ES2943932T3

ES2943932T3 - Métodos y composiciones para las células asesinas naturales

Info

Publication number: ES2943932T3
Application number: ES19175670T
Authority: ES
Inventors: Alicja Copik; Vijay Reddy; Jeremiah Oyer
Original assignee: University of Central Florida Research Foundation Inc UCFRF
Current assignee: University of Central Florida Research Foundation Inc UCFRF
Priority date: 2012-06-28
Filing date: 2013-06-28
Publication date: 2023-06-16
Anticipated expiration: 2033-06-28
Also published as: US9623082B2; HRP20230424T1; PL3578201T3; PT3578201T; EP3578201B1; US11617781B2; US10874715B2; DK3578201T3; US10463715B2; US20190117736A1; AU2013282353B2; SI3578201T1; EP2866834A4; AU2019200525A1; AU2019200525B2; FI3578201T3; CA2877968A1; EP2866834B1; RS64172B1; LT3578201T

Abstract

La solicitud proporciona nuevas composiciones y métodos para estimular la producción de células asesinas naturales (NK) en un sujeto. Las células NK se pueden expandir selectivamente con una combinación de ligandos estimulantes. También se describen métodos y composiciones para la administración de ligandos estimulantes modificados para autoinsertar en células tumorales, estimulando así un aumento en el número de células NK en la proximidad de un tumor. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para las células asesinas naturales

Campo de la invención

La presente solicitud generalmente se refiere a composiciones y métodos que comprenden células asesinas naturales (NK). Más concretamente, la solicitud se refiere a la estimulación y expansión de las células asesinas naturales endógenas (NK), in vivo o in vitro que son capaces de atacar y matar las células inmunitarias y las células cancerosas.

Antecedentes

El trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) de hermanos genotípicamente compatibles con HLA ha mejorado la supervivencia a largo plazo en pacientes con neoplasias malignas de cáncer hematológico y síndromes de insuficiencia medular. Cada año, más de 10,000 estadounidenses contraen enfermedades potencialmente mortales para las cuales la única esperanza de cura es un trasplante de médula ósea de un donante no emparentado o una unidad de sangre del cordón umbilical. Sin embargo, más del 70 % de los pacientes que podrían beneficiarse de un trasplante de células madre alogénicas no tienen un hermano donante compatible (Henslee-Downey, et al. 1997). Estas circunstancias retrasan el tratamiento, lo que hace necesario recurrir a un uso menos óptimo de un donante parcialmente incompatible, lo que eventualmente conduce a una mayor incidencia de enfermedad de injerto contra huésped (GVHD), falla del injerto y recaída, todo lo cual reduce drásticamente la supervivencia el paciente (Drobyski, et al. 2002), (Baker, et al. 2009).

Se plantean limitaciones adicionales por la duración y las costosas cargas financieras, mentales y de salud del proceso de trasplante. Por la tanto, la aplicación de HSCT de un donante no emparentado se limita a pacientes más jóvenes, sanos y con un soporte socioeconómico adecuado que puedan soportar el proceso.

Se plantean desafíos adicionales por la alta tasa de recaída debido a la incapacidad para erradicar las células cancerosas residuales. Aunque se considera que el HSCT es curativo, las tasas de recaída del cáncer son asombrosas. Por lo tanto, se necesitan inmunoterapias novedosas más dirigidas que serían más efectivas, preferiblemente sin la necesidad de un donante compatible. La infusión de linfocitos de donantes (DLI), para el tratamiento de la recaída de la leucemia mieloide aguda (AML) después del HSCT se introdujo en la década de 1990. Este enfoque consistió en la administración de linfocitos del donante original al paciente con AML con enfermedad recidivante. Sin embargo, los beneficios clínicos fueron limitados y se observaron solo en una minoría de pacientes con cargas tumorales más pequeñas, y la GVHD mediada por células T a menudo empeoró aún más los resultados. Christian D. A. & Hunter C.A. (Immunotherapy, 2012, 4, 4, 425-441) revisan el uso de citoquinas encapsuladas en partículas en inmunoterapia. Anderson P.M. et al. (Cytokine, 1994, 6, 1, 92-101) divulgan un método simple, de aplicación general, para incorporar GM-CSF, IL-1a, IL-2, IL-6 e IFN-y en liposomas que contienen dimiristoil fosfatidilcolina. Lachman L.B. et al. (European Cytokine Network, 1996, 7, 4, 693-698) revisan el uso de liposomas que contienen citoquinas como adyuvantes de vacunas. van Broekhoven C.L. y Altin J. G. (International Journal of Cancer, 2002, 98,1, 63-72) divulgan un método para modificar vesículas de membrana plasmática mediante el uso del lípido quelante ácido nitrilotriacético ditetradecilamina, y el uso de las vesículas como vacunas. El documento WO 2005/018610 A1 se refiere a una composición que comprende vesículas de membrana que contienen antígeno o liposomas que contienen antígeno y un ligando para un receptor en células dendríticas para modular la inmunidad mediante el direccionamiento in vivo del antígeno a las células dendríticas. El documento WO 2010/071836 A1 se refiere a un sistema de modelo animal transgénico basado en el desarrollo de ratones transgénicos que portan componentes del sistema inmunitario humano, incluidos un gran número de linfocitos innatos, Tales como las células asesinas naturales (NK) humanas maduras, las células T y§ y las células T NK como linfocitos T CD4 y CD8 adaptativos. Denman, C.J. et al. (PLoS ONE, 2012, 7, 1, e30264) divulgan el uso de células presentadoras de antígenos artificiales basadas en K562 con IL-21 unida a la membrana para apoyar la proliferación de células NK humanas. Klempner M.S. et al. (J Cell Biol, 1980, 86, 1, 21-28) divulgan un método de aislamiento de la membrana plasmática de neutrófilos, usando cavitación de nitrógeno para la ruptura celular y una combinación de centrifugación diferencial y ultracentrifugación de equilibrio en gradientes de dextrano para el fraccionamiento de la membrana. El documento WO 2013/175237 A1 se refiere a una composición de cebado de células NK que comprende un agente de ligación de CD2 y un agente de ligación de NKG2D. También se divulga un sustrato o vesícula de cebado de células NK (tal como un liposoma) que comprende un agente de ligación de CD2 y un agente de ligación de NKG2D. Colosimo, D. ([Thesis), 2012, HIM 1990-2015, 1325] divulga un método de expansión ex-vivo que utiliza líneas de células leucémicas k562 y citoquinas solubles, así como el uso de membranas plasmáticas aisladas de líneas de células tumorales modificadas genéticamente en la expansión de células NK. Oyer J. L. et al. (Biol. Blood Marrow Transplant., 2015, 21,4, 632-639) divulgan método ex vivo basado en partículas de expansión de células NK utilizando partículas de membrana plasmática) derivadas de células alimentadoras K562-mbIL15-41BBL.

Existe una gran necesidad de metodologías nuevas y mejoradas destinadas a aumentar el número de células NK.

Las ventajas adicionales del método y las composiciones divulgadas se expondrán en parte en la descripción que sigue, y en parte se entenderán a partir de la descripción, o se pueden aprender mediante la práctica del método y las composiciones divulgadas. Las ventajas del método y las composiciones divulgadas se realizarán y lograrán por medio de los elementos y combinaciones particularmente señalados en las reivindicaciones adjuntas. Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son solo explicativas e ilustrativas y no limitan la invención tal como se reivindica.

Breve resumen

La presente invención se refiere a una composición que contiene una vesícula de membrana plasmática purificada a partir de células alimentadoras de células NK. Las células alimentadoras de células NK son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) autólogas o alogénicas irradiadas, RPMI8866, HFWT, K562 o EBV-LCL. La vesícula de membrana plasmática incluye al menos un agente efector de células NK. Al menos un agente efector de células NK es IL-21 o IL-15. La invención también se relaciona con el uso de la composición para la estimulación o expansión de células NK en una población de células NK in vitro, administrando la composición a la población de células NK in vitro. Además, la invención se refiere a un método para producir una población de células ⁿK expandidas. El método incluye poner en contacto una primera población de células NK in vitro con la composición anterior. Se divulgan composiciones que comprenden una vesícula de membrana plasmática, en las que la vesícula de membrana plasmática comprende un agente efector de células NK. Los agentes efectores de células NK pueden ser una citoquina, una molécula de adhesión o un agente activador de células NK.

Se divulgan composiciones que comprenden una vesícula de membrana plasmática, en las que la vesícula de membrana plasmática comprende un agente efector de células NK, en los que el agente efector de células NK puede ser IL-15, IL-21, IL-2, 41BBL, IL-12, IL-18, MICA, 2B4, LFA-1 o BCM1/SLAMF2.

Se divulgan composiciones que comprenden una vesícula de membrana plasmática, en las que la vesícula de membrana plasmática comprende un agente efector de células NK, en los que el agente efector de células NK puede ser IL-15, IL-21 o 41BBL.

Se divulgan composiciones que comprenden una vesícula de membrana plasmática, en las que la vesícula de membrana plasmática comprende un agente efector de células NK, en las que la membrana plasmática puede comprender dos o más agentes efectores de células NK. Al menos un agente efector de células N^kpuede ser una citoquina. Por ejemplo, se divulgan composiciones que comprenden una vesícula de membrana plasmática, en las que la vesícula de membrana plasmática comprende un agente efector de células NK, en las que la membrana plasmática puede comprender IL-15 y 41BBL. En algunos aspectos, la membrana plasmática puede comprender además IL-21. Se divulgan composiciones que comprenden una vesícula de membrana plasmática, en las que la vesícula de membrana plasmática comprende un agente efector de células NK, en las que la membrana plasmática puede comprender IL-21 y 41BBL.

Se divulgan composiciones que comprenden una vesícula de membrana plasmática, en las que la vesícula de membrana plasmática comprende un agente efector de células NK, en las que la vesícula de membrana plasmática rodea una micropartícula.

Se divulgan composiciones que comprenden dos o más vesículas de membrana plasmática, en las que las vesículas de membrana plasmática comprenden un agente efector de células NK.

Se divulgan composiciones que comprenden al menos una composición que comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende un agente efector de células NK y al menos una composición que comprende un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK.

Se divulgan composiciones que comprenden un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK. Los agentes efectores de células NK pueden ser una citoquina, una molécula de adhesión o un agente activador de células NK. Se divulgan composiciones que comprenden un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK, en los que el agente efector de células NK puede ser IL-15, IL-21, IL-2, 41BBL, IL-12, IL-18, MICA, 2B4, LFA-1 y BCM1/SLAMF2.

Se divulgan composiciones que comprenden un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK, en las que el agente efector de células NK es IL-15, IL-21 o 41BBL.

Se divulgan composiciones que comprenden un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK, en las que el péptido autoinsertable en la membrana es una molécula que promueve la inserción en una membrana y puede ser Fc humano, GPI, receptor de células T transmembrana o pHLIP

Se divulgan composiciones que comprenden dos o más composiciones que comprenden un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células n K.

Se divulgan métodos para tratar el cáncer que comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende al menos un agente efector de células NK. Al menos un agente efector de células NK puede ser una citoquina, una molécula de adhesión o un agente activador de células NK. En algunos aspectos, el agente efector de células NK puede ser IL-15, IL-21 o 41BBL.

Se divulgan métodos para tratar el cáncer que comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende dos o más agentes efectores de células NK. Al menos un agente efector de células NK puede ser una citoquina. Por lo tanto, se divulgan métodos para tratar el cáncer que comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende dos o más agentes efectores de células NK, en los que la membrana plasmática puede comprender IL-15 y 41BBL. En algunos aspectos, la membrana plasmática puede comprender además IL-21. También se divulgan métodos para tratar el cáncer que comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende dos o más agentes efectores de células NK, en los que la membrana plasmática puede comprender IL-21 y 41BBL. También se divulgan métodos para tratar el cáncer que comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende dos o más agentes efectores de células NK, en los que la vesícula de membrana plasmática comprende IL-15 e IL-21.

Se divulgan métodos para tratar el cáncer que comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende al menos un agente efector de células NK, en los que la vesícula de membrana plasmática puede purificarse a partir de células alimentadoras de células NK. Las células alimentadoras de células NK pueden ser células mononucleares de sangre periférica (PBMC) autólogas o alogénicas irradiadas, células RPMI8866, HFWT, K562, K562 transfectadas con IL-15 y 41BBL unidos a la membrana, células K562 transfectadas con IL-21 y 41BBL unidos a la membrana, o EBV-LCL. En algunos aspectos, las células alimentadoras de células NK pueden ser células K562 transfectadas con IL-21 y 41BBL unidos a la membrana o células K562 transfectadas con IL-15 y 41BBL unidos a la membrana.

Se divulgan métodos para tratar el cáncer que comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende al menos un agente efector de células NK, en los que una cantidad eficaz de la composición estimula la expansión de las células NK. Cualquiera de las composiciones de vesículas de membrana plasmática divulgadas puede usarse en estos métodos.

Se divulgan métodos para tratar el cáncer que comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK. Una cantidad eficaz de la composición puede estimular la expansión de las células NK.

Se divulgan métodos para tratar el cáncer que comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK, en los que la composición comprende un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con IL-15, IL- 21 o 41BBL.

Se divulgan métodos para tratar el cáncer que comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK, en los que el péptido autoinsertable en la membrana puede ser Fc humano, GPI, receptor de células T transmembrana o pHLIP.

Se divulgan métodos para tratar el cáncer que comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK, en los que la composición puede comprender dos o más péptidos autoinsertables en la membrana conjugados con un agente efector de células NK.

Se divulgan métodos para expandir células NK que comprenden administrar a una población celular una cantidad eficaz de una composición que comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende al menos un agente efector de células NK, en los que la población celular comprende células NK. Los agentes efectores de células NK pueden ser una citoquina, una molécula de adhesión o un agente activador de células NK. En algunos aspectos, el agente efector de células NK puede ser IL-15, IL-21 o 41BBL.

Se divulgan métodos para expandir células NK que comprenden administrar a una población celular una cantidad eficaz de una composición que comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende al menos un agente efector de células NK, en los que la población celular comprende células NK, en los que la vesícula de membrana plasmática comprende IL-15 e IL-21. En algunos aspectos, la vesícula de la membrana plasmática puede comprender además 41BBL.

Se divulgan métodos para expandir células NK que comprenden administrar a una población celular una cantidad eficaz de una composición que comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende al menos un agente efector de células NK, en los que la población celular comprende células NK, en los que la vesícula de membrana plasmática comprende IL-15 y 41BBL. En algunos aspectos, la vesícula de la membrana plasmática puede comprender IL-21 y 41BBL.

Se divulgan métodos para expandir células NK que comprenden administrar a una población celular una cantidad eficaz de una composición que comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende al menos un agente efector de células NK, en los que la población celular comprende células NK, en los que la vesícula de membrana plasmática se puede purificar a partir de células alimentadoras de células NK. Las células alimentadoras de células NK pueden ser células mononucleares de sangre periférica (PBMC) autólogas o alogénicas irradiadas, células RPMI8866, HFWT, K562, K562 transfectadas con IL-15 y 41BBL unidos a la membrana, células K562 transfectadas con IL-21 y 41BBL unidos a la membrana, o EBV-LCL. En algunos aspectos, las células alimentadoras de células NK pueden ser células K562 transfectadas con IL-21 y 41BBL unidos a la membrana o células K562 transfectadas con IL-15 y 41BBL unidos a la membrana.

Se divulgan métodos para expandir células NK que comprenden administrar a una población celular una cantidad efectiva de una composición que comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende al menos un agente efector de células NK, en los que la población celular comprende células NK, en los que una cantidad efectiva de la composición estimula la expansión de células NK.

Se divulgan métodos para expandir células NK que comprenden administrar a una población celular una cantidad eficaz de una composición que comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende al menos un agente efector de células NK, en los que la población celular comprende células NK, en los que administrar a una población celular comprende administrar la composición a un sujeto, en los que el sujeto comprende la población celular.

Se divulgan métodos para expandir células NK que comprenden administrar a una población celular una cantidad eficaz de la composición que comprende un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK, en los que la población celular comprende células NK. Una cantidad eficaz de la composición puede estimular la expansión de las células NK.

Se divulgan métodos para expandir células NK que comprenden administrar a una población celular una cantidad eficaz de la composición que comprende un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK, en los que la población celular comprende células NK, en los que la composición comprende un péptido autoinsertable en la membrana conjugado IL-15, IL-21 o 41BBL.

Se divulgan métodos para expandir células NK que comprenden administrar a una población celular una cantidad eficaz de la composición que comprende un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK, en los que la población celular comprende células NK, en los que el péptido autoinsertable en la membrana puede ser Fc humano, GPI, receptor de células T transmembrana o pHLIP.

Se divulgan métodos para expandir células NK que comprenden administrar a una población celular una cantidad eficaz de la composición que comprende un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK, en los que la población celular comprende células NK, en los que administrar a una población celular comprende administrar la composición a un sujeto, en los que el sujeto comprende la población celular.

Se divulgan métodos para expandir células NK que comprenden administrar a una población celular una cantidad eficaz de la composición que comprende un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK, en los que la población celular comprende células NK, en los que la composición comprende al menos dos conjugados de péptidos autoinsertables en la membrana, en los que los conjugados de péptidos autoinsertables en la membrana se conjugan con un agente efector de células NK. Se pueden conjugar al menos dos conjugados de péptidos autoinsertables en la membrana con los mismos o diferentes agentes efectores de células NK.

Se divulgan métodos para modular el sistema inmunitario que comprenden administrar a un sujeto una o más de las composiciones que comprenden un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK o una vesícula de membrana plasmática que comprende un agente efector de células NK. Los métodos para modular el sistema inmunitario pueden comprender reducir el número de células T activadas, expandir el número de células NK o reducir el número de células dendríticas.

Breve descripción de los dibujos

Los dibujos adjuntos ilustran varias realizaciones del método y las composiciones divulgados y, junto con la descripción, sirven para explicar los principios del método y las composiciones divulgados.

La Figura 1 es una representación de una membrana plasmática de células K562-mb15-41BBL que contiene ligandos estimuladores (IL-15 y 41BBL) solos o cargados con nanopartículas magnéticas, una sílice C18 o una perla de poliestireno, o una perla de sílice.

La Figura 2 es una representación de agentes efectores de células NK, que incluyen 41-BBL, IL-15, IL-21, MICA, 2B4 y otros. El otro incluye, pero sin limitarse a, BCM1/SLAMF2, IL-2, IL-12. También se muestra un péptido autoinsertable en la membrana (MBI) genérico. El agente con efecto sobre las células NK y el MBI se pueden entrecruzar y autoinsertar en las células tumorales.

La Figura 3 presenta diagramas de puntos de CD56-PE frente a CD3-APC, que muestran que la población de células NK CD56+CD3- aumenta a medida que aumenta la concentración de membrana plasmática K562-mb21 en cultivo después de 10 días.

La Figura 4 presenta un gráfico de barras que representa el aumento en el porcentaje de células NK en células cultivadas como resultado de un aumento en la concentración de membrana plasmática K562-mb15 o K562-mb21. La Figura 5 presenta gráficos de barras que muestran un aumento en la expansión de células NK con concentraciones crecientes de vesículas de membrana PM-mb15-41BBL o PM-mb21-41BBL en cultivo.

La Figura 6 presenta un gráfico de barras que muestra el porcentaje de citotoxicidad de mbIL15 K562, mbIL21 K562, mbIL15 PM o mbIL21 PM contra células K562, KG1 y HL-60 en el día 10 de cultivo. Las células NK expandidas con membrana plasmática de K562mb15 y K562mb21 provocan respuestas citotóxicas comparables contra las líneas celulares a Ml (KG1 y HL-60) y CML (K562) en comparación con las células NK cultivadas con células alimentadoras vivas.

La Figura 7 presenta histogramas que muestran IL-15-FITC y 41BBL-PE. Se recubrieron perlas de látex o sílice C18 con membrana plasmática K562mb15 que contenía IL15 y 41BBL unidos a la membrana. Tanto las perlas de látex como las de sílice C18 mostraron la presencia de IL-15 y 41BBL después del recubrimiento. El isotipo es la línea de color más claro.

Las Figuras 8A y 8B representan los desechos encontrados en cultivos después de la expansión de células NK. a) FSC frente a SSC de PBMC (rojo) junto con membrana plasmática en el día 10 de cultivo. b) FSC frente a SSC de PBMC (rojo) junto con restos de células alimentadoras K562mb15 (verde). Las figuras superior e inferior representan cultivos separados en el día 10. La figura superior tiene significativamente más restos de células alimentadoras que la figura inferior.

La Figura 9 muestra que las vesículas de PM-mb15-41BBL expanden eficientemente las células NK. Las PBMC se cocultivaron con alimentadores K562-mb15-41BBL o se estimularon con vesículas de PMmb15-41BBL (a 100 o 200 |jg de proteína de membrana/mL) durante 21 días. El contenido celular se analizó cada 2 o 3 días y los medios se cambiaron según fuera necesario. La figura muestra una expansión representativa de 3 realizadas con PBMC derivadas de 3 donantes diferentes. Cada punto representa el promedio de cultivos duplicados.

La Figura 10 muestra que las vesículas de PM-mb15-41BBL expanden selectivamente las células NK. Las PBMC se estimularon con vesículas de PM-mb15-41BBL a 200 jg de proteína de membrana/mL durante 14 días. El recuento y contenido de células se analizó cada 2-3 días tiñendo las células con anticuerpos anti-CD56-PE y anti-CD3-APC y analizando el contenido en un citómetro de flujo Accuri. En todos los experimentos realizados hasta la fecha, las células NK CD56+ CD3- se expandieron selectivamente dentro de las PBMC cuando se estimularon con vesículas de PM-mb15-41BBL y para el día 14 consistían en > 95 % del contenido celular. La figura muestra una expansión representativa de 3 realizadas con PBMC derivadas de 3 donantes diferentes.

La Figura 11 muestra que el contenido de células NK aumenta con la concentración de vesículas de PMmb15-41BBL. Las PBMC se estimularon con cantidades variables de vesículas de membrana plasmática durante 14 días. Contenido celular medido usando anti-CD56-PE y anti-CD3-APC. Cada punto representa el promedio de cultivos duplicados. La Figura 12 muestra que las vesículas de PM-mb15-41BBL optimizadas expanden las células NK tan bien como las células alimentadoras vivas. Las PBMC se cocultivaron con preparaciones de vesículas de PM optimizadas (n=6) o iniciales (n=4) a 200 jg de proteína de membrana/mL o se cocultivaron con 1 * 106/mL alimentadores vivos K562-mb15-41BBL (n=6, control positivo de alimentadores) o 50 ng/mL de IL-15 soluble y 50 ng/mL de 41BBL soluble (n=6, control de SC) hasta por 20 días. El gráfico representa la veces que se expanden las células NK después de 12-13 días en cultivo.

La Figura 13 muestra que la velocidad de crecimiento de las células NK expandidas con vesículas de PM-mb15-41BBL se ralentiza después de dos semanas en cultivo. Las PBMC se cocultivaron con vesículas de PM a 200 jg de proteína de membrana/mL durante más de 4 semanas. La mitad de los medios se reemplazó cada dos días después del día 3. Se reemplazaron 100 jg de vesículas de PM con el reemplazo del medio cada dos días. Contenido celular medido usando anti-CD56-PE y anti-CD3-APC. Cada punto representa el promedio de cultivos duplicados. La figura muestra una expansión representativa de 3 realizadas con PBMc derivadas de 3 donantes diferentes.

La Figura 14 muestra que las células NK expandidas de vesículas de PM-mb15-41BBL son citotóxicas frente a dianas de CML y AML. Ensayo de citotoxicidad realizado los días 13 y 14 con el kit PanToxiLux que mide la actividad de caspasa/granzima en células diana marcadas. Células marcadas a razón de 0.5 * 106/mL se coincubaron con células NK expandidas en proporciones variables por duplicado durante 1.5 horas y luego se analizaron mediante citometría de flujo. La cantidad de muerte espontánea de células diana se determinó utilizando un control "Target Alone". El porcentaje de citotoxicidad se determinó restando la muerte celular espontánea de la muerte de la célula diana y luego dividiendo por el total de células diana. La figura muestra un ensayo citotóxico representativo de 3 realizados con PBMC derivadas de 3 donantes diferentes.

La Figura 15 muestra células diana NK expandidas con vesículas de PM-mb15-41BBL en comparación con células NK recién aisladas. Ensayo de citotoxicidad inicial realizado en células NK recién aisladas de donantes sanos. Las NK aisladas de PBMC después de Ficoll usando el kit de selección negativa de Stem Cell Technologies se dejaron reposar y preactivar durante la noche en medio de crecimiento FBS IL2 alto (1000U/mL) antes de probar la citotoxicidad. Las NK expandidas a partir de PBMC con vesículas de PM a 200 jg de proteína de membrana/mL durante 13-14 días se preactivaron con lL2 alta (1000 U/mL) durante la noche antes de probar la citotoxicidad. La figura muestra una expansión representativa de 3 realizadas con PBMC derivadas de 3 donantes diferentes.

La Figura 16 muestra que las células NK expandidas con vesículas de PM-mb15-41BBL son citotóxicas contra las células de AML primarias del paciente. La citotoxicidad de las células NK cultivadas con vesículas de PM a 200 jg de proteína de membrana/mL durante 13-14 días se probó contra el tumor primario de 2 pacientes diferentes. Las células tumorales se recolectaron de médula ósea o sangre periférica de pacientes que firmaron el consentimiento informado. Los blastos de leucemia se separaron mediante gradiente de Ficoll y se criopreservaron para futuros experimentos. Las muestras de tumor descongeladas se incubaron en medios durante la noche para recuperarlas antes de usarlas en ensayos de citotoxicidad. Las células tumorales diana se tiñeron con colorante TFL4 para distinguirlas de los efectores. Además, las células tumorales se tiñeron con anti-CD34-PE para distinguir las células tumorales del paciente de las PBMC del paciente sano. La figura muestra una expansión representativa de 3 realizadas con PBMC derivadas de 3 donantes diferentes.

La Figura 17 muestra vesículas de PM-mb15-41BBL que expanden las células NK in vivo en ratones NSG. Se estimularon PBMC derivadas de dos donantes diferentes con vesículas de PM-mb15-41BBL a 200 |jg de proteína de membrana/mL durante 7 días. El día siete se contaron las células y se analizó el contenido celular, se centrifugaron, se resuspendieron a 15 mL de células NK/mL en 100 jL de RPMI transparente con 50 U/mL de IL 2 y se inyectaron en la vena de la cola del ratón NSG. Se inyectaron ratones 3 veces a la semana con vesículas de PM-mb15-41BBL (200 jg de proteína de membrana/mL) y una dosis baja de 100 U o 1000 U de IL-2. El día 1 y 4 después de la inyección, se extrajeron 50-100 jL d e sangre de ratón y se analizó la presencia y el número de linfocitos CD45+ humanos, células NK CD3-CD56+ y células T CD3+ CD56-. El gráfico representa las veces que se expanden las células NK entre los días 1 y 3 después de la inyección.

Descripción detallada

El método y las composiciones divulgados pueden entenderse más fácilmente con referencia a la siguiente descripción detallada de realizaciones particulares y el Ejemplo incluido en la misma y a las Figuras y su descripción anterior y siguiente.

Debe entenderse que el método y las composiciones divulgados no se limitan a métodos de síntesis específicos, técnicas analíticas específicas o reactivos particulares a menos que se especifique lo contrario y, como tales, pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente y no pretende ser limitativa.

Una parte significativa del efecto injerto contra tumor (GVT) mediado por la infusión de linfocitos del donante puede deberse a las células asesinas naturales (NK). La infusión de células Nk aisladas de la sangre de un donante podría producir efectos GVT beneficiosos sin causar GVHD. Los datos preclínicos y clínicos han demostrado la eficacia de las infusiones de células NK que conducen a la remisión completa sin GVHD. Por lo tanto, la infusión de células NK, en combinación con el trasplante autólogo, o como tratamiento independiente, ofrece una alternativa innovadora y potencialmente muy efectiva para aquellos pacientes que no tienen un donante compatible, experimentan una recaída o no califican para el trasplante.

Las infusiones de células NK son una opción de tratamiento para pacientes con cánceres susceptibles a la lisis de células NK, incluidos los cánceres de la sangre (tales como la leucemia mieloide aguda o el mieloma múltiple) y varios tumores sólidos (p. ej., tumor cerebral, sarcoma de Ewing y rabdomiosarcoma) (Harada, Saijo et al., Alabama. 2002; Ruggeri, Capanni et al. 2002; Miller, Soignier et al., 2005; Cho, Shook et al., 2010). Un mayor número de células NK funcionales también puede mejorar significativamente la eficacia de los anticuerpos terapéuticos utilizados en el tratamiento de varios tipos de cáncer, incluidos los linfomas, el cáncer colorrectal, el cáncer de pulmón y el cáncer de mama, entre otros (Hatjiharissi, Xu et al. 2007; Triulzi, Vertuani et al. 2010; Houot, Kohrt et al. 2011; Tai, Horton et al.

2012). Estos tipos de tratamientos personalizados son, sin embargo, muy costosos, con un régimen típico que contiene anticuerpos que cuesta decenas de miles de dólares. Además, la eficacia esperada de los métodos existentes a menudo no se logra debido a la falta de participación de las células inmunitarias en pacientes con cáncer inmunocomprometidos (Dewan, Takada et al., 2009; Mamessier, Sylvain et al. 2011).

Para que sea efectivo como método de tratamiento del cáncer, es deseable lograr un grado de expansión de células NK que alcance una dosis terapéutica efectiva. Varios estudios han demostrado que las células NK proliferan en un cultivo in vitro de forma exponencial y preferencial dentro de una mezcla de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) cuando se estimulan con una combinación de citoquinas (tales como IL-15 o IL-21) y ligandos para activar receptores (tales como 4-1BBL) expresados en la superficie de las células estimuladoras (Imai, Iwamoto et al. 2005; Cho and Campana 2009; Lee, Verneris et al., 2010; Somanchi, Senyukov et al. 2011).

Para las citoquinas IL-15 e IL-21, la presentación cruzada de la interleucina unida a la membrana, como en las células dendríticas normales, induce la expansión de las células NK de forma más potente que la forma soluble de estas citoquinas. Además, bajo tales condiciones de estimulación, solo se requiere una baja concentración de IL-2 soluble para la supervivencia de las células NK, lo que permite la expansión selectiva de las células NK dentro de una mezcla de PBMC sin una proliferación observable de células T La forma soluble de las citoquinas IL-15 e IL-21 o la IL-2 en dosis altas estimulan más potentemente la proliferación de células T que la de células NK. Un estudio publicado previamente por Campana y colaboradores ha demostrado que en un cultivo in vitro, la estimulación de células NK con la línea celular K562 que tiene IL-15 y 4-1BBL unidos a la membrana conduce a una potente expansión de células NK que no se observa con células K562 que expresan cualquiera de las moléculas solas (Imai, Iwamoto et al., 2005; Fujisaki, Kakuda et al., 2009). Sin embargo, la expansión de las células NK se limitó a varias divisiones y las células alcanzaron la senescencia y dejaron de proliferar, coincidiendo con la observación del acortamiento de los telómeros. En un estudio de seguimiento, se encontró que la estimulación con IL-21 unida a la membrana en lugar de IL-15 estimula la propagación continua de las células NK durante innumerables generaciones, lo que permite la expansión continua de las células NK siempre que el cultivo se reponga periódicamente con células estimulantes frescas ( Somanchi, Senyukov et al. 2011; Denman, Senyukov et al., 2012). Si bien estos métodos permiten una expansión eficiente de células NK in vitro, la necesidad de células alimentadoras vivas dificulta la transferencia de la metodología a entornos clínicos. Además, es probable que las células NK que se infunden en el paciente dejen de dividirse debido a la falta de estimulación continua por parte de los alimentadores. Además, todavía falta información acerca de la capacidad de las células NK cultivadas in vitro para funcionar según lo previsto cuando se reinfunden en un paciente (Miller 2009).

Actualmente, la administración de IL-2 es el único método de expansión de células NK in vivo aprobado por la FDA. La IL-15 se está probando actualmente en un ensayo clínico de Fase I como un enfoque alternativo a la administración de IL-2, pero según los hallazgos preclínicos, aún se espera que tenga una toxicidad significativa si se administra sistemáticamente. Por lo tanto, ambos métodos conllevan toxicidades significativas para los pacientes y también inducen la proliferación de células T, incluidas las células T reguladoras, lo que conduce a una persistencia corta (en promedio, menos de 21 días) de las células NK.

Una prueba piloto exitosa mostró que la infusión de células NK purificadas aisladas de la sangre del donante es segura y puede conducir a la remisión completa de la LMA, sin GVHD. Para alcanzar la dosis terapéutica, las células NK se expandieron in vivo en pacientes con agotamiento de linfocitos mediante la administración diaria de dosis altas de IL-2. Sin embargo, el régimen de acondicionamiento intensivo requerido para el agotamiento de los linfocitos y las altas dosis de IL-2 utilizadas en este estudio dieron como resultado una toxicidad significativa y una hospitalización prolongada y, en muchos casos, una baja expansión in vivo de las células NK. Además, la administración sistémica de IL-2 conduce a la proliferación de células T reguladoras que suprimen el número y la función de las células NK, lo que limita su persistencia y eficacia en el paciente. Por lo tanto, se necesitan enfoques alternativos para la expansión in vivo o ex vivo de las células NK.

La eficacia de la inmunoterapia con células NK depende de la dosis de células NK administrada al paciente o alcanzada después de la infusión a través de la expansión in vivo. Las técnicas actualmente disponibles están limitadas por su incapacidad para lograr el nivel de expansión de células NK requerido para lograr un efecto terapéutico en un paciente. La falta de un protocolo de expansión clínica es una barrera importante para el progreso de la inmunoterapia basada en células NK. Los protocolos de expansión ex vivo actuales utilizan una combinación de citoquinas en dosis altas con ligandos activadores expresados en líneas celulares alimentadoras/estimuladoras derivadas de la leucemia, lo que representa una desventaja significativa para la transferencia a entornos clínicos en la mayoría de los centros y no son susceptibles de expansión directa in vivo. El uso de la tecnología de partículas descrita en este documento elimina la necesidad de células estimuladoras, lo que simplifica la metodología y permite la expansión in vivo directa y selectiva.

Varios grupos han buscado un método para expandir las células NK ex vivo. Sin embargo, la mayoría de los métodos ex vivo desarrollados actualmente se basan en sistemas de cocultivo de líneas de células tumorales y células NK en presencia de altas concentraciones de varias citoquinas, principalmente IL-2 (revisado en Cho y Campana 2009; Suck y Koh 2010). Las células utilizadas para desencadenar la proliferación de células NK incluyen PBMC autólogas o alogénicas irradiadas, RPMI8866, HFWT, K562, K562-mb15-41BBL (K562 transfectadas con 4-1BBL e IL-15 unida a la membrana), K562-mb21-41BBL y EBV-LCL (Harada, Saijo et al., 2004; Imai, Iwamoto et al., 2005; Berg, Lundqvist et al., 2009; Fujisaki, Kakuda et al., 2009; Siegler, Meyer-Monard et al., 2010). Aunque la expansión de las células NK puede ser significativa con algunas de estas líneas celulares (30 a 10,000 veces en 7 a 21 días), el uso de células alimentadoras presenta desventajas significativas para la transferencia a un entorno clínico en la mayoría de los centros debido al requisito de una Instalación de Buenas Prácticas de Manufactura (cGMP), que cuesta varios millones de dólares (Revisado en Cho y Campana 2009; Suck y Koh 2010). Además, el cultivo continuo de células alimentadoras es costoso y requiere el apoyo de personal dedicado. Los Institutos Nacionales de Salud (NIH) actualmente brindan apoyo en la fabricación de células para terapia celular en forma de Asistencia de Producción para Terapia Celular (PACT). Sin embargo, las células NK parecen perder su actividad durante la crioconservación (presentación del taller PACT). Por lo tanto, el almacenamiento y transporte de células NK expandidas desde el sitio de producción hasta el centro de trasplante es otro obstáculo para la aplicación exitosa de la terapia. Una preocupación adicional es la posibilidad de infusión de células alimentadoras vivas y/o material genético liberado de esas células transformadas y componentes de cultivo (p. ej., suero bovino fetal) en un paciente receptor.

Miltenyi Biotech ha introducido un kit de expansión in vitro que utiliza perlas recubiertas de anticuerpos para entrecruzar la activación de los receptores de células N^k. Sin embargo, este método requiere el uso de IL-2 de alta concentración. Si bien es útil para aplicaciones de laboratorio, este método no se puede transferir a entornos clínicos porque las células NK cultivadas con altas concentraciones de citoquinas experimentan una apoptosis rápida después de la infusión debido a la abstinencia de citoquinas (Miller 2009).

Se ha informado la expansión de las células NK dentro de PBMC con una alta concentración de IL-2 y estimulación con anticuerpos anti-CD3 durante los primeros cinco días (Carlens, Gilljam et al., 2001; Alici, Sutlu et al. 2008). La expansión general de las células NK fue de casi 1000 veces, pero la mayoría de las células NK eran en realidad células T similares a las NK (Berg y Childs 2010). Por lo tanto, todos los métodos plantean dificultades significativas para la transferencia a aplicaciones clínicas y ninguno de los métodos puede usarse en expansión directa in vivo.

A. Vesículas de membrana plasmática

Se divulgan vesículas de membrana plasmática que comprenden al menos un agente efector de células NK. Los agentes efectores de células NK pueden ser una citoquina, una molécula de adhesión o un agente activador de células NK (es decir, un ligando estimulador). Los ejemplos de citoquinas pueden ser, pero no se limitan a, IL-2, IL-12, IL-15, IL-21 e IL-18. Los ejemplos de moléculas de adhesión pueden ser, pero no se limitan a, LFA-1, MICA, BCM/SLAMF2.

Ejemplos de agentes activadores de células NK pueden ser, pero no se limitan a, 41BBL y BCM/SLAMF2. En algunos aspectos, un miembro de un grupo también puede ser miembro de otro grupo. Por ejemplo, BCM/SLAMF2 puede ser tanto una molécula de adhesión como un agente activador de células NK. El agente efector de células NK puede ser, pero sin limitarse a, 41BBL, IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, IL-18, MICA, LFA-1, 2B4 y BCM/SLAMF2. Las vesículas de membrana plasmática son vehículos utilizados para transportar agentes efectores de células NK. Los agentes efectores de células NK pueden unirse a la membrana. Mientras que los agentes efectores de células NK están unidos a la membrana, otros agentes terapéuticos o de diagnóstico pueden transportarse en el interior de la vesícula de la membrana plasmática.

En algunos aspectos, la vesícula de la membrana plasmática comprende al menos una citoquina unida a la membrana. Por lo tanto, se divulgan vesículas de membrana plasmática, en las que la vesícula de membrana plasmática comprende un agente efector de células NK, en las que el agente efector de células NK es IL-15, IL-21 o 41BBL.

Se divulgan composiciones que comprenden vesículas de membrana plasmática, en las que la vesícula de membrana plasmática comprende dos o más agentes efectores de células NK. En algunos aspectos, al menos un agente efector de células NK puede ser una citoquina. Por ejemplo, la membrana plasmática puede comprender IL-15 y 41BBL; IL-15, 41BBL e IL-21; o IL-21 y 41BBL. En algunos aspectos, la vesícula de la membrana plasmática comprende al menos dos citoquinas unidas a la membrana. Por ejemplo, una vesícula de membrana plasmática puede comprender IL-15 unida a membrana e IL-21 unida a membrana.

Las vesículas de membrana plasmática se pueden usar solas, cargadas con nanopartículas magnéticas o montadas sobre una superficie sólida como, entre otras, una perla de sílice o látex. En algunos aspectos, las vesículas de la membrana plasmática pueden rodear o recubrir una micropartícula. Las micropartículas recubiertas con membrana plasmática se pueden fabricar con cualquiera de las vesículas de membrana plasmática descritas en el presente documento. Por ejemplo, se divulgan micropartículas recubiertas con una membrana plasmática que comprende IL-15 y 41BBL o IL-21 y 41BBL. Las micropartículas recubiertas con membrana plasmática se pueden cargar con partículas magnéticas, perlas de sílice, perlas de poliestireno, perlas de látex, agentes de contraste o agentes terapéuticos conocidos, tales como agentes terapéuticos contra el cáncer.

Se divulgan composiciones que comprenden dos o más vesículas de membrana plasmática, en las que las vesículas de membrana plasmática comprenden un agente efector de células NK. Por ejemplo, las composiciones pueden comprender una vesícula de membrana plasmática que contiene IL-15 y 41BBL y una vesícula de membrana plasmática que contiene IL-21 y 41BBL.

Se divulgan composiciones que comprenden al menos una composición que comprende un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK y al menos una composición que comprende una vesícula de membrana plasmática, en la que la vesícula de membrana plasmática comprende un agente efector de células NK. El agente efector de células n K conjugado con el péptido autoinsertable en la membrana puede ser el mismo o diferente del agente efector de células NK presente en la vesícula de membrana plasmática.

Las vesículas de membrana plasmática son vesículas hechas de la membrana plasmática de una célula o hechas artificialmente (es decir, liposomas). Las vesículas de membrana plasmática se pueden preparar utilizando cualquiera de las técnicas conocidas en el arte. Por ejemplo, se pueden usar protocolos comunes de preparación de membranas plasmáticas o protocolos comunes para preparar liposomas. La vesícula de la membrana plasmática puede contener una bicapa lipídica o simplemente una sola capa de lípidos. Las membranas plasmáticas fabricadas artificialmente, como los liposomas, se pueden preparar utilizando una bicapa lipídica y conjugados peptídicos autoinsertables en la membrana como se describe a continuación.

B. Conjugados de péptidos autoinsertables en la membrana

Se divulgan composiciones que comprenden un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK. Estas composiciones también pueden denominarse conjugados peptídicos autoinsertables en la membrana.

Los agentes efectores de células NK pueden ser una citoquina, una molécula de adhesión o un agente activador de células NK (es decir, un ligando estimulador). Los ejemplos de citoquinas pueden ser, pero no se limitan a, IL-2, IL-12, IL-15, IL-21 e IL-18. Los ejemplos de moléculas de adhesión pueden ser, pero no se limitan a, LFA-1, MICA, BCM/SLAMF2. Ejemplos de agentes activadores de células NK pueden ser, pero no se limitan a, 41BBL y BCM/SLAMF2. En algunos aspectos, un miembro de un grupo también puede ser miembro de otro grupo. Por ejemplo, BCM/SLAMF2 puede ser tanto una molécula de adhesión como un agente activador de células NK. El agente efector de células NK puede ser, pero sin limitarse a, 41BBL, IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, IL-18, MICA, LFA-1, 2B4 y BCM/SLAMF2. Por lo tanto, se divulgan composiciones que comprenden un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células Nk , en los que el agente efector de células NK puede ser IL-15, IL-21 o 41BBL.

Se divulgan composiciones que comprenden un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK, en las que el péptido autoinsertable en la membrana es una molécula que promueve la inserción en una membrana y puede ser Fc humano, GPI, receptor de células T transmembrana o pHLIP El péptido autoinsertable en la membrana puede ser cualquier péptido que se sabe que se inserta en una membrana celular. Dependiendo del uso del conjugado de péptido autoinsertable en la membrana, ciertos péptidos autoinsertables en la membrana pueden ser mejores opciones que otros. Un experto en la técnica comprenderá qué péptido autoinsertable en la membrana es ideal en diferentes circunstancias. Por ejemplo, para uso in vivo, se puede usar el péptido autoinsertable en la membrana pHLIP Los péptidos autoinsertables en la membrana pHLIP se insertan en la membrana solo en condiciones de pH bajo. Por lo tanto, los conjugados de pHLIP no se insertarán en las membranas celulares en condiciones fisiológicas normales. Sin embargo, tras la inyección en un entorno tumoral, el conjugado pHLIP puede insertarse en la membrana celular de las células tumorales porque el entorno tumoral es más ácido que las condiciones fisiológicas normales. Esta inserción en el ambiente del tumor permite la activación de las células NK en el área del tumor. El uso de pHLIP evita la inserción no deseada en membranas celulares aleatorias.

Se divulgan composiciones que comprenden dos o más conjugados peptídicos autoinsertables en la membrana, en las que los conjugados autoinsertables en la membrana están conjugados con un agente efector de células NK. Cualquiera de los conjugados divulgados autoinsertables en la membrana en el presente documento puede usarse en estas composiciones. Los dos o más conjugados autoinsertables en la membrana pueden tener el mismo agente efector de células NK o uno diferente.

Los péptidos autoinsertables en la membrana se pueden conjugar con un agente efector de células NK de diversas formas. Las técnicas de conjugación son bien conocidas en el arte. En algunos aspectos, los conjugados peptídicos autoinsertables en la membrana pueden ser proteínas de fusión. Las proteínas de fusión se pueden producir en células bacterianas. Las proteínas de fusión pueden consistir en el agente efector de células NK conjugado con una molécula lipofílica tal como un péptido hidrófobo, GPI o Fc humana para anclarse en liposomas o membranas celulares (Hunt, Rath et al., 1997; Kueng, Leb et al. 2007; Paulick, Forstner et al., 2007; Paulick, Wise et al., 2007; Reshetnyak, All et al.. 2007). Los vectores de ADNc para estas proteínas de fusión se pueden ligar en un plásmido de expresión, que permite la expresión en células bacterianas (E. coli), de insectos o de mamíferos. El vector de ADNc puede estar marcado con FLAG o HIS. Las células bacterianas se pueden transfectar usando métodos estándar de transfección de CaCl, tal como el que se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Las células bacterianas se pueden cultivar en medios LB y las células se pueden recolectar y lisar utilizando una prensa francesa. Las proteínas de interés se pueden purificar a partir de lisados mediante cromatografía de afinidad. La proteína A conjugada con palmitato y las proteínas de fusión Fc purificadas se pueden conjugar como se describe en la literatura mezclando 1:2 (p/p) a 4 grados C (véase Kim & Peacock, Journal of Immunological Methods, 14 de enero de 1993; 158(1): 57-65 y Liu et al., Journal of Immunology, 1 de marzo de 2007; 178(5); 3301-3306). A continuación, los conjugados pueden inyectarse directamente por vía intratumoral o pueden incorporarse en liposomas.

Los conjugados peptídicos autoinsertables en la membrana se pueden incorporar en liposomas. Por ejemplo, GPI puede acoplarse con 41BBL, IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, MICA, 2B4 o BCM/SLAMF1 y puede incorporarse en liposomas.

Los liposomas se pueden preparar disolviendo lípidos en cloroformo y evaporando bajo nitrógeno para formar una película. Los liposomas unilaminares pequeños se pueden formar resuspendiendo los lípidos en agua y sonicando con un sonicador de baño. Cualquiera de los conjugados de proteína A/proteína de fusión de A/Fc o proteínas acopladas a GPI se pueden mezclar con liposomas. La inserción de proteínas puede ser tal que la proteína A o el anclaje GPI puedan insertarse en la bicapa lipídica, dejando la proteína estimuladora funcional en la región extracelular. A continuación, los liposomas se pueden PEGilar para aumentar la vida útil. Los liposomas recubiertos de proteínas se pueden usar para la terapia del cáncer mediante expansión ex-vivo de células efectoras inmunes o por inyección intravenosa directa para promover la expansión/activación de células inmunitarias in vivo.

Los tipos de conjugación y los métodos para la conjugación son conocidos en la técnica. El término "conjugado" se refiere al péptido autoinsertable en la membrana que está conjugado, acoplado o unido a otra composición tal como un péptido o una proteína. Por ejemplo, los conjugados de péptidos autoinsertables en la membrana pueden ser proteínas de fusión en las que el péptido autoinsertable en la membrana se conjuga con otra proteína a través de un enlace disulfuro. El acoplamiento o la conjugación pueden significar que existe un enlace químico entre el péptido autoinsertable en la membrana y el agente efector de células NK.

En algunos aspectos, el agente efector de células NK se puede conjugar con péptidos autoinsertables en la membrana o anclajes GPI para autoensamblaje in situ. Por ejemplo, 41-BBL e IL-21 se pueden conjugar en un péptido pHLIP que se inserta por sí mismo en las membranas celulares en condiciones ácidas, lo que permite el anclaje de los ligandos estimuladores en las células cercanas al tumor (Reshetnyak, et al.2006; Andreev, et al. 2007; Reshetnyak, et al. 2007). Los agentes efectores de células NK 41BBL, IL-2, IL-12, IL-15, IL-21 y BCM/SLAMF2 pueden producirse en células bacterianas o adquirirse de fuentes disponibles comercialmente. Los vectores de ADNc para estas proteínas se pueden ligar en el plásmido de expresión pTriEX que permite la expresión en células bacterianas (E. coli), de insectos o de mamíferos. El vector de ADNc puede codificar la expresión de la etiqueta FLAG- o HIS-. Las células bacterianas se pueden transfectar utilizando métodos de transfección de CaCl estándar. Las células bacterianas se pueden cultivar en medios LB. Las células se pueden recolectar y lisar usando una prensa francesa. A continuación, las proteínas de interés se pueden purificar a partir de lisados mediante cromatografía de afinidad.

pHLIP se puede preparar mediante síntesis de péptidos en fase sólida utilizando la química de 9-fluorenilmetiloxicarbonilo y el producto se puede purificar en una columna C18 mediante cromatografía de fase inversa. Luego, pHLIP se puede conjugar con ligandos de proteínas humanas estimulantes mediante la incubación con un agente de entrecruzamiento, tal como benzofenona-4-yodoacetamida. Después de varios lavados, la proteína pHLIP conjugada puede resuspenderse en medios (por ejemplo, solución salina) e inyectarse por vía intratumoral o intravenosa. Basado en evidencia de literatura previa (Imai, Iwamoto et al., 2005; Liu, Breiter et al., 2007; Fujisaki, Kakuda et al., 2009; Somanchi, Senyukov et al., 2011; Denman, Senyukov et al., 2012) y presentó resultados experimentales, la interacción de las células NK con ligandos estimulantes como IL-21 o IL-15 y 41-BBL en la superficie de dichas células tumorales modificadas puede estimular la expansión de las células NK in situ y desencadenar su respuesta citotóxica hacia un tumor. Este tipo de enfoque estimulador se puede utilizar para tratamientos de tumores sólidos como el cáncer de ovario, en el que los ligandos estimulantes de NK que se insertan in situ en las células tumorales bajo pH ácido se pueden inyectar en el espacio intraperitoneal de pacientes con dosis bajas de IL-2 solo o junto con células NK (Geller, Cooley et al. 2011). Existe una fuerte evidencia de que los linfocitos citotóxicos que expresan altos niveles de FCyIIIR (CD16), tal como las células NK, son cruciales para la eficacia de la terapia contra el cáncer con anticuerpos terapéuticos (Kute, Savage et al., 2009; Reim, Dombrowski et al., 2009; Mamessier, Sylvain et al., 2011). Por lo tanto, este enfoque también se puede usar en combinación con anticuerpos terapéuticos.

C. Combinación de vesículas de membrana plasmática y conjugados peptídicos autoinsertables en la membrana

Se divulgan composiciones que comprenden una o más de las vesículas de membrana plasmática divulgadas y uno o más de los conjugados peptídicos autoinsertables en la membrana divulgados. La vesícula de membrana plasmática y el conjugado peptídico autoinsertables en la membrana pueden comprender el mismo agente efector de células NK o diferentes agentes efectores de células NK.

D. Métodos de expansión de células asesinas naturales

Se divulgan métodos para expandir células NK que comprenden administrar a una población celular una cantidad eficaz de una composición que comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende al menos un agente efector de células NK, en el que la población celular comprende células NK.

Se divulgan métodos para expandir células NK que comprenden administrar a una población celular una cantidad eficaz de una composición que comprende un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK, en los que la población celular comprende células NK.

También se divulgan métodos para expandir células NK que comprenden la administración de una composición que comprende una de las vesículas de membrana plasmática descritas y una composición que comprende uno de los conjugados peptídicos divulgados autoinsertables en la membrana. En algunos aspectos, se puede formular una composición para que contenga una o más vesículas de membrana plasmática y uno o más conjugados peptídicos autoinsertables en la membrana.

Las células NK expandidas y/o las composiciones usadas para expandir las células NK se pueden usar como un método de tratamiento para pacientes que tienen cánceres que son susceptibles a la lisis mediada por células NK, así como para pacientes que se han sometido a un trasplante de células madre hematopoyéticas. Las composiciones de expansión de células N^kse pueden usar para aumentar la cantidad de células NK citotóxicas después del trasplante de células madre para aumentar la eliminación de células tumorales residuales y/o para prevenir la recaída. Las composiciones de expansión de células NK también se pueden usar para tratar pacientes con infección viral.

Las composiciones de expansión de células NK pueden usarse como un método de tratamiento posterior a la infusión de células NK para aumentar el número y la persistencia in vivo de células NK citotóxicas para aumentar la eficacia de la terapia con células NK (es decir, el número de pacientes que alcanzan la remisión y/o permanecen en remisión).

Las células NK con o sin composiciones de expansión de células NK se usarán en combinación con anticuerpos terapéuticos para el tratamiento de varios tipos de cáncer, incluidos, pero sin limitarse a, linfomas, cáncer colorrectal, de pulmón, colon, cabeza y cuello y de mama para aumentar el número de pacientes que responden a la terapia de anticuerpos terapéuticos y alcanzan la remisión y/o permanecen en remisión.

1. Células NK en expansión con vesículas de membrana plasmática

Las vesículas de membrana plasmática que comprenden al menos un agente efector de células NK se pueden usar para expandir las células NK in vitro o in vivo. Los métodos de expansión de células NK pueden comprender administrar a una población celular una cantidad eficaz de una composición que comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende al menos un agente efector de células NK.

Los agentes efectores de células NK pueden ser una citoquina, una molécula de adhesión o un agente activador de células NK. Se divulgan métodos para expandir células n K que comprenden administrar a una población celular una cantidad eficaz de una composición que comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende al menos un agente efector de células NK, en los que la población celular comprende células NK, en los que el agente efector de células NK puede ser IL-15, IL-21 o 41BBL. En algunos aspectos, la vesícula de la membrana plasmática puede comprender cualquier combinación de agentes efectores de células NK. Por ejemplo, una vesícula de membrana plasmática puede comprender IL-15 e IL-21; IL-15 y 41BBL; IL-21 y 41BBL; o IL-15, IL-21 y 41BBL. Por lo tanto, una vesícula de membrana plasmática que contenga cualquier combinación de uno o más de lL-15, IL-21 y 41BBL puede usarse para expandir las células NK.

Se divulgan métodos para expandir células NK que comprenden administrar a una población celular una cantidad eficaz de una composición que comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende al menos un agente efector de células NK, en los que la vesícula de membrana plasmática puede purificarse a partir de células alimentadoras de células NK. Las células alimentadoras de células NK pueden ser células mononucleares de sangre periférica (PBMC) autólogas o alogénicas irradiadas, células RPMI8866, HFWT, K562, K562 transfectadas con IL-15 y 41BBL unidos a la membrana, células K562 transfectadas con IL-21 y 41BBL unidos a la membrana, o EBV-LCL. En algunos aspectos, las células alimentadoras de células NK pueden ser células K562 transfectadas con IL-21 y 41BBL unidos a la membrana o células K562 transfectadas con IL-15 y 41BBL unidos a la membrana.

En algunos aspectos, las vesículas de membrana plasmática usadas en los métodos para expandir células NK pueden derivarse de cualquier tipo de célula. La membrana plasmática de cualquier célula puede alterarse para contener los agentes efectores de células NK de interés.

Se divulgan métodos para expandir células NK que comprenden administrar a una población celular una cantidad efectiva de una composición que comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende al menos un agente efector de células NK, en los que una cantidad efectiva de la composición comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende al menos un agente efector de células NK estimula la expansión de las células NK.

Se divulgan métodos para expandir células NK que comprenden administrar a una población celular una cantidad eficaz de una composición que comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende al menos un agente efector de células NK, en los que la administración a una población celular comprende administrar la composición a un sujeto, en los que el sujeto comprende la población celular.

En algunos aspectos de los métodos, las células NK citotóxicas se expanden selectivamente in vivo en presencia de una combinación de agentes efectores de células NK que incluyen, pero sin limitarse a, citoquinas unidas a la membrana, moléculas de adhesión y agentes activadores de células NK. Los agentes efectores de células NK se pueden administrar en forma de vesícula de membrana celular vacía o cargada, liposoma, perla recubierta de membrana celular o perla recubierta de lípidos (Figura 1). Las moléculas que se pueden cargar en las vesículas de la membrana plasmática incluyen, entre otras, IL-2 para la administración local en el sitio de expansión de las células NK, agentes de contraste para la detección para controlar la biodistribución y eliminación, o partículas supermagnéticas para suministrar las partículas a ubicaciones específicas, p. ej., ganglios linfáticos o tumores. Las partículas magnéticas también pueden permitir una rápida eliminación y detección.

2. Células NK en expansión con conjugados peptídicos autoinsertables en la membrana

Se divulgan métodos para expandir células NK que comprenden administrar a una población celular una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos péptidos autoinsertables en la membrana conjugados con un agente efector de células NK, en los que la población celular comprende células NK. Los péptidos autoinsertables en la membrana conjugados con un agente efector de células NK se pueden usar para expandir las células NK. Los conjugados peptídicos autoinsertables en la membrana se pueden administrar como un conjugado peptídico o se pueden usar para hacer una composición tal como liposomas que contienen los conjugados peptídicos autoinsertables en la membrana y luego se pueden administrar los liposomas.

Se divulgan métodos para expandir células NK que comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK, en los que una cantidad eficaz de la composición que comprende un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK estimula la expansión de las células NK.

Se divulgan métodos para expandir células NK que comprenden administrar a una población celular una cantidad eficaz de una composición que comprende un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK, en los que una cantidad eficaz de la composición estimula la expansión de células NK.

Se divulgan métodos para expandir células NK que comprenden administrar a una población celular una cantidad eficaz de una composición que comprende un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK, en los que la composición puede comprender un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con IL-15. En algunos aspectos, la composición puede comprender un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con IL-21. En algunos aspectos, la composición puede comprender un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con 41BBL. En algunos aspectos, el agente efector de células Nk es cualquier citoquina, molécula de adhesión o agente activador de células NK.

Se divulgan métodos para expandir células NK que comprenden administrar a una población celular una cantidad eficaz de una composición que comprende un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK, en los que el péptido autoinsertable en la membrana puede ser Fc humano, GPI, receptor de células T transmembrana, o pHLIP

Se divulgan métodos para expandir células NK que comprenden administrar a una población celular una cantidad eficaz de una composición que comprende un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK en los que la administración a una población celular comprende administrar la composición a un sujeto, en los que el sujeto comprende la población celular.

Se divulgan métodos para expandir células NK que comprenden administrar a una población celular una cantidad eficaz de una composición que comprende un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK, en los que la composición comprende al menos dos conjugados peptídicos autoinsertables en la membrana, en los que los conjugados de péptidos autoinsertables en la membrana se conjugan con un agente efector de células NK. Al menos dos conjugados de péptidos autoinsertables en la membrana pueden conjugarse con los mismos o diferentes agentes efectores de células NK. Por ejemplo, los métodos de expansión de células NK pueden incluir la administración de una composición que comprende un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con una citoquina y un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente activador de células NK. En algunos aspectos, los métodos para expandir las células NK pueden comprender la administración de dos o más composiciones separadas en las que cada composición contiene solo un conjugado de péptido autoinsertable en la membrana.

3. Células NK

Las células NK humanas son un subconjunto de linfocitos de sangre periférica definidos por la expresión de CD56 o CD16 y la ausencia del receptor de células T (CD3) (Ljunggren y Malmberg 2007; Woan y Reddy 2007). Las células NK detectan y eliminan las células diana que carecen de moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I. Los receptores activadores de células NK incluyen, pero sin limitarse a, los receptores de citotoxicidad naturales (NKp30, NKp44 y NKp46) y los receptores de tipo lectina NKG2D y DNAM-1. Sus ligandos se expresan en células estresadas, transformadas o infectadas, pero no en células normales, lo que hace que las células normales sean resistentes a la destrucción de células NK (Bottino, Castriconi et al. 2005; Gasser, Orsulic et al. 2005; Lanier 2005). La activación de las células NK se regula negativamente a través de receptores inhibidores, tales como los receptores similares a inmunoglobina (Ig) asesina (KIR), NKG2A/CD94 y el receptor 1 similar a Ig de leucocitos (LIR-1). La participación de un receptor inhibidor puede ser suficiente para prevenir la lisis de la diana (Bryceson, Ljunggren et al., 2009). Por lo tanto, las células n K se dirigen de manera eficiente a las células diana que expresan muchos ligandos inducidos por estrés y pocos ligandos del MHC de clase I.

Las células NK destruyen eficazmente las células tumorales, las células estresadas y las células infectadas por virus mediante una variedad de métodos diferentes. La primera consiste en involucrar directamente a las células diana, penetrar sus membranas y luego inyectar una proteína que escinde y activa varias proteínas apoptóticas, iniciando así la muerte celular programada (apoptosis) de la célula diana. La superficie de una célula NK también contiene ligandos de proteínas que pueden unirse y activar receptores, tales como el receptor para el ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAIL), en células diana que activan señales internas para muerte celular apoptótica programada. Cuando se estimulan, las células NK también pueden secretar citoquinas tales como INFy y TNFa que no solo inhiben virus y tumores, sino que también señalan la invasión a otras células inmunitarias. Esta actividad anticancerígena amplia y multimodal de las células NK las hace de gran interés para el campo médico.

Debido a que las células NK tienen una función destacada en el sistema inmunitario, la capacidad de expandir las células NK brinda oportunidades de tratamiento que no eran posibles o eran menos eficaces con un bajo número de células NK.

4. La expansión de las células NK ofrece otras opciones para las células NK

Los métodos de expansión de las células NK son beneficiosos para el tratamiento del cáncer, el tratamiento de infecciones virales, el estudio de las células NK, el tratamiento de la esclerosis múltiple, la vigilancia inmunológica y el tratamiento de la enfermedad de injerto contra huésped. Cualquier trastorno relacionado con las células NK puede ser tratado o afectado por la expansión de las células NK. Por ejemplo, enfermedades tales como la esclerosis múltiple que se sabe que tienen un aumento en las células T activadas pueden tratarse con las composiciones divulgadas porque estas composiciones provocan una expansión de las células NK que atacan y destruyen las células T activadas. Por lo tanto, las composiciones divulgadas pueden usarse para disminuir las células T activadas.

E. Métodos para tratar el cáncer

Se divulgan métodos para tratar el cáncer que comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende al menos un agente efector de células NK.

Se divulgan métodos para tratar el cáncer que comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK.

El tratamiento del cáncer con una vesícula de membrana plasmática que comprende al menos un agente efector de células NK o un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK puede ocurrir debido a la expansión de las células NK en presencia de estas composiciones. La expansión de las células NK conduce a más células NK capaces de atacar y matar las células tumorales, reduciendo así las células tumorales y, en última instancia, tratando el cáncer.

La vesícula de membrana plasmática que comprende al menos un agente efector de células NK o un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK puede proporcionar un efecto preventivo. Se sabe que las células NK proporcionan inmunovigilancia. Por lo tanto, la administración de una composición que da como resultado la expansión de las células NK permite que más células NK proporcionen inmunovigilancia y se dirijan y eliminen las células precancerosas antes de que se produzca el cáncer.

En algunos aspectos, la administración a un sujeto puede incluir la administración de las composiciones descritas a una población celular in vitro y luego administrar esas células tratadas a un sujeto.

1. Tratamiento con vesículas de membrana plasmática

Las vesículas de membrana plasmática que comprenden al menos un agente efector de células NK pueden usarse para tratar el cáncer. Los métodos para tratar el cáncer pueden comprender administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende al menos un agente efector de células NK.

Los agentes efectores de células NK pueden ser una citoquina, una molécula de adhesión o un agente activador de células NK. Se divulgan métodos para tratar el cáncer que comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende al menos un agente efector de células NK, en los que el agente efector de células NK puede ser IL-15, IL-21 o 41BBL. En algunos aspectos, la vesícula de la membrana plasmática puede comprender cualquier combinación de agentes efectores de células NK. La membrana plasmática puede comprender dos o más agentes efectores de células NK. En algunos aspectos, al menos un agente efector de células NK puede ser una citoquina. Por ejemplo, una vesícula de membrana plasmática puede comprender IL-15 e IL-21; IL-15 y 41BBL; IL-21 y 41BBL; o IL-15, IL-21 y 41BBL. Por lo tanto, una vesícula de membrana plasmática que contiene cualquier combinación de uno o más de IL-15, IL-21 y 41BBL puede usarse para tratar el cáncer.

En algunos aspectos, las vesículas de membrana plasmática usadas en los métodos para tratar el cáncer pueden derivarse de cualquier tipo de célula. La membrana plasmática de cualquier célula puede alterarse para contener los agentes efectores de células NK de interés.

Se divulgan métodos para tratar el cáncer que comprenden administrar a un sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende al menos un agente efector de células NK, en los que una cantidad efectiva de la composición comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende al menos un agente efector de células NK estimula la expansión de las células NK.

Se divulgan métodos para tratar el cáncer que comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos dos vesículas de membrana plasmática, en los que la vesícula de membrana plasmática comprende al menos un agente efector de células NK. Al menos dos vesículas de membrana plasmática pueden comprender los mismos o diferentes agentes efectores de células NK. Por ejemplo, los métodos para tratar el cáncer pueden incluir la administración de una composición que comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende una citoquina unida a la membrana y una vesícula de membrana plasmática que comprende un agente activador de células NK unido a la membrana. En algunos aspectos, los métodos para tratar el cáncer pueden comprender la administración de dos o más composiciones separadas en las que cada composición contiene solo una vesícula de membrana plasmática.

2. Tratamiento con conjugados peptídicos autoinsertables en la membrana

Los péptidos autoinsertables en la membrana conjugados con un agente efector de células NK se pueden usar para tratar el cáncer. Los conjugados peptídicos autoinsertables en la membrana pueden administrarse como un conjugado peptídico o pueden usarse para hacer una composición tal como liposomas que contienen los conjugados peptídicos autoinsertables en la membrana y luego los liposomas pueden administrarse a un sujeto.

Se divulgan métodos para tratar el cáncer que comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK, en los que una cantidad eficaz de la composición que comprende un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK estimula la expansión de las células NK.

Se divulgan métodos para tratar el cáncer que comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK, en los que la composición puede comprender un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con IL-15. En algunos aspectos, la composición puede comprender un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con IL-21. En algunos aspectos, la composición puede comprender un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con 41BBL. En algunos aspectos, el agente efector de células NK es cualquier citoquina, molécula de adhesión o agente activador de células NK.

Se divulgan métodos para tratar el cáncer que comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK, en los que la composición comprende al menos dos conjugados peptídicos autoinsertables en la membrana, en los que los conjugados peptídicos auto insertables en la membrana se conjugan con un agente efector de células NK. Al menos dos conjugados de péptidos autoinsertables en la membrana pueden conjugarse con los mismos o diferentes agentes efectores de células NK. Por ejemplo, los métodos para tratar el cáncer pueden incluir la administración de una composición que comprende un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con una citoquina y un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente activador de células NK. En algunos aspectos, los métodos para tratar el cáncer pueden comprender la administración de dos o más composiciones separadas en los que cada composición contiene solo un conjugado de péptido autoinsertable en la membrana.

3. Tratamientos combinados

Los métodos para tratar el cáncer que comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende al menos un agente efector de células NK o un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK se pueden combinar con otros tratamientos contra el cáncer. Por ejemplo, los métodos pueden comprender administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende al menos un agente efector de células NK o un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK y un agente terapéutico contra el cáncer.

En algunos aspectos, el agente terapéutico contra el cáncer y la vesícula de membrana plasmática se pueden formular en la misma composición. En algunos aspectos, el agente terapéutico contra el cáncer y la vesícula de membrana plasmática se pueden formular en diferentes composiciones.

La composición que comprende una vesícula de membrana plasmática que comprende al menos un agente efector de células NK y el agente terapéutico contra el cáncer puede administrarse simultáneamente o en momentos diferentes.

Los agentes terapéuticos contra el cáncer que se pueden administrar en combinación con la vesícula de membrana plasmática que comprende al menos un agente efector de células NK pueden ser cualquier agente terapéutico contra el cáncer conocido, incluidos, pero sin limitarse a, quimioterapéuticos e inmunoterapéuticos, tales como, pero sin limitarse a, anticuerpos y citoquinas.

F. Métodos de modulación del sistema inmunológico

Se divulgan métodos para modular el sistema inmunitario que comprenden administrar a un sujeto una o más composiciones, en los que las composiciones comprenden al menos una vesícula de membrana plasmática que comprende un agente efector de células NK o al menos un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK. En algunos aspectos, una o más composiciones contienen una combinación de vesículas de membrana plasmática y conjugados peptídicos autoinsertables en la membrana.

Se divulgan métodos para modular el sistema inmunitario que comprenden administrar a un sujeto una o más composiciones, en los que las composiciones comprenden al menos una vesícula de membrana plasmática que comprende un agente efector de células NK o al menos un péptido autoinsertable en la membrana conjugado con un agente efector de células NK, en los que modular el sistema inmunitario comprende reducir el número de células T activadas, expandir el número de células NK, reducir el número de células dendríticas o una combinación de los mismos.

G. Tratamientos combinados

Se divulgan métodos para tratar el cáncer, las infecciones virales, la esclerosis múltiple y la enfermedad de injerto contra huésped que comprenden administrar a un sujeto una de las composiciones divulgadas en combinación con un agente terapéutico conocido para la enfermedad o trastorno que se está tratando. Por ejemplo, se divulgan métodos para tratar el cáncer que comprenden administrar a un sujeto una vesícula de membrana plasmática que comprende un agente efector de células NK en combinación con un agente terapéutico conocido contra el cáncer tal como, pero sin limitarse a, un agente quimioterapéutico, inmunoterapéutico, de radioterapia o terapéutico para el dolor.

Durante los tratamientos combinados, la vesícula de la membrana plasmática o los conjugados peptídicos autoinsertables en la membrana divulgados en el presente documento pueden administrarse al mismo tiempo que el agente terapéutico conocido para la enfermedad o trastorno que se está tratando. En algunos aspectos, se administran conjugados de péptido autoinsertable de membrana o vesícula de membrana plasmática , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 días antes o después del agente terapéuticamente conocido para la enfermedad o trastorno que se está tratando. En algunos aspectos, la vesícula de membrana plasmática o los conjugados de péptidos autoinsertables en la membrana se administran 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses antes o después del agente terapéutico conocido para el enfermedad o trastorno a tratar.

H. Administración

Las composiciones divulgadas se pueden administrar in vitro o in vivo. En algunos aspectos, los métodos incluyen una combinación de administración in vitro e in vivo. Las composiciones se pueden administrar in vivo en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por "farmacéuticamente aceptable" se entiende un material que no es indeseable desde el punto de vista biológico o de otro tipo, es decir, el material se puede administrar a un sujeto, junto con la vesícula de membrana plasmática o el conjugado de péptido autoinsertable en la membrana, sin causar efectos biológicos indeseables o interacción de forma nociva con cualquiera de los demás componentes de la composición farmacéutica en la que está contenido. El vehículo se seleccionaría naturalmente para minimizar cualquier degradación del ingrediente activo y para minimizar cualquier efecto secundario adverso en el sujeto, como sería bien conocido por un experto en la técnica.

Las composiciones se pueden administrar por vía oral, parenteral (p. ej., intravenosa), por inyección intramuscular, por inyección intraperitoneal, por inyección intratumoral, por vía transdérmica, extracorpórea, tópica o similar, incluida la administración tópica intranasal o la administración por inhalación. Tal como se usa en el presente documento, "administración intranasal tópica" significa la administración de las composiciones en la nariz y las fosas nasales a través de una o ambas narinas y puede comprender la administración mediante un mecanismo de atomización o un mecanismo de gotitas, o mediante la aerosolización de las vesículas de la membrana plasmática. La administración de las composiciones por inhalación puede ser a través de la nariz o la boca a través de un mecanismo de atomización o gotitas. El suministro también puede ser directamente a cualquier área del sistema respiratorio (p. ej., pulmones) mediante intubación. La cantidad exacta de las composiciones requeridas variará de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, edad, peso y estado general del sujeto, la gravedad del trastorno que se está tratando, la composición particular utilizada, su modo de administración y similares. Por lo tanto, no es posible especificar una cantidad exacta para cada composición. Sin embargo, un experto normal en la técnica puede determinar una cantidad apropiada usando solo experimentación de rutina dadas las enseñanzas de este documento.

I. Portadores farmacéuticamente aceptables

Las composiciones se pueden usar terapéuticamente en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los vehículos adecuados y sus formulaciones se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (decimonovena edición) ed. A. R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, Pa. 1995. Típicamente, se usa una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable en la formulación para hacer que la formulación sea isotónica. Los ejemplos del vehículo farmacéuticamente aceptable incluyen, pero no se limitan a, solución salina, solución de Ringer y solución de dextrosa. El pH de la solución es preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 8, y más preferiblemente de aproximadamente 7 a aproximadamente 7.5. Otros vehículos incluyen preparaciones de liberación sostenida tales como matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas, liposomas o micropartículas. Será evidente para los expertos en la técnica que ciertos vehículos pueden ser más preferibles dependiendo, por ejemplo, de la vía de administración y la concentración de la composición que se administre.

Los vehículos farmacéuticos son conocidos por los expertos en la técnica. Normalmente, estos serían vehículos estándar para la administración de fármacos a seres humanos, incluidas soluciones tales como agua estéril, solución salina y soluciones tamponadas a pH fisiológico. Las composiciones se pueden administrar por vía intramuscular o subcutánea. Otros compuestos se administrarán de acuerdo con los procedimientos estándar utilizados por los expertos en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas pueden incluir vehículos, espesantes, diluyentes, tampones, conservantes, agentes tensioactivos y similares, además de la molécula elegida. Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir uno o más ingredientes activos tales como agentes antimicrobianos, agentes antiinflamatorios, anestésicos y similares.

La composición farmacéutica se puede administrar de varias formas dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico y del área a tratar. La administración puede ser tópica (incluyendo oftálmica, vaginal, rectal, intranasal), oral, por inhalación o parenteral, por ejemplo, por goteo intravenoso, inyección subcutánea, intraperitoneal o intramuscular. Los anticuerpos divulgados pueden administrarse por vía intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intracavitaria o transdérmica.

Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Ejemplos de disolventes no acuosos son el propilenglicol, el polietilenglicol, los aceites vegetales tales como el aceite de oliva y los ésteres orgánicos inyectables tales como el oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluidos medios salinos y tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, solución de Ringer lactada o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer) y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares.

Las formulaciones para administración tópica pueden incluir ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, líquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables vehículos farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesantes y similares.

Las composiciones para administración oral incluyen polvos o gránulos, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, bolsitas o tabletas. Pueden ser deseables espesantes, saborizantes, diluyentes, emulsionantes, auxiliares de dispersión o aglutinantes.

Algunas de las composiciones pueden administrarse potencialmente como una sal de adición de ácido o base farmacéuticamente aceptable, formada por reacción con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido perclórico, ácido nítrico, ácido tiociánico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico y ácidos orgánicos tales como ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico y ácido fumárico, o por reacción con una base inorgánica tal como hidróxido de sodio, hidróxido de amonio, hidróxido de potasio y bases orgánicas tales como mono, di, trialquilo y arilaminas y etanolaminas sustituidas.

I. Dispositivos

Se divulgan dispositivos que comprenden una vesícula de membrana plasmática que comprende un agente efector de células NK. Por ejemplo, un recipiente usado durante la aféresis puede comprender vesículas de membrana plasmática que comprenden agentes efectores de células NK. Por lo tanto, durante la aféresis, las células que pasan a través del recipiente pueden incubarse o ponerse en contacto con las vesículas de la membrana plasmática, lo que permite la estimulación de las células NK y, en última instancia, la expansión de las células NK.

J. Kits

Los materiales descritos anteriormente, así como otros materiales, pueden empaquetarse juntos en cualquier combinación adecuada como un kit útil para realizar o ayudar en la realización del método divulgado. Es útil si los componentes del kit en un kit determinado están diseñados y adaptados para su uso conjunto en el método divulgado. Por ejemplo, se divulgan kits para preparar los conjugados de péptidos autoinsertables en la membrana, comprendiendo el kit péptidos autoinsertables en la membrana. Los kits también pueden contener reactivos usados para acoplar o conjugar el péptido autoinsertable en la membrana con un agente efector de células NK.

Los kits divulgados también pueden incluir efectores de células NK o agentes de expansión. Los kits pueden contener además componentes para preparar membranas plasmáticas o liposomas. Se pueden proporcionar nanopartículas y micropartículas en los kits.

K. Definiciones

Debe señalarse que tal como se usa en este documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen una referencia en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una vesícula de membrana plasmática" incluye una pluralidad de tales vesículas de membrana plasmática, la referencia al "agente efector de células NK" es una referencia a uno o más agentes efectores de células N^ky sus equivalentes conocidos por los expertos en el arte, etc.

"Vesícula de membrana plasmática" se refiere a una preparación de una membrana plasmática a partir de una célula o una membrana plasmática o liposoma fabricados artificialmente.

Los "péptidos autoinsertables en la membrana" son péptidos que son capaces de insertarse o anclarse a una membrana celular.

Los "conjugados de péptidos autoinsertables en la membrana" son péptidos autoinsertables en la membrana conjugados o acoplados a un agente efector de células NK.

Los "agentes efectores de células NK" son agentes que provocan la proliferación, estimulación, adhesión o activación de células NK. Los agentes efectores de células NK pueden ser citoquinas, moléculas de adhesión o agentes activadores de células NK.

"Agente activador de células NK" se refiere a ligandos estimulantes que se unen a receptores activadores presentes en la superficie de las células NK.

"Modular" o "modulación" como se usa en el presente documento se refiere a un aumento o disminución. La modulación da como resultado cualquier diferencia en comparación con la función inmune normal. Por lo tanto, la modulación del sistema inmunitario se refiere a aumentar o disminuir las células inmunitarias.

"Opcional" u "opcionalmente" significa que el evento, circunstancia o material descrito posteriormente puede o no ocurrir o estar presente, y que la descripción incluye instancias en las que el evento, circunstancia o material ocurre o está presente y las instancias en las que no ocurre o no está presente.

Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a cualquier organismo al que se pueden administrar las composiciones divulgadas, por ejemplo, con fines experimentales, de diagnóstico y/o terapéuticos. Los sujetos típicos incluyen animales (p. ej., mamíferos tales como primates no humanos y humanos; aves; animales domésticos o de granja tales como gatos, perros, ovejas, cabras, vacas, caballos y cerdos; animales de laboratorio tales como ratones, ratas y cobayas; conejos, peces, reptiles, animales de zoológico y salvajes). Típicamente, los "sujetos" son animales, incluidos mamíferos tales como seres humanos y primates; y similares. Sujetos también pueden referirse a una célula o una línea celular.

Los intervalos pueden expresarse en este documento como desde "aproximadamente" un valor particular, y/o hasta "aproximadamente" otro valor particular. Cuando se expresa tal intervalo, también se contempla específicamente y se considera divulgado el intervalo desde un valor particular y/o hasta otro valor particular a menos que el contexto indique específicamente lo contrario. De manera similar, cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del antecedente "aproximadamente", se entenderá que el valor particular forma otra realización específicamente contemplada que debe considerarse divulgada a menos que el contexto específicamente indique lo contrario. Se entenderá además que los extremos de cada uno de los intervalos son significativos tanto en relación con el otro extremo como independientemente del otro extremo a menos que el contexto indique específicamente lo contrario. Finalmente, debe entenderse que todos los valores individuales y subintervalos de valores contenidos dentro de un intervalo divulgado explícitamente también se contemplan específicamente y deben considerarse divulgados a menos que el contexto indique específicamente lo contrario. Lo anterior se aplica independientemente de si en casos particulares algunas o todas estas realizaciones se divulgan explícitamente.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen los mismos significados que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenecen el método y las composiciones divulgadas. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en este documento puede usarse en la práctica o prueba del presente método y composiciones, los métodos, dispositivos y materiales particularmente útiles son como se describen. No se admite que ninguna referencia constituya estado de la técnica. La discusión de las referencias establece lo que afirman sus autores, y los solicitantes se reservan el derecho de cuestionar la exactitud y pertinencia de los documentos citados. Se entenderá claramente que, aunque en este documento se hace referencia a una serie de publicaciones, dicha referencia no constituye una admisión de que cualquiera de estos documentos forme parte del conocimiento general común en el arte.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones de esta memoria descriptiva, la palabra "comprende" y las variaciones de la palabra, tales como "que comprende", significa "que incluye pero no se limita a" y no pretende excluir, por ejemplo, otros aditivos, componentes, enteros o etapas. En particular, en los métodos declarados que comprenden una o más etapas u operaciones, se contempla específicamente que cada etapa comprenda lo que se enumera (a menos que esa etapa incluya un término limitante tal como "que consta de"), lo que significa que cada etapa no pretende excluir, por ejemplo, otros aditivos, componentes, números enteros o etapas que no se enumeran en la etapa.

Se divulgan materiales, composiciones y componentes que se pueden usar para, se pueden usar junto con, se pueden usar en preparación para, o son productos del método y las composiciones divulgadas. Estos y otros materiales se divulgan en este documento, y se entiende que cuando se divulgan combinaciones, subconjuntos, interacciones, grupos, etc. de estos materiales, si bien es posible que no se divulgue explícitamente la referencia específica de cada una de las diversas combinaciones individuales y colectivas y la permutación de estos compuestos, cada uno está específicamente contemplado y descrito en este documento. Por ejemplo, si se describe y analiza un conjugado de péptido autoinsertable en la membrana y se analizan varias modificaciones que se pueden realizar en varias moléculas, incluido el conjugado de péptido autoinsertable en la membrana, cada una de ellas se contempla y describe en el presente documento. Por ejemplo, si se describe y analiza un conjugado peptídico autoinsertable en la membrana y se analizan varias modificaciones que se pueden realizar en varias moléculas, incluido el conjugado peptídico autoinsertable en la membrana, todas y cada una de las combinaciones y permutaciones del conjugado peptídico autoinsertable en la membrana y las modificaciones que son posibles se contemplan específicamente a menos que se indique específicamente lo contrario. Por lo tanto, si se divulga una clase de moléculas A, B y C, así como una clase de moléculas D, E y F, y se divulga un ejemplo de una combinación de molécula, A-D, incluso si cada una de ellas no se cita individualmente, cada una se contempla individual y colectivamente. Por lo tanto, en este ejemplo, cada una de las combinaciones A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E y C-F se contemplan específicamente y deben considerarse divulgadas a partir de la divulgación de A, B y C; D, E y F; y el ejemplo de combinación A-D. Asimismo, cualquier subconjunto o combinación de estos también se contempla y divulga específicamente. Así, por ejemplo, el subgrupo de A-E, B-F y C-E se contempla específicamente y debe considerarse divulgado a partir de la divulgación de A, B y C; D, E y F; y el ejemplo de combinación A-D. Este concepto se aplica a todos los aspectos de esta solicitud, incluidos, pero sin limitarse a, las etapas en los métodos de preparación y uso de las composiciones divulgadas. Por lo tanto, si hay una variedad de etapas adicionales que se pueden realizar, se entiende que cada una de estos etapas adicionales se puede realizar con cualquier realización específica o combinación de realizaciones de los métodos divulgados, y que cada combinación de este tipo se contempla específicamente y debe ser considerado divulgado.

Ejemplos

A. Ejemplo 1: Generación in vivo de células asesinas naturales citotóxicas y métodos asociados de tratamiento del cáncer

La expansión de las células NK puede ocurrir mediante el uso de vesículas de membrana derivadas de células estimuladoras. Se seleccionaron células estimuladoras K562-mb15-41BBL y K562-mb21-41BBL para la generación de vesículas de membrana plasmática (PM) porque se informó que estas células expanden las células NK de manera muy robusta y no requieren el aislamiento de células NK de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) antes de iniciar el cultivo. Además, la presencia de ligandos estimulantes 41BBL y mbIL15 o mbIL21 se puede rastrear fácilmente mediante la tinción de anticuerpos para confirmar la expresión de estas moléculas en las células alimentadoras y su presencia en vesículas de membrana aisladas, así como en micropartículas recubiertas de membrana. Se probó si las partículas que consisten en vesículas de membrana purificadas derivadas de células estimuladoras soportan o no la expansión de las células NK de manera similar a como lo hacen las células estimuladoras. Cuando las PBMC se expusieron en cultivo a 50 U/mL de IL-2 y concentraciones crecientes de vesículas de PMmb15-41BBL o PM-mb21-41BBL durante un período de 10 días, el contenido de células NK en la mezcla de PBMC aumentó proporcionalmente a la concentración de PM utilizada (Figuras 3 y 4). A la concentración más alta de 200 pg/mL de proteínas de membrana plasmática analizadas, el contenido de células NK resultante fue del 70 % y 82 % en presencia de PM-mb15-41BBL o PM-mb21-41BBL, respectivamente. A modo de comparación, las células NK comprendían solo el 22 % del contenido celular de los cultivos que se expusieron únicamente a IL-2. Además, el número total de células NK aumentó en los cultivos expuestos a vesículas de PM y el aumento fue proporcional a la concentración de PM utilizada. Por lo tanto, la expansión de las células NK fue mayor en los cultivos que recibieron IL-2 con 200 pg/mL de proteínas de membrana plasmática donde las células NK se expandieron 24 y 22 veces durante 14 días en presencia de vesículas de PM-mb21-41BBL o PM-mb15-41BBL respectivamente, mientras que no se observó expansión en el cultivo de control (Figura 5). Por lo tanto, tanto el nivel de expansión como el contenido de células NK en el cultivo fueron directamente proporcionales a la concentración de partículas de membrana utilizadas (Figuras 3, 4 y 5). Aunque el nivel de expansión en presencia de partículas PM fue menor que el observado en los cultivos de control donde las células NK se expandieron 88 y 150 veces en presencia de K562-mb15-41BBL y K562-mb21-41BBL vivas, respectivamente, esta expansión es suficiente para generar las dosis requeridas para aplicaciones clínicas. Por lo tanto, estos experimentos indican que las células NK pueden expandirse selectivamente dentro de la mezcla de PBMC usando partículas que consisten en vesículas de membrana plasmática purificada con ligandos estimulantes sin alimentadores.

Células NK expandidas mediante cultivo durante 14 días con 200 pg/mL de vesículas de membrana PM-mb15-41BBL o PM-mb21-41BBL se analizaron para determinar su función citotóxica en una proporción de 1:1 (E:T) contra la línea de células de leucemia mieloide crónica (CML) K562 y líneas celulares de leucemia mieloide aguda (AML) KG1 y HL-60. El nivel de citotoxicidad se comparó con las células NK cultivadas con células alimentadoras vivas K562-mb15-41BBL o K562-mb21-41BBL (Figura 6). Las células NK estimuladas con PM-mb15-41BBL y PM-mb21-41BBL mataron el 60 y el 78 % de las células diana K562, el 44 % y el 54 % de las células KG1 y el 9 y el 15 % de las HL-60, respectivamente. Estos niveles de respuesta citotóxica observados con células NK estimuladas con PM fueron solo ligeramente inferiores a los observados con células NK cultivadas durante 14 días utilizando las líneas celulares alimentadoras K562-mb15-41BBL o K562-mb21-41BBL vivas. Estos resultados indican que las células NK expandidas usando PMmb15-41BBL son citotóxicas frente a dianas de leucemia mieloide aguda y, por lo tanto, son adecuadas para aplicaciones terapéuticas en el tratamiento del cáncer.

Juntos, estos resultados indican que las células NK pueden expandirse selectivamente dentro de la mezcla de células de PBMC utilizando vesículas de membrana que contienen ligandos estimulantes y en ausencia de células alimentadoras. Estas células son citotóxicas frente a varias dianas derivadas de la leucemia. Este método de expansión es adecuado tanto para la expansión in vitro como in vivo de células NK para aplicaciones clínicas. La idoneidad de las partículas de membrana para su uso en expansión in vivo se demuestra por el aumento del número de células NK en pacientes tratados con exosomas derivados de células dendríticas (Dex), vacuna contra el cáncer, partículas de membrana secretadas naturalmente por las células dendríticas y otras células inmunitarias (Viaud, Terme et al. 2009).

La Figura 7 muestra la generación de partículas de látex recubiertas con membranas de PM-mb15-41BBL. La Figura 7 representa histogramas que muestran IL15-FITC (arriba) y 41BBL-PE (abajo). Se recubrieron perlas de látex (izquierda) o sílice C18 (derecha) con membrana plasmática K562mb15 que contenía IL-15 y 41BBL unidos a la membrana. Tanto el látex como la perla de sílice C18 mostraron presencia de IL-15 y 41BBL después del recubrimiento (Isotipo en gris). Para preparar las partículas de látex recubiertas con membrana, se usaron vesículas de membrana plasmática purificadas como se describe y que contenían las moléculas estimuladoras 41BBL y mbIL15 y se incluyeron en micropartículas de látex de 5 micrómetros usando un protocolo previamente establecido. Se resuspendieron microesferas de látex de poliestireno sulfato (Inerfacial Dynamics) en PBS, se lavaron y se contaron en un hemocitómetro. Para recubrir las perlas, se añadió una parte alícuota de la suspensión de perlas a la solución de membrana PM-mb15-41BBL mientras se sonicaba la suspensión. La solución de membrana de perlas se colocó en un rotador a 4 grados °C durante 2 horas. Las perlas se centrifugaron y lavaron tres veces. Las perlas se marcaron con anticuerpos y se analizaron mediante citometría de flujo para confirmar la presencia de proteínas estimulantes en la superficie de las perlas (paneles de la izquierda). Las perlas recubiertas con membrana mostraron una tinción positiva tanto para IL-15 como para 41BBL y una tinción de fondo baja con anticuerpos de control de isotipo. Se recubrieron perlas de sílice C18 con PM-mb15-41BBL de manera similar. De nuevo, la presencia de moléculas estimulantes se confirmó mediante tinción de anticuerpos (paneles de la derecha). Estos resultados indican que se pueden generar partículas recubiertas con membranas celulares que contienen moléculas estimulantes.

La Figura 8 representa los desechos encontrados en cultivos después de la expansión de células NK. a) FSC frente a SSC de PBMC (rojo) junto con membrana plasmática en el día 10 de cultivo. b) FSC frente a SSC de PBMC (rojo) junto con restos de células alimentadoras K562mb15 (verde). Las figuras superior e inferior representan cultivos separados en el día 10. La figura superior tiene significativamente más restos de células alimentadoras que la figura inferior.

1. Materiales y métodos

Se utilizaron las líneas celulares K562-mb15-41BBL y K562-mb21-41BBL (K562-clone9.mbIL21). Las líneas celulares K562, KG1 y HL-60 utilizadas en los ensayos de citotoxicidad se adquirieron de la American Tissue Culture Collection (ATCC).

Los análisis se realizaron con los siguientes anticuerpos monoclonales de ratón: CD56-PE (Miltenyi Biotech), CD3-APC, CD16-FITC (Beckman Coulter), CD19-PECy7, 41BBL-PE (BD Biosciences) y 41BBL (R&D).

Otros reactivos y kits utilizados incluyen perlas de látex de sulfato (5 pm; Invitrogen), perlas de sílice C18 (10 pm; Sorbtec), medio RPMI (Thermo Scientific), medio CellGro (Cellgenix), suero bovino fetal (Invitrogen), IL-2 ( Peprotec), Glutamax (Invitrogen). La preparación de vesículas de membrana plasmática PM-mb15-41BBL y PM-mb21-41BBL se realizó como sigue. K562-mb15-41BBL y K562-mb21-41BBL se cultivaron en medio RPMI complementado con FBS al 10 % y el cultivo se amplió hasta 1 litro. Las células se recogieron mediante centrifugación a 1000xg, se lavaron con PBS frío con EDTA 10 mM y se resuspendieron en tampón de lisis (HEPES 50 mM, pH 7.4, cóctel inhibidor de proteasa). Las células se rompieron con el homogeneizador Dounce y la solución se centrifugó a 300xg durante 15 minutos para eliminar las células enteras restantes. Las membranas plasmáticas crudas se separaron de los componentes citosólicos por centrifugación durante 30 min a 4 °C (30000 rpm, 50Ti). Las membranas crudas se resuspendieron en tampón de lisis y se purificaron adicionalmente usando un gradiente de densidad de sacarosa para producir vesículas de membrana plasmática pura, denominadas PM-mb15-41BBL o PM-mb21-41BBL. Se usó un ensayo BCA para determinar la concentración de proteína de membrana mientras que la cantidad de ligando 41-BBL estimulador se determinó mediante transferencia Western.

La expansión de células NK dentro de la mezcla de PBMC se probó en presencia de concentraciones crecientes de partículas de membrana PM-mb15-41BBL o PM-mb21-41BBL. Las cantidades utilizadas fueron 40, 80 y 200 pg de proteína de membrana por 1 mL de cultivo que para el cultivo de PM-mb15-41BBL correspondió a 16, 32, 80 ng de proteína 41-BBL por mL de cultivo. Las PBMC aisladas de sangre mediante gradiente de densidad de Ficol-Paque se cultivaron en medio SCGM Cell Gro complementado con FBS al 10 % y 10 o 50 U/mL de IL-2 y concentraciones crecientes de partículas de membrana. Las células se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2. A partir del día 5, los medios de cultivo se cambiaron cada dos días reemplazando la mitad de los medios con medios frescos y reemplazando la cantidad de membrana eliminada mediante el reemplazo de medios. Las células se contaron cada dos días y el contenido del cultivo se verificó los días 7, 10 y 14.

Los ensayos de citotoxicidad se realizaron como sigue. Las líneas de células diana derivadas de la leucemia K562, KG1, HR-60R se marcaron con TFL4 (Oncoimmunin) o CellTrace Far Red (CTFR; Invitrogen), un marcador fluorescente rojo lejano para el marcaje celular a largo plazo, antes de la adición de células NK efectoras. Las células se lavaron dos veces con tampón PBS con BSA al 1%.

A continuación, las células diana se coincubaron con diversas cantidades de células NK durante 90 minutos a 37 °C en una atmósfera humidificada de Aire/CO295/5%. Al final de la incubación conjunta, las células se transfirieron a tubos, se colocaron en hielo y se cargaron con sustrato de caspasa/granzima (kit Pantoxilux, OncoImmunin) y se marcaron con anticuerpos contra antígenos de superficie. Las células se analizaron inmediatamente por citometría de flujo (BD FACS Canto-II). La muerte celular inducida por las células NK se detectó utilizando un sustrato de caspasa/granzima fluorogénico permeable a las células (OncoImmunin). La escisión de este sustrato por la granzima, liberada en la célula diana tras la interacción con las células NK, y la caspasa secuencia abajo produce una fluorescencia verde dentro de las células diana moribundas.

B. Ejemplo 2: Optimización de vesículas de membrana plasmática para expandir células NK

1. Resumen

Se han optimizado métodos para preparar vesículas de membrana plasmática, así como métodos para aumentar el nivel de expansión de las células Nk en presencia de las vesículas. Se determinó que las células n K expandidas con estos métodos eliminaban las células leucémicas primarias de los pacientes. El procedimiento se amplió para el cultivo de células K562-mb15-41BBL y se optimizó la preparación de vesículas de membrana plasmática (PM) al romper las células mediante el método de cavitación con nitrógeno. Las vesículas de membrana plasmática optimizadas eran más homogéneas y tenían niveles más altos de ligando estimulador 41BBL. En las pruebas de expansión de células NK con PBMC derivadas de donantes sanos (n=3) como material de partida, las vesículas de PM optimizadas superaron a las preparaciones anteriores de PM en la estimulación del crecimiento de células NK y produjeron niveles de expansión selectiva de células NK comparables a los alcanzados con células alimentadoras K562-mb15-41BBL vivas. La expresión en la superficie de las células NK de una multitud de marcadores de superficie con relevancia para la función de las células NK se determinó en el material de partida, así como en las células NK expandidas en presencia de vesículas de PM o células alimentadoras vivas. El análisis inicial indicó que las células NK expandidas con PM tienen un fenotipo activado similar a las expandidas con células alimentadoras K562-mb15-41BBL vivas pero significativamente alteradas con respecto al fenotipo en estado de reposo medido con células recién aisladas de sangre periférica. La función de las células NK recién aisladas y expandidas se probó midiendo los niveles de citotoxicidad frente a líneas celulares de leucemia (K562, KG1, HL-60, BDCM) y blastos de leucemia primaria (de 3 muestras de AML de pacientes diferentes) en proporciones variables de efector a diana. Los datos indican que las células NK expandidas por estimulación con vesículas de PM-mb15-41BBL matan líneas celulares y células primarias de AML y lo hacen de manera más eficiente que las células NK recién aisladas. Se realizaron pruebas in vivo en NSG de la expansión de células NK con PM y se encontró que las células NK se pueden expandir directamente in vivo en el animal con dosis seriadas de vesículas de PM.

2. Resultados

La expansión de NK se probó a partir de cuatro donantes sanos diferentes utilizando vesículas de PM-mb15-41-BBL de las preparaciones optimizadas de membrana plasmática. La vesícula de PMmb15-41-BBL optimizada expande de manera eficiente y selectiva las células NK dentro de la mezcla de PBMC y el contenido de células NK aumentó con las cantidades crecientes de vesículas de PM (Figuras 9, 10 y 11). El número de células NK aumentó en promedio 293 veces (intervalo 104-557) después de 12-13 días de cultivo en presencia de vesículas de PM optimizadas y 173 veces (79-895) en presencia de células alimentadoras vivas (Figura 12). Esto representa una mejora significativa en los niveles de expansión de células NK alcanzados con la vesícula PM optimizada con respecto a las preparaciones iniciales (233 frente a 23 respectivamente). La tasa de crecimiento de las células NK estimuladas con vesículas de PM cambia durante el período de tiempo de cultivo de 28 días y la fase exponencial se produce entre los días 5 y 14 de cultivo, después de lo cual el crecimiento se ralentiza (Figura 13). Se ha logrado un progreso significativo en el acceso a la citotoxicidad de las células NK que se expandieron usando vesículas de PM. Las células NK se expandieron usando vesículas de PM-mb15-41-BBL optimizadas que mataron todas las líneas de células diana de leucemia probadas tan eficientemente como las células NK se expandieron usando células alimentadoras K562-mb15-41-BBL vivas (Figura 14) y fueron significativamente más citotóxicas en comparación con células NK recientemente aisladas (Figura 15). Además, las células NK se expandieron con la vesícula PM y eliminaron de manera eficiente los blastos de AML CD34+ derivados del paciente, al mismo tiempo que conservaron las células CD34- sanas (Figura 16). En un modelo animal de ratón NSG humanizado, las células NK se preincubaron durante 7 días con vesícula PM-mb15-41-BBL y se inyectaron en forma ivy se estimularon adicionalmente con vesícula PM-mb15-41-BBL administrada en forma iv3 veces por semana (lunes, miércoles y viernes) junto con dosis bajas de IL-2 aumentó en 15-20 veces en un período de 3 días (Figura 17), mientras que las células de control se expandieron en condiciones de cultivo óptimas y se gastaron solo 8 veces durante el mismo período de tiempo.

Se entiende que el método y las composiciones divulgados no se limitan a la metodología, los protocolos y los reactivos particulares descritos, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente, y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Los expertos en la técnica reconocerán, o podrán determinar utilizando no más que experimentación de rutina, muchos equivalentes a las realizaciones específicas del método y las composiciones descritas en el presente documento. Dichos equivalentes están destinados a ser abarcados por las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende una vesícula de membrana plasmática purificada a partir de células alimentadoras de células N^k, en la que las células alimentadoras de células ⁿK son células mononucleares de sangre periférica (PB-MC) autólogas o alogénicas irradiadas, RPMI8866, HFWT, K562 o EBV-LCL, en la que la vesícula de membrana plasmática comprende al menos un agente efector de células NK, y en la que al menos un agente efector de células NK es IL-21 o IL-15.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que la vesícula de membrana plasmática comprende además al menos un agente efector de células NK adicional, en la que al menos un agente efector de células NK adicional se selecciona de una citoquina, una molécula de adhesión y un agente activador de células NK.

3. La composición de la reivindicación 2, en la que al menos un agente efector de células NK adicional se selecciona de IL-2, 41BBL, IL-12, IL-18, MICA, 2B4, LFA-1 y BCM1/SLAMF2.

4. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, en la que al menos un agente efector de células NK es IL21 y la vesícula de membrana plasmática comprende además al menos uno o dos agentes efectores de células NK adicionales seleccionados entre IL-15 y 41BBL.

5. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que al menos un agente efector de células NK es IL-15 y la vesícula de membrana plasmática comprende además 41BBL como al menos un agente efector de células NK adicional.

6. La composición de la reivindicación 4, en la que la vesícula de la membrana plasmática comprende IL-21 y 41BBL unidos a la membrana.

7. La composición de la reivindicación 6, en la que las células alimentadoras son células K562 transfectadas con IL-21 y 41BBL unidos a la membrana.

8. Uso de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 7 para la estimulación o expansión de células NK en una población de células NK in vitro, administrando la composición a la población de células NK in vitro.

9. Un método para producir una población de células NK expandidas que comprende poner en contacto una primera población de células NK in vitro con la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 7.

10. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 7 para uso en el tratamiento de cáncer, infecciones virales, enfermedad de injerto contra huésped o esclerosis múltiple.

11. La composición para uso de la reivindicación 10, en la que el uso es el tratamiento del cáncer y en la que la composición se administra en combinación con al menos un agente terapéutico contra el cáncer.

12. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que la vesícula de la membrana plasmática rodea una micropartícula.