ES2940564T3 - Mitigación liposómica de la inhibición inducida por fármaco del canal IKr cardíaco - Google Patents

Abstract

Se proporcionan composiciones y métodos para prevenir una o más canalopatías cardíacas o afecciones resultantes de irregularidades o alteraciones en los patrones cardíacos, o ambas, en un sujeto humano o animal que comprenden: uno o más agentes farmacológicamente activos que causan al menos uno de los canales IKr inhibidores o Prolongación del intervalo QT mediante la inhibición de la actividad de un gen relacionado con el éter-a-go-go (hERG); y uno o más liposomas, en los que los liposomas son liposomas vacíos y se administran antes, de forma concomitante o después de la administración del agente farmacológicamente activo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Mitigación liposómica de la inhibición inducida por fármaco del canal Ik cardíaco

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere en general a la farmacología y cardiología, y más particularmente a las composiciones a base de liposomas y a métodos para alterar terapéuticamente una inhibición genética inducida farmacológicamente del canal Ik cardíaco.

Antecedentes de la técnica

Sin limitación del alcance de la invención, se describen los antecedentes de la misma en relación a composiciones y métodos para el control de la duración de la repolarización del QT del ventrículo cardíaco en un sujeto, que comprende administrar en un sujeto que lo necesita una modificación o interferencia funcional de un agente terapéutico, o defecto congénito, que si no se modificase, podría inducir la prolongación de la repolarización en el potencial de acción de los miocitos cardíacos, taquicardia de torsión de puntas (“torsade de pointes”) y el síndrome de QT largo. La presente invención comprende la unión de un fármaco que prolonga el QT a un liposoma previamente a la administración parenteral (intravenosa o subcutánea) o la administración de un liposoma vacío antes o simultáneamente con agentes terapéuticos que es conocido que presentan un riesgo elevado de prolongación del QT, o inmediatamente después de un envenenamiento.

El latido del corazón se debe a ondas de excitación y contracción miocárdicas uniformemente espaciadas y controladas con precisión. Las corrientes eléctricas durante la despolarización y repolarización iónicas pueden medirse mediante cables eléctricos colocados sobre el cuerpo en sitios específicos (el electrocardiograma) que miden ondas eléctricas. La onda P representa una onda de despolarización en la aurícula. Cuando la aurícula entera se despolariza, la onda vuelve a cero. Tras 0.1 segundos, el ventrículo se encuentra totalmente despolarizado, resultando en el complejo QRS. Los tres picos se deben al modo en que la corriente se extiende por los ventrículos. A continuación se genera la onda T, o repolarización del ventrículo. El intervalo QT medido desde el inicio del complejo QRS hasta el final de la onda T en el ECG estándar representa el periodo de tiempo hasta que se completa la etapa de repolarización del miocito cardíaco (o la despolarización y repolarización del ventrículo). La duración de dicho intervalo puede variar debido a variabilidad genética, enfermedad cardíaca, equilibrio de electrolitos, envenenamiento y fármacos. La prolongación del intervalo QT puede resultar en arritmias ventriculares y muerte súbita.

El síndrome de QTc largo (LQTS) inducido farmacológicamente, es decir, una prolongación de la duración del potencial de acción, es una causa habitual de retirada de un fármaco ordenada por un gobierno. La prolongación del QTc es un factor de riesgo impredecible de taquicardia de torsión de puntas (TdP), una taquicardia ventricular polimórfica que conduce a fibrilación ventricular. El LQTS inducido farmacológicamente comprende aproximadamente el 3% de todas las prescripciones, las cuales, si van seguidas de TdP, podrían constituir una reacción adversa mortal. Los pacientes que toman uno o más fármacos de prolongación del QTc simultáneamente presentan un riesgo incrementado de TdP. Aunque la incidencia global de TdP es estadísticamente rara, aunque clínicamente significativa para el individuo afectado, el ensayo de este efecto farmacológico es un requisito obligatorio para que se autorice la entrada de un fármaco en ensayo clínico.

Unos fármacos estructuralmente diversos comunes bloquean los canales de K+ codificados por el gen relacionado con ether-a-go-go (KCNH2 o hERG) y la corriente de potasio rectificadora tardía (“delayed-rectifier”) cardíaca I^k (KV11.1), resultando en LQTS adquirido. El riesgo incrementado asociado a fármacos de LQTS es un obstáculo importante para el desarrollo de medicamentos, y muchos fármacos han sido retirados durante la fase de desarrollo preclínico, o se les han asignado advertencias de caja negra después de su aprobación, o han sido retirados del mercado. El LQTS autosómico recesivo o dominante basado en 500 posibles mutaciones en 10 genes diferentes codificantes del canal del potasio presenta una incidencia de 1:3000, es decir, aproximadamente 100.000 personas en EE. UU. Los intervalos de QT prolongado o el riesgo de LQTS ocurren en 2,5% de la población estadounidense asintomática. Este síndrome cuando se expresa puede conducir a arritmia cardíaca grave y muerte súbita en los pacientes no tratados. En pacientes con LQTS congénito asintomático bajo medicación inductora de LQTS la probabilidad de muerte cardíaca está incrementada.

La mayoría de las retiradas de medicamento para LTQS adquirida se debe a la obstrucción de los canales de ion potasio codificados por el gen relacionado con ether-a-go-go humano (hERG). Las concentraciones elevadas de medicamentos bloqueantes de hERG generalmente inducen un intervalo de QTc prolongado e incrementan la probabilidad de TdP. Hasta 10% de los casos de TdP inducido farmacológicamente podrían deberse a 13 mutaciones genéticas mayores, 471 mutaciones diferentes y 124 polimorfismos (Chig, C., 2006).

Los sistemas y métodos de detección del LQTS han sido descritos anteriormente. Por ejemplo, la publicación de patente US n° 2010/0004549 (Kohls et al., 2010) da a conocer un sistema y un método de detección del LQTS en un paciente mediante la comparación de un conjunto de datos de ECG recogido del paciente con una pluralidad de bases de datos de ECG recolectados. La pluralidad de bases de datos incluye una base de datos que contiene ECG anteriores del paciente, una base de datos de características conocidas de LQTS adquirido y una base de datos de características conocidas de LQTS genético. La comparación del ECG del paciente con dichas bases de datos facilitará la detección de dichas ocurrencias como cambios en el intervalo Q^t en una sucesión de ECG, cambios en la morfología de la onda T, cambios en la morfología de la onda U y puede encontrar coincidencias con patrones genéticos conocidos del LQTS. El sistema y método es sensible al sexo y etnicidad del paciente, ya que se ha mostrado que estos factores afectan al LQTS, y además es capaz de encontrar correspondencias entre la duración de QT y una base de datos de efectos farmacológicos. El sistema y método asimismo se integran fácilmente en los sistemas de gestión de ECG y dispositivos de almacenamiento actuales.

Se describe un sistema y método para el diagnóstico y tratamiento del LQTS en la publicación de patente US n° 2008/0255464 (Michael, 2008). La invención de Michael incluye un sistema de diagnóstico del síndrome de QT prolongado (LQTS), que deriva una relación (“ratio”) QT/QS2 a partir de una sístole eléctrica (QT) y una sístole mecánica (QS2) con el fin de detectar un intervalo QT prolongado en un ciclo cardiaco del paciente. Un procesador adquiere las sístoles utilizando un micrófono y electrodos torácicos, calcula la relación QT/QS2 y proporciona como salida el resultado en una pantalla. El procesador puede comparar la relación QT/QS2 con un valor umbral almacenado en la memoria, para el diagnóstico del LQTS en el paciente. Una interfaz de usuario proporciona la programación, configuración y personalización de la visualización. Un selector de modo permite que el sistema funcione alternativamente como fonocardiógrafo, electrocardiógrafo de 12 derivaciones o aparato de diagnóstico del LQTS. Un método relacionado para diagnosticar trastornos cardíacos tales como el LQTS incluye la medición de QT y QS2 durante un mismo ciclo cardíaco, el cálculo de la relación QT/QS2 y la comparación del resultado con un valor umbral derivado de datos empíricos. El método puede incluir la medición de sístoles tanto en reposo como durante el ejercicio, y puede utilizarse para ensayos de eficacia farmacológica, optimización de dosis y de causalidad del LQTS adquirido. Se proporciona un método para el tratamiento de las arritmias cardíacas en la publicación de patente Us n° 2007/0048284 (Donahue y Marban, 2007). El método incluye administrar una cantidad de por lo menos un polinucleótido que modula una propiedad eléctrica del corazón. Los polinucleótidos de la invención pueden utilizarse, además, con un vehículo de microadministración, tal como liposomas catiónicos y vectores adenovíricos.

Los métodos, las composiciones, posologías y vías de administración para el tratamiento o la prevención de arritmias han sido descritos por Fedida et al. (2010) en la publicación de patente US n° 2001/00120890. En la invención de Fedida, pueden reducirse o eliminarse las despolarizaciones tempranas y la prolongación del intervalo QT, mediante la administración de compuestos moduladores de los canales iónicos en el sujeto que lo necesita. Los compuestos moduladores de los canales iónicos pueden ser compuestos de éter de cicloalquilamina, particularmente compuestos de éter de ciclohexilamina. Se describen, además, composiciones y fármacos de compuestos moduladores de canales iónicos que inducen despolarizaciones tempranas, la prolongación del intervalo QT o la taquicardia de torsión de puntas. La invención de Fedida, además, da a conocer antioxidantes que pueden proporcionarse en combinación con compuestos moduladores de canales iónicos; entre los ejemplos no limitativos de los antioxidantes se incluyen vitamina C, vitamina E, beta-caroteno, luteína, licopeno, vitamina B2, coenzima Q10, cisteína, así como hierbas, tales como arándano, cúrcuma (curcumina), extractos de semillas de la uva o de corteza del pino, y ginkgo.

Sumario de la invención

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Cualesquiera referencias en la descripción a métodos de tratamiento se refieren a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para la utilización en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para el diagnóstico).

El crizotinib (Xalkori®) y el nilotinib (Tasigna®) son inhibidores de la tirosina cinasa aprobados para el tratamiento del cáncer pulmonar no microcítico y la leucemia mieloide crónica, respectivamente. Se ha mostrado en ambos que resultan en la prolongación del Qt en seres humanos y animales. Se ha mostrado que los liposomas mejoran los efectos inducidos farmacológicamente sobre el canal k ^r (KV11.1), codificado por el gen relacionado con ethera-go-go humano (hERG). Este estudio se llevó a cabo para determinar si los liposomas asimismo reducirían el efecto del crizotinib y del nilotinib sobre el canal k ^r. Se sometieron a ensayo el crizotinib y el nilotinib en un ensayo de I^Kr in vitro estándar mediante la utilización de células renales embrionarias humanas (HEK) 293 transfectadas establemente con hERG. Se determinaron las respuestas a las dosis y se calcularon las concentraciones inhibidoras al 50% (IC⁵⁰). Al tratar las células HEK 293 con crizotinib y nilotinib que se habían mezclado con liposomas, se produjo una reducción significativa de los efectos inhibidores del canal k ^r de estos dos fármacos. Se encontró que la utilización de agentes encapsulados en liposomas de prolongación del QT, o simplemente la mezcla de dichos fármacos con liposomas, por ejemplo, liposomas vacíos, reducía la afectación cardíaca de los fármacos.

En una forma de realización, la presente invención incluye una composición para prevenir una o más canalopatías cardíacas o afecciones que resultan de irregularidades o alteraciones en los patrones cardíacos, o ambos, en un sujeto humano o animal, que comprende: uno o más agentes farmacológicamente activos que causan por lo menos una de entre inhibición del canal Ik y prolongación del QT, mediante la inhibición de la actividad de un gen relacionado con ether-a-go-go (hERG), y uno o más liposomas, en el que los liposomas son liposomas vacíos y se administran antes, simultáneamente o después de la administración del agente farmacológicamente activo. En un aspecto, la canalopatía cardíaca o la afección que resulta de la irregularidad o alteración del patrón cardíaco es la inhibición de un canal iónico responsable de la corriente rectificadora tardía de K+ en el corazón, taquicardia ventricular polimórfica, prolongación del QTc, LQT2, LQTS, o taquicardia de torsión de puntas. En otro aspecto, la composición se utiliza para el tratamiento o la prevención de la prolongación de la inhibición del canal I^k o de la prolongación del QT inducida por la administración de uno o más fármacos utilizados en el tratamiento de enfermedades cardíacas o no relacionadas con el corazón. En otro aspecto, el agente o agentes activos se seleccionan de entre por lo menos uno de crizotinib, nilotinib, terfenadina, astemizol, gripafloxacina, terodileno, droperidol, lidoflazina, levometadilo, sertindoílo o cisaprida. En otro aspecto, el agente o agentes activos se seleccionan de entre por lo menos uno de: aloxi, amiodarona, trióxido de arsénico, astemizol, bepridilo, cloroquina, clorfeniramina, clorpromazina (torazina), cisaprida, celaxa, citalopram, claritromicina, eritromicina, curcumina, disopiramida, dofetilida, domperidona, doxorrubicina, dronedarona, droperidol, grepafloxacina, haldol, haloperidol, halofantrina, ibutilida, levometadilo, lidoflazina, loratidina, lovostatina, mesoridazona, metadona, metanosulfonanilida, moxifloxacino, palonosetrón, pentamadina, pimozida, prenilamina, probucol, procainamida, propafenona, pirilamina, quinidina, terfenidina, sertindol, sotalol, esparfloxacina, tioridazina o vandetanib. En otro aspecto, la composición se adapta para la administración entérica, parenteral, intravenosa, intraperitoneal u oral. En un aspecto, la composición consiste esencialmente en una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende: uno o más agentes farmacológicamente activos que causan canalopatías cardíacas o afecciones que resultan de irregularidades o alteraciones en los patrones cardíacos y los liposomas vacíos, en la que la cantidad de liposomas vacíos es suficiente para reducir las canalopatías cardíacas o las afecciones que resultan de irregularidades o alteraciones en los patrones cardíacos causados por el agente activo. En otro aspecto, el agente activo y los liposomas pueden unirse o conjugarse entre sí. En otro aspecto, los liposomas comprenden liposomas aniónicos, catiónicos o neutros. En otro aspecto, los liposomas comprenden un lípido o una pared fosfolipídica, en la que los lípidos o los fosfolípidos se seleccionan de entre el grupo que consiste en fosfatidilcolina (lecitina), lisolecitina, lisofosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, esfingomielina, fosfatidiletanolamina (cefalina), cardiolipina, ácido fosfatídico, cerebrósidos, dicetilfosfato, fosfatidilcolina y dipalmitoíl-fosfatidilglicerol, estearilamina, dodecilamina, hexadecilamina, palmitato de acetilo, ricinoleato de glicerol, esterato de hexadecilo, miristato de isopropilo, polímeros acrílicos anfóteros, ácido graso, amidas de ácido graso, colesterol, éster de colesterol, diacilglicerol y diacilglicerolsuccinato. En otro aspecto, la composición comprende, además, un medio de dispersión, solvente o vehículo farmacéuticamente aceptable, en el que el agente activo, el liposoma, o ambos, están disueltos, dispersados o suspendidos en el medio, el solvente o el vehículo. En otro aspecto, los liposomas comprenden DMPC (1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfocolina) y DMPG (1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfo-rac-[1-glicerol]). En otro aspecto, los liposomas comprenden una relación 9.1:1 de DMPC (1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfocolina) a DMPG (1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfo-rac-[1-glicerol]).

En una forma de realización, la presente invención incluye una composición para la prevención o el tratamiento de una o más reacciones adversas derivadas de la administración de un agente terapéuticamente activo o de un fármaco en un ser humano, que causa por lo menos uno de entre la inhibición del canal Ik y la prolongación del QT, mediante la inhibición de la actividad de un gen relacionado con ether-a-go-go (hERG), que comprende: uno o más agentes farmacológicamente activos que causan por lo menos uno de entre la inhibición del canal Ik y la prolongación del QT, y uno o más liposomas, en la que los liposomas son liposomas vacíos y se administran antes, simultáneamente o después de la administración del agente terapéuticamente activo o el fármaco, y los liposomas se proporcionan en una cantidad suficiente para reducir o eliminar la canalopatía de IKr o la prolongación del QT. En un aspecto, el agente terapéuticamente activo o un fármaco se utiliza en la prevención o el tratamiento de una o más enfermedades cardíacas o no cardíacas en el sujeto humano o animal. En otro aspecto, la canalopatía cardíaca o la afección que resulta de la irregularidad o alteración en el patrón cardíaco es la inhibición de un canal iónico responsable de la corriente rectificadora tardía de K+ en el corazón, taquicardia ventricular polimórfica, prolongación del QTc, LQT2, LQTS o taquicardia de torsión de puntas. En otro aspecto, la composición se utiliza para el tratamiento o la prevención de la prolongación de la inhibición del canal IKr o la prolongación del QT inducidas por la administración de uno o más fármacos utilizados en el tratamiento de las enfermedades cardíacas o no relacionadas con el corazón. En otro aspecto, el agente o agentes activos se seleccionan de entre por lo menos uno de crizotinib, nilotinib, terfenadina, astemizol, gripafloxacina, terodileno, droperidol, lidoflazina, levometadilo, sertindoílo o cisaprida. En otro aspecto, el agente o agentes activos se seleccionan de entre por lo menos uno de: aloxi, amiodarona, trióxido de arsénico, astemizol, bepridilo, cloroquina, clorfeniramina, clorpromazina (torazina), cisaprida, celaxa, citalopram, claritromicina, eritromicina, curcumina, disopiramida, dofetilida, domperidona, doxorrubicina, dronedarona, droperidol, grepafloxacina, haldol, haloperidol, halofantrina, ibutilida, levometadilo, lidoflazina, loratidina, lovostatina, mesoridazona, metadona, metanosulfonanilida, moxifloxacino, palonosetrón, pentamadina, pimozida, prenilamina, probucol, procainamida, propafenona, pirilamina, quinidina, terfenidina, sertindol, sotalol, esparfloxacina, tioridazina o vandetanib. En otro aspecto, la composición se adapta para la administración entérica, parenteral, intravenosa, intraperitoneal u oral. En otro aspecto, el agente activo y los liposomas pueden estar unidos o conjugados entre sí. En otro aspecto, los liposomas comprenden liposomas aniónicos, catiónicos o neutros. En otro aspecto, los liposomas comprenden un lípido o una pared fosfolipídica, en los que los lípidos o los fosfolípidos se seleccionan de entre el grupo que consiste en fosfatidilcolina (lecitina), lisolecitina, lisofosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, esfingomielina, fosfatidiletanolamina (cefalina), cardiolipina, ácido fosfatídico, cerebrósidos, dicetilfosfato, fosfatidilcolina y dipalmitoíl-fosfatidilglicerol, estearilamina, dodecilamina, hexadecilamina, palmitato de acetilo, ricinoleato de glicerol, esterato de hexadecilo, miristato de isopropilo, polímeros acrílicos anfóteros, ácido graso, amidas de ácido graso, colesterol, éster de colesterol, diacilglicerol y diacilglicerolsuccinato. En otro aspecto, los liposomas son liposomas esféricos con un diámetro de entre 10 nm y 200 nm. En otro aspecto, los liposomas comprenden DMPC (1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfocolina) y DMPG (1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfo-rac-[1-glicerol]). En otro aspecto, los liposomas comprenden una relación 9.7:1 de DMPC (1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfocolina) y DMPG (1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfo-rac-[1-glicerol]).

En otra forma de realización, la presente invención incluye un método para la prevención o el tratamiento de una o más canalopatías cardíacas, irregularidades o alteraciones en los patrones cardíacos, o ambos, en un sujeto humano o animal, que comprende las etapas de: identificar el sujeto humano o animal que necesita de prevención o tratamiento de una o más canalopatías cardíacas, irregularidades o alteraciones en los patrones cardíacos, o ambos; y administrar en el sujeto humano o animal una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende: uno o más agentes farmacológicamente activos que causan por lo menos uno de entre la inhibición del canal I^k y la prolongación del QT, mediante la inhibición de la actividad de un gen relacionado con ether-a-gogo (hERG); uno o más liposomas, en la que los liposomas son liposomas vacíos y se administran antes, concurrentemente o después de la administración del agente farmacológicamente activo en una cantidad suficiente para prevenir o tratar una o más canalopatías cardíacas, o irregularidades o alteraciones en los patrones cardíacos, y un medio de dispersión, solvente o vehículo farmacéuticamente aceptable opcional, en el que el agente activo, el liposoma, o ambos, se disuelven, dispersan o suspenden en el medio, el solvente o el vehículo. En un aspecto, la composición consiste esencialmente en la cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende: uno o más agentes farmacológicamente activos que causan por lo menos uno de entre la inhibición del canal Ik y la prolongación del QT mediante la inhibición de la actividad de un gen relacionado con ether-a-gogo (hERG), y liposomas vacíos, en la que la cantidad de liposomas vacíos es suficiente para reducir la inhibición del canal Ik o la prolongación del QT. En un aspecto, la canalopatía cardíaca o la afección que resulta de la irregularidad o alteración en el patrón cardíaco es la inhibición de un canal iónico responsable de la corriente rectificadora tardía de K+ en el corazón, taquicardia ventricular polimórfica, prolongación del QTc, LQT2, LQTS o taquicardia de torsión de puntas. En otro aspecto, el agente o agentes activos se seleccionan de entre por lo menos uno de crizotinib, nilotinib, terfenadina, astemizol, gripafloxacina, terodileno, droperidol, lidoflazina, levometadilo, sertindoílo o cisaprida. En otro aspecto, los liposomas comprenden DMPC (1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfocolina) y DMPG (1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfo-rac-[1-glicerol]). En otro aspecto, los liposomas comprenden una relación 9.7:1 de DMPC (1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfocolina) a DMPG (1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfo-rac-[1-glicerol]). En otro aspecto, el agente o agentes activos se seleccionan de entre por lo menos uno de: aloxi, amiodarona, trióxido de arsénico, astemizol, bepridilo, cloroquina, clorfeniramina, clorpromazina (torazina), cisaprida, celaxa, citalopram, claritromicina, eritromicina, curcumina, disopiramida, dofetilida, domperidona, doxorrubicina, dronedarona, droperidol, grepafloxacina, haldol, haloperidol, halofantrina, ibutilida, levometadilo, lidoflazina, loratidina, lovostatina, mesoridazona, metadona, metanosulfonanilida, moxifloxacino, palonosetrón, pentamadina, pimozida, prenilamina, probucol, procainamida, propafenona, pirilamina, quinidina, terfenidina, sertindol, sotalol, esparfloxacina, tioridazina o vandetanib.

En todavía otra forma de realización, la presente invención incluye un método para la prevención o el tratamiento de una o más reacciones adversas derivadas de la administración de un agente terapéuticamente eficaz o un fármaco en un sujeto humano o animal, que comprende las etapas de: identificar el sujeto humano o animal que necesita de prevención o tratamiento de una o más reacciones adversas derivadas de la administración del agente terapéuticamente activo o del fármaco que causa por lo menos uno de entre la inhibición del canal Ik y la prolongación del QT, mediante la inhibición de la actividad de un gen relacionado con ether-a-go-go (hERG), y la administración en el sujeto humano o animal de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende uno o más liposomas, en la que los liposomas son liposomas vacíos y se administran antes, simultáneamente o después de la administración del agente terapéuticamente activo o el fármaco o son liposomas cargados con el agente terapéuticamente activo o el fármaco, y la medición del efecto de la combinación de los liposomas y el agente terapéuticamente activo o el fármaco sobre la canalopatía inducida farmacológicamente, en la que la composición reduce o elimina la canalopatía inducida por el agente terapéuticamente activo o el fármaco. En un aspecto, el agente o agentes activos o fármacos se seleccionan de entre por lo menos uno de: aloxi, amiodarona, trióxido de arsénico, astemizol, bepridilo, cloroquina, clorfeniramina, clorpromazina (torazina), cisaprida, celaxa, citalopram, claritromicina, eritromicina, curcumina, disopiramida, dofetilida, domperidona, doxorrubicina, dronedarona, droperidol, grepafloxacina, haldol, haloperidol, halofantrina, ibutilida, levometadilo, lidoflazina, loratidina, lovostatina, mesoridazona, metadona, metanosulfonanilida, moxifloxacino, palonosetrón, pentamadina, pimozida, prenilamina, probucol, procainamida, propafenona, pirilamina, quinidina, terfenidina, sertindol, sotalol, esparfloxacina, tioridazina o vandetanib.

En otra forma de realización, la presente invención incluye un método para evaluar un fármaco candidato que reduce una canalopatía causada por un agente farmacológicamente activo, en el que el método comprende: (a) administrar un fármaco candidato en un primer subgrupo de los pacientes y un placebo en un segundo subgrupo de los pacientes, en el que la composición se proporciona junto con el agente farmacológicamente activo que causa por lo menos uno de entre inhibición del canal I^k y prolongación del QT, y uno o más liposomas, en el que los liposomas son liposomas vacíos y se administran antes, simultáneamente o después de la administración del agente terapéuticamente activo o el fármaco, (b) medir la canalopatía de un paciente que se sospecha que presenta una canalopatía inducida farmacológicamente de un grupo de pacientes, (c) repetir la etapa (a) después de la administración del fármaco candidato o el placebo, y (d) determinar si la composición reduce la canalopatía inducida farmacológicamente en un grado estadísticamente significativo en comparación con cualquier reducción ocurrida en el segundo subgrupo de pacientes, donde una reducción estadísticamente significativa indica que el fármaco candidato resulta útil en el tratamiento de dicho estado de enfermedad. En un aspecto, el fármaco ha fracasado anteriormente en un ensayo clínico debido a la inhibición del canal Wo la prolongación del QT inducidas farmacológicamente. En otro aspecto, el agente o agentes activos se seleccionan de entre por lo menos uno de: aloxi, amiodarona, trióxido de arsénico, astemizol, bepridilo, cloroquina, clorfeniramina, clorpromazina (torazina), cisaprida, celaxa, citalopram, claritromicina, eritromicina, curcumina, disopiramida, dofetilida, domperidona, doxorrubicina, dronedarona, droperidol, grepafloxacina, haldol, haloperidol, halofantrina, ibutilida, levometadilo, lidoflazina, loratidina, lovostatina, mesoridazona, metadona, metanosulfonanilida, moxifloxacino, palonosetrón, pentamadina, pimozida, prenilamina, probucol, procainamida, propafenona, pirilamina, quinidina, terfenidina, sertindol, sotalol, esparfloxacina, tioridazina o vandetanib. En un aspecto, el método se lleva a cabo in vitro. Breve descripción de los dibujos

Para una comprensión más completa de las características y ventajas de la presente invención, a continuación se hace referencia a la descripción detallada de la invención unto con las figuras adjuntas, en las que:

La figura 1 es un gráfico que representa el efecto de la terfenadina sobre la densidad de corriente de hERG en células HEK 293 transfectadas a 20 mV.

La figura 2 es un gráfico que representa la relación de corriente-voltaje (C-V) de la amplitud de corriente de hERG en células HEK 293 transfectadas y expuestas a terfenadina.

La figura 3 es un gráfico que representa el efecto de la terfenadina sobre la densidad de corriente de hERG en células HEK 293 transfectadas a 20 mV.

La figura 4 es un gráfico que representa la relación C-V de la amplitud de corriente de hERG en células HEK 293 transfectadas y expuestas a terfenadina.

La figura 5 es un gráfico que representa el efecto de E-4031 sobre la densidad de corriente de hERG en células HEK 293 transfectadas a 20 mV.

La figura 6 es un gráfico que representa el efecto de la curcumina sobre la densidad de corriente de hERG en células HEK 293 transfectadas a 20 mV.

La figura 7 es un gráfico que representa la relación C-V de la amplitud de corriente de hERG en células HEK 293 transfectadas y expuestas a curcumina.

La figura 8 es un gráfico que representa el efecto de la curcumina (en forma de curcumina liposómica) sobre la densidad de corriente de hERG en células HEK 293 transfectadas a 20 mV.

La figura 9 es un gráfico que representa la relación C-V de la amplitud de corriente de hERG en células HEK 293 transfectadas y expuestas a curcumina (en forma de curcumina liposómica).

La figura 10 es un gráfico que representa el efecto de la curcumina (liposomas curcumina) sobre la densidad de corriente de hERG en células HEK 293 transfectadas a 20 mV.

La figura 11 es un gráfico que representa la relación C-V de la amplitud de corriente de hERG en células HEK 293 transfectadas y expuestas a curcumina (liposomas curcumina).

La figura 12 es un gráfico que representa el efecto de liposomas sobre la densidad de corriente de hERG en células HEK 293 transfectadas a 20 mV.

La figura 13 es un gráfico que representa la relación C-V de la amplitud de corriente de hERG en células HEK 293 transfectadas y expuestas a liposomas.

La figura 14 es un gráfico que representa el efecto de liposomas E-4031 sobre la densidad de corriente de hERG en células HEK 293 transfectadas a 20 mV.

La figura 15 es un gráfico que representa la relación C-V de la amplitud de corriente de hERG en células HEK 293 transfectadas y expuestas a liposomas E-4031.

La figura 16 es un gráfico que representa el efecto de liposomas terfenadina sobre la densidad de corriente de hERG en células HEK 293 transfectadas a 20 mV.

La figura 17 es un gráfico que representa la relación C-V de la amplitud de corriente de hERG en células HEK 293 transfectadas y expuestas a liposomas terfenadina.

Las figuras 18A y 18B son gráficos que representan las medias de densidad de corriente de cola de kr y la dependencia del voltaje obtenidas mediante la medición de la amplitud de la corriente pico de cola de kr y en presencia de crizotinib, con únicamente liposomas y con crizotinib junto con liposomas.

Las figuras 19A y 19B son gráficos que representan las medias de densidad de corriente de cola de kr y la dependencia del voltaje obtenidas mediante medición de la amplitud de la corriente pico de cola de kr y en presencia de nilotinib, con únicamente liposomas y con nilotinib junto con liposomas.

La figura 20 es un gráfico que representa el efecto in vivo de crizotinib y de liposomas crizotinib sobre el intervalo RR (ms) en corazón de conejo.

La figura 21 es un gráfico que representa el efecto in vivo de crizotinib y de liposomas crizotinib sobre el intervalo PR (ms) en corazón de conejo.

La figura 22 es un gráfico que representa el efecto in vivo de crizotinib y de liposomas crizotinib sobre el intervalo QRS (ms) en corazón de conejo.

La figura 23 es un gráfico que representa el efecto in vivo de crizotinib y de liposomas crizotinib sobre el intervalo QT (ms) en corazón de conejo.

La figura 24 es un gráfico que representa el efecto in vivo de crizotinib y de liposomas crizotinib sobre los intervalos QTC Van der Water en corazón de conejo.

La figura 25 es un gráfico que representa el efecto in vivo de nilotinib y de liposomas nilotinib sobre el intervalo RR (ms) en corazón de conejo.

La figura 26 es un gráfico que representa el efecto in vivo de nilotinib y de liposomas nilotinib sobre el intervalo PR (ms) en corazón de conejo.

La figura 27 es un gráfico que representa el efecto in vivo de nilotinib y de liposomas nilotinib sobre el intervalo QRS (ms) en corazón de conejo.

La figura 28 es un gráfico que representa el efecto in vivo de nilotinib y de liposomas nilotinib sobre el intervalo QT (ms) en corazón de conejo.

La figura 29 es un gráfico que representa el efecto in vivo de nilotinib y de liposomas nilotinib sobre los intervalos QTc Van der Water en corazón de conejo, y

Las figuras 30A y 30B son gráficos que representan la prolongación del QTc en conejos tratados con crizotinib, nilotinib, crizotinib más liposomas, y nilotinib más liposomas. Los animales recibieron una dosis IV de carga a lo largo de un periodo de 10 minutos, seguido de una dosis de mantenimiento a lo largo de un periodo de 15 minutos. Se administraron liposomas por vía IV 5 minutos antes de la dosis de carga de los fármacos. Las dosis de carga y de mantenimiento de crizotinib eran de 1, 2 y 3 mg/kg, y de 0.4, 0.8 y 1.2 mg/kg, respectivamente (figura 30A). Las dosis de nilotinib eran de 2, 4 y 5.5 mg/kg, y de 0.14, 0.28 y 0.39 mg/kg, respectivamente (figura 30B). Las dosis de liposomas eran 9 veces más altas que las dosis de fármaco, en mg/kg. Los valores representados son de medias errores estándares de la media, para 3 conejos por grupo. Se llevaron a cabo comparaciones estadísticas tal como se indica en las figuras 23 y 28.

Descripción detallada de la invención

Aunque la preparación y utilización de diversas formas de realización de la presente invención se exponen en detalle a continuación, debe apreciarse que la presente invención proporciona muchos conceptos inventivos aplicables que pueden realizarse en una amplia diversidad de contextos específicos. Las formas de realización específicas expuestas en la presente memoria son únicamente ilustrativas de maneras específicas para preparar y utilizar la invención y no son limitativas del alcance de la invención.

Con el fin de facilitar la comprensión de la presente invención, se definen varios términos posteriormente. Los términos definidos en la presente memoria presentan los significados habitualmente entendidos por el experto ordinario en la materia en los campos relevantes a la presente invención. Los términos, tales como “un” o “una” y “el” o “ la” no pretenden referirse a únicamente una entidad singular, sino incluir la clase general de la que podría utilizarse un ejemplo específico a título ilustrativo. La terminología en la presente memoria se utiliza para describir formas de realización específicas de la invención, aunque el uso de la misma no es limitativa de la invención, excepto según se indica de manera general en las reivindicaciones.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “curcumina”, “diferuloílmetano” o “1,7-bis(4-hidroxi-3-metoxifenil)-1,6-heptadién-3,5-diona” es un compuesto presente de forma natural que es el principio colorante principal que se encuentra en los rizomas de la planta Curcuma longa (ver, por ejemplo, la patente US n° 5.679.864, de Krackov et al.).

El término “ liposoma” se refiere a una cápsula en la que la pared o membrana de la misma está formada por lípidos, especialmente fosfolípidos, con la adición opcional de un esterol, especialmente colesterol.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “in vivo" se refiere a la presencia en el interior del cuerpo. La expresión “in vitro" utilizada tal como se utiliza en la presente solicitud debe entenderse que indica una operación realizada en un sistema no vivo.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “receptor” incluye, por ejemplo, moléculas que residen sobre la superficie de las células y median en la activación de las células por ligandos activadores, aunque asimismo se utilice genéricamente para referirse a cualquier molécula que se une específicamente a una contrapartida. Un miembro de una pareja de unión específica se denominaría arbitrariamente “receptor”, mientras que la otra se denominaría “ ligando”. No es necesario que haya ninguna función fisiológica particular que esté asociada a dicha unión específica. De esta manera, por ejemplo, un “receptor” podría incluir anticuerpos, partes inmunitariamente reactivas de anticuerpos, moléculas que están diseñadas para complementar otras moléculas, y de esta manera, etc. En efecto, en el contexto de la presente invención, la distinción entre “receptor” y “ligando” es totalmente irrelevante; la invención se refiere a parejas de moléculas, dentro de las cuales las moléculas se unen específicamente entre sí con mayor afinidad que cualquiera de ellas se une a otras moléculas. Sin embargo, para facilitar la explicación, el método de la invención se expone en términos de receptor diana (nuevamente, simplemente una molécula para la que se busca una contrapartida que reaccione o se una a ella) y “ligando”, que simplemente representa esa contrapartida.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “tratamiento” se refiere al tratamiento de las afecciones mencionadas en la presente memoria, particularmente en un paciente que demuestra síntomas de la enfermedad o trastorno.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “que trata” se refiere a cualquier administración de un compuesto de la presente invención, e incluye: (i) inhibir la enfermedad en un animal que experimenta o manifiesta la patología o sintomatología del enfermo (es decir, detener el desarrollo ulterior de la patología y/o la sintomatología), o (ii) mejorar la enfermedad en un animal que experimenta o manifiesta la patología o sintomatología del enfermo (es decir, revertir la patología y/o la sintomatología). La expresión “que controla” incluye tratar, erradicar, mejorar o, alternativamente, reducir la gravedad de la afección que se controla.

Las expresiones “cantidad eficaz” o “cantidad terapéuticamente eficaz” indicadas en la presente memoria se refieren a la cantidad del compuesto de la invención que inducirá la respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, animal o ser humano que busca el investigador, veterinario, médico u otro profesional clínico.

Las expresiones “administración de” o “administrar un” compuesto tal como se utilizan en la presente memoria debe entenderse que se refieren a proporcionar un compuesto de la invención al individuo que necesita de tratamiento en una forma que pueda introducirse en el cuerpo de dicho individuo en una forma terapéuticamente útil y en una cantidad terapéuticamente útil, incluyendo, aunque sin limitación: formas de administración oral, tales como comprimidos, cápsulas, jarabes, suspensiones y similares; formas de administración inyectables, tales como IV, IM o IP, y similares; formas de administración transdérmica, incluyendo cremas, gelatinas, polvos o parches; formas de administración bucal; polvos para inhalación, espráis , suspensiones y similares, y supositorios rectales.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “administración intravenosa” incluye la inyección y otros modos de administración intravenosa.

La expresión “farmacéuticamente aceptable” tal como se utiliza en la presente memoria indica un portador, diluyente o excipiente que debe ser compatible con los demás ingredientes de la formulación y no perjudicial para el receptor del mismo.

El término “hERG” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere al gen humano relacionado con Ether-ágo-go, que está codificado por el gen KCNH2 (ver www.genecards.com). El gen KCNH2 codifica una proteína asimismo conocida como Kv11.1, que es la subunidad alfa de un canal de ion potasio que contribuye a la actividad eléctrica del corazón coordinadora del latido del mismo. Específicamente, el canal que contiene hERG actúa de mediador en la repolarización de la corriente Ik en el potencial de acción cardíaco. La inhibición de la capacidad del canal iónico de conducir la corriente eléctrica a través de la membrana celular resulta en un trastorno potencialmente mortal llamado síndrome de QT largo. Se han encontrado que varios fármacos clínicamente satisfactorios presentes en el mercado inhiben hERG, creando de esta manera un riesgo de muerte súbita. Este efecto secundario inducido por el fármaco ha provocado que la inhibición de hERG sea una diana clave que debe evitarse durante el desarrollo farmacológico.

La expresión “canal de IKr” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la corriente rectificadora tardía “rápida” (IKr) que conduce los iones de potasio (<+) hacia el exterior de las células musculares del corazón (miocitos cardíacos). Esta corriente resulta crucial para temporizar correctamente el retorno al estado de reposo (repolarización) de la membrana celular durante el potencial de acción cardíaco. Con frecuencia, los términos “canales de hERG” e I<r se utilizan indistintamente, aunque hERG forma parte de los canales presentes naturalmente en el cuerpo, a los que se hace referencia más habitualmente por el nombre de la corriente eléctrica que se ha medido en ese tipo celular, que en el caso del corazón es I<r.

Ejemplo 1. Composiciones y métodos para controlar la duración de la repolarización del intervalo QT del ventrículo cardíaco.

En la presente memoria se dan a conocer composiciones y métodos para controlar la duración de la repolarización del intervalo QT del ventrículo cardíaco. El método de la presente invención comprende administrar en el sujeto que lo necesita una modificación o una interferencia funcional con un agente terapéutico, o un defecto congénito que, si se deja sin modificar, puede inducir la prolongación de la repolarización del potencial de acción del miocito cardíaco, taquicardia de torsión de puntas y el síndrome de QT largo. La presente invención comprende la unión de un fármaco prolongador de QT con un liposoma antes de la administración parenteral (intravenosa o subcutánea), o la administración de liposomas vacíos antes o simultáneamente con uno o más agentes terapéuticos que es conocido que presentan un riesgo elevado de prolongación de QT, o inmediatamente después de un envenenamiento. Los resultados de la presente invención indican que el efecto adverso de la curcumina y otros fármacos prolongadores de QT resulta anulado por la curcumina liposómica y con mezclas sometidas a agitación con vórtex de liposomas vacíos de una manera dependiente de la dosis.

Los canales iónicos son proteínas integrales de membrana formadoras de poros, que establecen y controlan el gradiente electroquímico (el potencial de acción) a través de la membrana plasmática y de los orgánulos intracelulares de las células mediante la modulación de los iones. Los canales se organizan en forma de un círculo de proteínas empaquetadas en torno a un poro lleno de agua. El paso de los iones por el canal en fila de a uno, puede ser abierto o cerrado por señales químicas o eléctricas, la temperatura o por una fuerza mecánica. La disfunción del canal iónico puede estar asociada a mutaciones en los genes que codifican estos canales o con fármacos que interfieren en el flujo de los iones. La disfunción en los canales de los electrolitos cardíacos de potasio, calcio y sodio en la membrana de los miocitos cardíacos induce defectos en las corrientes eléctricas y en el potencial de acción normal que son necesarios para la contracción coordinada de los miocitos y el mantenimiento de la circulación sanguínea normal, resultando en síntomas cardíacos de tipo clínico. Las funciones cruciales de los 40 elementos y 12 subfamilias de canales de potasio activados por voltaje (Kv) son repolarizar la membrana celular después de los potenciales de acción. El flujo de iones de potasio en los canales de <+ de los miocitos cardíacos modula las corrientes electrolíticas, y los niveles de despolarización y repolarización. Los defectos congénitos e inducidos farmacológicamente en los canales están asociados a morbilidad y mortalidad en individuos por lo demás asintomáticos. El canal correctamente codificado por el gen KCNH2 o hERG (gen humano relacionado con ether-a-go-go) contiene proteínas denominadas Kv11.1 y la subunidad a de Lv11.1 de la corriente de <+ rectificadora rápidamente activadora I<r. Este canal de membrana celular media en la I<r de corriente rectificadora tardía “rápida” mediante conducción de los iones <+ hacia el exterior de los miocitos cardíacos y es un mecanismo crucial para permitir que el potencial cardíaco vuelva al estado de reposo (repolarización).

Aunque se desconoce la estructura tridimensional del dominio poro del canal de hERG, se ha obtenido información sobre su estructura putativa a partir de datos de mutagénesis dirigida a sitio (Stansfeld PJ, 2007). En la cavidad de poro del canal de hERG, puede modificarse el flujo y las corrientes iónicas según los estados abierto o cerrado, y mediante interacciones farmacológicas en sitios clave de alta afinidad de unión a fármaco. Estos sitios son los residuos aminoácidos aromáticos (Y652 y F656) en las hélices internas del poro. Las corrientes más importantes mediadas por fármacos, la corriente I<r (rápida) tardía sensible que repolariza las células miocárdicas y las corrientes Iks (lenta) rectificadora se muestran en el electrocardiograma (ECG) estándar como el intervalo QT, que, al corregirlo para la frecuencia cardíaca, se define convencionalmente como QTc.

Los defectos congénitos en los canales iónicos descritos por primera vez por Jervell A. (1957) alteran el equilibrio de las corrientes que determinan la repolarización del potencial de acción y predisponen a arritmias de LQTS y la muerte cardíaca súbita. Se han identificado mutaciones que dan lugar a subtipos de LQTS congénito, síndromes arritmogénicos hereditarios caracterizados por una función anormal de los canales iónicos, repolarización tardía, intervalo QT prolongado en el electrocardiograma y una taquicardia ventricular polimórfica potencialmente mortal conocida como taquicardia de torsión de puntas. Diferentes mutaciones en el gen hERG y sus proteínas codificadas se traducen en defectos de la función de los canales y en varios síndromes clínicos. El síndrome del QT largo congénito de tipo 2 (LQT2) resulta de mutaciones de sentido erróneo A614V en el gen KCNH y se caracteriza por cuatro clases de pérdida de la proteína Kv11.1 y la consiguiente disfunción del canal. Entre estos canales Kv11.1 anormales se incluye (clase 1), una proteína de canal iónico dominante y deficiente en tráfico celular habitualmente debida a mutaciones de sentido erróneo, (clase 2), un fenotipo corregible al incubar células durante 24 horas a 27° de temperatura o bajo exposición al fármaco E-4031 (Zhou Z, 1999 (clase 3)), activación de canales, y (Clase 4) permeación) (Anderson C.L., 2006). El bloqueo de cualquiera de ellos y, particularmente, la corriente “rápida”, prolonga el potencial de acción y se manifiesta en el ECG como un intervalo QT prolongado y en la aparición de otras anormalidades de onda T o U. Bajo tales circunstancias, la activación de una corriente de despolarización hacia el interior induce una mayor dispersión de la repolarización. Esto último resulta en una recuperación heterogénea de la excitabilidad y la inducción de taquicardia de torsión de puntas (TdP), una contracción ventricular prematura (CVP). (R- 0n-T). En ésta, la despolarización ventricular, es decir, la onda R, ocurre simultáneamente con el periodo refractario relativo al final de la repolarización (la segunda mitad de la onda T) e inicia ondas T-U patológicas y torsiones. La TdP sostenida conduce a una zona funcionalmente refractaria en el miocardio y a arritmias cardíacas. La lectura de ECG en la torsión muestra una taquicardia ventricular polimórfica rápida con una torsión característica del complejo QRS en torno a la línea basal isoeléctrica. Esta se caracteriza por una rotación del eje eléctrico del corazón hasta en 180°, intervalos R-R largos y cortos, y clínicamente ello conduce a una caída de la presión sanguínea arterial, síncope, degeneración en fibrilación ventricular y muerte súbita.

En el ECG, el retraso del intervalo de corriente Ik es sinónimo de prolongación de QT en el caso de que sea superior a 440 ms en hombres y a 460 ms en mujeres. La inhibición farmacológica de los canales de K+ hERG con fármacos estructural y terapéuticamente diversos se traduce en la forma clínicamente adquirida de síndrome de QT largo (LQTS). Aunque los fármacos que prolongan el QT representan dos a tres por ciento del total de prescripciones en el mundo desarrollado, la incidencia informada de prolongación de QT y las dosis varían significativamente en las diferentes clases de fármacos. Entre estas se incluyen antiarrítmicos de clase 1A y de clase III, antihistamínicos, antimicrobianos, antipsicóticos, antidepresivos tricíclicos, procinéticos y antianginosos. Recientemente se ha informado de que los curcuminoides bloquean los canales cardíacos humanos del K+ (Moha ou Maati H., 2008).

Asimismo puede producirse una incidencia incrementada de prolongación de QT en presencia de hipomagnesemia, hipocalemia, hipocalcemia, hipoxia, acidosis, insuficiencia cardíaca, hipertrofia ventricular izquierda, frecuencia cardíaca lenta, sexo femenino, hipotermia y hemorragia subaracnoidea. La gravedad de la arritmia en un intervalo QT dado, y el desarrollo de TdP, varía de fármaco a fármaco y de paciente a paciente, y puede no estar linealmente relacionada con la dosis o concentración plasmática de un fármaco específico. Sin embargo, los fármacos cardíacos antiarrítmicos que afectan al flujo de salida de potasio (K+) (clase III) y los fármacos no cardíacos que alteran significativamente la repolarización, medida como una prolongación del intervalo QT, predisponen al paciente a sufrir taquicardia de torsión de puntas. Entre los factores adicionales asociados a una mayor tendencia a TdP se incluyen el síndrome de QT largo hereditario (LQTS). Las causas más comunes de LQTS hereditario son las mutaciones en genes.

El KCNQ1 codifica KvLTQI, la subunidad alfa del canal rectificador retrasado lento de potasio se expresa a nivel elevado en el corazón. La corriente por el canal heterómero durante la interacción con la subunidad beta minK se conoce como Iks. En el caso de que presente una mutación de sentido erróneo, se reduce el nivel de corriente repolarizante necesario para terminar el potencial de acción. Estas mutaciones LTQ1 representan 35% de los casos y son los menos graves, causando habitualmente un síncope.

El KCNH2 o el gen de hERG en el caso de encontrarse mutado representa 30% de todos los casos genéticos y es la subunidad del canal rectificador retrasado rápido de potasio hERG+MiRP1. La corriente por este canal conocido como IKr es responsable de la terminación del potencial de acción y de la longitud del intervalo QT. En el caso de que esté reducida, conduce a LQT2. La corriente rápida no solo es la más sensible a fármacos, sino que asimismo está asociada al efecto proarrítmico en las células de His-Purkinje y en las células M en el miocardio medioventricular. Las LQT inducidas farmacológicamente ocurren con los fármacos antiarrítmicos, antihistamínicos, antipsicóticos y otros fármacos. La combinación de LQTS genético y fármacos inductores de LQTS incrementa la susceptibilidad a efectos secundarios mortales. La mayoría de fármacos que causan LQTS bloquean la corriente Ik mediante el gen hERG. Este canal muestra una unión del fármaco no deseada a la tirosina 652 y a la fenilalanina 656 que, cuando está unido, bloquea la conducción de la corriente. Algunas mutaciones no comunes aunque mortales en el gen SCN5A retrasan la inactivación de la subunidad alfa del canal de sodio, prolongando el flujo de entrada de Na+ y la corriente iNa durante la despolarización. La corriente despolarizante continua por el canal en una fase tardía del potencial de acción induce una corriente en estallido tardía (LQT3).

Los canales de calcio de tipo L se reabren durante la etapa de meseta del potencial de acción después de LQTS como “despolarizaciones posteriores tempranas”. Su actividad es sensible a la estimulación adrenérgica e incrementa el riesgo de muerte súbita durante los estados adrenérgicos en presencia de una repolarización alterada. En estos sujetos, la TdP puede precipitarse por el ejercicio físico o una sorpresa emocional no relacionada con fármacos. Existen mutaciones no comunes y raras adicionales denominadas LQT4-13.

Aparte de la frecuencia cardíaca, la duración de QT varía con la técnica de registro y medición, la actividad simpático-vagal, fármacos, trastornos de electrolitos, enfermedades cardíacas o metabólicas, variación diurna y mutaciones de LQT2 genéticas. Estos parámetros causan que la incidencia informada de TdP inducido farmacológicamente tenga una asociación laxa con los estudios clínicos de desarrollo farmacológico, la vigilancia postcomercialización, los estudios epidemiológicos y los informes de caso de carácter anecdótico. La detección de la prolongación de QT durante el desarrollo preclínico de fármacos puede llevar al abandono e impide cualquier explicación completa de la incidencia real de la prolongación de QT relacionada con fármacos (Yap, 2003). Se han retirado varios fármacos prolongadores de QT durante el desarrollo o después de la comercialización. Entre ellos se incluyen terfenadina, astemizol, gripafloxacino, terodileno, droperidol, lidoflazina, levometadilo, sertindoílo, levometadilo y cisaprida.

La susceptibilidad genética y relacionada con la edad: existen predisposiciones a los acontecimientos farmacológicos de prolongación de QT: ello incluye los pacientes con enfermedad cardíaca estructural, que toman inhibidores de C450 hepático, que presentan una predisposición genética o polimorfismos del ADN. Las mujeres de edad avanzada generalmente son más susceptibles que las mujeres jóvenes, mientras que los varones jóvenes presentan una susceptibilidad incrementada en comparación con varones de edad avanzada.

La terapia actual para los fármacos prolongadores de QT y en la sensibilidad a QT genotípica: terapia farmacológica: el tratamiento de primera línea para LQTS, una enfermedad potencialmente mortal con una incidencia de 13% de parada cardíaca y muerte súbita. (i) Dexrazoxano (un derivado cíclico de piperazindiona del ácido edético). Elimina, aunque no elimina, el potencial de cardiotoxicidad inducido por antraciclina asociado a la administración de más de 300 mg/M2 de epirrubicina en pacientes con cáncer de mama. La utilización de dexrazoxano por vía intravenosa está limitada exclusivamente a las antraciclinas, es decir, está contraindicada en regímenes quimioterápicos que no contienen una antraciclina. (ii) p-bloqueantes: el propanol como terapia de estimulación simpática puede reducir el riesgo de acontecimientos cardíacos en un 81% en el LQT1; además, puede suprimir el aumento por isoproteranolol de la dispersión transmural de la repolarización (TDR) y la TdP. Sin embargo, bajo un tratamiento de propanolol adecuado, 10% sigue desarrollando acontecimientos cardíacos. En sujetos con LQT2, el riesgo de acontecimientos cardíacos se ve reducido en 59%; sin embargo, 23% todavía desarrolla acontecimientos cardíacos. (iii) Bloqueantes del canal de sodio: 32% de los sujetos con LQT3 desarrolla acontecimientos cardíacos bajo tratamiento adecuado con propanolol. En estos sujetos con bajas frecuencias cardíacas, los p-bloqueantes pueden incrementar la dispersión de la repolarización y el riesgo de TdP. Los sujetos con LQT3 con mutaciones del canal de sodio que impiden la inactivación e inducen un incremento persistente de iNa tardío durante la fase 2 del potencial de acción, una causa de prolongación de QT utilizando mexiletina (Shimizu W., 1997), un bloqueante de clase IB del canal de sodio, acorta el intervalo de QT mediante la reducción de TDR. (iv) Complementación de potasio: tanto Ik como Ik1 son sensibles a los niveles extracelulares de potasio. La elevación de las concentraciones plasmáticas en 1.5 mEq/l sobre el nivel basal puede reducir el intervalo de QTc en 24% (Compton, 1996, y Etheredge, 2003), aunque no hay pruebas de que se traduzca en una protección frente a las arritmias. (v) Abridores del canal de potasio: el nicorandilo, un abridor del canal de potasio administrado por vía intravenosa a razón de 2 a 20 pmol/l acorta el intervalo de QT en sujetos con LQT1 o LQT2 (Shimizu W., 2000). (vi) Potenciadores de corriente hERG: RPR 260243 revierte la prolongación del potencial de acción inducida por dofetilide en miocitos de cobaya (Kang J., 2005). (vii) Bloqueantes del canal de calcio: el flujo de entrada de calcio por canales de calcio de tipo L mantiene la etapa de meseta, la duración del potencial de acción y el intervalo de QT del potencial de acción. El verapamilo, un bloqueante del canal de calcio de tipo L e inhibidor de iNa que acorta el intervalo de QT y suprime la TdP en modelos de LQTS, se utiliza en pacientes con taquicardia reentrante nodal aurículoventricular paroxística con QT significativamente acortado a frecuencias cardíacas bajas. La EC50 inhibidora de hERG es de 83 pM. Al administrar verapamilo a una dosis apropiada, pueden evitarse las torsiones de puntas (Fauchier L., 1999). (viii) Corrección de defectos de tráfico: los defectos en el transporte de proteínas y glucoproteínas que forman los poros iónicos transmembranarios en la membrana de las células cardíacas reducen la amplitud de las corrientes correspondientes y tienen un papel en el LQTS. La fexofenadina, un metabolito de la terfenadina o la tapsigargina, puede rescatar dicho tráfico defectuoso sin bloquear la corriente de hERG en mutaciones con sentido erróneo seleccionadas que están asociadas a LQT2. (ix) Potenciadores de acoplamiento de uniones comunicantes (“gap junctions”): las uniones comunicantes son canales intercelulares que permiten transferir tanto moléculas pequeñas como corriente entre células cardíacas. La insuficiencia y la hipertrofia cardíacas están asociadas al desacoplamiento de las uniones comunicantes. La potenciación de éstas puede producir un efecto antiarrítmico en el que la dispersión de la repolarización está potenciada en el LQTS. La infusión de un péptido sintético: AAP10, un potenciador de uniones comunicantes, ha reducido el intervalo QT en una preparación de ventrículo izquierdo de conejo (Quan XQ, 2007).

El presente estudio de laboratorio no clínico descrito en la presente invención se llevó a cabo de acuerdo con las Good Laboratory Practice Regulations de la United States Food and Drug Administration (FDA), título 21 del CFR, parte 58; los Principals of Good Laboratory Practice de la Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) [C(97) 186/Final], publicados el 26 de noviembre de 1997, y la Good Laboratory Practice Standards Ordinance n.° 21, de 26 de marzo de 1997, del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar Social japonés (MHLW).

Descripción general del estudio: 1) artículos de ensayo: curcumina, liposomas vacíos, curcumina liposómica (0.014, 0.20, 3.4 y 11.4 pM); 2) sistema de ensayo: estirpe celular HEK 293 transfectada y que expresa hERG; 3) ensayo realizado: adquisición y análisis de corriente de pinza de parche en células completas; 4) temperatura experimental: 35 ± 2°C.

Aplicación del artículo de ensayo: 1) 5 minutos de exposición a cada concentración en presencia de perfusión en circuito cerrado (2 ml/min); 2) 5 minutos para los periodos de lavado en presencia de una perfusión de flujo al través (2 ml/min) además de una perfusión en circuito cerrado (2 ml/min); 3) se añadieron los controles positivos (E-4031 100 nM y terfenadina (0.01,0.03 y 0.1 |^j M)) a las células previamente no expuestas que se habían obtenido de la misma estirpe celular y pase, durante un periodo de 5 minutos en presencia de perfusión en circuito cerrado (2 ml/min); 4) se sometió a agitación con vórtex cada uno de curcumina, terfenadina y E-4031 durante 15 minutos con liposomas vacíos y después se sometieron a ensayo. Las células se encontraban bajo estimulación continua del protocolo de pulsos durante la totalidad de los estudios y se registraron las corrientes celulares tras 5 minutos de exposición a cada condición.

Diseño de la adquisición de datos: tasa(s) de adquisición: 1.0 kHz. Diseño para la adquisición durante el ensayo de los compuestos o el equivalente de vehículo/solvente: 1 registro realizado bajo la condición basal; 1 registro realizado en presencia de la concentración 1, 2, 3 o 4, y 1 registro realizado después del lavado (solo después de la cuarta concentración). Diseño de la adquisición durante el ensayo de los controles positivos: 1 registro realizado en condición basal; 1 registro realizado en presencia de control positivo y n=número de células que respondieron pinzadas y en las que pudo aplicarse la totalidad del protocolo indicado anteriormente.

Análisis estadístico: se realizaron comparaciones estadísticas mediante la utilización de pruebas t de Student emparejadas. Para los artículos de ensayo, las corrientes registradas después de la exposición a las diferentes concentraciones de artículo de ensayo se compararon estadísticamente con las corrientes registradas bajo las condiciones basales. Las corrientes, registradas después del lavado, se compararon estadísticamente con las corrientes medidas después de la concentración más alta de artículo de ensayo. De la misma manera, las corrientes registradas después del control positivo se compararon con las corrientes registradas bajo las condiciones basales. Las diferencias se consideraron significativas cuando p<0.05.

Criterios de exclusión de datos: 1) marco temporal de exposición al fármaco no respetado; 2) inestabilidad del sello; 3) la célula pinzada no ha generado corriente de cola; 4) efecto no significativo del control positivo, y 5) variabilidad superior a 10% en la amplitud transitoria de la capacitancia a lo largo del periodo del estudio.

Se determinaron los efectos in vitro de la curcumina, la curcumina liposómica, los liposomas vacíos y los controles positivos E-4031 y terfenadina sobre la corriente rectificadora tardía humana mediante la utilización de células renales embrionarias humanas (HEK) 293 transfectadas con el gen ether-a-go-go humano (hERG).

La inhibición del canal k ^r y la toxicidad cardíaca se han convertido en un peligro importante de algunas clases de fármacos, en particular los que inducen la inhibición del canal k ^r y/o la prolongación in vivo de QT. Durante el desarrollo preclínico de fármacos se ha encontrado que muchos presentan esta actividad, lo que ha llevado al abandono de muchas clases prometedoras de fármacos. Como consecuencia de esta actividad se han retirado varios fármacos prolongadores de QT o han tenido un uso muy limitado. Entre los ejemplos se incluyen, aunque sin limitación: crizotinib, nilotinib, terfenadina, astemizol, gripafloxacino, terodileno, droperidol, lidoflazina, levometadilo, sertindoílo y cisaprida.

Existe un número grande de fármacos actualmente comercializados que presentan un riesgo incrementado de LQTS y TdP. Se presentan a continuación algunos ejemplos no limitativos:

Aloxi o palonasitrón HCl: antagonista de receptor de 5-hidroxitriptamina-3, un fármaco intravenoso para la náusea y vómitos postoperatorios (Eisai Corp., Helsinn, Suiza). Entre los acontecimientos adversos (AA) se incluyen: >2% EKG, 5% prolongación de QT, 4% bradicardia, a dosis superiores a 2.25 mg.

Amiodarona (cordorona X): agente antiarrítmico de clase III para el síndrome de WPW, para las arritmias ventriculares: riesgo mujeres>varones, considerado bajo. Entre 1% y 3% presentan predominantemente efectos de clase III. Disfunción del nodo SA y potenciación de las arritmias cardíacas. “MOA” es la prolongación de la duración del potencial de acción de la célula miocárdica y del periodo refractario; un incremento de 10% en los intervalos de QT se asocia a un agravamiento de las arritmias y la TdP, y la inhibición no competitiva a- y padrenérgica. Prolongación de QTc con y sin TdP con la administración concomitante de fluoroquinolonas, antibióticos macrólidos o azolas. TEVA Pharmaceuticals Ind. Ltd.

Trióxido de arsénico: bloqueante de hERG ineficiente (IC⁵⁰>300 ^j M). Podría presentar un efecto indirecto sobre la corriente de hERG; fármaco anticáncer. El fabricante es Cephalon, Inc.

Astemizol*: antagonista de los receptores de las histaminas H1 y H3 de segunda generación y antipalúdico comercializado por Janssen. Es estructuralmente similar a la terfenidina y al haloperidol. Originariamente se utilizó para la rinitis alérgica, pero ya no se encuentra disponible en EE. UU. debido a la incidencia de arritmias raras aunque mortales. La IC⁵⁰ es de 50 nM, corriente de cola de hERG.

Bepridilo: agente bloqueante de los canales de calcio de acción prolongada y baja potencia (EC⁵⁰: 10 ^j M). Ambos canales de K⁺ son dianas sensibles a los bloqueantes del canal del calcio. Bloquea el componente rápido de hERG de una manera dependiente de la concentración (EC⁵⁰: 0.55 j M) y asimismo inhibe el canal KvLQTI/IsK de K⁺ , que genera los componentes lentos de la corriente rectificadora tardía cardíaca de K⁺ . Estos cambios pueden conducir a un QT largo. Asimismo es un antagonista de la calmodulina con actividades antiangina de esfuerzo y antihipertensiva significativas. Fabricante: TOCRIS Bioscience Inc.

Cloroquina: antipalúdico: Novartis Pharma AG. Inhibe los canales de hERG de una manera dependiente de la concentración y del tiempo. La concentración inhibidora semimáxima (IC⁵⁰) es de 2.5 j M.

Clorofeniramina: bloqueante antihistamina H1 de primera generación de baja potencia que induce la prolongación de QT, es decir, un bloqueante de hERG de una manera dependiente de la concentración. Afecta los canales en los estados activado e inactivado, aunque no en los estados cerrados. La sobredosis de antihistamínicos de primera y segunda generación ejerce efectos arrítmicos al afectar las corrientes de K⁺ .

Clorpromazina (torazina): antipsicótico/antiemético/antiesquizofrénico desarrollado por Rhone-Poulec en 1950. Causa arritmias cardíacas (Fowler NO, 1976).

Cisaprida: utilizado como agente gastroprocinético por Janssen Inc. Fue retirada en 2000 debido a su efecto secundario de síndrome de QT largo (Layton D., 2003).

Celaxa (citalopram): un prolongador de QT, Forest Labs: un inhibidor de la recaptación selectiva de la serotonina (SSRI), que prolonga el intervalo de QTc mediante el bloqueo directo del canal hERG de potasio, altera la expresión de la proteína hERG en la membrana celular, reduciendo eficazmente el número de canales de potasio hERG y bloqueando la corriente de calcio de tipo I, conduciendo a una despolarización prolongada (Witchel et al.).

Claritromicina y eritromicina: antibióticos, las mujeres son más sensibles que los varones. Ambos causan una prolongación de QT y TdP. La eritromicina reduce la corriente de hERG de una manera dependiente de la concentración, con una IC⁵⁰ de 38.9, y la claritromicina, de 45.7 j M, a concentraciones clínicamente relevantes.

Curcumina (diferuloílmetano): inhibe la corriente de hERG (Moha ou Maati H., 2008). La curcumina a una IC⁵⁰ de 3.5 j M es una molécula de potencia moderada (Katchman AN, 2005).

Disopiramida: fármaco antiarrítmico de clase 1 (clasificación de Vaughan Williams) asociado a LQTS adquirida. Prolonga el intervalo de QT y amplia el complejo QRS QT de una manera dependiente de la dosis (IC⁵⁰: 7.23 j M). bloquea los canales tanto de sodio como de potasio; deprime la despolarización de fase “O” y prolonga la duración del potencial de acción de las células cardíacas normales en tejidos auriculares y ventriculares.

Dofetilide: un agente antiarrítmico de clase III comercializado por Pfizer como Tikosyn cápsulas orales, utilizado para el mantenimiento del ritmo sinusal y la fibrilación auricular. Bloquea selectivamente ^{k r} , la corriente rectificadora tardía hacia el exterior de potasio. La TdP es un efecto secundario grave con una incidencia relacionada con la dosis de 0.3 a 10.5%. Es un incremento de dos veces en el riesgo de muerte si el QTc pretratamiento es superior a 479 ms. Un bloqueante de hERG de alta potencia: la IC⁵⁰ es de 10 nM.

Domperidona: un fármaco antidopaminérgico utilizado como agente antinauseante. De Janssen Pharmaceuticals, no se encuentra disponible en EE. UU. Se asocia a parada cardíaca y arritmias, y a prolongaciones de QT incrementadas en neonatos (Djeddi D., 2008).

Doxorrubicina: a 30 ^j M prolonga el QTc en 13%; causa una prolongación aguda de QT sin bloquear significativamente los canales de hERG, aunque inhibe las IK (IC⁵⁰: 4.78 ^j M).

Dronedarona: análogo no yodado de la amiodarona (bloquea la hERG a una IC⁵⁰ de 70 nM) que ha sido utilizado para más de 40,000 pacientes con fibrilación auricular. Las colas de hERG de tipo salvaje medidas a -40 mV tras la activación a 30 mV se bloquearon con valores de IC⁵⁰ de 59 nM. Inhibición de la hERG tras la activación del canal, con desarrollo de bloqueo con la despolarización membranal independiente de la activación del canal. [K⁺] externa elevada: 94 mM, redujo la potencia de la inhibición de I(hERG) y es independiente de los residuos aminoácidos aromáticos Y652 y F656. Fabricado por Chemsky (Shanghai) International y por Sanofi-Avantis Inc. como “Muttag”). El NIH del Reino Unido bloqueó este fármaco en 2010 por su coste.

Droperidol: complemento de anestesia antinauseante sedante central; asociado a la prolongación del intervalo QT, a TdP y a muerte súbita. Las corrientes de cola de hERG tras los pulsos de ensayo a 50 mV resultaron inhibidas con una IC⁵⁰ de 77.3 nM. Los canales de hERG resultaron afectados en sus estados abierto e inactivado. La potencia se redujo con la mutación de Phe-656 A Thr o Ser-631 a Ala. Se encuentran registradas catorce compañías para este compuesto.

Grepafloxacino: antibiótico fluoroquinolona oral que causa varios acontecimientos cardiovasculares graves, incluyendo PQTS. Fue retirado voluntariamente del mercado (OMS, 1999).

Haldol, haloperidol: un bloqueante de hERG de alta potencia, antipsicótico para la esquizofrenia y la agitación, administrado por vía intravenosa o a dosis más altas de las recomendadas; riesgo de muerte súbita, prolongación de QT e incrementos de TdP. Janssen-Silag Ltd.

Halofantrina: antipalúdico, asociado a arritmias cardíacas y a una prolongación significativa de QT. Las mujeres son más sensibles que los varones. Glaxo-Smith-Kline.

Ibutilida: Corvert de Pfizer, un antiarrítmico de clase III puro para aleteo y fibrilación auriculares; las mujeres son más sensibles que los varones. Induce una lenta corriente de sodio hacia el interior. No bloquea la corriente de K, aunque prolonga el potencial de acción.

Levometadilo: agonista de opiáceo/control del dolor; dependencia de narcóticos. Similar a la metadona. Roxanne Labs. lo retiró del mercado debido a trastornos del ritmo ventricular.

Lidoflazina: bloqueante piperazina del canal de calcio con actividad antiarrítmica. Bloqueante de hERG de alta potencia (IC⁵⁰: 16 nM) de la subunidad alfa del canal de potasio. Inhibe preferentemente los canales activados abiertos. Es 13 veces más potente que el verapamilo contra la hERG.

Loratidina, claritina: antihistamínico de segunda generación; bloqueante de hERG a una IC⁵⁰ de 173 nM. Podría presentar un efecto indirecto sobre la corriente de repolarización de hERG. Comercializado por Schering-Plough. Lovostatina: bloqueante sintético de hERG de baja potencia.

Mesoridazona: antipsicótico para la esquizofrenia.

Metadona: interactúa con los canales miocárdicos activados por voltaje del potasio de una manera dependiente de la concentración, causando arritmias cardíacas graves y muerte por TdP y fibrilación ventricular en pacientes que toman metadona. La IC⁵⁰ es de 4.8 ^|j M (comparado con 427 ^|j M para la heroína); fármaco antidopaminérgico. Las predisposiciones a la TdP relacionadas con la metadona son: mujer, dosis altas, metabolizador lento CYP2 B6 de la S-metadona y polimorfismos del ADN. Las combinaciones parenterales de metadona y clorobutanol están contraindicadas. La actividad de prolongación de QT se debe principalmente a la S-metadona, que bloquea la corriente de hERG 3 a 5 veces más potentemente que la R-metadona.

Metanosulfonanilida (E-4031): compuesto de potencia extremadamente alta; inhibe la hERG a concentraciones nM. Se ha utilizado como control positivo en ensayos estándares.

Moxifloxacino: bloqueante de los canales de hERG. A 100 j M prolonga el QTc en un 22% no impedido por el dexrazoxano.

Pentamadina: bloqueante de hERG ineficiente (IC⁵⁰>300 j M), antiinfeccioso de la neumonía por Pneumocystis. Asociado al alargamiento del intervalo QT y a TdP. Por lo tanto, podría presentar un efecto indirecto desconocido sobre la repolarización de hERG.

Pimozida: antipsicótico; tics de Tourette.

Prenilamina: bloqueante moderado de la hERG.

Probucol: antilipémico, anticolesterolémico; ya no se encuentra disponible en EE. UU.

Procainamida: antiarrítmico.

Propafenona: bloqueante de hERG de baja potencia (IC⁵⁰>1 jM ).

Pirilamina: bloqueante de hERG de baja potencia.

Quinidina: antiarrítmico. Mujeres > Varones.

Seldano (terfenidina): bloqueante de hERG de alta potencia.

Sertindol: bloqueante de hERG de potencia moderada.

Sotalol: un modelo de LQT2; su acción resulta bloqueada por el nicorandilo, un abridor de los canales de potasio. Puede actuar como antiarrítmico, como p-bloqueante para la taquicardia ventricular y la fibrilación auricular (Ducroq J., 2005). Dos (2)% de 1288 pacientes mostraron prolongación del QT y un QTc superior a 455 ms condujo a TdP. Esparfloxacino: antibiótico.

Tioridazina: bloqueante de hERG de potencia moderada.

Vandetanib: inhibidor oral de cinasa comercializado por Astra-Zeneca aprobado para el cáncer de tiroides medular metastásico o localmente avanzado, progresivo. En las advertencias del prospecto se incluyen la prolongación de QT, la TdP y la muerte súbita. Entre las reacciones adversas más comunes (>5%) de grado 3/4 se incluyen la prolongación de QT, la fatiga y las erupciones cutáneas.

Como compuestos de referencia para el presente estudio se seleccionó la terfenadina, un profármaco antihistamínico para la forma activa fexofenadina, y E-4031. Se ha informado de que la terfenadina presenta efectos cardiotóxicos con arritmias ventriculares, particularmente tomada en combinación con antibióticos macrólidos o ketoconazol. Se ha estimado un valor de IC50 del efecto inhibidor de hERG de 99 nM a partir de datos obtenidos en la misma estirpe celular que la utilizada para el artículo de ensayo en el presente estudio. E-4031, un fármaco antiarrítmico de clase III, es una toxina sintética utilizada exclusivamente con fines de investigación, con una excepción clínica (Okada Y., 1996). Su mecanismo de acción es el bloqueo de los canales de potasio activados por voltaje de hERG. A 100 nM, E-4031 inhibe 90.6% de la densidad de corriente. Las inhibiciones observadas concuerdan con los datos de validación interna generados bajo condiciones idénticas y están de acuerdo con los valores publicados de inhibición para este compuesto. Estos resultados confirman la sensibilidad del sistema de ensayo a los inhibidores selectivos de hERG, en este caso la terfenadina y E-4031.

Efecto de la curcumina sobre las corrientes de hERG Ik en células completas: se registraron bajo condiciones basales las corrientes de células completas inducidos durante un pulso de voltaje, tras la aplicación de las concentraciones seleccionadas de curcumina y tras un periodo de lavado. Según el protocolo, se analizaron 4 concentraciones de curcumina para la inhibición de la corriente de hERG. Las células se despolarizaron durante un segundo desde el potencial de fijación (-80 mV) a un valor máximo de 40 mV, partiendo de -40 mV y progresando en incrementos de 10 mV. A continuación, se repolarizó el potencial de membrana a -55 mV durante un segundo y finalmente retornó a -80 mV.

Se midió la amplitud de corriente de cola en células completas se midió a un potencial de fijación de -55 mV, seguido de la activación de la corriente de -40 a 40 mV. Se midió la amplitud de la corriente en el máximo (pico) de dicha corriente de cola. Se obtuvo la densidad de corriente mediante división de la amplitud de la corriente por la capacitancia celular medida previamente a la minimización de la corriente transitoria capacitiva.

Correcciones por disminución (“run down”) de la corriente y del efecto del solvente: todos los puntos de datos fueron corregidos para el efecto del solvente y la disminución dependiente del tiempo de la corriente. Los efectos de disminución de la corriente y del solvente se midieron simultáneamente mediante la aplicación del diseño experimental bajo condiciones libres de artículo de ensayo (DMSO) en el mismo marco temporal que el ejecutado con el artículo de ensayo. La pérdida de amplitud de la corriente medida durante estos denominados experimentos con vehículo (que representan tanto efectos del solvente como la disminución de corriente dependiente del tiempo) se restaron de la pérdida de amplitud medida en presencia del artículo de ensayo con el fin de aislar el efecto del mismo, separado del efecto del solvente y de la disminución inevitable de la amplitud de la corriente durante el tiempo.

El estudio presentado en la presente memoria cuantificó el efecto de la curcumina solubilidad en DMSO sobre la IKr. Las concentraciones de curcumina (0.14, 0.2, 3.4 y 11.4 ^j M) estaban basadas en información disponible en el momento del diseño del presente estudio. Las concentraciones se seleccionaron basándose en: (1) los niveles plasmáticos predichos en el ser humano en el nivel de dosis de fase 1 más bajo previsto, (2) las concentraciones plasmáticas predichas en el ser humano en el nivel de dosis de fase 1 más alto previsto, (3) 30 veces los niveles plasmáticos terapéuticos predichos en el ser humano, y (4) 100 veces los niveles plasmáticos terapéuticos predichos en el ser humano. Estas concentraciones seleccionadas se considera que proporcionan predicciones valiosas del efecto de la curcumina sobre la electrofisiología cardíaca humana. La curcumina, de 99.2% de pureza, se sintetizó bajo condiciones de BPF en Sami Labs, Bangalore, India, y se conservó a 4°C bajo condiciones de oscuridad. Se analizó independientemente el contenido de curcumina en una alícuota de 1 ml de cada concentración de curcumina utilizada para exponer las células incluidas en el presente estudio. Para los estudios posteriores, la curcumina liposómica de grado BPF se formuló en Polymun GmbH, Vienna, Austria, y se conservó a 4°C. Los liposomas se obtuvieron de Polymun gmbH; la terfenadina y el E04031 se adquirieron en Sigma Aldrich Fine Chemicals.

Tabla 1: efecto de la terfenadina, un control positivo, sobre la densidad de la corriente de hERG a partir de células He K 293 transfectadas a 20 mV.

*10 nM, **30 nM, ***100 nM.

La terfenadina inhibió la k ^r con una IC⁵⁰ de 0.065 amolar (65 nM).

Tabla 2: efecto de la terfenadina sobre la densidad de corriente de la hERG en células HEK 293 transfectadas a 20 mV.

*La corriente registrada tras la exposición a la concentración del artículo de ensayo era estadísticamente diferente de la corriente registrada bajo la condición de línea base. La diferencia se considera estadísticamente significativa con p<0.05.

La figura 1 es una representación gráfica de los datos presentados en la tabla 2. La figura 2 es un gráfico de la relación de corriente-voltaje (C-V) de la amplitud de la corriente de hERG a partir de células HEK 293 transfectadas y expuestas a terfenadina. La figura 3 es un gráfico del efecto de la terfenadina sobre la densidad de corriente de hERG a partir de células HEK 293 transfectada a 20 mV. La figura 4 es un gráfico de la relación C-V de la amplitud de la corriente de hERG a partir de células HEK 293 transfectadas y expuestas a terfenadina.

Tabla 3: efecto de E-4031 sobre la densidad de corriente de hERG en células HEK 293 transfectada a 20 mV.

E-4031 inhibió la k ^r con una IC⁵⁰ de 50 nM. La figura 5 es un gráfico que representa el efecto de E-4031 sobre la densidad de corriente de hERG a partir de células HEK 293 transfectadas a 20 mV.

Tabla 4: efecto de la curcumina sobre la densidad de corriente de hERG en células HEK 293 transfectadas a 20 mV.

A una concentración de 11.4 ^j M, la curcumina causó una inhibición de 79.6% de la densidad de corriente de cola de hERG a I+20 (n=7). Las pruebas t de Student emparejadas confirmaron que la diferencia de densidad de corriente normalizada medida en la línea base y en presencia de 0.2 a 11.4 ^j M de curcumina alcanzaba el umbral seleccionado de significancia estadística (p<0.05). La tabla 3 proporciona los valores de p obtenidos en el análisis estadístico. Se consiguió una inhibición de cincuenta por ciento de la corriente dentro del intervalo de concentraciones (0.014 a 11.4 j M) seleccionado para el presente estudio. Se estimó el valor de IC⁵⁰ en 4.9 j M a partir de los datos obtenidos. La figura 6 es un gráfico de los datos mostrados en la tabla 4. La figura 7 es un gráfico de la relación C-V de la amplitud de corriente de hERG a partir de células HEK 293 transfectadas y expuestas a curcumina.

Tabla 5: efecto de la curcumina (en forma de curcumina liposómica) sobre la densidad de corriente de hERG a partir de células HEK 293 transfectadas a 20 mV.

Los valores de p obtenidos en el análisis estadístico indicaron diferencias marginalmente significativas de la densidad de corriente entre la línea base y 11.4 pM; sin embargo, el grado de inhibición de la corriente era inferior al de la IC⁵⁰.

La figura 8 es un gráfico que representa el efecto de la curcumina (en forma de curcumina liposómica) sobre la densidad de corriente de hERG a partir de células HEK 293 transfectadas a 20 mV, y la figura 9 es un gráfico que representa la relación C-V de la amplitud de la corriente de hERG a partir de células HEK 293 transfectadas y expuestas a curcumina (en forma de curcumina liposómica).

En la tabla 5, la corriente hacia el interior rectificadora mostró que el efecto inhibidor de la curcumina sobre la corriente de cola de hERG es dependiente del voltaje, con una potencia más alta a potenciales de retención positivos. Las corrientes registradas después del lavado se compararon estadísticamente con las corrientes registradas después de la concentración más alta de curcumina (curcumina liposómica) (11.4 pM).

Tabla 6: efecto de liposomas vacíos sometidos a agitación con vórtex con curcumina sobre la densidad de corriente de hERG a partir de células HEK 293 transfectadas a 20 mV.

La concentración de liposomas era 0.7, 12 o 41 ng/ml. No se observaron diferencias significativas por la curcumina a ningún nivel de dosis.

La figura 10 es un gráfico que representa el efecto de la curcumina (liposomas+curcumina) sobre la densidad de corriente de hERG a partir de células HEK 293 transfectadas a 20 mV, y la figura 11 es un gráfico de la relación C-V de la amplitud de corriente de hERG a partir de células HEK 293 transfectadas y expuestas a curcumina (liposomas+curcumina). La corriente registrada después del lavado se comparó con las corrientes registradas después de la concentración más alta de curcumina (11.4 pM) y eran estadísticamente similares. No se alcanzó la corriente IC⁵⁰.

Tabla 7: efecto de los liposomas sobre la densidad de corriente de hERG a partir de células HEK 293 transfectadas a 20 mV.

Los liposomas no muestran un efecto inhibidor del canal de hERG in vitro. La corriente registrada después del lavado era comparable estadísticamente con las corrientes registradas después de la concentración más alta de liposomas (41.193 ng/ml). La figura 12 es un gráfico de los datos presentados en la tabla 7, y la figura 13 es un gráfico de la relación C-V de la amplitud de corriente de hERG a partir de células HEK 293 transfectadas y expuestas a liposomas.

Tabla 8: efecto de liposomas+E-4031 sobre la densidad de corriente de hERG a partir de células HEK 293 transfectadas a 20 mV.

*la corriente registrada después de la exposición a la concentración del artículo de ensayo era estadísticamente diferente (p<0.05) a la corriente registrada bajo las condiciones de línea base.

La figura 14 es un gráfico que representa el efecto de liposomas+E-4031 sobre la densidad de corriente de hERG a partir de células HEK 293 transfectadas a 20 mV. La figura 15 es un gráfico de la relación C-V de la amplitud de corriente de hERG a partir de células HEK 293 transfectadas y expuestas a liposomas+E-4031.

Los liposomas vacíos, sometidos a agitación con vórtex con E-4031 a concentraciones de 30 a 300 nM, no bloqueaban el efecto anti-hERG de E-4031. Inhibición de E-4031. Se comparó estadísticamente la corriente registrada después del lavado con las corrientes registradas después de la concentración más alta de liposomas+E-4031.

Tabla 9: efecto de liposomas+terfenadina sobre la densidad de corriente de hERG a partir de células HEK 293 transfectadas a 20 mV.

*La corriente registrada después de la exposición a la concentración de artículo de ensayo era estadísticamente diferente de la corriente registrada bajo las condiciones basales. La diferencia se consideró estadísticamente significativa con p<0.05.

Los datos presentados en la tabla 9, anteriormente, se representan gráficamente en la figura 16, y la figura 17 es un gráfico que representa la relación C-V de la amplitud de corriente de hERG a partir de células HEK 293 transfectadas y expuestas a liposomas+terfenadina. No se observó ningún efecto de los liposomas vacíos al someterlos a agitación con vórtex con terfenadina a 30-300 nM sobre la inhibición por terfenadina de la densidad de corriente de hERG.

Los datos presentados anteriormente en la presente memoria sugieren que la curcumina, dentro del intervalo de concentraciones sometido a ensayo y en el contexto específico del presente estudio, modula negativamente la corriente Ikp. Es decir, interactúa con las proteínas codificadas por el gen hERG y activa las funciones de activación del canal, reduciendo el flujo iónico. Se ha publicado una observación similar con una mezcla de curcuminoides (78% de curcumina) (Moha ou Matti, 2008). Los datos en la presente memoria apoyan su observación inicial y subrayan que la molécula de curcumina (diferuloílmetano) muestra la inhibición predominante, si no completa, de IKr.

Los resultados de la presente invención de que la curcumina liposómica o mezclas sometidas a agitación con vórtex de liposomas con curcumina anulan la modulación negativa de Ik por la curcumina, permitiendo que se produzcan las funciones de activación de canal normales y sugieren que el encapsulado en liposomas de la curcumina no resulta necesario para bloquear las interacciones con los sitios de receptor del fármaco en el canal. Los liposomas vacíos aparentemente no interactuaban con la proteína codificada por el gen hERG en ausencia de curcumina, o en presencia de E-4031 y terfenadina, y la falta de interacción se relaciona con la especificidad y grado de afinidad, o interacciones preferidas, de los receptores en el canal de K+ (Zachariae U., 2009).

La supresión de kr/hERG inducida por curcumina es mitigada cuando la curcumina se incorpora dentro de un liposoma o simplemente se somete a agitación con vórtex con liposomas antes de la exposición. La administración intravenosa combinada de dichos liposomas y fármacos prolongadores de QT por vía intravenosa diferentes de la curcumina podría mitigar el retraso del intervalo QT in vivo.

Ejemplo 2. Los liposomas mitigan la inhibición inducida farmacológicamente del canal cardíaco iKr.

El crizotinib (Xalkori®) y el nilotinib (Tasigna®) son inhibidores de tirosina cinasa aprobados para el tratamiento del cáncer pulmonar no microcítico y la leucemia mieloide crónica, respectivamente. Se ha mostrado que ambos resultan en la prolongación de ^q T en seres humanos y animales. Se ha mostrado que los liposomas mitigan los efectos inducidos farmacológicamente sobre el canal kr (Kv11.1), codificado por el gen relacionado con ether-ago-go humano (hERG). Se llevó a cabo un estudio para determinar si los liposomas asimismo reducirían el efecto del crizotinib y el nilotinib sobre el canal kr. El crizotinib y el nilotinib asimismo se sometieron a ensayo en un ensayo de kr in vitro estándar mediante la utilización de células renales embrionarias humanas (HEK) 293 transfectadas establemente con hERG. Se determinaron las respuestas a dosis y se calcularon las concentraciones inhibidoras al 50% (IC50). Al tratar las células HEK 293 con crizotinib y nilotinib que habían sido mezclados con liposomas, se observó una reducción significativa de los efectos inhibidores sobre el canal kr de dichos dos fármacos. La utilización de agentes de prolongación de QT encapsulados en liposomas, o simplemente la mezcla de dichos fármacos con liposomas, podría reducir su afectación cardíaca.

El crizotinib (Xalkori®) es un inhibidor de la cinasa del linfoma anaplásico (ALK) aprobado para el tratamiento del cáncer pulmonar no microcítico en pacientes con tumores positivos para ALK. El nilotinib (Tasigna®) es un inhibidor de la cinasa BCR-ABL aprobado para la leucemia mieloide crónica positiva para el cromosoma Philadelphia. Ambos fármacos inhiben el canal iónico responsable de la corriente rectificadora tardía de K+ en el corazón (kr o Kv11.1), codificada por el gen relacionado con ether-a-go-go humano (hERG). La inhibición del canal kr puede resultar en la prolongación de QTc, lo que puede conducir a taquicardia ventricular polimórfica potencialmente mortal, o a taquicardia de torsión de puntas (1). El crizotinib causa una prolongación de QT en seres humanos y animales, mientras que el nilotinib solo se ha mostrado que cause prolongación de QT en seres humanos.

La inhibición del canal kr y la toxicidad cardíaca pueden ser una limitación importante para algunas clases de fármacos. La detección de inhibición del canal kry/o de prolongación de QT in vivo durante el desarrollo preclínico del fármaco puede conducir a que se abandone el desarrollo de clases de fármacos prometedores. Se han retirado varios fármacos prolongadores de QT durante el desarrollo o después de su comercialización. Entre los ejemplos se incluyen terfenadina, astemizol, gripafloxacino, terodileno, droperidol, lidoflazina, levometadilo, sertindoílo y cisaprida.

Durante el desarrollo, se ha mostrado que el crizotinib inhibe el canal kr con concentraciones inhibidoras al 50% (IC50) de 1.1 |^jM (2), lo que indica el potencial de prolongación del intervalo QT. Los valores de IC50 eran inferiores o similares a la Cmax observada en seres humanos a dosis clínicamente relevantes. Los perros tratados por vía intravenosa con crizotinib mostraron una frecuencia y contractilidad cardíacas disminuidas y una presión diastólica terminal del ventrículo izquierdo incrementada, e intervalos PR, QRS y QT incrementados (3). Estos resultados preclínicos correlacionan con resultados clínicos de prolongación del QTc, bradicardia y parada cardíaca observados ocasionalmente en ensayo clínico (3, 4). Se ha mostrado que el nilotinib inhibe el canal kr con una IC50 de 0.13 ^j M (5). Sin embargo, en contraste con el crizotinib, los perros tratados por vía oral con hasta 600 mg/kg no mostraron prolongación de QT (5). Una diferencia entre los estudios con perros de crizotinib y nilotinib es que el crizotinib se administró por vía intravenosa, mientras que el nilotinib se administró por vía oral. Al igual que con el crizotinib, los ensayos clínicos mostraron una asociación de las dosis terapéuticas del nilotinib con la prolongación de QTc (6, 7). Un estudio por Doherty et al. (8) encontró múltiples efectos del crizotinib y el nilotinib sobre los cardiomiocitos humanos in vitro. Estos efectos incluían la muerte de células cardíacas, la activación incrementada de la caspasa y un incremento de la generación de superóxido. La morfología de las células cardíacas resultó alterada junto con una disrupción de los patrones de latido normales de células cardíacas individuales. Para el crizotinib, los canales iónicos cardíacos kr, NaV1.5 y CaV resultaron inhibidos con IC50 de 1.7, 3.5 y 3.1, respectivamente. Para el nilotinib, las IC50 fueron de 0.7, >3 y >3 ^j M, respetivamente.

Los presentes inventores han mostrado anteriormente que los liposomas mitigan la inhibición inducida por curcumina del canal kr (9). El presente estudio muestra resultados sobre los efectos del crizotinib y el nilotinib en el canal kr, y determina si la adición de liposomas mitigará estos efectos.

El crizotinib, a concentraciones de 11 y 56 j M, causó una inhibición de 56% y 89%, respectivamente, de la densidad de corriente de cola de kr a 20 mV (figura 18A). Las pruebas t de Student emparejadas confirmaron que la diferencia en las densidades de corriente normalizadas medidas en la línea base y en presencia de 11 y 56 j M de crizotinib alcanzó el umbral seleccionado de significancia estadística (p<0.05). La IC50 era de 8.9 ^j M con crizotinib solo (tabla 10). Al someter a agitación con vórtex el crizotinib durante 10 minutos a temperatura ambiente con liposomas en una relación de 9:1 (por ejemplo, 56 j M [25 jg/m l] de crizotinib con 225 jg/m l de liposomas), únicamente la concentración más alta de crizotinib, 56 ^j M, alcanzó una inhibición estadísticamente significativa (59%). La IC⁵⁰ era de 44 pM (tabla 10). Los liposomas solos no presentaron ningún efecto sobre la densidad de corriente de cola de k ^r (figura 18A).

El nilotinib, a concentraciones de 0.1 y 1 pM, causó una inhibición estadísticamente significativa de la densidad de corriente de cola de k ^r a 20 mV; de 54% y 74%, respectivamente (figura 19A). La IC⁵⁰ era de 0.08 pM con nilotinib solo (tabla 10). Al someter a agitación con vórtex el nilotinib durante 10 minutos a temperatura ambiente con liposomas en una relación de 9:1 (por ejemplo, 1 pM [0.5 pg/ml] de nilotinib con 4.5 pg/ml de liposomas), no se observaron efectos del nilotinib sobre el canal k ^r, ni siquiera a las concentraciones más altas, de 1 pM. La IC⁵⁰ era >1 pM (tabla 10). Los liposomas solos no presentaron ningún efecto sobre la densidad de corriente de cola de k ^r (figura 19A).

Las relaciones de corriente-voltaje de la corriente hacia adentro rectificadora mostraron que las inhibiciones observadas en la corriente de cola no eran dependientes del voltaje tanto para crizotinib como para nilotinib (figuras 18B y 19B, respectivamente).

Las figuras 18A y 18B muestran las medias de densidad de corriente de cola de k ^r y la dependencia del voltaje, respectivamente, obtenidos mediante la medición de la amplitud del pico de cola de ¡^Kr a 20 mV bajo condiciones basales y en presencia de crizotinib, con únicamente liposomas y con crizotinib junto con liposomas. Para crizotinib junto con liposomas, se mezcló el crizotinib con liposomas en una relación de 9:1 y se sometió a agitación con vórtex; por ejemplo, 56 pM (25 pg/ml) de crizotinib con 225 pg/ml de liposomas. La figura 18A es un gráfico que representa la densidad de corriente medida en 3 a 4 células, promediada y normalizada frente a la densidad de corriente basal, y corregida para efectos temporales y del solvente. Los valores representados son de medias ± errores estándares de la media. Las comparaciones estadísticas entre los niveles de densidad de corriente después de la exposición a fármaco y los niveles basales se llevaron a cabo mediante la utilización de pruebas t de Student emparejadas repetidas (*). Las diferencias se consideraron significativas con p<0.05. La figura 18B es un gráfico que representa la dependencia del voltaje de la inhibición de las corrientes de cola de ¡^Kr a la concentración más alta de crizotinib sometida a ensayo (56 pM).

Las figuras 19A y 19B muestran las medias de densidad de corriente de cola de ¡^Kr y la dependencia del voltaje, respectivamente, obtenidos mediante la medición de la amplitud del pico de cola de ¡^Kr a 20 mV bajo condiciones basales y en presencia de nilotinib, liposomas solos y nilotinib junto con liposomas. Para el nilotinib junto con liposomas, se mezcló el nilotinib con liposomas en una relación de 9:1 y se sometió a agitación con vórtex; por ejemplo, 1 pM (0.5 pg/ml) de nilotinib con 4.5 pg/ml de liposomas. La figura 19A es un gráfico de la densidad de corriente medida en 3 células, promediada y normalizada frente a la densidad de corriente basal, y corregida para efectos temporales y del solvente. Los valores representados son de medias ± errores estándares de la media. Se llevaron a cabo comparaciones estadísticas entre los niveles de densidad de corriente después de la exposición a fármaco y los niveles basales mediante la utilización de pruebas t de Student emparejadas repetidas (*). Se consideró que las diferencias eran estadísticamente significativas con p<0.05. La figura 19B es un gráfico que representa la dependencia del voltaje de la inhibición de las corrientes de cola de ¡^Kr a la concentración más alta de nilotinib sometida a ensayo (1 pM).

Tabla 10. Concentraciones que causan una inhibición del cincuenta por ciento (IC⁵⁰) de la densidad de corriente de ¡^Kr en células HEK 293 establemente transfectadas con hERG.

El control positivo, E-4031, causó reducciones estadísticamente significativas de la densidad de corriente a una concentración de 100 nM. Se sometió a ensayo E-4031 en dos ocasiones, observando una inhibición de 67% y 79% (datos no representados). Los resultados se encontraban dentro del intervalo de los datos de validación interna del laboratorio de los presentes inventores.

Reactivos. El crizotinib y el nilotinib se obtuvieron de Reagents Direct. El control positivo, E-4031 (dihidrocloruro de sulfonamida de A/-[4-[[1-[2-(6-met¡l-2-p¡r¡d¡n¡l)et¡l]-4-p¡per¡din¡l]carbon¡l]fen¡l]metano, anhidro) se obtuvo de Sigma-Aldrich. Los liposomas vacíos se obtuvieron de Polymun GmbH. Los liposomas estaban constituidos por una relación 9.7:1 de DMPC (1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfocolina) y DMPG (1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfo-rac-[1-glicerol]). Para el crizotinib o nilotinib junto con liposomas, se mezcló el crizotinib o nilotinib con liposomas en una relación de 9:1 y se sometió a agitación con vórtex durante 10 minutos a temperatura ambiente; por ejemplo, 56 pM (25 pg/ml) de crizotinib sometido a agitación con vórtex con 225 pg/ml de liposomas. La solución de pipeteado interna estaba compuesta de KCl 140 mM, MgCh 1.0 mM, Mg-ATP 4.0 mM, EGTA 5.0 mM, HEPES 10 mM y sucrosa 10 mM, pH 7.4 ± 0.05. La solución externa de hERG estaba compuesta por NaCl 140.0 mM, KCl 5.0 mM, CaCl21.8 mM, MgCh 1.0 mM, HEPES 10.0 mM y dextrosa 10.0 mM, pH 7.3 ± 0.05.

Cultivo celular. Células HEK 293 establemente transfectadas con el canal hERG se mantuvieron en medio esencial mínimo complementado con suero de feto bovino al 10% (Wisent Inc., St. Bruno, Quebec, Canadá), medio esencial mínimo-piruvato sódico al 1%, aminoácidos no esenciales al 1%, L-glutamina al 1%, penicilina/estreptomicina al 1% y G-418 (geneticina) 400 pg/ml como el agente de selección (todos los ingredientes eran de Gibco/Invitrogen, Burlington, Ontario, Canadá) y se utilizaron entre los pases 12 y 16. Aquellas células en las que no pudo conseguirse un sello gigaohm (GD) o que no generaron corrientes con una corriente de cola clara, fueron eliminadas durante el periodo de equilibrado.

Procedimiento. Se utilizó la técnica de pinza de parche de células completas para evaluar funcionalmente las interacciones de los fármacos con los canales iónicos. Se lavaron células HEK 293 sembradas en placas de Petri de 35 mm dos veces con 1 ml de solución externa de hERG, seguido de la adición de 2 ml de solución externa de hERG. La placa de Petri se montó en la platina de un microscopio de contraste de fases invertido y se mantuvo a temperatura constante (35°C ± 2°C). Se posicionó una micropipeta de vidrio de borosilicato con la solución de pipeteado interna sobre una sola célula mediante la utilización de un micromanipulador PatchMan de Eppendorf (Eppendorf Canada, Mississauga, Ontario, Canadá). Se bajó la micropipeta hasta la célula hasta conseguir un contacto estrecho. A continuación, se creó el sello de membrana-pipeta de rango GD mediante la aplicación de una ligera presión negativa (se midieron las resistencias utilizando un pulso cuadrado de 5 mV). Se midió inmediatamente la capacitancia celular con el fin de evaluar la superficie celular, utilizando un factor de conversión de 1 pF/pm2. Esta superficie celular se utilizó a continuación para calcular la densidad de corriente neta.

Todas las corrientes se registraron tras un filtrado analógico con un filtro Bessel de 4 polos (Frequency Devices, Haverhill, Massachusetts) configurado a 1 kHz. Mediante el amplificador controlado por ordenador, se despolarizó la célula a un valor máximo de 40 mV (células en cultivo), partiendo de -10 mV, en incrementos de 10 mV, durante 1 segundo. A continuación, se devolvió el potencial de membrana (mV) a -55 mV durante 1 segundo y finalmente se repolarizó hasta el valor de potencial de reposo. Esto permitió que los canales pasasen de modo activado a modo inactivado, y de vuelta a modo activado, a fin de medir corrientes de cola robustas. Todas las corrientes selectivas de K+ que pasaban por los canales de hERG se registraron utilizando un amplificador Axopatch-1D o Axopatch 200B y se digitalizaron con un interfaz Digidata 1322A o 1440A ADDA (Axon Instruments Inc., Foster City, California; ahora Molecular Devices Inc.). El registro de la corriente celular se inició 500 ms antes de la despolarización celular a -40 mV y se prolongó durante 500 ms después de la repolarización de la célula a -80 mV.

Tras obtener los registros basales, se añadieron las concentraciones crecientes de los agentes de ensayo crizotinib y nilotinib, solos o mezclados con liposomas, en alícuotas de 20 pl directamente en la cámara experimental, y se dejó que se dispersasen a través de un sistema de perfusión de circuito cerrado utilizando una bomba miniperistáltica (MP-1, Harvard Instruments, Holliston, Massachusetts). Los tiempos de exposición para cada concentración se limitaron a 5 minutos. Tras el registro de las corrientes en presencia de las concentraciones más altas de agentes de ensayo, se utilizó un sistema de perfusión de flujo abierto para sacar por lavado el artículo de ensayo y obtener corrientes de hERG postexposición del modo indicado anteriormente. Finalmente, se expusieron a 100 nM de E-4031 tres células previamente no expuestas. Se añadieron las concentraciones de E-4031 a la cámara experimental tal como se había hecho con el artículo de ensayo.

Las corrientes de hERG generadas por los sistemas de expresión heteróloga, tales como las células HEK 293, es conocido que disminuyen a lo largo de periodos largos de registro. Por lo tanto, se llevaron a cabo experimentos en paralelo en ausencia de los agentes de ensayo y en presencia del solvente a fin de corregir la reducción dependiente del tiempo de la densidad de corriente, conocida como disminución de la corriente.

Análisis estadístico. La corrección de la reducción dependiente del tiempo de la densidad de corriente implicó promediar los cambios en la densidad de corriente asociados al tiempo y a los solventes, y multiplicar los resultados del “artículo de ensayo” por el factor de corrección resultante. Todos los resultados se corrigieron para el efecto del vehículo y para cambios dependientes del tiempo en la densidad de corriente.

Las amplitudes de la corriente de hERG se expresan como densidad de corriente (en nanoamperios/picofarad [nA/pF]) para corregir para las variaciones de tamaño celular dentro de la población de células utilizada para el presente estudio. Se analizaron las corrientes utilizando el módulo Clampfit 10.0 del software pClamp 10.0 (Axon Instruments Inc.). Los resultados obtenidos en la presencia de cada concentración se expresaron como densidad de corriente neta, se normalizaron frente a la densidad de corriente medida bajo condiciones basales.

Se calculó la amplitud de la corriente de cola de Ik como la diferencia entre la corriente media registrada antes del pulso de despolarización a -40 mV y la corriente transitoria máxima registrada al inicio del pulso de repolarización a -55 mV. Se llevaron a cabo pruebas t emparejadas con el fin de determinar la significancia estadística de las diferencias en densidad de corriente obtenidas antes y después de la exposición de las células al artículo de ensayo. Se fijó la significancia en P<0.05, donde P es la probabilidad de que la diferencia en niveles de densidad de corriente se debe únicamente al azar.

Ejemplo 3. Evaluación in vivo de los efectos del crizotinib y de liposomas junto con crizotinib sobre los parámetros electrofisiológicos cardíacos de corazones de conejo.

Evaluación in vivo de los efectos del crizotinib y de liposomas junto con crizotinib sobre parámetros electrofisiológicos cardíacos en corazones de conejo. El propósito del presente estudio es cuantificar los efectos in vivo del crizotinib y de liposomas junto con crizotinib sobre parámetros electrofisiológicos cardíacos (intervalos PR, QRS, RR, QT y QTc) en corazones de conejo.

Conejos macho adultos de entre 3 y 4 kg de peso. Se sometió a ensayo el crizotinib a 1, 2 y 3 mg/kg (dosis de carga) a lo largo de un periodo de infusión de 10 minutos a 0.057 ml/kg/min seguido de una infusión de mantenimiento de 15 minutos de 0.4, 0.8 y 1.2 mg/kg (dosis de mantenimiento), respectivamente, a razón de 0.037 ml/kg/min. Se seleccionaron las concentraciones basándose en la información disponible en el momento de diseñar el presente estudio.

Los liposomas se inyectaron en forma de bolo i.v. en la relación 9:1 de la dosis total de crizotinib.

Tabla 11: dosis sometidas a ensayo

Se incorporaron electrodos de ECG en los conejos bajo anestesia. Los conejos fueron anestesiados con una mezcla de isoflurano USP al 2.5% (Abbott Laboratories, Montréal, Canadá) en 95% de O2 y 5% de CO2. Se canuló la vena yugular izquierda para la infusión i.v. del artículo de ensayo. Los electrodos de ECG se colocaron en el animal. Se inició un registro continuo del ECG y se detuvo al final de la infusión de la última concentración de artículo de ensayo.

La infusión de cada dosis de carga (1, 2 y 3 mg/kg) duró 10 minutos y fue seguida de una infusión de 15 minutos de la dosis de mantenimiento respectiva (0.4, 0.8 y 1.2 mg/kg). La tasa de infusión de la dosis de carga era de 0.057 ml/kg/min y de 0.037 mg/kg/min para la dosis de mantenimiento. Se expusieron tres conejos al crizotinib (n=3).

Los liposomas se inyectaron 5 minutos antes de iniciar la infusión de cada dosis de carga. Los liposomas se administraron en forma de un bolo i.v. en la vena de la oreja izquierda en una relación de 9:1. Se expusieron tres conejos a liposomas+crizotinib (n=3). Se realizó un registro continuo de todo el procedimiento experimental. Ensayo de significancia realizado: prueba t de Student emparejada con un umbral de significancia fijado en p<0.05, n=3.

Crizotinib. El crizotinib causó reducciones dependientes de las dosis estadísticamente significativas de la frecuencia cardíaca (prolongación de los intervalos RR). 2 y 3 mg/kg incrementaron los intervalos RR en 67 y 110 ms, respectivamente. La dosis de crizotinib de 2 mg/kg causó una prolongación estadísticamente significativa de los intervalos PR y QRS. El intervalo PR se incrementó en 23 ms y el intervalo QRS, en 13 ms, tras la exposición a 3 mg/kg de crizotinib. El crizotinib causó una prolongación dependiente de la dosis del intervalo QT estadísticamente significativa.

Proporcionado a dosis de 2 y 3 mg/kg, causó una prolongación de los intervalos QT de 34 y 48 ms, respectivamente. Una vez corregido para el cambio de frecuencia cardíaca mediante la utilización del factor de corrección de van der Water, el crizotinib todavía causaba una prolongación estadísticamente significativa de 38 ms de los intervalos QT que no podía explicarse por una frecuencia cardíaca más baja.

Liposomas junto con crizotinib. Los liposomas junto con crizotinib (en relación 9:1) en una dosis de 2 mg/kg causaron una reducción estadísticamente significativa de la frecuencia cardíaca (prolongación de los intervalos RR). Los intervalos RR se incrementaron en 61 y 90 ms tras la exposición a 2 y 3 mg/kg de crizotinib, respectivamente.

Los liposomas junto con crizotinib causaron una prolongación de los intervalos PR y QRS. El efecto de los liposomas+crizotinib sobre los intervalos PR y QRS fue estadísticamente significativo solo a la dosis de 3 mg/kg, con una prolongación de 15 ms del intervalo P^r y de 7 ms del intervalo QRS.

Los liposomas junto con crizotinib a una dosis de 3 mg/kg causaron una prolongación de los intervalos QT de 24 ms. Sin embargo, dicho efecto sobre los intervalos QT no era estadísticamente significativo en comparación con el intervalo QT medido bajo condiciones basales. Una vez corregido para los cambios en la frecuencia cardíaca mediante la utilización del factor de corrección de van der Water, 3 mg/kg causaron una prolongación de 15 ms de los intervalos QT que seguía sin ser estadísticamente significativo.

El presente estudio tenía como objetivo evaluar los efectos del crizotinib y de liposomas junto con crizotinib sobre los parámetros electrofisiológicos cardíacos de corazones de conejo in vivo. Se encontró que el crizotinib por sí solo causaba una prolongación dependiente de la dosis de los intervalos RR, PR, QRS y QT de los corazones de conejo in vivo. El efecto del crizotinib sobre los intervalos RR y QT era estadísticamente significativo a las dosis de 1 y 2 mg/kg sobre los intervalos PR y QRS.

Los liposomas junto con crizotinib causaron una prolongación de los intervalos RR, PR y QRS de los corazones de conejo in vivo. El efecto de los liposomas junto con crizotinib sobre el intervalo Rr fue estadísticamente significativo a la dosis de 2 mg/kg, mientras que fue estadísticamente significativo sobre los intervalos PR y QRS solo a la dosis de 3 mg/kg. Los liposomas junto con crizotinib no causaron ninguna prolongación estadísticamente significativa de los intervalos QT de los corazones de conejo in vivo.

La tabla a continuación resume los índices de protección proporcionados por la presencia de liposomas.

Tabla 12: comparación del efecto in vivo máximo sobre los parámetros electrofisiológicos de los corazones causados por 3 mg/kg de crizotinib frente a 3 mg/kg de crizotinib precedido por la inyección i.v. de liposomas.

Tabla 13: efecto in vivo del crizotinib sobre el intervalo RR (ms) en corazones de conejo.

*El valor obtenido tras la exposición de la concentración de artículo de ensayo era estadísticamente diferente del valor bajo la condición basal. La diferencia se consideró estadísticamente significativa con p<0.05.

Tabla 14: efecto in vivo de liposomas junto con crizotinib sobre el intervalo RR (ms) en corazones de conejo.

Figura 20: efecto in vivo de crizotinib y de liposomas+crizotinib sobre el intervalo RR (ms) en corazones de conejo.

Tabla 15: efecto in vivo del crizotinib sobre el intervalo PR (ms) en corazones de conejo.

Tabla 16: efecto in vivo de liposomas junto con crizotinib sobre el intervalo PR (ms) en corazones de conejo.

Figura 21: efecto in vivo del crizotinib y de liposomas junto con crizotinib sobre el intervalo PR (ms) en corazones de conejo.

Tabla 17: efecto in vivo del crizotinib sobre los intervalos QRS (ms) en corazones de conejo.

Tabla 18: efecto in vivo de liposomas junto con crizotinib sobre el intervalo QRS (ms) en corazones de conejo.

Figura 22: efecto in vivo del crizotinib y de liposomas juntos con crizotinib sobre el intervalo QRS (ms) en corazones de conejo.

Tabla 19: efecto in vivo del crizotinib sobre el intervalo QT (ms) en corazones de conejo.

Tabla 20: efecto in vivo de liposomas junto con crizotinib sobre el intervalo QT (ms) en corazones de conejo.

Figura 23: efecto in vivo del crizotinib y de liposomas junto con crizotinib sobre el intervalo QT (ms) en corazones de conejo.

Tabla 21: efecto in vivo del crizotinib sobre el intervalo QTc van der Water en corazones de conejo.

Tabla 22: efecto in vivo de liposomas junto crizotinib sobre el intervalo QTc van der Water en corazones de conejo.

Figura 24: efecto in vivo del crizotinib y de liposomas junto con crizotinib sobre los intervalos QTc van der Water en corazones de conejo.

Ejemplo 4: evaluación in vivo de los efectos in vivo del nilotinib y de liposomas junto con nilotinib sobre los parámetros electrofisiológicos cardíacos en corazones de conejo.

Evaluación in vivo de los efectos in vivo del nilotinib y de liposomas+nilotinib sobre parámetros electrofisiológicos cardíacos en corazones de conejo. El propósito del presente estudio es cuantificar los efectos in vivo del nilotinib y de liposomas+niotinib sobre parámetros electrofisiológicos cardíacos (intervalos PR, QRS, RR, QT y QTc) en corazones de conejo.

Sistema de ensayo. Conejos macho adultos de entre 3 y 4 kg de peso.

Dosis sometidas a ensayo. Se sometió a ensayo el nilotinib a dosis de 2, 4 y 5.5 mg/kg (dosis de carga) a lo largo de un periodo de infusión de 10 minutos a 0.057 ml/kg/min, seguido de una infusión de mantenimiento de 15 minutos de 0.14, 0.28 y 0.39 mg/kg (dosis de mantenimiento), respectivamente, a 0.037 ml/kg/min. Se seleccionaron las concentraciones basándose en la información disponible en el momento de diseño del presente estudio. Los liposomas se inyectaron en forma de un bolo i.v. en la relación de 9:1 de la dosis total de nilotinib.

Ensayo realizado. Se incorporaron electrodos de ECG en los conejos bajo anestesia. Procedimiento. Conejos in vivo. Los conejos fueron anestesiados con una mezcla de isoflurano USP al 2.5% (Abbott Laboratories, Montréal, Canadá) en 95% de O2 y 5% de CO2. Se canuló la vena yugular izquierda para la infusión i.v. del artículo de ensayo. Los electrodos de ECG se colocaron en el animal y las señales de ECG se filtraron a 500 Hz utilizando un Iso-DAM8A (de Word Precision Instrument, Sarasota, FL, EE. UU.) y se digitalizaron a una tasa de muestreo de 2.0 kHz utilizando un interfaz Digidata 1322A (de Axon Instruments Inc., Foster City, CA, EE. UU. [ahora Molecular Devices Inc.]). Se inició un registro continuo del ECG cinco minutos antes de iniciar la infusión de la primera dosis del compuesto y terminó al final de la infusión de la última dosis. Tras el registro de la ECG basal, se inició la infusión de la primera dosis de carga del compuesto. Al final de la primera dosis de carga, la infusión se pasó a la primera dosis de mantenimiento. Los conejos se expusieron a cada dosis durante 25 minutos (10 minutos de dosis de carga, seguido de 15 minutos de dosis de mantenimiento). Se aplicó el mismo procedimiento hasta la exposición de los conejos a todas las dosis seleccionadas del agente de ensayo o vehículo equivalente. Los liposomas se inyectaron cinco minutos antes del inicio de la infusión de cada dosis de carga. Los liposomas se administraron en forma de un bolo IV en la vena de la oreja izquierda en una relación de 9:1 (en |jg/ml). Se analizaron los parámetros de ECG y se presentan de la misma manera que para el experimento in vitro con corazones.

Tabla 23: dosis sometidas a ensayo

Análisis y adquisición de datos. Registro continuo de todo el procedimiento experimental. Análisis estadístico. Se llevó a cabo una prueba t unidireccional emparejada para determinar la significancia estadística de las diferencias en los valores basales en comparación con cada tratamiento. Se llevó a cabo una prueba t unidireccional no emparejada, suponiendo varianzas desiguales, para comparar el crizotinib o el nilotinib solo con el crizotinib o el nilotinib junto con liposomas. Prueba de significancia realizada: prueba de Student emparejada con umbral de significancia fijado en p<0.05, n=3.

El nilotinib causó reducciones dependientes de la dosis de la frecuencia cardíaca (prolongación del intervalo RR). Una dosis de 5.5 mg/kg de nilotinib causó una prolongación estadísticamente significativa del intervalo RR de 78 ms.

Los liposomas junto con nilotinib a una concentración de hasta 5.5 mg/kg no causaron ningún efecto estadísticamente significativo sobre el intervalo PR.

La dosis de 2 mg/kg de nilotinib causó una prolongación estadísticamente significativa del intervalo QRS. Una dosis de 5.5 mg/kg de nilotinib causó una prolongación del intervalo QRS de 7 ms.

El nilotinib causó una prolongación dependiente de la dosis estadísticamente significativa del intervalo QT. Las dosis de 4 y 5.5 mg/kg causaron una prolongación del intervalo QT de 41 y 66 ms, respectivamente. Una vez corregidos para el cambio en la frecuencia cardíaca mediante la utilización del factor de corrección de van der Water, el nilotinib todavía causaba una prolongación estadísticamente significativa del intervalo QT que no podía explicarse por una frecuencia cardíaca más baja.

Liposomas junto con nilotinib. Los liposomas junto con nilotinib (en relación 9:1) a una dosis de 5.5 mg/kg causaron una reducción estadísticamente significativa de la frecuencia cardíaca (prolongación del intervalo RR). Se incrementó el intervalo RR en 69 ms tras la exposición a 5.5 mg/kg de nilotinib.

Los liposomas junto con nilotinib a una concentración de hasta 5.5 mg/kg no causaron ningún efecto estadísticamente significativo sobre los intervalos PR, QRS y QT.

El presente estudio evaluó los efectos del nilotinib y de liposomas junto con nilotinib sobre los parámetros electrofisiológicos cardíacos en corazones de conejo in vivo.

Se encontró que el nilotinib por sí solo causaba una prolongación dependiente de la dosis de los intervalos RR, QRS y QT en corazones de oncejo in vivo. El efecto del nilotinib sobre el intervalo RR era estadísticamente significativo solo a la dosis de 5.5 mg/kg, mientras que era estadísticamente significativo sobre los intervalos QRS y QT a la dosis de 2 mg/kg.

Los liposomas junto con nilotinib causaron una prolongación del intervalo RR en corazones de conejo in vivo. El efecto de los liposomas junto con nilotinib sobre el intervalo RR era estadísticamente significativo a la dosis de 5.5 mg/kg. Los liposomas junto con nilotinib no causaron ninguna prolongación estadísticamente significativa de los intervalos PR, QRS y QT en los corazones de conejo in vivo.

La tabla a continuación resume los índices de protección proporcionados por la presencia de liposomas.

Tabla 24: comparación entre el efecto in vivo máximo sobre los parámetros electrofisiológicos de los corazones causado por 4 mg/kg de nilotinib frente a 4 mg/kg de nilotinib precedido de la inyección i.v. de liposomas.

Tabla 25: efecto in vivo del nilotinib sobre el intervalo RR (ms) en corazones de conejo.

*El valor obtenido tras la exposición a la concentración de artículo de ensayo era estadísticamente diferente del valor bajo la condición basal. Se consideró una diferencia estadísticamente significativa con p<0.05.

Tabla 26: efecto in vivo de liposomas junto con nilotinib sobre el intervalo RR (ms) en corazones de conejo.

La figura 25 es un gráfico que representa el efecto in vivo del nilotinib y de liposomas junto con nilotinib sobre el intervalo RR (ms) en corazones de conejo.

Tabla 27: efecto in vivo del nilotinib sobre el intervalo PR (ms) en corazones de conejo.

Tabla 28: efecto in vivo de liposomas junto con nilotinib sobre el intervalo PR (ms) en corazones de conejo.

La figura 26 es un gráfico que representa el efecto in vivo del nilotinib y de liposomas junto con nilotinib sobre el intervalo PR (ms) en corazones de conejo.

Tabla 29: efecto in vivo del nilotinib sobre el intervalo QRS (ms) en corazones de conejo.

Tabla 30: efecto in vivo de liposomas junto con nilotinib sobre el intervalo QRS (ms) en corazones de conejo.

La figura 27 es un gráfico que representa el efecto in vivo del nilotinib y de liposomas junto con nilotinib sobre el itnervalo QRS (ms) en corazones de conejo.

Tabla 31: efecto in vivo del nilotinib sobre el intervalo QT (ms) en corazones de conejo.

Tabla 32: efecto in vivo de liposomas junto con nilotinib sobre el intervalo QT (ms) en corazones de conejo.

La figura 28 es un gráfico que representa el efecto in vivo del nilotinib y de liposomas junto con nilotinib sobre el intervalo QT (ms) en corazones de conejo.

Tabla 33: efecto in vivo del nilotinib sobre el intervalo QTc van der Water en corazones de conejo.

Tabla 34: efecto in vivo de liposomas junto con nilotinib sobre el intervalo QTc van der Water en corazones de conejo.

La figura 29 es un gráfico que representa el efecto in vivo del nilotinib y de liposomas junto con nilotinib sobre el intervalo QTc van der Water en corazones de conejo.

Las tablas 35 y 36 resumen los resultados proporcionados anteriormente, y proporcionan información adicional sobre los efectos de la presente invención.

Tabla 35. Concentraciones que causaron una inhibición del cincuenta por ciento de la densidad de corriente de IKr en células HEK 293 establemente transfectadas con hERG.

Las concentraciones que causaron una inhibición de cincuenta por ciento de la densidad de corriente de k ^r (IC⁵⁰) se calcularon a partir de los datos presentados en las figuras 18A-B y 19A-B. ^a225 y 4.5 pg/ml fueron las concentraciones más altas de liposomas solos sometidas a ensayo en el ensayo, para crizotinib y nilotinib, respectivamente.

Tabla 36. Efectos del crizotinib y del nilotinib, solos y junto con liposomas, sobre la presión ventricular izquierda (PVI), en corazones de conejo in vitro.

Los valores son de cambio respecto al nivel basal (mmHg).

Los valores son medias (SEM) de 3 corazones por cada grupo.

Corriente k ^r in vitro.

Se encontró que el crizotinib, a concentraciones de 11 y 56 pM, causaba una inhibición de 57% y 89%, respectivamente, de la densidad de corriente de cola de ^{k r} a 20 mV (figura 18A). Las pruebas t de Student emparejadas mostraron que la diferencia de densidad de corriente normalizada medida en el nivel basal y en presencia de 11 y 56 pM de crizotinib alcanzaban el umbral seleccionado de significancia estadística (p<0.05). La IC⁵⁰ era de 8.9 pM con crizotinib solo (tabla 35). Al mezclar el crizotinib con liposomas en una relación de 9:1, únicamente la concentración más alta de 56 pM de crizotinib alcanzó una inhibición estadísticamente significativa en comparación con el nivel basal (59%). La IC⁵⁰ era de 44 pM. Los liposomas junto con crizotinib a una concentración de 11 pM no presentaron ningún efecto sobre la densidad de corriente de cola de ^{k r} . Los liposomas junto con crizotinib a la concentración de 56 pM sí presentaron un efecto significativo sobre la densidad de corriente de cola de ^{k r} en comparación con el nivel basal. Sin embargo, al comparar la densidad de corriente con crizotinib a 11 pM y a 56 pM, y de los liposomas junto con crizotinib, se observó una inhibición significativa de los efectos del crizotinib cuando estaba mezclado con liposomas. Los liposomas por sí solos no presentaron ningún efecto sobre la densidad de corriente de cola de ^{k r} (figura 18A).

El nilotinib, a las concentraciones de 0.1 y 1 pM, causó una inhibición estadísticamente significativa de la densidad de corriente de cola de ^{k r} a 20 mV, en comparación con el nivel basal; de 54% y 74%, respectivamente (figura 19A). La IC⁵⁰ era de 0.08 pM con nilotinib solo (tabla 35). Al someter a agitación con vórtex el nilotinib durante 10 minutos a temperatura ambiente con liposomas en una relación de 9:1, no se observó ningún efecto del nilotinib sobre el canal ^{k r} , ni siquiera a la concentración más alta, de 1 pM. La IC⁵⁰ era >1 pM. Al comparar la densidad de corriente entre nilotinib, y liposomas junto con nilotinib, se observó una inhibición significativa de los efectos de nilotinib a las concentraciones de 0.1 y 1 pM al mezclarlo con liposomas. Los liposomas por sí solos no presentaron ningún efecto sobre la densidad de corriente de cola de ^{k r} (figura 19A).

Las relaciones de corriente-voltaje de la corriente hacia adentro rectificadora mostraron que las inhibiciones observadas en la corriente de cola no eran dependientes del voltaje ni para crizotinib ni para nilotinib (figuras 18B y 19B, respectivamente). El control positivo, E-4031, produjo una reducción estadísticamente significativa de la densidad de corriente a una concentración de 100 nM. E-4031 se sometió a ensayo dos veces y se observaron inhibiciones de 67% y 79% (datos no representados).

Intervalos QTc en corazones de conejo in vitro.

El crizotinib, a concentraciones de 11 y 56 pM, causó una prolongación dependiente de la dosis del intervalo QTc (figura 30A). La mezcla del crizotinib con liposomas en una relación de 9:1 resultó en una inhibición significativa de la prolongación de QTc inducida por crizotinib. El nilotinib, a concentraciones de 14 y 28 pM, asimismo causó una prolongación dependiente de la dosis del intervalo QTc (figura 30B). Al igual que con crizotinib, la mezcla de nilotinib con liposomas resultó en una inhibición significativa de la prolongación de QTc inducida por nilotinib. El control positivo cisaprida mostró la prolongación esperada del intervalo QTc.

Los efectos del crizotinib y el nilotinib sobre los ECG se asociaron a efectos sobre la PVI (tabla 36). Al exponer los corazones a crizotinib o a nilotinib por sí solos, se observó una reducción de la PVI. Al mezclar liposomas con crizotinib o nilotinib, se revertieron los efectos sobre la PVI.

Intervalos QTc en el conejo después de la administración de dosis in vivo.

Se administró crizotinib en conejos a dosis de 1, 2 y 3 mg/kg mediante infusión IV durante 10 minutos, seguido de una dosis de mantenimiento durante 15 minutos. Se observó una prolongación dependiente de la dosis del intervalo QTC (figura 23). La inyección de liposomas 5 minutos antes del tratamiento con crizotinib resultó en una inhibición significativa de la prolongación de QTc inducida por el crizotinib. Los conejos en los que se administró nilotinib a dosis de 2, 4 y 5.5 mg/kg mediante infusión IV durante 10 minutos, seguido de una dosis de mantenimiento durante 15 minutos, mostraron una prolongación dependiente de la dosis del intervalo QTc (figura 28). Al igual que con el crizotinib, la inyección de liposomas 5 minutos antes del tratamiento con nilotinib resultó en una inhibición significativa de la prolongación de QTc inducida por el nilotinib.

Estos datos demuestran que los liposomas protegen frente al efecto inhibidor de los fármacos inhibidores de cinasa sobre el canal kr utilizando células HEK 293 establemente transfectadas con hERG y mitigan la prolongación de QTc cardíaco que resulta de la exposición tanto in vitro como in vivo. Estos resultados demuestran que la mezcla de dichos fármacos con liposomas evita las interacciones de estos fármacos inhibidores con el canal kr, permitiendo que ocurra una cinética de activación más normal, y reduciendo el grado de incidencia de prolongación de QTc que podría ocurrir clínicamente.

Se ha mostrado que otros inhibidores de tirosina cinasa presentan efectos sobre el intervalo QTc, incluyendo el lapatinib, el sunitinib y el vandetanib (Shah et al., 2013). El más estudiado in vitro es el lapatinib (Lee et al., 2010). Se ha mostrado que el lapatinib prolonga la duración del potencial de acción en fibras de Purkinje de conejo aisladas a una concentración de 5 pM. Lo anterior se ha asociado a un efecto inhibidor del canal Ike con una IC50 de 0.8 pM y un ligero efecto sobre la amplitud de Iks a 5 pM. No se han observado efectos sobre los canales INa, Ik1 o Ica.

Clínicamente, el crizotinib se administra a dosis de hasta 500 mg/día (250 mg dos veces al día [BID]), que representa aproximadamente 4.2 mg/kg o 156 mg/m2, BID. Desde la revisión de la FDA de la nueva aplicación farmacológica para el crizotinib, la Cmax de estado estable en pacientes de cáncer en los que se administran 500 mg BID presentaba un promedio de 650 ng/ml, equivalentes a 1.5 pM (Xalkori, 2011b). Mossé et al. (2013) han informado de una Cmax de estado estable en niños con cáncer de 630 ng/ml (1.4 pM) tras la administración de 280 mg/m2 BID. Este valor se encuentra perfectamente dentro del rango de efectos sobre el canal kr observados in vitro, con una IC50 de 8.9 pM de la que se informa en el presente estudio y 1.1 pM de la que se informa durante el desarrollo del crizotinib (Xalkori, 20 lla ). El nilotinib se administró a una dosis de hasta 600 mg/día (300 mg BID), que equivale a aproximadamente 5 mg/kg (188 mg/m2), BID. Unos pacientes de cáncer que recibieron 400 mg BID presentaron una Cmax de estado estable de 1754 ng/ml, equivalentes a 3.3 pM (Kim et al., 2011). Unos pacientes chinos que recibieron 400 mg BID presentaron una Cmax de estado estable de 2161 ng/ml, equivalentes a 4.1 pM (Zhou et al., 2009). El presente estudio mostró una IC50 en el ensayo de kr de 0.08 pM, y se informó de 0.13 pM durante el desarrollo del nilotinib (Tasigna®, 2007a).

Anteriormente se ha informado de que los liposomas mitigan los efectos inhibidores de la curcumina sobre el canal IKr (Helson et al., 2012). La curcumina por sí sola inhibió el canal kr con una IC50 de 4.9 pM, resultando la concentración más alta sometida a ensayo (11.4 pM) en una inhibición del 80%. Al mezclarla con los mismos liposomas, y en la misma relación que en el presente estudio, la dosis más alta de curcumina sometida a ensayo (1 l.4 pM) únicamente consiguió una inhibición del 45%. La curcumina que se había encapsulado en liposomas, y no únicamente mezclado, asimismo resultó en inhibición de kr inducida por curcumina: una inhibición de 25% a la concentración alta, de 11.4 pM. En el presente estudio, al someter a ensayo por sí solo el control positivo E-4031, la IC50 fue de 56 nM. Al mezclar E-403l con liposomas, la IC50 se incrementó a 210 nM.

El tártaro emético es un fármaco derivado del antimonio trivalente que causa la elongación del intervalo QT en ratas y seres humanos. Al encapsular el tártaro emético en liposomas, se anularon los efectos sobre QT (Maciel et al., 2010). Una diferencia importante entre el estudio del tártaro emético y el presente estudio es la composición de los liposomas que se utilizaron. Los liposomas utilizados en el estudio del tártaro emético estaban compuestos por L-a-diestearoilfosfatidilcolina, colesterol y polietilenglicol 2000 diestearoilfosfatidil-etanolamina. Otra diferencia es que el presente estudio mostró que simplemente mezclando los fármacos con los liposomas, o inyectándolos antes del tratamiento con los fármacos prolongadores de QT, y sin encapsularlos, se conseguían los efectos inhibidores.

Un ensayo clínico con voluntarios sanos ha mostrado que el encapsulado con liposomas anula los efectos de prolongación de QT. Cuando la bupivacaína, que incrementa el intervalo QT en seres humanos y en animales de laboratorio, se encapsuló en liposomas (Exparel®), no causó la prolongación de QT a dosis de hasta 750 mg administradas por vía subcutánea (Naseem et al., 2012). Al igual que con el estudio del tártaro emético, en este caso el fármaco se encapsuló y los componentes de los liposomas eran diferentes a los del presente estudio: colesterol, 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo-rac-(1-glicerol), tricaprilina y 1,2-dierucoilfosfatidilcolina.

El ensayo in vitro de evaluación de los efectos de los fármacos sobre la corriente Ik (hERG) se utiliza ampliamente para ayudar a predecir los efectos potenciales de un fármaco sobre el intervalo QTc en la clínica (Witchel, 2001). Ha resultado ser un ensayo útil, aunque en ocasiones resulta en falsos positivos. El presente estudio muestra un ejemplo en el que dicho ensayo in vitro fue muy predictivo de la prolongación in vivo de QTc tanto en animales como en seres humanos.

Inesperadamente, basándose en los datos en el presente estudio y en los datos referidos a la curcumina (Helson et al., 2012), aparentemente no resulta necesario encapsular un fármaco en el liposoma de DMPC/DMPG para mitigar la supresión de I^k por crizotinib y nilotinib, y posiblemente otros agentes prolongadores de QTc. Una simple mezcla del compuesto con los liposomas podría resultar suficiente. La presente invención muestra que para agentes prolongadores de QT administrados por vía oral, podría resultar suficiente una administración subcutánea concurrente de una formulación de liberación prolongada de liposomas. Mediante la utilización de los métodos y técnicas mostrados en la presente memoria resulta posible estudiar los fármacos prolongadores de QT en modelos animales in vivo de prolongación de QTc.

Se encuentra contemplado que cualquier forma de realización expuesta en la presente memoria descriptiva pueda implementarse con cualquier método, kit, reactivo o composición de la invención, y viceversa. Además, las composiciones de la invención pueden utilizarse para llevar a cabo métodos de la invención.

Se entenderá que las formas de realización particulares descritas en la presente memoria se proporcionan a título ilustrativo y no limitativo de la invención. Las características principales de la presente invención pueden utilizarse en diversas formas de realización sin apartarse del alcance de la invención. El experto en la materia reconocerá, o podrá determinar mediante la utilización de nada más que experimentación rutinaria, numerosos equivalentes a los procedimientos específicos descritos en la presente memoria. Dichos equivalentes se considera que se encuentran comprendidos dentro del alcance de la presente invención y cubiertos por las reivindicaciones.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la especificación son indicativas del nivel de conocimientos del experto en la materia a la que se refiere la presente invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en la presente memoria como referencia en la misma medida que si cada publicación o solicitud de patente individual se indicase específica e individualmente que está incorporada como referencia.

La utilización del término “un” o “una” utilizado junto con la expresión “que comprende” en las reivindicaciones y/o en la especificación puede significar “uno”, aunque asimismo concuerda con el significado de “uno o más”, “por lo menos uno” y “uno o más de uno”. La utilización del término “o” en las reivindicaciones se utiliza para referirse a “y/o”, a menos que se indique explícitamente que se refiere únicamente a alternativas o las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la exposición puede incluir una definición que se refiera únicamente a alternativas y “y/o”. A lo largo de toda la presente solicitud, el término “aproximadamente” se utiliza para indicar que un valor incluye la variación inherente del error por el dispositivo, el método que se utiliza para determinar el valor o la variación que existe entre sujetos de estudio.

Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva y en la reivindicación o reivindicaciones, las expresiones “que comprende” (y cualquier forma de “que comprende”, tal como “comprende” y “comprenden”), “que presenta” (y cualquier forma de “que presenta”, tal como “presenta” y “presentan”), “que incluye” (y cualquier forma de “que incluye”, tal como “incluye” e “ incluyen”) o “que contiene” (y cualquier forma de “que contiene”, tal como “contiene” y “contienen”) son inclusivas y abiertas y no excluyen elementos o etapas de método adicionales y no enumerados. En formas de realización de cualquiera de las composiciones y métodos proporcionados en la presente memoria, “que comprende” puede sustituirse por “que consiste esencialmente en” o “que consiste en”. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “que consiste esencialmente en” requiere el número o números enteros, o etapas, especificados, así como aquellos que no afectan materialmente al carácter o funcionamiento de la invención reivindicada. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “que consiste” se utiliza para indicar la presencia del número entero (por ejemplo, una función, un elemento, una característica, una propiedad, una etapa de método/procedimiento, o una limitación) o grupo de números enteros enumerado (por ejemplo, una o más funciones, uno o más elementos, una o más características, una o más propiedades, una o más etapas de método/procedimiento o una o más limitaciones) únicamente.

La expresión “o combinaciones del mismo” (o “o combinaciones de los mismos”) tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a todas las permutaciones y combinaciones de los ítems enumerados que preceden a la expresión. Por ejemplo, “A, B, C, o combinaciones de los mismos” pretende incluir por lo menos uno de entre: A, B, C, AB, AC, BC o ABC, y si el orden es importante en un contexto particular, asimismo BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC o CAB. Continuando con el presente ejemplo, se encuentran incluidos expresamente las combinaciones que contienen repeticiones de uno o más ítems o términos, tales como BB, AAA, AB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, etc. El experto en la materia entenderá que normalmente no existe un límite para el número de ítems o términos en cualquier combinación, a menos que resulte evidente a partir del contexto.

Tal como se utilizan en la presente memoria, los términos de aproximación, tales como, aunque sin limitación, “aproximadamente”, “sustancial” o “sustancialmente”, se refieren a una condición que, al modificarse de esta manera, se entiende que no es necesariamente absoluta o perfecta, sino que el experto ordinario en la materia considerará que es suficientemente similar para justificar la afirmación de que la condición está presente. El grado en que la descripción puede variar dependerá de la magnitud del cambio que puede iniciarse y a pesar del cual todavía el experto ordinario en la materia reconocerá que la función modificada presenta las características y capacidades requeridas de la función no modificada. En general, aunque sujeto a la exposición precedente, un valor numérico en la presente memoria que ha sido modificado por un término de aproximación tal como “aproximadamente” puede variar entre el valor indicado por como mínimo ±1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 12 o 15%.

Además, los encabezamientos de sección en la presente memoria se proporcionan para concordar con las disposiciones en la norma 37 CFR 1.77, o alternativamente para proporcionar indicaciones organizativas. Estos encabezamientos no deberán limitar o caracterizar la invención o invenciones explicadas en cualesquiera reivindicaciones que puedan resultar a partir de la presente exposición. Específicamente y a título de ejemplo, aunque el encabezamiento se refiere a “Campo de la invención”, dichas reivindicaciones no deberían estar limitadas por el texto bajo dicho encabezamiento en la descripción del denominado campo técnico. Además, una descripción de la tecnología en la sección de “Antecedentes de la invención” no debe interpretarse como una admisión de que la tecnología es técnica anterior a cualquier invención o invenciones en la presente exposición. Tampoco el “Sumario” debe considerarse una caracterización de la invención o invenciones explicadas en las reivindicaciones publicadas. Además, cualquier referencia en la presente exposición a “ invención” en singular no debe utilizarse para argumentar que solo existe un único punto de novedad en la presente exposición. Pueden proporcionarse múltiples invenciones según las limitaciones de las múltiples reivindicaciones surgidas de la presente exposición, y dichas reivindicaciones por lo tanto definen la invención o invenciones, y sus equivalentes, que de esta manera quedan protegidos. En todos los casos, el alcance de dichas reivindicaciones se considerará por sus propios méritos a partir de la presente exposición, aunque no debe considerarse restringida por los encabezamientos proporcionados en la presente memoria.

La totalidad de las composiciones y/o métodos dados a conocer y reivindicados en la presente memoria pueden prepararse y ejecutarse sin necesidad de experimentación indebida a partir de la presente exposición. Aunque las composiciones y métodos de la presente invención han sido descritos en términos de formas de realización preferentes, resultará evidente para el experto en la materia que pueden introducirse variaciones en las composiciones y/o métodos, y en las etapas o en la secuencia de etapas del método descrito en la presente memoria, sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. La totalidad de dichas sustituciones similares y modificaciones evidentes para el experto en la materia se considera que se encuentra comprendida en el espíritu, alcance y concepto de la invención según se define mediante las reivindicaciones adjuntas.

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Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Composición para la utilización en la prevención de una o más canalopatías cardíacas o afecciones que resultan de irregularidades o alteraciones en los patrones cardíacos, o ambas, en un sujeto humano o animal, que comprende:

uno o más agentes farmacológicamente activos que provocan por lo menos uno de inhibición del canal Ik o prolongación de QT, inhibiendo la actividad de un gen relacionado con ether-a-go-go (hERG); y

uno o más liposomas, en la que los liposomas son liposomas vacíos que comprenden DMPC (1,2-dimiristoílsn-glicero-3-fosfocolina) y DMPG (1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfo-rac-[1-glicerol]) proporcionados en una cantidad eficaz para reducir las canalopatías cardíacas o afecciones que resultan de irregularidades o alteraciones en los patrones cardíacos, en la que la canalopatía cardíaca o la afección que resulta de la irregularidad o alteración en el patrón cardíaco es la inhibición de un canal iónico responsable de la corriente rectificadora tardía de K+ en el corazón, taquicardia ventricular polimórfica, prolongación de QTc, LQT2, LQTS o taquicardia de torsión de puntas provocados por los uno o más agentes farmacológicamente activos,

en la que los uno o más agentes activos se seleccionan de entre por lo menos uno de crizotinib y nilotinib.

2. Composición para la utilización según la reivindicación 1, en la que la composición está adaptada para la administración entérica, parenteral, intravenosa, intraperitoneal u oral; y/o

el agente activo y los liposomas pueden estar unidos o conjugados entre sí; y/o

los liposomas comprenden liposomas aniónicos, catiónicos o neutros; y/o

los liposomas comprenden una pared de lípidos o fosfolípidos, en la que los lípidos o los fosfolípidos se seleccionan de entre el grupo que consiste en fosfatidilcolina (lecitina), lisolecitina, lisofosfatidiletanol-amina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, esfingomielina, fosfatidiletanolamina (cefalina), cardiolipina, ácido fosfatídico, cerebrósidos, dicetilfosfato, fosfatidilcolina, y dipalmitoíl-fosfatidilglicerol, estearilamina, dodecilamina, hexadecil-amina, palmitato de acetilo, ricinoleato de glicerol, estearato de hexadecilo, miristato de isopropilo, polímeros acrílicos anfóteros, ácido graso, amidas de ácido graso, colesterol, éster de colesterol, diacilglicerol y succinato de diacilglicerol; y/o

la composición comprende además un medio de dispersión, solvente o vehículo farmacéuticamente aceptables, en la que el agente activo, el liposoma o ambos, están disueltos, dispersados o suspendidos en el medio, el solvente o el vehículo.

3. Composición para la utilización según la reivindicación 1, en la que los liposomas comprenden una relación 9.7:1 de DMPC (1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfocolina) y DMPG (1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfo-rac-[1-glicerol]).

4. Composición para la utilización según la reivindicación 1, en la que los liposomas son liposomas vacíos y se administran antes, simultáneamente o después de la administración del agente terapéuticamente activo o el fármaco en una cantidad eficaz para reducir las reacciones adversas que surgen a partir de la administración del agente terapéuticamente activo o fármaco.

5. Composición para la utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que los liposomas son liposomas esféricos con un diámetro comprendido entre 10 nm y 200 nm.

6. Composición para la utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que los liposomas están disueltos, dispersados, o suspendidos en un medio de dispersión, solvente, o vehículo farmacéuticamente aceptables.

7. Composición para la utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la canalopatía cardíaca o la afección que resulta de la irregularidad o alteración en el patrón cardíaco es la inhibición de un canal iónico responsable de la corriente rectificadora tardía de K+ en el corazón, taquicardia ventricular polimórfica, prolongación del QTc, LQT2, LQTS o taquicardia de torsión de puntas.

8. Composición adecuada para prevenir una o más canalopatías cardíacas o afecciones que resultan de irregularidades o alteraciones en los patrones cardíacos, o ambas, en un sujeto humano o animal que comprende:

uno o más agentes farmacológicamente activos que provocan por lo menos una de inhibición del canal I^k y prolongación de QT, inhibiendo la actividad de un gen relacionado con ether-a-go-go (hERG); y

uno o más liposomas, en la que los liposomas son liposomas vacíos que comprenden DMPC (1,2-dimiristoílsn-glicero-3-fosfocolina) y DMPG (1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfo-rac-[1-glicerol]) proporcionados en una cantidad eficaz para reducir las canalopatías cardíacas o afecciones que resultan de irregularidades o alteraciones en los patrones cardíacos, en la que la canalopatía cardíaca o la afección que resulta de la irregularidad o alteración en el patrón cardíaco es la inhibición de un canal iónico responsable de la corriente rectificadora tardía de K+ en el corazón, taquicardia ventricular polimórfica, prolongación de QTc, LQT2, LQTS o taquicardia de torsión de puntas provocados por los uno o más agentes farmacológicamente activos,

en la que los uno o más agentes activos se seleccionan de entre por lo menos uno de crizotinib y nilotinib.

9. Composición según la reivindicación 8, en la que la composición está adaptada para la administración entérica, parenteral, intravenosa, intraperitoneal u oral; y/o

el agente activo y los liposomas pueden estar unidos o conjugados entre sí; y/o

los liposomas comprenden liposomas aniónicos, catiónicos o neutros; y/o

los liposomas comprenden una pared de lípidos o fosfolípidos, en la que los lípidos o los fosfolípidos se seleccionan de entre el grupo que consiste en fosfatidilcolina (lecitina), lisolecitina, lisofosfatidiletanol-amina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, esfingomielina, fosfatidiletanolamina (cefalina), cardiolipina, ácido fosfatídico, cerebrósidos, dicetilfosfato, fosfatidilcolina y dipalmitoíl-fosfatidilglicerol, estearilamina, dodecilamina, hexadecil-amina, palmitato de acetilo, ricinoleato de glicerol, esterato de hexadecilo, miristato de isopropilo, polímeros acrílicos anfóteros, ácido graso, amidas de ácido graso, colesterol, éster de colesterol, diacilglicerol y succinato de diacilglicerol; y/o

la composición comprende además un medio de dispersión, solvente o vehículo farmacéuticamente aceptables, en la que el agente activo, el liposoma o ambos están disueltos, dispersados o suspendidos en el medio, el solvente o el vehículo.

10. Composición según la reivindicación 8 o 9, en la que los liposomas comprenden una relación 9.7:1 de DMPC (1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfocolina) y DMPG (1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfo-rac-[1-glicerol]).