ES2942212B2 - Composicion farmaceutica que comprende un extracto procedente de la grasa de jamon de cerdo como principio activo y su uso en medicina para la prevencion de enfermedad cardiovascular e inflamacion intestinal - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA QUE COMPRENDE UN EXTRACTO

PROCEDENTE DE LA GRASA DE JAMÓN DE CERDO COMO PRINCIPIO ACTIVO

Y SU USO EN MEDICINA PARA LA PREVENCIÓN DE ENFERMEDAD

CARDIOVACULAR E INFLAMACIÓN INTESTINAL

Sector técnico de la invención

La invención se encuadra en el ámbito de la industria farmacéutica. Trata específicamente de formulaciones con un uso médico que provienen del campo de la alimentación, y que están compuestas exclusivamente de ingredientes naturales, a base de grasa de cerdo. La grasa puede ser de cualquier cerdo, aunque de manera más preferida es un cerdo ibérico(sus scrofa mediterránea),preferiblemente alimentado de bellotas y pasto (hierba), engorde conocido como montanera, pudiendo ser dicho tiempo de engorde de 36 meses en la mejor de las realizaciones. La grasa se obtiene concretamente del jamón curado del cerdo. Dada la composición de este extracto de origen natural, se ha comprobado que posee propiedades farmacéuticas, con beneficios en el organismo derivados de su capacidad antioxidante.

Antecedentes de la invención

La mayoría de organismos se ven expuestos a estrés oxidativo, causado por la generación de especies reactivas de oxígeno (EROs) tras la respiración o tras exposición a luz UV u otras radiaciones ionizantes. Estas son formas parcialmente reducidas del oxígeno molecular, altamente reactivas y con gran capacidad de ejercer daño celular. Su producción puede ser consecuencia de los propios procesos metabólicos de las células (principalmente del metabolismo de las mitocondrias), o formarse por exposición a determinados factores ambientales como la luz UV, la polución, el tabaco y otros contaminantes ambientales como la exposición a metales pesados (Martorell, P., Forment, J.V., de Llanos, R., Montón, F., Llopis, S., González, N., Genovés, S., Cienfuegos, E., Monzó, H., y Ramón, D. (2011). Use of Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans as Model Organisms to Study the Effect of Cocoa Polyphenols in the Resistance to Oxidative Stress.J. Agrie. Food Chem.,59(5), 2077-2085; Takagi, H., y Kitagaki, H. (Eds.). (2015). Stress Biology of Yeasts and Fungi. Tokio, Japón). El exceso de estas especies oxidativas es contrarrestado rápidamente a través de los mecanismos de defensa antioxidante, dando lugar a un equilibrio oxidación-reducción esencial para los organismos vivos, conocido comoequilibrio redox.Estos sistemas antioxidantes pueden ser de origen endógeno, destacando: la superóxido dismutasa, catalasa, glutatión peroxidasa, peroxiredoxinas y los antioxidantes no enzimáticos como la coenzima Q10, melatonina, albúmina, bilirrubina y el ácido úrico (Martorell, P., Forment, J.V., de Llanos, R., Montón, F., Llopis, S., González, N., Genovés, S., Cienfuegos, E., Monzó, H. , y Ramón, D. (2011). Use of Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans as Model Organisms to Study the Effect of Cocoa Polyphenols in the Resistance to Oxidative Stress.J. Agrie. Food Chem.,59(5), 2077-2085; Carocho, M., y Ferreira, I. C.F.R (2013). A review on antioxidants, prooxidants and related controversy: Natural and synthetic compounds, screening and analysis methodologies and future perspectives.Food and Chemical Toxicology 51,5-25; Takagi, H., y Kitagaki, H. (Eds.). (2015). Stress Biology of Yeasts and Fungi. Tokio, Japón). Por otro lado, disponemos también de antioxidantes exógenos que pueden ser obtenidos a través de la dieta y de los suplementos nutricionales. En este grupo destacan los carotenoides, flavonoides, compuestos fenólicos, compuestos organosulfurados y las vitaminas C y E. Estos compuestos antioxidantes presentan diferentes mecanismos de acción, como la activación de enzimas antioxidantes, quelación de metales, bloqueo de la peroxidación lipídica o eliminación de los radicales superóxido (Carocho, M., y Ferreira, I.C.F.R (2013). A review on antioxidants, prooxidants and related controversy: Natural and synthetic compounds, screening and analysis methodologies and future perspectives.Food and Chemical Toxicology,51, 5-25).

Cuando se produce un exceso de moléculas oxidantes (EROs) que no pueden ser neutralizadas por la defensa antioxidante, se genera un desequilibrio que recibe el nombre deestrés oxidativo.Este estado se relaciona directamente con la aparición y el desarrollo de enfermedades crónicas tales como cáncer, diabetes, enfermedades cardiovasculares o enfermedades neurodegenerativas (García-Sánchez, A, Miranda-Díaz, A.G. y Cardona-Muñoz, E.G.(2020). The Role of Oxidative Stress in Physiopathology and Pharmacological Treatment with Pro- and Antioxidant Properties in Chronic Diseases.Hindawi,1-16) y con el debilitamiento del sistema inmune (Matsushita, M., Freigang, S. Schneider, C., Conrad, M., Bornkamm, G.W., y Kopf, M. (2015). T cell lipid peroxidation induces ferroptosis and prevents immunity to infection. J. Exp. Med., 212(4), 555-568). La producción excesiva y la acumulación de EROs ocasionan interacciones con las estructuras celulares, como la modificación de las bases de los ácidos nucleicos, produciendo mutagénesis y carcinogénesis. También altera las estructuras proteicas, mediante su inactivación y desnaturalización, y actúan sobre los lípidos provocando peroxidación lipídica, que tiene como efecto alteraciones en la integridad y funcionalidad de las membranas de los sistemas biológicos (Huang, M.Z., y Li, J.Y. (2020). Physiological regulation of reactive oxygen species in organisms based on their physicochemical properties.Acta Physiologica,228, 1-16). La peroxidación lipídica es una reacción en cadena que desencadena la formación de compuestos reactivos como el malondialdehído (MDA) o el 4-hidroxinonenal (HNE), que forman uniones cruzadas con las proteínas dando lugar a productos avanzados de lipoxidación (Ayala, A., Muñoz, M.F., y Argüelles, S. (2014). Lipid Peroxidation: Production, Metabolism, and Signaling Mechanisms of Malondialdehyde and 4-Hydroxy-2-Nonenal.Hindaw,1-31).

Por todas estas razones, es obvio el interés actual en conseguir compuestos y formulaciones con actividad antioxidante, entre ellos alimentos e ingredientes funcionales, dada su capacidad para proporcionar beneficios en la salud a través de su intervención en procesos fisiológicos que promueven la reducción del estrés oxidativo (Miguel, M., Vassallo, D. V., y Wiggers, G. A. (2020). Bioactive peptides and hydrolysates from egg proteins as a new tool for protection against cardiovascular problems.Current Pharmaceutical Design,26(30), 3676-3683). Un estudio de 2003 demostró que el consumo de jamón ibérico de bellota produce una disminución de triglicéridos en el plasma, de la presión arterial y de la peroxidación lipídica, además de un aumento de antioxidantes, lo cual disminuye el riesgo aterogénico (aterosclerosis) en el organismo (Mayoral, P., Martínez-Salgado, C.S., Santiago, J.M., Rodríguez-Hernández, M.V., García-Gómez, M.L., Morales, A., López-Novoa, J.M. y Marcías-Nuñez, J.F. (2003). Effect of ham protein substitution on oxidative stress in older adults. Nutr Health Aging, 7(2), 84-9).

La determinaciónin vitrode la capacidad antioxidante de un compuesto o formulación, como puede ser un ingrediente alimentario o un medicamento, no puede ser directamente relacionada con su capacidad antioxidantein vivo, en la que influyen múltiples factores como la estabilidad, la biodisponibilidad y su distribución en los tejidos (intestino, sistema vascular e hígado), barreras que tienen que superar estos compuestos para alcanzar su lugar de actuación en forma activa. Sin embargo, la posible influencia de estos parámetros no se tiene en cuenta en los ensayosin vitro.Dada la relevancia que en la actualidad ha tomado el estrés oxidativo, y el papel crucial que pueden jugar los antioxidantes en la salud, se hace necesaria su evaluaciónin vivomediante el uso de modelos experimentales que, además, permiten investigar los posibles mecanismos de acción a través de los cuáles un compuesto o ingrediente bioactivo puede ejercer su actividad biologica en el organismo, a nivel celular y molecular (Huang, D., Ou, B., y Prior, R.L. (2005). The Chemistry behind Antioxidant Capacity Assays.J. Agrie. Food Chem.,53, 1841-1856; MacDonald-Wicks, L.K., Wood, L.G., y Garg, M.L. (2006). Methodology for the determination of biological antioxidant capacity in vitro: a review.J Sci Food Agrie,86, 2046-2056).

En este sentido, la utilización de biomarcadores de la oxidación de lípidos y proteínas, así como el uso biomarcadores de daño en el ADN pueden ser muy adecuados para evaluar y monitorizar cambios en el sistema redox en situacionesin vivo.Finalmente, es necesario comprobar, mediante ensayos en humanos, su eficacia y seguridad antes de su posible comercialización que reivindique este efecto biológico (Morales, D., Miguel, M., y Garcés-Rimón, M., (2021). Pseudocereals: a novel source of biologically active peptides.Critical Reviews in food science and nutrition,61(9), 1537-1544). En efecto, los estudios de intervención en humanos permiten establecer la dosis óptima del compuesto bioactivo, así como el potencial consumo de riesgo en la población general y en determinados colectivos (Vettorazzi, A., López de Cerain, A., Sanz-Serrano, J., Gil, A.G., y Azqueta, A. (2020). European Regulatory Framework and Safety Assessment of Food-Related Bioactive Compounds.Nutrients,12, 613, 1-16). Sin embargo, no se han encontrado estudios en los que se analice la actividad antioxidantein vivode la grasa de cerdo ibérico y sus implicaciones en la salud.

Por otro lado, la legislación vigente sobre el uso de animales de experimentación hace que estos ensayosin vivosean complicados social, ética y legalmente (Sneddon, L.U., Halsey, L.G., y Bury, N.R. (2017). Considering aspects of the 3Rs principles within experimental animal biology.Journal of Experimental Biology,220, 3007-3016). De hecho, las 3 Rs (Reemplazar, Reducir y Refinar) publicadas por Russel y Burch en 1959, por las que se promueve el reemplazo de modelos animales por células, tejidos o modelos computacionales, siempre que sea posible (Sneddon, L.U., Halsey, L.G., y Bury, N.R. (2017). Considering aspects of the 3Rs principles within experimental animal biology.Journal of Experimental Biology,220, 3007-3016), están siendo cada vez más reclamadas en los proyectos de investigación en España y también en Europa. Es por ello que, en los últimos años, se hayan llevado a cabo numerosas investigaciones con el objetivo de buscar alternativas para estos animales de experimentación (especialmente para modelos murinos y otros mamíferos). Así, el uso de levaduras como organismo modelo para la determinación de la actividad biológica relevante de ciertos alimentos ha sido ampliamente utilizado en los últimos años como opción para la realización de estudiosin vivo.Específicamente, se ha comprobado que la levaduraSaccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae)supone una alternativa viable.

S.cerevisiae(BY4741) es un microorganismo eucariota perteneciente alFilumde los hongos unicelulares Saccharomycotina. Constituye un organismo modelo empleado con frecuencia en la investigación de diversos procesos relacionados con la salud humana como, por ejemplo, el estrés oxidativo y el efecto de determinados compuestos en la resistencia a antibióticos. Las razones de su empleo son muy variadas: se trata de un organismo de fácil manejo; permite el estudio de millones de células en cultivos de poco volumen; su genoma ha sido ampliamente estudiado, disponiendo actualmente de una de las mejores anotaciones funcionales; la presencia de genes ortólogos y similitudes a nivel fisiológico con humanos permite extrapolar los resultados obtenidos en los ensayos (Smith, M.G. y Snyder, M. (2006). Yeast as a Model for Human Disease.Current Protocols in Human Genetics,48, 15.6.1-15.6.8; Bolotin-Fukuhara, M., Dumas, B., y Gaillardin, C. (2010). Yeasts as a model for human diseases.FEMS Yeast Res.,10, 959-960; Karathia, H., Vilaprinyo, E., Sorribas, A., y Alves, R. (2011). Saccharomyces cerevisiae as a model organism: a comparative study.PloS one,6(2), 1-10; Pérez de Vega, M.J., Moreno-Fernández, S., Pontes-Quero, G.M., González-Amor, M., Vázquez-Lasa, B., Sabater-Muñoz, B., Briones, A.M., Aguilar, M.R., Miguel , M., y González-Muñiz, R., (2020). Characterization of Novel Synthetic Polyphenols: Validation of Antioxidant and Vasculoprotective Activities.Antioxidants,9(787), 1-23). Y, sobre todo, supone una ventaja en cuanto a consideraciones éticas, evitando el uso de modelos animales. Cabe mencionar queS. cerevisiaees uno de los organismos modelo eucariotas más usados, habiéndose empleado en estudios sobre envejecimiento, regulación de expresión génica, transducción de señales y enfermedades neurodegenerativas, entre otros (Karathia, H., Vilaprinyo, E., Sorribas, A., y Alves, R. (2011). Saccharomyces cerevisiae as a model organism: a comparative study.PloS one,6(2), 1-10).

De la misma forma que las células poseen mecanismos de defensa,S. cerevisiaeposee factores de transcripción y de enzimas implicadas directamente en la respuesta a estrés oxidativo como las superóxido dismutasas (SODs), glutatión peroxidasas (GPXs), catalasas, etc., similares a las de mamíferos implicadas también en envejecimiento celular (Takagi, H., y Kitagaki, H. (Eds.). (2015). Stress Biology of Yeasts and Fungi. Tokio, Japón; Eleutherio, E., de Araujo Brasil, A., Braga Fran?a, M., Seixas Gomes de Almeida, D., Breves Rona, G., y Silva Magalhaess, R.S. (2018). Oxidative stress and aging: Learning from yeast lessons.Fungal Biology,122, 514 525).

Se ha visto que el cacao enriquecido con polifenoles presenta resistenciain vivoal estrés oxidativo en organismos modelo como la levadura S.cerevisiaeo el gusanoC. elegans(Martorell, P., Forment, J.V., de Llanos, R., Montón, F., Llopis, S., González, N., Genovés, S., Cienfuegos, E.,Monzó, H., y Ramón, D. (2011). Use of Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans as Model Organisms to Study the Effect of Cocoa Polyphenols in the Resistance to Oxidative Stress.J. Agrie. Food Chem.,59(5), 2077-2085). La quercetina, uno de los flavonoides dietéticos más abundantes y uno de los antioxidantes más estudiados, ha sido utilizado para estimar el efecto sobre la resistencia al estrésin vivode células de S.cerevisiae,tomando como medidas el efecto en su crecimiento exponencial. Los resultados obtenidos sugieren que la quercetina en concentraciones elevadas puede actuar como antioxidante, proporcionando protección parcial a las proteínas contra la modificación inducida por EROs bajo exposición al choque térmico y al estrés oxidativo (Bayliak, M.M., Burdylyuk, N.I., y Lushchak, V.I. (2016). Quercetin increases stress resistance in the yeast Saccharomyces cerevisiae not only as an antioxidant.Ann Microbiol.,66, 569-576). Meng et al. 2017, realizaron un estudio que tenía como objetivo comprobar la actividad antioxidante de productos dietéticos naturales (arándanos, resveratrol, catequinas y quercetinas, entre otros), utilizando S.cerevisiaecomo sistema modelo. En este estudio, se concluyó que muchos de los productos naturales estudiados son eficaces antioxidantes en S.cerevisiae(Meng, D., Zhang, P., Li, S., Ho, C.T., y Zhao, H. (2017). Antioxidant activity evaluation of dietary phytochemicals using Saccharomyces cerevisiae as a model.Journal of Functional Foods,38, 36-44). Más recientemente se ha demostrado que el flavonoide hiperósido (presente en frutas y vegetales principalmente) tiene función protectora enS. cerevisiaeen respuesta al estrés oxidativo inducido en este organismo unicelular (Gao, Y., Fang, L., Wang, X., Lan, R., Wang, M., Du, G., Guan, W., Liu, J., Brennan, M., Guo, H., Brennan, C., y Zhao, H. (2019). Antioxidant Activity Evaluation of Dietary Flavonoid Hyperoside Using Saccharomyces Cerevisiae as a Model.Molecules,24(788), 1-12). Todo ello indica que la levaduraS. cerevisiaees un modelo efectivo, más natural, para el estudio de compuestos y productos antioxidantes activos, como pueden ser alimentos, y para ayudar y complementar la investigaciónin vivo(Meng, D., Zhang, P., Li, S., Ho, C.T., y Zhao, H. (2017). Antioxidant activity evaluation of dietary phytochemicals using Saccharomyces cerevisiae as a model.Journal of Functional Foods,38, 36-44).

Ante esta posibilidad que ofrecen los modelos experimentalesin vitrocon S.cerevisiaede los mecanismos de oxidación en el organismo, y ante las carencias detectadas en este campo de investigación, se ha desarrollado la presente invención con el fin de ofrecer un nuevo fármaco, completamente natural, en el tratamiento de enfermedades vinculadas con el estrés oxidativo.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención tiene como principal objeto una composición farmacéutica a base de (que comprende) un extracto derivado de (procedente de) grasa de jamón de cerdo como principio activo, en una cantidad comprendida entre 75% y 95% en peso del peso total de la composición, siendo preferiblemente esta cantidad de entre 92% y 95%, incluidos ambos límites, y 95%, la cantidad preferida. Asimismo, la invención se refiere al uso en medicina de dicha composición farmacéutica que comprende el extracto de grasa de jamón de cerdo como principio activo, preferiblemente de grasa de recorte, y también preferiblemente de jamón ibérico. Preferiblemente, se dirige al uso de la composición, y por ende del extracto de grasa de jamón de cerdo, para la prevención de enfermedades relacionadas con el envejecimiento celular, y más preferiblemente aún en la prevención de enfermedades como cáncer, diabetes, enfermedades cardiovasculares, enfermedades inflamatorias intestinales o enfermedades neurodegenerativas, entre las más importantes, aunque también aquellas que se relacionan con el debilitamiento del sistema inmune; siendo preferiblemente seleccionada entre enfermedades cardiovasculares o enfermedades inflamatorias intestinales.

En el ámbito de la presente invención, debe entenderse que el uso en medicina de la composición farmacéutica (o del extracto que incluye como principio activo) cubre, en esencia, un producto para su uso en medicina, y concretamente para la prevención de las enfermedades que se mencionan en este documento. Asimismo, se refiere indirectamente al uso del extracto aquí definido como principio activo para la fabricación de una composición farmacéutica útil en el tratamiento de dichas enfermedades (cardiovasculares e inflamatorias intestinales).

Este nuevo uso médico del extracto procedente de grasa del jamón de cerdo fue observado al analizar la capacidad antioxidantein vivoen diferentes muestras de dicho extracto. Para ello, se empleó la cepa BY4741 de S.cerevisiaecomo modelo experimental, y su efecto en la mejora de la longevidad celular y prevención del envejecimiento celular, sometiéndose dicha levadura a estrés oxidativo, utilizando el medio YPO<x>D (con H<2>O<2>al 0,01%) y se caracterizó el efecto fenotípico de la aplicación de cada uno de los extractos. Se evaluó el efecto de recuperación de actividad celular (medido como recuperación de la tasa de crecimiento y tasa de supervivientes o masa producida) promovido por el extracto en la levadura S.cerevisiaetras exposición a un agente altamente oxidante (H<2>O<2>) y se comparó este efecto con el producido por dos reconocidos antioxidantes como la vitamina C y el resveratrol. De este modo, se comprobó que el extracto de grasa de jamón de cerdo que se describe en esta memoria tiene un efecto positivo en el organismo de protección celular frente al estrés oxidativo, ya que su composición lipídica le atribuye actividad antioxidante con una fuerte reducción de la muerte celular causada por el estrés oxidativo, y un incremento de la tasa de crecimiento celular, lo que indica recuperación del equilibrio redox y recuperación del daño celular causado por este fenómeno.

La presente invención ofrece el uso en medicina de una composición que comprende, como principio o agente activo, un extracto animal, obtenido de la grasa del cerdo, concretamente de la grasa de los jamones (curados) que se obtienen de él, de forma análoga a los extractos vegetales extraídos de las plantas. Dicho extracto contiene componentes en su formulación, por la propia naturaleza de la materia prima, que realizan una función beneficiosa en el organismo, útil en la prevención de enfermedades relacionadas con el estrés oxidativo, por lo que se configura como un principio activo de gran valor farmacéutico, ya que, como se ha visto, su ingestión incrementa las sustancias antioxidantes en el organismo y decrece la peroxidación de los lípidos, lo que genera efectos beneficiosos en la reducción de los factores de riesgo aterogénico (enfermedad cardiovascular) (Mayoral, P.; Martinez-Salgado, C.; Santiago, J.; Rodriguez-Hernandez, M.; García-Gomez, M.; Morales, A.; López-Novoa, J.; Macías-Nuñez, J. (2003). Effect of Ham Protein Substitution on Oxidative Stress in Older Adults.J. Nutr. Health & aging, 7(2),84-89).

De manera preferida, el jamón de cerdo del que se obtiene el extracto que actúa de principio activo es de bellota, y más preferiblemente aún de cerdo ibérico de bellota, como son los cerdos de montanera, siendo un ejemplo muy preferido los cerdos Joselito®. En el caso más preferido de todos, la grasa de jamón es grasa de recorte procedente de jamones de cerdo como los descritos, en cualquiera de sus variantes, con una curación mínima de 36 meses (es decir, igual o superior a 36 meses).

En el ámbito de la presente invención, se entiende por "jamón de cerdo” al jamón curado que se obtiene de los cuartos traseros del animal, y que se someten a sazonado y curado en condiciones ambientales particulares: tras aplicar sal unos días, se elimina la sal y se cuelga para exponerse al viento, con bajas temperaturas y baja humedad, sin técnicas artificiales de secado o calentamiento. El proceso de curado se mantiene durante al menos 36 meses, preferiblemente 2 años. La grasa se extrae de dicha pieza de jamón, siendo la grasa de recorte como se conoce a la grasa de cobertura del jamón. Ésta es una parte del jamón que no se destina al consumo directo, pero es un subproducto de gran valor porque mantiene las características nutricionales y sensoriales del producto, por lo que su utilización y revalorización es altamente interesante, incluso desde el punto de vista sostenible. El cerdo ibérico de bellota es aquel que, siendo de una variedad de raza porcina perteneciente al llamado "tronco ibérico" y predominante en la península ibérica, se alimenta de bellotas y hierba de pasto, lo que se conoce como montanera. Las bellotas presentan un alto contenido en ácido oleico (56-58%) similar al del aceite de oliva.

El extracto obtenido se presenta preferiblemente en forma de grasa, ya que está formado al 100% por grasa del jamón de cerdo, de tal forma que se encuentra en forma semi-sólida a temperatura ambiente (por ejemplo, entre 18°C y 20°C) y líquida por encima de los 37°C, por su contenido en ácidos grasos monoinsaturados (AGMI) y poliinsaturados (AGPI). Sin embargo, en múltiples realizaciones, para utilizarse como principio activo, el extracto puede presentarse en una de las formas seleccionadas dentro del grupo compuesto por: extracto seco, deshidratado, emulsionado, diluido, liofilizado, atomizado, y centrifugado, sin verse alteradas sus propiedades.

Debe tenerse en cuenta que cuando se cita un intervalo de valores en la presente memoria, sus límites inferior y superior están siempre incluidos en el ámbito de la invención, como realizaciones concretas de la misma.

Preferiblemente, el extracto presenta un contenido de uno o más AGMI comprendido entre 60% y 62% en peso con respecto del peso total del extracto (por ejemplo, de cada 100 gramos de extracto obtenido, entre 60 y 62 gramos son de ácidos grasos monoinsaturados), de los cuales el ácido graso oleico está comprendido entre 55% y 59% en peso del peso total del extracto, más preferiblemente entre 56% y 58%, es decir, en torno a 57% (±1% ó 2%). Esto es relevante en la medida en que, además de presentar propiedades beneficiosas para la salud, gracias al efecto antihipertensivo y a la capacidad de prevención de enfermedades cardiovasculares, el extracto muestra unas agradables propiedades organolépticas que facilitan su ingesta al paciente, siendo apreciado por su sabor y aroma.

Continuando con el contenido en ácidos grasos, el extracto puede presentar, aparte de los AGMI antes descritos, uno o más ácidos grasos saturados (AGS), en una cantidad comprendida entre 30% y 33% en peso con respecto del peso total del extracto; y uno o más AGPI, en una cantidad comprendida entre 7% y 10% en peso con respecto del peso total del extracto, más preferentemente 8%. Entre los AGS se encuentran el ácido palmítico (entre 19% y 21% en peso con respecto del peso total del extracto, el de mayor presencia) y el esteárico (entre 8% y 10,5% en peso con respecto del peso total del extracto), predominantemente, aunque también pueden aparecer otros ácidos grasos en menor cantidad (se identifican, en proporciones mucho menores, el láurico, el mirístico y el margárico, por ejemplo). Por su parte, entre los AGMI además del ácido oleico también se reconocen el ácido palmitoleico (entre 2%-2,5% en peso con respecto del peso total del extracto), ácido eicosenoico (entre 1% y 1,5% en peso con respecto del peso total del extracto) y, en menor medida, ácido Cis-10-heptadecenoico (igual o menor a 0,5% en peso con respecto del peso total del extracto). En lo que respecta a los AGPI, estos son principalmente ácido linoleico (entre 6% y 9%) y ácido a-linolénico (entre 0,5 y 1,5% en peso con respecto del peso total del extracto).

Este extracto de grasa de jamón de cerdo descrito anteriormente, en cualquiera de sus variantes, puede obtenerse principalmente mediante un método que comprende: incrementar la temperatura de la grasa de (jamón de) cerdo a un valor comprendido entre 30°C-90°C, en condiciones de vacío con rotación, a una presión comprendida entre 55 y 930 mbar, con una velocidad de rotación comprendida entre 80-90 rpm; y durante un tiempo estimado comprendido entre 40 minutos y 130 minutos, preferentemente entre 45 minutos y 120 minutos. Se consigue con este método la obtención de un extracto con una composición como la que aquí se define, en condiciones de vacío y sin el uso de disolventes (es decir, en ausencia de disolventes). El sistema de vacío que se utiliza (por ejemplo, un rotavapor) reduce la presión interna del sistema, de tal forma que una presión de 100 mbar es suficiente para lograr la extracción deseada, estableciéndose como la menor presión recomendable y preferible que se puede utilizar para obtener el extracto. De manera preferida, la presión está comprendida entre 90 y 120 mbar. En el caso más preferido de todos, el valor de presión está entre 100 y 120 mbar, estando más preferiblemente en torno a 100 mbar.

Con respecto a la temperatura utilizada para la obtención del extracto, ésta puede estar preferiblemente comprendida entre 30°C y 85°C, más preferiblemente entre 30°C y 82°C, y más preferiblemente aún la temperatura puede ser seleccionada entre las siguientes: en torno a 31°C (es decir, entendido como entre 30-32°C), en torno a 61°C (es decir, entendido como entre 60-62°C) y en torno a 81°C (es decir, entendido como entre 80-82°C), siendo el más preferible de todos, por sus propiedades nutricionales y organolépticas, 60-62°C. Una variación de la temperatura permite modular las propiedades del extracto, cambiando su transparencia, color, brillo y características organolépticas. En cuanto al tiempo de extracción, se comprobó que dicho tiempo varió en función de la temperatura empleada: cuanto menor es la temperatura, mayor el tiempo necesario para obtener la misma cantidad de extracto. Por ejemplo, a una temperatura inferior a 40°C (30°C ó 37°C, por ejemplo) se requieren 2 horas de proceso, mientras que entre 40°C y 70°C se necesita la mitad de tiempo (1 hora); con 80°C o más, se precisan solamente 45 minutos.

De manera preferible, la etapa de calentamiento en vacío se lleva a cabo en un evaporador rotativo o rotavapor, aunque puede ser cualquier dispositivo configurado para rotar en condiciones de vacío, y que pueda llevarse a cabo a las temperaturas requeridas en este método.

De acuerdo con este procedimiento, por cada 1 kg de grasa de jamón de cerdo inicial se obtienen 300-350 gr de extracto, más normalmente 320 gr de extracto, lo que muestra un alto rendimiento del proceso.

Una vez obtenido el extracto, éste puede almacenarse preferiblemente a una temperatura comprendida entre 2°C y -22°C, es decir, en condiciones de refrigeración o congelación, sin alterar sus propiedades nutricionales y organolépticas. Preferiblemente, el extracto puede mantenerse en condiciones de refrigeración (2-10°C) o de congelación (-18 a -22°C) durante un tiempo máximo de 14 meses en condiciones de congelación, y un tiempo máximo de 8 meses en condiciones de refrigeración, más preferiblemente no más de 12 meses en congelación y más preferiblemente no más de 6 meses en refrigeración, sin sufrir degradación de sus propiedades y sin alterarse sus propiedades microbiológicas.

Como se ha dicho, la composición farmacéutica descrita comprende el extracto de grasa de cerdo como principio activo en una cantidad comprendida entre 75% y 95% en peso del peso total de la composición, más preferiblemente entre 92% y 95% y, en el caso más preferido de todos, el 95% en peso del peso total de la composición.

Dada su naturaleza y su forma, este extracto se combina con excipientes que permiten su inclusión y conservación en la composición farmacéutica, que está preparada para ser ingerida. Así, el compuesto farmacéutico objeto de protección comprende, en cualquiera de sus variantes e independientemente de la cantidad de principio activo, uno o más excipientes o ingredientes habitualmente utilizados en el campo de la medicina, como pueden ser una mezcla de tocoferoles y/o aceites vegetales (aceite de semillas o aceite de coco), y/o agentes de carga, como maltodextrina.

De manera preferible, la composición farmacéutica descrita aquí, en cualquiera de sus variantes, se usa para la prevención de enfermedades, patologías o afecciones en las que está implicado el estrés oxidativo, tales como: cáncer, diabetes, enfermedades cardiovasculares, enfermedades inflamatorias intestinales, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades dermatológicas y aquellas relacionadas con el debilitamiento del sistema inmune. En el caso más preferido de todos, la composición farmacéutica se usa para la prevención de enfermedades cardiovasculares y enfermedades inflamatorias intestinales (Mayoral, P.; Martinez-Salgado, C.; Santiago, J.; Rodriguez-Hernandez, M.; García-Gomez, M.; Morales, A.; López-Novoa, J.; Macías-Nuñez, J. (2003). Effect of Ham Protein Substitution on Oxidative Stress in Older Adults.J. Nutr. Health & aging, 7(2),84-89; Fernández, J., García de la Fuente, V., Fernández García, M. T., Gómez Sánchez, J., Isabel Redondo, B., Villar, C.J., y Lombó, F., (2020). A diet based on cured acorn-fed ham with oleic acid content promotes anti- inflammatory gut microbiota and prevents ulcerative colitis in an animal model.Lipids in Health and Disease,19(28), 1-19).

La dosis diaria a administrar de principio activo en el tratamiento preventivo se infiere a partir de la ingestión diaria de alimentos que también pueden actuar frente al estrés oxidativo. Así, dicha dosis diaria de principio activo es preferiblemente de al menos el 0,5% de la ingesta diaria de este tipo de extracto. En un caso preferido, la dosis es concretamente del 0,5% de la ingesta diaria, es decir, si ingerimos al día 100 g de alimentos que también pueden actuar frente al estrés oxidativo, la ingesta del principio activo sería 0,5 g; y en el caso en el que el 95% de la formulación farmacéutica sea el principio activo serían 0,53 g. Más preferiblemente, la dosis diaria de extracto a ingerir está comprendida entre 0,5% y 1,5% de la cantidad total de la ingesta diaria, incluidos ambos límites.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Tasa de crecimiento deSaccharomyces cerevisiaesometida a estrés oxidativo (YPOxD) con diferentes extractos de grasa de cerdo de acuerdo con la presente invención (extraídos a 30°C, 60°C y 80°C, y denominados extracto t30, t60 y t90, respectivamente) y reconocidos compuestos antioxidantes (vitamina C -VitC- y resveratrol), así como una muestra control (Ctrl(OxD). Media de tres medidas ± desviación estándar. Letras diferentes muestran diferencias significativas (p <0,05).

Figura 2. Supervivientes como unidades formadoras de colonias, UFCs por ml (media ±SD) deSaccharomyces cerevisiaesometida a estrés oxidativo (YPOxD) con los diferentes extractos de grasa de jamón de cerdo según Ejemplo 1, y los demás antioxidantes analizados (vitamina C y resveratrol). Media de tres medidas ± desviación estándar. Letras diferentes muestran diferencias significativas (p <0,05).

EJEMPLOS DE REALIZACIÓN

Ejemplo 1: Estudio de la determinación de la actividad antioxidante in vivo del extracto de jamón de cerdo utilizado como principio activo en la composición farmacéutica objeto de la presente invención

Definición de las muestras de extracto objeto de estudio

Se testaron 3 extractos obtenidos a diferentes temperaturas, 30°C, 60°C y 80°C, es decir, resultantes de tres procesos de extracción diferentes a partir de grasa de jamón de cerdo ibérico de bellota de marca Joselito®. Este jamón es un jamón curado de raza ibérica que ha sido alimentado durante el periodo de montanera exclusivamente en base a bellota y pasto. La grasa utilizada es grasa subcutánea de jamón procedente del loncheado del jamón Joselito® con una curación mínima de 36 meses. Estas muestras se introdujeron en evaporador por rotación o rotavapor BÜCHI Labortechnik AG, 2019, bajo diferentes condiciones que se detallan a continuación:

- una temperatura de: 30°C, 60°C y 80°C;

- una presión seleccionada de: 100 mbar;

- una velocidad de agitación comprendida entre 80-90 rpm.

De esta manera, se obtuvieron 3 muestras diferentes procedentes de misma grasa de jamón Joselito inicial. Las condiciones específicas de extracción se encuentran enmarcadas en la Tabla 1.

Tabla 1. Condiciones de obtención de los extractos objeto de análisis

Los tres extractos obtenidos (muestras t30, t60 y t80) presentan una elevada composición en AGMI, en antioxidantes y compuestos fenólicos. La composición detallada de los ácidos grasos de las muestras (t30, t60 y t80) se encuentra enmarcada en la Tabla 2, expresada en %.

Tabla 2. Composición en ácidos grasos de las muestras analizadas

*Media de tres mediciones ± desviación estándar. Letras diferentes en la misma fila muestran diferencias significativas (p < 0,05).;;A su vez, el contenido en antioxidantes y compuestos fenólicos (contenido fenólico total, o CFT) de los extractos se muestra en la tabla 3, expresado en ^mol equivalentes de Trolox (TE) /g y en mg equivalentes de ácido gálico (GAE) / 100 g, respectivamente. ;;Tabla 3. Capacidad antioxidante y contenido en compuestos fenólicos de las muestras analizadas;;; ;; *Media de tres mediciones ± desviación estándar. Letras diferentes en la misma columna muestran diferencias significativas (p < 0,05).

Además, se pudo verificar que los extractos eran muy estables, ya que pudieron almacenarse durante un tiempo de 14 meses en condiciones de congelación, y un tiempo de 8 meses en condiciones de refrigeración, sin sufrir degradación de sus propiedades y sin alterarse sus propiedades microbiológicas.

Caracterización del método de medida de la actividad antioxidante

Para la determinación de la actividad antioxidantein vivose utilizó la cepa BY4741 de S.cerevisiae.Esta cepa se sometió a estrés oxidativo y se controló el crecimiento en continuo, con elBioscreen c(Oy Growth Curves Ab Ltd, Finlandia). Este equipo permite determinar la densidad óptica (OD) de un microcultivo de forma continua y a gran escala, utiliza unas placas exclusivas denominadas Honeycomb de 10x10 pocillos con un volumen máximo de 300 ^l, y permite usar dos placas porrun,testando 200 muestras a la vez.

Para el crecimiento de la cepa BY4741 de S.cerevisiaese utilizó un glicerinado mantenido a -80°C, inoculando 20 ^l del glicerinado en 5ml de medio YPD (medio control: 2% extracto de levadura, 1% peptona y 2% glucosa), durante 24h a 200 rpm y 28°C. A partir de este precultivo, se sometió a estrés oxidativo mediante crecimiento de 500 ^l en 5 ml de medio YPOxD (medio estresante: 2% extracto de levadura, 1% peptona, 1% glucosa y 0,01% H<2>O<2>), incubando durante 16-24h a 200 rpm y 28°C. Una vez alcanzada una OD600 ~ 0,6 (entre 16 y 24h), estuvo listo para empezar la caracterización del efecto antioxidante de los extractos analizados con el instrumentoBioscreen c. Para ello, el precultivo estresado se diluyó con medio YOPxD hasta obtener una OD600 ~ 0,1, y se depositaron 180 ^l de esta dilución de levaduras en cada pocillo de la placa Honeycomb, utilizando una pipeta multi-dispensadora (Eppendorf Multipette). Cada muestra se testó a cuatro dosis (1^l, 5^l, 10^l y 20^l), con al menos 5 repeticiones (réplicas técnicas) por dosis. La vitamina C y el resveratrol se utilizaron como compuestos comparativos de conocida actividad antioxidante, y se testaron a dos dosis (2^l y 10^l; 2mg/ml en metanol al 50%) con al menos 7 repeticiones por dosis. En cada experimento, se incluyen los correspondientes controles negativos (medios sin inocular: YPD, YPOxD, YPOxD 50% metanol) y controles de cultivo bajo estrés (levadura bajo estrés en YPOxD 50% metanol), con al menos 3 repeticiones de cada uno, estando distribuidos entre las dos placas del experimento. El ensayo se realizó en un volumen final de 200 l^.

Las placas se incubaron en elBioscreen Cbajo los siguientes parámetros: 200 muestras; filtro 600 nm, Brown; 28°C; longitud del experimento de 5 días 1 hora; mediciones de OD600 cada 15 minutos; agitación alta y continua. ElBioscreen crecogió datos de OD600 en intervalos de 15 minutos, Los valores de OD600 se normalizaron respecto al valor medio del blanco correspondiente (controles negativos). Los parámetros tasa de crecimiento (r) y capacidad de carga (k) del sistema se determinaron con la libreríaGrowthcurver v.0.3.1 en RStudio v. 1.4.1106(Sprouffske & Wagner, 2016; RStudio 2021). Esta librería realiza el ajuste de los datos de OD600 a un modelo de crecimiento logístico, a partir de los cuales determina los parámetros que definen la curva de crecimiento como r (tasa de crecimiento, en h-1) y k (tamaño máximo de población o capacidad de carga), entre otros. Este software también permite la comprobación de la presencia deoutliersmediante análisis por PCA, utilizando los paquetes Dplyr 1.0.6 y Ggplot2 3.3.3 (Sprouffske, K., y Wagner, A. (2016). Growthcurver: an R package for obtaining interpretable metrics from microbial growth curves.BMC Bioinformatics,17(172), 2-4). Finalmente, se generó un fichero con los datos de caracterización del ajuste de la curva de crecimiento al modelo logístico, para cada una de las réplicas técnicas de cada muestra testada.

Una vez terminado el experimento, se determinó el número de células viables tras la exposición de las muestras a cada uno de los extractos utilizados como compuesto activo farmacéutico, así como a vitamina C, resveratrol y controles. Para ello se determinó el número de unidades formadoras de colonia (UFCs) mediante la técnica de dilución seriada y siembra en placas estériles de 96 pocillos. La dilución seriada se realizó con pipeta multicanal automática (Eppendorf Xplorer® plus) transfiriendo 20 ^l desde la fila A a la siguiente fila. Cada fila contenía 180 ^L de glicerol 10% estéril, realizando homogeneización y transferencia al mismo tiempo. Una vez preparada cada placa de dilución seriada, se sembró en placa Petri con medio YPDA (YPD agar) con la ayuda de un replicador de 8x6 pines(SIGMA replica plater for 96 well plate,8x6array,ref. R2383-1EA) esterilizado por flambeado con etanol 96%. Este replicador depositó 1,65^l de cada pocillo en cada placa Petri. Se realizaron 3 réplicas técnicas de cada siembra en placa Petri. Las placas se mantuvieron en posición boca-arriba, y se incubaron 48h a 28°C. Se determinó el número de colonias obtenidas en cada réplica, y corrigiendo con la fórmula 1, se determina el número de UFCs por ml.

Fórmula 1. Formula a aplicar para la corrección del número de colonias:

UFCs/ml = (número de colonias x factor de dilución) / (1,65x10-3)

Análisis estadístico

Mediante el programaGrnphpad PRISM v6se determinó si existían diferencias significativas entre la media de los valores de tasa de crecimiento (r), capacidad de carga (k) y supervivientes (medidos como UFCs/ml), mediante ANOVA de una vía, con corrección Tukey para múltiples comparaciones, estableciendo el nivel de significación con un valor de p <0,05. Se graficaron los datos como media ± SD, indicando nivel de significación.

Resultados y discusión sobre el afecto antioxidante y aplicación dosis-respuesta En los resultados obtenidos se observó que el estrés oxidativo afectó negativamente a los parámetros de crecimiento de la levadura, en especial a la tasa de crecimiento (r) (Figura 1) y a los supervivientes (Figura 2). Se observó que todas las muestras del extracto de grasa de jamón de cerdo analizadas proporcionaron una mayor recuperación de los parámetros de crecimiento celular. No se observaron diferencias significativas entre las muestras analizadas en cuanto a la tasa de crecimiento (r) y capacidad de carga (k) (no se muestran los datos de capacidad de carga). Todas las muestras analizadas del extracto, y los controles antioxidantes, vitamina C y resveratrol, mostraron un aumento significativo de la tasa de crecimiento respecto al control OxD (Figura 1). No se observaron diferencias significativas entre las muestras de extractos analizadas y los controles antioxidantes vitamina C y resveratrol (Figura 1) . Con respecto a los resultados obtenidos en la tasa de supervivientes (UFCs) en las muestras de extracto no se observaron diferencias significativas entre ellas y el resveratrol. Únicamente la vitamina C no mostró aumento significativo con respecto al control OxD (Figura 2).

Estos resultados demuestran que el extracto de grasa de cerdo aquí descrito presenta actividad antioxidantein vivo,ya que permitió una notable recuperación de biomasa producida, tasa de crecimiento y del número de viables (supervivientes), comparada con la muestra control sometida a estrés oxidativo. Cabe mencionar que el efecto antioxidante del extracto fue similar al del resveratrol e incluso mejora el efecto en el número de viables (supervivientes) con respecto a la vitamina C en un 31-38% (Figura 2) , siendo dos compuestos de reconocido efecto antioxidante. Por ello, se puede concluir que el extracto presenta un efecto positivo en el organismo de protección celular frente a estrés oxidativo, lo que está relacionado con el sistema inmunitario: bajo situaciones de estrés oxidativo, la peroxidación de lípidos afecta gravemente el sistema inmunitario, haciéndolo más sensible al ataque de patógenos (ya sean víricos o producidos porLeishmania major(leismaniosis), pero que a su vez incrementa el ritmo de muerte celular (Matsushita et al., 2015). También se ha visto que el suministro de vitamina E, un potente antioxidante, reduce la peroxidación lipídica, que a su vez reduce el ritmo de muerte celular y senescencia (Matsushita et al., 2015). Aquí se ha comprobado que la utilización de estos extractos lipídicos con actividad antioxidante procedentes de la grasa de jamón ibérico produjo una fuerte reducción de muerte celular, con incremento de la tasa de crecimiento, lo que indica recuperación del equilibrio redox y recuperación del daño celular.

Concretamente, el estudio realizado ha demostrado que con 1 ^l de cualquiera de los diferentes extractos analizados se produce una notable recuperación de biomasa producida, tasa de crecimiento y del número de viables (supervivientes), comparada con la muestra control sometida a estrés oxidativo, en un 57-63% en la tasa de crecimiento y en un 54-59%en el número de viables (supervivientes). Lo cual significa que con 1 ^l de extracto en un volumen final de 200 ^l se produce el efecto antioxidantein vivo,y la prevención del estrés oxidativo celular y mejora de la longevidad y prevención del envejecimiento celular.

Ejemplo 2: Ejemplo de preparación de una composición farmacéutica objeto de la presente invención a partir de los extractos del Ejemplo 1

Siguiendo con las indicaciones dadas a lo largo de la presente memoria, se preparó 1 gramo de la composición farmacéutica, necesitando entre 750-950 mg de cualquiera de los extractos del Ejemplo 1, al que se adicionaron mediante técnicas habituales y conocidas en el campo los excipientes, que fueron: agentes de carga, maltodextrina, tocoferoles y agua purificada. Esta composición se presenta en forma de cápsula.

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende un extracto procedente de grasa de jamón curado de cerdo como principio activo en una cantidad comprendida entre 75% y 95% en peso del peso total de la composición; donde el jamón es de cerdo ibérico de bellota, alimentado de montanera, y la grasa del jamón de cerdo es grasa de recorte; donde el extracto presenta al menos:

- ácidos grasos monoinsaturados en una cantidad entre 60% y 62% en peso con respecto al peso total del extracto, donde al menos un ácido graso monoinsaturado es ácido graso oleico y está presente en una cantidad comprendida entre 55% y 59% en peso con respecto al peso total del extracto; - ácidos grasos saturados en una cantidad comprendida entre 30% y 33% en peso con respecto al peso total del extracto, donde al menos un ácido graso saturado es ácido palmítico y está presente en una cantidad comprendida entre 19% y 21% en peso con respecto al peso total del extracto, y un segundo ácido graso saturado es ácido esteárico y está presente en una cantidad comprendida entre 8% y 10,5% en peso con respecto al peso total del extracto; y

- ácidos grasos poliinsaturados en una cantidad comprendida entre 7% y 10% en peso con respecto al peso total del extracto, donde al menos un ácido graso poliinsaturado es ácido linoleico y está presente en una cantidad comprendida entre 6% y 9% en peso con respecto al peso total del extracto, y un segundo ácido graso poliinsaturado es ácido a-linolénico y está presente en una cantidad menor del 0,5% al 1,5% en peso con respecto al peso total del extracto;

y donde el extracto se obtiene mediante un proceso que comprende:

- calentar la grasa en condiciones de vacío con rotación, a una presión comprendida entre 55 y 930 milibares y a una temperatura comprendida entre 30°C-90°C; con una velocidad de rotación comprendida entre 80-90 rpm; y durante un tiempo estimado comprendido entre 40 minutos y 130 minutos.

2. La composición farmacéutica que según la reivindicación 1, que comprende el extracto de grasa de jamón curado de cerdo como principio activo en una cantidad comprendida entre 92% y 95% en peso del peso total de la composición.

3. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, para su uso en medicina.

4. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 3, en la prevención o disminución de los efectos derivados del estrés oxidativo en enfermedades seleccionadas dentro del grupo compuesto por: cáncer, diabetes, enfermedad cardiovascular, enfermedad inflamatoria intestinal y enfermedad neurodegenerativa.

5. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación anterior, donde la enfermedad es seleccionada entre enfermedad cardiovascular o enfermedad inflamatoria intestinal.