ES2938482T3

ES2938482T3 - Sulfato de condroitina reticulado, composición que contiene el mismo y agente de tratamiento para enfermedad ocular

Info

Publication number: ES2938482T3
Application number: ES21150701T
Authority: ES
Inventors: Sho Funayama
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 2015-01-16
Filing date: 2016-01-15
Publication date: 2023-04-11
Anticipated expiration: 2036-01-15
Also published as: US11207345B2; JP6715201B2; EP3246037A4; WO2016114397A1; US20190365796A1; EP3831394A1; US20210052634A1; US10716804B2; US20170368093A1; EP3246037A1; US10420796B2; JP6110037B2; JPWO2016114397A1; JP2017125203A; EP3831394B1

Abstract

Se proporciona un derivado de sulfato de condroitina que tiene una estructura reticulada con un grupo en una amina polivalente. También se proporciona una composición que contiene el derivado de sulfato de condroitina. También se proporcionan un agente y un método para el tratamiento de una enfermedad ocular, teniendo el agente y el método un efecto terapéutico sobre un trastorno del epitelio corneal y/u ojo seco. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Sulfato de condroitina reticulado, composición que contiene el mismo y agente de tratamiento para enfermedad ocular

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para producir sulfato de condroitina reticulado.

Antecedentes de la técnica

Según el taller internacional sobre el ojo seco (DEWS), el “ojo seco” se define de la siguiente manera: “ojo seco es una enfermedad multifactorial de las lágrimas y la superficie ocular que da como resultado síntomas de malestar, trastorno visual e inestabilidad de la película lagrimal con posible daño a la superficie ocular. Está acompañada por un aumento de osmolaridad de la película lagrimal e inflamación de la superficie ocular” (The Ocular Surface vol. 5, n.° 2: 75-92, 2007).

En Japón se conoce un colirio (Chondron (marca registrada)) que contiene sulfato de condroitina (a continuación en el presente documento puede denominarse “SC”), y el colirio tiene el efecto de “proteger la córnea superficial”. Estudios sobre el efecto del SC sobre la superficie ocular (Tsutomu Fujihara, et al., Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics, vol. 11, n.° 4: 503-508, 1995) han informado sobre el examen de la prevención de trastornos epiteliales corneales. Teruo Nishida, et al., Experimental Eye Research, 53: 753-758, 1991 describen el examen de la presencia o ausencia del efecto del SC sobre las células epiteliales corneales. La bibliografía reciente Gary D. Novack, The Ocular Surface, vol. 12, n.° 3: 227-230, 2014 describe una variedad de agentes terapéuticos para el ojo seco desarrollados en Japón y EE. UU.

Por lo que se refiere a los derivados de SC que tienen una estructura reticulada a través de un agente reticulante (a continuación en el presente documento un derivado de este tipo puede denominarse “SC reticulado”) (documento WO 1991/16881, documento de patente, publicación de patente japonesa abierta a consulta por el público (Kokai) n.° 1994-73102, Amnon Sintov, et al., Biomaterials, 16: 473-478, 1995), Rubinstein, et al. han informado sobre intentos de producir derivados de SC usando 1,12-diaminododecano como agente de reticulación (documento WO 1991/16881, documento de patente, Amnon Sintov, et al., Biomaterials, 16: 473-478, 1995). En el campo del SC, el SC (que es fácilmente soluble en agua) se reticula para conferir mala solubilidad en agua al mismo, para su uso como, por ejemplo, membranas o comprimidos.

Documentos de la técnica anterior

Documentos de patente

Documento de patente 1: documento WO 1991/16881, documento de patente

Documento de patente 2: publicación de patente japonesa abierta a consulta por el público (Kokai) n.° 1994-73102 Documentos no de patente

Documento no de patente 1: The Ocular Surface vol. 5, n.° 2: 75-92, 2007

Documento no de patente 2: Tsutomu Fujihara, et al., Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics, vol. 11, n.° 4: 503-508, 1995

Documento no de patente 3: Teruo Nishida, et al., Experimental Eye Research, 53: 753-758, 1991

Documento no de patente 4: Gary D. Novack, The Ocular Surface, vol. 12, n.° 3: 227-230, 2014

Documento no de patente 5: Amnon Sintov, et al., Biomaterials, 16: 473-478, 1995

Documento no de patente 6: C. Bourie, et al., Journal of Biomaterials Applications, vol. 12: 201-221, 1998 Sumario de la invención

Problemas que van a resolverse mediante la invención

Sin embargo, el documento Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics, vol. 11, n.° 4: 503-508, 1995 no divulga el tratamiento para trastornos epiteliales corneales desarrollados. El documento Experimental Eye Research, 53: 753-758, 1991 describe que el SC no tiene ningún efecto sobre la migración de células epiteliales corneales. El documento The Ocular Surface, vol. 12, n.° 3: 227-230, 2014 no describe un agente terapéutico que contiene SC como principio activo farmacéutico.

La reticulación de SC no se confirmó mediante diversos métodos analíticos y métodos de producción descritos en el documento WO 1991/16881, documento de patente o en el documento Biomaterials, 16: 473-478, 1995 (C. Bourie, et al., Journal of Biomaterials Applications, vol. 12: 201-221, 1998). Por tanto, se reveló que no se había producido de manera práctica SC reticulado.

En vista de lo anterior, un objeto de la presente invención es proporcionar un método para producir SC reticulado. Medios para resolver los problemas

En primer lugar, los presentes inventores han producido con éxito un derivado de SC que tiene una estructura reticulada a través de un grupo en una amina polivalente y han llevado a cabo la presente invención.

La presente invención incluye las siguientes realizaciones.

[A1] Un método para producir sulfato de condroitina reticulado, comprendiendo el método reticular un sulfato de condroitina a través de la formación de un enlace covalente mediante la amidación de un grupo carboxilo del sulfato de condroitina y un grupo amino de una amina polivalente, que es una diamina que tiene dos grupos amino primarios o una triamina que tiene tres grupos amino primarios, en el que un equivalente molar de la amina polivalente es de desde 0,005 hasta 0,100 en relación con 1,00 equivalente molar de la unidad disacárida del sulfato de condroitina.

[A2] El método según el punto [A1], en el que la amidación se realiza mediante un método usando un agente de condensación en un disolvente, un método de anhídrido de ácido simétrico, un método de anhídrido de ácido mixto o un método de éster activo.

[A3] El método según el punto [A2], en el que el agente de condensación se selecciona del grupo que consiste en una carbodiimida soluble en agua, diciclohexilcarbodiimida y cloruro de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinio N-hidratado.

[A4] El método según el punto [A2] o [A3], en el que un equivalente molar del agente de condensación es de [(de 0,50 a 5,00) * valencia de la amina polivalente] a 1,00 equivalente molar de la amina polivalente.

[A5] El método según uno cualquiera de los puntos [A1] a [A4], en el que el sulfato de condroitina reticulado y el sulfato de condroitina están en forma distinta de sal o forma de sal farmacéuticamente aceptable.

Efectos ventajosos de la invención

La presente invención proporciona un método para producir un derivado de SC reticulado que tiene una estructura reticulada a través de un grupo en una amina polivalente.

Breve descripción de los dibujos

[Figura 1] La figura 1 muestra diagramas de HPLC de líquidos digeridos con condroitinasa-ABC.

[Figura 2] La figura 2 muestra un ejemplo de los resultados del análisis mediante espectrometría de masas de múltiples etapas.

[Figura 3] La figura 3 muestra un ejemplo de los resultados del análisis mediante espectrometría de masas de múltiples etapas.

[Figura 4] La figura 4 muestra un gráfico que ilustra un grado promedio de tinción con fluoresceína en el caso de instilación ocular en un modelo animal dos veces al día.

[Figura 5] La figura 5 muestra un gráfico que ilustra un grado promedio de tinción con fluoresceína en el caso de instilación ocular en un modelo animal dos veces al día.

[Figura 6] La figura 6 muestra un gráfico que ilustra un grado promedio de tinción con fluoresceína en el caso de instilación ocular en un modelo animal dos veces al día.

[Figura 7] La figura 7 muestra un gráfico que ilustra un grado promedio de tinción con fluoresceína en el caso de instilación ocular en un modelo animal dos veces al día.

[Figura 8] La figura 8 muestra un gráfico que ilustra un grado promedio de tinción con fluoresceína en el caso de instilación ocular en un modelo animal dos veces al día.

[Figura 9] La figura 9 muestra un gráfico que ilustra un grado promedio de tinción con fluoresceína en el caso de instilación ocular en un modelo animal dos veces al día.

[Figura 10] La figura 10 muestra un gráfico que ilustra un grado promedio de tinción con fluoresceína en el caso de instilación ocular en un modelo animal dos veces al día.

Modos para llevar a cabo la invención

Los términos tal como se usan en el presente documento se definirán ahora de la siguiente manera. El término “sulfato de condroitina” (puede denominarse “SC”) se refiere a sulfato de condroitina o una forma de sal del mismo. El término “sulfato de condroitina reticulado” (puede denominarse “SC reticulado”) se refiere a un derivado de SC o una forma de sal del mismo que tiene una estructura reticulada a través de un agente reticulante, reticulándose el derivado entre unidades disacáridas del SC. El derivado puede reticularse dentro de una única molécula de SC y/o entre diferentes moléculas de SC.

Tal como se usa en el presente documento, el término “sustitución” se refiere a la sustitución de uno o más átomos de hidrógeno en un compuesto por otro átomo o un grupo de átomos. El átomo o grupo de átomos que sustituye el/los átomo(s) de hidrógeno se denominarán “sustituyente”. El término “heteroátomo” se refiere a un átomo (distinto de carbono e hidrógeno) contenido en un compuesto, tal como nitrógeno, oxígeno o azufre. A menos que se especifique lo contrario, la expresión “que tiene un heteroátomo” se refiere al caso en el que un compuesto tiene uno o más tipos de heteroátomos, y uno o más átomos de cada tipo están presentes en el compuesto. La expresión “que tiene un heteroátomo en una cadena” se refiere al caso en el que al menos un átomo de carbono en la cadena se sustituye por un heteroátomo. El término “cadena de carbonos” se refiere a una cadena atómica formada principalmente por átomos de carbono, teniendo la cadena opcionalmente una ramificación y/o un heteroátomo. El término “grupo funcional reactivo” se refiere a un grupo funcional que tiene reactividad con un grupo funcional contenido en el sulfato de condroitina. A menos que se especifique lo contrario, el término “cadena principal” se refiere a una cadena de carbonos lineal que une dos grupos funcionales reactivos. Cuando están presentes tres o más grupos funcionales reactivos, la cadena principal es la más larga de las cadenas de carbonos lineales uniendo cada una dos grupos funcionales reactivos. Cuando la cadena de carbonos tiene una ramificación, a menos que se especifique lo contrario, una cadena de carbonos de una ramificación no está incluida en la cadena principal. La cadena principal puede tener uno o más heteroátomos en cualquier posición de un átomo de carbono distinta de una posición en la que el átomo de carbono se une directamente a un grupo funcional reactivo. Cuando está presente una estructura cíclica en una cadena de carbonos que une grupos funcionales reactivos, se considera que la estructura cíclica tiene al menos una ramificación y comparte un átomo como terminal de al menos dos cadenas de carbonos ramificadas. En este caso, la cadena principal es la cadena más larga entre cada una de las cadenas ramificadas. Tal como se usa en el presente documento, el “número de átomos en una cadena principal” se refiere al número de átomos que constituyen la cadena principal. En el caso en el que la cadena principal tiene un heteroátomo, el número de átomos en la cadena principal incluye el número del heteroátomo. Tal como se usa en el presente documento, la “cadena principal” de una amina polivalente o un grupo en una amina polivalente se refiere a una cadena de carbonos lineal que une dos grupos amino primarios, que son grupos funcionales reactivos.

Por ejemplo, tal como se usa en el presente documento, el término “hidrocarburo” se refiere a un grupo o compuesto que tiene carbono e hidrógeno. A menos que se especifique lo contrario, el hidrocarburo puede tener un heteroátomo y/o un sustituyente. El “hidrocarburo” puede tener una estructura lineal o ramificada. Por ejemplo, el término “alifático” se refiere a un grupo o compuesto que no tiene aromaticidad. Por ejemplo, el término “cíclico” se refiere a un grupo o compuesto que tiene una estructura cíclica intramolecular. Por ejemplo, el término “acíclico” se refiere a un grupo o compuesto que no tiene estructura cíclica intramolecular. El término “grupo alquilo” se refiere a un grupo hidrocarburo alifático saturado lineal o ramificado monovalente. El término “grupo alquileno” se refiere a un grupo hidrocarburo alifático saturado lineal o ramificado divalente. El término “grupo alquenileno” se refiere a un grupo hidrocarburo alifático insaturado lineal o ramificado divalente que tiene al menos un doble enlace. El término “grupo alquinileno” se refiere a un grupo hidrocarburo alifático insaturado lineal o ramificado divalente que tiene al menos un triple enlace. El término “grupo arilo” se refiere a un grupo hidrocarburo aromático monocíclico o policíclico monovalente. El término “grupo arileno” se refiere a un grupo hidrocarburo aromático monocíclico o policíclico divalente. El término “grupo arilalquileno” se refiere a un grupo divalente formado a través de la sustitución de un átomo de hidrógeno de un grupo arilo por un grupo alquileno, o un grupo divalente formado a través de la sustitución de dos átomos de hidrógeno de un anillo aromático por grupos alquileno. El término “grupo cicloalquilo” se refiere a un grupo hidrocarburo alifático cíclico monovalente. El término “grupo cicloalquileno” se refiere a un grupo hidrocarburo alifático cíclico divalente. El término “grupo cicloalquilalquileno” se refiere a un grupo divalente formado a través de la sustitución de un átomo de hidrógeno de un grupo cicloalquilo por un grupo alquileno, o un grupo divalente formado a través de la sustitución de dos átomos de hidrógeno de un cicloalcano por grupos alquileno. El término “grupo aminoalquilo” se refiere a un grupo alquilo sustituido con amino. El término “grupo hidroxialquilo” se refiere a un grupo alquilo sustituido con hidroxilo.

Tal como se usa en el presente documento, el término “amina polivalente” se refiere a una amina que tiene dos o más grupos amino primarios (-NH2). Tal como se usa en el presente documento, el término “diamina” se refiere a un amina que tiene dos grupos amino primarios, y el término “triamina” se refiere a una amina que tiene tres grupos amino primarios.

Tal como se usa en el presente documento, el término “amina polivalente alifática” se refiere a una amina polivalente formada a través de la sustitución de dos o más átomos de hidrógeno de un hidrocarburo alifático por grupos amino primarios. El término “amina polivalente aromática” se refiere a una amina polivalente formada a través de la sustitución de dos o más átomos de hidrógeno de un hidrocarburo aromático por grupos amino primarios o grupos aminoalquilo.

Tal como se usa en el presente documento, el término “a/hasta” entre dos valores numéricos indica que los valores numéricos antes y después del término significan el valor límite inferior y el valor límite superior en el intervalo, respectivamente. Cuando una composición contiene alguna clase de componentes, el contenido del componente en la composición se refiere a la cantidad total de los componentes en la composición, a menos que se especifique lo contrario.

La presente invención se describirá a continuación con más detalles con referencia a las realizaciones, que no debe interpretarse como que se limita la invención a las mismas.

El “SC reticulado” producido mediante el método de la presente invención tiene una estructura reticulada entre unidades disacáridas de SC a través de un agente reticulante. El SC reticulado puede reticularse dentro de una única molécula de SC y/o entre diferentes moléculas de SC. No se impone ninguna limitación particular en el tipo de SC usado como materia prima para producir el SC reticulado, siempre que el SC sea un glicosaminoglicano que tiene una estructura primaria formada por unidades disacáridas de repetición de ácido D-glucurónico y N-acetil-D-galactosamina en la que se sulfatan parcialmente los grupos hidroxilo de los azúcares constitutivos. El SC reticulado y el SC usado como materia prima para el mismo puede estar en forma libre (distinta de sal) o forma de sal farmacéuticamente aceptable.

Los ejemplos de la sal farmacéuticamente aceptable incluyen un metal alcalino, tal como una sal de sodio y una sal de potasio; y una sal de metal alcalinotérreo, tal como una sal de magnesio y una sal de calcio. El SC reticulado producido mediante el método de la presente invención está preferiblemente en forma de una sal de metal alcalino farmacéuticamente aceptable, más preferiblemente en forma de una sal de sodio, desde los puntos de vista de afinidad y compatibilidad biológica.

El SC reticulado producido mediante el método de la presente invención o el SC usado como materia prima para el mismo puede estar en forma de un hidrato o un solvato.

No se impone ninguna limitación particular en el tipo de SC usado como materia prima para producir el SC reticulado, y el SC puede ser, por ejemplo, sulfato de condroitina C (a continuación en el presente documento puede denominarse “SCC”). No se impone ninguna limitación particular en el origen del SC usado como materia prima para producir el SC reticulado. El SC puede ser una sustancia que se produce de manera natural o puede ser una sustancia sintetizada químicamente. Por ejemplo, en el caso en el que se obtiene el SC a partir de un producto que se produce de manera natural, el producto que se produce de manera natural (es decir, la materia prima) puede seleccionarse de manera apropiada dependiendo del tipo de SC de interés, etc. Alternativamente, el S^cde interés puede prepararse a través de una modificación apropiada de una sustancia que se produce de manera natural mediante una técnica de quimiosíntesis.

No se impone ninguna limitación particular en el peso molecular promedio en peso del SC usado como materia prima para producir el SC reticulado. El peso molecular promedio en peso del SC es preferiblemente de 10.000 a 100.000, más preferiblemente de 10.000 a 80.000, todavía más preferiblemente de 10.000 a 60.000, de manera particularmente preferible de 15.000 a 45.000. El peso molecular promedio en peso del SC puede determinarse mediante una técnica habitual, tal como cromatografía de exclusión molecular o un método de dispersión de luz. El SC reticulado puede producirse a través de la formación de un enlace covalente entre el SC y un agente de reticulación. A continuación se describirá adicionalmente el método para producir un SC reticulado.

Tal como se usa en el presente documento, el término “agente reticulante” se refiere a un residuo derivado de un compuesto que tiene dos o más grupos capaz de unirse covalentemente a los grupos contenidos en el SC. En el método de la presente invención, el agente de reticulación usado para reticular el SC es una amina polivalente, que es una diamina que tiene dos grupos amino primarios o una triamina que tiene tres grupos amino primarios (a continuación también denominada “amina polivalente usada en la presente invención”).

No se impone ninguna limitación particular en el número de átomos de carbono de la amina polivalente usada en la presente invención. Por ejemplo, el número de los átomos de carbono es de 1 a 20, de 1 a 12, de 1 a 10, de 1 a 8, de 1 a 6, de 1 a 4, de 2 a 12, de 2 a 10, de 2 a 8, de 2 a 6, de 2 a 4, de 4 a 12, de 4 a 10, o de 4 a 8.

El grupo amino puede formar un enlace amida con el grupo carboxilo del SC. No se impone ninguna limitación particular en la amina polivalente usada en el método de la presente invención, siempre que sea una diamina que tiene dos grupos amino primarios (-NH2) o una triamina que tiene tres grupos amino primarios (-NH2). La amina polivalente es preferiblemente una diamina para reducir la diversidad estructural del SC reticulado.

La amina polivalente usada en la presente invención puede ser una amina polivalente que no tiene un enlace biodegradable (es decir, no tiene un resto biodegradable). En la presente invención, la amina polivalente puede ser una amina polivalente que no tiene un resto biodegradable en la cadena principal de la molécula. Tal como se usa en el presente documento, el término “resto biodegradable” se refiere a una estructura representada por la siguiente fórmula (II):

-C(=O)-D- (II)

(en la que D representa un átomo de oxígeno o un átomo de azufre). Específicamente, el resto biodegradable corresponde a un enlace éster o un enlace tioéster. Por tanto, en la presente invención, la amina polivalente puede ser una amina polivalente que no tiene ni enlace éster ni un enlace tioéster en la cadena principal de la molécula. En la presente invención, la amina polivalente puede ser una amina polivalente que no tiene ningún enlace disulfuro. La amina polivalente puede ser una amina polivalente que no tiene ningún enlace disulfuro en la cadena principal. En la presente invención, por ejemplo, la amina polivalente puede ser una amina polivalente alifática o una amina polivalente aromática, pero es preferiblemente una amina polivalente alifática. La amina polivalente alifática puede ser una amina polivalente alifática acíclica o una amina polivalente alifática cíclica, pero es preferiblemente una amina polivalente alifática acíclica. La amina polivalente alifática puede ser una amina polivalente alifática saturada o una amina polivalente alifática insaturada. Es decir, la amina polivalente alifática puede ser una amina polivalente alifática saturada acíclica, una amina polivalente alifática insaturada acíclica, una amina polivalente alifática saturada cíclica, o una amina polivalente alifática insaturada cíclica, pero es preferiblemente una amina polivalente alifática saturada acíclica. La amina polivalente puede ser igual que un componente biológico o un derivado del mismo. Por ejemplo, la amina polivalente puede ser un aminoácido básico o un derivado del mismo.

En la presente invención, por ejemplo, la amina polivalente puede ser una amina polivalente alifática o amina polivalente aromática sustituida o no sustituida que tiene opcionalmente un heteroátomo en la cadena principal. En la presente invención, los ejemplos del sustituyente incluyen un grupo alquilo, un grupo aminoalquilo, un grupo hidroxialquilo, un grupo éster alquílico, un grupo alcoxilo, un grupo amino, un grupo formilo, un grupo hidroxilo, un grupo carboxilo y un grupo carbonilo. Cuando el sustituyente contiene un grupo funcional reactivo (por ejemplo, un grupo aminoalquilo), el sustituyente no forma la cadena principal de la amina polivalente. El sustituyente es preferiblemente un grupo alquilo, un grupo aminoalquilo, un grupo éster alquílico o un grupo hidroxilo. El grupo alquilo, el grupo aminoalquilo, el grupo hidroxialquilo, el grupo éster alquílico y el grupo alcoxilo tienen cada uno preferiblemente de uno a cinco átomos de carbono, más preferiblemente de uno a tres átomos de carbono. El grupo alquilo es preferiblemente un grupo alquilo C1 a C3; es decir, un grupo metilo, un grupo etilo o un grupo propilo. El grupo aminoalquilo es preferiblemente un grupo aminometilo, un grupo aminoetilo o un grupo aminopropilo. Los ejemplos del grupo éster alquílico incluyen un grupo éster metílico, un grupo éster etílico, un grupo éster propílico y un grupo éster butílico. De estos, se prefiere un grupo éster metílico o un grupo éster etílico. La amina polivalente puede tener cualquier número de sustituyentes. La amina polivalente puede tener de uno a cinco sustituyentes en posiciones sustituibles. La amina polivalente tiene preferiblemente de uno a tres sustituyentes. Si la amina polivalente tiene dos o más sustituyentes, los sustituyentes pueden ser idénticos o diferentes entre sí.

En la presente invención, los ejemplos del heteroátomo incluyen nitrógeno, oxígeno y azufre. La amina polivalente usada en la presente invención puede tener cualquier número de heteroátomos en la cadena principal. Por ejemplo, la amina polivalente tiene de uno a cinco heteroátomos o de uno a tres heteroátomos. Cuando la amina polivalente tiene dos o más heteroátomos, los heteroátomos pueden ser idénticos o diferentes entre sí. Cuando la amina polivalente tiene dos o más heteroátomos en la cadena principal, estos heteroátomos pueden estar ubicados por separado para impedir el enlace directo entre los mismos. Cuando la amina polivalente tiene un heteroátomo en la cadena principal, el heteroátomo puede estar ubicado en una posición distinta de una posición en la que se une directamente un grupo funcional reactivo (en particular, un grupo amino primario).

En la presente invención, el número de átomos de carbono en la cadena principal de la amina polivalente es, por ejemplo, de 1 o más, o 2 o más, y es, por ejemplo, de 20 o menos, 12 o menos, 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, o 4 o menos. El número de átomos de carbono es, por ejemplo, de 1 a 20, de 1 a 12, de 1 a 10, de 1 a 8, de 1 a 6, de 1 a 4, de 2 a 20, de 2 a 12, de 2 a 10, de 2 a 8, de 2 a 6, de 2 a 4, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12. El número de átomos de carbono en la cadena principal de la amina polivalente es preferiblemente de 1 a 10, más preferiblemente de 1 a 8, todavía más preferiblemente de 1 a 6, de manera particularmente preferible de 2 a 4, desde un punto de vista de una mejora de la eficacia de reticulación. El número de átomos de carbono en la cadena principal de la amina polivalente es preferiblemente de 1 a 10, más preferiblemente de 1 a 8, todavía más preferiblemente de 1 a 6, aún más preferiblemente de 2 a 5, aún todavía más preferiblemente de 2 a 4, desde un punto de vista de una mejora de la eficacia médica.

En la presente invención, el número de átomos en la cadena principal de la amina polivalente es, por ejemplo, de 1 o más, o 2 o más, y es, por ejemplo, de 20 o menos, 12 o menos, 11 o menos, 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, o 4 o menos. El número de átomos es, por ejemplo, de 1 a 20, de 1 a 12, de 1 a 11, de 1 a 10, de 1 a 8, de 1 a 6, de 1 a 4, de 2 a 20, de 2 a 12, de 2 a 11, de 2 a 10, de 2 a 8, de 2 a 6, de 2 a 4, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12. El número de átomos en la cadena principal de la amina polivalente es preferiblemente de 1 a 11, más preferiblemente de 1 a 10, todavía más preferiblemente de 1 a 8, aún más preferiblemente de 1 a 6, de manera particularmente preferible de 2 a 4, desde un punto de vista de una mejora de la eficacia de reticulación. El número de átomos en la cadena principal de la amina polivalente es preferiblemente de 1 a 11, más preferiblemente de 1 a 10, todavía más preferiblemente de 1 a 8, aún más preferiblemente de 1 a 6, aún todavía más preferiblemente de 2 a 5, de manera particularmente preferible de 2 a 4, desde un punto de vista de una mejora de la eficacia médica.

En la presente invención, la amina polivalente es una triamina o una diamina, y más preferiblemente una diamina. En la presente invención, la amina polivalente es preferiblemente una diamina alifática o una diamina aromática, y más preferiblemente una diamina alifática. Por ejemplo, la diamina alifática puede ser una diamina alifática acíclica o una diamina alifática cíclica, pero es preferiblemente una diamina alifática acíclica. Los ejemplos de la diamina alifática cíclica incluyen una cicloalquilendiamina y un bis(aminoalquil)cicloalcano. Los ejemplos de la diamina alifática acíclica incluyen una alquilendiamina, una alquenilendiamina y una alquinilendiamina. De estos, se prefieren una alquilendiamina y una alquenilendiamina, y se prefiere particularmente una alquilendiamina. Los ejemplos de la diamina aromática incluyen una arilendiamina y un bis(aminoalquil)benceno.

En la presente invención, los ejemplos específicos de la amina polivalente incluyen una alquilendiamina, tal como etano-1,2-diamina, 1,3-diaminopropano, 1,4-diaminobutano (putrescina), 1,5-diaminopentano (cadaverina), 1,6-diaminohexano, 1,7-diaminoheptano, 1,8-diaminooctano, 1,9-diaminononano, 1,10-diaminodecano, 1,11-diaminoundecano, 1,12-diaminododecano, 1,3-diamino-2-propanol, 2,2'-tiodietanamina, 2,2'-oxidietanamina, 1,11-diamino-3,6,9-trioxaundecano, éster etílico de L-lisina, éster etílico de L-ornitina, N-(2-aminoetil)-1,2-etanodiamina, N-(3-aminopropil)butano-1,4-diamina (espermidina) y N,N'-bis(3-aminopropil)butano-1,4-diamina (espermina); triaminas, tales como propano-1,2,3-triamina, pentano-1,3,5-triamina y 2-(aminometil)-2-metilpropano-1,3-diamina; 1,4-bis(aminometil)ciclohexano; 1,4-bis(aminometil)benceno; (E)-2-buteno-1,4-diamina; y una forma de sal de los mismos. Estas aminas pueden usarse individualmente o en combinación de dos o más especies.

CANCELADO

Tal como se usa en el presente documento, el término “estructura reticulada” se refiere a una estructura formada dentro de una única molécula de SC o entre diferentes moléculas de SC a través de la formación de un enlace covalente con un agente reticulante.

El SC reticulado producido mediante el método de la presente invención puede tener una estructura reticulada representada por la siguiente fórmula (I):

Y-CO-NH-R-NH-CO-Z (I)

(en la que Y-CO- representa un resto de unidad disacárida en una molécula de sulfato de condroitina;

-CO-Z representa un resto de unidad disacárida en la misma molécula de sulfato de condroitina o una molécula de sulfato de condroitina diferente;

R representa un grupo hidrocarburo sustituido o no sustituido que tiene opcionalmente un heteroátomo en la cadena principal; y

-CO-NH- y -NH-CO- representan cada uno un enlace amida formado entre un grupo amino de una amina polivalente y un grupo carboxilo de un ácido glucurónico, que es un resto de azúcar constitutivo en el sulfato de condroitina). El SC reticulado producido mediante el método de la presente invención puede tener una estructura representada por la siguiente fórmula (III):

Y-CO-NH-R-NH2 (III)

(en la que Y-CO-, R y -CO-NH- representan cada uno las mismas realizaciones tal como se definió en la fórmula (I) anteriormente). Es decir, el SC reticulado de la presente invención puede tener una estructura en la que un grupo amino de la amina polivalente se une covalentemente a SC.

En la fórmula (I) o (III), -NH-R-NH- o -NH-R-NH2 es un grupo en una amina polivalente usada en la presente invención. Por tanto, la descripción, los ejemplos e intervalos preferidos por lo que se refiere a la amina polivalente usada en la presente invención descritos anteriormente en la sección <Agente reticulante> pueden aplicarse mutatis mutandis a aquellos.

R en las fórmulas (I) y (III) puede ser un grupo hidrocarburo sustituido o no sustituido que tiene opcionalmente un heteroátomo en la cadena principal. El grupo hidrocarburo puede ser un grupo hidrocarburo alifático o un grupo hidrocarburo aromático, pero es preferiblemente un grupo hidrocarburo alifático. El grupo hidrocarburo alifático puede ser un grupo hidrocarburo alifático acíclico o un grupo hidrocarburo alifático cíclico, pero es preferiblemente un grupo hidrocarburo alifático acíclico. El grupo hidrocarburo alifático puede ser un grupo hidrocarburo alifático saturado o un grupo hidrocarburo alifático insaturado. Es decir, el grupo hidrocarburo alifático puede ser un grupo hidrocarburo alifático saturado acíclico, un grupo hidrocarburo alifático insaturado acíclico, un grupo hidrocarburo alifático saturado cíclico o un grupo hidrocarburo alifático insaturado cíclico, pero es preferiblemente un grupo hidrocarburo alifático saturado acíclico. Los ejemplos del grupo hidrocarburo alifático acíclico incluyen un grupo alquileno, un grupo alquenileno y un grupo alquinileno. De estos, se prefiere un grupo alquileno o un grupo alquenileno, y se prefiere más un grupo alquileno. Los ejemplos del grupo hidrocarburo alifático cíclico incluyen un grupo cicloalquileno y un grupo cicloalquilalquileno. Los ejemplos del grupo hidrocarburo aromático incluyen un grupo arileno y un grupo arilalquileno. R en las fórmulas (I) y (III) puede ser un grupo hidrocarburo distinto de un grupo hidrocarburo no sustituido que no tiene ningún heteroátomo en la cadena principal.

La descripción, los ejemplos e intervalos preferidos por lo que se refiere a la amina polivalente en la presente invención descritos anteriormente en la sección <Agente reticulante> pueden aplicarse mutatis mutandis al sustituyente y el heteroátomo en la presente invención.

R en las fórmulas (I) y (III) puede ser un grupo hidrocarburo que no tiene un resto biodegradable. Alternativamente, R puede ser un grupo hidrocarburo que no tiene un resto biodegradable en la cadena principal. Por ejemplo, el resto biodegradable puede ser un enlace éster o un enlace tioéster. Por tanto, R puede ser un grupo hidrocarburo que no tiene ni un enlace éster ni un enlace tioéster en la cadena principal.

R en las fórmulas (I) y (III) puede ser un grupo hidrocarburo que no tiene ningún enlace disulfuro. Alternativamente, R puede ser un grupo hidrocarburo que no tiene ningún enlace disulfuro en la cadena principal. Cuando R tiene dos o más heteroátomos en la cadena principal, estos heteroátomos pueden estar ubicados para impedir el enlace directo entre los mismos. En las fórmulas (I) y (III), los átomos terminales de R unidos a los átomos de nitrógeno pueden ser átomos de carbono.

La descripción, los ejemplos e intervalos preferidos por lo que se refiere al número de átomos de carbono y los átomos en la cadena principal de la amina polivalente usada en la presente invención descritos anteriormente en la sección <Agente reticulante> pueden aplicarse mutatis mutandis al número de átomos de carbono y los átomos en la cadena principal de R en las fórmulas (I) y (III).

En un ejemplo del SC reticulado producido mediante el método de la presente invención, R en las fórmulas (I) y (III) es -CH2CH2-(R1-CH2CH2)n-(en el que R1 representa un átomo de oxígeno, un átomo de azufre o -NH; cuando n es 2 o más, los radicales R1 pueden ser idénticos o diferentes entre sí; y n representa un número entero de 1 a 5 o de 1 a 3).

En un ejemplo del SC reticulado producido mediante el método de la presente invención, R en las fórmulas (I) y (III) es -(CH2)-(CR2R3)-(CH2)m-(en el que R2 y R3 representan independientemente cada uno un átomo de hidrógeno, -OH, -NH2 o un grupo alquilo C1 a C3, un grupo éster alquílico o un grupo aminoalquilo; l representa un número entero de 1 a 5; y m representa un número entero de 0 a 5). En un ejemplo adicional, R es -(CH2)l-(CR2R3)-(CH2)m-(en la que R2, R3, l y m son iguales que los definidos anteriormente; y cuando R2 es un átomo de hidrógeno, R3 no es un átomo de hidrógeno). En otro ejemplo adicional, R es -(CH2)l-(CR2R3)-(CH2)m-(en la que R2, R3 y l son iguales que los definidos anteriormente; m representa un número entero de 1 a 5; y cuando R2 es un átomo de hidrógeno, R3 no es un átomo de hidrógeno).

En un ejemplo del SC reticulado producido mediante el método de la presente invención, R en las fórmulas (I) y (III) es -(CH2)p-CH=CH-(CH2)q-(en el que p y q representan independientemente cada uno un número entero de 0 a 3 o de 1 a 2).

Los ejemplos específicos de R en las fórmulas (I) y (III) incluyen -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)e-, -(CH2)7-, -(CH2)8-, -(CH2)9-, -(CH2)10-, -(CH2)m -(CH2)12-, -CH2CH=CHCH2-, -CH2CH(OH)CH2-, -CH2CH2-S-CH2CH2-, - CH2CH2-O-CH2CH2-, -CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-, - CH2CH(NH2)CH2-, -CH2CH2CH(NH2)CH2CH2-, -CH2CH2-NH-CH2CH2-, -CH2-X-CH2-, -CH2-Ph-CH2-, -CH2C(CH2NH2)(CH3)CH2-, -(CH2)4-NH-(CH2)3-, -(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-, -(CH2)4-CH(COOCH2CH3)- y -(CH2)3-CH(COOCH2CH3)-(en los que X representa un grupo 1,4ciclohexileno, y Ph representa un grupo 1,4-fenileno).

Todos los grupos carboxilo en el SC no forman necesariamente enlaces amida con el agente reticulante; es decir, algunos de los grupos carboxilo pueden formar enlaces amida con el agente reticulante.

Un ejemplo del SC reticulado producido mediante el método de la presente invención es de la siguiente manera. Un derivado de SC que tiene una estructura reticulada formada con un grupo en una amina polivalente usada en la presente invención, estando la estructura reticulada presente entre unidades disacáridas del SC, en el que la estructura reticulada se representa por la siguiente fórmula (I):

Y-CO-NH-R-NH-CO-Z (I)

(en la que Y-CO- representa un resto de unidad disacárida en una molécula de SC;

-CO-Z representa un resto de unidad disacárida en la misma molécula de SC o una molécula de SC diferente;

R representa un grupo hidrocarburo alifático sustituido o no sustituido que tiene de 1 a 11 átomos en la cadena principal y que tiene opcionalmente un heteroátomo en la cadena principal, el heteroátomo es de uno a tres átomos seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre, y el grupo hidrocarburo sustituido tiene al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un grupo alquilo C1 a C3, un grupo aminoalquilo C1 a C3, un grupo hidroxialquilo C1 a C3, un grupo éster alquílico C1 a c 3, un grupo alcoxilo C1 a C3, un grupo amino, un grupo formilo, un grupo hidroxilo y un grupo carboxilo; y

-CO-NH- y -NH-CO- representan cada uno un enlace amida formado entre un grupo amino de una amina polivalente usada en la presente invención y el grupo carboxilo del ácido glucurónico, que es un azúcar constitutivo del SC). En el SC reticulado según este ejemplo, R en la fórmula (I) puede ser un grupo hidrocarburo que no tiene un resto biodegradable y/o un enlace disulfuro en la cadena principal.

<Método para producir SC reticulado>

En el método de la presente invención, SC reticulado se produce a través de la formación de un enlace covalente mediante la amidación de un grupo carboxilo del SC y un grupo amino de una amina polivalente, que es una diamina que tiene dos grupos amino primarios o una triamina que tiene tres grupos amino primarios. Los grupos carboxilo de Sc pueden estar presentes en una única molécula de SC o en moléculas de SC diferentes. Los ejemplos e intervalos preferidos descritos anteriormente en la sección <Agente reticulante> pueden aplicarse mutatis mutandis a la amina polivalente usada en el método de la presente invención.

La concentración de SC en un disolvente usado para la reacción de reticulación entre el SC y el agente de reticulación es preferiblemente del 2 al 20% en peso (a continuación en el presente documento puede denominarse “% en peso”), más preferiblemente del 2 al 15% en peso, de manera particularmente preferible del 3 al 15% en peso. No se impone ninguna limitación particular en el disolvente usado para la reacción de reticulación, siempre que disuelva el SC y el agente de reticulación. El disolvente es preferiblemente agua o una mezcla de agua y un disolvente orgánico miscible en agua. Los ejemplos del disolvente orgánico miscible en agua incluyen, pero se limitan particularmente a, alcoholes inferiores, tales como metanol, etanol, isopropanol, n-propanol y butanol terciario; éteres de glicol, tales como monometil éter de etilenglicol y monoetil éter de etilenglicol; acetona; 1,4-dioxano; tetrahidrofurano; y acetonitrilo. De estos, se prefieren metanol, etanol, acetona, tetrahidrofurano y 1,4-dioxano. Estos disolventes orgánicos miscibles en agua, que se mezclan con agua, pueden usarse individualmente o en una combinación de dos o más especies.

No se impone ninguna limitación particular en el tiempo de reacción de reticulación. Por ejemplo, el tiempo de reacción de reticulación puede ser de 1 a 48 horas, de 1 a 24 horas, de 2 a 20 horas, o durante la noche. Tal como se usa en el presente documento, el término “durante la noche” se refiere a de 10 a 24 horas. Por ejemplo, la reacción de reticulación puede detenerse durante la reacción mediante la adición de una disolución acuosa de carbonato de sodio al 10%. No se impone ninguna limitación particular en la temperatura de reacción de reticulación. La temperatura de reacción de reticulación, que se determina de manera apropiada dependiendo del tipo del disolvente usado, es preferiblemente de 5 a 60°C, más preferiblemente de 15 a 30°C.

La reacción de reticulación puede estar seguida de manera apropiada por una etapa de tratamiento con álcali. No se impone ninguna limitación particular en el tratamiento con álcali para alcalinizar la mezcla de reacción obtenida a través de la reacción de reticulación, siempre que la mezcla de reacción tratada presente alcalinidad. Específicamente, el tratamiento con álcali implica preferiblemente el uso de una base inorgánica. En particular, se usa preferiblemente hidróxido de sodio, hidrogenocarbonato de sodio o carbonato de sodio. Por ejemplo, el tratamiento con álcali se realiza a un pH de 7,2 a 11, preferiblemente a un pH de 7,5 a 10. No se impone ninguna limitación particular en el tiempo de tratamiento con álcali. Por ejemplo, el tiempo de tratamiento con álcali es de 2 a 12 horas, preferiblemente de 2 a 6 horas. La temperatura de tratamiento con álcali es preferiblemente de 5 a 60°C, más preferiblemente de 15 a 30°C.

Después de la reacción de reticulación o la etapa de tratamiento con álcali, la mezcla de reacción que contiene el SC reticulado se somete a 1) una etapa de agitación, 2) una etapa de precipitación, 3) una etapa de lavado y 4) una etapa de secado, preparando de ese modo finalmente un polvo seco de SC reticulado.

La etapa de agitación, la etapa de precipitación, la etapa de lavado y la etapa de secado pueden llevarse a cabo mediante un método conocido generalmente por los expertos en la técnica. No se impone ninguna limitación particular en el método.

CANCELADO

Por ejemplo, el método de amidación usado en el método de la presente invención puede ser un método que usa, en un disolvente, un agente de condensación, tal como una carbodiimida soluble en agua (por ejemplo, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida), diciclohexilcarbodiimida (DCC) o cloruro de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinio N-hidratado (DMT-MM); el método de anhídrido de ácido simétrico; el método de anhídrido de ácido mixto; o el método de éster activo. Las condiciones de reacción para el método de amidación se determinan de manera apropiada dependiendo del SC y el agente de reticulación usado.

La concentración de SC en un disolvente es preferiblemente del 2 al 20% en peso, más preferiblemente del 2 al 15% en peso, de manera particularmente preferible del 3 al 15% en peso. El equivalente molar (eq) de la amina polivalente como agente de reticulación es de 0,005 a 0,100 eq, en relación con 1,00 equivalente molar (eq) de la unidad disacárida de SC.

El equivalente molar (eq) del agente de condensación es preferiblemente [(de 0,50 a 5,00) * valencia] eq, más preferiblemente [(de 1,00 a 4,00) * valencia] eq, de manera particularmente preferible [(de 1,00 a 3,00) * valencia] eq, en relación con 1,00 equivalente molar (eq) de la amina polivalente usada en la presente invención. Tal como se usa en el presente documento, el término “valencia” se refiere a la valencia de la amina polivalente.

Los ejemplos e intervalos preferidos descritos anteriormente pueden aplicarse mutatis mutandis al disolvente usado para la reacción de reticulación, el tiempo de reacción de reticulación, y la temperatura de reacción de reticulación. El método de amidación usado para la reacción de reticulación, la concentración de SC, la estructura de la amina polivalente como agente de reticulación, la cantidad del agente de reticulación añadido, la cantidad del agente de condensación añadido, y el disolvente se determinan de manera apropiada dependiendo de las propiedades requeridas para el SC reticulado.

En el caso de la reticulación mediante el uso de un grupo hidroxilo de SC (que no es según la presente invención), pueden producirse productos de SC reticulado que tienen una variedad de estructuras dependiendo de la posición reticulada de los grupos hidroxilo. En el método de la presente invención, la reticulación se realiza usando un grupo carboxilo del SC mediante lo cual se reduce la diversidad estructural del SC reticulado. El agente de reticulación es una amina polivalente en vista de formación de un enlace amida entre la amina polivalente y un grupo carboxilo del SC. Para reducir la diversidad estructural del SC reticulado, se prefiere particularmente una diamina.

Por ejemplo, la estructura reticulada del SC reticulado puede determinarse mediante el método descrito en el ejemplo 12A.

Tal como se usa en el presente documento, el porcentaje de reticulación del SC reticulado se refiere al porcentaje del número de agentes reticulantes (en los que dos o más grupos funcionales están unidos al SC) en relación con el número de unidades disacáridas del SC. Por ejemplo, el porcentaje de reticulación de un derivado del SC que tiene una estructura reticulada formada con un grupo en una diamina se calcula mediante la siguiente fórmula (A):

[Fórmula 1] (la cantidad en moles (mol) de un agente reticulante en el que ambos grupos aminos terminales están unidos al SC)/(la cantidad total en moles (mol) de -COR en el SC reticulado) x 100(%) (A)

(en la que R representa -OH, -OM (M representa un metal del grupo 1 ó 2 de la tabla periódica), o un grupo en una diamina).

No se impone ninguna limitación particular en el porcentaje de reticulación del SC reticulado producido mediante el método de la presente invención. Por ejemplo, el porcentaje de reticulación puede ser del 0,01% o más, del 0,05% o más, del 0,1% o más, del 0,5% o más, del 30% o menos, del 10% o menos, del 5% o menos, del 3% o menos, o del 1% o menos. El porcentaje de reticulación es preferiblemente del 0,01 al 30%, más preferiblemente del 0,05 al 10%, todavía más preferiblemente del 0,1 al 5%, aún más preferiblemente del 0,25 al 4%, de manera particularmente preferible del 0,5 al 3%.

<Determinación del porcentaje de reticulación>

Por ejemplo, el porcentaje de reticulación del derivado de SC que tiene una estructura reticulada a través de un grupo en una diamina puede determinarse mediante el método descrito a continuación. Específicamente, se añade ácido sulfúrico diluido a una sustancia de prueba seguido por calentamiento a 60°C durante seis horas, y luego se basifica la disolución resultante. Se añade óxido de propileno a la disolución basificada y se calienta a 60°C durante la noche. La disolución fuertemente acidificada se calienta a 110°C durante la noche, y se basifica la disolución resultante. Se marca el grupo amino del agente reticulante con isotiocianato de fenilo, y el agente reticulante marcado se cuantifica por medio de CL/EM. La razón de la cantidad en moles del agente reticulante con respecto a la de la unidad disacárida de SC se calcula en porcentaje.

Los ejemplos del “portador farmacéuticamente aceptable” tal como se usa en el presente documento incluyen solución salina, solución salina tamponada con fosfato, agua purificada y agua para inyección. El portador farmacéuticamente aceptable puede contener un aditivo habitual, tal como un agente de ajuste del pH, un tampón, un agente isotonizante, un estabilizador o un conservante. Los ejemplos del aditivo incluyen cloruro de sodio, cloruro de potasio, dihidrogenofosfato de sodio, hidrogenofosfato de disodio, dihidrogenofosfato de monopotasio, edetato de sodio y cloruro de benzalconio.

<Composición que contiene SC reticulado>

El SC reticulado producido mediante el método de la presente invención puede contenerse en una composición. No se impone ninguna limitación particular en el método para preparar la composición que contiene el SC reticulado de la presente invención (a continuación en el presente documento puede denominarse “la composición que contiene el SC reticulado”). Por ejemplo, la composición que contiene el SC reticulado puede prepararse mezclando el SC reticulado producido mediante el método de la presente invención con un portador farmacéuticamente aceptable, y agitando la mezcla resultante por medio de un aparato de agitación durante de 4 a 24 horas o más.

La composición que contiene el SC reticulado está preferiblemente en forma de líquido, más preferiblemente en forma de disolución acuosa en vista de una dispersión suficientemente homogénea del soluto microparticulado en un disolvente. Tal como se usa en el presente documento, el término “disolución acuosa” se refiere a una composición que contiene agua como disolvente y que está en forma transparente (a continuación en el presente documento puede denominarse “forma de disolución”). La forma de disolución puede determinarse mediante la “prueba para determinar la forma de disolución” descrita a continuación. En el caso en el que la composición que contiene el SC reticulado se usa como preparación farmacéutica (por ejemplo, un colirio), la presencia de materia insoluble en la composición puede provocar un cuerpo extraño. Por tanto, la composición que contiene el SC reticulado está preferiblemente en forma de disolución acuosa. Por ejemplo, la composición que contiene agua como disolvente es una composición preparada mezclando el SC reticulado con solución salina, solución salina tamponada con fosfato, agua purificada o agua para inyección.

El SC reticulado es preferiblemente soluble en agua. La “prueba para determinar la solubilidad en agua” descrita a continuación puede determinar si el SC reticulado es soluble o no en agua.

En la composición que contiene el SC reticulado, el SC reticulado presenta una tasa de paso de filtro de preferiblemente el 50% o más, más preferiblemente el 60% o más, todavía más preferiblemente el 70% o más, aún más preferiblemente el 80% o más, de manera particularmente preferible el 85% o más.

La composición que contiene el SC reticulado puede tener una viscosidad de 5 a 11.000, de 10 a 5.000, de 20 a 1.000, de 30 a 300, o de 30 a 250 mPa s. La concentración del SC reticulado en la composición que contiene el SC reticulado puede ser del 0,1 al 15% en peso, del 0,3 al 13% en peso, o del 1 al 10% en peso en relación con la cantidad total de la composición.

La absorbancia de una composición preparada a 600 nm se mide por medio de un espectrofotómetro ultravioletavisible (UV-1800, fabricado por Shimadzu Corporation). Una composición que presenta una absorbancia de 0,1 o menos se define como “transparente”, y una composición que presenta una absorbancia de más de 0,1 se define como “turbia”.

Un SC reticulado se disuelve en agua o PBS para lograr una concentración del 2,0% (p/p), y la absorbancia de la composición resultante a 600 nm se mide por medio de un espectrofotómetro ultravioleta-visible (UV-1800, fabricado por Shimadzu Corporation). Un SC reticulado que presenta una absorbancia de 0,1 o menos se define como “soluble en agua”.

<Medición de la viscosidad>

La viscosidad de la composición se mide a 25°C y 5 rpm por medio de un viscosímetro rotatorio de tipo E (TV-L/H, Toki Sangyo Co., Ltd.) con un cono convencional (CORD-1, 1° 34' xR24). La viscosidad medida se define como “viscosidad” (mPas) tal como se usa en el presente documento. Si la viscosidad a 5 rpm está fuera del intervalo de detección, se determina un valor extrapolado a otra velocidad de rotación, y el valor se define como “viscosidad” (mPas) tal como se usa en el presente documento.

Se hace pasar una muestra a través de un filtro poroso (tamaño de poro: 5,0 |im, diámetro: 25 mm) a 25°C, y la concentración de SC (en cuanto a unidad disacárida) de la muestra (a continuación en el presente documento puede denominarse “concentración de SC”) se mide antes y después del paso de la muestra a través del filtro mediante el método de carbazol-ácido sulfúrico descrito a continuación. La “tasa de paso de filtro” tal como se usa en el presente documento se calcula mediante la siguiente fórmula (B). La presión durante el paso de la muestra a través del filtro se ajusta a 5,3 kgf/cm2 o menos.

[Fórmula 2] (la concentración de SC (% en peso) de una muestra después del paso a través de un filtro)/(la concentración de SC (% en peso) de la muestra antes del paso a través del filtro) x 100(%) (B)

Por ejemplo, cuando la concentración de SC de una muestra antes del paso a través de un filtro es del 1,00% y la concentración de SC de la muestra después del paso a través del filtro es del 0,90%, la tasa de paso de filtro es del 90%.

<Cálculo de la concentración de SC mediante el método de carbazol-ácido sulfúrico>

La concentración de SC (mol/l) se calcula mediante la siguiente fórmula (C) según el método de carbazol-ácido sulfúrico mediante el uso de disolución acuosa de D-glucuronolactona 20,0 |ig/ml (peso molecular: 176,12) como patrón.

[Fórmula 3] DO530 [muestra] DO530 [patrón] x concentración de D-glucuronolactona (mol/l) (C)

(en la que DO530 corresponde a la densidad óptica a una longitud de onda de 530 nm).

Pueden usarse el SC reticulado producido mediante el método de la presente invención y la composición que contiene el SC reticulado producida mediante el método de la presente invención, por ejemplo, como preparación farmacéutica o un agente para el tratamiento de una enfermedad ocular. Por tanto, el SC reticulado producido mediante el método de la presente invención puede usarse como principio activo farmacéutico de una preparación farmacéutica o un agente para el tratamiento de una enfermedad ocular.

El agente para el tratamiento de una enfermedad ocular contiene el SC reticulado producido mediante el método de la presente invención como principio activo farmacéutico. El SC reticulado es cualquiera de los descritos anteriormente en el presente documento; en particular, cualquiera de los derivados de SC mencionados anteriormente producidos según las realizaciones [A1] a [A5]. No se impone ninguna limitación particular en la “enfermedad ocular” tal como se usa en el presente documento, siempre que provoca cualquier anomalía en el segmento anterior del ojo. El segmento anterior del ojo es preferiblemente la superficie ocular, más preferiblemente la córnea, y de manera particularmente preferible la córnea superficial. El “segmento anterior del ojo” tal como se usa en el presente documento incluye las lágrimas. La “enfermedad ocular” tal como se usa en el presente documento es preferiblemente trastorno epitelial corneal, película lagrimal anómala u ojo seco, y de manera particularmente preferible trastorno epitelial corneal u ojo seco. El “ojo seco” tal como se usa en el presente documento puede ser uno o ambos de enfermedad de ojo seco y síndrome de ojo seco. El término “película lagrimal anómala” corresponde al estado en el que la película lagrimal se rompe o la película lagrimal es probable que se rompa, e incluye el estado de “inestabilidad de película lagrimal” según la definición de ojo seco por el DEWS (The Ocular Surface vol. 5, n.° 2: 75-92, 2007). Por ejemplo, la película lagrimal anómala es provocada por un aumento de evaporación de las lágrimas o una reducción del volumen de lágrimas. Por ejemplo, la película lagrimal anómala puede determinarse mediante la prueba de Schirmer, tiempo de ruptura (BUT) o índice de regularidad superficial (SRI).

No se impone ninguna limitación particular en el “trastorno epitelial corneal”, siempre que sea el trastorno en la córnea superficial. Por ejemplo, el trastorno epitelial corneal es defecto epitelial corneal, erosión corneal, úlcera corneal, perforación corneal. Los ejemplos del trastorno epitelial corneal incluyen trastornos epiteliales corneales provocados por queratopatía punteada superficial, queratitis, o similares. Otros ejemplos del trastorno epitelial corneal incluyen trastornos epiteliales corneales provocados por enfermedades endógenas, tales como ojo seco, síndrome Sjogren y síndrome Stevens-Johnson; y trastornos epiteliales corneales provocados por factores exógenos, tales como llevar lentes de contacto, traumatismo, cirugía, infección o preparación farmacéutica. Es particularmente preferido un trastorno epitelial corneal provocado por ojo seco.

El término “tratamiento” tal como se usa en el presente documento incluye terapia. El término “terapia” incluye mejora, curación y aceleración de la curación. Por tanto, el término “agente para el tratamiento” incluye un agente terapéutico, y el término “agente terapéutico” incluye un agente de mejora y un acelerador de la curación. Tal como se usa en el presente documento, la terapia para película lagrimal anómala puede denominarse “estabilización de la película lagrimal”.

El “agente para el tratamiento de enfermedad ocular” tal como se usa en el presente documento es preferiblemente un agente para el tratamiento de una anomalía en el segmento anterior del ojo, en particular, una anomalía en la superficie ocular o las lágrimas. Los ejemplos específicos del agente incluyen un agente para el tratamiento de un trastorno epitelial corneal, un estabilizador de la película lagrimal y un agente para el tratamiento de ojo seco.

No se impone ninguna limitación particular en la forma de dosificación del agente para el tratamiento de una enfermedad ocular que contiene el SC reticulado producido mediante el método de la presente invención como principio activo farmacéutico (a continuación en el presente documento el agente puede denominarse “el agente”). Los ejemplos de la forma de dosificación incluyen colirio, una pomada oftálmica, una crema y una loción. De estos, se prefiere un colirio, y es particularmente preferido un colirio acuoso. El término “colirio acuoso” se refiere a un colirio que contiene agua en una cantidad del 50% en peso o más. El colirio acuoso de la presente invención contiene agua en una cantidad de preferiblemente el 80% en peso o más, más preferiblemente el 90% en peso o más. El colirio acuoso de la presente invención puede contener cualquier agua farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable. Los ejemplos del agua incluyen agua destilada, agua purificada, agua purificada esterilizada, agua para inyección y agua destilada para inyección. Estas definiciones se basan en la Farmacopea Japonesa, decimosexta edición. Por ejemplo, el colirio puede contener solución salina o solución salina tamponada con fosfato. El colirio puede contener de manera apropiada un aditivo habitual, tal como un agente de ajuste del pH, un tampón, un agente isotonizante, un estabilizador o un conservante. Los ejemplos del aditivo incluyen cloruro de sodio, cloruro de potasio, dihidrogenofosfato de sodio, hidrogenofosfato de disodio, dihidrogenofosfato de monopotasio, edetato de sodio y cloruro de benzalconio. No se impone ninguna limitación particular en el pH y la razón de presión osmótica del colirio, siempre que se encuentren dentro de los intervalos aceptables para las preparaciones oftálmicas. El agente no contiene necesariamente ácido hialurónico.

El agente está preferiblemente en forma de líquida, más preferiblemente en forma de disolución acuosa en vista de una dispersión suficientemente homogénea del soluto microparticulado en un disolvente. En el caso en el que el agente se usa como colirio, la presencia de materia insoluble en el agente puede provocar una sensación de cuerpo extraño. Por tanto, el agente está preferiblemente en forma de disolución acuosa. En el agente, el SC reticulado presenta una tasa de paso de filtro de preferiblemente del 60% o más, más preferiblemente el 70% o más, todavía más preferiblemente el 80% o más, de manera particularmente preferible el 85% o más.

No se impone ninguna limitación particular en la concentración del SC reticulado en el agente, siempre que sea una concentración eficaz que presenta una eficacia médica deseada. Por ejemplo, la concentración del SC reticulado es del 0,01 al 20% en peso, del 0,1 al 15% en peso, o del 0,3 al 10% en peso.

La diana de aplicación del agente es preferiblemente un mamífero. Los ejemplos del mamífero incluyen, pero no se limitan particularmente a, humano, equino, bovino, canino, felino, conejo, hámster, cobaya y ratón. El agente puede servir como preparación farmacéutica para un humano o un animal, preferiblemente una preparación farmacéutica para un humano.

Por ejemplo, la dosificación del agente puede variarse de manera apropiada dependiendo del grado del síntoma del paciente, la edad o peso corporal de un paciente, o el diagnóstico de un médico.

No se impone ninguna limitación particular en el número de veces de instilación del agente por día o el periodo de instilación. Por ejemplo, el número de veces de instilación del agente por día es de uno a ocho, de uno a seis, de uno a cuatro, de uno a tres, uno o dos, y el número puede “aumentarse o disminuirse de manera apropiada”. No se impone ninguna limitación particular en el periodo de instilación y, por ejemplo, el periodo es de una semana a varios meses. El agente se instila preferiblemente cada día. Por ejemplo, para el caso de un colirio se instilan una o dos gotas o de una a tres gotas con una única aplicación; específicamente, de una a ocho instilaciones oculares por día (de una a tres gotas por instilación), de una a seis instilaciones oculares por día (de una a tres gotas por instilación), de una a cuatro instilaciones oculares por día (de una a tres gotas por instilación), de una a tres instilaciones oculares por día (de una a tres gotas por instilación), o una o dos instilaciones oculares por día (de una a tres gotas por instilación). Por ejemplo, el colirio se instila cada día.

<Método de uso del agente>

El agente puede instilarse en los ojos de un humano o un animal. No se impone ninguna limitación particular en la instilación del agente en el/los ojo(s) de un humano o un animal, siempre que el agente se instile de una manera médicamente aceptable de modo que se logren los efectos ventajosos de la presente invención.

No se impone ninguna limitación particular en la manera específica de instilación del agente. La manera de instilación puede determinarse de manera apropiada dependiendo de la forma de dosificación o preparación y, por ejemplo, es preferiblemente instilación ocular.

<Método para el tratamiento de una enfermedad ocular>

El agente puede usarse en un método para el tratamiento de una enfermedad ocular, implicando el método la instilación del agente o la composición que contiene el SC reticulado producido mediante el método de la presente invención en los ojos de un humano o un animal. El método de tratamiento puede llevarse a cabo de la misma manera tal como se describió anteriormente, por ejemplo, en las secciones <Diana de aplicación>, <Uso y dosificación> y <Método de uso del agente>.

Ejemplos

La presente invención se describirá a continuación con más detalle por medio de ejemplos y ejemplos de prueba, que no deben interpretarse como una limitación del alcance técnico de la invención a los mismos. A menos que se especifique lo contrario, el “%” es en una base en masa. A menos que se especifique lo contrario, el equivalente molar (representado por “eq”) de una amina polivalente como agente de reticulación y un agente de condensación es en relación con la unidad disacárida de SC.

Ejemplo 1

Producción de SC-NC2N reticulado

(A) Ejemplo típico

Se disolvió SC (SCC, sulfato de condroitina sódico (Japanese Pharmaceutical Codex), peso molecular promedio en peso: 40.000, Seikagaku Corporation) (2,00 g) (unidad disacárida: 3,91 mmol [calculado a partir del peso molecular promedio de la unidad disacárida (= 511)], 1,00 eq) en agua para inyección (WFI) para lograr una concentración del 10%. Se mezcló la disolución resultante con etanol (EtOH) (20,0 ml). Se añadieron secuencialmente gota a gota una disolución (4,00 ml) de diclorhidrato de etano-1,2-diamina (NC2N2HCl, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (es decir, un agente de reticulación) (10,4 mg, 0,0783 mmol, 0,0200 eq) en etanol al 50% y una disolución (4,00 ml) de DMT-MM (TRIAZIMOCH, Tokuyama Corporation) (es decir, un agente de condensación) (86,6 mg, 0,313 mmol, 0,0800 eq) en etanol al 50% a la mezcla, y se agitó la mezcla resultante a temperatura ambiente durante la noche (reacción de reticulación). Se añadió una disolución acuosa de carbonato de sodio al 10% (Na2CO3/WFI) (20 ml) a la mezcla, y se agitó vigorosamente la mezcla durante de dos a cuatro horas. Se neutralizó la mezcla resultante con una disolución acuosa de ácido acético al 50% en peso (AcOH/WFI) (4,0 ml), y luego se añadió cloruro de sodio (NaCl) (2,0 g) a la mezcla, seguido por precipitación con EtOH. Se recogió el precipitado resultante a través de filtración y se lavó con EtOH al 90% (200 ml) tres veces y luego con EtOH (200 ml) dos veces. Se secó el precipitado resultante a presión reducida a 42°C durante la noche, para producir de ese modo un producto de SC reticulado (SC-NC2N reticulado, compuesto 1) como un polvo blanco (1,81 g).

(B) Ejemplo de producción diferente del ejemplo típico en cuanto a equivalente de agente de reticulación

Se repitió el procedimiento del ejemplo 1(A), excepto que el equivalente molar de NC2N 2HCl se cambió a 0,0050, 0,0100, 0,0150, 0,0175, 0,0225, 0,0250 y 0,0275 eq, y el equivalente molar de DMT-MM se cambió a 0,0200, 0,0400, 0,0600, 0,0700, 0,0900, 0,100 y 0,110 eq, para producir de ese modo productos de SC reticulado (SC-NC2N reticulado, compuestos 2 a 8) como polvos blancos (aproximadamente 1,75 g cada uno).

Ejemplo 2

Producción de SC-NC2N reticulado

(A) Escala de 10 g

Se repitió el procedimiento del ejemplo 1(A), excepto que la cantidad de SC se cambió a 10 g, el equivalente molar de NC2N2HCI se cambió a 0,020 eq, y el equivalente molar de DMT-MM se cambió a 0,080 eq, para producir de ese modo un producto de SC reticulado (SC-NC2N reticulado, compuesto 9) como un polvo blanco (8,94 g).

(B) Escala de 20 g

Se repitió el procedimiento del ejemplo 1(A), excepto que la cantidad de SC se cambió a 20 g, el equivalente molar de NC2N2HCI se cambió a 0,02375 eq, el equivalente molar de DMT-MM se cambió a 0,0950 eq, y el tiempo de reacción de reticulación se cambió a 3 horas y 46 minutos, para producir de ese modo un producto de SC reticulado (SC-NC2N reticulado, compuesto 10) como un polvo blanco (19,1 g).

Ejemplo 3

Producción de SC-NC3N reticulado

Se repitió el procedimiento del ejemplo 1(A), excepto que la cantidad de SC se cambió a 1 g, se usó diclorhidrato de 1,3-diaminopropano (NC3N2HCl, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) como agente de reticulación (equivalente molar: 0,0150, 0,0200, 0,0300 y 0,0400 eq), y el equivalente molar de DMT-MM se cambió a 0,0600, 0,0800, 0,120 y 0,160 eq, para producir de ese modo productos de SC reticulado (SC-NC3N reticulado, compuestos 11 a 14) como polvos blancos (aproximadamente 0,84 g cada uno).

Ejemplo 4

Producción de SC-NC4N reticulado

Se repitió el procedimiento del ejemplo 1(A), excepto que la cantidad de SC se cambió a 4 g, se usó diclorhidrato de 1,4-diaminobutano (NC4N2HCI, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) como agente de reticulación (equivalente molar: 0,0300, 0,0425, 0,0450 y 0,0475 eq), y el equivalente molar de D^mT-MM se cambió a 0,120, 0,170, 0,180 y 0,190 eq, para producir de ese modo productos de SC reticulado (SC-NC4N reticulado, compuestos 15 a 18) como polvos blancos (aproximadamente 3,85 g cada uno).

Ejemplo 5

Producción de SC-NC5N reticulado

Se repitió el procedimiento del ejemplo 1(A), excepto que la cantidad de SC se cambió a 1 g, se usó diclorhidrato de 1,5-diaminopentano (NC5N2HCl, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) como agente de reticulación (equivalente molar: 0,0250, 0,0350, 0,0450 y 0,0550 eq), y el equivalente molar de DMT-MM se cambió a 0,100, 0,140, 0,180 y 0,220 eq, para producir de ese modo productos de SC reticulado (SC-NC5N reticulado, compuestos 19 a 22) como polvos blancos (aproximadamente 0,85 g cada uno).

Ejemplo 6

Producción de SC-NC6N reticulado

Se repitió el procedimiento del ejemplo 1(A), excepto que la cantidad de SC se cambió a 4 g, se usó diclorhidrato de 1,6-diaminohexano (NC6N2HCI, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) como agente de reticulación (equivalente molar: 0,0400, 0,0525, 0,0550 y 0,0575 eq), y el equivalente molar de D^mT-MM se cambió a 0,160, 0,210, 0,220 y 0,230 eq, para producir de ese modo productos de SC reticulado (SC-NC6N reticulado, compuestos 23 a 26) como polvos blancos (aproximadamente 3,83 g cada uno).

Ejemplo 7

Producción de SC-NC8N reticulado

Se repitió el procedimiento del ejemplo 1(A), excepto que la cantidad de SC se cambió a 4 g, se usó diclorhidrato de 1,8-diaminooctano (NC8N 2HCI, preparado mediante la adición de ácido clorhídrico 1 N (2,00 eq) a 1,8-diaminooctano [Wako Pure Chemical Industries, Ltd.]) como agente de reticulación (equivalente molar: 0,0500, 0,0650, 0,0700 y 0,0725 eq), y el equivalente molar de DMT-MM se cambió a 0,200, 0,260, 0,280 y 0,290 eq, para producir de ese modo productos de SC reticulado (SC-NC8N reticulado, compuestos 27 a 30) como polvos blancos (aproximadamente 3,88 g cada uno).

Ejemplo 8

Producción de SC-NC12N reticulado

Se repitió el procedimiento del ejemplo 1(A), excepto que la cantidad de SC se cambió a 1 g, se usó diclorhidrato de 1,12-diaminododecano (NC12N2HCl, preparado mediante la adición de ácido clorhídrico 1 N (2,00 eq) a 1,12-diaminododecano [Sigma-Aldrich]) como agente de reticulación (equivalente molar: 0,0550 y 0,0700 eq), y el equivalente molar de DMT-MM se cambió a 0,220 y 0,280 eq, para producir de ese modo productos de SC reticulado (SC-NC12N reticulado, compuestos 31 y 32) como polvos blancos (aproximadamente 0,82 g cada uno). Ejemplo 9

Producción de SC-LysEt reticulado

Se repitió el procedimiento del ejemplo 1(A), excepto que la cantidad de SC se cambió a 1 g, se usó diclorhidrato de éster etílico de L-lisina (LysEt2HCl, Sigma-Aldrich) como agente de reticulación (equivalente molar: 0,0450 eq), se fijó el equivalente molar de DMT-MM a 0,180 eq, y el tiempo de reacción de reticulación se cambió a 2 horas, 3 horas, 3 horas y 40 minutos, 4 horas y 20 minutos, 5 horas, y 5 horas y 50 minutos, para producir de ese modo productos de SC reticulado (SC-LysEt reticulado, compuestos 33 a 38) como polvos blancos (aproximadamente 1,04 g cada uno).

Ejemplo 10

Producción de SC-OrnEt reticulado

Se repitió el procedimiento del ejemplo 1(A), excepto que la cantidad de SC se cambió a 2 g, se usó diclorhidrato de éter etílico de ornitina (OrnEt2HCl, Chem-Impex International) como agente de reticulación (equivalente molar: 0,0200, 0,0300, 0,0325 y 0,0350 eq), y el equivalente molar de DMT-MM se cambió a 0,0800, 0,120, 0,130 y 0,140 eq, para producir de ese modo productos de SC reticulado (SC-OrnEt reticulado, compuestos 39 a 42) como polvos blancos (aproximadamente 1,99 g cada uno).

Ejemplo 11

Producción de SC-espermidina reticulado

Se repitió el procedimiento del ejemplo 1(A), excepto que la cantidad de SC se cambió a 1 ó 2 g, se usó triclorhidrato de espermidina (espermidina3HCl, Sigma-Aldrich) como agente de reticulación (equivalente molar: 0,0100, 0,0200 y 0,0220 eq), y el equivalente molar de DMT-MM se cambió a 0,0400, 0,0800 y 0,0880 eq, para producir de ese modo productos de SC reticulado (SC-espermidina reticulado, compuestos 43, 44 y 67) como polvos blancos (aproximadamente 0,77 g, aproximadamente 0,77 g y aproximadamente 1,75 g, respectivamente).

Ejemplo A1

Producción de SC-triAmina reticulado

Se repitió el procedimiento del ejemplo 1(A), excepto que la cantidad de SC se cambió a 2 g, se usó triclorhidrato de 2-(aminometil)-2-metilpropano-1,3-diamina (triAmina-3HCl, Aldrich) como agente de reticulación (equivalente molar: 0,0091, 0,0092 y 0,0097 eq), y el equivalente molar de DMT-^mM se cambió a 0,0364, 0,0368 y 0,0388 eq, para producir de ese modo productos de SC reticulado (SC-triAmina reticulado, compuestos 48 a 50) como polvos blancos (aproximadamente 1,74 g cada uno).

Ejemplo A2

Producción de SC-NC3(OH)N reticulado

Se repitió el procedimiento del ejemplo 1(A), excepto que la cantidad de SC se cambió a 2 g, se usó diclorhidrato de 1,3-diamino-2-propanol (NC3(o H)N 2HCI, preparado mediante la adición de ácido clorhídrico 1 N (2,00 eq) a 1,3-diamino-2-propanol [Aldrich]) como agente de reticulación (equivalente molar: 0,0220, 0,0240 y 0,0260 eq), y el equivalente molar de DMT-MM se cambió a 0,0880, 0,0960 y 0,1040 eq, para producir de ese modo productos de SC reticulado (SC-NC3(OH)N reticulado, compuestos 51 a 53) como polvos blancos (aproximadamente 1,75 g cada uno).

Ejemplo A3

Producción de SC-NC4(=)N reticulado

Se repitió el procedimiento del ejemplo 1(A), excepto que la cantidad de SC se cambió a 2 g, se usó diclorhidrato de (E)-2-buteno-1,4-diamina (NC4(=)N 2HCl, Small Molecules, Inc.) como agente de reticulación (equivalente molar: 0,0270 y 0,0275 eq), y el equivalente molar de DMT-MM se cambió a 0,1080 y 0,1100 eq, para producir de ese modo productos de SC reticulado (SC-NC4(=)N reticulado, compuestos 54 y 55) como polvos blancos (aproximadamente 1,80 g cada uno).

Ejemplo A4

Producción de SC-xilileno reticulado

Se repitió el procedimiento del ejemplo 1(A), excepto que la cantidad de SC se cambió a 2 g, se usó diclorhidrato de 1,4-bis(aminometil)benceno (xilileno-2HCl, preparado mediante la adición de ácido clorhídrico 1 N (2,00 eq) a 1,4-bis(aminometil)benceno [Aldrich]) como agente de reticulación (equivalente molar: 0,0135, 0,0145 y 0,0150 eq), y el equivalente molar de DMT-MM se cambió a 0,0540, 0,0580 y 0,0600 eq, para producir de ese modo productos de SC reticulado (SC-xilileno reticulado, compuestos 56 a 58) como polvos blancos (aproximadamente 1,77 g cada uno).

Ejemplo A5

Producción de SC-ciclohex. reticulado

Se repitió el procedimiento del ejemplo 1(A), excepto que la cantidad de SC se cambió a 2 g, se usó diclorhidrato de 1.4- bis(aminometil)ciclohexano (ciclohex.2HCl, preparado mediante la adición de ácido clorhídrico 1 N (2,00 eq) a 1.4- bis(aminometil)ciclohexano [Kanto Chemical Co., Inc.]) como agente de reticulación (equivalente molar: 0,0410 y 0,0425 eq), y el equivalente molar de DMT-MM se cambió a 0,1640 y 0,1700 eq, para producir de ese modo productos de SC reticulado (SC-ciclohex. reticulado, compuestos 59 y 60) como polvos blancos (aproximadamente 1,80 g cada uno).

Ejemplo A6

Producción de SC-NC5(S)N reticulado

Se repitió el procedimiento del ejemplo 1(A), excepto que la cantidad de SC se cambió a 2 g, se usó diclorhidrato de 2,2'-tiodietanamina (NC5(S)N2HCl, preparado mediante la adición de ácido clorhídrico 1 N (2,00 eq) a 2,2'-tiodietanamina [Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.]) como agente de reticulación (equivalente molar: 0,0170 y 0,0180 eq), y el equivalente molar de DMT-MM se cambió a 0,0680 y 0,0720 eq, para producir de ese modo productos de SC reticulado (SC-NC5(S)N reticulado, compuestos 61 y 62) como polvos blancos (aproximadamente 1,77 g cada uno).

Ejemplo A7

Producción de SC-glicol(C5) reticulado

Se repitió el procedimiento del ejemplo 1(A), excepto que la cantidad de SC se cambió a 2 g, se usó diclorhidrato de 2,2'-oxidietanamina (glicol(C5)2HCl, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) como agente de reticulación (equivalente molar: 0,0290 y 0,0310 eq), y el equivalente molar de DMT-MM se cambió a 0,1160 y 0,1240 eq, para producir de ese modo productos de SC reticulado (SC-glicol(C5) reticulado, compuestos 63 y 64) como polvos blancos (aproximadamente 1,76 g cada uno).

Ejemplo A8

Producción de SC-glicol(C11) reticulado

Se repitió el procedimiento del ejemplo 1(A), excepto que la cantidad de SC se cambió a 2 g, se usó diclorhidrato de 1,11-diamino-3,6,9-trioxaundecano (glicol(C11)-2HCl, preparado mediante la adición de ácido clorhídrico 1 N (2,00 eq) a 1,11-diamino-3,6,9-trioxaundecano [Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.]) como agente de reticulación (equivalente molar: 0,0380 y 0,0410 eq), y el equivalente molar de ^dM^t-MM se cambió a 0,1520 y 0,1640 eq, para producir de ese modo productos de SC reticulado (SC-glicol(C11) reticulado, compuestos 65 y 66) como polvos blancos (aproximadamente 1,87 g cada uno).

Ejemplo comparativo 1

Producción de derivado de SC-NC12N (ejemplo comparativo)

Se produjo un polvo de un derivado de SC modificado con 1,12-diaminododecano a través del método descrito a continuación. Según la bibliografía que cita el método de producción, la modificación se lleva a cabo para reducir la hidrofilicidad del SC.

A través del método descrito en el ejemplo 5 “A. Modificación de condroitina” del documento WO 91/16881 y el documento Biomaterials, 16: 473-478, 1995, se produjeron derivados de SC (“derivados SC-NC12N (ejemplos comparativos),” compuestos 45 a 47) como polvos blancos (aproximadamente 0,46 g cada uno) mediante el uso de sulfato de condroitina A (SCA, Sigma-Aldrich) (1,00 g) (unidad disacárida: 2,18 mmol [calculado a partir del peso molecular promedio de la unidad disacárida (= 458)], 1,00 eq), diclorhidrato de 1,12-diaminododecano (Sigma-Aldrich) (equivalente molar: 0,30, 0,60 y 0,90 eq), y diciclohexilcarbodiimida (DCC) que sirve como agente de condensación (equivalente molar: 0,66, 1,32 y 1,98 eq).

Las tablas 1 a 4 ilustran los compuestos producidos en los ejemplos y ejemplos comparativos mencionados anteriormente.

[Tabla 1]

[Tabla 2]

1) Los compuestos 33 a 38 se produjeron en las siguientes condiciones: el equivalente del agente de reticulación (fijo); el equivalente de DMT-MM (fijo); y el tiempo de reacción de reticulación: 2 horas (compuesto 33), 3 horas (compuesto 34), 3 horas y 40 minutos (compuesto 35), 4 horas y 20 minutos (compuesto 36), 5 horas (compuesto 37), y 5 horas y 50 minutos (compuesto 38).[Tabla 3]

[Tabla 4]

Ejemplo 12A

Análisis (determinación de la estructura reticulada)

Se analizó el derivado de SC-NC12N producido a través del método descrito en el documento WO 91/16881 mediante diversos métodos analíticos. Sin embargo, no se determinó la reticulación del SC (C. Bourie, et al., J. Biomater. Appl., 12, (1998), 201-221). Para la determinación de la reticulación del SC reticulado de la presente invención, se digirió el SC reticulado con una enzima, y se analizó el producto digerido por medio de cromatografía de líquidos (HPLC)/espectrometría de masas de múltiples etapas.

Se usaron SC (SCC, sulfato de condroitina sódico (Japanese Pharmaceutical Codex), peso molecular promedio en peso: 40.000, Seikagaku Corporation) y el SC-NC2N reticulado (compuesto 9).

<Método>

(1) Digestión enzimática de SC y SC-NC2N reticulado

Se diluyó condroitinasa ABC (C-ABC) (Seikagaku Corporation) con tampón tris-HCl 50 mM (pH 7,5)-disolución de BSA al 0,1% (50 U/ml). Se añadió el C-ABC diluido (10 pl) a una disolución acuosa de SC al 1% p/v (20 pl) o una disolución acuosa de SC-NC2N reticulado al 1% p/v (20 pl). Se calentó la mezcla resultante a 37°C durante tres horas y luego se hirvió durante 30 segundos, para detener de ese modo la reacción.

(2) Análisis de HPLC de producto digerido con enzimas

Se diluyó la muestra líquida digerida con C-ABC para preparar una disolución (200 pl en total), comprendiendo el líquido agua y acetonitrilo (= 1:1 (v/v)). Se analizó la disolución resultante por medio de un aparato de CL-EM de HPLC (Prominence, fabricado por Shimadzu Corporation) conectado a un dispositivo de ESI-EM (CLEM-IT-TOF, fabricado por Shimadzu Corporation). Se usó como columna TSKgel Amide-80 HR (D.I. de 4,6 mm * 250 mm). Se usaron una disolución acuosa de formiato de amonio 20 mM (disolvente A) y acetonitrilo (disolvente B) como eluyentes para el análisis de la muestra líquida digerida con C-ABC (detección: 232 nm y EM). Se hizo funcionar un dispositivo de ESI-EM en las siguientes condiciones: tensión de interfase: -3,5 kV, temperatura de CDL: 200°C, temperatura de bloque térmico: 200°C, intervalo de barrido de peso molecular: m/z = de 300 a 1.500 para EM, m/z = de 50 a 2.000 para EMn.

(3) Espectrometría de masas de múltiples etapas de un pico recién observado

Se sometieron a espectrometría de masas los picos observados solo en el diagrama del SC-NC2N reticulado a través de análisis de CL-EM en las condiciones descritas a continuación. Se usó un dispositivo de CLEM-IT-TOF (fabricado por Shimadzu Corporation) conectado a una fuente de iones de nanoESI (NES-100, fabricado por New Objective) para ESI-EM. Se fraccionó una disolución que contenía el SC-NC2N reticulado en las condiciones de HPLC mencionadas anteriormente, y se retiró el disolvente de la disolución a presión reducida. Después de eso, se disolvió el residuo en una disolución de MeOH al 50% que contenía NH3 al 0,5%. Se inyectó directamente la disolución resultante por medio de una bomba de jeringa. Se hizo funcionar el dispositivo de ESI-EM en las siguientes condiciones: velocidad de flujo: 10 pl/h, tensión de interfase: -1,5 kV, temperatura de CDL: 200°C, temperatura de bloque térmico: 200°C, intervalo de barrido de peso molecular: m/z = de 1.300 a 1.500 para EM, m/z = de 50 a 2.000 para EMn.

Los diagramas de HPLC de los líquidos digeridos ilustran que el SC y el SC-NC2N reticulado se digirieron de manera similar con C-ABC (figura 1). Los picos A y B en la figura 1 son picos típicos que no se observan en el diagrama de HPLC del SC no reticulado. El análisis de CL-EM sugirió que estos picos pertenecen a una estructura que tiene un grupo en una diamina. La tabla 5 resume las estructuras que se supone que tienen un grupo en una diamina en función de la razón masa con respecto a carga.

Se sometió el B a espectrometría de masas de múltiples etapas para determinar una estructura reticulada con un grupo en una diamina. Las figuras 2 y 3 ilustran algunos de los resultados. Tal como se ilustra en las figuras 2 y 3, se detectaron picos que sugieren la formación del enlace covalente entre etano-1,2-diamina y dos moléculas de ácido glucurónico de SC.

[Tabla 5]

<Conclusión>

La cromatografía de líquidos/espectrometría de masas de múltiples etapas del SC-NC2N reticulado digerido con enzimas mostró la formación del enlace covalente entre la diamina y los grupos carboxilo de dos moléculas de ácido glucurónico. Los resultados demostraron que el SC reticulado de la presente invención tiene una estructura reticulada.

Ejemplo 12B

Determinación del porcentaje de reticulación

Se pesó una porción de la muestra preparada en el ejemplo 1 ó 2 (10 mg) y se disolvió en ácido sulfúrico 20 mM (1 ml) seguido por someterla a desgasificación. Se calentó la disolución resultante a 60°C durante seis horas y luego se basificó. Se añadieron etanol y óxido de propileno a la disolución basificada, y se calentó la disolución a 60°C durante la noche. Se enfrió la disolución y se acidificó seguido por someterla a evaporación hasta sequedad a presión reducida. Se añadió diaminobutano (patrón interno) al producto resultante, y se añadió ácido clorhídrico 6 M al mismo. Se calentó la disolución resultante a 110°C durante la noche seguido por someterla a evaporación hasta sequedad a presión reducida. Se añadió una mezcla de dimetilsulfóxido y agua (= 3:1) al producto resultante, y se agitó la mezcla durante 30 minutos. Se transfirió la mezcla resultante a otro recipiente, y se añadieron trietilamina y una mezcla de isotiocianato de fenilo y acetonitrilo (= 1:9) a la mezcla. Se agitó vigorosamente la mezcla y luego se calentó a 30°C durante 20 minutos. Se hizo pasar la mezcla a través de un filtro de 0,22 |im, y luego se sometió a análisis por medio de CL-ESI-EM (modo positivo). Se usó como columna Gemini-NX 3 |im C18 2 * 50 mm. Se usaron H2O (disolvente A), MeCN (disolvente B), y NH4HCO3 100 mM (pH 10,0 por NH4OH) (disolvente C) como eluyentes para el análisis. Los resultados se ilustran en la tabla 6.

[Tabla 6]

Ejemplo 13

Preparación de una composición que contiene SC reticulado

Se preparó solución salina tamponada con fosfato (puede denominarse “PBS” en el presente documento) que tenía la siguiente composición:

dihidrogenofosfato de sodio dihidratado al 0,065% (p/v)

hidrogenofosfato de disodio dodecahidratado al 0,03% (p/v)

cloruro de sodio al 0,9% (p/v).

Se mezclaron los productos de SC reticulado producidos en los ejemplos 1, 2, 4, 6 a 11, y A1 a A8 con la PBS mencionada anteriormente para lograr concentraciones tal como se muestran en las tablas 7, 8 y 9, seguido por agitación con un aparato de agitación durante la noche, para preparar de ese modo muestras (muestras 1 a 43, 55 a 71, y 75 a 77). Después de eso, se midieron algunas muestras para determinar la absorbancia a 600 nm por medio de un espectrofotómetro ultravioleta-visible (UV-1800, fabricado por Shimadzu Corporation). Los resultados se ilustran en las tablas 7, 8, y 9.

Ejemplo comparativo 2

Preparación de una composición que contiene SC

De la misma manera tal como se describe en el ejemplo 13, se mezclaron SC (SCC [Seikagaku Corporation] y SCA [Sigma-Aldrich]) con la PBS para lograr concentraciones tal como se muestran en la tabla 10, para preparar de ese modo muestras (muestras 47 a 54). Después de eso, se midió la muestra 53 para determinar la absorbancia a 600 nm por medio de un espectrofotómetro ultravioleta-visible (UV-1800, fabricado por Shimadzu Corporation). Los resultados se ilustran en la tabla 10.

Ejemplo comparativo 3

Preparación de una composición que contiene un derivado de SC-NC12N (ejemplo comparativo)

De la misma manera tal como se describe en el ejemplo 13, se mezcló el derivado de SC-NC12N (ejemplo comparativo) producido en el ejemplo comparativo 1 con la PBS para lograr concentraciones tal como se muestran en la tabla 8, para preparar de ese modo muestras (muestras 44 a 46 y 72 a 74). Después de eso, se midieron las muestras para determinar la absorbancia a 600 nm por medio de un espectrofotómetro ultravioleta-visible (UV-1800, fabricado por Shimadzu Corporation). Los resultados se ilustran en la tabla 8.

Ejemplo 14

Medición de las viscosidades de las muestras

Se midieron las viscosidades (mPas) de las muestras preparadas en el ejemplo 13 y el ejemplo comparativo 2 a 25°C y 5 rpm por medio de un viscosímetro rotatorio de tipo E (TV-L/H, Toki Sangyo Co., Ltd.) con un cono convencional (CORD-1, 1° 34' xR24). Si la viscosidad a 5 rpm estaba fuera del intervalo de detección, se determinó un valor extrapolado a otra velocidad de rotación, y se definió el valor como viscosidad (mPa s). Los resultados se ilustran en las tablas 7 a 10.

[Tabla 7]

-: Sin datos[Tabla 8]

-: Sin datos

[Tabla 9]

[Tabla 10]

-: Sin datos

<Conclusión>

Se halló que las muestras 7, 13, 16, 19, 22, 26, 31, 35 a 40, 42, 53, 55 a 71 y 75 a 77 estaban en forma de disolución transparente (es decir, estas muestras eran una disolución acuosa). Cuando una composición de mayor concentración está en forma de disolución transparente, una composición de menor concentración también está probablemente en forma de disolución transparente. Se confirmó que las muestras 1 a 43, 47 a 71 y 75 a 77 eran transparente a través de observación visual (el término “transparente” tal como se usa en el presente documento se refiere a una composición transparente). En cambio, se halló que las composiciones que contienen el derivado de SC-NC12N (Ejemplo comparativo) (compuestos 45 a 47) estaban en forma de disolución turbia (es decir, estas composiciones no eran una disolución acuosa).

Ejemplo 15

Prueba para determinar la tasa de paso de filtro

Se sometieron algunas de las muestras preparadas en el ejemplo 13 a la prueba para determinar la tasa de paso de filtro. Específicamente, se cargó una muestra en una jeringa de 1 ml (SS-01T, Terumo Corporation) equipada con un filtro poroso (tamaño de poro: 5,0 |im, diámetro: 25 mm, Millex (marca registrada)-SV 5,00 |im (Millipore Ireland)). Se extruyó la muestra con un émbolo a 25°C y una presión de 5,3 kgf/cm2 o menos, para hacerse pasar de ese modo la muestra a través del filtro. Se determine la concentración de SC de la muestra antes del paso de la muestra a través del filtro. Además, se determinó la concentración de SC de la muestra después del paso de la muestra (en una cantidad de 0,5 ml o más) a través del filtro. Se determinó la concentración de SC mediante el método de carbazolácido sulfúrico usando una disolución acuosa de D-glucuronolactona 20,0 |ig/ml como patrón. Se calculó la razón de la concentración de SC después del paso de la muestra a través del filtro con respecto a la de antes del paso de la muestra a través del filtro, para determinar de ese modo la tasa de paso de filtro de la muestra. Los resultados se ilustran en la tabla 11.

[Tabla 11]

<Conclusión>

Los resultados demostraron que las muestras preparadas en el ejemplo 13 presentan una tasa de paso de filtro del 80% o más.

Ejemplo 16

Examen para determinar el efecto del SC reticulado sobre la aceleración de la curación del trastorno epitelial corneal (1)

Se prepararon ratas SD (Charles River Laboratories Japan, Inc.) para obtener modelos de ojo seco según el método descrito en Fujihara, et al. (Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42 (1): 96-100 (2001)). Se instiló una sustancia de prueba en los ojos de cada modelo y se examinó para determinar el efecto de la aceleración de la curación del trastorno epitelial corneal.

Se mezcló SC (SCC, sulfato de condroitina sódico (Japanese Pharmaceutical Codex), peso molecular promedio en peso: 40.000, Seikagaku Corporation), compuesto 10, compuesto 18 o compuesto 42 con PBS para lograr una concentración de SC (o SC reticulado) del 2%, y se agitó la mezcla por medio de un aparato de agitación durante la noche, para preparar de ese modo una sustancia de prueba. La sustancia de prueba era SC al 2%, SC-NC2N reticulado al 2%, SC-NC4N reticulado al 2% o SC-OrnEt reticulado al 2%. Se usó PBS como control.

<Método>

(1) Preparación de modelo de ojo seco

Se extirpó la glándula lagrimal exorbital de ambos ojos de una rata SD bajo anestesia por inhalación con isoflurano, para preparar de ese modo un modelo de ojo seco.

(2) Instilación ocular de la sustancia de prueba

Aproximadamente ocho semanas después de la preparación del modelo, se tiñó una porción de trastorno epitelial corneal con fluoresceína. Se puntuó el grado de tinción de una porción superior, media o inferior de la córnea superficial según la siguiente clasificación, y se calcularon las puntuaciones totales de cada porción. Para un individuo que presentaba una puntuación promedio binocular de 5 o más, se instiló la sustancia de prueba en ambos ojos (5 |il por ojo) dos veces al día durante tres semanas. Se instiló PBS que sirvió como control de la misma manera tal como se describió anteriormente.

Puntuación 0: ningún punto teñido

Puntuación 1: escaso (los puntos de tinción con fluoresceína están distantes entre sí)

Puntuación 2: moderado (intermedio entre las puntuaciones 1 y 3)

Puntuación 3: denso (la mayoría de los puntos de tinción con fluoresceína están cerca entre sí)

(3) Evaluación del efecto de la curación del trastorno epitelial corneal

Una, dos y tres semanas después del inicio de la instilación ocular, se puntuó el efecto de la curación del trastorno epitelial corneal según el método descrito en el punto (2) anterior.

(4) Análisis estadístico

Una, dos y tres semanas después del inicio de la instilación ocular, se analizó la diferencia en la puntuación promediada entre la PBS y la sustancia de prueba mediante la prueba de la t con un nivel de significación de 5% (bilateral).

La tabla 12 y la figura 4 ilustran las transiciones y promedios de puntuaciones durante una, dos y tres semanas. El SC-NC2N reticulado al 2%, el SC-NC4N reticulado al 2% y el SC-OrnEt reticulado al 2% presentaron un efecto significativo de aceleración de la curación del trastorno epitelial corneal en comparación con la PBS. El SC-NC2N reticulado al 2% y el SC-NC4N reticulado al 2% presentaron un efecto significativo de aceleración de la curación del trastorno epitelial corneal en comparación con el SC al 2%.

[Tabla 12]

Promedio error estándar Ejemplo 17

Examen para determinar el efecto del SC reticulado sobre la aceleración de la curación del trastorno epitelial corneal (2)

Se examinó el efecto de la aceleración de la curación del trastorno epitelial corneal de la misma manera tal como se describe en el ejemplo 16.

Se mezcló el compuesto 49 o el compuesto 52 con PBS para lograr una concentración de SC reticulado del 2%, y se agitó la mezcla por medio de un aparato de agitación durante la noche, para preparar de ese modo una sustancia de prueba. La sustancia de prueba era SC-triAmina reticulado al 2% y SC-NC3(OH)N reticulado al 2%. Se usó PBS como control (ejemplo 17A).

Se mezcló el compuesto 55 o el compuesto 60 con PBS de la misma manera tal como se describió anteriormente, para preparar de ese modo una sustancia de prueba. La sustancia de prueba era SC-NC4(=)N reticulado al 2% y SC-ciclohex. reticulado al 2%. Se usó PBS como control (ejemplo 17B).

La tabla 13 y la figura 5 (ejemplo 17A) y la tabla 14 y la figura 6 (ejemplo 17B) ilustran las transiciones y promedios de puntuaciones durante una, dos y tres semanas. El SC-triAmina reticulado al 2%, el SC-NC3(OH)N reticulado al 2%, el SC-NC4(=)N reticulado al 2% y el SC-ciclohex. reticulado al 2% presentaron un efecto significativo de aceleración de la curación del trastorno epitelial corneal en comparación con la PBS.

[Tabla 13]

Promedio error estándar [Tabla 14]

Promedio error estándar Ejemplo 18

Examen para determinar el efecto del SC reticulado sobre la aceleración de la curación del trastorno epitelial corneal (3)

Se mezcló el compuesto 26, compuesto 62, compuesto 64, compuesto 66 o compuesto 67 con PBS para lograr una concentración de SC del 2%, y se agitó la mezcla por medio de un aparato de agitación durante la noche, para preparar de ese modo una sustancia de prueba. La sustancia de prueba era SC-NC6N reticulado al 2%, SC-NC5(S)N reticulado al 2%, SC-glicol(C5) reticulado al 2%, SC-glicol(C11) reticulado al 2% y SC-espermidina reticulado al 2%. Se usó PBS como control (ejemplos 18A a 18D).

La tabla 15 y la figura 7 (ejemplo 18A), la tabla 16 y la figura 8 (ejemplo 18B), la tabla 17 y la figura 9 (ejemplo 18C), y la tabla 18 y la figura 10 (ejemplo 18D) ilustran las transiciones y promedios de puntuaciones durante una, dos y tres semanas. El SC-NC6N reticulado al 2%, SC-NC5(S)N reticulado al 2%, SC-glicol(C5) reticulado al 2%, SC-glicol(C11) reticulado al 2% y SC-espermidina reticulado al 2% presentaron un efecto significativo de aceleración de la curación del trastorno epitelial corneal en comparación con la PBS. Los promedios de puntuaciones para una, dos y tres semanas del SC-glicol(C11) reticulado al 2% eran menores que los del SC-glicol(C5) reticulado al 2%. Los resultados demostraron que un mayor número de átomos de oxígeno en la cadena principal conduce a un efecto más fuerte de aceleración de la curación del trastorno epitelial corneal.

[Tabla 15]

Promedio error estándar [Tabla 16]

Promedio error estándar Tabla 17]

Promedio error estándar[Tabla 18]

Promedio error estándar <Conclusión>

Tal como se ilustró anteriormente, el SC reticulado producido mediante el método de la presente invención puede usarse como agente para el tratamiento de una enfermedad ocular, en particular, un agente para la terapia de un trastorno epitelial corneal y/u ojo seco.

Aplicabilidad industrial

El método de la presente invención puede usarse industrialmente como método para producir SC reticulado.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para producir sulfato de condroitina reticulado, comprendiendo el método:

reticular un sulfato de condroitina a través de la formación de un enlace covalente mediante la amidación de un grupo carboxilo del sulfato de condroitina y un grupo amino de una amina polivalente, que es una diamina que tiene dos grupos amino primarios o una triamina que tiene tres grupos amino primarios, en el que un equivalente molar de la amina polivalente es de desde 0,005 hasta 0,100 en relación con 1,00 equivalente molar de la unidad disacárida del sulfato de condroitina.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la amidación se realiza mediante un método usando un agente de condensación en un disolvente, un método de anhídrido de ácido simétrico, un método de anhídrido de ácido mixto o un método de éster activo.

3. Método según la reivindicación 2, en el que el agente de condensación se selecciona del grupo que consiste en una carbodiimida soluble en agua, diciclohexilcarbodiimida y cloruro de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinio N-hidratado.

4. Método según la reivindicación 2 ó 3, en el que un equivalente molar del agente de condensación es de [(de 0,50 a 5,00) x valencia de la amina polivalente] a 1,00 equivalente molar de la amina polivalente.

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el sulfato de condroitina reticulado y el sulfato de condroitina están en forma distinta de sal o forma de sal farmacéuticamente aceptable.