ES2928480T3 - Compuestos dirigidos a PSMA y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Se describen compuestos dirigidos al antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA). También se describen los usos de los compuestos para formación de imágenes, terapia, clasificación de células y mapeo de tumores. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Compuestos dirigidos a PSMA y usos de los mismos
Referencia cruzada a solicitud relacionada
Esta solicitud reivindica prioridad a las solicitudes provisionales US n.° 61/161, 484 presentada el 19 de marzo de 2009, 61/161, 485 presentada el 19 de marzo de 2009, 61/161, 61/248.067 presentada el 2 de octubre de 2009, y 61/248.934 presentada el 2 de octubre de 2009. Esta invención se ha realizado usando el apoyo del Gobierno de EE.UU con la financiación del NIH, NIH U24 CA92871.
Antecedentes
Campo de la invención
La presente invención se refiere compuestos que se unen al antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), precursores químicos de compuestos que se unen al PSMA y procedimientos de estudio por la imagen para el uso de los compuestos. Cualquier referencia en la descripción a procedimientos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal para terapia o para diagnóstico.
Antecedentes
El cáncer de próstata (CaP) es la enfermedad maligna más comúnmente diagnostica y la segunda causa de muerte por cáncer en hombres en los Estados Unidos (Cancer Facts & Figures; American Cancer Society: Atlanta, GA, 2009). En el año 2009, se calculó que 192.000 hombres serían diagnosticados de cáncer de próstata y 27.000 fallecerían a causa de la enfermedad. Sólo la mitad de los tumores debidos a un CaP son clínicamente localizados en el momento del diagnóstico y la mitad de estos representan una diseminación extracapsular. La localización de dicha diseminación, así como la determinación de la carga corporal total de CaP tiene unas implicaciones importantes para la terapia, particularmente a medida que se va disponiendo de nuevas combinaciones de terapias y focales.
El antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), cuando se expresa en el epitelio tumoral de la próstata, tiene una curiosa propiedad por la que se expresa en la neo-vascularización de varios tumores sólidos, pero no en el del cáncer de próstata (Chang y col., Cancer Res., vol. 59, pp. 3192-3198, 1999; Chang y col., Clin. Cancer Res., vol.
5, pp. 2674-2681, 1999; Gong y col., Cancer Metástasis Rev., vol. 18, pp. 483-490, 1999; Chang y col., Mol. Urol., vol.
3, pp. 313-320, 1999; Baccala y col., Urology, vol. 70, pp. 385-390, 2007; Chang y col., Urology, vol. 57, pp. 801-805, 2001 Milowsky y col., J. Clin. Oncol., vol. 25, pp. 540-547, 2007). A causa de esta propiedad, un anticuerpo monoclonal marcado con In111 frente a un epítopo extracelular del PSMA, In111- J591, es capaz de identificar los tumores renales, de vejiga, de pulmón, de mama colorrectal y de páncreas en ensayos clínicos por la imagen en Fase I (Milowsky y col., J. Clin. Oncol., vol. 25, pp. 540-547, 2007). Este ensayo validó el In111- J591, agente con diana vascular en sujetos humanos. Puesto que otros informes han estudiado más la expresión del PSMA en determinados tipos de tumores. Baccala y col, indicó que células limpias del carcinoma de células renales expresa significativamente más PSMA en su neovascularización que la variedad papilar (Baccala y col., Urology, vol. 70, pp. 385-390, 2007). Además, el angiomiolioma, una lesión renal benigna, no expresa PSMa . Como enzima con un sitio activo extracelular, PSMA representa una diana excelente para la terapia y estudio por la imagen dirigido hacia la neovascularización del tumor sólido además del cáncer de próstata. Los agentes basados en PSMA puede informar de la presencia de este marcador, que está siendo reconocido cada vez más como un determinante pronóstico importante en el CaP (Murphy y col., Urology, vol. 51, pp. 89-97, 1998). También es la diana para varias terapias nuevas contra CaP (Galsky y col., J Clin Oncol, vol. 26, pp. 2147-2154, 2008).
ProstaScint™ es un anticuerpo monoclonal marcado con In111 frente a PSMA que está clínicamente disponible para el diagnóstico por la imagen de CaP. La Radioterapia basado en ProstaScint™ y variaciones radiomarcadas de este anticuerpo está marcado con dificultades similares al uso de anticuerpos radiomarcados para el diagnóstico por la imagen, que incluyen unos tiempos de circulación prolongadas, poca unión a tejidos que no son diana de contraste, efectos biológicos impredecibles y la necesidad ocasional de estrategias de pre-dirección, que limitan la utilidad de estos agentes (Lange, P. H., Urology, vol. 57, pp. 402-406, 2001; Haseman y col., Cancer Biother Radiopharm, vol.
15, pp. 131-140, 2000; Rosenthal y col., Tech Urol, vol. 7, pp. 27-37, 2001). Además, los anticuerpos pueden tener menos acceso al tumor que los agentes de bajo peso molecular, los cuales se pueden manipular farmacológicamente.
El desarrollo de agentes radioterapéuticos de bajo peso molecular es muy diferente de radiofármacos para el diagnóstico por la imagen en los que unos tiempos de residencias en el tumor superiores pueden ser a menudo importante por lo anterior.
La detección y erradicación completa del tumor primario y los focos metastásicos son necesarias para obtener una cura en los pacientes con cáncer; sin embargo, a veces la evaluación preoperativa actual pierde los pequeños depósitos metastásicos. Las técnicas de diagnóstico por la imagen más sensibles que la tomografía computarizada, diagnóstico por la imagen por resonancia magnética e incluso la tomografía por emisión de positrones (p Et ), que se pueden usar fácilmente en el quirófano son necesarias. Una técnica antigua, recientemente revisitada debido a unas ópticas mejoradas y química colorante fluorescente, es el fotodiagnóstico intra-operatorio (PDD) (Toda, Keio J. Med., vol. 57, pp. 155-161, 2008). Los colorantes de fluoresceína se habían utilizado intra-operatoriamente para identificar los tumores cerebrales y comprobar la claridad de los márgenes del tumor desde 1948. (Toda, Keio J. Med., vol. 57, pp. 155-161, 2008). Un informe reciente describe su utilidad para la identificación de las metástasis cerebrales (Okuda y col., Minim. Invasive Neurosurg., vol. 50, pp. 382-384, 2007). Una historia larga del uso del ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) para la resección del tumor cerebral es también evidente, y su uso se había asociado con una mejora de la supervivencia libre de progresión (Stummer y col., Lancet Oncol., vol. 7, pp. 392-401, 2006). PDD se puede realizar fácilmente durante la cirugía debido a que no es necesario para un equipo de diagnóstico por la imagen complejo. Lo único que se necesita es un diodo que emite luz para excitar el fluoróforo, que se puede administrar por vía sistémica o “pintado” en el tejido directamente. Unas incarnaciones más recientes de la PDD han utilizado puntos cuánticos (Arndt-Jovin y col., IEEE Trans Nanobioscience, 2009), y colorantes más avanzados, como el verde indocianina (ICG) (Gotoh y col., J. Surg. Oncol., 2009), que emite en la región del infrarrojo cercano (INR) del espectro, lo que permite una penetración razonable en el tejido de la luz emitida (y detectada). Las aplicaciones han incluido enfoques no dirigidos, como la evaluación preoperativa de la integridad vascular de los bordes quirúrgicos o la identificación de nódulos de carcinoma hepatocelular (Matsui y col., Plast. Reconstr. Surg., vol. 123, pp. 125e-127e, 2009). Los enfoques dirigidos también están surgiendo, como el uso de un anticuerpo anti-CEA conjugado con fluoróforo para identificar el cáncer de colon o de páncreas (Kaushal y col., J. Gastrointest. Surg., vol. 12, pp. 1938-1950, 2008), o el uso de sondas activables en INR que emiten luz sólo cuando están unidas a una proteasa asociada a tumores (Sheth y col., Gynecol. Oncol., vol. 112, pp. 616-622, 2009).
Recientemente, la aplicación de los péptidos marcados son Ga68 ha atraído un interés considerable para el diagnóstico por la imagen del cáncer debido a las características físicas del Ga68 (Reubi y col., J Nucl Med, vol. 49, pp. 1735-1738, 2008). Ga68 está disponible de un generador in situ de Ge68 / generador Ga68(Ge68, t A = 270,8 día), lo que lo hace independiente de un ciclotrón onsite. Por lo tanto, los agentes de PET basados en Ga68 poseen un potencial significativamente potencial y sirve como alternativa conveniente a los isótopos basados en ciclotrón para la tomografía por emisión de positrones (PET), como F18 o I124. Ga68 presenta una fracción con alta emisión de positrón (89% de su decay total). La energía máxima de positrón de Ga68 (energía máx. = 1,92 MeV, media = 0,89 MeV) es superior a la de F18 (máx. = 0,63 MeV, media = 0,25 MeV). Sin embargo, un estudio de resolución espacial utilizando un análisis Monte Carlo reveló que bajo la asunción de una resolución espacial de 3 mm para la mayoría de los detectores PET, el ancho total a la mitad del máximo (FWHM) de F18 y Ga68 son indistinguibles en tejido blando (3,01 mm versus 3,09 mm) (Sanchez-Crespo y col., Eur J Nucl Med Mol Imaging, vol. 31, pp. 44-51, 2004). Este hallazgo implica que la resolución espacial estándar de 5 a 7 mm para los escáneres clínicos actuales, calidad de imagen usando radio­ indicadores a base de Ga68 será prácticamente indistinguible de la de los agentes a base de F18, lo que estimula el interés en el desarrollo de compuestos marcados con Ga68para el diagnóstico médico por la imagen (Sanchez-Crespo y col., Eur J Nucl Med Mol Imaging, vol. 31, pp. 44-51, 2004; Khan y col., Eur J Surg Oncol, vol. 35, pp. 561-567, 2009; Fani y col., Contrast Media Mol Imaging, vol. 3, pp. 67-77, 2008). Con una vida media física de 68 minutos. Ga68 encaja también correctamente con la farmacocinética de muchos péptidos usados en el diagnóstico por la imagen. Con anterioridad se habían descrito algunos radio-indicadores con un mecanismo basado en Ga68 marcado, pero ninguno para PSMA. Además, Ga68 se introduce en biomoléculas a través de quelantes macrocíclicos lo que permite la posible formulación de un kit y una gran disponibilidad de los agentes de diagnóstico por la imagen correspondientes. El documento WO 2009/026177 A1 describe conjugados de tres grupos, principalmente de un antígeno de membrana específico de próstata (PSMA) unido a un ligando, un conector y un fármaco.
El documento WO 2009/002529 A2 describe conjugados de tres grupos, principalmente de un quelante metal, un conector y un inhibidor de PSMA.
Chandran y col. (Characterization of a Targeted Nanoparticle Functionalized with a Urea-Based Inhibitor of Prostate Specific Membrane Antigen (PSMA), Cancer Biology & Therapy, Vol. 7, No. 6, 2008, 974-982) describe unas nanopartículas que muestran unas superficies decoradas con un inhibidor peptidomimético del PSMA de molécula pequeña a base de urea del PSMA.
Banerjee y col. (Synthesis and Evaluation of Technetium-99m- and Rhenium-Labeled Inhibitors of the Prostate-Specific Membrance Antigen (PSMA), J. Med. Chem., 51, 2008, 4504-4517) describe la presentación de compuestos radio-marcados de un agente quelante Tc/Re, un conector y un inhibidor PSMA.
Chen y col. (Radiohalogenated Prostate-Specific Membrane Antigen (PSMA)-Based Ureas as Imaging Agents for Prostate Cancer, J. Med. Chem., 51, 2008, 7933-7943) describe la preparación de una plantilla de Lys-C(O)-Glu para el desarrollo de agentes de diagnóstico por la imagen de tomografía computarizada de emisión de fotón sencillo y de tomografía de emisión de positrón del cáncer de próstata. Maresca y col. (A Series Targeting of Halogenated Prostate Heterodimeric Inhibitors of Prostate Specific Membrane Antigen (PSMA) as Radiolabeled Probes for Targeting Prostate Cancer, of J. Med. Chem., 52, 2009, 347-357) describe el diseño y la síntesis de unas series de inhibidores heterodiméricos de glutamato urea del PSMA.
Sumario de la invención
La presente invención satisface la necesidad permanente e insatisfecha de nuevos compuestos para la obtención de imágenes y terapéuticos dirigidos al cáncer de próstata y la angiogénesis del cáncer. La presente invención, en particular, proporciona compuestos terapéuticos y agentes para la obtención de imágenes que difieren de la técnica anterior en modificaciones que no se conocían ni se habían sugerido anteriormente. Además, la invención proporciona agentes para la obtención de imágenes que ofrecer un mejor contraste entre los tejidos elegidos como objetivo y los que no. La invención también proporciona compuestos con mayor retención celular y bajo peso molecular. La materia objeto de la invención se describe en las reivindicaciones. Las realizaciones que no entran dentro del alcance de las reivindicaciones se desvelan solamente con fines de información.
Las realizaciones desveladas no cubiertas por la invención reivindicada incluyen compuestos que tienen la estructura
Figure imgf000004_0001
en la que las subunidades asociadas con los elementos p, q, r y s pueden estar en cualquier orden. Z es tetrazol o CO2Q; cada Q se selecciona independientemente entre hidrógeno o un grupo protector, a es 1, 2, 3 o 4 y cada R es independientemente H o alquilo C1-C4.
La variable r es 0 o 1. Tz es un grupo triazol seleccionado entre el grupo que consiste en
Figure imgf000004_0002
en la que L1 es
Figure imgf000004_0003
L2 es
o
Figure imgf000004_0004
X1 es -NRC(O)-, -NRC(O)NR-, -NRC(S)NR-, o -NRC(O)O-; X2 es -C(O)NR-, -NRC(O)NR-, -NRC(S)NR-, o -OC(O)NR-; R5 es H, CO2H, o CO2R6, en el que R6 es alquilo C1-C6 , arilo C2-C12 o arilaquilo C4-C16; b es 1, 2, 3, o 4; y d es 1, 2, 3, o 4.
La variable q es 0 o 1. W es -NRC(O)-, -NRC(O)NR-, NRC(S)NR-, -NRC(O)O-, -OC(O)NR-, -OC(O)-,-C(O)NR-; o -C(O)O-; R2 y R3 son independientemente H, CO2H o CO2R4 , en el que R4 es alquilo C1-C6, arilo C2-C12 o arilaquilo C4-C16; en el que si uno de R2 y R3 es CO2H o CO2R2, entonces el otro es H; n es 1,2, 3, 4, 5 o 6.
La variable s es 0 o 1. Y es -C(O)-, -NRC(O)-, -NRC(S)-, -OC(O)-; y m es 1, 2, 3, 4, 5, o 6.
La variable p es 0, 1, 2, o 3, y cuando p es 2 o 3, cada R1 puede ser el mismo o diferente. R1 es H, alquilo C1-C6, arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16.
s un grupo seleccionado de entre el grupo que consiste en
Figure imgf000005_0001
1. en el que Ch es un grupo quelante de metal, que incluye opcionalmente un metal quelado; FG es un grupo colorante fluorescente que emite en el espectro visible o en el espectro infrarrojo cercano; uno de A y A' es Ch y el otro es FG; V y V' son independientemente -C(O)-, -NRC(O)-, -NRC(S)-, o -OC(O)-; y g es 1, 2, 3, 4, 5, o 6. Las condiciones siguientes se aplican también:
1) cuando G es ambos 1;
Figure imgf000005_0002
y r es 0, entonces q y s son ambos 0 o ambos 1;
3) Cuando G es
Figure imgf000005_0003
entonces p es 0 y R2 es H, la estructura incluye opcionalmente un ion metal quelado.
4) Cuando G es
Figure imgf000005_0004
y r es 0, entonces si p es 0, entonces uno de R2 y R3 es CO2R2 , y el otro es H; y
5) Cuando g es
Figure imgf000006_0001
entonces r es 0.
Formas de realización de la invención incluyen compuestos que presentan la estructura
Figure imgf000006_0002
en la que Z es un tetrazolio o CO2Q; cada Q es hidrógeno, a es 1, 2, 3, o 4, y R es cada uno independientemente H o alquilo C1-C4. Ch es un grupo quelante de metal tal como se define en la reivindicación 1, que opcionalmente incluye un metal quelado. W es -NRC(O)-, NRC(O)NR-, NRC(S)NR-, -NRC(O)O-, -OC(O)NR-, -OC(O)-, -C(O)NR-, o -C(O)O-. Y es -C(O)-, NRC(O)-, -NRC(S)-, -OC(O)-. V es - C(O)- o NRC(O)- o -NRC(S)-, o -OC(O)-. En la invención m es 1, 2, 3,4, 5, o 6; n es 1, 2, 3,4, 5, o 6; y p es 1, 2 o 3 y, cuando p es 2 o 3, cada R1 puede ser igual o diferente. R1 es H, alquilo C1-C6 , arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16. Uno de R2 y R3 es CO2H o CO2R4 y el otro es H; en el que R4 es alquilo C1-C6 , arilo C2-C12 o arilaquilo C4-C16.
Algunas formas de realización incluyen además un metal quelado. En algunas formas de realización, el metal quelado es Tc, In, Ga, Y, Lu, Re, Cu, Ac, Bi, Pb, Sm, Sc, Co, Ho, Gd, Eu, Tb, o Dy. En algunas formas de realización, el metal quelado es un isotopo, por ejemplo. En algunas formas de realización, el isótopo es Tc-94m, Tc-99m, In-111, Ga-67, Ga-68, Y-86, Y-90, Lu-177, Re-186, Re-188, Cu-64, Cu-67, Co-55, Co-57, Sc-47, Ac-225, Bi-213, Bi-212, Pb-212, Sm-153, Ho-166, o Dy-166. Los párrafos hasta el [0022] se refieren a las formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada. Las formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada incluyen compuestos que presentan la estructura
Figure imgf000006_0003
que opcionalmente incluye un ion metal quelado. Z es tetrazolio o CO2Q; cada Q se selecciona independientemente de entre hidrógeno o un grupo protector, a es 1, 2, 3 o 4. R es cada uno independientemente H o alquilo C1-C4. W es -NRC(O)-, NRC(O)NR-, NRC(S)NR-, -NRC(O)O-, -OC(O)NR-, -OC(O)-, -C(O)NR-, o -C(O)O-. Y es -C(O)-, NRC(O)-, -NRC(S)-, -OC(O)-;
En las formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada m es 1, 2, 3, 4, 5, o 6; n es 1,2, 3, 4, 5 o 6; q es 0 o 1; y s es 0 o 1. R3 es H, CO2H o -CO2R4, en el que R4 es alquilo C1-C6 , arilo C2-C12 o arilaquilo C4-C16. Algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada incluyen además un ion metal quelado. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, el ion metal es Tc, Re, Cu, o Ga. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, el ion metal es Tc-99m, Re-186, Re-188, Cu-64 o Ga-68. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, el ion metal es Tc-99m.
Las realizaciones desveladas no cubiertas por la invención reivindicada incluyen compuestos que presentan la estructura
Figure imgf000007_0001
en la que p, q y s están en el orden dibujado, y q y s son o bien ambos 0 o bien ambos 1. Z es tetrazolio o CO2Q; cada Q se selecciona independientemente de entre hidrógeno o un grupo protector, a es 1, 2, 3 o 4. FG es un grupo colorante fluorescente que emite en el espectro visible o en el espectro infrarrojo cercano. R es cada uno independientemente H o alquilo C1-C4. V es - C(O)- o -NRC(O)- o -NRC(S)-. W es -NRC(O)-, NRC(O)NR-, NRC(S)NR-, -NRC(O)O-, -OC(O)NR-, -OC(O)-, -C(O)NR-, o -C(O)O--. Y es -C(O)-, NRC(O)-, -NRC(S)-, -OC(O)-. En las formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada m es 1, 2, 3, 4, 5, o 6; n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6; p es 0, 1, 2, o 3, y cuando p es 2 o 3, cada R1 puede ser el mismo o diferente. R1 es H, alquilo C1-C6 , arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16. R2 y R3 son independientemente H, CO2H o CO2R2, en el que R2 es alquilo C1-C6 , arilo C2-C12 o arilaquilo C4-C16; en el que cuando uno de R2 y R3 es CO2H o CO2R2, el otro es H. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, el grupo colorante fluorescente emite en el espectro del infrarrojo cercano.
Formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada incluyen compuestos que presenta la estructura
Figure imgf000007_0002
en la que Z es tetrazolio o CO2Q; cada Q se selecciona independientemente de entre hidrógeno o un grupo protector, a es 1, 2, 3 o 4. Uno de A y A' es Ch y el otro es FG, en el que FG es un grupo colorante fluorescente que emite en el espectro visible o en el espectro infrarrojo cercano y Ch es un grupo quelante de metal que opcionalmente incluye un metal quelado. R es cada uno independientemente H o alquilo C1-C4. V o V' son independientemente - C(O)-, -NRC(O)- o -NRC(S)-. W es -NRC(O)-, NRC(O)NR-, NRC(S)NR-, -NRC(O)O-, -OC(O)NR-, -OC(O)-, -C(O)NR-, o -C(O)O--. Y es -C(O)-, NRC(O)-, -n Rc (S)-, -OC(O)-. En las formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada m es 1,2, 3, 4, 5, o 6; n es 1,2, 3, 4, 5 o 6; y g es 1, 2, 3, 4, 5 o 6; p es 0, 1, 2, o 3, y cuando p es 2 o 3, cada R1 puede ser el mismo o diferente. R1 es H, alquilo C1-C6 , arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16. R2 y R3 son independientemente H, CO2H o CO2R2, en el que R2 es alquilo C1-C6, arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16; en el que cuando uno de R2 y R3 es CO2H o CO2R2, el otro es H. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, el grupo colorante fluorescente emite en el espectro del infrarrojo cercano. Algunas de las formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada incluyen además un metal quelado.
Las formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada incluyen compuestos que presentan la estructura
Figure imgf000007_0003
en la que las subunidades asociadas con p, q, r y s pueden estar en cualquier orden. Z es tetrazolio o CO2Q; cada Q se selecciona independientemente de entre hidrógeno o un grupo protector, y a es 1, 2, 3 o 4. R es cada uno independientemente H o alquilo C1-C4. En esta forma de realización desvelada no cubierta por la invención reivindicada r es 1. Tz es un grupo triazolio que presenta la estructura
Figure imgf000008_0001
en la que L1 es
Í-(CH2)di-
o
Figure imgf000008_0002
L2 es
Figure imgf000008_0003
o
R5
-|-(C H 2)b---- k i
X .
5
X1 es -NRC(O)-, -NRC(O)NR-, -NRC(S)NR-, o -NRC(O)O-; X2 es -C(O)NR-, -NRC(O)NR-, -NRC(S)NR-, o -OC(O)NR-; R5 es H, CO2 H, o CO2R6 en el que R6 es alquilo C1-C6 , arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16; b es 1,2, 3, o 4; y d es 1, 2, 3, o 4. En las formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada q es 0 o 1, W es -NRC(O)-, -NRC(O)NR-, NRC(S)NR-, -NRC(O)O-, -OC(O)NR-, -OC(O)-,-C(O)NR - o -C (O)O-; n es 1,2, 3, 4, 5, o 6: y R2 y R3 son independientemente H, CO2H o CO2R4, en el que R4 es alquilo C1-C6 , arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16; en el que si uno de R2 y R3 es CO2H o CO2R2 , entonces el otro es H. En formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada s es 0 o 1; Y es -C(O)-, -NRC(O)-, -NRC(S)-, -OC(O)-; y m es 1, 2, 3, 4, 5, o 6. En formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada p es 0, 1, 2, 3, o 4, y cuando p es 2 o 3, cada R1 puede ser el mismo o diferente; y R1 es H, alquilo C1-C6, arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16. G1 es un grupo seleccionado de entre el grupo que consiste en
Figure imgf000008_0004
en el que Ch es un grupo quelante de metal, que incluye opcionalmente un metal quelado; FG es un grupo colorante fluorescente que emite en el espectro visible o en el espectro infrarrojo cercano; uno de A y A' es Ch y el otro es FG; V y V' son independientemente -C(O)-, -NRC(O)-, -n Rc (S)-, o -OC(O)-; y g es 1, 2, 3, 4, 5, o 6. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, el grupo colorante fluorescente emite en el espectro del infrarrojo cercano. Algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada incluyen un metal quelado.
Las formas de realización de la invención incluyen los compuestos de la invención para el uso en un procedimiento de diagnóstico por la imagen de una o más células, órganos o tejidos mediante exposición de la célula o por administración de una cantidad eficaz del compuesto a un organismo, en el que el compuesto incluye un isotopo adecuado para el diagnóstico por la imagen.
Las formas de realización de la invención incluyen los compuestos de la invención para el uso en un procedimiento de tratamiento de un tumor que comprende la administración del compuesto, en el que el compuesto incluye un radioisótopo terapéuticamente eficaz.
Las formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada procedimientos para la clasificación de células mediante la exposición de las células a un compuesto tratado anteriormente, en el que el compuesto incluye un grupo colorante fluorescente, seguido por la separación de células que están unidas al compuesto de las células que no están unidas al compuesto.
Las formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada incluyen procedimientos de mapeo intraoperatorio de tumores que comprenden la administración de una cantidad eficaz de un compuesto tratado anteriormente en el objeto, en el que el compuesto incluye un grupo colorante fluorescente.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra imágenes de SPECT-TC de un ratón portador de tumores LNCaP PSMA+ inyectado por vía intravenosa con el compuesto ejemplar [Tc 99m]SRV32 (no de acuerdo con la invención).
La Figura 2 imagen de GE eXplore VISTA de PET pseudodinámica (co-registrado con la correspondiente imagen de TC) del ratón portador de tumor LNCaP PSMA+ inyectado por vía intravenosa con 0,2 mCi (7,4 MBq) del compuesto ejemplar [Ga68] SRV27 (no de acuerdo con la invención).
La Figura 3 imagen de g E eXplore VISTA de PET pseudodinámica (co-registrado con la correspondiente imagen de TC) del ratón portador de tumor PIP PSMA+ p Sm A- flu inyectado por vía intravenosa con 0,2 mCi (7,4 MBq) del compuesto ejemplar [Ga68] SRV100.
La Figura 4 muestra un esquema sintético del compuesto ejemplar SRV100 y [In 111] SRV100.
La Figura 5 muestra imágenes de SPECT-TC de un ratón portador de tumores PC-3 PIP PSMA+ inyectado por vía intravenosa con el compuesto ejemplar [In 111] SRV27 (no de acuerdo con la invención).
La Figura 6 muestra imágenes de SPECT-TC de un ratón portador de tumores PC-3 PIP PSMA+ inyectado por vía intravenosa con el compuesto ejemplar [In 111] SRV100.
La Figura 7 muestra imágenes de SPECT-TC de un ratón portador de tumores PC-3 PIP PSMA+ inyectado por vía intravenosa con el compuesto ejemplar de modalidad dual [In 111] SRV73 (no de acuerdo con la invención). La Figura 8 muestra el espectro de absorbancia y emisión y el rendimiento cuántico del compuesto ejemplar YC-27 (no de acuerdo con la invención).
La Figura 9 muestra el decaimiento de la fluorescencia del compuesto ejemplar YC-27 (no de acuerdo con la invención).
La Figura 10 muestra la curva CI50 del compuesto ejemplar YC-27 usando un ensayo NAALADase basado en fluorescencia (no de acuerdo con la invención).
La Figura 11 muestra un estudio por la imagen in vivo de un ratón NOD/SCID (ratón #1), portador de tumores PC-3 PIP (flanco izquierdo hacia delante) y PC-3 flu (flanco derecho hacia delante). El ratón # 1 recibió 10 nmol de YC-27 y se obtuvieron vistas dorsal (animal posición prona) y ventral (animal posición supina). La vista dorsal y ventral a los 40 minutos p.i. (A, B, respectivamente); 18,5 h (C, D); 23 h (E, F); 42,5 h (G, H); 6 8 h (I, J). Vista dorsal de la imagen pre-inyección (K). Vistas dorsal y ventral 70,5 h p.i. (L, M). Imágenes después de laparotomía de línea media (N) y de los órganos extraídos individualmente (O) en una placa Petri a las 70,5 h p.i.. Las imágenes se escalaron al mismo máximo (unidades arbitrarias) (no de acuerdo con la invención).
La Figura 12 muestra un estudio por la imagen in vivo de un ratón NOD/SCID (ratón #2) (panel izquierdo), portador de tumores PC-3 PIP (flanco izquierdo hacia delante) y PC-3 flu (flanco derecho hacia delante). El ratón # 2 recibió 1 nmol de YC-27 y se obtuvieron vistas dorsal (animal posición prona) y ventral (animal posición supina). La vista dorsal y ventral de la imagen preinyección. (A, B, respectivamente); 10 minutos p.i.(C, D); 20,5 h (E, F); 24 (G, H). Imágenes después de laparotomía de línea media (I) y de los órganos extraídos individualmente (J) en una placa Petri a las 24 h p.i.. Paneles derechos: Ratón # 3 en la misma orientación que el ratón #2. El ratón # 3 recibió 1 nmol de YC-27 coinyectado con 1 pmol de DCIBzL, que sirvió como agente bloqueador para el ensayo de especificada de la unión. Las imágenes se escalaron al mismo máximo (unidades arbitrarias) (no de acuerdo con la invención).
La Figura 13 muestra imágenes de SPECT-TC de un ratón portador de tumores LNCaP PSMA+ inyectado por vía intravenosa con el compuesto ejemplar [Tc 99m]SRVI34B (no de acuerdo con la invención).
La Figura 14 muestra imágenes de SPECT-TC de un ratón portador de tumores PC3-PIP PSMA+ inyectado por vía intravenosa con el compuesto ejemplar [Tc 99m]SRVI34B (no de acuerdo con la invención).
La Figura 15 muestra imágenes de s Pe c T-TC de un ratón portador de tumores portador de tumores PC-3 PIP PSMA (flanco derecho hacia delante) y PC-3 flu PSMA- (flanco izquierdo hacia delante) inyectado por vía intravenosa con el compuesto ejemplar [Tc 99m]SRVI34A (no de acuerdo con la invención).
La Figura 16 muestra imágenes de SPECT-TC de un ratón portador de tumores portador de tumores PC-3 PIP PSMA (flanco izquierdo hacia delante) y PC-3 flu PSMA- (flanco derecho hacia delante) inyectado por vía intravenosa con el compuesto ejemplar [Tc 99m]SRVI34B (no de acuerdo con la invención).
La Figura 17 muestra células PC-3 PIP y PC-3 Flu tratadas con el compuesto fluorescente YC-VIII-36 (verde, superior izquierda) y DAPI (azul) y células PC-3 PIP y PC-3 Flu tratadas con ambos YC-VIII-36 y el inhibidor de PSMA, PMPA (no de acuerdo con la invención).
La Figura 18 muestra células PC-3 PIP tratadas con DAPI (azul) y concentraciones variables de YC-VIII-36 (verde) (no de acuerdo con la invención).
La Figura 19 muestra la internalización tiempo dependiente de YC-VIII-36 en células PC-3 PIP tratadas con YC-VIII-36 (verde) y DAPI (azul) (no de acuerdo con la invención).
La Figura 20 muestra la titulación y la detección de unas cantidades variantes de YC-VIII-36 inyectado subcutáneamente en un ratón desnudo (espectro IVIS con exposición de 10 seguido de no mezcla espectral) no de acuerdo con la invención).
La Figura 21 muestra imágenes de fluorescencia de un ratón portador de tumores PC-3 PIP PSMA+ y PC-3 flu PSMA- inyectado por vía intravenosa con el compuesto ejemplar YC-VIII-36 (no de acuerdo con la invención). La Figura 22 muestra imágenes de fluorescencia de un ratón portador de tumores PC-3 PIP PSMA+ y PC-3 flu PSMA- inyectado por vía intravenosa con el compuesto ejemplar YC-VIII-36, 180 minutos después de la inyección (superior) y la biodistribución del compuesto ejemplar YC-VIII-36, 180 minutos después de la inyección (inferior) (no de acuerdo con la invención).
La Figura 23 muestra el análisis FACS que muestra la subpoblación de células PSMA positivo en células PC-3 flu, PC-3 PIP y LNCaP (no de acuerdo con la invención).
La Figura 24 muestra los resultados de la clasificación de células PC-3 PIP tratadas con el compuesto ejemplar YC-VIII-36, incluyendo el porcentaje inicial (centro superior) y después de 3 pases de clasificación (inferior) (no de acuerdo con la invención).
La Figura 25 muestra el número de células en pico PIC-pos en 10 millones de PC3-flu detectable por 100 nM del compuesto YC-VIII-36 en citometría de flujo (BD LSR-II). La ventana 1 es el número total de células sencillas contadas.; ventana P2 a una intensidad superior es el número de células Pip-pos detectadas y ventana P3 a una intensidad inferior (no de acuerdo con la invención).
Descripción detallada de las formas de realización ejemplares
Algunas formas de realización de la presente invención se exponen con detalle a continuación. En la descripción de las formas de realización, se emplea una terminología específica para aportar claridad.
Cuando se proporciona un intervalo de valores en la presente invención, se entiende que cada valor que interviene, hasta el tercer decimal de la unidad del límite más bajo a menos que el contexto indica claramente que es de otra manera, entre el límite superior e inferior de este intervalo y cualquier otro valor indicado o que interviene en dicho intervalo indicado, está englobado en esta invención. Los valores finales de cualquier intervalo están incluidos en el intervalo.
Definiciones
Los términos siguientes más abajo tienen el significado que debe ser fácilmente comprendido por los expertos en la técnica. Las definiciones se proporcionan en el documento presente para claridad. Cuando una definición excluye un significado reconocido en la técnica, el término debe ser tomado con el significado que se describe a continuación. Cuando los significados reconocidos en la técnica y el significado que se da a continuación difieren, pero no son exclusivos, el significado pretendido es claro por el contexto en el que se utiliza.
Tal como se utiliza en el documento presente, "agente" es un no péptido, un compuesto de una molécula pequeña.
Por "sustrato celular" se indica el material celular o acelular (por ejemplo, una matriz extracelular, polipéptidos, péptidos u otros componentes moleculares) que están en contacto con la célula.
Por "control" se indica un estándar o elemento de referencia.
Por "enfermedad" se indica cualquier estado o trastorno que daña o interfiere con la función normal de una célula, tejido, órgano o sujeto.
Por "cantidad efectiva" se indica una cantidad suficiente para producir una diferencia medible, cuando se compara con un control. Por ejemplo, una cantidad suficiente para producir una imagen medible, cuando el compuesto se utiliza para un estudio por la imagen, o una cantidad suficiente para mejorar los síntomas de una enfermedad, cuando el compuesto se utiliza para la terapia. La cantidad efectiva de un agente terapéutico activo para el tratamiento de una enfermedad o lesión varía en función del modo de administración, la edad, el peso corporal, y el estado de salud general del sujeto. Por último, el médico que asiste decidirá la cantidad adecuada y el régimen de dosificación.
Por “modifica” se indica altera. Un agente que modifica una célula, un sustrato o un entrono celular produce una alteración bioquímica en un componente (por ejemplo, polipéptido, nucleótido o componente molecular) de la célula, sustrato o entorno celular.
Tal como se utilizan en el documento presente, los términos “evita”, “que evita”, “prevención”, “tratamiento profiláctico” o similares se refiere a reducir la probabilidad de desarrollar un trastorno o una enfermedad en un sujeto, que no la tiene, pero está en riesgo o es susceptible para desarrollar un trastorno o una enfermedad.
Por “sujeto” se indica un mamífero, incluyendo, pero no se limita a, un humano o un mamífero no humano, como un bovino, equino, canino, ovino o felino.
Por “dispositivo de suministro terapéutico” se indica cualquier dispositivo que proporciona la liberación de un agente terapéutico. Los dispositivos de suministro terapéutico incluyen comprimidos y cápsulas, descritos a continuación, así como jeringas, bombas osmóticas, catéteres, biomateriales de liberación retardada y de liberación mantenida.
Tal como se utilizan en el documento presente, los términos “tratar”, “que trata”, “tratamiento”, “terapéutico” y similares se refiere a la reducción o mejora de un trastorno y/o síntomas asociados al mismo. Se apreciará que, aunque no excluye, el tratamiento de un trastorno o enfermedad no requiere que el trastorno, enfermedad o síntomas asociados al mismo se eliminen por completo.
Los compuestos descritos en el presente documento pueden tener uno o más centros o planes asimétricos. Los compuestos de la presente invención que contienen un átomo sustituido asimétricamente se pueden aislar en formas ópticamente activas o racémicas. Es bien conocido en la técnica como preparar formas ópticamente activas tales como por resolución de formas racémicas (racematos), por síntesis asimétrica o por síntesis a partir de materiales de partida formas ópticamente activas. La resolución de los racematos se puede conseguir, por ejemplo, mediante los procedimientos convencionales como la cristalización en presencia de un agente de resolución o cromatografía, por ejemplo, una columna de HPLC quiral. Varios isómeros geométricos de olefinas, dobles enlaces c=N, y similares pueden estar también presentes en los compuestos descritos en el documento presente y todos estos isómeros estables están contemplados en la presente invención. Los isómeros geométricos cis y trans de los compuestos de la presente invención se describen y puede ser aislados como una mezcla de isómeros o como unas formas isoméricas separadas. Todas las formas quirales (enantioméricas y diastereoméricas) y las formas racémicas, así como todas las formas isoméricas geométricas de la estructura están previstas, a menos que la estereoquímica específica o las formas isoméricas estén indicadas específicamente.
Los compuestos descritos en el presente documento pueden tener uno o más átomos cargados. Por ejemplo, los compuestos pueden ser zwitteriónicos, pero pueden ser totalmente neutrales. Otras formas de realización pueden tener uno o más grupos cargados, dependiendo del pH y de otros factores. En estas formas de realización, el compuesto se puede asociar con un contraión adecuado. Es bien conocido en la técnica como preparar formas sales 0 contra-iones de intercambio. Generalmente, dichas sales se pueden preparar mediante la reacción de las formas ácidas libre de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base adecuada (como hidróxido, carbonato, bicarbonato de Na, Ca, Mg o K o similares) o bien mediante la reacción de las formas básicas libres de estos compuestos con una cantidad estequiométrica del ácido adecuado. Dichas reacciones se llevan a cabo generalmente en agua o en una solvente orgánica, o en una mezcla de los dos. Los contraiones se pueden cambiar, por ejemplo, por técnicas de intercambio de iones como la cromatografía de intercambio iónico. Todas las sales, contraiones de zwitteriones están previstos, excepto que el contraión o la sal estén indicado específicamente. En determinadas formas de realización, la sal o el contraión pueden ser farmacéuticamente aceptables para la administración a un sujeto. Las sales farmacéuticamente aceptables se tratarán más tarde.
Tal como se utilizan en el documento presente, un “grupo protector” es un sustituyente químico que se puede extraer selectivamente por reactivos fácilmente disponible que no atacan al grupo funcional regenerado u otros grupos funcionales en la molécula. Los grupos protectores adecuados son bien conocidos en la técnica y se siguen desarrollando. Los grupos protectores adecuados se pueden encontrar por ejemplo en Wutz y col. ("Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, Fourth Edition," Wiley-Interscience, 2007). Los grupos protectores para la protección del grupo carboxilo, tal como se han descrito por Wutz y col. (páginas 533-643) se usan en determinadas formas de realización. En algunas formas de realización, el grupo protector es eliminable mediante el tratamiento con un ácido. Los ejemplos específicos de grupos protectores incluyen, pero no se limitan a bencilo, p-metoxibencilo (PMB), tertiari butilo (t Bu), metoximetilo (Mo M), metoxietoximetilo (MEM), metiltiometilo (MTM), tetrahidropiranilp (THP), tetrahidrofuranilo (THF), benziloximetilo (BOM), trimetilsililo (TMS), trietilsililo (TES), t-butildimetilsililo (t Bd Ms ), y trifenilmetilo (tritil, Tr). Los expertos en la técnica reconocerán las situaciones adecuadas en las que se necesitan unos grupos protectores y serán capaces de seleccionar un grupo protector adecuado para el uso en una circunstancia particular.
Tal como se utiliza en el documento presente, “alquilo” está previsto que incluya los grupos hidrocarburos ramificados, de cadena lineal, cíclicos alifáticos saturados. Los ejemplos de alquilo incluyen, pero no se limitan a metilo, etilo, npropilo, iso- propilo n-butilo, sec- butilo, terc- butilo, n-pentilo y sec-pentilo. En determinadas formas de realización, los grupos alquilo son alquilo C1-C6 o grupos alquilo C1-C4. Grupos alquilo particulares son metilo, etilo, propilo, butilo y 3-pentilo. El término “alquilo C1-C6 “tal como se utiliza en el presente documento significa de cadena lineal, ramificada o hidrocarburos C1-C6 cíclicos que están completamente saturados y sus híbridos como (cicloalquil)alquilo. Los ejemplos de sustituyentes alquilo C1-C6 incluyen metilo (Me), etilo (Et), propilo (incluyendo n-propilo (n-Pr, nPr), iso-propilo (iPr, 1 Pr), y ciclopropilo (c-Pr, cPr)), butilo (incluyendo n-butilo (n-Bu, nBu), iso- butilo (i-Bu, i Bu), sec- butilo (s-Bu, sBu), tertc butilo (t-Bu, * Bu), o ciclobutilo (c-Bu, cBu)), y además. "Cicloalquilo" está previsto que incluya los grupos anillo saturados como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo. Los grupos cicloalquilo generalmente tienen de 3 a 8 miembros del anillo. En el término “(cicloalquil) alquilo”, cicloalquilo, y alquilo como se han definido anteriormente. Este término engloba, pero no se limita a ciclopropilmetilo, ciclopentilometilo y ciclohexilmetilo. El grupo alquilo se puede sustituir o no sustituir. Los sustituyentes no se cuentan hacia el número total de átomo en el grupo alquilo, siempre y cuando los átomos totales del sustituyente (s) no es mayor que el grupo alquilo.
Tal como se utiliza en el documento presente, “arilo” incluye grupos aromáticos que contiene de 1 a 3 átomos separados o anillos fusionados y desde 2 hasta aproximándote 12 átomos de carbono, y hasta tres heteroátomos con miembros del anillo. Los Ejemplos of heteroátomos incluyen nitrógeno, oxígeno o átomos azufre. El grupo arilo puede tener 0, 1,2 o 3 heteroátomos como anillos. Los ejemplos de grupos arilo incluyen, pero no se limitan a fenilo, difenilo y naftilo incluyendo 1- naftilo y 2- naftilo. Los ejemplos de grupos arilo que presentan heteroátomos incluyen quinolinilo, isoquinolinilo, quinazolinilo, piridilo, pirazinilo, pirimidilo, furanilo, pirrolilo, tienilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo, tiazolilo, triazinilo, oxazolilo, isoxazolilo, imidazolilo, indolilo, benzofuranilo, y benzotiazolilo entre otros. Los grupos arilo se pueden sustituir o no sustituir. Los sustituyentes no se cuentan hacia el número total de átomos del grupo arilo, siempre y cuando los átomos torales en los sustituyentes no sean mayores que los del grupo arilo.
Tal como se utiliza en el documento presente, el término “alquilarilo” incluye los grupos alquilo, tal como se han definido anteriormente, sustituidos por grupos arilo tal como se ha definido anteriormente. El grupo arilo puede estar unido en cualquier punto con el grupo arilo. El término alquilarilo C4-C16 incluye los grupos alquilarilo que presentan de 4 a 16 átomos de carbono, contando los átomos de carbono en el grupo alquilo y el grupo arilo juntos. Los ejemplos de grupos alquilarilo incluyen, pero no se limitan a bencilo (fenilmetilo), feniletilo, y naftilmetilo. El grupo alquilarilo puede ser sustituido o no sustituido. Los sustituyentes no se cuentan hacia el número total de átomos del grupo alquilarilo, siempre y cuando los átomos torales en los sustituyentes no sean mayores que los del grupo alquilarilo.
El término “sustituido” tal como se utiliza en el documento presente, significa que uno o más hidrógeno en el átomo o grupo designado se sustituye por un sustituyente, siempre que la valencia normal del átomo designado no sea superada, y que la sustitución de cómo resultado un compuesto estable. Cuando el sustituyente es oxo (ceto, es decir =O), entonces se sustituyen 2 hidrógenos en el átomo. La presente invención tiene como objetivo incluir todos los isótopos (incluyendo los radioisótopos) de átonos que se encuentran en los compuestos presentes. Cuando se sustituyen los compuestos, se deben sustituir en una o más posiciones disponibles, generalmente 1,2,3 o 4 posiciones por uno o más grupos adecuados como los que se han descrito en el documento presente. Los grupos adecuados que pueden estar presentes en un grupo “sustituido” incluyen por ejemplo halógeno; ciano; hidroxilo; nitro; azido; amino; alcanoílo (como el grupo alcanoílo C1-C6 como acilo o similares); carboxamido; grupos alquilo (incluyendo grupos cicloalquilo que presentan de 1 a 8 átomos de carbono, por ejemplo 1,2,3,4, 5 o 6 átomos de carbono) y grupos alquenilo y alquinilo (incluyendo grupos que presentan uno o más enlaces insaturados y desde 2 a 8 átomos de carbono, por ejemplo 2,3,4, 5 o 6 átomos de carbono); grupos alcoxilo que presentan uno más enlaces de oxígeno de 1 a 8 átomos de carbono, por ejemplo 1,2,3,4, 5 o 6 átomos de carbono; ariloxi como fenoxi; grupos alquiltio que incluyen aquellos que presentan enlaces tioéter y de 1 a 8 átomos de carbono, por ejemplo 1,2,3,4, 5 o 6 átomos de carbono; grupos alquilsulfinilo que incluyen aquellos que presentan uno o más enlaces sulfinilo y de 1 a 8 átomos de carbono, por ejemplo 1,2,3,4, 5 o 6 átomos de carbono; grupos alquilsulfonilo que incluyen aquellos que presentan uno o más enlaces sulfonilo y de 1 a 8 átomos de carbono, por ejemplo 1,2,3,4, 5 o 6 átomos de carbono; grupos aminoalquilo que incluyen grupos que tienen uno o más átomos de N de 1 a 8 átomos de carbono, por ejemplo 1,2,3,4, 5 o 6 átomos de carbono; arilo carbocíclico que presenta 4, 5, 6 o más carbonos y uno o más anillos (por ejemplo, fenilo, bifenilo, naftilo o similares, cada anillo bien aromático sustituido o aromático no sustituido); arilalquilo que presenta 1 a 3 anillos fusionados o separados y de 6 hasta aproximadamente 18 átomos de carbono en anillo (por ejemplo, bencilo); arilalcoxi que presenta de 1 a 3 anillos fusionados o separados y de 6 hasta aproximadamente 18 átomos de carbono en anillo (por ejemplo, O-bencilo); o un grupo saturado, no saturado o aromático que presenta de 1 a 3 anillos fusionados o separados con 3 hasta aproximadamente 8 miembros por anillo y uno o más átomos N,O o S ( por ejemplo, coumarinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, quinazolilo, piridilo, pirazinilo, pirimidilo, furanilo, pirrolilo, tienilo, tiazolilo, triazinilo, oxazolilo, isoxazolilo, imidazolilo, indolilo, benzofuranilo, benzotiazolilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, piperidinilo, morfolinilo, piperazinilo, y pirrolidinilo). Dichos grupos heterocíclicos pueden estar más sustituidos, por ejemplo, con hidroxilo, alquilo, alcoxi, halógeno y amino.
Tal como se usa en el documento presente, cuando un sustituyente interno está flaqueado por enlaces (por ejemplo -NRC(O)-) el orden de los átomos se debe fijar, la orientación del grupo no se debe invertir y se inserta en la estructura en la orientación presentada. Dicho de otra forma, NRC(O)- no representa lo mismo que -C(O)NR-. Tal como se utiliza en el documento presente el término C(O) (por ejemplo -NRC(O)-) se usa para indicar un grupo carbonilo (C=O), en el que el oxígeno está unido al carbono por un doble enlace.
Un sustituyente que presenta un enlace roto, como en el ejemplo que se muestra a continuación, significa que el sustituyente está unido directamente a la molécula en la posición indicada. Ningún grupo metileno (C2H2 ) adicional está implicado.
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Un sustituyente que presenta un enlace roto, como en el ejemplo que se muestra a continuación, significa que el sustituyente está unido directamente a la molécula en la posición indicada. Ningún grupo metileno (C2H2 ) adicional está implicado.
Figure imgf000012_0002
Formas de realización
Tal como se describe en el siguiente documento, todas las formas de realización o subcombinaciones se pueden utilizar en combinación con toras las otras formas de realización o subcombinaciones, excepto que sean mutuamente excluyentes.
En algunas de las formas de realización siguientes, z es CO2Q. En algunas de las formas de realización siguientes, Q es H. En algunas de las formas de realización siguientes, m es 4, 5, o 6. En algunas de las formas de realización siguientes m es 6. En algunas de las formas de realización siguientes, n es 2, 3, o 4. En algunas de las formas de realización siguientes, n es 3. En algunas de las formas de realización siguientes, a es 3 o 4. En algunas de las formas de realización siguientes, a es 4. En algunas de las formas de realización siguientes, Y es -C(O)-. En algunas de las formas de realización siguientes, W es -NH(O)-.
Formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada incluyen compuestos que presentan la estructura
Figure imgf000013_0001
en la que las subunidades asociadas con elementos p, q, r y s pueden estar en cualquier orden. Z es tetrazolio o CO2Q; cada Q se selecciona independientemente de entre hidrógeno o un grupo protector, a es 1, 2, 3 o 4, y R es cada uno independientemente H o alquilo C1-C4.
La variable r es 0 o 1. Tz es un grupo triazolio seleccionado de entre el grupo que consiste en
Figure imgf000013_0002
en la que L1 es
Figure imgf000013_0003
L2 es
o
Figure imgf000013_0004
X1 es -NRC(O)-, -NRC(O)NR-, -NRC(S)NR-, o -NRC(O)O-; X2 es -C(O)NR-,-NRC(O)NR-, -NRC(S)NR-, o -OC(O)NR-; R5 es H, CO2 H, o CO2R6 en el que R6 es alquilo C1-C6, arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16; b es 1,2, 3, o 4; y d es 1, 2, 3, o 4.
La variable q es 0 o 1. W es -NRC(O)-, -NRC(O)NR-, NRC(S)NR-, -NRC(O)O-, -OC(O)NR-, -OC(O)-,-C(O)NR-; o -C(O)O-; R2 y R3 son independientemente H, CO2H o CO2R4, en el que R4 es alquilo C1-C6 , arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16; en el que si uno de R2 y R3 es CO2H o CO2R2, entonces el otro es H; n es 1,2, 3, 4, 5 o 6.
La variable s es 0 o 1. Y es -C(O)-, -NRC(O)-, -NRC(S)-, -OC(O)-; y m es 1, 2, 3, 4, 5, o 6.
La variable p es 0, 1, 2, o 3, y cuando p es 2 o 3, cada R1 puede ser el mismo o diferente. R1 es H, alquilo C1-C6, arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16.
G es un grupo seleccionado de entre el grupo que consiste en
Figure imgf000014_0001
en el que Ch es un grupo quelante de metal, que incluye opcionalmente un metal quelado; FG es un grupo colorante fluorescente que emite en el espectro visible o en el espectro infrarrojo cercano; uno de A y A' es Ch y el otro es FG; V y V' son independientemente -C(O)-, -NRC(O)-, -NRC(S)-, o -o C(O)-; y g es 1, 2, 3, 4, 5, o 6. Las condiciones siguientes se aplican también:
1) cuando G es
Figure imgf000014_0002
y r es 0, entonces q y s son ambos 1;
2) cuando G es
Figure imgf000014_0003
y r es 0, entonces q y s son ambos 0 o ambos 1;
3) Cuando G es
Figure imgf000014_0004
entonces p es 0 y R2 es H, la estructura incluye opcionalmente un ion metal quelado.
4) Cuando G es
Figure imgf000014_0005
y r es 0, entonces si p es 0, entonces uno de R2 y R3 es CO2R2 , y el otro es H; y
5) Cuando g es
Figure imgf000015_0001
entonces r es 0.
En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, Z es CO2Q. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, Q es H. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada m es 4, 5 o 6. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada m es 6. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, n es 2, 3, o 4. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, n es 3. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, a es 4. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, p, q y s están en el orden dibujado, y r puede estar en cualquier posición, que incluye entre uno de entre p, q o s. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada r es 0.
Formas de realización de la invención incluyen compuestos que presentan la estructura
Figure imgf000015_0002
en la que Z es un tetrazolio o CO2Q cada Q es hidrógeno, a es 1, 2, 3, o 4, y R es cada uno independientemente H o alquilo C1-C4. Ch es un grupo quelante de metal tal como se define en la reivindicación 1 que opcionalmente incluye un metal quelado. W es -NRC(O)-,NRC(O)NR-, NRC(S)NR-, -NRC(O)O-, -OC(O)NR-, -OC(O)-,-C(O)NR-, o -C(O)O-. Y es -C(O)-, NRC(O)-, -NRC(S)-, -OC(O)-. V es - C(O)- o NRC(O)- o -NRC(S)-, o -OC(O)-. En la invención m es 1, 2, 3,4, 5, o 6; n es 1, 2, 3,4, 5, o 6; y p es 1, 2 o 3 y, cuando p es 2 o 3, cada R1 puede ser igual o diferente. R1 es H, alquilo C1-C6 , arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16. Uno de R2 y R3 es CO2H o CO2R4 y el otro es H; en el que R4 es alquilo C1-C6 , arilo C2-C12 o arilaquilo C4-C16.
En algunas formas de realización de la invención, el compuesto presente la estructura que se muestra a continuación.
Figure imgf000015_0003
En algunas formas de realización de la invención, el compuesto presenta la estructura que se muestra a continuación.
Figure imgf000015_0004
En algunas formas de realización, p es 1, 2, o 3. Cuando p es 2 o 3, cada R1 puede ser igual o diferentes. Cuando dos grupos R1 son diferentes, los dos pueden estar en cualquier orden. En algunas formas de realización, p es 2. En algunas formas de realización, p es 2 y los dos R1 con iguales. En algunas formas de realización, R1 es un arilo C2-C12. En algunas formas de realización, R1 es fenilo. En algunas formas de realización, R3 es CO2H y R2 es H. En algunas formas de realización, R2es CO2H y R3 es H. En algunas formas de realización, R2y R3son ambos H.
En la divulgación no cubierta por la invención reivindicada, p es 0. En algunas formas de realización no cubiertas por la invención reivindicada en las que p es 0, R2 es CO2R4 y R3 es H. En algunas formas de realización no cubiertas por la invención reivindicada en las que p es 0, R3 es CO2R4 y R2 es H. En algunas formas de realización de la invención, R4es arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16. En algunas formas de realización de la invención, R4 es bencilo.
Ch es un grupo quelante de metal, que incluye opcionalmente un metal quelado. Un grupo quelante de metal es un grupo químico que se une de forma no covalente a un átomo de metal, habitualmente con varias interacciones no covalentes. Ch incluye cualquier átomo o conector adicional necesario para unir el grupo quelante de metal al resto del compuesto. Por ejemplo, grupos de unión que presentan alquilo, arilo, la combinación de alquilo y arilo, o grupos alquilo y arilo que presentan heteroátomos pueden estar presentes el grupo quelante. Varios grupos quelantes de metal son conocidos en la técnica. Cualquier quelante se puede utilizar en la presente invención siempre que sea compatible y sea capaz de quelar el metal deseado. Los ejemplos de grupos quelantes de metal (Ch) incluyen, pero no se limitan a ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA) y ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA). En algunas formas de realización, Ch presenta la estructura que se muestra a continuación.
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000017_0001
Ejemplos específicos de compuestos incluyen los compuestos descritos a continuación.
Figure imgf000017_0002
(no de acuerdo con la invención)
Figure imgf000017_0003
(no de acuerdo con la invención)
Figure imgf000017_0004
Figure imgf000018_0001
(no de acuerdo con la invención)
Figure imgf000018_0002
(no de acuerdo con la invención)
Figure imgf000019_0001

Figure imgf000020_0001
En algunas formas de realización de la invención, el compuesto incluye además un metal quelado. En algunas formas de realización, el metal quelado es Tc, In, Ga, Y, Lu, Re, Cu, Ac, Bi, Pb, Sm, Sc, Co, Ho, Gd, Eu, Tb, o Dy. En algunas formas de realización, el metal quelado es Tc, Ga, In, Y, Ac, Lu, Re o Bi. En algunas formas de realización el metal es un isotopo, por ejemplo, un isótopo radioactivo. En algunas formas de realización, el isótopo es Tc-94m, Tc-99m, In-111, Ga-67, Ga-68, Y-86, Y-90, Lu-177, Re-186, Re-188, Cu-64, Cu-67, Co-55, Co-57, Sc-47, Ac-225, Bi-213, Bi-212, Pb-212, Sm-153, Ho-166, o Dy-166. En algunas formas de realización, el isótopo es Tc-94m, Tc-99m, In-111, Ga-67, Ga-68, Y-86, Y-90, Lu-177, Re-186, Re-188, Cu-64, Cu-67, Ac-225, Bi-213 o Bi-212.
Formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada incluyen compuestos que presentan la estructura
Figure imgf000020_0002
que opcionalmente incluye un ion metal quelado. Z es tetrazolio o CO2Q; cada Q se selecciona independientemente de entre hidrógeno o un grupo protector, a es 1, 2, 3 o 4. R es cada uno independientemente H o alquilo C1-C4. W es -NRC(O)-,NRC(O)NR-, NRC(S)NR-, -NRC(O)O-, -OC(O)NR-, -OC(O)-,-C(O)NR-, o -C(O)O-. Y es -C(O)-, NRC(O)-, -NRC(S)-, -OC(O)-. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, subunidades asociadas a q y s pueden estar en el orden mostrado o en el orden inverso.
En las formas de realización ejemplares no cubiertas por la invención reivindicada m es 1, 2, 3, 4, 5, o 6; n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6; q es 0 o 1; y s es 0 o 1. R3 es H, CO2H o -CO2R4, en el que R4 es alquilo C1-C6 , arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16. Algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada incluyen además un ion metal quelado. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, el ion metal es Tc, Re, Ga, o Cu. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, el ion metal es Tc-99m, Re-186, Re-188, Cu-64 o Ga-68. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, el ion metal es Tc-99m, Re-186 o Re-188.
En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, el compuesto presenta la estructura
Figure imgf000020_0003
que opcionalmente incluye un ion metal quelado. Z es tetrazolio o CO2Q; cada Q se selecciona independientemente de entre hidrógeno o un grupo protector, a es 1, 2, 3 o 4. R es cada uno independientemente H o alquilo C1-C4. W es -NRC(O)-,NRC(O)NR-, NRC(S)NR-, -NRC(O)O-, -OC(O)NR-, -OC(O)-,-C(O)NR-, o -C(O)O-. Y es -C(O)-, NRC(O)-, -NRC(S)-, -OC(O)-. En formas de realización ejemplares no cubiertas por la invención reivindicada m es 1, 2, 3, 4, 5 o 6; y n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6. R3 es H, CO2H o CO2R4, en el que R4 es alquilo C1-C6, arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, el compuesto presenta la estructura
Figure imgf000021_0001
En la que a es 1,2, 3 o 4. Y es -C(O)-, NRC(O)-, -NRC(S)-, -OC(O)-, y en algunas formas de realización ejemplares no cubiertas por la invención reivindicada m es 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, el compuesto presenta la estructura
Figure imgf000021_0002
en la que a es 1,2, 3, o 4. W es -NRC(O)-,NRC(O)NR-, NRC(S)NR-, -NRC(O)O-, -OC(O)NR-, -OC(O)-,-C(O)NR-, o -C(O)O-, y n es 1,2, 3,4, 5, o 6. R3 es H, CO2H o CO2R4, en el que R4 es alquilo C1-C6, arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, el compuesto presenta la estructura
Figure imgf000021_0003
en la que a es 1, 2, 3, o 4.
En algunas formas de realización de la divulgación, Y es -C(O)-.
En algunas formas de realización de la divulgación, W es -NHC(O)-.
En algunas formas de realización de la divulgación, m es 1, 2, 3, 4, 5 o 6. En algunas formas de realización, m es 6. En algunas formas de realización, n es 2, 3 o 4. En algunas formas de realización, n es 3.
En algunas formas de realización, R3 es CO2H. En algunas formas de realización, R3 es H. En algunas formas de realización, R3 es CO2R4.
Ejemplos de compuestos no cubiertos por la invención reivindicada incluyen aquellos que presentan la estructura que se muestra a continuación
Figure imgf000022_0001
En algunas formas de realización, el compuesto incluye ademas un ion metal quelado. En algunas formas de realización el ion metal es Tc, Re, Cu, o Ga. En algunas formas de realización, el ion metal es Tc-99m, Re-186, Re-188, Cu-64 o Ga-68. En algunas formas de realización el ion metal es Tc-99m.
El ion metal quela la porción aminoácido del triazolio de la molécula para formar la estructura que se muestra a continuación utilizando Tc como un ejemplo.
Figure imgf000022_0002
Formas de realización no cubiertas por la invención reivindicada incluyen compuestos que presentan la estructura
Figure imgf000022_0003
en la que p, q y s están en el orden dibujado, y q y s son o bien ambos 0 o bien ambos 1. Z es tetrazolio o CO2Q; cada Q se selecciona independientemente de entre hidrógeno o un grupo protector, a es 1, 2, 3 o 4. FG es un grupo colorante fluorescente que emite en el espectro visible o en el espectro infrarrojo cercano. R es cada uno independientemente H o alquilo C1-C4. V es - C(O)- o -NRC(O)- o -NRC(S)-. W es --NRC(O)-,NRC(O)NR-, NRC(S)NR-, -NRC(O)O-, -OC(O)NR-, -OC(O)-,-C(O)NR-, o -C(O)O--. Y es -C(O)-, NRC(O)-, -NRC(S)-, -OC(O)-. En las formas de realización ejemplares no cubiertas por la invención reivindicada m es 1,2, 3, 4, 5, o 6; n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6; p es 0, 1, 2, o 3, y cuando p es 2 o 3, cada R1 puede ser el mismo o diferente. R1 es H, alquilo C1-C6 , arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16. R2 y R3 son independientemente, H, CO2H u O2R2, en el que R2 es alquilo C1-C6 , arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16; en el que cuando uno de R2 y R3 es CO2H o CO2R2, el otro es H. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, el grupo colorante fluorescente emite en el espectro del infrarrojo cercano.
Algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada presentan la estructura que se muestra a continuación.
Figure imgf000022_0004
en la que Z es tetrazolio o CO2Q; cada Q se selecciona independientemente de entre hidrógeno o un grupo protector, a es 1, 2, 3 o 4. FG es un grupo colorante fluorescente que emite en el espectro visible o en el espectro infrarrojo cercano. R es cada uno independientemente H o alquilo C1-C4. V es - C(O)-, o NRC(O)- o -NRC(S)-. W es -NRC(O)-,NRC(O)NR-, NRC(S)NR-, -NRC(O)O-, -OC(O)NR-, -OC(O)-,-C(O)NR-, o -C(O)O--. Y es -C(O)-, NRC(O)-, -NRC(S)-, -OC(O)-. En las formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada m es 1, 2, 3, 4, 5, o 6; n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6; p es 0, 1, 2, o 3, y cuando p es 2 o 3, cada R1 puede ser el mismo o diferente. R1 es H, alquilo C1-C6, arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16. R2 y R3 son independientemente H, CO2H o CO2R2, en el que R2 es alquilo C1-C6 , arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16; en el que cuando uno de R2 y R3 es CO2H o CO2R2 , el otro es H. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, el grupo colorante fluorescente emite en el espectro del infrarrojo cercano.
En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, el compuesto presenta la estructura que se muestra a continuación.
Figure imgf000023_0001
En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, el compuesto presenta la estructura que se muestra a continuación.
Figure imgf000023_0002
En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, el compuesto presenta la estructura que se muestra a continuación.
Figure imgf000023_0003
En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, el compuesto presenta la estructura que se muestra a continuación.
Figure imgf000023_0004
En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, p es 1, 2, o 3. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, p es 2. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, R1 es un arilo C2-C12. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, R1 es fenilo.
En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, p es 0.
En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, R3 es CO2H y R2 es H. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, R2es CO2H y R3 es H. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, R2 es CO2R4 y R3 es H. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, R3es CO2R4 y R2 es H. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, R4 es alquilo arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, R4 es bencilo. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, R2es H y R3es H.
En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, V es -C(O)- o NRC (S)-.
FG es un grupo colorante fluorescente que emite luz en el espectro visible o en el espectro infrarrojo cercano. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, FG es un grupo colorante fluorescente que emite en el espectro infrarrojo cercano. Fg incluye cualquier átomo o conector adicional necesario para unir el grupo colorante fluorescente al resto del compuesto. Por ejemplo, grupos de unión que presentan alquilo, arilo, la combinación de alquilo y arilo, o grupos alquilo y arilo que presentan heteroátomos pueden estar presentes el grupo quelante, siempre que no interfieran con la fluorescencia del colorante. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, el grupo colorante fluorescente incluye un conector polietilenglicol. Varios grupos colorantes fluorescentes son conocidos en la técnica, y son fácilmente evidentes para un experto en la técnica. Varios fluorescentes están comercialmente disponibles con grupos activados usados para reacciones con las cadenas laterales de proteínas u otros compuestos.
Los ejemplos de compuestos fluorescentes que pueden formar toda la estructura o parte de la estructura de FG incluyen carbocianina, indocarbocianina, oxacarbocianina, tiacarbocianina merocianina, polimetina, coumarina, rodamina, xanteno, fluoresceína, y compuestos de boron-dipirrometano (BODIPY).
Ejemplos específicos de grupos colorantes fluorescentes incluyen los descritos en el documento WO 20089/109832.
Colorantes específicos que emiten en el espectro infrarrojo cercano incluyen compuestos comercialmente disponibles Cy5, Cy5,5, y Cy7, disponibles en GE Healthcare; VivoTag-680, VivoTag-S680, y VivoTag-S750, disponibles en VisEn Medical; AlexaFluor660, AlexaFluor680, AlexaFluor700, AlexaFluor750, y AlexaFluor790, disponible en Invitrogen; Dy677, Dy676, Dy682, Dy752, y Dy780, disponible en Dyonics; DyLight547, y Dylight647, disponible en Pierce; HiLyte Fluor 647, HiLyte Fluor 6 8 0 , y HiLyte Fluor 750, disponible en AnaSpec; IRDye 800CW, IRDye 800RS, y IRDye 700Dx , disponible en Li-Cor; y ADS780WS, ADS830WS, y ADS832WS, disponible en American Dye Source.
En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, FG es una estructura que se muestra a continuación.
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
Los compuestos ejemplares no cubiertos por la invención reivindicada incluyen los que se muestran a continuación.
Figure imgf000026_0001

Figure imgf000027_0001

Figure imgf000028_0001

Figure imgf000029_0001
Formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada incluyen compuestos que presentan la estructura
Figure imgf000029_0002
en la que Z es tetrazolio o CO2Q; cada Q se selecciona independientemente de entre hidrógeno o un grupo protector, a es 1,2, 3 o 4. Uno de A y A' es Ch y el otro es FG, en el que G es un grupo colorante fluorescente que emite en el espectro visible o en el espectro infrarrojo cercano y Ch es un grupo quelante de metal que opcionalmente incluye un metal quelado. R es cada uno independientemente H o alquilo C1-C4. V o V' son independientemente -C(O )-, NRC(O)-o -NRC(S)-. W es -NRC(O)-,NRC(O)NR-, NRC(S)NR-, -NRC(O)O-, -OC(O)NR-, -OC(O)-,-C(O)NR-, o -C(O)O--. Y es -C(O)-, NRC(O)-, -NRC(S)-, -OC(O)-. En las formas de realización ejemplares no cubiertas por la invención reivindicada m es 1, 2, 3, 4, 5, o 6; n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6; y g es 1, 2, 3, 4, 5 o 6; p es 0, 1, 2, o 3, y cuando p es 2 o 3, cada R1 puede ser el mismo o diferente. R1 es H, alquilo C1-C6, arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16. R2 y R3 son independientemente H, CO2H o CO2R4 , en el que R4 es alquilo C1-C6 , arilo C2-C12 o arilaquilo C4-C16; en el que cuando uno de R' y R' es CO2H o CO2R2, el otro es H. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, el grupo colorante fluorescente emite en el espectro del infrarrojo cercano. Algunas de las formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada incluyen además un metal quelado.
En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, el compuesto presenta la estructura que se muestra a continuación.
Figure imgf000029_0003
En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, el compuesto presenta la estructura que se muestra a continuación.
Figure imgf000029_0004
En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, el compuesto presenta la estructura que se muestra a continuación.
Figure imgf000030_0001
En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, el compuesto presenta la estructura que se muestra a continuación.
Figure imgf000030_0002
En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, p es 1, 2, o 3. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, p es 2. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, R1 es arilo C2-C12. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada R1 es fenilo.
En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, p es 0.
En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, R3es CO2H y R2 es H. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, R2es CO2H y R3 es H. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, R2 es CO2R4 y R3 es H. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, R3es CO2R4 y R2 es H. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, R4 es arilo C2-C12 o alquilo C4-C16. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, R4 es bencilo. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, R2es H y R3es H.
En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, V y V' son individualmente -C(O)- o -NRC(S)-. Esto significa que uno de V y V' puede ser -C(O)-, mientras que el otro es -NRC(S)-, o que ambos V y V' sean o bien -C(O)- o -NRC(S)-. Se determinarán V y V', en parte, por el tipo de FG y Ch usados.
FG es un grupo colorante fluorescente que emite en el espectro visible o en el espectro infrarrojo cercano. Los grupos colorantes fluorescentes ejemplares se han descrito anteriormente.
Ch es un grupo quelante de metal. Los grupos quelantes de metal adecuados se han descrito anteriormente. En algunas formas de realización el compuesto incluye además un metal quelado. La lista de metales ejemplares y sus isótopos se han descrito anteriormente.
Algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada presentan la estructura
Figure imgf000031_0001
Los ejemplos específicos de compuestos no cubiertos por la invención reivindicada incluyen las estructuras que se muestran a continuación.
Figure imgf000031_0002
Las formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada incluyen compuestos que presentan la estructura
Figure imgf000031_0003
en la que las subunidades asociadas con elementos p, q, r y s pueden estar en cualquier orden. Z es tetrazolio o CO2Q; cada Q se selecciona independientemente de entre hidrógeno o un grupo protector, y a es 1, 2, 3 o 4. R es cada uno independientemente H o alquilo C1-C4. En una forma de realización ejemplar no cubierta por la invención reivindicada r es 1. Tz es un grupo triazolio que presenta la estructura
Figure imgf000032_0001
en la que L1 es
Figure imgf000032_0002
L2 es
o
Figure imgf000032_0003
X1 es -NRC(O)-, -NRC(O)NR-, -NRC(S)NR-, o -NRC(O)O-; X2 es -C(O)NR-, -NRC(O)NR-, -NRC(S)NR-, o -OC(O)NR-; R5 es H, CO2 H, o CO2R6 en el que R6 es alquilo C1-C6, arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16; b es 1,2, 3, o 4; y d es 1, 2, 3, o 4. En formas de realización ejemplares no cubiertas por la invención reivindicada q es 0 o 1, W es -NRC(O)-, -NRC(O)NR-, NRC(S)NR-, -NRC(O)O-, -OC(O)NR-, -OC(O)-,-C(O)NR - o -C (O)O-; n es 1, 2, 3, 4, 5, o 6: y R2 y R3 son independientemente H, CO2H o CO2R4, en el que R4 es alquilo C1-C6 , arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16; en el que si uno de R2 y R3 es CO2H o CO2R2, entonces el otro es H. En formas de realización ejemplares no cubiertas por la invención reivindicada s es 0 o 1; Y es -C(O)-, -NRC(O)-, -NRC(S)-, -OC(O)-; y m es 1, 2, 3, 4, 5, o 6. En formas de realización ejemplares n o cubiertas por la invención reivindicada p es 0, 1, 2, 3, o 4, y cuando p es 2 o 3, cada R1 puede ser el mismo o diferente; y R1 es H, alquilo C1-C6, arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16. G1 es un grupo seleccionado de entre el grupo que consiste en
Figure imgf000032_0004
en el que Ch es un grupo quelante de metal, que incluye opcionalmente un metal quelado; FG es un grupo colorante fluorescente que emite en el espectro visible o en el espectro infrarrojo cercano; uno de A y A' es Ch y el otro es FG; V y V' son independientemente -C(O)-, -NRC(O)-, -n Rc (S)-, o -OC(O)-; y g es 1, 2, 3, 4, 5, o 6. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, el grupo colorante fluorescente emite en el espectro del infrarrojo cercano. Algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada incluyen un metal quelado. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada las subunidades asociadas con elementos p, q, y s están en el orden que se muestra. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, p es 0.
Algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada presentan la estructura que se muestra a continuación.
Figure imgf000032_0005
Algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada presentan la estructura que se muestra a continuación.
Figure imgf000033_0001
Algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada presentan la estructura que se muestra a continuación.
Figure imgf000033_0002
En algunas de las formas desveladas no cubiertas por la invención reivindicada Y es -C(O)-. En algunas de las formas desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, W es -NRC(O)-.
En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, p es 1, 2, o 3. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, p es 2. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, R1 es un arilo C2-C12. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, R1 es fenilo.
En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, p es 0.
En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, R3es CO2H y R2 es H. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, R2es CO2H y R3 es H. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, R2 es CO2R4 y R3 es H. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, R3es CO2R4 y R2 es H. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, R4 es arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, R4 es bencilo. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, R2es H y R3es H.
En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, V y V' son individualmente -C(O)- o -NRC(S)-.
FG es un grupo colorante fluorescente que emite luz en el espectro visible o en el espectro infrarrojo cercano. Los grupos colorantes fluorescentes ejemplares se han descrito anteriormente y se pueden usar en estas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada.
Ch es un grupo quelante de metal. Los grupos quelantes de metal adecuados se han descrito anteriormente. En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, el compuesto incluye además un metal quelado. La lista de metales ejemplares y sus isótopos se han descrito anteriormente y se pueden usar en estas formas de realización no cubiertas por la invención reivindicada.
Ejemplos de compuestos desvelados no cubiertos por la invención reivindicada incluyen las estructuras que se describen a continuación
Figure imgf000034_0001
Las formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada incluyen también los compuestos intermedios usados para preparar los compuestos de triazolio de acuerdo con las varias formas de realización de la divulgación. Las formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada incluyen compuestos que presentan la estructura
Figure imgf000034_0002
en la que las subunidades asociadas con elementos p, q, r y s pueden estar en cualquier orden. Z es tetrazolio o CO2Q; cada Q se selecciona independientemente de entre hidrógeno o un grupo protector, a es 1, 2, 3 o 4, y R es cada uno independientemente H o alquilo C1-C4. La variable q es 0 o 1. W es -NRC(O)-, -NRC(O)NR-, NRC(S)NR-, -NRC(O)O-, -OC(O)NR-, -OC(O)-,-C(O)NR-; o -C(O)O-; R2 y R3 son independientemente H, CO2H o CO2R4 , en el que R4 es alquilo C1-C6, arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16; en el que si uno de R2 y R3 es CO2H o CO2R2, entonces el otro es H; n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
La variable s es 0 o 1. Y es -C(O)-, -NRC(O)-, -NRC(S)-, -OC(O)-; y m es 1, 2, 3, 4, 5, o 6.
La variable p es 0, 1, 2, o 3, y cuando p es 2 o 3, cada R1 puede ser el mismo o diferente. R1 es H, alquilo C1-C6, arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16. G2 es
Figure imgf000035_0001
N3 o
Figure imgf000035_0002
En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, el compuesto presenta la estructura que se muestra a continuación.
Figure imgf000035_0003
En algunas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, el compuesto presenta la estructura que se muestra a continuación.
Figure imgf000035_0004
En algunas formas de realización desveladas de la divulgación, el compuesto presenta la estructura que se muestra a continuación.
Figure imgf000035_0005
Los ejemplos de la divulgación no cubiertos por la invención reivindicada incluyen los compuestos que se muestra a continuación.
Figure imgf000035_0006
Otras formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada incluyen sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en cualquiera de las formas de realización anteriores. Tal como se usa en el presente documento, “sales farmacéuticamente aceptables” se refiere a derivados de los compuestos descritos en los que el compuesto de partida se modifica mediante la preparación de sus sales ácidas o básicas no tóxicas. Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a sales ácidas orgánicas o minerales de residuos básicos como las aminas, sales orgánicas o alcalinas de residuos ácidos como los ácidos carboxílicos o similares. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales convencionales no toxicas o las sales de amonio cuaternario del compuesto de partida formado, por ejemplo, a partir de unos ácidos inorgánicos u orgánicos no tóxicos. Por ejemplo, las sales ácidas convencionales no toxicas incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos como el clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, fosfórico, nítrico y similares; y las sales preparadas a partir de ácidos orgánicos como acético, propiónico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, pamoico, maléfico, hidroximaleico, fenilacético, glutámico, benzoico, salicílico, mesílico, sulfanílico, 2-acetoxibenzoico, fumárico, toluensulfónico, metanosulfónico, etanodisulfónico, oxálico, isetiónico, HOOC-(CH2)n-COOH en la que n es 0-4 y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables desveladas no cubiertas por la invención reivindicada se pueden sintetizar a partir de un compuesto de partida que contiene un grupo básico o ácido mediante los procedimientos químicos convencionales. Generalmente, dichas sales se pueden preparar mediante la reacción de formas ácidas libres de los compuestos con una cantidad estequiométrica de la base adecuada (tales como hidróxido, carbonato, bicarbonato de Na, Ca, Mg o K y similares) o mediante la reacción de formas básicas libres de los compuestos con una cantidad estequiométrica del ácido adecuado. Dichas reacciones se llevan a cabo generalmente en agua o en un solvente orgánico, o en una mezcla de los dos. Generalmente, se usan medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo, cuando se pueden usar. Las listas de sales adicionales adecuadas se pueden encontrar, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, p. 1418 (1985).
Preparación
Los compuestos descritos en las formas de realización anteriores se pueden preparar usando los procedimientos conocidos en la técnica. En general, los materiales usados serán determinados por la estructura deseada, el tipo de enlace usado.
A veces, los compuestos se preparan mediante la adición secuencial de componentes a urea preformada, como los compuestos de Lisina-urea-glutamato descritos en Banerjee y col. (J. Med. Chem. vol. 51, pp. 4504-4517, 2008). Se pueden utilizar otros compuestos a base de urea como los bloques de construcción.
Los compuestos se ensamblan mediante la reacción entre diferentes componentes, para formar enlaces como urea (-NRC(O)NR-), tioureas (-NRC(S)NR-), amidas (-C(O)NR- o - NRC(O)-), o ésteres (-C(O)O- o -OC(O)-). Los enlaces de urea se pueden formar fácilmente mediante la reacción entre una amina y un isocianato, o entre una amina y una carboamida activada (-NRC(O)-). Las tioureas se pueden preparar fácilmente mediante la reacción de una amina con isotiocinato. Las amidas (-C(O)NR- o -NRC(O)-) se pueden preparar fácilmente mediante la reacción de una amina y ácidos carboxílicos o ésteres activados, como un haluro de acilo o éster de N-hidroxisuccinimida. Los ácidos carboxílicos también se pueden activar in situ, por ejemplo, con un reactivo de acoplamiento, como una carbodiimida, o carbonildiimidazol (CDI). Los ésteres se pueden formar mediante la reacción entre alcoholes y ácidos carboxílicos activados. Los triazolios se pueden preparar fácilmente mediante la reacción de una azida y un alquino, opcionalmente en presencia de cobre (Cu) catalizador.
Se pueden usar los grupos protectores, si es necesario, para proteger los grupos reactivos mientras los compuestos se están ensamblando. Los grupos protectores adecuados, y su eliminación, serán fácilmente disponibles para un experto en la técnica.
De este modo, los compuestos se pueden preparar fácilmente a partir de bloques de construcción individuales, como unas aminas, ácidos carboxílicos y aminoácidos.
A veces, el grupo Ch o FB es coloca en el compuesto mediante la adición de un grupo quelante de metal o un colorante fluorescente al compuesto hacia el final de una síntesis, por ejemplo, mediante la reacción de una amina reactiva en el compuesto con un grupo quelante de metal activado o un colorante fluorescente. En la técnica se conocen una amplia variedad de grupos quelantes de metales y colorantes fluorescentes, con unos grupos funcionales activados mediante la reacción con aminas. El tipo de grupo quelante de metal será determinado, en parte por el metal deseado. La selección de un grupo quelante de metal para un átomo de metal particular será evidente para un experto en la técnica. El colorante fluorescente usado se determinará, en parte, por la longitud de onda de fluorescencia deseada, y puede ser seleccionado fácilmente por un experto en la técnica.
Los procedimientos para los compuestos específicos se describen en los Ejemplos siguientes. Se pueden preparar otros compuestos dentro del alcance de las reivindicaciones usando modificaciones fácilmente evidentes de estos procedimientos.
Usos
Se ha explicado que los compuestos descritos anteriormente, incluido varios compuestos radio-marcados, se pueden utilizar con fines de diagnóstico, de diagnóstico por la imagen o terapéuticos. En general, la adecuación de un radioisótopo particular para un fin particular (es decir, diagnóstico por la imagen o terapéutico) se entenderá mejor en la técnica. Otras formas de realización ejemplares son compuestos usados como precursores de compuestos radiomarcados en los que un metal o isótopo radioactivo de un metal se puede añadir al compuesto. Algunos compuestos de acuerdo con la invención son productos intermedios para la formación de otros compuestos del a invención.
Estudio por la imagen
Las formas de realización de la invención incluyen compuestos de la invención para el uso de procedimientos de diagnóstico por la imagen de una o más células, órganos o tejidos mediante la exposición de las células o mediante la administración a un sujeto de una cantidad eficaz de un compuesto con un marcador isotópico adecuado para el diagnóstico por la imagen. En algunas de las formas de realización, el uno o más órganos o tejidos incluyen tejido de próstata, tejido de riñón, tejido de cerebro, tejido vascular o tejido tumoral. Las células, órganos o tejidos se pueden visualizar mientras están dentro del organismo, a través de un estudio por la imagen de cuerpo completo o por diagnóstico por la imagen intraoperatorio, o se pueden extirpar del organismo para el diagnóstico por la imagen.
En otra forma de realización, los procedimientos de diagnóstico por es adecuado para los estudios por la imagen de inhibidores de PSMA, por ejemplo, mediante el estudio de unión competitiva de los inhibidores no radio-marcados. En otra forma de realización, el procedimiento de diagnóstico por la imagen es adecuado para el diagnóstico por la imagen de cáncer, un tumor o un neoplasma. En otra forma de realización más, el cáncer se selecciona de entre cáncer ocular, cáncer rectal, cáncer de colon, cáncer cervical, cáncer de próstata, cáncer de mama y cáncer de vejiga, cáncer oral, tumores benignos y malignos, cáncer de estómago, cáncer hepático, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, de útero, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer renal, cáncer de cerebro (por ejemplo, gliomas), cáncer de garganta, melanoma cutáneo, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielogénica aguda, sarcoma de Ewing, sarcoma de Kaposi, carcinoma de células basales y carcinoma de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, coriocarcinoma, rabdomiosarcoma, angiosarcoma, hemangioendotelioma, Tumor de Wilms, neuroblastoma, cáncer de boca/faringe, cáncer de esófago, cáncer de laringe, linfoma, neurofibromatosis, esclerosis tuberosa, hemangiomas, y linfangiogénesis.
Los compuestos de la invención para el uso en procedimientos de diagnóstico por la imagen de la invención son adecuados para el estudio por la imagen de cualquier proceso fisiológico o característica en la que está implicado en PSMA. Generalmente, los procedimientos de diagnóstico por la imagen son adecuados para la identificación de áreas de tejidos o diana que expresan unas concentraciones elevadas de PSMA. Las aplicaciones habituales incluyen el estudio por la imagen de la neurotransmisión glutamatérgica, la neurotransmisión glutamatérgica pre-sináptica, tumores malignos o cánceres que expresan PSMA; cáncer de próstata (incluyendo el cáncer de próstata metastatizado) y la angiogénesis. Esencialmente todos los tumores sólidos que expresan PSMA en la neovascularización. Por lo tanto, los compuestos de la invención para el uso en procedimientos de la presente invención se pueden usar para visualizar casi todos los tumores sólidos incluyendo pulmón, células renales, glioblastoma, páncreas, vejiga, sarcoma, melanoma, mama, colon, células germinales, feocromocitoma, esófago y estómago. También se pueden visualizar determinadas lesiones y tejidos benignos incluyendo endometrio, schwanoma y esófago de Barrett de acuerdo con la presente invención.
Los compuestos de la invención para el uso en procedimientos para el estudio por la imagen de la angiogénesis con adecuados para el uso para el estudio por la imagen de variedad de enfermedades y trastornos en los que tiene lugar una angiogénesis. Los ejemplos ilustrativos, no limitantes incluyen tumores, enfermedad vascular del colágeno, cáncer, infarto, malformaciones vasculares y retinopatía. Los compuestos de la invención para su uso en procedimientos para el estudio por la imagen de la angiogénesis son adecuados para el uso en el diagnóstico y la observación del desarrollo de tejido normal.
El PSMA se expresa frecuentemente en células endoteliales de los vasos capilares en las áreas peritumorales y endotumorales de varias patologías malignas como los compuestos de la invención y compuestos de la invención para el uso en procedimientos de estudio por imagen que utilizan el mismo son adecuados para el diagnóstico por la imagen de dichas patologías malignas.
En ciertas formas de realización, el compuesto radiomarcado es estable in vivo.
En ciertas formas de realización, el compuesto radiomarcado es detectable por Tomografía por emisión de positrones (PET) o tomografía por emisión de fotón único (SPECT).
En algunas formas de realización, el sujeto es un humano, una rata, un ratón, un gato, un perro, un caballo, una oveja, una vaca, un mono, un ave o un anfibio. En otras formas de realización, las células son in vivo o in vitro. Los sujetos habituales a los cuales se pueden administrar los compuestos de la invención serán mamíferos, particularmente primates, especialmente humanos. Para las aplicaciones veterinarias, será adecuada para una amplia variedad de sujetos, por ejemplo, animales de granja como reses, ovejas, cabras, vacas, cerdos y similares, aves de corral como gallinas, patos, gansos, pavos y similares; y animales domésticos particularmente mascotas como perros y gatos. Para aplicaciones en diagnóstico o investigación, una gran variedad de mamíferos será sujetos adecuados incluyendo los roedores (por ejemplo, ratones, ratas y hámster), conejos, primates, y cerdos como los cerdos endogámicos y similares. Además, para aplicaciones in vitro, como aplicaciones in vitro para diagnóstico e investigación, muestras de fluidos corporales y células de los sujetos descritos anteriormente serán adecuados para el uso como mamíferos, particularmente primates como muestras de tejido humano, de sangre, de orina, de orina-sangre o muestras de tejido de los animales mencionados para las aplicaciones veterinarias. En otras aplicaciones in vitro, las células o tejidos está presentes en cultivo o en suspensión.
Los agentes para el estudio por la imagen de la invención para su uso según la invención se pueden utilizar de acuerdo con los procedimientos de la invención desvelados en el presente documento por un experto en la técnica. Las imágenes se pueden generar en virtud de la distribución espacial de los agentes de estudio por la imagen que se acumulan en un sitio cuando entran en contacto con PSMA. La distribución espacial se puede medir usando los medios adecuados para el marcado particular, por ejemplo, una cámara gamma, un aparato para PET, un aparato para SPECT, una cámara de fluorescencia y similares. La extensión de la acumulación del agente para el estudio por la imagen se puede cuantificar usando los procedimientos conocidos para cuantificar emisiones radioactivas. Los enfoques de estudio por la imagen particularmente útiles emplean más de un agente para el estudio por la imagen, o un agente bimodal que presenta un grupo colorante fluorescente o un grupo quelante de metal, tales como los descritos anteriormente, para realizar unos estudios simultáneos.
En general, una cantidad efectiva detectable del agente para el estudio por la imagen se administra a un sujeto. Tal como se utiliza en el presente documento, “una cantidad efectiva detectable” del agente para el estudio por la imagen se define como una cantidad suficiente para obtener una imagen aceptable usando un equipo que está disponible para uso clínico. Una cantidad efectiva detectable del agente para el estudio por la imagen se debe administrar en más de una inyección. La cantidad efectiva detectable del agente para el estudio por la imagen puede variar de acuerdo a factores como el grado de susceptibilidad del individuo, la edad, el sexo, el peso del individuo, las respuestas idiosincráticas del individuo y la dosimetría. Las cantidades efectivas detectables del agente para el estudio por la imagen pueden variar también de acuerdo con instrumento y factores relacionados con la película. La optimización de dichos factores está al alcance del experto en la técnica. La cantidad del agente usada para fines diagnósticos y la duración del estudio por la imagen dependerán del radionúclido usado para marcar el agente, la masa corporal del paciente, la naturaleza y la gravedad de la enfermedad que se trata, la naturaleza de los tratamientos terapéuticos a los que debe someterse el paciente, y las respuestas idiosincráticas del paciente. Por último, el médico responsable decidirá la cantidad del agente para el estudio por la imagen que se administra a cada paciente individual y la duración del estudio por la imagen.
En algunas formas de realización, los compuestos de la invención para su uso son secretados de los tejidos corporales rápidamente para evitar una exposición prolongada de la radiación del compuesto radio-marcado administrado al paciente. Generalmente, los compuestos de la invención para su uso son secretados de los tejidos del cuerpo de forma suficientemente lenta para permitir el tiempo suficiente para el estudio por la imagen u otros usos.
Habitualmente, los compuestos para su uso de la invención se eliminan del cuerpo en menos de 24 horas. Más habitualmente, los compuestos de la invención se eliminan del cuerpo en menos de 16 horas, 12 horas, 8 horas, 6 horas, 4 horas, 2 horas, 90 minutos o 60 minutos. Los compuestos ejemplares de la invención para su uso se eliminan entre aproximadamente 60 minutos y aproximadamente 120 minutos.
En algunas formas de realización de la invención, los compuestos de la invención para su uso se han diseñado para aumentar la absorción en células PSMA positivo (es decir, células tumorales). Por ejemplo, los compuestos altamente hidrófilos se pueden excitar rápidamente. Los compuestos con una hidrofilidad elevada, como los compuestos que tiene conectores hidrófilos, pueden tener unos tiempos de circulación mayores, por lo tanto, proporcionan un suministro más prolongado de marcador que se une a las células, De acuerdo con las formas de realización para su uso según la invención, la hidrofilidad se puede aumentar, cuando, por ejemplo, R2 o R3 es CO2R4.
Usos terapéuticos
Las formas de realización de la invención incluyen los compuestos de la invención para el uso en procedimientos para el tratamiento de un tumor que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto, en el que el compuesto incluye un radioisótopo terapéuticamente eficaz. El desarrollo de agentes radioterapéuticos de bajo peso molecular es muy diferente de los radiofármacos desarrollado para el diagnóstico por la imagen en los que unos tiempos de residencia en el tumor superiores pueden importante por lo anterior.
En algunas formas de realización, las células tumorales pueden expresar PSMA, como las células tumorales de próstata o células tumorales de próstata metastatizados. En otras formas de realización, un tumor puede ser tratado tomando como diana las células próximas o adyacentes que expresan PSMA. Por ejemplo, células vasculares que sufren angiogénesis asociada con el tumor que se tomará como diana. Esencialmente todos los tumores sólidos expresan PSMA en la neo-vascularización. Por consiguiente, los compuestos de la invención para su uso en procedimientos de tratamiento de los tumores sólidos incluyendo pulmón, células renales, glioblastoma, páncreas, vejiga, sarcoma, melanoma, mama, colon, células germinales, feocromocitoma, esófago y estómago. También se pueden tratar ciertas lesiones y tejidos benignos incluyendo endometrio, schwanoma y esófago de Barrett con los compuestos para su uso de acuerdo con la presente invención. Los ejemplos de radioisótopos terapéuticamente eficaces incluyen Y90, Lu177, Re186, Re188, Cu67, Ac225, Bi213, Bi212, Ga67, In111, Sm153, Pb212, I131
Clasificación de células
Las formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada incluyen procedimientos para la clasificación de las células mediante la exposición de las células a un compuesto tratado anteriormente, en el que el compuesto incluye un grupo colorante fluorescente, seguido por la separación de células que están unidas al compuesto de las células que no están unidas al compuesto.
Los compuestos fluorescentes descritos anteriormente se unen al PSMA en células que expresan PSMA en la superficie celular, En ajunos casos, el compuesto fluorescente se internaliza. Las células que se unen al compuesto fluorescente aparecen fluorescentes, y se pueden visualizar usando un microscopio de fluorescencia. Se puede usar la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o la citrometría de flujo para separar las células PSMA positivas de las células PSMA negativas.
Mapeo intraoperatorio del tumor
Las formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada incluyen procedimientos para el mapeo intra-operatorio del tumor o el fotodiagnóstico intraoperatorio (PDD) mediante la administración de una cantidad eficaz de un compuesto tratado anteriormente a un sujeto, en el que el compuesto incluye un grupo colorante fluorescente. De acuerdo con dichas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, una cantidad eficaz de un compuesto es una cantidad suficiente para producir un nivel detectable de fluorescencia cuando se usa para el mapeo intraoperatorio del tumor o el PDD. Los compuestos se unen a, o se pueden internalizar en, células, particularmente células tumorales, que expresan PSMA. Los compuestos fluorescentes definen de este modo las uniones del tumor, lo que permite una extracción quirúrgica precisa. Los compuestos que incluyen un grupo colorante fluorescente se pueden usar también para visualizar células tumorales circulantes que expresan PSMA.
Composiciones farmacéuticas y sus kits
Los compuestos tratados anteriormente se pueden formular en varias composiciones, para su uso en procedimientos de diagnóstico, estudio por la imagen o tratamiento terapéutico. Las composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) se pueden ensamblar como un kit. Generalmente, una composición farmacéutica comprende una cantidad eficaz (por ejemplo, cantidad farmacéuticamente eficaz o cantidad eficaz detectable) de un compuesto descrito anteriormente.
Una composición desvelada no cubierta por la invención reivindicada se puede formular como una composición farmacéutica, que comprende un compuesto de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por un “vehículo farmacéuticamente aceptable” se entiende un material que no es biológicamente o de otro modo indeseable, es decir, el material se puede administrar a un sujeto sin producir ningún efecto biológico indeseable o interactuar de manera nociva con cualquiera de los otros componentes de la composición farmacéutica en la que está contenido. El vehículo se puede seleccionar naturalmente para reducir cualquier degradación del ingrediente activo y para reducir cualquier efecto adverso en el sujeto, como debería ser conocido por el experto en la técnica. Para una discusión de los vehículos farmacéuticamente aceptables y otros componentes de las composiciones farmacéuticas, ver por ejemplo Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, 1990. Algunos vehículos farmacéuticos adecuados se harán evidentes para el experto en la materia e incluyen, por ejemplo, agua (incluyendo agua estéril y/o desionizada), tampones adecuados (como PBS), suero fisiológico, medio de cultivo celular (como DMEM), líquido cefalorraquídeo artificial, o similares.
Una composición farmacéutica o kit desvelados no cubiertos por la invención reivindicada pueden contener otros fármacos, además del compuesto. Los otros agentes se pueden administrar en tiempo adecuado durante el tratamiento del paciente, ya sea de forma simultánea o de forma secuencial.
Un experto en la técnica entenderá que la formulación particular dependerá, en parte, del agente particular que se emplea, y la vía de administración seleccionada. Por consiguiente, existe una gran variedad de formulaciones adecuadas de composiciones de la presente divulgación.
Un experto en la técnica entenderá que la formulación adecuada o apropiada se puede seleccionar, adaptar o desarrollar en base a la aplicación particular disponible. Las dosificaciones para las composiciones de la divulgación no cubiertas por la invención reivindicada pueden ser en formas farmacéuticas unitarias. El término “forma farmacéutica unitaria” tal como se utiliza en el presente documento se refiere a unidades físicamente separadas adecuadas como formas farmacéuticas unitaria para sujetos animales (por ejemplo, humanos), cada unidad que contiene una cantidad predeterminada de un agente de la invención, sólo o en combinación con otros agentes terapéuticos, calculada en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado en asociación con un diluyente, cargador o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Un experto en la técnica puede determinar fácilmente la dosis, la pauta y el procedimiento de administración adecuado para la formulación exacta de la composición que se usa, con el fin de conseguir la cantidad eficaz deseada o la concentración eficaz del agente para el paciente individual.
La dosis de una composición de la divulgación no cubierta por la invención reivindicada, administrada a un animal, particularmente un humano, en el contexto de la presente invención debería ser suficiente para producir por lo menos una cantidad detectable para una respuesta de diagnóstico o terapéutica en el individuo durante un intervalo de tiempo razonable. La dosis usada para conseguir el efecto deseado se determinará por una variedad de factores, incluyendo la potencia del agente particular que se va a administrar, la farmacodinamia asociada al agente en el huésped, la gravedad del estado de la enfermedad de los individuos infectados, otros medicamentos se pueden administrar al sujeto, etc. El tamaño de la dosis también se administrará por la existencia de cualquier efecto adverso que puede acompañar el agente particular, su composición, empleada. Resulta generalmente deseable, siempre que sea posible, mantener los efectos adversos al mínimo. La dosis del material biológicamente activo variará, las cantidades adecuadas de cada agente particular será evidente para un experto.
Otras formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada proporcionan kits que incluyen un compuesto según la invención. En ciertas formas de realización de la divulgación no cubiertas por la invención reivindicada, el kit proporciona unas composiciones farmacéuticas empaquetas que presentan un vehículo farmacéuticamente aceptable y un compuesto de la invención. En algunas formas de realización de la divulgación no cubiertas por la invención reivindicada la composición farmacéutica empaquetadas incluirá los precursores de reacción necesarios para generar el compuesto de la invención en combinación con un radionúclido. Otras composiciones farmacéuticas empaquetadas proporcionadas por la presente divulgación pero no cubiertas por la invención reivindicada comprenden además indicios de que comprende por lo menos uno de: instrucciones para la preparación de compuestos de acuerdo con la invención a partir de precursores proporcionados, instrucciones para el uso de la composición para visualizar células o tejidos que expresan PSMA, o instrucciones de uso de la composición para visualizar la neurotransmisión glutamatérgica en pacientes que padecen un trastorno relacionado con el estrés, o instrucciones para el uso de la composición para visualizar el cáncer de próstata.
En determinadas formas de realización desveladas no cubiertas por la invención reivindicada, un kit de acuerdo a la divulgación contiene desde aproximadamente 1 mCi hasta aproximadamente 30 mCi del agente de estudio por la imagen marcado con radionúclido descrito anteriormente, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptables. El agente de estudio por la imagen y el vehículo se pueden proporcionar en solución o en forma liofilizada. Cuando el agente de estudio por la imagen y el vehículo del kit están en forma liofilizada, el kit puede contener opcionalmente un medio de reconstitución estéril y fisiológicamente aceptable como agua, solución salina, solución salina tamponada y similares. El kit puede proporcionar un compuesto de la invención en forma de solución o liofilizado, y estos componentes del kit de la divulgación puede contener opcionalmente estabilizantes como NaCl, silicato, tampones fosfato, ácido ascórbico, ácido gentísico y similares. La estabilización adicional de los componentes del kit se puede proporcionar en esta forma de realización desvelada no cubierta por la invención reivindicada, por ejemplo, proporcionando un agente reducto en forma resistente a la oxidación. La determinación y optimización de dichos estabilizantes y procedimientos de estabilización son bien conocidos por el experto en la técnica.
Un “vehículo farmacéuticamente aceptable” se refiere a una solución biocompatible, que contiene debido a su esterilidad, p[Eta], isotonicidad, estabilidad y similares y puede incluir cualquiera y todos los solventes, diluyentes (incluyendo solución salina, inyección de cloruro sódico, inyección de Ringer, inyección de glucosa, inyección de cloruro sódico y glucosa, inyección de Ringer lactado y otras soluciones acuosas tamponadas), medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, y similares. El vehículo farmacéuticamente aceptable también puede contener estabilizantes, conservantes, antioxidantes u otros aditivos, que son bien conocidos por el experto en la técnica y otro vehículo como los conocidos en la técnica.
La invención y la manera y el proceso de preparación y de uso, se describen de unos términos tan completos, claros, concisos y exactos de modo que permiten a cualquier persona experta en la técnica a la que pertenece, preparar y usar la misma.
Se pretende, por lo tanto, que la invención se defina a través del alcance de las reivindicaciones que siguen y dichas reivindicaciones se deben interpretar lo más ampliamente que sea razonable.
Se entiende que lo siguiente describe unas formas de realización ejemplares de la presente invención y que se pueden realizar modificaciones de las mismas sin alejarse del alcance de la presente invención como se presenta en las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos
La presente invención se ilustra más mediante los ejemplos siguientes que no se deben construir/tomar como limitantes en ningún modo.
Ejemplo 1 (no de acuerdo con la invención)
Ácido 2-{3-[5-(7-{5-[4-(2-Amino-2-carboxi-etil)-[1, 2,3] triazolio-1-il]-1-carboxipentilcarbamoil}-heptanoilamino)-1-carboxi-pentil]-ureido}-pentanodioico, compuesto SRV32. El compuesto SRV32 se prepara en tres etapas siguiendo el esquema descrito a continuación.
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El ejemplo 1 se preparó a partir del procedimiento de la bibliografía (Banerjee y col., J Med Chem, vol. 51, pp. 4504­ 4517, 2008). Se añade a una solución del compuesto 1 (100 mg, 0,107 mmol en 5 ml DMF) H-Lys(£-azida)-OH (20 mg, 0,107 mmol) (Boc-Lys(Azida)-OH se adquirió de Anaspec. La extracción del grupo Boc se llevó a cabo mediante el tratamiento del compuesto de comercial con TFA/CH2CH21:1 a temperatura ambiente durante 4 horas y la solución se agitó durante 16 horas a T. amb. El disolvente se extrajo al vacío. El residuo sólido obtenido de este modo se disolvió en 10 ml de acetato de etilo y se extrajo con 3 x 10 ml de agua. La capa orgánica se secó al vacío para obtener un sólido incoloro como compuesto de urea protegido por el grupo azido SRV25. ESIMS: 991 [M+1]+.Se añadió N(a)-Boc-L-propargilglicina (Anaspec) (14 mg, 0,012 mmol en 1 ml de t-BuOH) al compuesto SRV25 (60 mg, 0,06 mmol en 1 ml t-BuOH), seguido de Cu(OAc).H2 O2 (2 mg, 0,012 mmol en 1 ml de agua) y ascorbato sódico (4.75 mg, 0,024 mmol en 1 ml agua) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 72 horas. El producto se extrajo en CH2Cl2 y se lavó do veces con NaCl acuoso. Las fases acuosas se re-extrajeron con CH2Cl2. Las fases orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na2SO4 y se evaporó. El producto, compuesto SRV29, se purificó mediante una columna pipeta de gel de sílice eluida con una solución de CH2Ch/MeOH 90/10. ESIMS: Calculado para C60H82N8O18 1203,57, encontrado 1204[M+1]+.
El compuesto SRV29 se disolvió en 2 ml de CHCl3/TFA 1:1 y se agitó durante toda la noche. La solución se extrajo al vacío para obtener un sólido incoloro. El sólido se lavó 3 veces con 5 ml de CH2Cl2 para eliminar impurezas. El sólido crudo, compuesto SRV32 se purificó más mediante HPLC usando una mezcla agua/acetonitrilo 85/15 (TFA 0,1% en cada uno) a una velocidad de flujo de 4 ml, Rt = 10,0 min. ESMS: 742,77[M+1]+, RMN NMR H1 (D2O) 8: 7,46(M, 1H), 5,2(m, 2H) 4,35(m, 1H), 4,26(m, 1H), 4,18(m, 1H), 3,80-3,70(m, 1H), 3,18(t, J = 6 Hz, 2H), 2,69(m, 2H), 2,51(t, J = 7,6 Hz, 2H), 2,40-2,18(m, 25H).
El radiomarcado con Tc-99m se realizó mediante el mismo procedimiento descrito anteriormente (Banerjee y col., J Med Chem, vol. 51, pp. 4504-4517, 2008).
Biodistribución y estudio por la imagen
Se inyectó por vía intravenosa el compuesto Tc99m-SRV32 en solución salina un solo ratón SCID implantado con un xenoinjerto tanto con PC-3 PIP (PSMA+) y PC-3 flu (PSMA-). A las 0,5 horas, 1 hora, 2 horas y 5 horas post-inyección se anestesió el ratón con isoflurano y se mantuvo bajo isoflurano al 1% en oxígeno. El ratón se colocó en la abertura del X-SPECT (Gamma Medica, Northridge, CA) y se escaneó usando dos colimadores con orificios de alta resolución de baja energía (Gamma Medica) en rotación a través de 360 1 en 6 incrementos durante 45 segundos cada incremento. Todas las imágenes gamma se reconstruyeron usando el software Lumagen (Gamma Medica, Northridge, CA). Inmediatamente después de la adquisición por SPECT, el ratón se sometió a escaneo por TC (X-SPECT) sobre un campo de vista de 4,6 cm usando un haz de 600 pA, 50 kV. Los datos de SPECT y TC se co-registraron usando el software del proveedor (Gamma Medica, Northridge, CA) y se mostraron usando AMIDE (http://amide.sourceforge.net/). Los datos se reconstruyeron usando el algoritmo Ordered Subsets-Expectation Maximization (OS-EM).
Se midió la biodistribución en los tejidos. Los resultados se resumen en la tabla siguiente. Tc99m-SRV32 mostró una absorción elevada (~7% Id/g a los 30 minutos), y un buen aclaramiento de los tejidos que no son dianas.
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Se inyectó por vía intravenosa el compuesto Tc99m-SRV32 en solución salina un solo ratón SCID implantado con un xenoinjerto con LNCaP PSMA+. A las 0,5 horas y 3,5 horas post-inyección se anestesió el ratón con isoflurano y se mantuvo bajo isoflurano al 1% en oxígeno. El ratón se colocó en la abertura del X-SPECT (Gamma Medica, Northridge, CA) y se escaneó usando dos colimadores con orificios de alta resolución de baja energía (Gamma Medica) en rotación a través de 360 1 en 6 incrementos durante 45 segundos cada incremento. Todas las imágenes gamma se reconstruyeron usando el software Lumagen (Gamma Medica, Northridge, CA). Inmediatamente después de la adquisición por SPECT, el ratón se sometió a escaneo por TC (X-SPECT) sobre un campo de vista de 4,6 cm usando un haz de 600 pA, 50 kV. Los datos de SPECT y TC se co-registraron usando el software del proveedor (Gamma Medica, Northridge, CA) y se mostraron usando AMIDE (http://amide.sourceforge.net/). Los datos se reconstruyeron usando el algoritmo Ordered Subsets-Expectation Maximization (OS-EM). Las imágenes se muestran en la Figura 1.
Ejemplo comparativo 1
Bajo las mismas condiciones, se determinó la adquisición del tumor para el compuesto Tc99m -L1, mostrado a continuación. Los resultados se resumen en la tabla siguiente. Los datos muestran que mientras Tc99m -L1 muestra una buena retención, el compuesto Tc99m-SRV32 presenta una retención superior in vivo tanto para el tumor diana como para los tejidos que no son diana, y una retención CI inferior que el compuesto Tc99m -L1 anterior a los tiempos iniciales.
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Ejemplo 2- Compuestos de Ga68
General
Los solventes y los productos químicos obtenidos de fuentes comerciales poseían un grado analítico o superior y se usaron sin una purificación adicional. Todos los experimentos se realizaron por duplicado o triplicado para asegurar la reproductibilidad. Se llevó a cabo una cromatografía de capa fina analítica (TLC) usando un gel de sílice de 0,2 mm con dorso de aluminio Z19, 329-1 placas y se visualizó mediante luz ultravioleta (254 nm), 12 y ninhidrino al 1% en EtOH. La cromatografía Flash se realizó usando un gel de sílice obtenido de Bodman (Aston pA), MP SiliTech 32-63 D 60 A. El espectro de RMN H1 se grabó en un espectrómetro Varian Mercury 400 MHz o en un Bruker ultrashieldTM 400 MHz. Los desplazamientos químicos (8) se indican en ppm campo abajo en referencia a las resonancias de protón que resultan de la deuteración incompleta del disolvente de RMN. Los espectros de masa ESI de baja resolución se obtuvieron en espectrómetro Bruker Daltonics Esquire 3000 Plus. Los espectros de masa FAB de resolución-superior se obtuvieron en un espectrómetro de masa JOEL JMS-AX505HA en las instalaciones de espectrómetro de masa de la Universidad Notre Dame. La rotación óptica se midió en un polarímetro Jasco P-1010. Los espectros infrarrojos se obtuvieron en un espectrómetro Bruker Tensor 27. La purificación por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de los nuevos compuestos se realizó usando una columna Phenomenex C 18 Luna 10x 250 mm23en un sistema en un sistema CL Waters 600E Delta con un detector de UV/Vis de absorbencia tunable Waters 486, ambos controlados por un software Empower.
Para la purificación del [Ga68]SRV100, se usó una columna Varian Microsorb-Mv C18 250 x 4,6 mm2. La HPLC se realizó usando las condiciones isocráticas siguientes: para el Procedimiento 1, la fase móvil era 80% de solvente A (TFA 0,1% en agua) y 20% de solvente B (TFA 0,1% en CH3CN), velocidad de flujo de 4 ml/min; para el Procedimiento 2, la fase móvil era 80% de solvente y 20% de solvente B, velocidad de flujo de 1 ml/min. El Procedimiento 1 se usó para la purificación de los compuestos SRV27 (no de acuerdo con la invención), [Ga 69/71]SRV27 (no de acuerdo con la invención), SRV100, [Ga 69/71]SRV100 y [Ga 68]SRV27 (no de acuerdo con la invención).
Para la purificación del [Ga68]SRV100 se usó el Procedimiento 2. Para la purificación radiosintética, se realizó una HPLC en un Varian Prostar System (Palo Alto, CA), equipado con un modelo de detector de absorbancia UV 490 y un detector Bioscan Nal scintillation conectado a un sistema de recuento de flujo Bioscan controlado por un softWare Empower.
Radioquímica
El protocolo de marcado con Ga68 del compuesto SRV27 (no de acuerdo con la invención) se llevó a cabo siguiendo un procedimiento de la bibliografía (Zhernosekov y col., J Nucl Med, vol. 48, pp. 1741-1748, 2007). Se proporciona una descripción detallada a continuación.
1. 1,32 mCi de Ga68 en 7 ml de HCl 0,1 N se obtuvieron a partir de un generador 740-MBq de un año de antigüedad. La solución se transfirió a un cartucho de intercambio de cationes, tubos Phenomenex Strata-X-C (resina de intercambio de cationes fuerte 33 pm, parte n.° 8B-S029-TAK, 30 mg/ lml).
2. La columna se eluyó con 5 ml de una solución 20/80 de ácido clorhídrico 0,10 N/acetona. El eluyente restante se extrajo en el intercambiador de cationes mediante el paso de nitrógeno. Estos dos procesos tienen como objetivo eliminar la mayor parte de las impurezas químicas y radioquímicas remanentes de la resina, mientras el Ga68debe permanecer cuantitativamente en la columna.
3. La columna se rellena con 150 ul de una solución 2,4/97,6 HCl 0,05 N/acetona. Mantenerlo aproximadamente 2 minutos resultó ser lo mejor para la completa desorción del Ga68 (III) de la resina hacia la fase líquida. Se aplicaron 250 pL adicionales de esta mezcla, y se obtuvo el Ga68 (III) purificado en 400 pL de eluyente total.
4. La fracción (400 pL de eluyente) se utilizó directamente para el marcado del compuesto urea-DOTA. La actividad procesada se añadió a 500 pL de H2O pura en un vial de reactivo de vidrio estándar que contiene 100 pl (92 nmol, solución 1 mg/ml) de ligando. No se añadió solución tampón. El vial de la reacción se calentó a 95 °C durante 10 minutos. La complejación se supervisó mediante la inyección de alícuotas de 100 pl (210 pCi) de la solución en HPLC. El producto obtenido = 160 pCi. El rendimiento radioquímico = (160/210) x 100 = 76,19% (sin corrección de decaimiento). El sistema de solvente 80/20 agua/acetonitrilo (TFA 0,1% en cada uno), Rt(tiempo de retención) = 25 minutos para el compuesto y Rt = 19 minutos para el ligando libre. El producto obtenido = 5,92 MBq. Para [Ga 68]SRV27 (no de acuerdo con la invención), rendimiento radioquímico: 76,2% (sin corrección de decaimiento). La HPLC se realizó mediante el Procedimiento 1 como se ha descrito en la sección experimental General. Rt = 25 minutos para el producto deseado y Rt = 19 minutos para el ligando libre. Par [Ga 68]SR100, rendimiento radioquímico: 70%. La HPLC se realizó mediante el Procedimiento 2 como se ha descrito en la sección experimental General. Rt = 55 minutos para el producto deseado y Rt = 16 minutos para el ligando libre.
Líneas celulares y modelos de tumores
Las líneas celulares PC-3 PIP (PSMA+) y PC-3 flu (PSMA-) se obtuvieron del Dr. Warren Heston (Cleveland Clinic) y se mantuvieron como se ha descrito anteriormente Mease y col., Clin Cancer Res, vol. 14, pp. 3036-3043, 2008). Las células LNCaP se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y se mantuvieron según las directrices de la ATCC. Todas las células se hicieron crecer hasta el 80-90% de confluencia antes de la trispsinización y la formulación en una solución de sal equilibrada de Hank (HBSs, Sigma, St Louis, MO) para la implantación en los ratones.
Los estudios en animales se llevaron a cabo cumpliendo con las directrices institucionales relacionadas con la realización de experimentos animales. Para los estudios de biodistribución de [Ga 68]SRV27 (no de acuerdo con la invención) y [Ga 68]SRV100 y el estudio por la imagen de [Ga 68]SRV100, ratones macho SCID (NCI) fueron implantados subcutáneamente con 1-5 x 106 células PC-3 PIP PSMA+ y PC-3 flu PSMA- detrás de cada hombro. Para los estudios por la imagen [Ga 68]SRV27 (no de acuerdo con la invención), ratones macho SCID (NCI) fueron implantados subcutáneamente con 5 x 106 células LNCaP detrás de cada hombro. Se capturaron imágenes de los ratones o se usaron estudios de bidodistribución cuando los xenoinjertos de tumores alcanzaron 3-5 mm de diámetro.
Síntesis de SRV27 (no de acuerdo con la invención)
Ácido 2-{3-[5-(7 1-Benciloxicarbonil-5-[2-(4,7,10-tris-carboximetil-1,4,7,10tetraazaciclododec-1- il)-acetilamino]-pentilcarbamoil}-heptanoilamino)-1-carboxi-pentil]-ureido}-pentanodioico, compuesto SRV27. El compuesto SRV27 se prepara en tres etapas siguiendo el esquema siguiente.
Figure imgf000044_0001
El compuesto 1 se preparó de acuerdo con el procedimiento de la bibliografía (Banerjee y col., J Med Chem, vol. 51, pp. 4504-4517, 2008). Se añade a una solución del compuesto 1 (100 mg, 0,11 mmol en 5 ml DMF) H-Lys(Boc)-OBz (36 mg, 0,11 mmol) (Hamachi y col., Chem. Eur. J., vol. 5, pp. 1503-1511, 1999). La solución se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. El disolvente se extrajo al vacío. El residuo sólido obtenido de este modo se disolvió en 10 ml de acetato de etilo y se extrajo con 3 x 10 ml de agua. La capa orgánica se secó al vacío para obtener un sólido incoloro ESIMS: 1154 [M+1]+. El compuesto crudo se disolvió en 3 ml de CHCh seguido de la adición de 3 ml de TFA a 0 °C. La solución se dejó agitando durante toda la noche a temperatura ambiente. Le volumen de la solución se redujo al vacío y el residuo sólido se lavó 3 x 5 ml de CH2Ch para eliminar impurezas. El residuo sólido incoloro, 3, se secó al vacío para proporcionar 80 mg de compuesto 3. El compuesto 3 se purificó más usando un cartucho 2 g Sep Pak C18 con una solución de usando una mezcla agua/acetonitrilo 85/15 (TFA 0,1% en cada uno). RMN H1 (D2O, 8) : 7,5 (bm, 5H), 4,27 (m, 1H) 4,12 (m, 1H), 3,99 (m, 1H), 3, 04 (m, 4H), 2,38 (m, 2H), 2,3 -1,0 (m, 27H). ESIMS: 694 [M+1]+.A la solución de DoTA-mono-NHS (54 mg, 0,11 mmol en 5 ml de DMF) se añadió 3 (80 mg, 0,08 mmol) y TEA (60 ml, 0,43 mmol) y la solución se dejó en agitación durante 16 horas a temperatura ambiente. El disolvente se extrajo al vacío y el sólido crudo, SRV27, se purificó por HPLC Procedimiento 1, tiempo de retención 19 minutos. Rendimiento: = 40%. ESMS: 1080 [M+1]+, HRESI+-MS: Calculado para C49H77N9O181080,5487 [M+H], encontrado 1080,5459. RMN H1 (D2O) 8: 7,88 (m, 4H), 4,26- 4,1 (m, 5H) 3,45 - 3,18 (m, 16H), 2,52 - 2,43 (m, 16H), 2,40 - 2,18 (m, 25 H). 13C (CD3CO2D) d: 177,5; 177,6; 175,3; 172,3; 160,6; 160,2; 159,8; 159,5; 135,5; 128,5; 128,4; 119,9; 117, 114,0; 111,3; 67,3; 55,5; 53,1; 51,0; 49,9; 30,7; 28,0; 26,4; 25,1.
Ácido 2-{3-[5-(7 1-Benciloaicarbonil-5-[2-(4, 7, 10-tris-carboximetil-1, 4, 7,10tetraazaciclododec-1- il)-acetilamino]-pentilcarbamoil}-heptanoilamino)-1-carboxi-pentil]-ureido}-pentanodioico Galio (111), SRV31 ([Ga 69/71]SRV27) (no de acuerdo con la invención). Se añadió el compuesto SRV27 (4,2 mg, 39 jm ol) una solución de GaNO3 (10 mg, 39 jm ol) en 1 ml de agua desionizada y la solución resultante se calentó en agua hirviendo durante 10 minutos. El solvente se evaporó hasta la sequedad y el residuo crudo se purificó mediante HPLC usando una mezcla agua/acetonitrilo 80/20 (TFA 0,1% en cada uno), velocidad de flujo de 8 ml/ min. El tiempo de retención para el producto fue a 12 minutos. Rendimiento ~35% ESMS: 1146[M+1]+, RMN H1 (D2O 8: 788 (m, 4H), 4,26 -4 ,1 (m, 5H), 3,45 (m, 8H), 3,18 (m, 8H), 2, 69 (m, 8H), 2,51 (m, 8H), 2,40-2,18(m, 25H).
SRV 100
Ácido 2- -[3-(1-Carboxi-5-{7-[5-carboxi-5-(3-fenil-2-{3-fenil-2-[2-(4, 7,10-tris-carboximetil-1, 4,7,10-tetraazaciclododec-1-il)-acetilam ino]-propionilam ino}-propionilam ino)-pentilcarbamoil]-heptanoilam ino}-pentil)-ureido]-pentanodioico (SRV100). El compuesto SV100 se preparó de acuerdo con el esquema que se muestra en la Figura 4. Se dejó que la resina Fmoc-Lys(Boc)-Wang (100 mg, 0,43 nM) creciera con CH2Ch (3 ml) seguido de DMF (3 ml). Se añadió una solución de piperidina al 20% en DMF (3 x 3 ml) a la resina que después se agitó suavemente en un agitador mecánico durante 30 minutos a temperatura ambiente. La resina se lavó con DMF (3 x 3 ml) y CH2Ch (3 x 3 ml). La formación de amina libre se evaluó mediante el test de Kaiser (Kaiser y col., Anal Biochem, vol. 34, pp. 595-598, 1970). Después de que la resina se infle en DMF, se añadió una solución de Fmoc-Phe-OH (3 eq), HBTU (3 eq), HOBt (3 eq), and DIPEA (4,0 eq) en DMF y se agitó suavemente durante 2 horas. Después la resina se lavó con DMF (3 x 3 ml) y CH2Cl2 (3 x 3 ml). La eficiencia de acoplamiento se evaluó mediante el test de Kaiser. Esta secuencia mencionada anteriormente se repitó durante dos etapas más de acoplamiento con Fmoc-Phe-OH and DOTA-(f-butil éster)3-CO2H. El compuesto resultante se separó de la resina usando TFA: CH2Ch (1:1) y se concentró al vacío para producir la amina libre. El producto concentrado se purificó usando una columna 2 g Sep Pak C18. El producto se eluyó con una solución 70/30 agua/acetonitrilo (TFA 0,1% en cada uno). ESIMS: 827 [M+1]+. Se añadió una amina liofilizada (10 mg, 12 jm ol en 2 ml de DMF) a 1 (preparada separadamente) (20 mg, 21,4 |jmol en 1 ml de DMF) seguida de TEA (214 jmol, 30 j l ) y después se agitó a 25 °C durante 16 horas. Después de extraer el solvente, el residuo sólido se trató con 3 ml de TFA: CH2Cl2 para eliminar el grupo PMB. El residuo se lavó 2 x 5 ml de CH2Ch para eliminar impurezas. El residuo sólido incoloro obtenido de este modo se purificó usando una columna 2 g Sep Pak C18 usando como eluyente 70/30 agua/acetonitrilo (TFA 0,1% en cada uno) para producir SRV100 (SR-V-100). El producto se purificó más usando una HPLC-RP mediante el procedimiento 1, tiempo de retención 17 minutos. Rendimiento ~30% ESMS ml Z 1284 [M+1]+, HRESI+'MS: Calculado para C68H90N11O20 1284,6365 [M+H], encontrado 1284,6365. RMN H1 (CD3CO2D) 8: 7,35- 7,20 (m, 10H), 4,86 (bm, 2H), 4,47 - 4,46 (4H), 4,4 -2,8 (m, 14H), 2,51 (t, 2H), 2,4- 1,2 (m, 28H). 13C (CD3CO2D) d: 176,5; 177; 177,06; 177,6; 173,6; 173,24; 161,3; 160,92; 160,53; 160,14; 159,77; 137,95; 137,06; 130,5; 129,5; 127,9; 127,71; 120,8, 118,0; 115,1; 112,3; 56,1; 55,5; 53,5; 53,3; 40,1;38,8; 36,832,6; 31,8; 30,7; 29,42 ; 27,9; 26,53.
Ácido 2- -[3-(1-Carboxi-5-{7-[5-carboxi-5-(3-fenil-2-{3-fenil-2-[2-(4,7,10-tris-carboximetil-1,4,7,10-tetraazaciclododec-1-il)-acetilaminol propionilam inol}-propionilam ino)-pentilcarbamoil]-heptanoilam inol}-pentil)-ureido]-pentanodioico Galio (III) [Ga 69/71] SRV100. Este compuesto se preparó de acuerdo al mismo procedimiento general como el descrito para ([Ga 69/71] SRV27. El compuesto [Ga 69/71] SRV100 se purificó mediante el procedimiento 1, tiempo de retención 22 minutos. Rendimiento ~30% ESMS mlZ: 1351 [M+1]+, HRESI+-MS: Calculado para C68H90N11O20 1372,5204 [M+H], encontrado 1372,5199.
Caracterización del compuesto- Lipofilicidad
Los coeficientes de partición, los valores logo/w (pH = 7,4) se determinaron de acuerdo con el procedimiento de la bibliografía (Antunes y col., Bioconjug Chem, vol. 18, pp. 84-92, 2007). Brevemente, una solución de [Ga 68] SRV27 (no de acuerdo con la invención) o [Ga 68] SRV100 se añadió a una solución presaturada de 1-octanol (5 ml mezclada con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (5 ml) en un tubo de centrífuga de 15 ml. Después de una agitación vigorosa de la mezcla, se centrifugó a 3.000 rpm durante 5 minutos. Se extrajeron alícuotas (100 j l) de las dos fases y se midió la radioactividad en un contador-y, 1282 Compugamma CS (LKB, Wallac, Turku, Finlandia).
En el análisis de la mezcla de la reacción mediante HPLC, el tiempo de retención del compuesto radiomarcado fue ligeramente más largo que el correspondiente al ligando libre. La radioactividad específica de [Ga 68] SRV27 (no de acuerdo con la invención) y [Ga 68] SRV100 purificados fue de entre 3,0 y 6,0 MBq/nmol. Los valores de logP octanol/agua para de [Ga 68] SRV27 (no de acuerdo con la invención) o [Ga 68] SRV100 fueron aproximadamente -3,9 como se determina en el procedimiento de frasco de agitación (Antunes y col., Bioconjug Chem, vol. 18, pp. 84-92, 2007). Sin embargo, usando el procedimiento de HPLC, encontramos que los tiempos de retención de HPLC para SRV100 (28 minutos) y [Ga 69/71] SRV100 (32 minutos) fueron superiores para SRV27 (19 minutos) (no de acuerdo con la invención) y [Ga 69/71] SRV100 (24 minutos). Resulta evidente que SRV100 y el compuesto de galio correspondiente fueron más lipófilos que SRV27 (no de acuerdo con la invención) y su análogo marcado con galio, que es razonable a la luz de la presencia de dos residuos fenilalanina en el conector largo de SRV100, mientras que SRV27 (no de acuerdo con la invención) solo presenta un residuo lisina protegido por el benciléster.
Ensayo de unión a células
Los valores de Ki para SRV27 (no de acuerdo con la invención), [Ga 69/71] SRV27 (no de acuerdo con la invención), SRV100 y [Ga 69/71] SRV100 se determinaron usando el ensayo de unión de células por fluorescencia competitiva N-acetil aspartil glutamato (NAAG) adaptado de la literatura (Kozikowski y col., J Med Chem, vol. 47, pp. 1729-1738, 2004). Se encontró que todos los compuestos eran inhibidores fuertes de PSMA. Los compuestos SRV27 (no de acuerdo con la invención) y [Ga 69/71] SRV27 (no de acuerdo con la invención) tuvieron unas capacidades inhibitorias de 2,9 nM y 29 nM respectivamente. Para SRV100 y [Ga 69/71] SRV100, los valores fueron 1, 23 nM y 0,44 nM, respectivamente.
Distribución Ex vivo
Se inyectaron los ratones SCID portadores de xenoinjertos de PC-3 PIP PSMA+ y PC-3 flu PSMA- a través de la vena de cola con 30 Uci (1,1 MBq) [Ga 68] SRV27 (no de acuerdo con la invención) o [Ga 68] SRV100. En cada caso se sacrificaron cuatro ratones mediante dislocación cervical a los 30, 60, 120, 180 minutos post-inyección para [Ga 68] SRV27 (no de acuerdo con la invención) y a los 5, 60, 120, 180 minutos post-inyección para [Ga 68] SRV1O0. Se extrajeron rápidamente el corazón, los pulmones, el hígado, el estómago, el páncreas, el bazo, la grasa, los riñones, el músculo, los intestinos delgado y grueso, la vejiga urinaria y los tumores PC-3 PIP y flu. Se extrajeron también muestras de 0,1 ml. Cada órgano se pesó y se midió la actividad radioactiva del tejido con un contador gamma automático (1282 Compugamma CS, Pharmacia/LKB Nuclear, Inc., Gaithersburg, MD). Se calculó el %ID/g mediante comparación con las muestras de la dilución estándar de la dosis inicial. Todas las medidas fueron correctas para el decaimiento.
Se evaluó el compuesto [Ga 68] SRV27 (no de acuerdo con la invención) para su farmacocinética ex vivo en ratones con inmunodeficiencia severa-combinada (SCID) portadores de ambos xenoinjertos de PC-3 PIP PSMA+ y PC-3 flu PSMA-. La Tabla 1 muestra el porcentaje de dosis inyectada por gramo (%Id/g) del radiomarcador en los órganos seleccionados para [Ga 68] SRV27 (no de acuerdo con la invención).
Tabla 1. Biodistribución Ex vivo en el tejido de [Ga 68] SRV27 (no de acuerdo con la invención)
Figure imgf000046_0001
El compuesto [Ga 68] SRV27 (no de acuerdo con la invención) mostró una clara unión dependiente de PSMA en los xenoinjertos de PSMA+PC3 PIP, que alcanzó una absorción máxima 3,78 ± 0,90 (DS)% ID/g a los 30 minutos postinyección (p.i.). La sangre, el bazo y el riñón mostraron una absorción superior a los 30 minutos. En los 60 minutos, la vejiga urinaria mostró la absorción más elevada, sin embargo, esta absorción representa excreción en todos los puntos temporales. Los valores elevados destacados en el riñón son debidos parcialmente a una alta expresión de PSMA dentro de los túbulos renales proximales (Silver y col., Clin Cancer Res, vol. 3, pp. 81-85, 197; Slusher y col., J Comp Neurol, vol. 315, pp. 271-229, 1992). Se demostró un aclaramiento rápido de los riñones, disminuyendo desde 97,19 ± 16,07 % IDg a los 30 minutos hasta 2,31 ± 0,11 % ID/g a las 3 horas. La radioactividad en el tumor PSMA+ PIP se limpió más lentamente, desde el valor mencionado anteriormente a los 30 minutos a 1,08 ± 0,19 % ID/g a las 3 horas.
También se estudiaron las características farmacocinéticas del compuesto [Ga 68] SRV100 en ratones portadores de tumor a los 5 minutos, 1 hora, 2 horas y 3 horas p.i. La tabla 2 muestra el % ID/g del radiomarcador en órganos seleccionados para [Ga 68] SRV100.
Tabla 2. Biodistribución Ex vivo en el tejido de [Ga 68] SRV100
Figure imgf000047_0001
Como para [Ga 68] SRV27 (no de acuerdo con la invención), [Ga 68] SRV100 mostró una absorción PSMA dependiente en el tumor. Después de pico, relacionado con el flujo, de absorción a los 5 minutos p.i. de 6,61 ± 0,55 %, [Ga 68] SRV100 demostró un valor de absorción a las 2 horas de 3,29 ± 0,77 %, que disminuyó a 1,80 ± 0,16 % a las 3 horas. La absorción en sangre fue alta a los 5 minutos y se eliminó rápidamente en 1 horas. Los órganos no diana como el riñón, el bazo y el pulmón mostraron una absorción máxima a los 5 minutos y se redujo rápidamente con el tiempo. Con la excepción de los riñones y el bazo, el aclaramiento desde la sangre y los órganos normales fue más rápida para [Ga 68] SRV100 que para [Ga 68] SRV27 (no de acuerdo con la invención). De nuevo, una absorción elevada en el riñón se asoció con la expresión elevada de PSMA en los túbulos renales proximales (Silver y col., Clin Cancer Res, vol. 3, pp. 81-85, 197; Slusher y col., J Comp Neurol, vol. 315, pp. 271-229, 1992). De forma similar a [Ga 68] SRV27 (no de acuerdo con la invención), [Ga 68] SRV100 demostró un aclaramiento más rápido de radioactividad en los riñones que el tumor PSMA+. Sin embargo, la velocidad de aclaramiento del riñón para [Ga 68] SRV100 fue mucho más lenta que para a [Ga 68] SRV27 (no de acuerdo con la invención), es decir, 65 ± 12 % a los 5 minutos p.i. hasta 10,04 ± 1,22 % a las 3 horas.
Estudio por la imagen PET de pequeños animales
Un solo ratón SCID implantado con un xenoinjerto con LNCaP PSMA+ se inyectó por vía intravenosa con 0,2 mCi (7,4 MBq) de [Ga68] SRV27 (no de acuerdo con la invención) en 200 pl de NaCl. A las 0,5 horas p.i. se anestesió el ratón con isoflurano al 3% en oxígeno para inducción y se mantuvo bajo isoflurano al 1% en oxígeno a una velocidad de flujo de 0,8 l/min. El ratón se colocó en posición prona en la abertura de un escáner PET para animales pequeños GE eXplore VISTA (GE Healthcare, Milwaukee, WI). La adquisición de imágenes se realizó usando el protocolo siguiente: Se adquirieron las imágenes con un escáner pseudodinámico, es decir, se adquirió una secuencia de imágenes sucesivas de cuerpo total en las tres posiciones de cama durante un total de 120 minutos. El tiempo de permanencia en cada posición fue de 5 minutos, de modo que una posición de cama determinada (u órgano del ratón) se revisitó cada 15 minutos. Se usó una ventana de energía de 250- 700 KeV. Las imágenes se reconstruyeron usando el procedimiento FORE/2D-OSEM (dos iteraciones, 16 subconjuntos) y se incluyó el decaimiento de la radioactividad, el tiempo muerto del escáner y la radiación dispersa. Después de la captura de la imagen PET, la plataforma móvil que sujeta el ratón se colocó en la abertura de un dispositivo X-SPECT (Gamma Medica Ideas, Northridge, CA)
Los estudios por la imagen [Ga 68] SRV100 y los estudios de bloqueo de [Ga 68] SRV27 (no de acuerdo con la invención) se llevaron a cabo con ratones SCID portadores de xenoinjertos de PC-3 PIP PSMA+ y PC-3 flu PSMA- o ratones SCID portadores de xenoinjertos de PC-3 PIP PSMA+ (25,9 MBq en 100 pL de NaCl). A los 30 minutos, 1 hora y 2 horas p.i. se anestesiaron los ratones y se obtuvieron imágenes de cuerpo entero usando el escáner PET como se ha mencionado anteriormente, dos posiciones de cama, 15 minutos en cada posición durante un total de 30 minutos usando la misma ventana de energía. Las imágenes se reconstruyeron y se co-registraron con las imágenes de TC usando los mismos procedimientos descritos anteriormente.
Las Figuras 2 y 3 demuestran la alta selectividad por diana de [Ga 68] SRV27 (no de acuerdo con la invención) y [Ga 68] SRV100 mediante la delineación de los tumores PSMA+. A pesar de que se incluyó el tumor control PSMA- en la Figura 2, se llevó a cabo un estudio de bloqueo separado para [Ga 68] SRV27 (no de acuerdo con la invención), en el que un animal fue pretratado con un ligando que se une a PSMA- conocido a una dosis de 50 mg/kg, ácido 2-(fosfonometil)pentanodioico (2-PMPA) (Jackson y col., J Med Chem, vol. 39, pp. 619-622, 1996), no demostró una absorción de PSMA+ del tumor, atestiguando la especificidad de unión de este compuesto. Los estudios ex vivo más cuantitativos de [Ga 68] SRV27 (no de acuerdo con la invención) y [Ga 68] SRV100 respaldaron más la elevada especificidad de la diana por PSMA, que demuestra las proporciones de diana a no diana (PIP/flu) a aproximadamente 5 y 18 a 1 hora y 2 horas p.i., respectivamente. Los valores de absorción del tumor PMSA+ a una hora y 2 horas para estos compuestos, 3,32 ± 0,33% y 3,29 ± 0,77%, respectivamente, para Ga 68] SRV27 (no de acuerdo con la invención) y [Ga 68] SRV100, son comparables con otros inhibidores de PSMA radiometalados (Banerjee y col., J Med Chem, vol.
51, pp. 4504-4517, 2008). Tal como se muestra en las Figuras 2 y 3 esos valores son suficientes para un estudio por la imagen claro del tumor. Principalmente, los tumores PIP contiene aproximadamente un orden de magnitud inferior de PSMA que los tumores LNCaP (datos no mostrados), que a menudo se emplean para evaluar la especificidad de unión de los agentes diana PSMA-. PIP/flu es la comparación preferida puesto que ambos derivan de las células PC-3, lo que proporciona un estudio más controlado.
Se observó una absorción intensa de radiomarcador sólo en los riñones y en tumores tanto de [Ga 68] SRV27 (Figura 2) (no de acuerdo con la invención) como [Ga 68] SRV100 (Figura 3). Tal como se ha observado para el estudio ex vivo, la absorción renal intensa se debía parcialmente a una unión específica del radiomarcador a los túbulos renales proximales (Silver y col., Clin Cancer Res, vol. 3, pp. 81-85, 197; Slusher y col., J Comp Neurol, vol. 315, pp. 271-229, 1992) así como la excreción de este compuesto hidrofílico. A parte de los riñones, sólo el tumor PSMA+ demostró una absorción significativa de radiomarcador.
Discusión
Debido a su demostrada utilidad clínica y la apariencia de los sistemas de modalidad dual (PET/ tomografía computada (TC)), el estudio por la imagen PET clínico se ha acelerado a nivel mundial y puede convertirse pronto en la técnica dominante en medicina nuclear. Los isótopos PET tienden a tener una vida corta y permiten la síntesis de radiomarcadores “fisiológicos”, especialmente, aquellos que incorporan O15, N13 o C11, lo que permite una conformidad precisa al principio marcador. Siendo esencialmente isostérico al H, F18 permite estudios casi a nivel de marcador, con varias advertencias, particularmente para [F18] fluorodesoxiglucosa (FDG), que es de lejos el radiofármaco más comúnmente usado para PET. Pero, en parte debido a que FDG no se acumula bien dentro de varios tipos de tumores, incluyendo el tumor de próstata, existe una nueva urgencia en el desarrollo de péptidos de radiometal, empleando a menudo Tc99m, que se unan a receptores acoplados a la proteína G. Galio-68 proporciona una unión entre PET y tomografía por emisión de fotón único (SPECT) ya que la metodología de metal quelante necesaria para Tc99m se puede aplicar también a Ga68. Otra analogía es la conveniencia en el uso de un generador Ge68 / Ga68 (PET), como con Mo99/Tc99m (SPECT) para proporcionar un isótopo fácilmente disponible sin necesidad de un ciclotrón in house. Aunque los inhibidores de PSMA de bajo peso molecular, marcados con F18 han resultado prometedores en los estudios preclínicos por la imagen (Mease y col., Clin Cancer Res, vol. 14, pp. 3036-3043, 2008; Lapi y col., J Nucl Med, vol. 50, pp. 2042-2048, 2009), la disponibilidad de Ga68 producido por generador y la extensión a PET a partir de nuestras series publicadas marcadas con Tc99mde agentes de estudio por la imagen radiometal que se unen a PSMA (Banerjee y col., J Med Chem, vol. 51, pp. 4504-4517, 2008) proporcionan la base de este estudio.
Ejemplo 3
El compuesto SRV27 (no de acuerdo con la invención) y SRV100 se preparó como se describe en el Ejemplo 2. El marcaje con Ln-111 se realizó generalmente mediante el tratamiento de SRV27 (no de acuerdo con la invención) o SRV100 o SRV73 (no de acuerdo con la invención) con InCl3111, en NaOAc acuoso 200 mM a ~60 °C durante 30 minutos. Especialmente para SRV27, se combinaron 60 pl de SRV27 ( acetato sódico, 2 mg/ml) con 100 pl de acetato sódico y 3mCi InCla111 en un tubo eppendorf de 1,5 ml y se mantuvo a 60 °C durante 30 minutos. El producto radiomarcado se diluyó con 800 pl de agua y se purificó mediante HPLC. El rendimiento del radiomarcado es 1,7 mCi (aprox. 57%) y la pureza radioquímica fue > 99,9%.
SRV73 (no de acuerdo con la invención)
El compuesto SRV73 se preparó según el procedimiento resumido en el esquema más abajo. El compuesto SRV73 es un compuesto bimodal que presenta un grupo colorante fluorescente y un grupo metal quelante.
Figure imgf000049_0001
Los experimentos de estudio por la imagen SPECT para [In111]SRV27 (no de acuerdo con la invención), [In111]SRV100 e [In111]SRV73 (no de acuerdo con la invención) se realizaron usando el mismo procedimiento general describo para [Tc99m]SRV32 descrito en el Ejemplo 1.
El experimento por la imagen SPECT-CT del compuesto [In111]SRV27 (Figura 5) (no de acuerdo con la invención) ilustro una unión PSMA dependiente clara en los xenoinjertos PC3 PIP PSMA+ en la hora post inyección. Los valores elevados observados en los riñones son parcialmente debidos a la alta expresión de PSMA en los túbulos renales proximales (Silver y col., Clin Cancer Res, vol. 3, pp. 81-85, 197; Slusher y col., J Comp Neurol, vol. 315, pp. 271-229, 1992). Se observó un aclaramiento rápido de los riñones mientras que la actividad se retuvo en el tumor PSMA+ incluso cuatro días post inyección.
El experimento por la imagen SPECT-CT del compuesto [In111] SRV100 (Figura 6) demostró una unión similar PSMA dependiente clara en los xenoinjertos PC3 PIP PSMA+ en la hora post inyección. Los valores elevados observados en los riñones son parcialmente debidos a la alta expresión de PSMA en los túbulos renales proximales (Silver y col., Clin Cancer Res, vol. 3, pp. 81-85, 197; Slusher y col., J Comp Neurol, vol. 315, pp. 271-229, 1992). Se observó un aclaramiento rápido de los riñones mientras que la actividad se retuvo en el tumor PSMA+ incluso cuatro días post inyección. La actividad de retención de actividad del tumo para [In111] SRV27 y [In111] SRV100 puede resultar útil en la aplicación radioterapéutica basada en Y-90/Lu-177.
La figura 7 demuestra una absorción clara del tumor para In111]SRV73 (no de acuerdo con la invención) a las 7 horas post inyección. Esto es significativo ya que después de unir una gran cantidad de colorante fluorescente, rodamina, el compuesto retiene su actividad de unión s PSMA. Este es un ejemplo de aplicación de modalidad dual para esta clase de compuestos.
Ejemplo 4 (no de acuerdo con la invención)
SRVI34
Ácido 2-{3-[1-Carboxi-5-(7-{5-carboxi-5-[3-fenil-2-(3- fenil -2-{2-[2-(2-tritilsulfanil-acetilamino)- acetilamino]-acetilam ino}-propionilam ino)- propionilam ino]-pentilcarbamoil}-heptanoilamino)-pentil]-ureido} pentanodioico (SRVI34). SRVI34 se preparó de acuerdo al esquema a continuación. Se dejó que la resina Fmoc-Lys(Boc)-Wang (100 mg, 0,43 nM) creciera con CH2Ch (3 ml) seguido de DMF (3 ml). Se añadió una solución de piperidina al 20% en DMF (3 x 3 ml) a la resina que después se agitó suavemente en un agitador mecánico durante 30 minutos a temperatura ambiente. La resina se lavó con DMF (3 x 3 ml) y CH2Ch (3 x 3 ml). La formación de amina libre se evaluó mediante el test de Kaiser. (Después de que la resina se infle en DMF, se añadió una solución de Fmoc-Phe-OH (3 eq), HBTU (3 eq), HOBt (3 eq), and DIPEA (4,0 eq) en DMF y se agitó suavemente durante 2 horas. Después la resina se lavó con d Mf (3 x 3 ml) y CH2Ch (3 x 3 ml). La eficiencia de acoplamiento se evaluó mediante el test de Kaiser. Esta secuencia mencionada anteriormente se repitió durante dos etapas más de acoplamiento con Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH y ácido S-tritil mercaptoacético. Finalmente, el producto se separó de la resina usando TFA: CH2Ch(1:1) y se concentró al vacío para producir la amina libre. El producto concentrado se purificó usando una columna 2 g Sep Pak C18. El producto se eluyó con una solución 70/30 agua/acetonitrilo (TFA 0,1% en cada uno). ESIMS: [M+1]+. Se añadió SRVI32 liofilizada (10 mg, 12 pmol en 2 ml de DMF) a la urea (compuesto 1 descrito en el Ejemplo 2) (20 mg, 21,4 pmol en 1 ml de DMF) seguida de TEA (214 pmol, 30 pl) y después se agitó a 25 °C durante 16 horas. El residuo se lavó 2 x 5 ml de CH2Ch para eliminar impurezas. El residuo sólido incoloro obtenido de este modo se purificó usando una columna 2 g Sep Pak C18 usando como eluyente 70/30 agua/acetonitrilo (TFA 0,1% en cada uno) El producto se purificó más usando una HPLC-RP preparativa mediante el procedimiento 1, tiempo de retención 17 minutos. Rendimiento ~30% ESMS ml Z 1328 [M+1]+, RMN H1 (D2OCD3CN) (1:1)5: 7,88 (m, 5H), 7,90- 7,76 (m, 18H), 7,66 (m, 2H), 5,11 (m, 1H), 4,82 - 4,72 (m, 3H), 4,28 (m, 2H), 4,16 (m, 2H), 3,68 (m, 5H), 3,49 - 3,2 (m, 2H), 3,00 (m, 2H), 2,69 (m, 4H), 2,64 -1,74 (m, 26H).
Figure imgf000050_0001
Radiomarcado con Tc 99m: el radiomarcado se realizó siguiendo el procedimiento de la literatura (Wang y col., Nature Protocols, vol. 1, pp. 1477-1480, 2006). En resumen, 1 mg (75,3 pmol) del compuesto SRVI34 se disolvió en 1 ml de tampón de acetato de amonio a pH 8. El tartarato dihidratado disódico se disolvió en el tampón de marcado de acetato de amonio (pH 8) a una concentración de 50 mg/ml. La solución ácido ascórbico/HCl se preparó mediante disolución de ácido ascórbico en HCl 10 mM a una concentración de 1,0 mg/ml. Una solución de SRVI84 (80 pl) se combina con una solución de 45 pl, de acetato de amonio 0,25 M, 15 pl de tampón tartrato, seguido de 5 pl de la solución acabada de preparar de 4 mg/ml SnCl2. 2H2O en la solución de ascorbato -HCl. El pH final deberá ser aproximadamente 88,5. Después de la agitación con vórtex, se añadió pertecnetato- Tc 99m en 200 |jl de solución salina y se calentó la solución a 90-100 °C durante 20 min. La mezcla de la reacción se enfrió, diluida en 850 j l de agua y se purificó por HPLS usando una columna Phenomenex C 18 Luna 10x 250 mm2 en un sistema en un sistema CL Waters 600E Delta con un detector de UV/Vis de absorbencia tunable Waters 486, ambos controlados por un software Empower. Se usaron un sistema de solvente HPLC, velocidad de flujo de 4 ml/ min, a gradiente, 0-5 minutos, agua/acetonitrilo 80/20 (TFA 0,1% en cada disolvente), 5-25 min 40/60 de agua/acetonitrilo (TFA al 0,1 % en cada disolvente) y 25-35 min 80/20 (TFA al 0,1 % en cada disolvente). Se encontraron dos compuestos radiomarcados, denominados SRVI34A [Tc 99m ] (5.52 mCi) (tiempo de retención 17,5 min) y RVI34B [Tc 99m ] (6 mCi) (tiempo de retención 18,9 min). SRVI34A y SRVI32B son diastereómeros, syn y anti-isómeros en relación al grupo Tc =O. Cada producto se neutralizó con 50 j l de bicarbonato sódico 1 M y se evaporó hasta la sequedad al vacío. Los residuos de sólido obtenido se disolvieron en 200 j l de solución salina y se usaron para el estudio por la imagen y el estudio de biodistribución.
Distribución Ex vivo
Se inyectaron los ratones SCID portadores de xenoinjertos de PC-3 PIP PSMA+ y PC-3 flu PSMA- a través de la vena de cola con 30 jC i SRVI34B [Tc 99m ]. Se sacrificaron cuatro ratones mediante dislocación cervical a los 30, 60, 120, 300 minutos post-inyección. Se extrajeron rápidamente el corazón, los pulmones, el hígado, el estómago, el páncreas, el bazo, la grasa, los riñones, músculo, intestinos delgado y grueso, la vejiga urinaria y los tumores PC-3 PlP y flu. Se extrajo también una muestra de 0,1 ml. Cada órgano se pesó y se midió la actividad radioactiva del tejido con un contador gamma automático (1282 Compugamma CS, Pharmacia/LKB Nuclear, Inc., Gaithersburg, MD). Se calculó el %ID/g mediante comparación con las muestras de la dilución estándar de la dosis inicial. Todas las mediciones fueron correctas para el decaimiento.
Se evaluó el compuesto SRVI34B [Tc 99m ] para su farmacocinética ex vivo en ratones con inmunodeficiencia severacombinada (SCID) portadores de ambos xenoinjertos de PC-3 PIP PSMA+ y PC-3 flu PSMA-. Chang y col., Cancer Res, vol. 59, pp. 3192-3198, 1999). La Tabla 3 muestra el porcentaje de dosis inyectada por gramo (%Id/g) del radiomarcador en los órganos seleccionados para SRVI34B [Tc 99m ].
Tabla 3. Datos de Biodistribución para SRVI34B [Tc 99m ] (n=4)
Figure imgf000051_0001
Estudio por la imagen PET de pequeños animales
Los experimentos de estudio por la imagen para SRVI34A [Tc 99m ] y SRVI34B [Tc 99m ] se realizaron usando el mismo procedimiento general descrito para [Tc99m]SRV32 (Ejemplo 1).
Las Figuras 13, 14, 15 y 16 demuestran la alta selectividad por diana de [SRVI34B [Tc 99m ] mediante la delineación de los tumores PSMA+. El compuesto SRVI34B [Tc 99m ] mostró una absorción elevada en el tumor PSMA+ y no mostró en el tumor PSMA-. La absorción del tumor se mantuvo alta en 4,88 % ID/g incluso 5 horas post inyección (p.i.). Sin embargo, este compuesto mostró una muy buena absorción en el riñón 116 % ID/g incluso 5 horas p.i.. Además, este compuesto mostró una absorción elevada en el bazo 24,5% ID/g a las 5 horas p.i.
Ejemplo 5 (no de acuerdo con la invención)
General
Todos los reactivos y solventes se adquirieron en Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI) o Fisher Scientific (Pitts- burgh, PA). El bis-(4-metoxi-bencil) éster (1) del ácido 2-{3-[5-[7-(2,5-Dioxo-pirrolidin-1-iloxicarbonil)-heptanoilamino]-1-(4-metoxibenciloxicarbonil)-pentil]-ureido}-pentanodioico se preparó de acuerdo con (Banerjee y col., J. Med. Chem., vol. 51, pp. 4504-4517, 2008). H-Lys(Boc)-OBuHCl se adquirió de Chem-Impex International (Wood Dale, IL). El éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) de IRDye 800CW se adquirió de LI-COR Biosciences (Lincoln, NE). El espectro RMN 1H se obtuvo en un espectrómetro Bruker Avance 400 mHz. El espectro de masa ESI se obtuvo en un sistema Bruker Esquire 3000 plus. La purificación por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) se llevó a cabo en un sistema Varian Prostar (Varian Medical Systems, Palo Alto, c A).
YC-27
El compuesto YC-27 se preparó de acuerdo con el esquema que se muestra a continuación.
Figure imgf000052_0001
Sal Trifluoroacetato de ácido 2-(3-{5-[7-(5-ammo-1-carboxi-pentNcarbamoN)-heptanoMammo]-1-carboxipentM}-ureido)-pentanodioic (YC-VNI-24). A la solución de 1 (0,065 g, 0,020 mmol) en CH2Cl2 se añadió trietanolamina (0,040 ml, 0,285 mmol), seguido de H-Lys(Boc)-OBz (0,028 g, 0,083 mmol). Después de agitarla durante 2 horas a temperatura ambiente, el solvente se evaporó en un evaporador rotatorio. Entonces se añadió al residuo una solución de TFA/CH2Cl21:1 (2 ml) y se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente. El material crudo se purificó por HPLC (columna, Econosphere C18, 10 p, 250 x 10 mm; tiempo de retención, 15 min; fase móvil, A = 0,1 % TFA en H2O, B = 0,1 % TFA en CH3CN; gradiente, 0 min = 5% B, 25 min = 25% B; velocidad de flujo, 4 ml/min) para conseguir 0,032 g (66%) de YC-VNI-24. RMN1H(400 MHz, D2O) 84,24-4,28 (m, 1H), 4,17-4,20 (m, 1H), 4,08-4,12 (m, 1H), 3,08-3,12 (m, 2H), 2,88-2,92 (m, 2H), 2,41-2,44 (m, 2H), 2,19-2,21 (m, 2H), 2,05-2,16 (m, 3H), 1,57-1,93 (m, 7H), 1,21-1,50 (m, 10H), 1,21 (m, 4H). ESI-Masa calculada para C26H46N5O11 [M]+ 604,3, encontrada 604, 0.
YC-27. A la solución de YC-VNI-24 (0,3 mg, 0,43 pmol) en DMSO (0,1 ml) se añadió N,N-diisopropiletilamina (0,002 ml, 11.4 pmol), seguido por el éster de NHS IRDye 800CW (0.3 mg, 0.26 pmol). Después de agitar el compuesto YC-VIII-24 durante 2 h a temperatura ambiente, la mezcla de la reacción se purificó por HPLC (columna, Econosphere C18 5 p, 150 x 4.6 mm; tiempo de retención, 22 min, fase móvil, A = 0.1 % TFA en H2O, B = 0,1% TFA en CH3CN; gradiente, 0 min = 0% B, 5 min = 0% B, 45 min = 100% B; velocidad de flujo, 1 ml/min) para conseguir 0,3 mg (72%) de YC-27. ESI-Masa calculada para C72H97N7O25S4 [M]+ 1587.5, encontrada 794.3 [M+H]2+, 1587.6 [M]+.
S ín te s is de p re c u rs o r Y C -V I-54
Figure imgf000053_0001
A la solución de Lys-Urea-Glu (0,103 g, 0,121 mmol, Banerjee y col J. Med. Chem., vol. 51, pp. 4507-4517, 2008) en DMF (2 ml) se añadió Boc-NH-PEG-COOH (0,060 g, 0,135 mmol) y TBTU (0,040 g, 0,125 mmol), seguido por N,N-diisopropiletilamina (0,042 ml, 0,241 mmol). Después de agitar toda la noche a temperatura ambiente, el solvente se evaporó en un evaporador rotatorio. El material crudo se purificó por de sílice usando metanol/cloruro de metileno (5:95) para conseguir 0,101 g (0,109 mmol, 90%) de YC-VI-53, que se disolvió en una solución de anisol al 3% en TFA (1 ml). La mezcla se puso a reaccionar a temperatura ambiente durante 10 minutos, después se concentró en un evaporador rotatorio. El material crudo se purificó mediante HPLC (Econosphere C18 10 u, 250 x 10 mm, H2O/CH3CN/TFA (92/8/0.1), 4 ml/min, Compuesto YC- VI-54 que se eluye at 11 min) para conseguir 0,035 g (57%) del compuesto YC-VI-54. RMN 1(400 MHz, D2O) 84,17-4,21 (m, 1H), 4,10-4,13 (m, 1H), 4,00 (s, 2H), 3,67-3,71 (m, 6H), 3,14-3,20 (m, 4H), 2,43-2,46 (m, 2H), 2,08-2,13 (m, 1H), 1,87-1,93 (m, 1H), 1,76-1,79 (m, 1H), 1,63-1,67 (m, 1H), 1,45-1,50 (m, 2H), 1,33-1,40 (m, 2H).. ESl-Masa calculada para C18H33N4O10 [M]+ 465.2, encontrada 465.2.
YC-VIII-11
Figure imgf000053_0002
A una solución del compuesto YC-VI-54 (0,3 mg, 53 pmol) en DMSO (0,05 ml) se añadió N,N-diisopropiletilamina (0,002 ml, 11,4 pmol), seguido de éster NHS de IRDye 800RS (0,2 mg, 0,21 pmol). Después de 2 horas a temperatura ambiente, la mezcla de la reacción se purificó por HPLC (columna, Econosphere C18 5 p, 1503 4.6 mm; tiempo de retención, 28 min; fase móvil, A = 0,1% TFA en H2O, B = 0,1% TFA en CH3CN; gradiente, 0 min = 0% B, 5 min = 0% B, 45 min = 100% B; velocidad de flujo, 1 ml/min) para obtener 0,2 mg (75%) del compuesto YC-VIII-11. ESI-Masa calculada para C64H84N6O18S2 [M]+ 1288.5, encontrada 1288.9.
Y C -V III-12
Figure imgf000054_0001
A una solución del compuesto YC-VI-54 (0,3 mg, 53 |jmol) en DMSO (0,05 ml) se añadió AA-diisopropiletilamina (0,002 ml, 11,4 jmol), seguido de éster NHS de IRDye 800RS (0,2 mg, 0,17 jmol). Después de 2 horas a temperatura ambiente, la mezcla de la reacción se purificó por HPLC (columna, Econosphere C18 5 j , 1503 4.6 mm; tiempo de retención, 22 min; fase móvil, A = 0,1% TFA en H2O, B = 0,1% TFA en CH3CN; gradiente, 0 min = 0% B, 5 min = 0% B, 45 min = 100% B; velocidad de flujo, 1 ml/min) para obtener 0,2 mg (80%) del compuesto YC-VNM2. ESI-Masa calculada para C64H84N6O24S4 [M]+ 1448.4, encontrada 1448.7.
YC-VIII-28
Figure imgf000054_0002
A una solución del compuesto YC-VNI-24 (preparada como se ha descrito anteriormente para YC-27 (0,3 mg, 0,42 jm ol) en DMSO (0,05 ml) se añadió AA-diisopropiletilamina (0,002 ml, 11,5 jmol), seguido de éster NHS de IRDye 800RS (0,3 mg, 0,31 jmol). Después de 2 horas a temperatura ambiente, la mezcla de la reacción se purificó por HPLC (columna, Econosphere C-is 5 j , 150 x 4.6 mm; tiempo de retención, 27 min; fase móvil, A = 0,1% t Fa en h 2o , B = 0,1% TFA en CH3CN; gradiente, 0 min = 0% B, 5 min = 0% B, 45 min = 100% B; velocidad de flujo, 1 ml/min) para obtener 0,3 mg (67%) del compuesto YC-VNI-28. ESI-Masa calculada para C72H97N7O19S2 [M]+ 1427.6, encontrada 714.4 [M+H]2+, 1427.8 [M]+.
Y C -V III-30
Figure imgf000055_0001
A una solución del compuesto YC-VIII-24 (0,5 mg, 0,70 |jmol) en DMSO (0,05 ml) se añadió W,A/-dMsoprop¡letMam¡na (0,005 ml, 28,7 jmol), seguido de éster NHS de BODIPY 650/665-X (0,3 mg, 0,47 jmol). Después de 2 horas a temperatura ambiente, la mezcla de la reacción se purificó por HPLC (columna, Econosphere C185 j , 150 x 4.6 mm; tiempo de retención, 28 min; fase móvil, A = 0,1% TFA en H2O, B = 0,1% TFA en CH3CN; gradiente, 0 min = 0% B, 5 min = 0% B, 45 min = 100% B; velocidad de flujo, 1 ml/min) para obtener 0,4 mg (75 %) del compuesto YC-VIII-30. ESI-Masa calculada para C55H73BF2N9O14 [M+H]+ 1132.5, encontrada 1132.0.
YC-VIII-31
Figure imgf000055_0002
A una solución del compuesto YC-VI-54 (0,5 mg, 0,70 jm ol) en DMSO (0,05 ml) se añadió W.W-diisopropiletilamina (0,005 ml, 28,7 jmol), seguido de éster NHS de BODIPY 650/665-X (0,3 mg, 0,47 jmol). Después de 2 horas a temperatura ambiente, la mezcla de la reacción se purificó por HPLC (columna, Econosphere C185 j , 150 x 4.6 mm; tiempo de retención, 29 min; fase móvil, A = 0,1% TFA en H2O, B = 0,1% TFA en CH3CN; gradiente, 0 min = 0% B, 5 min = 0% B, 45 min = 100% B; velocidad de flujo, 1 ml/min) para obtener 0,4 mg (86 %) del compuesto YC-VIII-31. ESI-Masa calculada para C47H59BF2N8O13 [M]+ 992.4, encontrada 992,9.
YC-VIII-41
Figure imgf000055_0003
A una solución de Lys-Urea-Glu (4,0 mg, 9,6 jmol) en DMF (0,5 ml) se añadió trietilamina (0,01 ml, 71,7 jmol), seguida de éster NHS Marina Blue (1,8 mg, 4.9 jmol). Después de 2 horas a temperatura ambiente, la mezcla de la reacción se purificó por HPLC (columna, Econosphere C18 10 j , 150 x 4.6 mm; tiempo de retención, 29 min; fase móvil, H2O/CH3CN/TFA = 85/15/0.1; velocidad de flujo, 1 ml/min) para obtener 02,5 mg (89 %) del compuesto YC-VNI-41.
1H NMR (400 MHz, D2O) 87.40 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 4.23-4.31 (m, 1H), 4.15-4.19 (m, 1H), 3.64 (s, 2H), 3.19-3.23 (m, 2H), 2.49-2.53 (m, 2H), 2.39 (s, 3H), 2.06-2.17 (m, 1H), 1.95-1.99 (m, 1H), 1.83-1.90 (m, 1H), 1.72-1.80 (m, 1H), 1.52­ 1.55 (m, 2H), 1.40-1.45 (m, 2H). v C24H28F2N3O11 [ESI-Masa calculada para C24H28F2N3O11 [M+H]+ 572.2, encontrada 571.8.
Y C -V III-52
Figure imgf000056_0001
A una solución de Lys-Urea-Glu (4,0 mg, 9,6 |jmol) en DMSO (0,5 ml) se añadió trietilamina (0,020 ml, 114,8 |jmol), seguida 4-[2-(4-dimetilamino-fenM)-vinil]-1-(3-isotiocianato-propM)-piridio (3 mg, 7,4 jmol). Después de 2 horas a temperatura ambiente, la mezcla de la reacción se purificó por HPLC (columna, Econosphere C18 10 j , 250 x 20 mm; tiempo de retención, 13 min; fase móvil, A = 0,1% TFA en H2O, B = 0,1% TFA en CH3CN; gradiente, 0 min = 10% B, 20 min = 60% B; velocidad de flujo, 4 ml/min) para obtener 1,3 mg (24%) del compuesto YC-VMI-52.. ESl-Masa calculada para C31H43N6O7S [M]+ 643.3, encontrada 642.9.
YC-VIII-74
Figure imgf000056_0002
A una solución de YC-VNI-24 (3,0 mg, 4,2 jmol) en DMSO (0,5 ml) se añadió W,W-diisopropiletilamina (0,020 ml, 114,8 jmol), seguida 4-[2-(4-dimetilaminofenil)-vinil]-1-(3-isotiocianato-propil)-piridio (2 mg, 4,9 jmol). Después de 2 horas a temperatura ambiente, la mezcla de la reacción se purificó por HPLC (columna, Econosphere C18 5 j , 150 x 4,6 mm; tiempo de retención, 15 min; fase móvil, A = 0,1% TFA en H2O, B = 0,1% TFA en CH3CN; gradiente, 0 min = 0% B, 25 min = 0% B; 45 min = 100% B velocidad de flujo, 1 ml/min) para obtener 2 mg (47%) del compuesto YC-VNI-54.. ESI-Masa calculada para C45H67N8O11S [M]+ 927.5, encontrada 927.0.
YC-VIII-63
Figure imgf000056_0003
A una solución de YC-VNI-24 (5,0 mg, 7,0 jm ol) en DMF (1 ml) trietilamina (0,020 ml, 143,5 jmol), seguida de éster NHS de 5-(ay-6)-carboxinaftofluoresceína (4,0 mg, 7,0 jmol). Después de 1 hora a temperatura ambiente, la mezcla de la reacción se purificó por HPLC (columna, Econosphere C18 10 j , 250 x 10 mm; tiempo de retención, minoritario producto a 17 min, producto principal a los 20 min; fase móvil, H2O/CH3CN/TFA = 70/30/0,1 velocidad de flujo, 1 ml/min) para obtener 0,3 de producto minoritario y 2,2 mg de producto principal 2 mg (dos isómeros de YC-VNI-63). ESI-Masa calculada para C55H59N5O17 [M]+ 1061.4, encontrada 927.0. 1 0 6 1 .6 (para ambos productos, minoritario y principal).
YC-IX-92
Figure imgf000057_0001
A una solución de Lys-Urea-Glu (0,2 mg, 0,48 jm ol) en DMSO (0,05 ml) se añadió N,N-diisopropiletilamina (0,002 ml, 11,5 |jmol), seguido de éster NHS de IRDye 800RS (0,2 mg, 0,21 jmol). Después de 2 horas a temperatura ambiente, la mezcla de la reacción se purificó por HPLC (columna, Econosphere C18 5 j , 150 x 4.6 mm; tiempo de retención, 23 min; fase móvil, A = 0,1% TFA en H2O, B = 0,1% TFA en CH3CN; gradiente, 0 min = 0% B, 5 min = 0% B, 45 min = 100% B; velocidad de flujo, 1 ml/min) para obtener 0,2 mg (84 %) del compuesto YC-IX-92. ESI-Masa calculada para C58H73N5O15S2 [M]+ 1143.5, encontrada 572.5 [M+H]2+, 1144.0 [M]+.
Caracterización- Fluorescencia
El espectro de fluorescencia se registró usando un espectrofotómetro de fluorescencia a Varian Cary Eclipse (Varian Medical Systems) con excitación a partir de una lámpara de arco de Xenón. YC-27 se disolvió en agua, Todas las mediciones de fluorescencia se realizaron en una solución acuosa bajo condiciones ambientales. El rendimiento del quantum de fluorescencia de YC-27 se midió usando una solución acuosa de ICG (□□= 0.016 (Sevick-Muraca y col., Photochem. Photobiol., vol. 6 6 , pp. 55-64, 1997), longitud de onda de excitación 775 nm) como estándar (Figure 8). Los datos de intensidad de fluorescencia se recolectaron en la región del espectro 780 - 900 nm sobre se integró el rendimiento cuántico. Los decaimientos de la intensidad resueltos con el tiempo se registraron usando un PicoQuant Fluotime espectrómetro de vida media de la fluorescencia por recuento por fotón único con factor de correlación de 100 (TCSPC) (PicoQuant, Berlín, DE). La excitación se obtuvo usando un láser pulsátil de diodo (PicoQuant PDL800-B) con una tasa de repetición de 20 MHz. El decaimiento de la intensidad de la fluorescencia de YC-27 se analizó en ítems de decaimiento exponencial simple usando el PicoQuant Fluofit 4.1 software con deconvolución del instrumento respuesta función no linear en los ajustes menos cuadrados. Los buenos resultados en el ajuste vienen dados por el valor D2.
El espectro electrónico de YC-27 mostró una absorbancia máxima a 774 nm con un coeficiente de extinción de 158,900 M-1. En el momento de la excitación, YC-27 proporcionó una intensidad de fluorescencia con una emisión máxima a 792 nm y una vida media de la fluorescencia de 443 psec en solución acuosa (Figure 9). Usando una longitud de onda de excitación de 775 nm, YC-27 mostró un rendimiento de cuanto de fluorescencia de 0,053 en una solución acuosa relativa a ICG, que demostró un rendimiento de 0,016 (Figure 8) (Sevick-Muraca y col., Photochem. Photobiol., vol.
6 6 , pp. 55-64, 1997), atestiguando la eficiencia de este compuesto a base de IRDye 800CW-. Esto es significativo porque ICG se había usado anteriormente en el mapeado inter-operatorio de tumores (K. Gotoh, T. Yamada, O. Ishikawa, H. Takahashi, H. Eguchi, M. Yano, H. Ohigashi, Y. Tomita, Y. Miyamoto, and S. Imaoka, A novel imageguided surgery of hepatocellular carcinoma by indocyanine green fluorescence imaging navigation. J. Surg. Oncol., 2009).
Actividad NAALADasa in vitro
La actividad inhibidora de PSMA de YC-27 se determinó usando un ensayo basado en la fluorescencia de acuerdo con un procedimiento previamente descrito (Chen y col., J. Med. Chem., vol. 51, pp. 7933-7943, 2008). En resumen, los lisados de extractos de células LNCaP (25 ml) se incubaron con el inhibidor (12,5 ml) en presencia de 4 mM N-acetilaspartilglutamato (NAAG) (12,5 ml) durante 120 min. La cantidad de glutamato liberada por la hidrolisis de NAAG se midió por incubación con una solución de trabajo (50 ml) del Kit Amplex Red Glutamic Acid Kit (Molecular Probes Inc., Eugene, OR durante 60 min. Se midió la Fluorescencia con un lector de placa multimarcado a VICTOR3V (Perkin Elmer Inc., Waltham, MA) con excitación a 530 nm y emisión a 560 nm. Las curvas de inhibición se determinaron usando unas representaciones semi-logarítmicas y se determinaron los valores de CI50 a la concentración a la que la actividad enzimática era inhibida en el 50%. Los ensayos se realizaron por triplicado. Las constantes enzimáticas inhibidoras (valores Ki ) se generaron usando la conversión de Cheng-Prusoff [19]. El análisis de los datos se realizó usando la versión 4.00 GraphPad Prism para Windows (GraphPad Software, San Diego, California).
Este ensayo está libre de la interferencia de IRDye 800CW porque la excitación/emisión máxima de IRDye 800CW está muy alejada de la de resorufina (Dex = 563 nm, Qem = 587 nm), que proporciona la lectura de fluorescencia en este ensayo. El valor de Ki de YC-27 fue 0,37 nM con 95% de intervalo de confianza desde 0,18 nM hasta 0,79 nM. Bajos las mismas condiciones experimentales, los valores de Ki del conocido inhibidor PSMA i ZJ-43 (Zhou y col., Nat. Rev. Drug Discov., vol. 4, pp. 1015-1026, 2005) fue 2,1 nM, lo que indica la gran capacidad inhibidora de f YC-27. La curva de inhibición de YC-27, que se expresó con respecto a la cantidad de glutamato liberado de la hidrólisis de NAAG, se muestra en la Figura 10.
Biodistribución y estudio por la imagen
Cultivos celulares y modelos animales Ambas líneas celulares de cáncer de próstata que expresan PSMA-(PSMA+ PC3-PIP) y las que no expresan (PSMA- PC3-flu) (Chang y col, Cancer Res., vol. 59, pp. 3192-3198, 1999) se hicieron crecer en medio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) que contiene el 10% de suero bovino fetal (FBS) (Invitrogen) y 1% Pen-Strep (Biofluids, Camarillo, CA). Todos los cultivos celulares se mantuvieron en dióxido de carbono al 5% (CO2), a 37 °C en incubador humidificado. Los estudios con animales se llevaron a cabo cumpliendo las regulaciones del comité de ética de Johns Hopkins. Se implantaron subcutáneamente (s.c.) células PC3-PIP ay PC3-flu (2 x 106 in 100 ml of Matrigel) en la parte externa de los flancos izquierdo y derecho respectivamente de ratones de seis a ocho semanas, no obesos diabéticos (NOD) /inmunodeprimidos severos combinados (SCID) (Charles River Lab- oratories, Wilmington, MA). Se capturaron imágenes o se usaron en los ensayos de biodistribución ex vivo cuando los xenoinjertos habían alcanzado de 5 a 7 mm de diámetro.
Estudio de la im agen in vivo y b iodistribución E x vivo. Se inyectó al ratón #1 10 nmol al ratón #2 1 nmol de YC-27 en 200 ml de PBS por vía intravenosa (i.v.) a través de la vena lateral de la cola. Se inyecto al ratón #3 1 nmol of YC-27 y también se coinyectó con 1 pmol del conocido inhibidor de PSMA ácido 2-{3-[1-carboxi-5-(4-iodobenzoilamino)-pentil]-ureido}-pentanodioico (DCIBzL) (Chen y col., J. Med. Chem., vol. 51, pp. 7933-7943, 2008; Barinka y col., J. Med. Chem. vol. 51, pp. 7737-7743, 2008) en 200 ml de PBS i.v. para evaluar la especificidad de unión de PSMA. Las imágenes se adquirieron en un matriz de post-inyección (p.i.) en unos intervalos de tiempo que empiezan a los 10 min p.i. usando un instrumento de captura de imagen dedicado para pequeños animales el Pearl Imager (LI-COR Biosciences). El Pearl Imager utiliza unos láseres difusos optimizados para IRDye 800CW. El instrumento utiliza una cámara CCD con un campo de visión de 11,2 cm x 8,4 cm en la superficie del lecho de la imagen. El tiempo de escaneo es inferior a 30 sec para completar la luz blanca, el canal de 700 nm y la adquisición de la imagen a 800 nm. Las imágenes se muestran usando una salida de pseudocolor con la escala correspondiente. Todas las imágenes se adquieren según los mismos parámetros de ajuste y se escalan a los mismos valores máximos. La temperatura del lecho de la imagen se ajusta a 37 °C, Los animales reciben anestesia por vía inhalada(isoflurano) a través de un cono nasal enganchado en el lecho de captura de imagen. Para el estudio por imagen ex vivo los animales son sacrificados por dislocación cervical al final de la adquisición de las imágenes. Las imágenes Ex vivo se adquieren primero por la línea de laparotomía quirúrgica media y después de nuevo al extraer el hígado, el bazo, el estómago, el intestino delgado, los riñones, la vejiga urinaria, y los p C-3 PIP y flu y se muestran de forma individual en unas placas de Petri. Las estimaciones de la señal de salida son proporcionadas por el dibujo de tres regiones circulares de interés dentro de cada tumor y determinando la señal media (unidades arbitrarias) / área usando el software del proveedor.
Figura 11 (ratón #1) muestra el comportamiento farmacocinético de YC-27 in vivo. En este experimento se administraron por vía intravenosa 10 nmol de YC-27 y se captaron imágenes de los animales repetidamente durante un periodo de tres días. A pesar de la dificultad de cuantificar estas imágenes planas, se puede observar claramente un aumento de la adquisición en los tumores PSMA+ PC3-PIP en relación al control (PSMA-negativo) PC3-flu a las 18., h p.i. hasta 70,5 h p.i. (Figure 11C hasta 11M). Usando la reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) se midieron las cantidades relativas de expresión en ARNm de la PSMA en extractos de tumores de ratones #1-3, y se confirmó que los tumores PC3-PIP (flanco izquierdo) expresan ARNm de PSMA a niveles varios millones superiores a los tumores PC3-flu (flanco derecho) (datos no mostrados). Paneles 11L y 11M muestran la emisión de un animal intacto, vivo sin rasurar mientras que los paneles 11N y 11O son estudios postmortem con órganos expuestos. Cabe destacar que en 11L apenas se puede distinguir los riñones, una diana conocida para PSMA (Tasch y col., Crit. Rev. Immunol., vol. 21, pp. 249-261,2001; Pomper y col., Mol. Imaging, vol.
1, pp. 96-101, 2002; Kinoshita y col., World J. Surg., vol. 30, pp. 628-636, 2006), mientras que los riñones están claramente visibles en 11O cuando se exponen. Una parte de la emisión de luz real puede ser debida al aclaramiento de este compuesto relativamente hidrófilo. La relación de diana a no diana (salida de luz de PC-3 PIP vs. PC-3) fue de 10 cuando se comparan los tumores del panel M (70,5 h p.i.).
El experimento de la Figura 12 se llevó a cabo con una dosis 10 veces inferior de YC-27 a la dosis ya administrada en el experimento anterior. A pesar de haber reducido la concentración de YC-27, el tumor PSMA+ PC3-PIP se puede ver claramente al día uno p.i. (Figura 12, ratón #2, Paneles izquierdos). DCIBzL, un conocido inhibidor de PSMA con alta afinidad, se co-administró con YC-27 como ensayo de especificidad de la unión (Figura 12, ratón #3, Paneles derechos). Casi toda la emisión de luz del tumor diana, así como de los riñones fue bloqueada, demostrando así la especificidad de este compuesto por el PSMA in vivo. La proporción estimada de diana -no- diana (salida de luz de PC-3 PIP vs. PC-3 flu) fue 26 cuando se compararon los tumores del panel F (20,5 h p.i.). Al administrar 1 nmol a este ratón de ~ 25 g, hemos comprobado la alta sensibilidad del estudio por la imagen in vivo si se compara con las técnicas basadas en radiofármacos. Por ejemplo, 1 nmol se convierte en 1.6 |jg inyectados. Si sintetizamos un compuesto similar marcado con F18 u otro radionúclido a 1.000 mCi/jmol (37 GBq/jmol), y lo administramos a dosis estándar de f 200 |j Ci (7,4 MBq) a un ratón, deberíamos inyectar 0.3 |jg.
De forma interesante, en el ratón #1, que recibió 10 nmol de YC-27, observamos un pequeño grado de adquisición no específica a las 23 horas, manifestada como una adquisición en un tumor PC3-flu PSMA-negativo. Este hallazgo podría deberse a la permeabilidad y retención mejoradas de YC-27. No se observó adquisición/ retención no específica en otro tiempo similar, 20,5 horas en el ratón #2, que recibió una dosis 10 veces menor. Este hallazgo sugiere la necesidad de una optimización adicional de la dosis y en tiempo en las aplicaciones in vivo.
Discusión
Se han sintetizado una gran variedad de agentes de diagnóstico por la imagen de bajo peso molecular basado en el PSMA, incluyendo aquellos que usan una cubierta de urea (Banerjee y col., J. Med. Chem., vol. 51, pp. 4504-4517, 2008; Chen y col., J. Med. Chem., vol. 51, pp. 7933-7943, 2008; Zhou y col., Nat. Rev. Drug Discov., vol. 4, pp. 1015­ 1026, 2005; Pomper y col., Mol. Imaging, vol. 1, pp. 96-101, 2002; Foss y col., Clin. Cancer Res., vol. 11, pp. 4022­ 4028, 2005; Humblet y col., Mol. Imaging, vol. 4, 448-462, 2005; Misra y col., J. Nucl. Med., vol. 48, pp. 1379-1389, 2007; Mease y col., Clin. Cancer Res., vol. 14, pp. 3036-3043, 2008; Liu y col., Prostate, vol. 68, pp. 955-964, 2008; Humblet y col., J. Med. Chem., vol. 52, pp. 544-550, 2009; Kularatne y col., Mol. Pharm., vol. 6, pp. 790-800, 2009; Hillier y col., Cancer Res., vol. 69, pp. 6932-6940, 2009). Estos compuestos han sido principalmente radiofármacos, pero no existen agentes ópticos. En dos estudios separados Humblet y col. describe la síntesis de derivados de fosfonatos fluorescentes IR mono y polivalentes para estudio por la imagen de PSMA, pero en el anterior estudio se hizo evidente la poca acumulación en tumores que expresan PSMA. (Humblet y col., Mol. Imaging, vol. 4, pp. 448­ 462, 2005) y no se describen resultados in vivo en el último. Humblet y col., J. Med. Chem., vol. 52, pp. 544-550, 2009). Liu y col también han sintetizado unos derivados de fosfonatos fluorescentes y han demostrado su especificad de unión a PSMA y la localización intracelular in vitro (Liu y col., Prostate, vol. 68, pp. 955-964, 2008). Recientemente, Kularatne y col. Han sinterizado unos derivados de urea fluorescentes (fluoresceína y rodamina) que muestran una migración de PSMA a los endosomas Kularatne y col., Mol. Pharm., vol. 6, pp. 790-800, 2009). Llegamos a YC-27 basado en unas relaciones estructura actividad desarrolladas por ureas que se unen a PSMA, que se centran en mejorar la farmacinética para el uso in vivo mediante la optimización del complejo conector-quelato (Banerjee y col., J. Med. Chem., vol. 51, pp. 4504-4517, 2008). Valores calculados de hidrofobicidad (Ghose y col., J. Phys. Chem. A, vol. 102, pp. 3762-3772, 1998) sugieren que YC-27 bebería ser considerablemente más hidrófobo (ALogD = 5.96) que el resto de radiofármacos como [125I]DCIBzL (ALogD = 1.19), puede ser debido a su larga retención en el tumor, que es deseable para un agente para la imagen óptica destinada a un uso intra-operatorio. Confirmamos una mayor hidrofobicidad de YC-27 relativa a DCIBzL mediante HPLC de fase inversa (datos no mostrados). EJEMPLO 6 (no de acuerdo con la invención)
Síntesis de YC-VIII-36
Figure imgf000059_0001
A una solución de YC-VIII-24 (preparado como se describe en el Ejemplo 5) (1,5 mg, 0,21 jm ol) en DMF (1 ml) se añadió trietilamina (0,005 ml, 35,9 jmol), isómero 1 isotiocianato de fluoresceína (1 mg, 2,57 jmol). Después de 2 horas a temperatura ambiente, la mezcla de la reacción se purificó por HPLC (columna, Econosphere C18 5 j , 150 x 4.6 mm; tiempo de retención, 15 min; fase móvil, H2O/CH3CN/TFA = 75/25/0.1; velocidad de flujo, 1 ml/min) para obtener 1,5 mg (72 %) del compuesto YC-VMI-36. ESI-Masa calculada para C47H57N6O16S [M+H]+ 993.4, encontrada, 992.8.
Marcaje de células
Las células PIP PSMA positivas y las Células Flu PSMA negativas fueron tratadas con el compuesto YC-VIII-36 (40 nM) y 4',6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI, azul). La Figura 17 muestra la fluorescencia de células que expresan PSMA (fluoresceína verde, superior izquierda). ALs células PIP y FLU fueron tratadas ambas con YC-VIII-36 y PMP un inhibidor de PMSA (5 uM) que muestra la inhibición de la fluorescencia celular por PMPA (Figura 17, superior).
La figura 18 muestra las células PC-3 PIP tratadas con DAPI (azul) y a unas concentraciones variantes de YC-VIII-36 (verde).
La figura 19 muestra la intemalización tiempo dependiente de YC-VIII-36 en las 'células PC-3 PIP tratadas con YC-VIII-36 (verde) y DAPI (azul). El estudio de la intemalización tiempo dependiente se realizó como está descrito Liu y col., Prostate vol. 68, pp. 955-964, 2008) con las modificaciones adecuadas. En resumen, las células PC-3 PIP se siembran como se ha descrito anteriormente. Primero se enfríen las células mediante incubación con hielo frío como medio de cultivo completo o y después se incuban con hielo frío para completar el medio de crecimiento que contiene 500 nM del compuesto YC-VIII-36 a 40 C durante 1 hora. Después de 1 hora de incubación se elimina el exceso de compuesto por lavado de las células dos veces con medio de cultivo completo de hielo frío y después se llenan los pocillos con medio de cultivo completo precalentado. Las cámaras que contienen las células se incuban durante 0 minutos, 30 minutos, 60 minutos y 180 minutos a 37 °C en el incubador humidificado.
Estudio de la imagen in vivo
La Figura 20 muestra la titulación y detección de cantidades variantes de YC-VIII-36 inyectadas subcutáneamente en ratones inmunodeprimidos (nude). Espectros de IVIS con 10 segundos de exposición mediante espectros no mezclados).
La Figura 21 y 22 (superior) muestra imágenes de fluorescencia de ratones portadores de tumores PC-3 PIP PSMA+ y PC-3 flu PMSA- inyectados por vía intravenosa con el compuesto ejemplar YC-VIII-36. El compuesto YC-VIII-36 (150 |jg) se inyecto en la vena de la cola del ratón inmunodeprimido. La frecuencia de excitación fue de 465 nm con 5 s de exposición. La emisión de fluorescencia se midió a 500, 520, 540 y 580 nm, seguida por una no mezcla de espectros.
La Figura 22 (inferior) muestra la biodistribución del compuesto YC-VII-36 (150 mg) 180 minutos después de la inyección.
FACS y clasificación de células
Análisis por citometría de flujo (FCA): Frascos confluentes de células PC-3 PIP, PC-3 flu y LNCaP se tripsinizaron, se lacaron con medio de cultivo completo (para neutralizar la tripsina) y se contaron, Aproximadamente 5 millones de cada tipo de células en suspensión se incubó con 1 mM del compuesto YC-VIII-36 durante 30 minutos con una agitación ocasional a 37 ° en un incubador humidificado con CO2 al 5%. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con tampón KRB hielo frío y se fijaron con paraformaldehído al 2% (hielo frio). Las muestras se guardaron en hielo y protegidas de la luz hasta que se realizara el FAC. el FCA se llevó a cabo usando un citómetro de flujo FACS Calibur (Becton Dickinson, San José, CA). Para la adquisición de datos, los singletes se pusieron como el grupo prominente de células identificadas a partir de un grupo de dispersión lateral (SSC) frente al de dispersión frontal (FSC) para asegurar que las células agregadas se excluyen del análisis. Se contaron 50.000 eventos para estimar las células que se han teñido positivamente del grupo de FI-1 (eje de las X) frente a FI-2 (eje de las Y). Todos los datos se analizaron usando Cell QUest Software versión 3.3.
Clasificación de flujo: las células PC-3PIP se marcaron con 1 mM del compuesto YC-VIII-36 durante 30 minutos con una agitación ocasional a 37 ° en un incubador humidificado con CO2 al 5%. las células se lavaron dos veces con tampón KRB hielo frío y se guardaron en hielo. La clasificación de flujo se realizó usando un sistema FACS Aria (Becton Dickinson, San José, CA) dentro de los 15 minutos de la finalización del último lavado. Ambas subpoblaciones las teñidas (positivas) y también las no teñidas (negativas) se recolectaron en tubos estériles que contienen 3 ml de medio de cultivo completo. Después de la clasificación, las células se centrifugan, se resuspendieron en medio de cultivo temperado, se transfirieron a frascos de cultivo de tejido y se incubaron a 37 °C en un incubador humidificado con 5% de CO2 para el cultivo. Las subpoblaciones clasificadas, las células “PIP-positiva (PIP-Pos)” y “PIP-negativa (PIP-neg)”, se re-analizaron por FCA (como antes) al pase 3 para otra confirmación de su heterogeneidad.
Determinación de la dosis de saturación en la citometría de flujo: Aproximadamente 5 millones de células de cada tipo PIP-pos (clasificadas) y PC-3 flu se marcaron como se ha descrito anteriormente con unas dosis variantes del compuesto #. Las células se lavaron dos veces con tampón KRB frío y se fijaron con paraformaldehído al 2% (hielo frio). Las muestras se guardaron en hielo y protegidas de la luz hasta que se realizara el FAC. Los singletes se pusieron como se ha descrito anteriormente en un conjunto (SSC) frente a (FSC) para asegurar que se excluyen los agregados del análisis. Se usaron en el eje de las X las pantallas estándar (FI-1) para el análisis de células teñidas en todas las dosis.
Las células PC3-flu, PC-3 PIP y LNCaP fueron tratadas con el compuesto YC-VIII-36, y se analizaron usando la clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) para determinar el porcentaje de células que expresan PSMA en la superficie de la célula. La Figura 23 muestra el análisis FACS que indica el porcentaje de subpoblación de células PC3-flu, PC3-PIP y LNCaP PSMA positivas. Tal como se esperaba las células PC3-flu (PSMA-) (izquierda) muestran un porcentaje muy pequeño, mientras que las células PC-3 PIP (PSMA+, centro) y LNCaP (PSMA+, derecha) muestran unos porcentajes mayores.
Las células PC-3 PIP (PSMA+) se clasificaron usando FACS después del tratamiento con el compuesto YC-VIII-36. La Figura 24 muestra la clasificación de las células PC-3 PIP, incluyendo el porcentaje inicial (superior centro) y después de 3 pases de clasificación (inferior). La Región R2 indica la expresión positiva de PSMA en la superficie, como se ha indicado por la unión del compuesto YC-VIII-36. Los resultados muestran un aumento en el porcentaje de células que expresan PSMA después de tres turnos de clasificación de células.
Determinación del lím ite de detección (Figura 25). Las células PIP-pos se mezclaron con 10 millones de células PC3-flu por triplicado en diferentes proporciones - 1 en 106, 105, 104, 103 y 102 respectivamente. Todos los tubos que contienen suspensiones de células en medio de cultivo completo incluyendo controles [10 millones de células PC3-flu con 0% de células PIP-pos y 100 millones de células PIP-pos (100%)] se incubaron con 100 nM del compuesto # YC-VNI-36 a 37 °C en un incubador humificado con 5% de CO2 como antes, con agitación ocasional. Las células se lavaron, se fijaron con paraformaldehído al 2% como se ha descrito anteriormente y se analizaron con LSRII (Becton Dickinson, San José, CA) para la determinación del límite de detección. Los singletes se protegieron como antes en un grupo de SSC frente a fSc para excluir los agregados. Se contaron 1 millón de eventos totales para estimar las células teñidas positivamente del grupo de FI-1 (eje de las X) frente a FI-2 (eje de las Y). Se aplicaron dos ventanas, P2 a una intensidad superior (103 o superior) y P3 a una intensidad inferior (102-103) en el eje de las Y para el aná81-81,197lisis de las células positivas como se describe en la figura 4. Todos los datos se analizaron usando el DIVA 6.1.3 software.

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Compuesto que tiene la estructura:
Figure imgf000062_0001
en la que Z es un tetrazolio o CO2Q; cada Q es hidrógeno;
a es 1, 2, 3, o 4;
R es cada uno independientemente H o alquilo C1-C4 ,
cada R1 puede ser igual o diferente y se selecciona del grupo que consiste de H, alquilo C1-C6, arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16,
Ch es un resto quelante de metal seleccionado del grupo que consiste en:
Figure imgf000062_0002
Figure imgf000063_0001
que opcionalmente incluye un metal quelado, en la que el metal quelado es Tc, In, Ga, Y, Lu, Re, Cu, Ac, Bi, Pb, Sm, Sc, Co, Ho, Gd, Eu, Tb o Dy;
W es -NRC(O)-, NRC(O)NR-, NRC(S)NR-, -NRC(O)O-, -OC(O)NR-, -OC(O)-, -C(O)NR-o -C(O)O-;
Y es -C(O)-, NRC(O)-, -NRC(S)-, -OC(O)-;
V es - C(O)- o NRC(O)- o -NRC(S)- o -OC(O)-;
m es 1,2, 3, 4, 5 o 6;
n es 1,2, 3, 4, 5 o 6;
p es 1, 2 o 3 y, cuando p es 2 o 3, cada R1 puede ser igual o diferente;
cada uno de R2 y R3 es independientemente H, CO2H, o CO2R4 ;
en el que R4 es alquilo C1-C6 , arilo C2-C12 o alquilarilo C4-C16 y
en el que uno de R2 y R3 es -CO2H o -CO2R4 y el otro es H.
2. Compuesto según la reivindicación 1 que tiene la estructura:
Figure imgf000064_0001
o
que tiene la estructura:
Figure imgf000064_0002
en la que p es 1,2 o 3.
3. El compuesto de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el compuesto se selecciona de entre el grupo que consiste en:
Figure imgf000064_0003
Figure imgf000065_0001
4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1a 3, en el que el metal quelado es un isótopo radioactivo en el que el isótopo es Tc-94m, Tc-99m, In-111, Ga-67, Ga-68, Y-86, Y-90, Lu-177, Re-186, Re-188, Cu-64, Cu-67, Co-55, Co-57, Sc-47, Ac-225, Bi-213, Bi-212, Pb-212, Sm-153, Ho-166 o Dy-166.
5. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para el uso en
(a) un procedimiento para la obtención de imágenes de una o más células, órganos o tejidos mediante la exposición de la célula a, o la administración a un organismo de una cantidad eficaz del compuesto, en el que el compuesto incluye un isótopo de metal adecuado para la obtención de imágenes, o
(b) un procedimiento para el tratamiento de un tumor, que comprende la administración del compuesto, en el que el compuesto incluye un radioisótopo terapéuticamente eficaz.
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