CN114081878A - 木犀草素在制备提高肠道中akk菌相对丰度的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了木犀草素在制备提高肠道中AKK菌相对丰度的药物中的应用。本发明发现，木犀草素能够提高肠道中AKK菌相对丰度，降低厚壁菌门(Fimicutes)的相对丰度。而AAK菌可发挥益生菌作用，在糖尿病、肝脏疾病、心血管疾病、炎症性肠病、神经退行性疾病等疾病中都呈现出了负相关趋势，且能与中药和化学药物相互作用治疗疾病。因此可以将木犀草素用于制备提高肠道中AKK菌相对丰度的药物。
Description
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体涉及木犀草素在制备提高肠道中AKK菌相对丰度的药物中的应用。
背景技术：
在人体的肠道中有数以万计、种类复杂的细菌、真菌和寄生虫等，被称之为肠道微生物。在肠道的不同部位，菌群的组成和数量各不相同，不同区段的消化道中优势菌群的种类和丰度存在较大差异。肠道菌群在长期的进化过程中，形成动态平衡，维持着人体的健康；但当人体的生理功能受到影响时，肠道菌群就会失衡，进而导致疾病的产生。近年来，越来越多的研究发现肠道微生态失衡与多种疾病的发生和发展有着密切的关系，如肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化和抑郁症等。研究人员利用多组学技术联合对肠道菌群进行研究，在疾病的治疗和预防中发挥了积极的作用，也发现了一些尚未发现的，且功能突出的肠道菌群。
嗜黏蛋白艾克曼氏菌Akkermansia muciniphila简称AKK菌，于2004年被发现。AKK菌是从人体肠道中被分离出来的一种椭圆形革兰阴性菌，被作为黏液降解菌，广泛存在于人体肠道中，能在肠道粘液层中增殖，并依靠宿主分泌的黏蛋白进行生存。越来越多的研究表明， AAK菌可发挥益生菌作用，在糖尿病、肝脏疾病、心血管疾病、炎症性肠病、神经退行性疾病等疾病中都呈现出了负相关趋势，且能与中药和化学药物相互作用治疗疾病。
查阅文献与专利资料，沈鹤霄等2018年申请专利(专利号201810395759.2)，提供一种提高肠道中AKK菌/致病菌比值的复合制剂，并且应用于制备大肠中AKK菌丰度，减少致病菌丰度的口服制剂。该复合物包括低聚糖、植物提取物、真菌提取物、牛磺酸钠和沙枣提取物。据马文玉综述文章嗜粘蛋白艾克曼式菌的药理作用研究进展报道，中药党参、小檗碱、富含原花青素的蔓越莓、柠檬等也可以提高人体内AKK菌的丰度。
木犀草素(luteolin)属于黄酮类化合物，其基本结构特征是3',4',5,7-四羟基取代黄酮。木犀草素广泛存在于多种植物中，一般在植物体内以糖苷的形式存在，进入人体后则经肠道分解变为苷元发挥作用。木犀草素具有多种药理活性，如消炎、抗过敏、降尿酸、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等。
发明内容：
本发明的目的是提供木犀草素或其药用盐在制备提高肠道中AKK菌相对丰度的药物中的应用。
本发明通过实验发现：
1、木犀草素可以有效得提高正常小鼠肠道中AKK菌的丰度值，并且能够通过粪菌移植的手段实现定植和增殖。并且还能降低拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Fimicutes)的相对丰度。
2、肠炎模型肠道菌群16S测序分析显示，木犀草素可以显著的改变肠道菌群结构，增加 AKK菌属相对丰度。并且还能降低厚壁菌门(Fimicutes)和变形菌门(Proteobateria)的相对丰度。
3、经木犀草素激活的受体组肠道AKK菌，经粪菌移植后，可以实现定植和有效增殖。并且还能降低拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Fimicutes)的相对丰度。
由此可见，木犀草素可以提高肠道中AKK菌的相对丰度，因此可以将木犀草素或其药用盐在制备提高肠道中AKK菌相对丰度的药物中的应用。
本发明的第二个目的是提供木犀草素在降低肠道中厚壁菌门(Fimicutes)的相对丰度药物中的应用。
所述的肠道可以是正常肠道，也可以是肠炎患者的肠道，或者肥胖患者的肠道，对于这些肠道，服用木犀草素都有增加肠道中AKK菌相对丰度的功能。
本发明发现，木犀草素能够提高肠道中AKK菌相对丰度，降低厚壁菌门(Fimicutes)的相对丰度。而AAK菌可发挥益生菌作用，在糖尿病、肝脏疾病、心血管疾病、炎症性肠病、神经退行性疾病等疾病中都呈现出了负相关趋势，且能与中药和化学药物相互作用治疗疾病。因此可以将木犀草素用于制备提高肠道中AKK菌相对丰度的药物。
附图说明：
图1是木犀草素对正常小鼠肠道菌群影响的β多样性分析；A：CW CON；B：CW LUT；C：CW+LUT+FMT；K：CW+FMT；
图2是木犀草素对正常小鼠肠道菌群相对丰度的影响柱状图(门水平)；
图3是木犀草素对正常小鼠肠道菌群相对丰度的影响柱状图(种水平)；
图4是木犀草素对肠炎小鼠肠道菌群β多样性分析；
图5是木犀草素对肠炎小鼠肠道菌群相对丰度的影响柱状图(门水平)；
图6是木犀草素对肠炎小鼠肠道菌群相对丰度的影响柱状图(种水平)；
图7是木犀草素对肥胖小鼠肠道菌群β多样性分析，E:HFD CON；F:HFD D-H；G:HFDD-M； H:HFD D-L；I:HFD+D-H+FMT；J:HFD FMT；
图8是木犀草素对肠炎小鼠肠道菌群相对丰度的影响柱状图(门水平)；
图9是木犀草素对肠炎小鼠肠道菌群相对丰度的影响柱状图(种水平)。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
以下实施例中的LUT代表木犀草素
实施例1、木犀草素对正常小鼠的肠道菌群的影响及粪菌移植实验
1 实验方法
1.1 小鼠模型的建立
6周龄的雄性野生型C57BL/6J(WT)小鼠，SPF级，购自浙江维通利华实验技术有限公司(中国杭州)。将小鼠饲养在动物房间中，温度控制在20–22℃，光照/黑暗周期为12h，喂养正常小鼠繁殖饲料，自由饮水直至实验结束。适应性喂养7天后，将C57BL/6小鼠随机分为五组(每组n＝10)，即：正常饮食组(CW CON)，正常饮食LUT给药组(CW LUT， 100mg/kg，每天给药1次，用水溶解)，正常饮食LUT给药粪菌移植供体组(CW+LUT+FMT， 100mg/kg，每天给药1次，用水溶解)，正常饮食+粪菌移植组(CW+FMT,60天后移植正常饮食LUT给药粪菌移值供体组粪便)。
正常饮食LUT给药粪菌移植供体组小鼠给药60天后，每天早晨取一次粪便。将小鼠放置在无菌的小鼠笼子中(无需垫料)，固定小鼠，将其尾部提起，用手指轻轻按压小鼠下腹部，用牙签或无菌镊子收集2粒粪便于1.5ml无菌EP管中，小心闭合管子。将收集的10只小鼠粪便立刻转移到无菌25ml离心管中，按重量比1:3加入生理盐水，轻轻的上下混匀即为粪菌液，按小鼠0.2ml/10g体重再灌入小鼠胃内。连续操作10天。正常饮食LUT给药粪菌移植供体组小鼠保留粪便，备肠道菌测定，小鼠停止饲养。其余组继续喂养30天，正常饮食和正常饮食+粪菌移植组继续喂养正常饲料，正常饮食+LUT给药组继续给予LUT药物。
实验结束后，按照取粪便的方法提取各组小鼠粪便。立即置于-80℃保存，并可长期保存。长途运输样本，采用足够的干冰进行运输，确保样本始终处于冷冻状态。
1.2肠道菌16S rRNA分析
提取粪便样品总DNA后，根据保守区设计得到引物，在引物末端加上测序接头，进行 PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina HiSeq 2500进行测序。高通量测序(如Illumina HiSeq等测序平台) 得到的原始图像数据文件，经碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列(Sequenced Reads)，采用Qiime1.91标准化流程，运用先进的Open_Reference算法，按照97％相似度进行OTU聚类，显著增加了菌种注释效率。最终与GreenGene数据库比对，生成包含样本名称及菌种注释与丰度信息的Biom数据。
1.3统计学分析
实验数据用mean±SD表示，采用Graphpad Prism 7软件对数据进行One-wayANOVA分析，考察数据间差异，*p<0.05为有显著性差异，**p<0.01为差异性极显著，***P<0.001为差异极其显著。
1.4实验结果
表1 LUT对正常小鼠肠道菌群相对丰度值的影响(门水平)
表2 LUT对正常小鼠肠道菌群相对丰度值的影响(种水平)
结果表明，从各实验组肠道菌群的β多样性来看，木犀草素对正常小鼠肠道菌群的结构能够产生一定的影响(图1)。从门水平分析，正常组小鼠给予木犀草素药物后，拟杆菌门 (Bacteroidetes)的菌群相对丰度从37.2％下降到33.6％，厚壁菌门(Fimicutes)的相对丰度从46.3％下降到38.7％，变形菌门(Proteobateria)两组间丰度差异不大，而疣微菌门 (Verrucomicrobia)的丰度则由正常组的5.5％上升到正常给药组的14.5％，增加了约2倍，与正常组比较形成极其显著差异(P<0.001)。粪菌移植组小鼠，供体组和受体组小鼠拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门移植前后相对丰度没有显著差异，说明粪菌移植实验是成功的。并且，疣微菌门的丰度从供体相对丰度值的26.2％上升到了移植组的35.2％，两者之间有极显著性差异(P<0.01)，说明经过木犀草素提升之后的肠道菌，转移给受体后能够成功的定植，并且增殖，图2和表1。至于在种水平，可以看到疣微菌门中Akkermansiamuciniphila菌(AKK 菌)的丰度值明显提升，其趋势与门水平结果一致。因此，证明了木犀草素可以有效得提高正常小鼠肠道中AKK菌的丰度值，并且能够通过粪菌移植的手段实现定植和增殖，见图3 和表2。
实施例2：木犀草素对溃疡性结肠炎小鼠的肠道菌群的影响
1实验方法
1.1溃疡性结肠炎小鼠模型的复制
动物分组：SPF级6-8周雄性C57BL/6J小鼠(18-22g)购自北京维通利华实验技术有限公司(中国,北京)。适应性饲养一周后，随机将小鼠分四组，分别为：正常空白对照组(Ctrl)、空白LUT给药组(100mg/kg，Drug，每天给药1次，用水溶解)、DSS模型组(DSS)、DSS模型LUT给药组(100mg/kg，每天给药1次，用水溶解，DSSD)，每组10只。在整个适应和给药期，所有动物都可以随意摄入食物和水，并保持在光/暗周期为12h(21±2℃，相对湿度为45±10％)。
造模和给药：正常对照组每天自由饮纯净水并每天灌胃100μL 0.5％的CMCNa溶液一次；正常给药组每天根据体重灌胃给予100mg/kg(用水溶解)的LUT；DSS模型组与DSS 模型LUT给药组小鼠从第4天到第10天自由饮用含有2％DSS的双蒸水。进行DSS造模和药物干预治疗，将DSS(MW.36000-50000，美国MP公司)配成2％(W/V g/ml)的溶液，且确保每一天更换新鲜的DSS溶液。DSS模型LUT给药组从第1天到第10天每天分别按小鼠体重灌胃给予0.1g/kg(用水溶解)的LUT。第11天结束实验，采用水合氯醛麻醉小鼠，处死解剖。
1.2 DSS诱导溃疡性肠炎小鼠一般情况的检测
整个实验过程中记录小鼠活动情况、体重变化和粪便等一般情况，包括日常饮食量、活跃程度、每日体重下降克数、大便性状和血便情况，以确保造模成功。连续给药至第10天后，进行观察，发现DSS模型给药组便血已经明显消除，小鼠体重得到逐步回升，说明药物有效。进一步进行取材，观测肠道菌群变化情况。选择早晨，将小鼠放置在无菌的小鼠笼子中(无需垫料)，固定小鼠，将其尾部提起，用手指轻轻按压小鼠下腹部，用牙签或无菌镊子收集排出粪便于1.5ml无菌EP管中，每管分装2-3颗，小心闭合管子。带有粪便的管子立即置于-80℃保存，并可长期保存。长途运输样本，采用足够的干冰进行运输，确保样本始终处于冷冻状态。
1.3肠道菌16S rRNA分析
应用已建立的肠道菌群16S rRNA基因PCR-DGGE技术和建立基于肠球菌、肠杆菌、拟杆菌、梭菌、双歧杆菌和乳酸菌等特殊菌属16S rRNA基因PCR-DGGE检测技术检测大鼠DSS造模前后，药物干预前后的粪便的总肠道菌群和各特异菌属的PCR-DGGE特征，采用Qiime1.91标准化流程，运用先进的Open_Reference算法，按照97％相似度进行OTU聚类，显著增加了菌种注释效率。最终与GreenGene数据库比对，生成包含样本名称及菌种注释与丰度信息的Biom数据，获得PCR-DGGE谱图。
1.4统计学分析
所有结果均采用SPSS22.0软件进行数据分析，以x±s表示，组间差异比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)法，方差齐时用LSD检验，方差不齐时用Dunnett’s T3检验，当 p值<0.05被认为具有统计学意义。
1.5实验结果
表3 LUT对肠炎小鼠肠道菌群相对丰度值的影响(门水平)
表4 LUT对肠炎小鼠肠道菌群相对丰度值的影响(种水平)
对小鼠粪便进行16S rRNA测序，分析木犀草素对小鼠肠道菌群结构影响。木犀草素对肠炎造模小鼠的肠道菌群有一定的干扰作用，见β多样性分析(图4)。结果显示，与单纯DSS肠炎组相比，木犀草素明显改变小鼠肠道菌群结构。首先，在门水平，木犀草素增加拟杆菌门(Bacteroidetes)和疣微菌门(Verrucomicrobia)的相对丰度，减少厚壁菌门(Fimicutes) 和变形菌门(Proteobateria)的相对丰度，见图5和表3。而与之相对应的在属水平，木犀草素显著增加疣微菌门中Akkermansia muciniphila(AKK菌)菌属的相对丰度。在正常组和正常给药组，AKK菌的相对丰度由0.3％上升到2.2％。在DSS诱导的肠炎模型组和DSS肠炎给药组，AKK菌的丰度由0.1％上升到0.9％，均有极显著差异(P<0.01)，见图6和表4。肠炎模型肠道菌群16S测序分析显示，木犀草素可以显著的改变肠道菌群结构，增加AKK菌属相对丰度。
实施例3、木犀草素对肥胖小鼠的肠道AKK菌的调节作用与粪菌移植实验
1.实验方法
1.1肥胖小鼠模型的建立
6周龄的雄性野生型C57BL/6J(WT)小鼠60只购自浙江维通利华实验技术有限公司(中国杭州)。将小鼠饲养在动物房间中，温度控制在20–22℃，光照/黑暗周期为12h。
给C57BL/6小鼠饲喂HFD高脂饲料(60kcal％的脂肪；美国Research Diets)，自由饮水直至实验结束。喂养2个月后，将C57BL/6小鼠随机分为六组(每组n＝10)，即：高脂饮食模型组(HFD CON)、高脂饮食高剂量给药组(HFD D-H，100mg/kg，每天给药1次，用水溶解，灌胃，下同)、高脂饮食中剂量给药组(HFD D-M，75mg/kg)、高脂饮食低剂量给药组(HFD D-L，50mg/kg)。高脂小鼠+高剂量给药+粪便移植供体组(HFD+D-H+FMT)(100mg/kg， 60天后作为移植粪便供体)，高脂小鼠+粪便移植组(HFD FMT)(60天后移植高脂高剂量给药组粪便)。
持续给药2个月后，高脂小鼠+高剂量给药+粪便移植供体组小鼠，每天早晨取一次粪便。将小鼠放置在无菌的小鼠笼子中(无需垫料)，固定小鼠，将其尾部提起，用手指轻轻按压小鼠下腹部，用牙签或无菌镊子收集2粒粪便于1.5ml无菌EP管中，小心闭合管子。将收集的 10只小鼠粪便立刻转移到无菌25ml离心管中，按重量比1:3加入生理盐水，轻轻的上下混匀即为粪菌液，按小鼠0.2ml/10g体重再灌入小鼠胃内。连续操作10天。高脂小鼠+高剂量给药 +粪便移植供体组小鼠取粪便保留，备肠道菌群分析，并停止给药实验。其余组继续喂养30 天，所有组继续给与高脂饲料，LUT高、中、低剂量组按剂量给于LUT药物。
实验结束后，按照取粪便的方法提取各组小鼠粪便。立即置于-80℃保存，并可长期保存。长途运输样本，采用足够的干冰进行运输，确保样本始终处于冷冻状态。
1.2肠道菌16S rRNA分析
提取粪便样品总DNA后，根据保守区设计得到引物，在引物末端加上测序接头，进行 PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina HiSeq 2500进行测序。高通量测序(如Illumina HiSeq等测序平台) 得到的原始图像数据文件，经碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列(Sequenced Reads)，采用Qiime1.91标准化流程，运用先进的Open_Reference算法，按照97％相似度进行OTU聚类，显著增加了菌种注释效率。最终与GreenGene数据库比对，生成包含样本名称及菌种注释与丰度信息的Biom数据。
1.3统计学分析
实验数据用mean±SD表示，采用Graphpad Prism 7.0软件对数据进行One-wayANOVA 分析，考察数据间差异，*p<0.05为有显著性差异，**p<0.01为差异性极显著，***p<0.001 为差异极其显著。
1.4实验结果
表5 LUT对肥胖小鼠肠道菌群相对丰度值的影响(门水平)
表6 LUT对肥胖小鼠肠道菌群相对丰度值的影响(种水平)
实验结果表明，化合物木犀草素对肥胖模型小鼠的肠道菌群具有一定的调节作用，见肠道菌群β多样性分析(图7)。实验结果显示，与肥胖模型组小鼠肠道菌群结构比较，在门水平，木犀草素降低拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Fimicutes)的相对丰度，尤其是厚壁菌门，高脂模型HFD组的相对丰度为68.3％，高脂模型木犀草素给药组低、中、高剂量组厚壁菌门的丰度值分别为58.6％、57.2％和56.9％。与高脂模型组比较，变形菌门(Proteobateria) 和疣微菌门(Verrucomicrobia)的相对丰度在给与木犀草素药物后，呈现增加的趋势。其中，变形菌门，由高脂模型组的相对丰度值9.6％增加到给药后的22.6～23.2％，给药组与模型组形成极显著差异(p<0.001)，见图8和表5。而与之相对应的在属水平，木犀草素显著增加疣微菌门中Akkermansia muciniphila(AKK菌)菌属的相对丰度。在高脂模型组，AKK菌的相对丰度值为0.1％，高脂给药模型组的AKK菌丰度值增加到1.5％，增加了15倍。
将高脂模型粪便供体组与高脂模型粪便受体组肠道菌群相对丰度进行比较，在门水平，主要的肠道菌拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门差异不显著，说明造模是成功的。疣微菌门在供体组为0.1％，粪菌移植后受体组增加到0.3％，增加了0.2％。在种水平，疣微菌门AKK 菌相对丰度，在供体组为0.1％，在粪菌移植受体组为0.3％，与门水平一致。由此，证明AKK 菌在受体组得到了定植，并且能够有效的增殖，改变肥胖小鼠的肠道微环境。并且证明经木犀草素激活的受体组肠道AKK菌，经粪菌移植后，可以实现定植和有效增殖，见图9和表6。
Claims (5)
1.木犀草素或其药用盐在制备提高肠道中AKK菌相对丰度的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肠道是正常肠道、肠炎患者的肠道，或者肥胖患者的肠道。
3.木犀草素在降低肠道中厚壁菌门(Fimicutes)的相对丰度药物中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肠道是正常肠道、肠炎患者的肠道，或者肥胖患者的肠道。
5.一种提高肠道中AKK菌相对丰度的药物或降低肠道中厚壁菌门的相对丰度药物，其特征在于，含有木犀草素作为活性成分。
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2021
- 2021-05-18 CN CN202110540210.XA patent/CN114081878A/zh active Pending
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