ES2935565T3 - Uso de ginsenósido M1 para prevenir o tratar la gota - Google Patents

Abstract

La presente invención describe un nuevo uso del ginsenósido M1 para tratar o prevenir la gota. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de ginsenósido M1 para prevenir o tratar la gota

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo uso del ginsenósido M1 para tratar o prevenir la gota.

Antecedentes de la invención

La gota es un tipo de artritis causada por una acumulación de cristales de ácido úrico en las articulaciones. Los síntomas incluyen dolor, hinchazón y enrojecimiento brillante sobre las articulaciones afectadas.

Se sabe que los ginsenósidos, los principales ingredientes activos del ginseng, tienen una variedad de actividades farmacológicas, por ejemplo, actividades antitumorales, antifatigas, antialérgicas y antioxidantes. Los ginsenósidos comparten una estructura básica, compuesta por un núcleo de esteroides gonanos que tiene 17 átomos de carbono dispuestos en cuatro anillos. Los ginsenósidos están metalizados en el cuerpo, y varios estudios recientes sugieren que los metabolitos de ginsenósidos, en lugar de los ginsenósidos naturales, se absorben fácilmente en el cuerpo y actúan como componentes activos. Entre ellos, el ginsenósido M1 es conocido como un metabolito de los ginsenósidos de tipo protopanaxadiol a través de la ruta del gipenósido por las bacterias intestinales humanas. Hasta ahora, ninguna referencia del estado de la técnica informa el efecto del ginsenósido M1 en el tratamiento de la gota.

Shao XIAOTONG ET AL describe el producto metabólico de la saponina protopanaxadiol y sus actividades farmacológicas (NATURAL PRODUCT COMMUNICATIONS, NATURAL PRODUCT INC., US, vol. 10, no.2, 1 de febrero de 2015, página 243). En este estudio, se discute la preparación de CK y su efecto protector sobre los riñones de ratas diabéticas.

US 2006/024385 divulga composiciones que aumentan la capacidad de energía metabólica y métodos para reducir el estrés oxidativo y mejorar la vitalidad en un mamífero. Una composición para aumentar la capacidad de energía metabólica puede estar en una formulación líquida apetecible o en una forma de dosificación sólida y típicamente incluye un antioxidante que contiene fitonéctar y un catalizador energético. Un antioxidante puede incluir un polifenol, antocianina, bioflavonoide, proantocianidina y una xantona. Un catalizador energético puede incluir un mineral, vitamina, covitamina, carbohidratos y un lípido. En una realización actualmente preferida, una composición incluye extractos de fitonéctar de uva, aloe vera, manzana, morinda citrifolia, escutelaria, arándano azul, ciruela pasa, arándano rojo, saúco, mirtilo y genciana y una mezcla mineral que contiene calcio, magnesio, manganeso, zinc, cromo, selenio, hierro, cobre, molibdeno, vanadio, potasio, yodo y cobalto. Un método para aumentar la capacidad de energía metabólica en un mamífero puede incluir el consumo de un componente químico que tiene la capacidad de sufrir oxidación, produciendo radicales libres y la administración de una composición que contiene un antioxidante que contiene fitonéctar y un catalizador energético.

KR 2015 0019337 se refiere a una composición farmacéutica para la antiinflamación, que contiene materiales enriquecidos con ginsenósidos que incluyen ginsenósido Rh4 como ingrediente activo. Un método para fabricar materiales enriquecidos con ginsenósidos que incluyen el ginsenósido Rh4, incluye un paso para tratar un extracto de ginseng o ginseng rojo con ácido, adsorber el ginseng tratado o el extracto de ginseng rojo en una columna y extraer. El método puede fabricar una fracción enriquecida con un componente específico y cumplir con el aspecto comercial debido a un método de fabricación simple y costos relativamente bajos en comparación con el método de fabricación de extracto de ginseng conocido o el método para fabricar únicamente un ginsenósido específico incluido en el ginseng. Además, el material enriquecido con ginsenósido según la presente invención muestra excelentes actividades antioxidantes y antiinflamatorias, y, por lo tanto, el material enriquecido con ginsenósido según la presente invención puede ser ampliamente utilizado en industrias relevantes.

WO 2011/077800 divulga un agente de control del nivel de grasa neutra, un agente de control del nivel de colesterol, un agente de control del nivel de ácidos grasos libres y un agente antiobesidad, cada uno caracterizado por comprender al menos uno de protopanaxatriol, panaxatriol, protopanaxadiol y panaxadiol, que son aglicones de saponinas de tipo dammarano; y un agente de mejora de la hiperlipemia caracterizado por comprender al menos uno de los agentes de control del nivel de grasa neutra, el agente de control del nivel de colesterol, el agente de control del nivel de ácidos grasos libres y el agente antiobesidad.

Breve resumen de la invención

En la presente invención, se encuentra inesperadamente que el ginsenósido M1 es eficaz para aliviar o retrasar la aparición o progresión de la gota. Por lo tanto, la presente invención proporciona un nuevo enfoque para el tratamiento o la prevención de la gota en un sujeto.

En particular, la presente invención proporciona ginsenósido M1 para su uso en el tratamiento y/o prevención de la gota, en donde el ginsenósido M1 es eficaz en la inhibición de la activación del inflamasoma NLRP3 inducida por cristales de urato monosódico (MSU) o pirofosfato de calcio deshidratado (CPPD).

Específicamente, el uso de ginsenósido M1 de la presente invención es eficaz en la inhibición de la producción de interleucina (IL) 1p a través del inflamasoma NLRP3 inducida por MSU o CPPD.

En algunas realizaciones, el ginsenósido M1 se administra por vía parenteral o enteral.

La presente invención también describe el uso de ginsenósido M1 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la gota en un sujeto que lo necesite.

Los detalles de una o más realizaciones de la invención se establecen en la descripción a continuación. Otras características o ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de varias realizaciones, y también de las reivindicaciones anexas.

Breve descripción de los dibujos

Con el propósito de ilustrar la invención, se muestran en los dibujos realizaciones. Debe entenderse, sin embargo, que la invención no se limita a las realizaciones preferidas mostradas. En los dibujos:

La Fig. 1 muestra que los macrófagos J774A.1 de ratón se incubaron durante 30 min con o sin Ginsenósido M1, luego durante 3o min con o sin 1 pg/ml de LPS en presencia o ausencia continua de Ginsenósido M1, y luego durante 24 h con o sin 100 pg/ml de MSU. Los niveles de IL-1p en el medio de cultivo se midieron mediante ELISA. *** indica una diferencia significativa a nivel de p < 0,001 en comparación con MSU sola.

La Fig. 2 muestra que los macrófagos J774A.1 de ratón se incubaron durante 30 min con o sin Ginsenósido M1, luego durante 30 min con o sin 1 pg/ml de LPS en presencia o ausencia continua de Ginsenósido M1, y luego durante 24 h con o sin 100 pg/ml de CPPD. Los niveles de IL-1 p en el medio de cultivo se midieron mediante ELISA. *** indica una diferencia significativa a nivel de p < 0,001 en comparación con la CPPD sola.

La Fig. 3 muestra que los macrófagos J774A.1 de ratón se incubaron durante 30 min con o sin Ginsenósido M1, luego durante 6 h con o sin 1 pg/ml de LPS en presencia o ausencia continua de Ginsenósido M1. Los niveles de NLRP3 y proIL-1 p en los lisados celulares se midieron mediante Western blot.

La Fig. 4 muestra que los macrófagos humanos de THP-1 se incubaron durante 6 h con o sin 1 pg/ml de LPS, luego durante 30 min con o sin Ginsenósido M1, en presencia o ausencia continua de LPS, y luego durante 24 h con o sin 100 pg/ml de MSU. Los niveles de IL-1 p en el medio de cultivo se midieron mediante ELISA. * y *** indica una diferencia significativa a nivel de p < 0,05 y p < 0,001, respectivamente, en comparación con MSU sola.

La Fig. 5 muestra que los macrófagos humanos de THP-1 se incubaron durante 6 h con o sin 1 pg/ml de LPS, luego durante 30 min con o sin Ginsenósido M1, en presencia o ausencia continua de LPS, y luego durante 24 h con o sin 100 pg/ml de MSU. Los niveles de TNF-a en el medio de cultivo se midieron mediante ELISA. * y *** indica una diferencia significativa a nivel de p < 0,05 y p < 0,001, respectivamente, en comparación con MSU sola.

La Fig. 6 muestra que los macrófagos humanos de THP-1 se incubaron durante 6 h con o sin 1 pg/ml de LPS, luego durante 30 min con o sin Ginsenósido M1, en presencia o ausencia continua de LPS, y luego durante 24 h con o sin 100 pg/ml de MSU. Los niveles de IL-6 en el medio de cultivo se midieron mediante ELISA. *** indica una diferencia significativa a nivel de p < 0,001 en comparación con MSU solo.

La Fig. 7 muestra que los niveles de IL-1 p en los fluidos peritoneales aislados de ratones control, ratones inyectados con MSU y ratones a los que se les ha administrado Ginsenósido M1 por vía oral más a los que se les ha inyectado MSU se midieron mediante ELISA. *** indica una diferencia significativa a nivel de p < 0,001 en comparación con el grupo de inyección de MSU.

La Fig. 8 muestra que los niveles de IL-6 en los fluidos peritoneales aislados de ratones control, ratones inyectados con MSU y ratones a los que se les ha administrado Ginsenósido M1 por vía oral más a los que se les ha inyectado MSU se midieron mediante ELISA. *** indica una diferencia significativa a nivel de p < 0,001 en comparación con el grupo de inyección de MSU.

La Fig. 9 muestra que los niveles de neutrófilos en los fluidos peritoneales aislados de ratones control, ratones inyectados con ^m S^u y ratones a los que se les ha administrado Ginsenósido M1 por vía oral más a los que se les ha inyectado MSU se midieron mediante citometría de flujo. *** indica una diferencia significativa a nivel de p < 0,001 en comparación con el grupo de inyección de MSU.

Descripción detallada de la invención

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el significado comúnmente entendido por una persona experta en la técnica a la que pertenece esta invención. Tal como se usan en este documento, los siguientes términos tienen los significados que se les atribuyen a menos que se especifique lo contrario.

Los artículos "un" y "uno/una" se utilizan aquí para referirse a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

La IL-1p es una de las citocinas importantes sintetizadas rápidamente en una forma inmadura inactiva (precursora de IL-1p, proIL-1 p) a través de la activación transcripcional en macrófagos activados por lipopolisacáridos (LPS) (Hsu y Wen, 2002). A diferencia de la de otras citocinas, la secreción de IL-1 p madura requiere el procesamiento de su forma precursora proIL-1 p por caspasa-1, una cisteína proteasa (Miller et al., 1997). La liberación de IL-1 p está controlada por complejos multiproteicos que contienen caspasa-1 llamados inflamasoma NLRP3, que controla la actividad de la caspasa-1 y la liberación de IL-1 p (Cassel et al., 2011; Jin y Flavell, 2010). La activación completa del inflamasoma NLRP3 requiere tanto una señal de cebado de TLR4 estimulado por LPS como una señal de activación de un segundo estímulo, por ejemplo, cristales de urato monosódico (MSU), el primero controla la expresión de NLRP3 y proIL-1 p y el segundo controla la activación de caspasa-1 (Martinon et al., 2009; Schroder y Tschopp, 2010; Davis et al., 2011; Cassel y otros, 2011; Jin y Flavell, 2010). La gota y la pseudogota son artritis inflamatorias caracterizadas por ataques abruptos autolimitados de inflamación causados por la precipitación de cristales de MSU y pirofosfato de calcio deshidratado (CPPD) respectivamente en la articulación. Un fuerte vínculo entre el inflamasoma NLRP3 y el desarrollo de la enfermedad inflamatoria es cada vez más evidente. Estudios recientes indican que la interleucina-1p (IL-1 p) es una citoquina proinflamatoria reguladora clave en la patogénesis de la gota (Martin et al., 2009; Torres y otros, 2009; Terkeltaub y otros, 2009; McGonagle y otros, 2007; So et al., 2007). Se ha demostrado que MSU activa la secreción de macrófagos de IL-1 p dependiente de inflamasoma NLRP3 (Martinon et al., 2006). Clínicamente, la gota se asocia con edema y eritema de las articulaciones, con el consiguiente dolor severo, condiciones que se asocian con una fuerte infiltración de neutrófilos en los espacios intraarticular y periarticular. Se encuentra una afluencia de neutrófilos alterada en un modelo in vivo de peritonitis inducida por cristales en ratones con deficiencia de inflamasoma NLRP3 o ratones deficientes en el receptor de IL-p (Martinon et al., 2006). Se ha establecido un modelo de trabajo en el que MSU activa la secreción de IL-1 p dependiente de inflamasoma NLRP3 de los macrófagos para estudiar la patogénesis de la gota (Martinon et al., 2006). La inhibición de la activación inflamatoria NLRP3 inducida por ^m S^u y la producción de IL-1p previene y mitiga la gota.

En la presente invención, se encuentra inesperadamente que el ginsenósido M1 tiene efectos antigota, al menos incluyendo que el ginsenósido M1 puede reducir la producción de IL-1 p inducida por MSU (Fig. 1) y la producción de IL-1 p inducida por CPPD (Fig. 2) y también la expresión de NLRP3 y proIL-1 p inducida por LPS (Fig. 3) en macrófagos. Estos resultados indican que LCHK168 puede prevenir y mitigar la gota.

Por lo tanto, la presente invención proporciona ginsenósido M1 para su uso en el tratamiento y/o prevención de la gota, en donde el ginsenósido M1 es eficaz en la inhibición de la activación del inflamasoma NLRP3 inducida por cristales de urato monosódico (MSU) o pirofosfato de calcio deshidratado (CPPD).

El ginsenósido M1, 20-O-p-D-glucopiranosil-20(S)-protopanaxadiol, es uno de los metabolitos de saponina conocidos en la técnica. La estructura química del ginsenósido M1 es la siguiente:

El ginsenósido M1 es conocido como un metabolito de los ginsenósidos de tipo protopanaxadiol a través de la ruta del gipenósido por las bacterias intestinales humanas. El ginsenósido M1 se puede encontrar en la sangre o la orina después de la ingesta. El ginsenósido M1 puede prepararse a partir de plantas de ginseng a través de la fermentación de hongos por métodos conocidos en la técnica, como la Solicitud de Patente de Taiwán No.

094116005 (1280982) y la Patente de los Estados Unidos No. 7,932 057. En ciertas realizaciones, las plantas de ginseng para preparar el ginsenósido M1 incluyen la familia Araliaceae, el género Panax, por ejemplo, P. ginseng y P. pseudoginseng (también llamado San Qi). En general, el método de preparación del ginsenósido M1 incluye los pasos de: (a) proporcionar polvo de materiales vegetales de ginseng (por ejemplo, hojas o tallos); (b) proporcionar un hongo para fermentar los materiales vegetales de ginseng, en el que la temperatura de fermentación oscila entre 20-50° C., la humedad de fermentación oscila entre 70-100%, el valor de pH oscila entre 4.0-6.0, y el período de fermentación oscila entre 5-15 días; (c) extraer y recoger los productos de fermentación; y (d) aislar 20-O-p-D-glucopiranosil-20(S)-protopanaxadiol de los productos de fermentación.

Cuando el ginsenósido M1 se describe como "aislado" o "purificado" en la presente invención, debe entenderse no como absolutamente aislado o purificado, sino como relativamente aislado o purificado. Por ejemplo, el ginsenósido purificado M1 se refiere a uno que está más purificado en comparación con su forma naturalmente existente. En una realización, una preparación que comprende ginsenósido M1 purificado puede comprender ginsenósido M1 en una cantidad de más del 50%, más del 60%, más del 70%, más del 80%, más del 90% o 100% (p/p) de la preparación total. Debe entenderse que cuando se utiliza un cierto número en este documento para mostrar una proporción o dosis, dicho número generalmente incluye que dentro del rango se incluye un alcance de 10% más y menos, o más específicamente, 5% más y menos que el número.

El término "individuo" o " sujeto" utilizado en este documento incluye animales humanos y no humanos, como animales de compañía (como perros, gatos y similares), animales de granja (como vacas, ovejas, cerdos, caballos y similares) o animales de laboratorio (como ratas, ratones, conejillos de indias y similares).

El término "tratar" tal como se usa en este documento se refiere a la aplicación o administración de una composición que incluye uno o más agentes activos a un sujeto afectado por un trastorno, un síntoma o condiciones del trastorno, una progresión del trastorno o en riesgo de desarrollar el trastorno, con el propósito de curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, mejorar, restablecer o afectar el trastorno, los síntomas o condiciones del trastorno, las discapacidades inducidas por el trastorno, o el inicio o progresión del trastorno.

El término "cantidad terapéuticamente efectiva" utilizado en este documento se refiere a la cantidad de un ingrediente activo para conferir un efecto terapéutico en un sujeto tratado. Por ejemplo, una cantidad efectiva para tratar la gota es una cantidad que puede inhibir la activación inducida por MSU o CPPD del inflamasoma NLRP3, más particularmente, una cantidad que puede inhibir la producción de interleucina 1 p inducida por MSU o CPPD a través del inflamasoma NLRP3.

La cantidad terapéuticamente efectiva puede cambiar dependiendo de varias razones, como la vía de administración y la frecuencia, el peso corporal y la especie del individuo que recibe dicho fármaco, y el propósito de la administración. Las personas expertas en la técnica pueden determinar la dosis en cada caso en base a la divulgación en este documento, los métodos establecidos y su propia experiencia. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la dosis oral de ginsenósido M1 utilizada en la presente invención es de 10 a 1.000 mg/kg diarios. En algunos ejemplos, la dosis oral de ginsenósido M1 utilizada en la presente invención es de 100 a 300 mg/kg diarios, 50 a 150 mg/kg diarios, 25 a 100 mg/kg diarios, 10 a 50 mg/kg diarios, o 5 a 30 mg/kg diarios. Además, en algunas realizaciones de la invención, el ginsenósido M1 se administra periódicamente durante un cierto período de tiempo, por ejemplo, la administración diaria durante al menos 15 días, un mes o dos meses o más.

De acuerdo con la presente invención, el ginsenósido M1 puede ser utilizado como un ingrediente activo para el tratamiento de la gota. En una realización, una cantidad terapéuticamente efectiva del ingrediente activo puede formularse con un portador farmacéuticamente aceptable en una composición farmacéutica de una forma apropiada para el propósito de administración y absorción. Dependiendo del modo de administración, la composición farmacéutica de la presente invención comprende preferentemente aproximadamente 0.1% en peso a aproximadamente 100% en peso del ingrediente activo, caracterizado porque el porcentaje en peso se calcula en base al peso de toda la composición.

Tal como se usa aquí, "farmacéuticamente aceptable" significa que el portador es compatible con el ingrediente activo en la composición, y preferiblemente puede estabilizar dicho ingrediente activo y es seguro para el individuo que recibe el tratamiento. Dicho portador puede ser un diluyente, vehículo, excipiente o matriz del ingrediente activo. Algunos ejemplos de excipientes apropiados incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbosa, manosa, almidón, goma arábiga, fosfato de calcio, alginatos, goma tragacanto, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinil pirrolidona, celulosa, agua esterilizada, jarabe y metilcelulosa. La composición puede incluir adicionalmente lubricantes, como talco, estearato de magnesio y aceite mineral; agentes humectantes; agentes emulsionantes y de suspensión; conservantes, como hidroxibenzoatos de metilo y propilo; edulcorantes; y agentes saborizantes. La composición de la presente invención puede proporcionar el efecto de liberación rápida, continua o retardada del ingrediente activo después de la administración al paciente.

De acuerdo con la presente invención, la forma de dicha composición puede ser tabletas, píldoras, polvo, pastillas, paquetes, troches, elixires, suspensiones, lociones, soluciones, jarabes, cápsulas de gelatina blanda y dura, supositorios, líquido de inyección esterilizado, y polvo envasado.

La composición de la presente invención puede administrarse por cualquier vía fisiológicamente aceptable, como métodos orales, parenterales (como intramuscular, intravenoso, subcutáneo e intraperitoneal), transdérmicos, supositorios e intranasales. En cuanto a la administración parenteral, se utiliza preferentemente en forma de una solución acuosa estéril, que puede comprender otras sustancias, como sales o glucosa suficiente para hacer que la solución sea isotónica a la sangre. La solución acuosa puede tamponarse adecuadamente (preferiblemente con un valor de pH de 3 a 9) según sea necesario. La preparación de una composición parenteral apropiada en condiciones estériles puede lograrse con técnicas farmacológicas estándar bien conocidas por personas expertas en la materia, y no se requiere trabajo creativo adicional.

De acuerdo con la presente invención, el ginsenósido M1 o las composiciones que comprenden ginsenósido M1 como ingrediente activo pueden ser utilizados en el tratamiento de individuos con gota o en riesgo de gota. Específicamente, el ginsenósido M1 o las composiciones que comprenden ginsenósido M1 como ingrediente activo pueden administrarse a individuos con gota o individuos en riesgo de adquirir gota, inhibiendo la activación del inflamasoma NLRP3 inducida por MSU o CPPD, para prevenir la aparición de la enfermedad o mejorar los síntomas o retrasar el deterioro de los síntomas.

La presente invención se ilustra aún más con los siguientes ejemplos, que se proporcionan con el propósito de demostración más que de limitación.

Ejemplos

1. Materiales y métodos

El Ginsenósido M1, 20-O-p-D-glucopiranosil-20(S)-protopanaxadiol (llamado LCHK168 a continuación), fue preparado por métodos conocidos en la técnica, como los descritos en la Solicitud de Patente de Taiwán No.

094116005 (1280982) y la Patente de los Estados Unidos No. 7,932,057.

Las MSU se prepararon por cristalización de una solución sobresaturada de ácido úrico en condiciones ligeramente básicas. Brevemente, 250 mg de ácido úrico (Sigma; No. cat. U2875) se añadió a 45 ml de agua doblemente destilada que contenía 300 pl de NaOH 5M, y la solución se hirvió hasta que se disolvió el ácido úrico. La solución se pasó a través de un filtro de 0,2 pM y se agregó 1 ml de NaCl 5M a la solución caliente, que luego se almacenó a 26°C. Después de 7 días, los cristales de MSU resultantes se lavaron con etanol y acetona. Los cristales de MSU triclínicos resultantes en forma de aguja tenían una longitud de 5-25 pm y eran birrefringentes a la luz polarizada. Se determinó que todos los cristales de MSU estaban libres de endotoxinas (<0,01 UE/10 mg) mediante el ensayo de lisado de células de amebocitos de Limulus.

La línea celular de macrófagos de ratón J774A.1 y la línea celular de leucemia monocítica humana THP-1 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Rockville, MD) y se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor al 10% y 2 mM de L-glutamina (todos de Life Technologies, Carlsbad, CA) a 37°C en una incubadora de CO² al 5%. Para inducir la diferenciación de monocitos a macrófagos, se cultivaron células THP-1 durante 48 h en medio RPMI-1640 suplementado con 100 nM de forbol 12-miristato 13-acetato (Sigma-Aldrich).

En las Fig. 1 y 2, macrófagos J774A.1 (1 * 105 células/500|jl medio/pocillo) se incubaron durante 30 min con o sin Ginsenósido M1, luego durante 30 min con o sin 1 jg/m l LPS (de Escherichia coli O111:B4, comprado a Sigma, St. Louis, MO) en presencia o ausencia continua de Ginsenósido M1, y luego durante 24 h con o sin 100 jg/m l MSU o 100 jg/m l CPPD (todos comprados a InvivoGen, San Diego, CA). Los niveles de IL-1p en el medio de cultivo se midieron mediante ELISA.

En la Fig. 3, macrófagos J774A.1 (2 * 106 células/2 ml medio/plato) se incubaron durante 30 min con o sin ginsenósido M1, luego durante 6 h con o sin 1 jg/m l LPS (de Escherichia coli O111:B4, comprado a Sigma, St. Louis, MO) en presencia o ausencia continua de ginsenósido M1. Los niveles de NLRP3 y proIL-1 p en los lisados celulares se midieron mediante Western blot. En resumen, después del tratamiento, las células se recogieron y lisaron a 4°C en tampón de lisis (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 2.5 mM EDTA, 2.5 mM EGTA, 20 mM NaF, 1 mM Na³VO⁴ , 20 mM sodio p-glicerofosfato, 10 mM pirofosfato de sodio, 0.5% Triton X-100) que contenía cóctel inhibidor de proteasa (Sigma, St. Louis, MO), luego todo el lisado celular fue separado por SDS-PAGE y electrotransferido a una membrana de PVDF. Las membranas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente en solución de bloqueo (leche descremada al 5% en solución salina tamponada con fosfato con 0,1% Tween 20), luego se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente con anticuerpos NLRP3 o proIL-1 p en solución de bloqueo. Después de tres lavados en PBS con Tween 20 al 0,1%, la membrana se incubó durante 1 h a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios conjugados con HRP en tampón de bloqueo y se revelaron utilizando un sistema mejorado de detección de Western blot quimioluminiscencia.

En las Fig. 4-6, los macrófagos THP-1 (1 * 105 células/500jl medio/pocillo) se incubaron durante 6 h con o sin 1 jg/m l de LPS, luego durante 30 min con o sin ginsenósido M1, en presencia o ausencia continua de LPS, y luego durante 24 h con o sin 100 jg/m l de MSU. Los niveles de IL-1 p en el medio de cultivo se midieron mediante ELISA.

En las Fig. 7-9, los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Nacional de Ilan. Los ratones macho C57BL/6 se compraron en el Centro Nacional de Animales de Laboratorio (Taipei, Taiwán). A los animales se les proporcionó una dieta chow y agua ad libitum en condiciones de 22-24 °C, 40-70% de humedad relativa y un ciclo de luz-oscuridad de 12 h. El ginsenósido M1 (60 mg/kg de peso corporal) se administró diariamente por vía oral por sonda en los días 0, 1 y 2. La inflamación aguda de la gota se indujo mediante inyección intraperitoneal en cada ratón con 3 mg de MSU en 0,5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en el día 0 y el día 2 1h después de la administración de ginsenósido M1. Los ratones control recibieron 0,5 ml de PBS sin MSU (n = 6). Después de 4 h, todos los ratones fueron sacrificados usando rotura de cuello, y los ratones fueron inyectados intraperitonealmente con 5 ml de PBS. Luego se recolectó el líquido peritoneal y el volumen de líquido peritoneal fue de aproximadamente 4 ml de cada ratón. Las células de exudado peritoneal recolectadas se lavaron y resuspendieron en PBS. Las células se tiñeron con anticuerpos fluorescentes contra los marcadores de superficie específicos de neutrófilos Ly-6G y CD45 (eBioscience, San Diego, CA, EUA) durante 20 min a 37 °C en la oscuridad, y las poblaciones celulares se clasificaron utilizando un citómetro de flujo FACScan (Becton-Dickinson, San José, CA). Los niveles de IL-1 p e IL-6 en el líquido peritoneal se midieron mediante ELISA.

Para el ensayo ELISA, se añadieron 50 j l de reactivo de anticuerpos biotinilados y 50 j l de medio de cultivo a una placa de pozo prerecubierto de IL-1 p o iL-6 antiratón, y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 h. Después de lavar la placa tres veces con tampón de lavado, se agregaron 100 j l de concentrado diluido de estreptavidina-HRP (peroxidasa de rábano picante) a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min. El proceso de lavado se repitió; luego se agregaron 100 j l de una solución de sustrato de tetrametilbencidina premezclada a cada pocillo y se reveló a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos. Tras la adición de 100 j l de solución de parada proporcionada a cada pocillo para detener la reacción, la absorbancia de la placa se midió mediante un lector de microplacas a una longitud de onda de 450 nm.

2. Resultados

2.1 El Ginsenósido M1 reduce la producción de IL-1 p inducida por MSU en macrófagos J774A.1.

Los macrófagos J774A.1 de ratón se incubaron durante 30 min con o sin Ginsenósido M1, luego durante 30 min con o sin 1 jg/m l de LPS en presencia o ausencia continua de Ginsenósido M1, y luego durante 24 h con o sin 100 jg/m l de MSU. Los niveles de IL-1p en el medio de cultivo se midieron mediante ELISA. Como se muestra en la Fig. 1, los resultados mostraron que el Ginsenósido M1 redujo la secreción de IL-1 p, lo que indica que el ginsenósido M1 reduce la inflamación asociada a la gota. *** indica una diferencia significativa en el nivel de p < 0,001 en comparación con MSU solo.

2.2 El Ginsenósido M1 reduce la producción de IL-1p inducida por CPPD en macrófagos J774A.1.

Los macrófagos J774A.1 de ratón se incubaron durante 30 min con o sin ginsenósido M1, luego durante 30 min con o sin 1 pg/ml de LPS en presencia o ausencia continua de Ginsenósido M1, y luego durante 24 h con o sin 100 pg/ml de CPPD. Los niveles de IL-1p en el medio de cultivo se midieron mediante ELISA. Como se muestra en la Fig. 2, los resultados mostraron que el ginsenósido M1 redujo la secreción de IL-1 p, lo que indica que el Ginsenósido M1 reduce la inflamación asociada a la gota. *** indica una diferencia significativa a nivel de p < 0,001 en comparación con la CPPD sola.

2.3 El Ginsenósido M1 reduce la expresión de NLRP3 y proIL-1p inducida por LPS.

Los macrófagos J774A.1 se incubaron durante 30 min con o sin Ginsenósido M1, luego durante 6 h con o sin 1 pg/ml de LPS en presencia o ausencia continuada de Ginsenósido M1. Los niveles de NLRP3 y proIL-1 p en los lisados celulares se midieron mediante Western blot. Como se muestra en la Fig. 3, los resultados mostraron que el Ginsenósido M1 redujo los niveles de NLRP3 y proIL-1 p en macrófagos J774A.1 activados por LPS.

En resumen, nuestro estudio muestra que el Ginsenósido M1 es eficaz para reducir la producción de IL-1 p inducida por MSU (Fig. 1) y la producción de IL-1 p inducida por CPPD (Fig. 2) y también la expresión de NLRP3 y proIL-1 p inducida por LPS (Fig. 3) en macrófagos. Estos hallazgos indican que el ginsenósido M1 es eficaz en la prevención y mitigación de la gota.

2.4 El Ginsenósido M1 reduce la producción de IL-1 inducida por MSUp, TNF-a e IL-6 en macrófagos THP-1. Para confirmar las actividades antiinflamatorias de Ginsenósido M1, se incubaron macrófagos humanos de THP-1 durante 6 h con o sin 1 pg/ml de LPS, luego durante 30 min con o sin Ginsenósido M1, en presencia o ausencia continua de LPS, y luego durante 24 h con o sin 100 pg/ml de MSU. Los niveles de IL-1 p en el medio de cultivo se midieron mediante ELISA. Como se muestra en las Fig. 4-6, los resultados mostraron que el Ginsenósido M1 redujo la producción de IL-1 p (Fig. 4), la producción de TNF-a (Fig. 5) y la producción de IL-6 (Fig. 6), lo que indica que el Ginsenósido M1 reduce la inflamación asociada a la gota en los macrófagos humanos. * y *** indica una diferencia significativa a nivel de p < 0,05 y p < 0,001, respectivamente, en comparación con MSU sola.

2.5 El Ginsenósido M1 reduce la peritonitis inducida por MSU in vivo.

La inyección intraperitoneal de MSU aumentó significativamente la producción de IL-1p (Fig. 7) e IL-6 (Fig. 8) en el líquido peritoneal murino en comparación con los ratones control. La administración oral de Ginsenósido M1 redujo significativamente la producción de IL-1 p inducida por MSU (Fig. 7) e IL-6 (Fig. 8) en el líquido peritoneal murino. MSU también estimuló significativamente la población de neutrófilos Ly-6G+, y Ginsenósido M1 reduce significativamente los niveles de neutrófilos Ly-6G+ inducidos por MSU (Fig. 9).

Referencias

Cassel SL, Joly S, Sutterwala FS. 2009. The NLRP3 inflammasome: a sensor of immune danger signals. Semin Immunol 21(4): 194-198.

Davis BK, Wen H, Ting JP. 2011. The inflammasome NLRs in immunity, inflammation, and associated diseases. Annu Rev Immunol 29: 707-735.

Hsu HY, Wen MH. 2002. Lipopolysaccharide-mediated reactive oxygen species and signal transduction in the regulation of interleukin-1 gene expression. J Biol Chem 277(25): 22131-22139.

Jin C, Flavell RA. 2010. Molecular mechanism of NLRP3 inflammasome activation. J Clin Immunol 30(5): 628-631.

Martinon F, Pétrilli V, Mayor A, Tardivel A, Tschopp J. 2006. Gout-associated uric acid crystals activate the NALP3 inflammasome. Nature: 440(7081): 237-241.

Martinon F, Mayor A, Tschopp J. 2009. The inflammasomes: guardians of the body. Annu Rev Immunol 27: 229-265.

Martin WJ, Walton M, Harper J. 2009. Resident macrophages initiating and driving inflammation in a monosodium urate monohydrate crystal-induced murine peritoneal model of acute gout. Arthritis Rheum 60(1): 281-289.

McGonagle D, Tan AL, Shankaranarayana S, Madden J, Emery P, McDermott MF. 2007. Management of treatment resistant inflammation of acute on chronic tophaceous gout with anakinra. Ann Rheum Dis 66(12): 1683-1684.

Miller DK, Myerson J, Becker JW. 1997. The interleukin-1 beta converting enzyme family of cysteine proteases. J Cell Biochem 64(1): 2-10.

Schroder K, Tschopp J. 2010. The inflammasomes. Cell 140(6): 821-832.

So A, De Smedt T, Revaz S, Tschopp J. 2007. A pilot study of IL-1 inhibition by anakinra in acute gout. Arthritis Res Ther 9(2): R28.

Terkeltaub R, Sundy JS, Schumacher HR, Murphy F, Bookbinder S, Biedermann S, Wu R, Mellis S, Radin A.

2009. The interleukin 1 inhibitor rilonacept in treatment of chronic gouty arthritis: results of a placebocontrolled, monosequence crossover, non-randomised, single-blind pilot study. Ann Rheum Dis 68(10): 1613­ 1617.

Torres R, Macdonald L, Croll SD, Reinhardt J, Dore A, Stevens S, Hylton DM, Rudge JS, Liu-Bryan R, Terkeltaub RA, Yancopoulos GD, Murphy AJ. 2009. Hyperalgesia, synovitis and multiple biomarkers of inflammation are suppressed by interleukin 1 inhibition in a novel animal model of gouty arthritis. Ann Rheum Dis 68(10): 1602-1608.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Ginsenósido M1 para uso en el tratamiento y/o prevención de la gota, en el que el ginsenósido M1 es eficaz en la inhibición de la activación del inflamasoma NLRP3 inducida por cristales de urato monosódico (MSU) o pirofosfato de calcio deshidratado (CPPD).

2. Ginsenósido M1 para uso según la reivindicación 1, en el que el ginsenósido se utiliza en una cantidad eficaz para tratar a un sujeto.

3. Ginsenósido M1 para uso según las reivindicaciones 1 a 2, en el que el ginsenósido M1 es eficaz en la inhibición de la producción de interleucina 1p inducida por MSU o CPPD a través del inflamasoma NLRP3.

4. Ginsenósido M1 para uso según las reivindicaciones 1 a 3, en el que el ginsenósido M1 se administra por vía parenteral o enteral.

5. Ginsenósido M1 para uso según las reivindicaciones 1 a 4, en el que el ginsenósido M1 se utiliza en una dosis de 10 a 1.000 mg/kg diarios, preferiblemente en una dosis de 100 a 300 mg/kg diarios, más preferiblemente en una dosis de 25-100 mg/kg diarios.

6. Una composición que comprende ginsenósido M1 y un portador farmacéutico aceptable para su uso en el tratamiento y/o prevención de la gota, en el que el ginsenósido M1 es eficaz en la inhibición de la activación del inflamasoma NLRP3 inducida por cristales de urato monosódico (MSU) o pirofosfato de calcio deshidratado (CPPD).

7. La composición de la reivindicación 6 para su uso según la reivindicación 6 en el que la composición puede ser administrada oral, parenteral, transdérmica, por supositorio e intranasal.