ES2926012T3

ES2926012T3 - Métodos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de desregulaciones del microbioma asociadas con la interrupción del reloj circadiano

Info

Publication number: ES2926012T3
Application number: ES17726885T
Authority: ES
Inventors: Mathias Chamaillard
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Lille 2 Droit et Sante; Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Lille 2 Droit et Sante; Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2016-05-20
Filing date: 2017-05-19
Publication date: 2022-10-21
Anticipated expiration: 2037-05-19
Also published as: EP3458047A1; EP3458047B1; US11364219B2; WO2017198847A1; US20200390740A1; JP2019519514A; JP6918839B2

Abstract

La presente invención se refiere al tratamiento de desregulaciones del microbioma. Dichas desregulaciones pueden contribuir posteriormente al desarrollo de varias enfermedades crónicas. Por lo tanto, la caracterización de nuevos compuestos posbióticos que inducen cambios beneficiosos en las interacciones huésped-microbiota puede ser muy deseable. Los inventores demostraron que Nlrp6 coordina diurnamente la adaptación cíclica de la diversidad de la microbiota intestinal a la plasticidad epitelial en respuesta a un tratamiento con un inhibidor de Csnk2. Por lo tanto, la invención se refiere a un inhibidor de Csnk2, para su uso en el tratamiento de desregulaciones del microbioma asociadas en particular con la interrupción del reloj circadiano. Dicho inhibidor puede seleccionarse entre inhibidores selectivos de Csnk2 químicamente sintetizados o naturales tales como flavonas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de desregulaciones del microbioma asociadas con la interrupción del reloj circadiano

Sector de la técnica

La presente descripción se refiere a composiciones farmacéuticas para uso en el tratamiento de la disbiosis que está asociada con la pérdida del ritmo diurno de la microbiota intestinal.

Estado de la técnica

Durante millones de años de coevolución, la adaptación de las comunidades microbianas intestinales (la microbiota) a su entorno rico en nutrientes ha contribuido al estado físico general del hospedador. Este ecosistema microbiano altamente complejo ha sido subestimado en su importancia hasta hace poco, cuando se ha revelado una visión detallada de la diversidad de las comunidades microbianas intestinales (la microbiota).

La microbiota intestinal representa uno de los ecosistemas más densos de la tierra que se ha adaptado desde los primeros días de vida a un entorno moldeado por la compleja interacción entre mecanismos intrínsecos y extrínsecos, incluida la higiene, el sexo, el envejecimiento, la ingesta de fármacos y los hábitos alimenticios (1). Alrededor de 500 a 1000 especies bacterianas diferentes pueden estar presentes en el intestino de un individuo humano determinado. El colon es el compartimento más densamente poblado, con cifras bacterianas que alcanzan en humanos aproximadamente 1011-1012 células por gramo de contenido.

Dicha microbiota mantiene importantes funciones fisiológicas como la digestión y la regulación inmunitaria, aumentando así el estado físico general del anfitrión. El microbioma realiza innumerables funciones protegiendo al hospedador contra varias patologías. De hecho, la simbiosis hospedador-microbiota ha evolucionado en al menos tres direcciones. En primer lugar, la colonización por microorganismos comensales es clave para el desarrollo inmunitario. En segundo lugar, la comunidad comensal mantiene a raya a los patógenos invasores y evita que sean virulentos. En tercer lugar, la microbiota intestinal parece digerir los glicanos y regular el almacenamiento de grasa en ratones y potencialmente en humanos.

La inestabilidad en la microbiota intestinal y, por lo tanto, en el microbioma intestinal (conocida como disbiosis) se ha relacionado con la patogénesis de varias inmunopatologías humanas comunes, tales como cáncer, trastornos autoinmunitarios e inflamatorios cuya incidencia e impacto socioeconómico están aumentando. Como consecuencia, se han descrito varios defectos funcionales del mutualismo hospedador-microbio tanto a nivel inmunitario como metabólico, lo que ha llevado a una mayor conciencia de la importancia del microbioma intestinal en la salud y la enfermedad.

Recientemente se ha observado una oscilación diurna en la composición de la microbiota intestinal (2), que coincide con la variación de la hora del día en la autorrenovación del epitelio (3). En cambio, varias funciones intestinales basadas en el reloj se anulan en ratones libres de gérmenes (4,5). Dichos ritmos caracterizan los cambios fisiológicos cíclicos que siguen un ciclo de aproximadamente 24 horas.

Los ritmos son mantenidos por el reloj circadiano, que es una maquinaria molecular de seguimiento del tiempo intrínseca y autosuficiente, que permite a la mayoría de los organismos vivos anticipar patrones fisiológicos que se repiten regularmente. Sin embargo, la maquinaria del reloj también puede adaptarse a los cambios ambientales (6). Las perturbaciones del sistema de seguimiento del tiempo antes mencionado tienen implicaciones potencialmente amplias para la salud humana, ya que los estudios epidemiológicos han demostrado un vínculo entre las condiciones que alteran los ciclos de día y noche y una variedad de enfermedades inflamatorias crónicas (8), como el cáncer colorrectal, el síndrome metabólico y la EII.

Además, se ha demostrado que esta interrupción del reloj circadiano del hospedador, ya sea por alteración genética o cambio de tiempo, es responsable de las desregulaciones de la microbiota, también conocida como disbiosis (Thaiss et al., 2014; Liang et al., 2014) que posteriormente pueden contribuir al desarrollo de varias enfermedades crónicas, tales como la EII. De hecho, vale la pena señalar que estudios recientes de asociación de todo el genoma han revelado varios polimorfismos de un solo nucleótido que predisponen a la EII en genes implicados en el reloj circadiano, incluyendo el receptor de vitamina D (VDR; rs11168249); factor nuclear regulado por interleucina 3 (NFIL3 también conocido como E4BP4; rs4743820); y caseína cinasa tipo II (CSNK2; rs9267531). Sin embargo, a pesar de la alta relevancia fisiológica del microbioma en la aptitud del hospedador, los determinantes moleculares que subyacen a la regulación circadiana de la microbiota aún se desconocen.

Como la exposición crónica a la interrupción de la duración del tiempo circadiano afecta a millones de personas en las sociedades industrializadas de todo el mundo, existe una gran necesidad de desarrollar nuevos compuestos que sean adecuados para prevenir o tratar la disbiosis inducida por la interrupción del reloj circadiano del hospedador. De esta forma, se ha sugerido que la caracterización de nuevos compuestos postbióticos que inducen cambios beneficiosos en las interacciones hospedador-microbiota puede ser muy deseable para sujetos con alteración del reloj circadiano y, en particular, para sujetos que padecen disbiosis asociada con la alteración del reloj circadiano. Objeto de la invención

Los inventores de la presente solicitud han descrito que la proteína 6 del receptor de tipo Nod (Nlrp6) conserva la homeostasis de las criptas intestinales basada en el reloj a través de la interacción directa con la caseína cinasa 2 (Csnk2).

Demostraron que los desajustes graves del reloj en la especificación del linaje de células intestinales conducen a la acumulación de géneros bacterianos oscilantes en ratones deficientes en Nlrp6y demostraron que mecánicamente, la pérdida de Nlrp6 anula el transporte nuclear rítmico de Csnk2 a expensas de la renovación de las células columnares de la base de la cripta.

Los inventores demostraron además que la inhibición sistémica de la actividad de Csnk2 por un inhibidor de Csnk2 reprime la expansión de los progenitores en proliferación mediante la Nlrp6 funcional, a la vez que conduce a cambios en la microbiota intestinal que protegen contra la inflamación intestinal independientemente de la caspasa-1. En conjunto, sus resultados han demostrado que Nlrp6 controla la composición de la microbiota y, en particular, que Nlrp6 coordina diurnamente la adaptación cíclica de la diversidad de la microbiota intestinal a la plasticidad epitelial en respuesta a un tratamiento con un inhibidor de Csnk2, tal como un flavonoide dietético.

La invención se define mediante las reivindicaciones.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a un inhibidor de la actividad de la caseína cinasa 2 (Csnk2) para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece disbiosis que está asociada con la pérdida del ritmo diurno de la microbiota intestinal.

Normalmente, el inhibidor de Cnsk2 de acuerdo con la invención se puede seleccionar de flavonoides, tirfostinas y sus derivados, como por ejemplo la apigenina, luteolina, crisina o tirfostina AG99.

Descripción detallada de la invención

La presente divulgación se refiere a un inhibidor de la actividad de la Csnk2 para uso en el tratamiento de desregulaciones de la microbiota o de desregulaciones del microbioma asociadas con la interrupción del reloj circadiano.

Como se utiliza en el presente documento, el término "Csnk 2" tiene su significado general en la técnica y se refiere a la caseína cinasa tipo 2 o "caseína cinasa 2", también conocida como "CK2". En consecuencia, Csnk2 es una proteína cinasa selectiva de serina/treonina tetramérica compuesta por dos subunidades catalíticas a/a' y dos subunidades p no catalíticas (es decir, reguladoras) que se conservan evolutivamente en todo el reino eucariota. Esta serina/treonina cinasa ubicua, altamente pleiotrópica y constitutivamente activa es responsable de la generación de una proporción considerable del fosfoproteoma humano, como se describe, por ejemplo, por Cozza G & Pinna L A. (Expert Opin Ther Targets. 2016; 20(3): 319-40).

La expresión "inhibidor de la actividad de la caseína cinasa 2" de acuerdo con la divulgación se refiere a un compuesto, natural o no, que tiene la capacidad de inhibir (parcial o totalmente) la actividad biológica de la proteína Csnk2. El alcance de la presente divulgación incluye todos los inhibidores de Csnk2 ahora conocidos y los inhibidores de Cnsk2 que se descubrirán en el futuro. Los inhibidores de Csnk2 se clasifican comúnmente en tres categorías: (1) inhibidores que se dirigen a la subunidad reguladora de Csnk2 (por ejemplo, aptámeros peptídicos genéticamente seleccionados); (2) inhibidores de la actividad catalítica de Csnk2 (por ejemplo, quinobeno, TBB, DMAT, IQA); y (3) disruptores de holoenzimas Csnk2, que a menudo son moléculas que se unen a la interfaz de la subunidad de Csnk2 e inhiben la interacción de alta afinidad de sus subunidades. Los inhibidores de Csnk2 de cada clase pueden ser cualquier tipo de molécula, tales como, moléculas pequeñas, ácidos nucleicos funcionales, peptidomiméticos, anticuerpos (incluidos también los fragmentos de anticuerpos), o péptidos aptámeros dirigidos contra Csnk2 y, en particular, contra las subunidades catalíticas o reguladoras, de modo que se inhibe la actividad biológica de Cnsk2.

Los inhibidores de Csnk2 se pueden seleccionar de i) inhibidores competitivos de ATP (también llamados inhibidores de tipo I), capaz de interactuar directamente con el sitio de unión de ATP, bloqueando así el acceso de ATP y la reacción de fosfotransferencia o ii) los inhibidores de ATP no competitivos (inhibidores alostéricos o competidores de sustrato), que se unen a elementos estructurales no relacionados con las regiones de unión a ATP (como las descritas en Cozza et al., Expert Opinion on Therapeutic Patents, 2012; 22:9, 1081-1097).

En algunas realizaciones, el inhibidor de CK2 es un compuesto como se describe en:

- Maksim O. Chekanov, Olga V. Ostrynska, Sergii S. Tarnavskyi, Anatoliy R. Synyugin, Nadiia V. Briukhovetska, Volodymyr G. Bdzhola, Alexander E. Pashenko, Andrey A. Fokin, Sergiy M. Yarmoluk. Design, synthesis and biological evaluation of 2-aminopyrimidinones and their 6-aza-analogs as a new class of CK2 inhibitors. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry 2014 Oct; 29(5): 639-46.

- Maksim O. Chekanov, Olga V. Ostrynska, Anatoliy R. Synyugin, Volodymyr G. Bdzhola, Sergiy M. Yarmoluk.

Design, synthesis and evaluation of 2-phenylisothiazolidin-3-one-1,1-dioxides as a new class of human protein kinase CK2 inhibitors. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry 2014 Jun; 29(3): 338-43.

- Giorgio Cozza, Lorenzo A Pinna, Stefano Moro. Protein kinase CK2 inhibitors: a patent review. Expert Opinion on Therapeutic Patents Sep 2012, Vol. 22, No. 9, páginas 1081-1097.

- Cozza et al, How druggable is protein kinase CK2? Med Res Rev. 2010 May; 30(3): 419-62.

- Zhu et al., Inhibition of protein kinase CK2 expression and activity blocks tumor cell growth. Mol Cell Biochem.

2010 Jan; 333(1-2): 159-67.

- Lopez-Ramos et al., New potent dual inhibitors of CK2 and Pim kinases: discovery and structural insights. FASEB J. 2010 Sep; 24(9): 3171-85.

- Giorgio Cozza & Lorenzo A Pinna, Casein kinases as potential therapeutic targets. Expert Opin Ther Targets.

2016 Mar; 20(3): 319-40.

Los inhibidores de Csnk2 incluyen de forma no limitativa:

- Derivados polihalogenados de benzotriazol y bencimidazol, como TBB (TTBt, 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazol, Ki = 0,40 ^|j M, Código PDB: 1J91), TBI (TTBz, 4,5,6,7-1H-tetrabromobencimidazol, Ki = 0,30 j M, Código PDB: 2OXY), DRB (5,6-dicloro-1-p-D-ribofuranosilbencimidazol), derivado de indolquinazolinas como IQA (ácido [5-oxo-5,6-dihidroindol-(1,2-a)quinazolin-7-il]acético), o el análogo K25/DMAT (2-dimetilamino-4,5,6,7-tetrabromo-1H-bencimidazol, Ki = 0,04 ^jM, Código PDB: 1^zO^e);

- Compuestos naturales como las antraquinonas, flavonoides (normalmente flavonas como se describe a continuación), tirfostinas, cumarinas y sus derivados, por ejemplo, emodina (5,6-dicloro-1-P-D-ribofuranosilbencimidazol (D B), 6-metil-1,3,8-trihidroxiantraquinona) (Ki = 1,5 ^jM, Códigos PDB: 1F0Q, 3PZH, 3BQC y 3C13), quercetina (2-(3,4-dihidroxifenil)-3,5,7-trihidroxi-4H-cromen-4-ona), resorufina, ácido 4,4',5,5',6,6'-hexahidroxidifénico 2,6,2',6'-dilactona (ácido elágico), MNA (1,8-dihidroxi-4-nitroantraquinona, Ki = 0,78 j M, MNY (1,4-diamino-5,8-dihidroxi-antraquinona), quinalizarina (1,2,5,8-tetrahidroxi-antraquinona, Ki = 0,06 ^jM, Códigos PDB: 3FL5, 3Q9Y, 3Q9Z), MNX (1 ,8-dihidroxi-4-nitro-xanteno-9-ona, Ki = 0,8 ^jM) o derivados de hidroxicumarinas como DBC (3,8-dibromo-7-hidroxi-4-metilcromen-2-ona).

- Compuestos que comparten una característica carboxilo común capaz de establecer una interacción con la Lys68 fundamental del sitio de unión a ATP de Csnk2, como el IQA (ácido 5-oxo-5,6-dihidroindol-(1,2-a)quinazolin-7-il acético) de Novartis, CI50 (0,39 ^jM), Código PDB: 1OM1), el TBCA (ácido (E)-3-(2,3,4,5-tetrabromofenil)acrílico, Ki = 0,077 j M) y sus derivados como el compuesto de ácido benzoico 26 (ácido 3,4,5 tribromobenzoico CI50 = 0,64 j M) y el compuesto 10 (ácido (E)-3-(3-estibonofenil)prop-2-enoico, CI50 = 0,15 j M), u otros derivados de diferentes andamios como el compuesto 7 (ácido 5,6,8-tricloro-4-oxo-1,4-dihidroquinolina-3-carboxílico, Ki = 0,06 j M), TID46 (ácido 2-(4,5,6,7-tetrayodo-1,3-dioxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)propanoico, CI50 = 0,15 ^jM), y el compuesto a base de xanteno 35 (ácido 2,3,4,5-tetrabromo-6-(6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-benzoico, CI50 = 0,08 j M), o el CX-4945 (ácido (5-(3-cloro-fenilamino)-benzo[c][2,6]naftiridin-8-carboxílico, CI50 (0,002 ^jM), código P^dB = 3PE1).

- Pirazolo-triazina, piridocarbazol, derivados de benzopiridoindol e indenoindol caracterizados por estructuras polianulares (códigos PDB: 2PVH, 2PVJ, 2PVK, 2PVL, 2PVN y 3BE9).

- Inhibidores de CK2 dirigidos al sitio no ATP, como pequeños péptidos, como el derivado de la secuencia de CFTR con la deleción Phe508 (CI50 = 15 ^jM), péptidos cíclicos y sus análogos indol de podofilotoxina (W16, CI50 = 20 j M,) capaces de alterar la arquitectura de la holoenzima CK2 in vitro, así como otros compuestos como la hemateína (3,4,6a, 10-tetrahidroxi-6,7-dihidroinden[2, 1-c]cromen-9-ona, CI50 = 0,55 j M), derivados de benzotiazol (en particular, el compuesto ácido 1,2'-(4-dimetilamino-fenil)-3,6,3'-trimetil-[2,6']bibenzotiazolil-7-sulfónico, CI50 = 0,5 ^jM) y polioxometalatos inorgánicos (POM, CI50 = 0,0014 ^jM).

Inhibidores de Csnk2 de acuerdo con la presente divulgación incluyen también, aunque no de forma limitativa, los compuestos de cualquiera de las fórmulas descritas en las Solicitudes de patente internacional números PCT/US2007/077464, PCT/US2008/074820 y PCT7US2009/035609, y Solicitud provisional de EE. UU. números de serie 61/170.468 (presentada el 17 de abril de 2009), 61/242.227 (presentada el 14 de septiembre de 2009), 61.180.090 (presentada el 20 de mayo de 2009), 61/218.318 (presentada el 18 de junio de 2009), 61/179.996 (presentada el 20 de mayo de 2009), 61/218.214 (presentada el 14 de junio de 2009), 61 (41.806) (11 de septiembre de 2009), 61/180.099 (presentada el 20 de mayo de 2009), 61/218.347 (presentada el 18 de junio de 2009), 61/237.227 (presentada el 26 de agosto de 2009), 61/243.107 (presentada el 16 de septiembre de 2009) y 61/243.104 (presentada el 16 de septiembre de 2009), los contenidos de cada una de las cuales se incorporan como referencia en el presente documento en su totalidad. Los inhibidores de CK2 pueden sintetizarse por métodos conocidos en la técnica, incluidos los métodos divulgados en las Solicitudes de patente internacional números PCT/US2007/077464, PCT US2008/074820 y PCT/US2009/035609.

En algunas realizaciones, el inhibidor de CK2 se selecciona del grupo que consiste en:

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En algunas realizaciones, el inhibidor de CK2 es CX-4945:

CX-4945 es un potente inhibidor competitivo de ATP selectivo y disponible por vía oral de CK2, primero en su clase, con propiedades farmacológicas favorables (Siddiqui-Jain A, Bliesath J, Macalino D, Omori M, Huser N, Streiner N, Ho C^b, Anderes K, Proffitt C, O'Brien SE, Lim JK, Von Hoff DD, Ryckman DM, Rice WG, Drygin D. CK2 inhibitor CX-4945 suppresses DNA repair response triggered by DNA-targeted anticancer drugs and augments efficacy: mechanistic rationale for drug combination therapy. Mol Cancer Ther. 2012 Apr; 11(4): 994-1005. doi: 10.1158/1535-7163.MCT-11-0613. Epub 2012 Jan 20).

En algunas realizaciones, el inhibidor de CK2 es un compuesto (Compuesto 1 o Compuesto 2) que tiene la fórmula:

o una sal o éster farmacéuticamente aceptable o de los mismos.

En algunas realizaciones, el inhibidor de CK2 es un compuesto descrito en el documento WO 2011/013002 y en particular se selecciona del grupo que consiste en:

y sales o ásteres farmacéuticamente aceptables del mismo.

En algunas realizaciones, el inhibidor de CK2 es un inhibidor alostérico de CK2, es decir, un compuesto que no compite con ATP pero que aún inhibe CK2 modificando la conformación de una subunidad de CK2 (por ejemplo, CK2 alfa) de manera que la enzima quede inactiva. Los ejemplos de inhibidores alostéricos de CK2 incluyen, entre otros, derivados de azonaftaleno (compuesto M4) como se describe en Moucadel V, Prudent R, Sautel CF, Teillet F, Barette C, Lafanechere L, Receveur-Brechot V, Cochet C. Antitumoral activity of allosteric inhibitors of protein kinase CK2. Oncotarget. 2011 Dec; 2(12): 997-1010.

En algunas realizaciones, el inhibidor alostérico de CK2 es D3.1 que tiene la fórmula general de:

En algunas realizaciones, el inhibidor alostérico de CK2 es M4 que tiene la fórmula general de:

Los compuestos de la divulgación como se ha descrito anteriormente se pueden sintetizar usando métodos, técnicas y materiales conocidos por los expertos en la materia, tal y como se describe, por ejemplo, en March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY 4.thEd., (Wiley 1992); Carey and Sundberg, ADVANCED ORGANIC CHEMISTY 3.rd Ed., Vols. A y B (Plenum 1992), y Green and Wuts, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS 2.nd Ed. (Wiley 1991). Los materiales de partida útiles para preparar los compuestos de la divulgación y los intermedios de los mismos están comercializados por varias fuentes, tales como Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, Wis.), Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.), Maybridge (Cornualles, Inglaterra), Asinex (Winston-Salem, NC), ChemBridge (San Diego, CA), ChemDiv (San Diego, CA), SPECS (Delft, Holanda), Timtec (Newark, DE), o como alternativa puede prepararse por métodos sintéticos bien conocidos (véase, por ejemplo, Harrison et al., "Compendium of Synthetic Organic Methods", Vols. 1-8 (John Wiley and Sons, 1971 - 1996); "Beilstein Handbook of Organic Chemistry", Beilstein Institute of Organic Chemistry, Frankfurt, Alemania; Feiser et al., "Reagents for Organic Synthesis", Volúmenes 1 -21, Wiley Interscience; Trost et al., "Comprehensive Organic Synthesis", Pergamon Press, 1991; "Theilheimer's Synthetic Methods of Organic Chemistry", Volúmenes 1 -45, Karger, 1991; March, "Advanced Organic Chemistry", Wiley Interscience, 1991; Larock "Comprehensive Organic Transformations", VCH Publishers, 1989; Paquette, "Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis", 3d Edition, John Wiley & Sons, 1995). Otros métodos para la síntesis de los presentes compuestos y/o materiales de partida de los mismos se describen en la técnica o serán fácilmente evidentes para el experto en la materia. Se pueden encontrar alternativas a los reactivos y/o grupos protectores en las referencias proporcionadas anteriormente y en otros compendios bien conocidos por los expertos en la materia. En particular, la preparación de los presentes compuestos puede incluir uno o más pasos de protección y desprotección (por ejemplo, la formación y eliminación de grupos acetal). Puede encontrar una guía para seleccionar grupos protectores adecuados, por ejemplo, en Greene & Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley Interscience, 1999. Asimismo, la preparación puede incluir varias purificaciones, tal como cromatografía en columna, cromatografía ultrarrápida, cromatografía de capa fina (TLC), recristalización, destilación, cromatografía líquida de alta presión (HPLC) y similares. Además, también se pueden utilizar varias técnicas bien conocidas en las artes químicas para la identificación y cuantificación de productos de reacción química, tales como la resonancia magnética nuclear de protón y carbono-13 (RMN de H y 13C), espectroscopía infrarroja y ultravioleta (IR y UV), cristalografía de rayos X, análisis elemental (AE), HPLC y espectroscopia de masas (EM). La preparación también puede implicar cualquier otro método de protección y desprotección, purificación e identificación y cuantificación que son bien conocidos en las artes químicas.

Los inhibidores naturales de Csnk2 seleccionados entre antraquinonas, flavonoides, tirfostinas y sus derivados, en particular entre las flavonas, las tirfostinas y sus derivados son particularmente preferidos de acuerdo con la presente invención. También se describen ejemplos no limitativos adicionales de tales compuestos en Lolli G et al. (Biochemistry 2012; 51: 60-97-6107). Entre los ejemplos de dichos compuestos se incluyen, además de los compuestos antes mencionados, quercetina, fisetina, kaempferol, luteolina, apigenina, crisina y tirfostina AG99. Normalmente, naringenina, naringina, hesperitina, taxifolina, galangina, biocanina A y genisteína no se usan como inhibidores de Csnk2 de acuerdo con la divulgación.

En particular los inhibidores de Cnsk2 seleccionados entre flavona, tirfostinas y sus derivados son muy adecuados de acuerdo con la divulgación. Lo más preferentemente, los inhibidores de Cnsk2 se pueden seleccionar del grupo de compuestos que consisten en apigenina, luteolina, crisina y tirfostina AG99, especialmente apigenina, luteolina y tirfostina AG99. Lo más preferentemente, un inhibidor de Csnk2 es apigenina, un componente destacado de la dieta humana.

Preferentemente, un inhibidor de Csnk2 de acuerdo con la divulgación (natural o no) tiene una CI50 menor de 10, lo más preferentemente menor de 5 pm, incluso más preferentemente menor de 1 pM para Csnk2. Preferentemente, también el inhibidor seleccionado es un inhibidor selectivo de Csnk2. Normalmente, dicho inhibidor selectivo tiene una CI50 mayor de 1 pM, especialmente mayor de 10 pM para G-CK y CK1, especialmente CK1a.

En algunas realizaciones, la inhibición de la actividad de Csnk2 también puede lograrse a través de un inhibidor de la expresión del gen Csnk2. De acuerdo con la presente divulgación, un inhibidor de Csnk2 se refiere a un compuesto natural o sintético que tiene un efecto biológico para inhibir o reducir significativamente la expresión del gen. Por ejemplo, en la presente divulgación se podrían usar construcciones de oligonucleótidos antisentido o ARN inhibidores pequeños (ARNip), como inhibidores de la expresión del gen Csnk2. Como ejemplo, se pueden usar oligómeros quiméricos de a Dn/ARN monocatenario o ARNip, específicamente dirigidos a Csnk2a/a' (Trembley JH, Unger GM, Korman VL, et al., PLoS One 2014;9(10):e109970; Unger GM, Kren BT, Korman VL, et al., Mol Cancer Ther 2014;13(8): 2018-29; Kren BT, Unger GM, Abedin MJ, et al., Breast Cancer Res 2015;17:19).

La microbiota se refiere a la totalidad de microorganismos que están presentes en o sobre un sujeto. El microbioma se refiere a la totalidad de microorganismos y su material genético colectivo presente en o sobre un sujeto. Por lo tanto, las desregulaciones del microbioma tienen como resultado directamente la desregulación de la microbiota. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "desregulaciones de la microbiota" o "desregulaciones del microbioma" se refiere preferentemente a "desregulaciones de la microbiota intestinal" y "desregulaciones del microbioma intestinal" respectivamente. Como se utiliza en el presente documento, "desregulaciones del microbioma", en particular, "desregulaciones del microbioma intestinal" se refiere en particular a la disbiosis. La disbiosis, también denominada "desequilibrio microbiano" se puede definir como un repertorio desviado de la microbiota o microbioma intestinal.

Aún falta una caracterización completa de la microbiota, en particular debido a la extrema complejidad y variabilidad en la composición de esta comunidad microbiana dentro de los individuos. Sin embargo, el componente bacteriano de la microbiota ha sido objeto de intensos estudios en los últimos años impulsados por proyectos a gran escala como el Proyecto Microbioma Humano (véase Petersen et al., The NIH Human Microbiome Project. Genome Res.

2009; (12): 2317-23). Los estudios metagenómicos han establecido que a pesar de la amplia variabilidad interpersonal en la composición de la comunidad, hay un núcleo compartido de funcionalidades en el microbioma. Partiendo de este conocimiento, la bibliografía que caracteriza la microbiota está creciendo rápidamente (véase Clemente et al., Cell 2012; 148(6): 1258-70; Sartor RB, Mucosal Immunology 2011; 4(2): 127-132, véase también Frank DN et Pace NR Current Opinion in Gastroenterology 2001, 17:52-57, que revisa los análisis de la microbiota gastrointestinal humana).

El desequilibrio microbiano en un sujeto dado puede caracterizarse por comparación de la microbiota de dicho sujeto con la microbiota de al menos un sujeto sano. La distinción en la composición de la comunidad puede revelar un desequilibrio microbiano. El análisis de microbiota se puede realizar en una muestra de microbiota intestinal, como una muestra fecal.

Preferentemente, el al menos un sujeto sano no sufre ningún problema metabólico, inflamatorio, enfermedad inmunitaria o cancerosa. Preferentemente, también el al menos un sujeto sano no sufre un trastorno del ritmo circadiano. Normalmente, dicho sujeto no sufre EII, síndrome metabólico, diabetes o cáncer colorrectal. Normalmente también, el sujeto tiene un patrón de sueño normal y un patrón regular de ingesta de alimentos.

Además, preferentemente, el al menos un sujeto sano tiene la misma edad, el mismo sexo y es de la misma área geográfica que el sujeto dado. Preferentemente también el al menos un sujeto sano tiene la misma dieta (por ejemplo, una dieta de tipo occidental) que el sujeto dado. De manera ventajosa, la comparación de la microbiota intestinal se realiza con un perfil de microbiota saludable de más de un sujeto sano (es decir, una población sana). La regulación o las desregulaciones del microbioma en un sujeto determinado también pueden detectarse analizando cualitativa y/o cuantitativamente los metabolitos de una muestra de microbioma intestinal (por ejemplo, una muestra fecal) y comparando el perfil de metabolitos obtenido con el perfil metabólico de al menos un sujeto sano (como se ha definido anteriormente). Por ejemplo, se puede realizar un análisis cuantitativo de compuestos de flavona (como la apigenina) en una muestra de microbioma intestinal en un sujeto determinado y comparar el resultado con el nivel de flavona en al menos un sujeto sano, preferentemente en una población sana. La desregulación del microbioma se puede caracterizar normalmente por un nivel reducido de compuestos de flavona en un sujeto determinado en comparación con el nivel en al menos un sujeto sano.

Los metabolitos que pueden considerarse producidos de forma diferente en el microbioma de un sujeto dado en comparación con al menos un sujeto sano pueden estar regulados al alza en al menos 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o más o regulados a la baja en al menos 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o más.

En algunas realizaciones, la disbiosis está asociada con un aumento de los niveles de bacterias nocivas generalmente asociado con niveles reducidos de bacterias beneficiosas y/o por una disminución de la diversidad bacteriana.

Un ejemplo no limitativo de bacterias nocivas/beneficiosas puede ser:

Ejemplo de bacterias nocivas/beneficiosas también se describen en Clemente et al., Cell 2012; 148(6): 125-1270; Sartor Mucosal Immunology 2011; 4(2): 127-132; Schwabe FR et Jobin C, Nat Rev Cancer. 2013 Nov; 13(11): 800 812; Gagniere J. et al., World J Gastroenterol. 2016 Jan 14; 22(2): 501-18; Keku TO et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2015 Mar 1; 308(5): G351-63.

Adicionalmente, como se ha mencionado anteriormente, la composición de la microbiota intestinal y, por lo tanto, del microbioma intestinal también está sujeta a oscilaciones diurnas, que coincide con la variación de la hora del día en la autorrenovación del epitelio. Como se muestra por los resultados incluidos en la presente solicitud, la ausencia de Nlrp6 se asocia con una fuerte acumulación de géneros bacterianos que oscilan diurnamente, lo que conduce a una composición alterada de la microbiota. De forma más general, los datos actuales muestran que Cnsk2 orquesta la oscilación diurna bien caracterizada de la actividad de las células madre epiteliales a través de la represión de la actividad de Nlrp6. La expresión desregulación de la microbiota o desregulación del microbioma asociada con la interrupción del reloj circadiano también se refiere a una pérdida de la ritmicidad diurna de la microbiota intestinal o del microbioma intestinal.

Por lo tanto, en este contexto, los sujetos que padecen disbiosis pueden caracterizarse normalmente por un cambio y/o pérdida de la variación diurna de la microbiota intestinal. La pérdida de la ritmicidad diurna de la microbiota se puede detectar en un sujeto mediante un análisis en serie de la microbiota intestinal a lo largo del día (como se ilustra, por ejemplo, en los resultados, pero véase también Thaiss CA et al., Gut Microbes. 2015; 6(2): 137-42 o Thais CA et al., Cell. 2014; 159(3): 514-29).

Como se utiliza en el presente documento, la "interrupción del reloj circadiano" se refiere a la interrupción de los ritmos circadianos de un sujeto que normalmente hace posible que los organismos coordinen su biología y comportamiento con los cambios ambientales diarios en el ciclo día-noche.

Como se utiliza en el presente documento, el término "sujeto" indica un mamífero, preferentemente un sujeto humano.

En una realización particular, un sujeto de acuerdo con la invención sufre un trastorno del sueño asociado con el ritmo circadiano, como el trastorno de la fase avanzada del sueño (ASPD), caracterizado por dificultad para permanecer despierto por la noche y dificultad para permanecer dormido por la mañana, trastorno de la fase retrasada del sueño (DSPD), caracterizado por un inicio y final del sueño mucho más tardío de lo normal y un período de máxima alerta en medio de la noche, ritmo irregular de sueño y vigilia, o trastorno de sueño y vigilia que no es de 24 horas, en el que el sueño del individuo afectado se produce cada vez más tarde cada día, con el período de alerta máxima también cambiando continuamente de hora de día a día. Un sujeto de acuerdo con la invención también puede tener riesgo de un trastorno del sueño asociado al ritmo circadiano, por ejemplo, debido a la edad, noches de trabajo, turnos rotativos, o una enfermedad como la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, o cualquier enfermedad de salud mental.

En alguna realización, un sujeto de acuerdo con la invención (preferentemente humano) también puede padecer o ser susceptible de padecer disbiosis. De acuerdo con la invención, el término "sujeto" se refiere a un sujeto que padece o es susceptible de padecer una disbiosis causada por la interrupción del reloj circadiano del hospedador. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "disbiosis que predispone a enfermedades" tiene su significado general en la técnica y se refiere a enfermedades inducidas por disbiosis que están asociadas con la interrupción del reloj circadiano del hospedador, como la EII, síndrome metabólico, obesidad, intolerancia a la glucosa, alergias y cánceres (Jones et al., 2016; Scavuzzi et al., 2016; Thaiss et al., 2014; Liang et al., 2014).

Los términos "tratamiento", "para tratar" o "tratar" y similares se refieren a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. Este efecto es notablemente terapéutico en términos de mejora o curación parcial o total de la enfermedad y/o efectos adversos atribuibles a la enfermedad. Tratamiento abarca cualquier tratamiento de la enfermedad en un mamífero, en particular, un ser humano, destinado a inhibir el síntoma de la enfermedad, (es decir, detener su desarrollo) o aliviar el síntoma de la enfermedad (es decir, provocar la regresión de la enfermedad o los síntomas). Los términos "tratamiento", "para tratar" o "tratar" y similares también se refieren a obtener un efecto profiláctico farmacológico y/o fisiológico deseado en términos de prevención total o parcial de la enfermedad o un síntoma de la misma. Abarca, por lo tanto, cualquier tratamiento de la enfermedad en un mamífero, en particular, un ser humano, destinado a prevenir la aparición de la enfermedad o síntoma en un sujeto que puede tener riesgo o estar predispuesto a la enfermedad o síntoma, pero que aún no se ha diagnosticado que la padece.

En particular, la expresión "tratamiento de las desregulaciones de la microbiota" o "tratamiento de las desregulaciones del microbioma" incluye, en particular, la restauración de la ritmicidad diurna de la funcionalidad beneficiosa de la microbiota intestinal o del microbioma intestinal y/o la disminución de la proporción de bacterias nocivas, en particular las bacterias nocivas para el intestino.

Adicionalmente, los datos obtenidos por los inventores muestran en conjunto que la inhibición de Csnk2 regula las funciones metabólicas y reduce la inflamación intestinal. A modo de ejemplo, sus datos demuestran que los ratones de tipo silvestre en ciclos LD (12 horas de luz/12 horas de oscuridad) tratados con un inhibidor de Csnk2 tuvieron una pérdida de peso corporal menos pronunciada tras la administración oral de dextrano sulfato de sodio (DSS), como modelo preclínico de colitis. Además, se evidenció notablemente una infiltración reducida de células inflamatorias en cortes representativos de colon teñidos con hematoxilina y eosina de ratones tratados con inhibidor de Csnk2 en comparación con los controles.

Por lo tanto, la expresión "tratamiento de las desregulaciones de la microbiota o de las desregulaciones del microbioma" también puede referirse a la prevención de las desregulaciones de la microbiota o de las desregulaciones del microbioma. Tal prevención y, en particular, la prevención diurna es de particular interés en un sujeto que sufre o corre el riesgo de sufrir una alteración del sueño relacionada con el ritmo circadiano. En una realización no abarcada por la invención reivindicada, un inhibidor de Csnk2 también se puede utilizar como tratamiento profiláctico en pacientes sanos. Preferentemente dicho paciente sano tiene riesgo de sufrir trastornos del ritmo circadiano, o tiene riesgo de padecer una enfermedad inflamatoria, una enfermedad inmunitaria, una enfermedad metabólica o un cáncer. Dicho riesgo podrá establecerse en función de los antecedentes patológicos familiares o de los hábitos higiénico-dietéticos.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, la expresión "tratamiento de las desregulaciones de la microbiota" también puede referirse a la prevención de varias enfermedades asociadas con la interrupción del ritmo circadiano y, de acuerdo con la invención, de enfermedades inducidas por desregulaciones de la microbiota asociadas con la interrupción del ritmo circadiano, tal como el cáncer colorrectal, el síndrome metabólico y la EII. Por lo tanto, un inhibidor de CK2 de acuerdo con la presente divulgación puede usarse en sujetos con riesgo de cáncer colorrectal, síndrome metabólico y EII, por ejemplo, debido a antecedentes patológicos familiares, o régimen dietético, o en la prevención de recaídas del cáncer colorrectal.

La expresión "tratamiento de las desregulaciones de la microbiota" también se refiere al mantenimiento de una condición saludable, en particular de las funciones fisiológicas digestivas e inmunitarias normales.

En este contexto, un inhibidor de Csnk2 de acuerdo con una realización no abarcada por la invención reivindicada puede usarse como un suplemento dietético en ausencia de cualquier síntoma patológico y particularmente en ausencia de cualquier síntoma digestivo o inmunitario para mantener la regulación digestiva e inmunológica fisiológica.

El inhibidor de la expresión del gen Csnk2 o el inhibidor de Csnk2 pueden administrarse en forma de una composición farmacéutica. Preferentemente, dicho inhibidor se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz. Por una "cantidad terapéuticamente eficaz" se entiende una cantidad suficiente del inhibidor de la expresión del gen Csnk2 o del inhibidor de Csnk2 para tratar y/o prevenir desregulaciones microbianas en una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico.

En algunas realizaciones de la invención, por una "cantidad terapéuticamente eficaz" también se entiende una cantidad suficiente del inhibidor de la expresión del gen Csnk2 o del inhibidor de Csnk2 para prevenir varias enfermedades inducidas por desregulaciones de la microbiota que están asociadas con la interrupción del ritmo circadiano.

En algunas realizaciones no abarcadas por la invención reivindicada, por una "cantidad terapéuticamente eficaz" también se entiende una cantidad suficiente del inhibidor de la expresión del gen Csnk2 o del inhibidor de Csnk2 para mantener al sujeto en un estado saludable, en particular para mantener las funciones digestivas y/o inmunitarias fisiológicas normales en dicho sujeto.

Se entenderá que el uso diario total de los compuestos y composiciones de la presente divulgación la puede decidir el médico responsable dentro del alcance del buen criterio médico. El régimen dietético o terapéutico específico para cualquier sujeto en particular puede depender de una variedad de factores que incluyen el trastorno o la desregulación a tratar o prevenir y su gravedad; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada, la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo y la dieta del paciente; el momento de la administración, la vía de administración y la tasa de secreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; los fármacos usados en combinación o de manera coincidente con el polipéptido específico empleado; y factores similares bien conocidos en la técnica médica. Por ejemplo, se encuentra dentro de la capacidad del experto iniciar las dosis del compuesto a niveles inferiores que los necesarios para conseguir el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta que se logre el efecto deseado.

Por "régimen terapéutico o dietético" se entiende el patrón de dosificación usado durante la terapia. Un régimen terapéutico o dietético puede incluir un régimen de inducción y un régimen de mantenimiento. La expresión "régimen de inducción" o "período de inducción" se refiere a un régimen terapéutico o dietético (o la parte de un régimen terapéutico o dietético) que se usa para el tratamiento inicial. El objetivo general de un régimen de inducción es proporcionar un alto nivel de fármaco a un sujeto durante el período inicial de un régimen de tratamiento. Un régimen de inducción puede emplear (en parte o en su totalidad) un "régimen de carga", que puede incluir la administración de una dosis mayor del fármaco que la que emplearía un médico durante un régimen de mantenimiento, administrar un fármaco con más frecuencia de lo que un médico administraría el fármaco durante un régimen de mantenimiento, o ambos. La expresión "régimen de mantenimiento" o "período de mantenimiento" se refiere a un régimen terapéutico o dietético (o la parte de un régimen terapéutico o dietético) que se usa para el mantenimiento de un sujeto durante el tratamiento de un trastorno o una desregulación, por ejemplo, para mantener al sujeto en remisión o en buen estado de salud durante largos períodos de tiempo (meses o años). Un régimen de mantenimiento puede emplear una terapia continua (por ejemplo, administrar un fármaco a intervalos regulares, por ejemplo, diariamente, semanalmente, mensualmente, anualmente, etc.) o terapia intermitente (por ejemplo, tratamiento interrumpido, tratamiento intermitente, tratamiento en la recaída).

El inhibidor de la expresión del gen Csnk2 o los inhibidores de Csnk2 para usar de acuerdo con la presente divulgación pueden combinarse con excipientes farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, matrices de liberación sostenida, tales como polímeros biodegradables, para formar composiciones terapéuticas o dietéticas. En las composiciones farmacéuticas o dietéticas de la presente divulgación, el principio activo, solo o en combinación con otro principio activo, se puede administrar en una forma de administración unitaria, como una mezcla con soportes farmacéuticos o fisiológicos convencionales, a animales y seres humanos. Las formas de administración unitarias adecuadas comprenden formas de administración oral, tales como comprimidos, cápsulas de gel, polvos, gránulos y suspensiones o soluciones orales, formas de administración sublingual y bucal, aerosoles, implantes, subcutánea, transdérmica, tópica, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, subdérmica, transdérmica, formas de administración intratecal e intranasal y formas de administración rectal. Preferentemente, la administración adecuada se realiza por vía oral o rectal.

Preferentemente, la composición farmacéutica contiene vehículos que son farmacéuticamente o fisiológicamente aceptables para una formulación que puede inyectarse. Estos pueden ser en particular soluciones salinas isotónicas, estériles, (fosfato monosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares o mezclas de dichas sales) o composiciones secas, especialmente liofilizadas que tras la adición, dependiendo del caso, de agua esterilizada o solución salina fisiológica, permiten la constitución de las soluciones inyectables. Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles; incluyendo las formulaciones aceite de sésamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de que pueda inyectarse fácilmente. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe protegerse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias, virus y hongos.

Las soluciones que comprenden compuestos de la divulgación en forma de base libre o de sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse adecuadamente en agua mezcladas con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.

El inhibidor de la expresión del gen Csnk2 o el inhibidor de Csnk2 de la divulgación se puede formular en una composición en forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente o fisiológicamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden obtenerse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férricos, y bases orgánicas, tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.

El vehículo también puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, usando un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, se preferirá incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. Puede lograrse la absorción prolongada de las composiciones mediante el uso en las composiciones de agentes que retarden la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación farmacéutica y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una diversidad de formas farmacéuticas, por ejemplo mediante cápsulas de liberación de fármacos y similares, otras formas farmacéutica o fisiológicamente aceptables incluyen, por ejemplo, comprimidos u otros sólidos para administración oral; formulaciones liposomales; cápsulas de liberación controlada; y cualquier otra forma usada en la actualidad. En una realización no abarcada por la invención reivindicada, la presente divulgación también se refiere a un método para tratar las desregulaciones de la microbiota, incluidas las asociadas con la interrupción del reloj circadiano, que comprende la administración de un inhibidor de Csnk2 como se ha descrito anteriormente a un sujeto que lo necesite.

En una realización, no abarcada por la invención reivindicada, la presente divulgación también se refiere a un método para el mantenimiento de una buena salud y/o para mantener la regulación digestiva e inmunitaria fisiológica que comprende administrar a un sujeto un suplemento dietético que comprende un inhibidor de Csnk2 como se ha descrito anteriormente. Dicho suplemento dietético puede administrarse de acuerdo con un régimen dietético como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, dicha suplementación sistémica con inhibidor de Csnk2 puede administrarse en un momento específico durante el día, en particular, cuando la absorción de los inhibidores de Cnsk2 de la dieta es menos eficaz.

En alguna realización, el sujeto sufre o tiene riesgo de sufrir un trastorno del sueño asociado con el ritmo circadiano. En alguna realización no abarcada por la invención reivindicada, el suplemento dietético se administra en ausencia de cualquier síntoma patológico y, en particular, en ausencia de cualquier síntoma digestivo o inmunitario.

La divulgación se ilustrará adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes del alcance de la presente divulgación.

Descripción de las figuras

Figura 1: La acumulación de bacterias que oscilan diurnamente coincide con la expresión cíclica de péptidos antimicrobianos e interleucina-18 en ratones deficientes en Nlrp6. A. Abundancia relativa de una OTU bacteriana que oscila dentro de la microbiota intestinal de ratones de tipo silvestre (n=5 por ZT) y ratones deficientes en Nlrp6 (n=6 por ZT). B. Oscilaciones circadianas de la relación Bacteroidetes/Firmicutes en ratones de tipo silvestre (n=5 por ZT) y ratones deficientes en Nlrp6 (n=6 por ZT) durante 3 días consecutivos. C.

Intensidad media de señales positivas de lisozima en el área de la mucosa de ratones de tipo silvestre (n = 4 por ZT) y Nlrp6~A (n=4 por ZT). D. Expresión de genes antimicrobianos en tejido ileal de ratones de tipo silvestre (n = 4-5 por punto temporal) y Nlrp6~A (n= 5-6 por punto temporal). E. Número de células positivas para Muc2 dentro del área de la mucosa de ratones de tipo silvestre (n = 4 por ZT) y Nlrp6~A (n=4 por ZT). F . Niveles de proteína IL-18 en explantes de tejido colónico de ratones de tipo silvestre (n = 4-5 por punto temporal) y Nlrp6~A (n= 5-6 por punto temporal). G. Expresión relativa del gen que codifica IL-18 en tejido colónico de ratones de tipo silvestre (n= 4-5 por ZT) y Nlrp6~A (n= 5-6 por ZT). Los símbolos en blanco y negro representan ratones de tipo silvestre y Nlrp6~A respectivamente. La barra de escala representa 100 mm. Las barras de error muestran el EEM. *p<0,05 **p<0,01.

Figura 2: La expresión epitelial cíclica de Nlrp6 regula el reloj circadiano. A. Oscilación del nivel de transcripción para Nlrp6, Bmal1 y Dbp en el colon y el intestino delgado de ratones de tipo silvestre (n=5). B,C.

Expresión génica en tejido del intestino delgado de ratones de tipo silvestre y Nlrp6~A (n=5). D. Imágenes representativas de la tinción inmunofluorescente en organoides del intestino delgado. Las barras de escala representan 50 pm. E. Imágenes representativas de la inmunotinción Ki67 en muestras de tejido colónico. La barra de escala representa 100 mm. Los símbolos en blanco y negro representan ratones de tipo silvestre y Nlrp6-/-respectivamente. Las barras de error muestran el EEM. *p<0,05 **p<0,01.

Figura 3: Nlrp6 regula la cronobiología de la autorrenovación del epitelio a través de la caseína cinasa 2. A, Coinmunoprecipitación de la proteína Nlrp6-3xFlag-GFP en tejido ileal con Ab anti-FLAG Ab. B, Los extractos nucleares (N) y citoplásmicos (C) de MEF de tipo silvestre y deficientes en Nlrp6 en ZT12 y ZT24 se sometieron a análisis de transferencia Western usando anticuerpos anti-CNSK2, anti-pERK y anti-ERK. Los resultados mostrados son representativos de dos experimentos independientes. C, Las 5 principales vías de señalización como resultado del régimen de 3 semanas de apigenina (750 pg/ratón, dos veces a la semana). Se representan números de genes expresados diferencialmente para cada ruta enriquecida. D, Expresión del gen reloj en tejido colónico de ratones tratados con vehículo y tratados con apigenina. E, Número promedio de células Ki67+ por cripta colónica. F, Pérdida de peso corporal de ratones de tipo silvestre (n=5) que fueron pretratados con apigenina durante 3 semanas (750 pg/ratón, dos veces por semana) antes de la administración de DSS al 2 %.

G, longitud del colón. H, Puntuación histológica. I, Pérdida de peso corporal de ratones Nlrp6-/-(n=4) que fueron pretratados con apigenina durante 3 semanas (750 pg/ratón, dos veces por semana) antes de la administración de DSS al 2 %. J, longitud del colón. K, Puntuación histológica. Las barras de error muestran el EEM. *p<0,05. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes. Los símbolos en blanco y negro representan ratones de tipo silvestre y Nlrp6-/- respectivamente.

Figura 4: El control de la microbiota intestinal por Nlrp6 contribuye al efecto antiinflamatorio de la apigenina. Los ratones NT y Api se alojaron conjuntamente durante 3 semanas de tratamiento con Api. A, Análisis de coordenadas principales de las comunidades bacterianas fecales perfiladas a partir de ratones de tipo silvestre (n=5) y Nlrp6-/- (n=5) que fueron tratados o no con apigenina. Las coordenadas principales se calcularon sobre distancias Jaccard basadas en la no abundancia que representan la composición de la comunidad de las muestras comparadas. La pérdida de peso corporal (B, E), la longitud del colon (C, F), y la puntuación de colitis (D, G) se presentan para ratones de tipo silvestre (n=5) y Nlrp6-/-(sh n=4, ch n=5). Los símbolos en blanco y negro representan ratones de tipo silvestre y Nlrp6-/- respectivamente. Las barras de error muestran el EEM. *p<0,05. Las barras de escala representan 100 pm.

Ejemplo:

Los resultados proporcionados en el presente documento muestran que Nlrp6 sustenta la oscilación diurna de las interacciones hospedador-microbiota a través de la caseína cinasa 2. En otras palabras, los autores demostraron que el inflamasoma Nlrp6 no canónico regula el reloj circadiano a través de Csnk2.

La exposición crónica a la interrupción de la duración del tiempo circadiano (por ejemplo, el trabajo en turnos de noche o el sueño inadecuado) afecta a millones de personas en todo el mundo. Las consecuencias para la salud de la disfunción del sueño incluyen la susceptibilidad a las enfermedades inflamatorias del intestino a través de mecanismos poco conocidos. En el presente documento, demostramos que la proteína 6 del receptor tipo Nod (Nlrp6) conserva la homeostasis de la cripta intestinal basada en el reloj a través de la interacción directa con la caseína cinasa 2 (Csnk2). Las desalineaciones graves del reloj en la especificación del linaje de células intestinales conducen a la acumulación de géneros bacterianos oscilantes en ratones deficientes en Nlrp6. Mecanísticamente, la pérdida de Nlrp6 anula el transporte nuclear rítmico de Csnk2 a expensas de la renovación de las células columnares de la base de la cripta. En cambio, la inhibición de la actividad de Csnk2 por el flavonoide apigenina reprime la expansión de los progenitores en proliferación a través de la Nlrp6 funcional, a la vez que conduce a cambios en la microbiota intestinal que protegen contra la inflamación intestinal independientemente de la caspasa-1. En conjunto, Nlrp6 coordina diurnamente la adaptación cíclica de la diversidad de la microbiota intestinal a la plasticidad epitelial en respuesta a los flavonoides de la dieta.

Listado de abreviaturas. ANOSIM: análisis de similitud, Arntl: proteína similar al translocador nuclear del receptor de hidrocarburos arilo, Csnk2: fosvitina/caseína cinasa tipo II, DSS: dextrano sulfato de sodio, IEC: células epiteliales intestinales, eGFP: proteína fluorescente verde mejorada, ERK1/2: cinasas 1 y 2 reguladas por señales extracelulares, EII: enfermedades inflamatorias intestinales, LD: 12 horas de luz/12 horas de oscuridad, MEF: fibroblastos embrionarios de ratón, Nlrp6: receptor 6 similar al dominio de oligomerización de unión a nucleótidos (NOD), OTU: unidades taxonómicas operativas, Ppar-alfa: receptor activado por el proliferador de peroxisomas alfa, Ppar-gamma: receptor activado por el proliferador de peroxisomas gamma, Rora, receptor huérfano A relacionado con RAR, ARNr: ^aRⁿribosomal 16S, ZT: Zeitgeber (Temporizador).

Materiales y métodos

Ratones y reactivos. El ratón Nlrp6-3xFlag-IRES-eGFP se generó en el Institut Clinique de la Souris (Illkirch, Francia; más detalles disponibles bajo petición). Los ratones deficientes en Nlrp6 (Nlrp6-/-) y de control C57BL6/J de la misma edad y sexo tenían libre acceso a una dieta de comida de laboratorio estándar en una exposición de ciclo de luz de medio día y un ambiente con temperatura controlada. Todos los estudios en animales fueron aprobados por la junta de revisión de investigación local (CEEA232009R) en un establecimiento acreditado (N° B59-108) de acuerdo con las directrices gubernamentales N°86/609/CEE. El modelo experimental de colitis se realizó como se ha descrito previamente10. El muestreo de tejido y sangre se realizó en condiciones de LD, siendo ZT0 el inicio del período de luz (8 a.m.) y ZT12 el crepúsculo vespertino (8 p.m.). La apigenina (750 pg/ratón; Santa Cruz) se administró por vía intraperitoneal dos veces por semana en ZT6 durante un período de 1 o 3 semanas.

Aislamiento de IEC primarias, generación y cultivo de fibroblastos embrionarios de ratón inmortalizados. Las IEC primarias y las células mononucleares de la lámina propia (LPMC) se aislaron del íleon distal y el colon como se ha descrito anteriormente 31. Las LPMC CD11b+ se enriquecieron con el kit Miltenyi siguiendo las instrucciones del fabricante. Para el aislamiento de fibroblastos, las IEC se aislaron y desecharon y el tejido restante se recogió y se lavó en PBS. Utilizando un bisturí estéril, se cortó tejido colónico en pequeños trozos (25-30 trozos). En el fondo de la placa de cultivo de células estándar, se grabó la red con un bisturí estéril y los trozos de tejido se colocaron en las uniones de la red con el lado luminal hacia abajo. Las placas se dejaron secar durante 20 minutos y se dejó que el tejido se adhiriera al fondo de la placa y al medio de cultivo DMEM, se añadió cuidadosamente FCS al 10 % suplementado con penicilina/estreptomicina al 5 %. Las placas se incubaron a 37 °C, 5 % de CO2. Durante los cinco días siguientes, el medio de las placas se cambió diariamente por DMEM fresco, FCS al 10 %, penicilina/estreptomicina al 2,5 % y después 2 veces por semana DMEM fresco, FCS al 10 %, penicilina/estreptomicina al 1 %. Se controló diariamente la presencia de células individuales que salían de las partes de tejido. Después de 5 días de cultivo, se observaron primero fibroblastos grandes en forma de estrella. Después de un total de 3 semanas de cultivo, las partes de tejido se retiraron de las placas, las células en suspensión se lavaron con PBS y las células unidas se separaron mediante incubación 2 veces con tripsina/EDTA durante 5 min, 37 °C. Las células de unión se sedimentaron a 400xg durante 3 min y se transfirieron al matraz de cultivo celular en DMEM, FCS al 10 %, penicilina/estreptomicina al 1 %. Las células se pasaron dos veces por semana y se usaron para manipulación adicional en el pase 4. Se generaron fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) inmortalizados a partir de embriones que se obtuvieron en el día embrionario E13,5 a 14,5 de cuernos uterinos de hembras preñadas deficientes en Nlrp6 y de tipo silvestre. Se extrajo la placenta y el saco vitelino de cada embrión que se había eviscerado y decapitado antes de la digestión con tripsina/EDTA al 0,25 % enfriada con hielo durante 20 minutos a 37 °C. Después de neutralizar la digestión con tripsina, las células suspendidas se pasaron a través de un filtro de 100 M y se cultivaron en matraces recubiertos de gelatina al 0,1 % con medio de cultivo DMEM (Life technology) suplementado con FBS al 10 %, aminoácidos no esenciales y antibióticos). Se utilizaron MEF inmortalizados (MEFi) con más de 25 pases. Se sembraron MEFi (0,08 x 106 células) por triplicado en una placa de 6 pocillos en medio DMEM Glutamax (Life technologies) que contenía ITS-A al 2 % (Life technologies) FBS al 2 % 24 h antes del experimento. Cada 24 horas durante 7 días, las células se recogieron mediante tripsinización y se contaron utilizando el dispositivo Countess® de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Life technologies). La sincronización de los MEF se realizó como se ha descrito anteriormente 32. El compuesto orgánico sintetizado químicamente U0126 se usó a 20 M (Sigma-Aldrich).

Formación de organoides intestinales y tinción inmunofluorescente. Las criptas del intestino delgado se aislaron como se ha descrito anteriormente 33. Se sembraron quinientas criptas/pocillos en placas de fondo redondo embebidas en 10 pl/pocillo de Matrigel de factor de crecimiento reducido (Corning). Tras una incubación de 20 min a 37 °C, las criptas con 5 % de CO2 se sobrecargaron con 100 pl/pocillo de medio de criptas como se ha descrito anteriormente 33. El medio se intercambió cada 4 días. En el día 6 después de la siembra, los organoides se recuperaron de la Matrigel añadiendo Cell Recovery Solution (BD Bioscience) y a continuación se trataron con 0,8 U/pl de ADNasa y 0,3 U/pl de dispasa en HBSS para obtener células individuales. A continuación, la suspensión celular se tiñó con tinción Live/Dead conjugada con AF488 (Life Technologies), se fijó, se permeabilizó y se incubó con Ab anti-Ki67 eFluor660 (clon SolA15, eBioscience). A continuación, las células se adquirieron en BD FACS Canto II y los resultados se analizaron con el software FlowJo. Para la tinción inmunofluorescente, los organoides se fijaron con PFA al 4 % y se incluyeron en agarosa de bajo punto de fusión al 4 % como ya se describió 34. Se obtuvieron cortes de 150 mm usando un vibratomo HM650V (Thermo Fisher Scientific). Se utilizaron anticuerpos anti-Ki67 efluor660 clon:SolA15 (eBioscience) y faloidina conjugada con AF488 (Life Technologies). Los núcleos se tiñeron con DAPI (1 pg/ml, Life Technologies). Los cortes se montaron con reactivo ProLong Gold Antifade (Life Technologies). Las imágenes se adquirieron utilizando el microscopio confocal de barrido multipunto Opterra (Bruker).

Inmunohistoquímica, inmunofluorescencia y análisis histológico. El tejido intestinal se fijó en formalina, se deshidrató en series de concentración creciente de alcoholes y tolueno antes de ser embebido en parafina. Para la inmunohistoquímica, se colocaron cortes de tejido de 5 pm de espesor en portaobjetos Superfrost Plus (Thermo Scientific), se incubaron durante 10 min a 60 °C y se rehidrataron mediante una serie de alcoholes graduados y agua destilada. Las peroxidasas endógenas se bloquearon con peróxido de hidrógeno al 3 % durante 10 min. La recuperación del antígeno se realizó en tampón citrato (10 mM, pH 6) sometiendo a vapor los cortes en un horno de microondas durante 20 min. Los cortes de tejido se bloquearon con BSA/PBS al 5 % durante 30 min a TA y se aplicó directamente Ab primario contra Ki67 (1:100, ab15580, Abcam), Anticuerpo anti-Flag M2 (1:100, F3165, Sigma) o caspasa 3 escindida (1:50, 9661, Cell Signalling) y se incubó durante una hora a temperatura ambiente (TA) o durante la noche a 4 °C. Los portaobjetos se lavaron 3 veces en PBS antes de aplicar Ab secundario anti-IgG de conejo de cabra conjugado con peroxidasa (1:100, Interchim) o anti-IgG de ratón de cabra conjugado con peroxidasa (1:100, Interchim) dos horas a TA. Los antígenos diana se visualizaron utilizando una solución de 3,3'-diaminobencidina (BD Pharmingen) seguido de una contratinción nuclear con hematoxilina. El procedimiento de tinción de inmunofluorescencia se realizó mediante la incubación durante la noche a 4 °C del anticuerpo primario contra lisozima (A0099, Dako) a 1:1000 de acuerdo con el protocolo proporcionado por Cell Signaling Technology. El Ab secundario (1:200, A11008, Life Technologies) se aplicó durante 1 hora a TA seguido de una contratinción nuclear con DAPI. Los cortes de tejido se cubrieron utilizando el reactivo ProLongR Gold Antifade (Life Technologies). Los análisis microscópicos se realizaron utilizando el microscopio de imagen Zeiss Axioplan 2, Microscopio Axio Imager Z1, Software Axiovision (todo de Zeiss, Oberkochen, Alemania) y el software ImageJ. Se realizó la tinción de los criocortes (5 m) para teñir la GFP en el tejido colónico de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Cell Signaling Technology). Se usaron Ab policlonal anti-GFP de conejo (1/1000, Molecular Probes) y Ab monoclonal anti-integrina 6 de rata (1/100, BD Pharmingen) como Abs primarios y se incubaron juntos en las muestras durante 3 horas a TA. Se aplicaron Ab secundario anti-conejo de cabra acoplado a AF488 y Ab anti-rata de cabra acoplado a AF594 (1:500, Molecular Probes) durante 1 hora a TA seguido de contratinción con DAPI. Los cortes se cubrieron con Mowiol.

Cribado de dos híbridos, coinmunoprecipitación y transferencia Western. El cribado de dos híbridos bacterianos se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Agilent technologies). Las muestras de tejido del íleon distal se lisaron en tampón PY (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, Tritón X-100 al 1 % (v/v), pH=8) suplementado con inhibidores completos de la proteasa (Roche). Se usaron proteína G recombinante Sepharose (Life Technologies) y Ab anti-Flag M2 de ratón (Sigma-Aldrich) para precipitar la proteína Nlrp6 de las proteínas tisulares totales de ratones Nlrp6-3xFlag-IRES-eGFP. Las proteínas para la transferencia Western se aislaron mediante la lisis de las células MEF en tampón Ripa (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, Tritón X-100 al 1 % (v/v), SDS al 0,1 % (p/v), desoxicolato de sodio al 0,5 % (p/v), suplementado con inhibidores de la proteasa completos (Roche). La concentración de proteínas se midió con el kit Pierce BCA (Thermo Fisher) y se cargaron 10 pg de proteínas en Blot LDS Sample Buffer y Blot Sample Reducing Agent en gel Blot 4-12 % Bis-Tris Plus (Life Technologies). Se utilizaron iBlot2 y NC Regular Stocks para la transferencia de muestras a la membrana y una solución de leche al 5 % para el bloqueo y la dilución del Ab. Se usaron los siguientes Ab primarios: anti-actina de conejo (Interchim), anti-Csnk2 de conejo (Sigma), anti-fosfo ERK1/2 de conejo (Cell Signalling), anti-ERK1/2 de conejo (Cell Signalling), anti-Flag M2 de ratón (Sigma), anti-Nlrp6 E20 de cabra (Santa Cruz), anti-SPl de conejo (Santa Cruz) y anti-tubulina de ratón (Cell Signalling). Como anticuerpos secundarios se usaron Ab anti-IgG de cabra de burro conjugado con peroxidasa (Santa Cruz), Ab anti-IgG de ratón de cabra conjugado con peroxidasa (Interchim) y Ab anti-IgG de conejo de cabra conjugado con peroxidasa (Interchim).

Análisis de explantes de tejido. La parte de tejido colónico distal (0,5 cm de largo) se abrió longitudinalmente y se lavó bien en PBS para desechar las heces y los desechos. El tejido se incubó en DMEM GlutaMax, FCS al 10 % (v/v), penicilina/estreptomicina al 1 % (v/v) y se dejó a 37 °C, 5 % de CO2 durante 8 h. La IL-18 se midió en el medio por ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (MBL).

Expresión génica y análisis de micromatrices. El ARN aislado se transcribió inversamente con el kit de síntesis de ADNc (Agilent Technologies), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc resultante (equivalente a 5 ng de ARN total) se amplificó utilizando el kit de PCR en tiempo real SYBR Green y se detectó en un Stratagene Mx3005P (Agilent Technologies). Se realizó una RT-PCR con cebadores directos e inversos (secuencias disponibles bajo pedido). Al finalizar la amplificación por PCR, se llevó a cabo un análisis de la curva de fusión del ADN para confirmar la presencia de un único amplicón. Se utilizó Actb como gen de referencia interno para normalizar los niveles de transcripción. Los niveles relativos de ARNm (2-Ct) se determinaron comparando (a) los umbrales del ciclo de PCR (Ct) para el gen de interés y los valores Actb (ACt) y (b) ACt para los grupos tratados y de control (ACt). El análisis de micromatrices en IEC que se aislaron de ratones tratados con apigenina o vehículo se realizó como se ha descrito anteriormente10. El análisis de ontología génica se realizó como se ha descrito anteriormente utilizando la prueba exacta de Fisher de dos caras28. Los procesos biológicos asociados con los genes de interés se obtuvieron del Gene Ontology Consortium (http://www.geneontology.org).

Análisis de microbiota. La región variable V3 y V4 del gen del ARNr 16S se amplificó usando cebadores de fusión indexados dobles, en resumen, los cebadores consisten en la secuencia del conector Illumina, la secuencia de código de barras de 12 bases y el espaciador de heterogeneidad seguido de las secuencias del cebador directo (319F: ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) o inverso (806R: GGACTACHVGGGTWTCTAAT) específicas del gen del ARNr 16S 29. El ADN se amplificó utilizando los cebadores compuestos mencionados anteriormente por duplicado en un sistema GeneAmp PCR 9700 (Applied Biosystems, Foster City, California, EE. UU.) utilizando las siguientes condiciones de ciclado: una desnaturalización inicial de 3 min a 98 °C seguida de 30 ciclos, desnaturalización a 98 °C durante 10 segundos, hibridación a 50 °C durante 30 segundos y elongación a 72 °C durante 30 segundos. La extensión final fue a 72 °C durante 10 minutos. El producto amplificado se aplicó a gel de agarosa para evaluar el tamaño del amplicón y el rendimiento de la amplificación. Las cantidades de amplicones se normalizaron utilizando el kit SequalPrep (Invitrogen) y se agruparon como una sola biblioteca. La secuenciación se realizó con Illumina MiSeq utilizando un kit de secuenciación 2 x 300 con cebadores estándar HP10 y HP11. Las lecturas de secuenciación se procesaron principalmente para el control de calidad utilizando el software MOTHUR. Las lecturas directa e inversa se ensamblaron para formar cóntigos, la lecturas que no tienen cebadores ni códigos de barras específicos perfectamente coincidentes, que tenían cualquier base ambigua y más de 8 homopolímeros se eliminaron del análisis posterior. Se detectaron y eliminaron las secuencias que no se alinean con las regiones variables V3-V4 bacterianas deseadas, las sospechas de quimera y probablemente de origen no bacteriano. Las secuencias con al menos un 97 % de similitud se agruparon en unidades taxonómicas operativas (OTU). Estas OTU se clasificaron taxonómicamente utilizando la base de datos de taxonomía y referencia RDP modificada de Mothur30. El análisis de coordenadas principales (PcoA) se realizó en distancias Jaccard entre comunidades. Las coordenadas principales se visualizaron usando rgl con el paquete de aplicación R (www.r-project.org). Se realizó un análisis de indicadores para identificar OTU prominentes que contribuyen a las diferencias entre los grupos analizados. El índice de diversidad de Shannon no paramétrico se calculó como una medida del índice de diversidad alfa. Las diferencias estadísticas se determinaron mediante la prueba no paramétrica de Mann-Whitney.

Estadística. Los datos se analizaron utilizando Prism4.0 (GraphPad Software, San Diego, CA). Se usó la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis con la prueba de comparación múltiple de Dunn, la prueba no paramétrica de Mann-Whitney o la prueba paramétrica ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Bonferroni. Se implementó el algoritmo JTK_cycle para detectar posibles componentes cíclicos en OTU a nivel de especie 12. La herramienta utiliza un método de prueba no paramétri

patrones de ritmo) en subconjuntos de datos en grupos independientes ordenados según un algoritmo combinado de Jonckheere-Terpstra-Kendall. Los valores representan la media de datos normalizados /- EEM. Asterisco, diferencia significativa P < 0,05.

Resultados

El progreso reciente en la secuenciación de alto rendimiento ha permitido una visión detallada de la arquitectura de las comunidades microbianas intestinales (la microbiota) que se han adaptado desde los primeros días de vida a un entorno moldeado por la compleja interacción entre mecanismos intrínsecos y extrínsecos, incluida la higiene, el sexo, el envejecimiento, la ingesta de fármacos y los hábitos alimenticios (1). La presencia de nichos ecológicos estables mantiene importantes funciones fisiológicas como la digestión o la regulación inmunitaria, aumentando así el estado físico general del anfitrión. Se observan oscilaciones diurnas en la composición de la microbiota intestinal en función del tiempo de alimentación, sexo y varios componentes centrales del reloj del hospedador (2, 3, 4), que coincide con la variación de la hora del día en la autorrenovación del epitelio (3). En cambio, varias funciones intestinales basadas en el reloj se anulan en ratones libres de gérmenes (4), incluida la detección de glucocorticoides por parte de las células epiteliales intestinales (IEC) (5). Dichos ritmos caracterizan los cambios fisiológicos cíclicos que siguen un ciclo de aproximadamente 24 horas. Los ritmos son mantenidos por el reloj circadiano, que es una maquinaria molecular de seguimiento del tiempo intrínseca y autosuficiente, que permite a la mayoría de los organismos vivos anticipar patrones fisiológicos que se repiten regularmente. Sin embargo, la maquinaria del reloj también puede adaptarse a los cambios ambientales (6). Las perturbaciones del sistema de seguimiento del tiempo antes mencionadas tienen implicaciones potencialmente amplias para la salud humana. Aproximadamente entre el 15 y el 20 % de los trabajadores trabajan regularmente en horarios de trabajo por turnos que implican trabajo nocturno (7), lo que puede alterar los ritmos circadianos a lo largo de toda la vida laboral. Los estudios epidemiológicos han demostrado una relación entre las condiciones que alteran los ciclos día-noche (por ejemplo, trabajo por turnos, privación del sueño, jet lag) y una variedad de enfermedades inflamatorias crónicas (8), como los síndromes metabólicos y las enfermedades inflamatorias intestinales (EII). A pesar de una influencia obviamente fuerte de la ingesta rítmica de nutrientes, sorprendentemente, se sabe poco sobre cómo se regula la interacción entre las IEC y la microbiota intestinal y cómo se mantiene la estabilidad de dicha interacción mutualista durante un ciclo diurno.

Se ha demostrado que el receptor 6 similar al dominio de oligomerización de unión a nucleótidos (NOD) (Nlrp6) controla la homeostasis intestinal al regular la composición de la microbiota intestinal (9-11). Para determinar si Nlrp6 puede controlar la composición de la microbiota intestinal a lo largo del día, aplicamos un algoritmo no paramétrico JTK_cycle para la detección de variables de ciclo en perfiles bacterianos basados en la secuenciación del gen del ARN ribosomal (ARNr) 16S de muestras fecales que se recolectaron cada doce horas durante un período de tres días (12). Acorde con los hallazgos previos (2), se observó que la abundancia de ~0,6 % (42/2672) de unidades taxonómicas operativas (OTU) bacterianas oscilaba durante el día (valor P < 0,05, después de la corrección de Benjamini-Hochberg, Fig. 1A). Entre estas OTU que oscilan rítmicamente, 8 OTU estaban compartidas entre ratones de tipo silvestre y deficientes en Nlrp6 que fueron alimentados ad libitum en condiciones estrictas de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad (LD). Se demostró que solo 8 OTU únicas mostraban un comportamiento oscilatorio en ratones de tipo silvestre. Por el contrario, la ausencia de Nlrp6 condujo a una fuerte acumulación de géneros bacterianos oscilantes diurnamente con 26 OTU que se caracterizaron por un patrón de ritmo significativo (valor de P < 0,05, después de la corrección de Benjamini-Hochberg, Fig. 1A). Entre las OTU cíclicas antes mencionadas, la mayoría de ellas estaban relacionadas con el grupo Clostridiales. Como consecuencia, la ritmicidad alterada condujo a una composición alterada de la microbiota con una fluctuación más fuerte de la relación Bacteroides/Firmicutes (Fig. 1B) que, en última instancia, contribuye al estado prediabético conocido en ratones deficientes en Nlrp6 (13). Y lo que es más importante, se observaron cambios rítmicos de los niveles de transcripción de varios péptidos antimicrobianos en el íleon distal de ratones deficientes en Nlrp6 (no mostrados). Como consecuencia, se observó que los gránulos que contienen lisozima de las células de Paneth eran menos abundantes en ratones deficientes en Nlrp6 al amanecer (tiempo Zeitgeber 0, ZT0), y no se observaron diferencias en ZT6 y ZT12 (Fig. 1C, D). Este patrón de expresión rítmica de los genes antes mencionados en ratones deficientes en Nlrp6 se correlacionaba con el número de IEC positivas para Muc2 (Fig. 1E) y la oscilación de ambos transcritos (Fig. 1F) y con el nivel de proteína (Fig. 1G) de interleucina-18 que se cree que previene la maduración de las células caliciformes (14). Esta fase anormal en el tiempo podría explicar la acumulación de géneros bacterianos oscilantes diurnamente que conjuntamente podrían ser responsables de los signos de disbiosis en ratones deficientes en Nlrp6 (9).

Dada la disminución nocturna de la hormona liberadora de corticotropina (también conocida como corticoliberina) (5), planteamos la hipótesis de que la expresión de Nlrp6 puede variar como resultado de las fluctuaciones diarias de dicha hormona peptídica liberada por el hipotálamo que se sabe que reprime la expresión de Nlrp6 (15). Cabe destacar que, por sí sola, se observó variación a lo largo del ciclo circadiano para el nivel de transcripción de Nlrp6 tanto en el íleon distal como en el colon (Fig. 2A). La batifase de la expresión de Nlrp6 en el intestino delgado y grueso se correlacionó inversamente con la expresión rítmica de la proteína similar al translocador nuclear del receptor de hidrocarburos arilo (también conocida como Arntl o Bmall) (Fig. 2B) que se sabe que está regulada por la señalización del receptor A huérfano relacionado con RAR (Rora) en las IEC (5). De acuerdo con la hipótesis, el análisis de la expresión génica en el íleon distal de ratones deficientes en Nlrp6 revelaron oscilaciones diurnas anormales de Bmal1 (Fig. 2B) y de varios receptores nucleares (Fig. 2C); cuya desregulación se ha demostrado que causa el síndrome metabólico (5). Particularmente, la expresión génica del receptor activado por el proliferador de peroxisomas alfa (Ppar-alfa) y gamma (Ppar-gamma) se redujo durante la "fase de reposo" tanto en el íleon distal como en el colon de los ratones de tipo silvestre, pero permaneció en el nivel más alto en ratones deficientes en Nlrp6 (Fig. 2C). Consecuentemente, el intestino delgado y grueso de los ratones deficientes en Nlrp6 mostraron una mayor expresión de nocturnina que se sabe que mejora la actividad de Ppar-gamma (Fig. 2C). En conjunto, nuestros resultados revelaron una activación epitelial exacerbada de los receptores nucleares que pueden hacer que la barrera intestinal de los ratones deficientes en Nlrp6 sean más propensos a respuestas inflamatorias a lesiones en el transcurso del día.

Para definir qué tipo de célula puede expresar Nlrp6 en la interfaz intestinal con la microbiota, generamos un ratón con el gen desactivado que expresa Nlrp6 con una etiqueta 3xFlag carboxi-terminal y un casete IRES-eGFP (no se muestra). El análisis qRT-PCR reveló una expresión restringida de Nlrp6 a IEC diferenciadas (datos no mostrados) como se describió para Ppar-gamma (16), lo que fue confirmado por inmunofluorescencia y análisis inmunohistoquímico (datos no mostrados). A continuación, utilizamos un modelo de IEC cultivadas tridimensionalmente (también conocidas como organoides) obtenidas del yeyuno de ratones de tipo silvestre y deficientes en Nlrp6. Curiosamente, la pérdida de la expresión de Nlrp6 en organoides dio como resultado una mayor proporción de células Ki67+ (Fig. 2D). Se observaron hallazgos similares en fibroblastos embrionarios de ratón (Me F) que se obtuvieron de ratones deficientes en Nlrp6 en los que se observó una mayor activación de las cinasas 1 y 2 reguladas por señales extracelulares (ERK1/2) y la señalización de Akt en respuesta a LPS (datos no mostrados). A continuación, evaluamos el crecimiento celular tras el tratamiento con U0126, que es un inhibidor selectivo de la señalización de las cinasas 1 y 2 reguladas por señales extracelulares (ERK1/2). Se vio que la tasa de crecimiento de los MEF de tipo silvestre tratados con U0126 era comparable a la de los MEF deficientes en Nlrp6 tratados de manera similar (datos no mostrados). También se observó un mayor índice de proliferación de iEc colónicas en el crepúsculo vespertino mediante análisis inmunohistoquímico utilizando Ki67 (datos no mostrados), sin embargo, se observó que el número de células positivas para caspasa-3 escindidas era similar entre los ratones de tipo silvestre y deficientes en Nlrp6 (datos no mostrados). En consecuencia, el mayor riesgo de colitis en ratones Nlrp6~/- coincidió con ciclos desregulados de IEC y una mayor expresión de genes diana de ERK1/2 implicados en la proliferación de IEC (10). Estos resultados sugerían que la expresión epitelial rítmica de Nlrp6 probablemente esté involucrada en un mantenimiento basado en el reloj de la función de la barrera epitelial.

Para obtener más información sobre cómo la señalización de Nlrp6 puede dictar la autorrenovación epitelial diurna, realizamos un cribado bacteriano de dos híbridos de una biblioteca de ADNc de MEF aplicando el dominio de pirina de Nlrp6 de ratón como cebo. Dos clones superpuestos positivos contenían un ADNc que codifica la subunidad beta reguladora de fosvitina/caseína cinasa tipo II (Csnk2p, OMIM 115441). Csnk2 es una proteína cinasa selectiva de serina/treonina tetramérica que se conserva evolutivamente en todo el reino eucariota. Curiosamente, Csnk2 es un miembro central del reloj circadiano involucrado en la regulación del alargamiento del período y las vías de respuesta al estrés (17,18). En Drosophila, el mutante Andante se caracteriza por la pérdida de Csnk2, lo que da como resultado períodos circadianos anormalmente largos (17). Como predijo nuestra evaluación de dos híbridos, Nlrp6 inmunoprecipitó endógenamente junto con Csnk2 p en el intestino de ratones (Fig. 3A). Dado que Csnk2 se transloca al compartimento nuclear tras la activación (19), a continuación postulamos que la mayor activación de la señalización de ERK1/2 en ausencia de Nlrp6 puede ser el resultado de un transporte anormal día-noche de Csnk2 (20, 21). Consecuentemente, se observó que la oscilación diurna del transporte nuclear de Csnk2 p y ERK1/2 fosforilada se interrumpió en ausencia de Nlrp6 de una manera dependiente de la hora del día (Fig. 3B). Para evaluar si Nlrp6 puede funcionar aguas abajo de Csnk2, utilizamos apigenina (4',5,7-trihidroxiflavona), como una flavona vegetal natural que es un inhibidor competitivo de ATP de la actividad de Csnk2. Cabe señalar que, el análisis de micromatrices reveló un subconjunto específico de 54 genes que se expresaron diferencialmente con un Logfc de 1,5 en ratones de tipo silvestre tras la administración de apigenina. Curiosamente, se observó que la firma del tratamiento con apigenina estaba enriquecida en genes asociados con el cáncer y la señalización del ritmo circadiano (Fig. 3C). Especialmente, el análisis de qRT-PCR reveló que los niveles de transcripción en el colon de varios genes de la maquinaria del reloj estaban significativamente influenciados por la administración de apigenina a través de Nlrp6 (Fig. 3d). Como consecuencia, un régimen de tres semanas de apigenina redujo la proliferación de IEC como se muestra en la tinción de Ab anti-Ki67 sin ningún cambio en el número de IEC positivas para caspasa-3 (Fig. 3 D). Por el contrario, el efecto antiproliferativo de la apigenina se anuló en ratones deficientes en Nlrp6 (Fig. 3D). Estos hallazgos demuestran contundentemente que Cnsk2 orquesta la bien caracterizada oscilación diurna de la actividad de las células madre epiteliales a través de la represión de la actividad de Nlrp6.

Las flavonas son una clase de flavonoides, que son un componente destacado de la dieta humana. El flavonoide dietético apigenina es un fármaco prometedor para el tratamiento de varias enfermedades asociadas con la interrupción del ritmo circadiano. Los ratones de tipo silvestre tratados con apigenina en ciclos de LD tuvieron una pérdida de peso corporal menos grave tras la administración oral de sulfato dextrano de sodio (DSS) (Fig. 3F). Tras la administración de apigenina, un índice de actividad de la enfermedad más bajo se correlacionó con una mayor longitud del colon como se observó con otras flavonas (22). Acorde con esto, se puso notablemente de evidencia una infiltración reducida de células inflamatorias en cortes representativos del colon teñidos con hematoxilina y eosina de ratones tratados con apigenina en comparación con los controles (Fig. 3J). Por el contrario, no se observó ningún efecto antiinflamatorio de la apigenina cuando los ratones se mantuvieron en la oscuridad durante tres ciclos circadianos durante la exposición a DSS. A continuación, determinamos si la apigenina puede proteger contra la colitis inducida por DSS a través de Nlrp6. Acorde con nuestros hallazgos anteriores, el tratamiento de ratones que carecían de Nlrp6 con apigenina no logró mejorar la enfermedad consuntiva (Fig. 4), no alteró la longitud del colon (Fig. 3J) y no tuvo efecto sobre la inflamación en el análisis histológico posterior (Fig. 3K). En conjunto, estas observaciones demuestran que Nlrp6 determina en gran medida si la apigenina protege a los ratones de la inflamación intestinal.

Por secuenciación del gen del ARNr 16S, abordamos si el papel antiinflamatorio de la apigenina estaba asociado con alteraciones en la composición bacteriana de la microbiota intestinal. El análisis estadístico de similitud (ANOSIM) en las distancias de Jaccard reveló que la composición de la microbiota intestinal de los ratones de tipo silvestre tratados con apigenina era marcadamente diferente de la de los controles (R2 = 0,33, p = 0,015; Fig. A). Los cambios inducidos por apigenina entre las OTU bacterianas incluyeron una expansión de varios géneros derivados de Bacteroidetes, incluido Alistipes, Parasatuerlla y Bacteroides. Y lo que es más importante, el tratamiento con apigenina en ratones de tipo silvestre condujo a una reducción en Clostridium sensu stricto y Ruminococcaceae sin clasificar y que fácilmente se vía que oscilaba en ratones deficientes en Nlrp6. De acuerdo con hallazgos previos (9), los cambios a gran escala en la composición de la microbiota intestinal dieron lugar a una diversidad bacteriana reducida en ausencia de Nlrp6 (p = 0,001). Particularmente, la ecología bacteriana intestinal de ratones deficientes en Nlrp6 se caracterizó por una menor abundancia de bacterias no flageladas y productoras de butirato pertenecientes al filo Bacteroidetes (incluyendo Alistipes, Barnesiella y Allobaculum), que se correlacionó con un sobrecrecimiento de géneros no clasificados Porphyromonadaceae y Clostridiales. Para confirmar el papel de la disbiosis inducida por apigenina en la homeostasis intestinal, los ratones tratados con vehículo y apigenina se alojaron conjuntamente durante un período de tres semanas antes de la exposición a DSS. Especialmente, la enfermedad consuntiva mejoró en animales tratados con vehículo con alojamiento compartido en un grado similar al observado en ratones de tipo silvestre que recibieron apigenina (Fig. 4B, C, D). Por el contrario, los experimentos de alojamiento compartido en ratones deficientes en Nlrp6 no revelaron ninguna diferencia en la protección contra la colitis entre los animales alojados en alojamiento compartido y los animales alojados individualmente (Fig. 40-R). Consecuentemente, no logramos observar cambios globales en la composición de la microbiota intestinal (ANOSIM, p = 0,283) de ratones deficientes en Nlrp6 tratados con apigenina y vehículo (Fig. 4E, F, G). En conjunto, estos resultados muestran que el arrastre del reloj circadiano por la apigenina se acompaña de alteraciones dependientes de Nlrp6 en la microbiota intestinal, que confieren una protección transmisible contra la inflamación intestinal.

En conjunto, se concluye que Nlrp6 orquesta la oscilación diurna de la proliferación de IEC y de la ecología bacteriana intestinal. Demostramos que Nlrp6 actúa aguas abajo de Csnk2, lo que puede alargar el período circadiano en una variedad de especies (17, 18). Y lo que es más importante, la inhibición farmacológica de la actividad de Csnk2 por parte de la apigenina en la dieta hizo que los ratones estuvieran protegidos contra la inflamación intestinal a través de Nlrp6. La apigenina es una flavona vegetal natural que es un ingrediente biológicamente activo de la medicina tradicional china para tratar una amplia gama de enfermedades. Principalmente, los experimentos de alojamiento compartido revelaron que la actividad protectora de la microbiota condicionada por apigenina es incluso transmisible a ratones adultos de tipo silvestre. Por el contrario, los ratones deficientes en Nlrp6 tratados con apigenina no confirieron protección a los animales mutantes no tratados con alojamiento compartido. Cabe señalar que, la actividad biológica de la apigenina depende principalmente de la actividad catabólica de algunos comensales con actividad de escisión del anillo C que se encuentran dentro de la microbiota intestinal (23). Ahora se espera con impaciencia más investigaciones para evaluar la absorción y el metabolismo de las flavonas por la microbiota intestinal de los pacientes con EII, que se sabe que es menos diversificada. Comprender este paradigma es un requisito previo para el desarrollo de la medicina personalizada en pacientes con EII que experimentan trastornos metabólicos y del sueño graves. Asimismo, estudios recientes de asociación de todo el genoma han revelado un alelo que predispone a la EII en el gen que codifica CSNK2 (24) que se expresa menos y se transloca menos en el núcleo de las criptas colónicas de pacientes con EII (25, 26). Curiosamente, también se ha observado que varios otros componentes del reloj circadiano se expresan diferencialmente en la EII (25), además de estar involucrados en la predisposición a la EII, incluido el receptor de vitamina D (rs11168249); regulado por factor nuclear y la interleucina 3 (rs4743820) (27, 28). En conjunto, nuestros resultados abogan por la necesidad de considerar la terapia cronobiológica en la EII mejorando la biodisponibilidad de las flavonas y nutracéuticos dietéticos con actividad inhibidora conocida de Csnk2, ya que influye en gran medida en la renovación del epitelio intestinal y el resultado de la colitis al determinar la arquitectura de la microbiota a través de Nlrp6.

Referencias

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A lo largo de esta solicitud, diversas referencias describen el estado de la técnica a la que pertenece esta divulgación.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Inhibidor de la actividad de la caseína cinasa 2 (Csnk2) para uso en el tratamiento de un sujeto que padece disbiosis que está asociada con la pérdida del ritmo diurno de la microbiota intestinal.

2. Inhibidor de la actividad de la Csnk2 para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el sujeto sufre o tiene riesgo de sufrir un trastorno del sueño asociado con el ritmo circadiano.

3. Inhibidor de la actividad de la Csnk2 para uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicho inhibidor se selecciona de flavonas, tirfostinas y sus derivados.

4. El inhibidor de la actividad de la Csnk2 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho inhibidor se selecciona del grupo que consiste en apigenina, luteolina y tirfostina AG99.

5. Inhibidor de la actividad de la Csnk2 para uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicho inhibidor es apigenina.