 micrómetros.

Ejemplos (todos realizados a temperatura ambiente = 22 /- 2°C)

Ejemplo 1 (Estudio de desinfección con Capto L) (referencia)

La finalidad de esta investigación era evaluar el efecto bactericida y esporicida de ocho desinfectantes sobre esporas bacterianas y bacterias, así como PBS como referencia, añadidos a una suspensión al 50% de Capto L. El efecto se sometió a ensayo con tiempos de contacto de 0 y 15 minutos, así como de 1,4 y 24 horas.

La prueba se realizó en suspensiones al 50% de Capto L y desinfectantes. Los microorganismos se añadieron con una concentración de aproximadamente 107 ufc/ml a la suspensión y se evaluó el efecto reductor después de determinados intervalos de tiempo mediante la neutralización del desinfectante. La eficacia del neutralizador y su capacidad para recuperar los microorganismos inoculados se demostró mediante la validación del método en paralelo con la prueba de provocación. Los resultados se evaluaron con respecto a reducciones logarítmicas de 10 de los microorganismos Bacillus subtilis (esporas) y Pseudomonas aeruginosa (bacterias vegetativas).

Se añadieron 107 ufc/mL del microorganismo a 10 mL de suspensión al 50% de Capto L con desinfectante. Las muestras se mezclaron y se añadieron muestras duplicadas de 0,1 mL a 50 mL de agente neutralizante (tampón fosfato 0,075 M con lecitina al 0,3%, Tween 80 al 3,0%, tiosulfato de sodio al 0,5% y L-histidina al 0,1%). La solución total se analizó filtrando fracciones correspondientes a diluciones en serie de 10 veces. Los filtros se lavaron tres veces con 100 mL de NaCl al 0,9%. Como control positivo, se añadieron a cada microorganismo 50 mL de agente neutralizante, la misma cantidad añadida para las pruebas de provocación con desinfectante. La solución total se analizó filtrando fracciones correspondientes a diluciones en serie de 10 veces. Los filtros se lavaron tres veces con 100 mL de NaCl al 0,9%. Los filtros se incubaron en TSA (agar de soja y tripticasa, del inglés Trypticase Soy Agar) a 30-35°C durante 2-5 días. La lectura preliminar se realizó después de 1-3 días. La reducción de microorganismos se calculó como el log¹⁰de los microorganismos supervivientes en comparación con la del control positivo. Los resultados muestran que, entre los desinfectantes sometidos a ensayo, solo el ácido peracético 0,1 M y el ácido fórmico al 0,6% con peróxido de hidrógeno al 3% son capaces de destruir eficazmente las esporas de B. subtilis.

Tabla 1. Resultados (reducciones de log¹ü) del recuento viable de Bacillus subtilis cuando se añade a una suspensión al 50% de Capto L que contiene varios desinfectantes, después de tiempos de contacto de 0 y 15 minutos, así como 1,4 y 24 horas. Los resultados son valores medios de muestras duplicadas procedentes de las suspensiones.

Tabla 2. Resultados (reducciones de log^) del recuento viable de Pseudomonas aeruginosa cuando se añade a una suspensión al 50% de Capto L que contiene varios desinfectantes después de tiempos de contacto de 0 y 15 minutos, así como 1,4 y 24 horas. Los resultados son valores medios de muestras duplicadas procedentes de las suspensiones.

Ejemplo 2 (Incubación de ligandos, prueba de Biacore)

El objetivo de esta actividad era estudiar la cinética de unión de diferentes ligandos de medios cromatográficos como una medida de la capacidad de unión retenida antes y después de la desinfección con ácido peracético (PAA) 0,1 M. La cinética se midió mediante resonancia de plasmón superficial en un instrumento Biacore™. Los ligandos sometidos a ensayo eran monómeros (Z1) y tetrámeros (Z4) de SEQ ID NO: 13, Proteína A recombinante (rPrA), Proteína L recombinante (rPrL) y anticuerpos monocatenarios de camélido contra cadenas kappa de IgG (ligando KappaSelect). Z1, Z4 y rPrA se analizaron con un anticuerpo monoclonal inmovilizado sobre un chip Biacore, mientras que rPrL y el ligando KappaSelect se analizaron con un fragmento de anticuerpo Fab inmovilizado.

1. Se redujo 1 ml de 10 mg/ml de Z1, Z4 y rPrA, se alquiló y se cambió el tampón por NaCl 10 mM y se analizó en un espectrómetro de masas (MS) para verificar la reducción y la alquilación.

2. Se diluyó 1 ml de rPrL y ligando KappaSelect hasta 10 mg/ml.

3. Se extrajo la muestra de referencia (0 h), 100 gl y se cambió el tampón por bicarbonato de amonio 50 mM.

4. Se añadió PAA 1 M al 10% y se iniciaron las incubaciones.

5. Se tomaron muestras después de 1, 2, 4, 8, 16 y 24 h, 100 gl y se cambió el tampón por bicarbonato de amonio 50 mM para detener la reacción de oxidación.

6. Las concentraciones se midieron en todas las muestras midiendo la absorbancia UV a 276 nm.

7. A continuación, las muestras se analizaron en LC-MS y Biacore.

El ligando Z1 incubado durante 0 a 16 h en PAA 0,1 M tiene una afinidad similar antes y después de la SIP. El ligando después de 24 h de incubación no cambia en la tasa de disociación, pero cambia en la tasa de asociación, lo que también proporciona un cambio en la afinidad.

El ligando Z4 incubado durante 0 a 24 h en PAA 0,1 M tiene una afinidad similar antes y después de la SIP. El ligando rPrA incubado durante 0 a 24 h en PAA 0,1 M tiene cierta pérdida de afinidad con el incremento del tratamiento SIP. El ligando cambia tanto en la tasa de disociación como en la tasa de asociación y proporciona un cambio en la afinidad. El ligando rPrL incubado durante 0 a 24 h en PAA 0,1 M tiene una afinidad similar antes y después de la SIP. Los cromatogramas de LC antes y después de la SIP (Fig. 1 a y b) no muestran señales de degradación.

El ligando KappaSelect ya estaba tan degradado después de 1 h en PAA 0,1 M que con él no era posible realizar ningún estudio de cinética. Los cromatogramas de LC antes y después de la SIP (Fig. 2 a y b) también muestran una degradación esencialmente completa.

Ejemplo 3 (Incubación de la matriz)

El objetivo de estos experimentos era someter a ensayo la compatibilidad de una desinfección en el sitio (SIP) de diferentes medios de cromatografía por afinidad. Esto se hizo calculando la capacidad de unión dinámica (DBC) de avance del 10% después de una SIP con ácido peracético 0,1 M, sobre seis medios de cromatografía diferentes empaquetados en una columna PreDictor RoboColumn de 600 gl mediante el uso de un robot TECAN. La DBC inicial se midió en seis columnas de referencia correspondientes que no se habían sometido a SIP. Los medios eran: Capto L (Proteína L recombinante), KappaSelect (anticuerpos de camélido monocatenarios contra cadenas kappa de IgG), MabSelect (Proteína A recombinante), MabSelect SuRe (multímero de la variante de Proteína Z con asparaginas sustituidas), MabSelect SuRe LX (multímero de la variante de Proteína Z con asparaginas sustituidas) y MabSelect Xtra (Proteína A recombinante). El soporte en todos esos medios es agarosa reticulada rígida.

Métodos

1. Lavado/eliminación de la solución de almacenamiento: 10 volúmenes de columna (CV) (6 x 1000 gl) de fosfato 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,4

2. Adición de 20 CV (12x 1000 gl) de solución SIP (ácido peracético 0,1 M)

3. Sellado de la parte inferior y superior de las minicolumnas con tapones de columna, papel Parafilm y lámina de aluminio.

4. Incubación en solución SIP durante 24 horas a temperatura ambiente

5. Después de 24 h de incubación SIP, lavar: 10 CV (6 x 1000 gl) de fosfato 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,4 6. Carga de la muestra: 12*600 gl de Fab/Mab a diferentes concentraciones, tiempo de residencia 6 min 7. Recogida de la muestra no unida en placas para lectura con UV y medición de la absorbancia UV a 280 (y 300 nm)

Para la DBC de las columnas no sometidas a SIP se realizaron los puntos 1,6 y 7.

Tabla 3. Capacidades de unión dinámica antes y después de la SIP (24 h de incubación en ácido peracético 0,1 M)

Ejemplo 4 (Incubación de la matriz con de Capto L) (referencia)

Se sometió a ensayo una placa de filtración de 96 pocillos PreDictor™ (GE Healthcare) con 6 microlitros de Capto L en cada pocillo con el siguiente procedimiento:

Eliminación de la solución de almacenamiento PreDictor (etanol al 20%)

Lavado: 3x 200 μl de fosfato 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,4

Lavado 3x200 μl de MilliQ

Adición de 600 μl de soluciones SIP y fosfato 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,4 (control) (48 soluciones y duplicados en placa)

Sellado de la parte inferior y superior de las placas con Parafilm

Incubación en soluciones SIP durante 4 o 24 horas con agitación a 450 rpm

Eliminación de los líquidos mediante centrifugación (500 x g, 1 min).

La capacidad de unión estática (SBC) de un Fab se determinó mediante:

1. Eliminación de soluciones SIP

2. Lavado: 1x600 μl de MilliQ, 1x600 μl de PBS

3. Equilibrado: 3x200 μl de fosfato 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,4

4. Carga de la muestra: 200 μl de Fab con una concentración de 2,5 mg/mL, incubación 10 min y 90 min a 1100 rpm 5. Recogida de la muestra no unida en placas para lectura con UV y medición de la absorbancia UV a 280 (y 254 nm)

Los líquidos se eliminaron mediante centrifugación (500 x g, 1 min).

La absorbancia de UV del tampón PBS a 280 nm (control de trayecto activado, “path check on”) se restó de la absorbancia de UV de la fracción de flujo continuo (A280-blanco280)

La concentración en la fracción de flujo continuo se calculó usando una curva estándar (A280-blanco280)/1,2796

Vmuestra= 200 μl

Vmedio= 6 μl

Vr = 6 0,6* Vmedio = 9,6

Vr: el volumen retenido, es decir, el volumen del filtro (6 μl) y el volumen de líquido en la resina (0,6*6) Tabla 4 Capacidades estáticas restantes de Capto L para un Fab después de 4 o 24 h de incubación en soluciones SIP, en comparación con el control, fosfato 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,4 (PBS). Los valores de SBC se determinaron tanto para 10 como para 90 minutos de incubación con la muestra de Fab.

Ejemplo 5 (Incubación de la matriz con análisis MS)

Se lavaron con agua 200 mg de matriz húmeda y se incubaron 24 h con ácido peracético 0,1 M. La matriz se eliminó por filtración y la solución de incubación se analizó en un sistema Waters AQUITY H-Class Waters Xevo Q-TOFMS LC-MS con una columna C¹⁸de RPLC. La presencia de fragmentos de proteína en la solución de incubación se tomó como una indicación de la degradación del ligando a través del ácido peracético.

Se sometieron a ensayo siete matrices (todas de GE Healthcare), con diferentes ligandos de afinidad proteicos:

Kappa Select (anticuerpos monocatenarios de camélido contra cadenas kappa de IgG)

LambdaFab Select (anticuerpos monocatenarios de camélidos contra cadenas IgG lambda)

Factor VII Select (anticuerpos monocatenarios de camélido contra el Factor VII)

Factor VIII Select (anticuerpos monocatenarios de camélido contra el Factor VIII)

Capto L (Proteína L recombinante)

MabSelect Xtra recombinante (Proteína A)

MabSelect SuRe (multímero de la variante de la Proteína Z con asparaginas sustituidas)

Tabla 5 Resultados de análisis LC-MS de soluciones de incubación de ácido peracético 0,1 M.

Ejemplo 6 (Estabilidad de la matriz base)

Con el fin de observar si el tratamiento con oxidante tenía propiedades negativas sobre la matriz base de agarosa, se realizó una prueba de presión-flujo de una matriz base de agarosa rígida sobre una muestra de matriz sin tratar y una muestra que se había incubado con oxidante.

Matriz base

La matriz base utilizada eran perlas de agarosa reticulada rígida con 88 micrómetros (volumen ponderado, d50V) de diámetro medio, preparadas de acuerdo con los métodos del documento US6602990 y con un tamaño de poro correspondiente a un valor K^dde una cromatografía de filtración inversa en gel de 0,70 para dextrano de PM 110 kDa, según los métodos descritos en Gel Filtration Principles and Methods, Pharmacia LκΒ Biotechnology 1991, págs. 6-13.

Incubación

La matriz base se incubó en ácido peracético acuoso 30 mM durante 24 horas a temperatura ambiente y luego se lavó con agua destilada.

Empaquetamiento de la columna

Se suspendieron con agua destilada 300 ml de gel sedimentado para proporcionar un volumen de suspensión de 620 ml y se empaquetaron en una columna 35/600 de FineLINE™ (GE Healthcare, Suecia) con un diámetro interior de 35 mm. La presión del empaquetamiento era de 0,10 /- 0,02 bar y la altura del lecho era de 300 /- 10 mm.

Prueba de flujo-presión

Se bombeó agua destilada a través de la columna aumentando gradualmente las contrapresiones hasta 7,5 bar. Después de cada etapa de aumento de presión, la tasa de bombeo se mantuvo constante durante 5 min y se midieron la tasa de flujo volumétrico y la contrapresión. Las velocidades de flujo lineal (calculadas como la tasa de flujo volumétrico dividida por el área de la sección transversal interna de la columna) se trazaron frente a la contrapresión y se calculó una velocidad de flujo máximo a partir de la curva, mientras que la presión máxima se tomó como la contrapresión con la máxima velocidad de flujo.

Resultados

La Fig. 5 muestra las curvas de la velocidad de flujo frente a la contrapresión para a) una matriz no incubada y b) una matriz después de la incubación. La velocidad máxima de flujo era de 1,30 x 103 cm/h antes de la incubación y 1,18 x 103 cm/h después de la incubación, mientras que las presiones máximas correspondientes eran 5,31 y 5,44 bar antes y después de la incubación. Las diferencias están dentro de los límites de un error experimental del método, lo que indicaba que la incubación con ácido peracético no afectaba a las propiedades de flujo-presión de la matriz. Esto se corroboró adicionalmente midiendo el diámetro medio de las perlas en un contador Coulter, mostrando que el diámetro medio de d50V era de 88,3 micrómetros antes y de 88,5 micrómetros después de la incubación (sin diferencia estadísticamente significativa). Además, el tamaño de poro de las perlas no se veía afectado, como se muestra con los valores de K^dpara dextrano de PM 110 kDa, de 0,696 antes de la incubación y 0,692 después.

Ejemplo 7 (Limpieza, MabSelect SuRe)

Se contaminaron partes alícuotas de la matriz MabSelect SuRe proporcionando anticuerpo monoclonal (mAb) y luego se incubaron con diferentes soluciones de limpieza. Después de la limpieza, la matriz se hirvió en tampón SDS-DTT para liberar las proteínas y el material sobrenadante se hizo pasar a través de un gel de electroforesis en un sistema Amersham WB (GE Healthcare, Suecia) para determinar la cantidad de proteínas contaminantes residuales.

Contaminación

Una placa de filtración de 96 pocillos con 20 microlitros de MabSelect SuRe en cada pocillo (PreDictor MabSelect Sure, GE Healthcare, Suecia) se equilibró con 3 x 200 microlitros de tampón PBS por pocillo y luego se cargó con 200 microlitros de alimentación de mAb (material sobrenadante de células CHO con 4 g/l de mAb) por pocillo y se incubó durante 30 min. Después de lavar con 200 microlitros de PBS, los pocillos se eluyeron con 2 x 200 microlitros de tampón acetato 50 mM pH 3,5. El ciclo de elución de equilibrio-carga-lavado se repitió durante un total de cinco ciclos y luego se equilibraron los pocillos y se añadió agua destilada.

El líquido se eliminó mediante filtración al vacío o centrifugación después de cada etapa (carga de la muestra, lavado, elución, limpieza)

Limpieza

Los pocillos se lavaron con 3*200 microlitros de agua destilada y luego se incubaron con 300 microlitros de solución CIP 1 durante 15 min. Después de retirar la solución CIP 1, se lavaron con 2*300 microlitros de PBS y 2*300 microlitros de agua. Luego se incubaron con 300 microlitros de solución CIP 2 durante 15 min y se lavaron como se ha indicado anteriormente. Las soluciones CIP 1 y CIP 2 se indican en la Tabla 6.

Tabla 6. Soluciones CIP y cantidades de proteínas contaminantes residuales sobre MabSelect SuRe

Análisis

La matriz de los pocilios se marcó previamente con colorante fluorescente Cy5 usando el kit para marcar con Cy5 de Amersham WB, añadiendo 50 microlitros de tampón de marcado 5 microlitros de Cy5 e incubando durante 30 minutos. A continuación, se añadieron 50 microlitros de tampón SDS-DTT y se hirvieron durante 5 min con la matriz. Los materiales sobrenadantes se cargaron sobre un Gel Card de Amersham WB y se dejaron correr junto con referencias de ligando MabSelect SuRe y mAb premarcados más un conjunto de patrones del peso molecular. El Gel Card se escaneó y las señales detectadas se integraron para proporcionar cantidades correspondientes a la cantidad de contaminante residual recuperado desde la matriz.

Los resultados muestran que el ácido peracético 30 mM es casi tan efectivo como el NaOH 100 mM, aunque el ácido peracético 100 mM es más efectivo. Se obtuvieron resultados particularmente buenos con una combinación en serie de oxidante y álcali.

Ejemplo 8 (Limpieza, Capto L) (referencia)

Este se llevó a cabo como en el Ejemplo 7, excepto que se usó una placa de PreDictor Capto L de 20 microlitros, con una matriz de Capto L con funcionalidad de Proteína L en los pocillos y que el contaminante era un suministro de anticuerpo de dominio (dAb), que consistía en el material sobrenadante procedente de un cultivo de E. coli tratado térmicamente, con expresión periplásmica del dAb.

Tabla 6. Soluciones CIP y cantidades de proteínas contaminantes residuales sobre Capto L

También en este caso, el ácido peracético tiene un efecto limpiador considerable y el efecto se mejora aún más mediante la combinación en serie con álcali 15 mM.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para limpiar o desinfectar una matriz de cromatografía por afinidad, que comprende las etapas de: a) proporcionar una matriz de cromatografía por afinidad que tiene ligandos proteicos tolerantes a la oxidación que comprenden la Proteína A de Staphylococcus o una variante que se une a inmunoglobulina estabilizada con álcali de la Proteína A de Staphylococcus, acoplada a un soporte,

b) poner en contacto dicha matriz con una solución desinfectante que comprende al menos un oxidante definido por la fórmula I,

R - O - O - H (I)

en donde R es hidrógeno o un grupo acilo R'-C(O)-, siendo R' un hidrógeno o un grupo metilo, etilo o propilo.

2. El método según la reivindicación 1, en el que dichos ligandos proteicos comprenden o consisten esencialmente en uno o varios dominios de unión a inmunoglobulina obtenidos a partir de una proteína bacteriana.

3. El método según la reivindicación 1 o 2, en el que la concentración de dicho oxidante en dicha solución desinfectante es de 0,01 - 1 mol/l.

4. El método según cualquier reivindicación precedente, en el que el pH de dicha solución desinfectante es de 2-4 o 2-3.

5. El método según cualquier reivindicación precedente, en el que:

i) dicho oxidante se selecciona a partir del grupo que consiste en peróxido de hidrógeno, ácido perfórmico y ácido peracético;

ii) dicha solución desinfectante comprende una mezcla de al menos dos oxidantes definidos por la fórmula I, tal como una mezcla de peróxido de hidrógeno con ácido perfórmico o peracético;

iii) la concentración total de oxidantes definida por la fórmula I es de 0,01 - 1 mol/l; y/o

iv) en la etapa b) se incuba la matriz con dicha solución desinfectante durante 1 min - 24 h, tal como 5 min -24 h o 15 min - 3 h.

6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en el que dichos dominios de unión a inmunoglobulina;

i) tienen al menos un 80%, tal como al menos un 90 o 95%, de homología con el dominio E, D, A, B o C de la Proteína A de Staphylococcus, con la Proteína Z

y/o

ii) están definidos por, o tienen al menos un 90%, tal como al menos un 95 o un 98% de homología de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12-16.

7. El método según cualquier reivindicación precedente, en el que dicho soporte:

i) comprende partículas porosas o una membrana porosa;

ii) se selecciona a partir del grupo que consiste en sílice, vidrio y polímeros hidroxifuncionales;

iii) es un polisacárido reticulado; y/o

iv) es agarosa reticulada, tal como agarosa reticulada rígida.

8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 2-7, que comprende, antes de la etapa b), una etapa a') de poner en contacto dicha matriz con una solución que comprende una inmunoglobulina para adsorber dicha inmunoglobulina y posteriormente poner en contacto dicha matriz con una solución de elución para desorber dicha inmunoglobulina, en donde opcionalmente la etapa a') se repite al menos 10 veces, tal como al menos 25 veces antes de la etapa b).

9. El método según cualquier reivindicación precedente, en el que dicha matriz se empaqueta en una columna de cromatografía y en donde, opcionalmente, dicha columna de cromatografía es una columna de un solo uso o una columna fabricada a partir de componentes termoplásticos y elastoméricos.