CN115989798A - 一种IgA血管炎人源菌群小鼠模型及构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种IgA血管炎人源菌群小鼠模型及构建方法，属于生物技术领域。所述的模型分为IgA血管炎初发模型和IgA血管炎复发模型，所述的模型肠道菌群具有供体IgA血管炎症患者特征的肠道微生物。所述的构建方法采用小鼠灌胃的方式进行粪菌移植。本发明操作简便，建模成功率高，为探索IgA血管炎发生与肠道微生物相关的机制提供了研究模型。

Description

一种IgA血管炎人源菌群小鼠模型及构建方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种IgA血管炎人源菌群小鼠模型及构建方法。

背景技术

IgA血管炎(Immunoglobulin A vasculitis，IgAV)也称为过敏性紫癜(Henoch–Scholein Purpura，HSP)，是由IgA介导的免疫性小血管炎，多发生于学龄期儿童，最常累及皮肤，还可伴有关节、胃肠道及肾脏受累。目前IgAV的发病机制尚未阐明。研究表明肠道微生物与IgAV密切关联，并在IgAV的发病机制中起着重要作用。研究发现IgAV患儿临床表现与特定肠道微生物相关，然而，肠道微生物在IgAV患儿发病过程中的具体机制尚不清楚，鉴于相关机制研究在人体进行受到伦理道德限制，故需选择合适的动物定植IgAV患儿特征肠道微生物用于机制研究。目前尚无经典IgAV动物疾病模型可用于肠道微生物与IgAV相关性研究，人源菌群(Human flora-associated，HFA)小鼠是将人类肠道微生物移植到小鼠肠道中构建的小鼠模型，可用于肠道微生物经肠黏膜免疫介导相关疾病的机制研究。

发明内容

为此，需要提供一种操作简单，真实反应IgAV疾病状况的动物模型，供后续研究。

为实现上述目的，发明人提供了如下技术方案：

一种IgA血管炎人源菌群小鼠模型，包括IgA血管炎初发模型和IgA血管炎复发模型，所述的初发模型肠道菌群具有供体IgA血管炎症初发患者特征的肠道微生物，包括普雷沃氏菌属(Prevotella)、Paraprevotella、双歧杆菌属(Bifidobacterium)中的一种以上；所述的复发模型肠道菌群具有IgA降解性肠道共生菌，包括产碱杆菌科细菌。

进一步的，所述的初发模型肠道微生物还包括葡萄球菌属、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、伯克氏菌属、萨特氏菌属、柯林斯氏菌属(Collinsella)、Catenibacterium、梭杆菌属(Fusobacterium)中的一种以上；所述的复发模型肠道微生物还包括梭状芽胞杆菌属(Clostridium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、Paenisporosarcina、Akkermansia、不动杆菌属(Acinetobacter)、短状杆菌属(Brachybacterium)、F16科、梭杆菌属中的一种以上。

所述的IgA血管炎人源菌群小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：

菌液的制备：收集IgA血管炎初发或复发患者的粪便样本，加入生理盐水(1g粪便：15mL生理盐水)，混合均匀，得到混悬液；过滤混悬液，除去残渣后，离心(5000r/min，3min)，收集上清菌液备用；

粪菌移植(FMT)：采用灌胃的方式将上一步制备的菌液灌入小鼠胃内，连续灌胃3～4天；

模型建立：第一次灌胃后，连续饲养小鼠7～21天，按昼夜明暗交替保持12/12小时光照/黑暗循环，自由摄食饮水。

进一步的，所述的IgA血管炎人源菌群小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：

粪菌悬液制备：收集初发或复发IgA血管炎患者的粪便80～100g，加入180～220ml生理盐水，过滤后获得粪菌悬液；粪菌悬液与甘油按体积比(4.5～5.5):1混合均匀，离心，弃去上清液；沉淀再次高速冷冻离心，弃去上清液；

粪菌胶囊制备：将沉淀物置入胶囊中，并封闭；

粪菌移植：采用灌胃的方式将上一步制备的胶囊灌入小鼠胃内，连续灌胃3-4天；

模型建立：第一次灌胃后，连续饲养小鼠7～21天。

进一步的，所述的粪菌胶囊制备方法为将沉淀物置入抗酸2号胶囊(体积约0.37ml)并封闭；或将沉淀物置入1号明胶胶囊(体积约0.50ml)，再分别使用0号胶囊(体积约0.68ml)和00号胶囊(体积约0.93ml)重封2次；或将沉淀物置入0号明胶胶囊中并封闭，再采用00号耐酸羟丙甲纤维素胶囊进行二次封闭。

进一步的，根据不同菌属定植时间确定灌胃后的饲养时间。其中，在IgA血管炎初发患者人源菌群小鼠模型中，葡萄球菌属在FMT后0～7d定植，肠杆菌科在FMT后7～14d定植，伯氏菌目(包括伯克氏菌属、萨特氏菌属)、柯林斯氏菌属、Catenibacterium、梭杆菌属在FMT后14～21d定植；在IgA血管炎复发患者人源菌群小鼠模型中，微小杆菌属、Paenisporosarcina、Akkermansia在FMT后0～7d定植，不动杆菌属在FMT后7～14d定植，短状杆菌属、F16科、梭杆菌属在FMT后14～21d定植。

进一步的，所述的IgA血管炎患者的纳入标准为：年龄＜18岁，性别不限；可触性皮疹并伴以下任何一条：①腹痛，②关节炎/关节痛，③血尿和/或蛋白尿，④任何部位活检提示IgA沉积。

进一步的，所述的小鼠选用SPF级C57BL/6J小鼠。

进一步的，所述的小鼠的灌胃量为200～300μL/次，灌胃频次每天至少1次。

进一步的，所述的复发IgA血管炎患者粪便样本菌群结构为Burkholderiaceae科丰度1.2～1.5％，红蝽菌科丰度0.1～0.3％，韦荣球菌科丰度0.1～0.4％，肠杆菌科丰度13.5～15％。

进一步的，所述的复发模型血清IL-17A≥25.10pg/ml，IL-21≥89.95pg/ml。

建模成功的判断方法：在IgAV初发患者人源菌群小鼠中检测出特征菌属(普雷沃氏菌属和Paraprevotella)，在IgAV复发患者人源菌群小鼠中检测出IgAV复发患者特征菌属(梭状芽胞杆菌属或产碱杆菌科细菌)；并且上述特征菌属为IgAV初发患者与IgAV复发患者、IgAV初发患者人源菌群小鼠和IgAV复发患者人源菌群小鼠的差异菌属，即代表IgAV初发与复发患者的差异菌属成功转移至小鼠肠道中。在复发模型的小鼠血清中可以检测到IgA和B细胞激活因子(B-cellactivatingfactor，BAFF)、白细胞介素(Interleukin，IL)-17A、IL-21升高，其中IL-17A、IL-21显著升高。

进一步的，IgA血管炎人源菌群小鼠模型在筛选治疗IgA血管炎药物中的应用。

进一步的，IgA血管炎人源菌群小鼠模型的检测试剂盒，包括普雷沃氏菌属、Paraprevotella、双歧杆菌属、梭状芽胞杆菌属和葡萄球菌属含量的检测试剂。

进一步的，IgA血管炎人源菌群小鼠模型的检测试剂盒，还包括产碱杆菌科细菌丰度的检测试剂、IL-17A的检测试剂和IL-21的检测试剂。

进一步的，所述的试剂盒还包括肠杆菌科、伯克氏菌属、萨特氏菌属、柯林斯氏菌属、Catenibacterium、梭杆菌属、微小杆菌属、Paenisporosarcina、Akkermansia、不动杆菌属、短状杆菌属或F16科其中一种以上的含量检测试剂。

进一步的，所述的IgAV人源菌群小鼠模型在筛选治疗IgA血管炎药物中的应用。

区别于现有技术，上述技术方案的有益效果在于：

(1)本发明为探索肠道微生物参与IgAV发生与的机制研究提供动物模型，也为IgAV药物研究提供了筛选模型。

(2)本发明操作简便，建模成功率高，并且在动物模型中真实反应了IgAV患者肠道微生物特征。

附图说明

图1为具体实施方式所述的IgAV初发患儿和IgAV复发患儿差异菌属比较的分类学分支图。图中，从内圈到外圈，表示样本中从门到属主要菌群的分类等级关系。节点大小对应相对丰度高低；红色节点代表IgAV复发患儿粪便中微生物中丰度较高的差异菌，蓝色节点代表在IgAV初发患儿粪便中微生物丰度较高的差异菌；空心节点代表该分类单元在组间差异不显著。

图2为具体实施方式所述的IgAV初发、复发患儿人源菌群小鼠差异菌属比较。其中，(A)分类学分支图：从内圈到外圈，表示样本中从门到属主要菌群的分类等级关系。节点大小对应相对丰度高低；红色节点代表在IgAV初发患儿人源菌群小鼠的肠道微生物中丰度较高的差异菌，蓝色节点代表在IgAV复发患儿人源菌群小鼠的肠道微生物中丰度较高的差异菌；空心节点代表该分类单元在组间差异不显著；(B)柱状图：设定LDA阈值为2，条形图的长短代表该菌群的差异显著程度。PT代表IgAV初发患儿人源菌群小鼠，RT代表IgAV复发患儿人源菌群小鼠。

图3为具体实施方式所述的桑基图。图中，Human表示IgAV患儿特有的ASV。PT代表IgAV初发组FMT小鼠粪便样本、RT代表IgAV复发组FMT小鼠粪便样本、HT代表健康儿童组FMT小鼠粪便样本。D7、D14、D21表示采集小鼠粪便样本的天数(与第1次接种后间隔时间)。

图4为具体实施方式所述的小鼠粪菌移植前后属水平肠道微生物组成。

图5为具体实施方式所述的科水平小鼠差异性肠道微生物。(a)随机森林分析确定了十个细菌种作为区分rIMb和rHMb组的标志物；(b)十个细菌种在粪菌移植后第7天在rIMb和rHMb组的相对丰度。rIMb指IgAV患儿人源菌群小鼠，rHMb指健康儿童人源菌群小鼠。P＜0.05表示有统计学意义。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001，****表示P＜0.0001，ns表示差异性不显著。

图6为具体实施方式所述的属水平小鼠差异性肠道微生物。(a)随机森林分析确定了10个细菌属作为区分rIMb和rHMb组的标志物；(b)10个细菌属在粪菌移植后第7d在rIMb和rHMb组的相对丰度。rIMb指IgAV患儿人源菌群小鼠，rHMb指健康儿童人源菌群小鼠。

图7为具体实施方式所述的科水平小鼠差异性肠道微生物在人类粪便中的相对丰度。IgAV指IgAV患儿，HC指健康儿童。

图8为具体实施方式所述的Burkholderiaceae的ROC曲线。

图9为具体实施方式所述的IgAV患儿粪便中Burkholderiaceae的组成情况。

图10为具体实施方式所述的健康儿童粪便中Burkholderiaceae的组成情况。

图11为具体实施方式所述的萨特氏菌属和副萨特氏菌属在人类粪便中的相对丰度。

图12为具体实施方式所述的模型小鼠血清IgA和细胞因子水平。

图13为具体实施方式所述的模型小鼠血清IL-17A的ROC曲线。

图14为具体实施方式所述的模型小鼠血清IL-21的ROC曲线。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。

实施例1

1粪便供体筛选及样本收集

标本收集过程如下：采用消毒后的EP管收集IgAV初发患儿、IgAV复发患儿粪便样本，采用含有缓冲液的试管收集健康儿童的粪便样本，嘱研究对象在排便前排空膀胱，使用无菌勺子挑取2～3g内层粪便，同时收集两份，置于冰上转运，尽快放置-80℃冰箱保存。选取临床表现相同的IgAV初发患儿、IgAV复发患儿和健康儿童的粪便标本各5份作为FMT供体样本。5例IgAV初发患儿均单独以皮疹为临床表现，其中男4例，女1例，年龄2～8岁；5例IgAV复发患儿均以皮疹及肾脏受为累临床表现，其中男3例，女2例，年龄5～11岁。

IgAV患儿纳入标准：(1)年龄＜18岁，性别不限；(2)可触性皮疹(必要条件)并伴以下任何一条：①腹痛；②关节炎/关节痛；③血尿和/或蛋白尿；④任何部位活检提示IgA沉积。IgAV复发组：既往诊断为IgAV且至少4周无症状但再次出现症状的患者。

排除标准：(1)收集粪便标本前2周内使用抗生素、质子泵抑制剂、免疫抑制剂、化疗药物等；(2)患有免疫缺陷病；(3)合并自闭症、炎症性肠病、艰难梭菌感染、癫痫、便秘等。

健康儿童纳入标准：(1)年龄＜18岁，性别不限；(2)无过敏性咳嗽、过敏性鼻炎、过敏性哮喘等过敏性疾病史；(3)样本采集前2周内未使用抗生素、免疫抑制剂、质子泵抑制剂等。

2实验动物

选取64只SPF级C57BL/6J小鼠，雌雄各半，周龄3～5w，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，在SPF级屏障环境中适应性喂养1周，随后转至普通环境中饲养。动物饲养中心保持良好通风，饲养室定期清洁并使用消毒液做消毒处理。按昼夜明暗交替保持12/12小时光照/黑暗循环。全部小鼠置于独立通气笼分笼饲养，每笼2只(性别相同)，自由摄食饮水，定期更换饮用灭菌水。鼠笼和垫料预先通过高压蒸汽进行灭菌处理，并定期更换。

C57BL/6J小鼠随机分为以下四组，每组16只：

(1)正常对照组(N组)；

(2)IgAV初发FMT组(PT组)；

(3)IgAV复发FMT组(RT组)；

(4)健康儿童FMT组(HT组)。

3人源菌群小鼠的构建

3.1菌液的制备

(1)将收集的5份IgAV初发患儿、5份IgAV复发患儿和5份健康儿童的粪便样本，各组分别取相等重量的样本混合；

(2)各取1g混合后的粪便，加入10mL生理盐水，轻柔地搅拌或使用涡旋振荡器将其混合均匀，最后得到混悬液；

(3)准备好滤网，将上一步骤中得到的混悬液进行过滤，除去过滤后的残渣，并用10mL消毒后的离心管收集过滤后的混悬液；

(4)将混悬液置于离心机中，以5000r/min的速率离心3min；

(5)收集上清液备用。

3.2粪菌移植操作方法

将每只小鼠单独饲养，采用灌胃的方式将制备好的菌液灌入小鼠胃内，每只小鼠粪菌悬液灌胃量为200μL/次，灌胃后观察30min，实验组小鼠未出现异常后合笼饲养，灌胃频次为1次/d，连续3d。

4样本收集方法

分别在FMT前及FMT后以下时间点(与第1次FMT后间隔时间)采集小鼠新鲜粪便：7d、14d、21d。采用应激性排便法收集粪便，轻按小鼠下腹部，及时将新鲜排出的粪便装入无菌离心管，每管为取材目标组所有小鼠的粪便集合；所有粪便样本在-80℃下保存。

516srDNA测序方法

5.1微生物组总DNA提取与检测

采用OMEGASoilDNAKit(D5625-01)试剂盒进行核酸提取。

5.2PCR扩增细菌16SrDNA基因功能基因的不同区域

选用长度约为468bp左右的细菌16SrDNA基因的高度可变的V3～V4区用来测序。PCR扩增用细菌16SrDNAV3～V4区特异性引物，338F(5’-barcode+ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’)，806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)。前引物中的barcode是一个7个碱基的寡核苷酸序列，用来区分同一文库中的不同样品。

PCR反应体系如下：

PCR程序：98℃预变性30s；98℃ 15s，50℃ 30s，72℃ 30s，扩增循环25～27次；72℃保持5min；4℃保存。

PCR产物采用2％琼脂糖凝胶进行电泳分离，切割下含目的DNA的片段，并用Axygen凝胶回收试剂盒回收含目的DNA的片段。

5.3PCR产物定量、混样

利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit对PCR产物在Microplate reader(BioTek，FLx800)上进行定量，并按照每个样品所需要的数据量进行混样。

5.4文库构建

利用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit进行建库。

5.5文库质检与测序

文库质检合格后，在Illumina NovaSeq 6000仪器上进行2×250bp的双端测序。

6信息分析

6.1物种组成分析

统计各样本在门、纲、目、科、属、种六个分类水平上的相对丰度，及样本物种组成情况。

6.2多样性分析

对各样本及分组进行多样性分析，包括α多样性分析和β多样性分析。

6.3物种差异与标志物种分析

(1)韦恩图：通过韦恩图对微生物群落进行分析，可以用来分析不同样本(组)间共有或独有的物种。

(2)桑基图(Sankey diagram)：桑基图即桑基能量分流图，可以用来表示不同时间段微生物的变化分布情况。

(3)河流图(Streamgraph)：也叫做“主题河流图”(Theme River)，是堆积面积图的一种变形，通过“流动”的形状来展示不同类别的数据随时间的变化情况。

7统计学方法

本研究采用SPSS24.0软件对数据进行分析，服从正态分布的计量资料以均数±标准差(x±s)表示；不服从正态分布的以中位数(下四分位数～上四分位数)[M(P25～P75)]表示；两组间数据差异比较采用两独立样本非参数检验(Mann-Whitney U检验)；三组及以上数据差异比较采用Kruskal-Wallis检验；P＜0.05表示差异具有统计学意义。

8结果

8.1IgAV患儿特有肠道微生物在FMT后小鼠中的建立

通过韦恩图分析FMT后IgAV患儿特有肠道微生物是否在小鼠肠道中定植。结果提示，IgAV患儿特有的ASV可在小鼠肠道中定植：在IgAV初发患儿人源菌群小鼠肠道中共检出96个IgAV初发患儿特有的ASV，其中49个属于拟杆菌门(Bacteroidetes)，31个属于厚壁菌门(Firmicutes)，9个属于变形菌门(Proteobacteria)，6个属于放线菌门(Actinobacteria)，1个属于梭杆菌门；在IgAV复发患儿人源菌群小鼠肠道中共检出116个IgAV复发患儿特有的ASV，其中44个属于拟杆菌门，46个属于厚壁菌门，10个属于变形菌门，11个属于放线菌门，1个属于梭杆菌门，1个属于TM7，1个属于疣微菌门，还有2个属于未分类的门。

门水平的物种组成分析提示(表1)：IgAV初发患儿人源菌群小鼠和IgAV复发患儿人源菌群小鼠都以拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和放线菌门为优势菌门，其中，IgAV初发患儿人源菌群小鼠拟杆菌门、变形菌门丰度较FMT前升高，厚壁菌门、放线菌门丰度较FMT前降低；IgAV复发患儿人源菌群小鼠拟杆菌门、变形菌门丰度较FMT前升高，厚壁菌门、放线菌门丰度较FMT前降低。

表1 IgAV患儿人源菌群小鼠FMT前后丰度百分比统计表

注：P_before表示FMT前的IgAV初发患儿人源菌群小鼠，PT表示FMT后的IgAV初发患儿人源菌群小鼠；R_before表示FMT前的IgAV复发患儿人源菌群小鼠，RT表示FMT后的IgAV复发患儿人源菌群小鼠。

8.2FMT后小鼠差异微生物分析

使用LEfse分析对IgAV初发患儿混合粪便和IgAV复发患儿混合粪便的微生物组成差异进行对比分析(见图1)。结果显示，在门水平上，拟杆菌门、梭杆菌门、变形菌门在IgAV初发患儿粪便中富集，放线菌门、厚壁菌门、TM7在IgAV复发患儿粪便中富集；在属水平上，分别有25个属和21个属在IgAV初发组富集和IgAV复发患儿粪便中富集，其中梭状芽胞杆菌属在IgAV复发患儿粪便中富集。

使用LEfse分析对IgAV初发患儿人源菌群小鼠和IgAV复发患儿人源菌群小鼠的肠道微生物组成差异进行对比分析(见图2)。结果显示，在门水平上，TM7在IgAV初发患儿人源菌群小鼠中富集，而IgAV复发患儿人源菌群小鼠中无富集门；在属水平上，双歧杆菌属(Bifidobacterium)、欧陆森氏菌属(Olsenella)、Paraprevotella、普雷沃氏菌属(Prevotella)在IgAV初发患儿人源菌群小鼠中富集，葡萄球菌属(Staphylococcus)、梭状芽胞杆菌属(Clostridium)在IgAV复发患儿人源菌群小鼠中富集。差异有意义的菌属(P＜0.05)包括：双歧杆菌属、Paraprevotella、普雷沃氏菌属和葡萄球菌属(见表2)。

表2 IgAV初发、复发患儿人源菌群小鼠差异菌属丰度比较

8.3FMT后人源菌群小鼠肠道微生物定植时间分析

8.3.1桑基图分析

为了评估IgAV患儿特有的ASV在不同时间段的变化分布情况，绘制了桑基图，结果如图3所示，随时间推移，微生物定植数量总体呈衰减趋势，微生物定植时间也存在差异，拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门、变形菌门中部分微生物在第7d首次定植、部分微生物在第14d首次定植、也有部分微生物在第21d才首次定植。

8.3.2FMT后IgAV患儿特有的ASV在受体小鼠中随时间变化定植情况

IgAV初发患儿人源菌群小鼠肠道中有6个ASV(23.08％)可以持久定植，其中3个属于拟杆菌门，2个属于厚壁菌门，1个属于变形菌门；IgAV复发患儿人源菌群小鼠肠道中有17个ASV(30.91％)可以持久定植，其中7个属于拟杆菌门，7个属于厚壁菌门，3个属于放线菌门。

8.3.3NMDS分析

对FMT后的小鼠进行NMDS分析，结果提示IgAV初发患儿人源菌群小鼠(stress＝0.0463)和IgAV复发患儿人源菌群小鼠(stress＝0.138)在FMT后14～21d肠道微生物群落趋于稳定。

8.3.4河流图分析

采用河流图来展示IgAV人源菌群小鼠肠道中拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、放线菌门的丰度随时间的变化情况。结果显示，IgAV初发患儿人源菌群小鼠以拟杆菌门和厚壁菌门为主，在FMT后7d拟杆菌门和厚壁菌门丰度明显下降，在14d以后丰度保持稳定；同样，IgAV复发患儿人源菌群小鼠以拟杆菌门和厚壁菌门为主，拟杆菌门丰度在FMT后7d较前下降，14d后丰度回升，并维持稳定；厚壁菌门丰度FMT后7d较前上升，14d后丰度较前下降，并维持稳定。

8.3.5物种组成分析

为了比较IgAV初发患儿人源菌群小鼠和IgAV复发患儿人源菌群小鼠肠道生物组成随时间的变化情况，分别在门和属水平进行了分类学组成分析。

IgAV初发患儿人源菌群小鼠肠道微生物组成结果如表3、表4所示。在门水平上，各时间点粪便样本微生物丰度主要集中于拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和放线菌门，其中拟杆菌门在各组的丰度值最高，厚壁菌门次之；与FMT前相比，FMT后第7d出现拟杆菌门丰度下降、厚壁菌门丰度上升，即厚壁菌门/拟杆菌门(F/B)比值上升；FMT后14d拟杆菌门丰度回升，厚壁菌门丰度下降，之后两者丰度趋于稳定。

表3IgAV初发患儿人源菌群小鼠肠道微生物丰度百分比统计表

注：P0代表IgAV初发患儿肠道微生物FMT前小鼠；PT代表IgAV初发患儿人源菌群小鼠。D7、D14、D21表示采集小鼠粪便样本的天数(与第1次接种后间隔时间)。

在属水平上，除Others外，FMT前及FMT后不同时间点粪便微生物共有的优势菌属为乳杆菌属(Lactobacillus)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、Flexispira；与FMT前相比，乳杆菌属、Flexispira、Desulfovibrio、Adlercreutzia、Coprococcus的丰度在FMT后第7d出现上升，此外，拟杆菌属(Bacteroides)、颤螺旋菌属(Oscillospira)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、Odoribacter丰度在FMT后第7d出现下降。

表4 IgAV初发患儿人源菌群小鼠肠道微生物丰度百分比统计表

注：P0代表IgAV初发患儿肠道微生物FMT前小鼠；PT代表IgAV初发患儿人源菌群小鼠。D7、D14、D21表示采集小鼠粪便样本的天数(与第1次接种后间隔时间)。

IgAV复发患儿人源菌群小鼠肠道微生物组成结果如表5、表6所示。在门水平上，拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和放线菌门为各组粪便样本主要组成，且拟杆菌门在各组的丰度值最高，厚壁菌门次之。与FMT前相比，FMT后第7d出现拟杆菌门、放线菌门丰度下降，厚壁菌门、变形菌门丰度上升；在FMT后第14d出现拟杆菌门、放线菌门丰度回升，而厚壁菌门、放线菌门丰度下降，之后两者的丰度趋于稳定。

表5 IgAV复发患儿人源菌群小鼠肠道微生物丰度百分比统计表

注：R0代表IgAV复发患儿肠道微生物FMT前小鼠；RT代表IgAV复发患儿人源菌群小鼠。D7、D14、D21表示采集小鼠粪便样本的天数(与第1次接种后间隔时间)。

在属水平上，除Others外，乳杆菌属(Lactobacillus)、[Prevotella]为各组共有的主要优势菌属。与FMT前相比，乳杆菌属、Flexispira、普雷沃氏菌属(Prevotella)、Desulfovibrio、螺杆菌属(Helicobacter)、Adlercreutzia、Rikenella、Staphylococcaceae_Staphylococcus、Akkermansia的丰度在FMT后第7d出现升高，[Prevotella]、颤螺旋菌属(Oscillospira)、拟杆菌属(Bacteroides)、Odoribacter、别样棒菌属(Allobaculum)、Bifidobacterium、Ruminococcaceae_Ruminococcus、Alistipes、Sphingomonas、Coprococcus、[Ruminococcus]的丰度在FMT后第7d出现下降。

表6 IgAV复发患儿人源菌群小鼠肠道微生物丰度百分比统计表

注：R0代表IgAV复发患儿肠道微生物FMT前小鼠；RT代表IgAV复发患儿人源菌群小鼠。

D7、D14、D21表示采集小鼠粪便样本的天数(与第1次接种后间隔时间)。

8.3.6IgAV患儿特有肠道微生物在小鼠肠道中定植时间分析

根据桑基图结果对IgAV患儿特有肠道微生物在小鼠肠道中定植的时间绘制表格，结果如表7、表8所示，在IgAV初发患儿人源菌群小鼠中，葡萄球菌属(Staphylococcus)、粪球菌属(Coprococcus)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)在FMT后0～7d定植，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)在FMT后7～14d定植，伯氏菌目(包括伯克氏菌属、萨特氏菌属)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、Catenibacterium、梭杆菌属(Fusobacterium)在FMT后14～21d定植；在IgAV复发患儿人源菌群小鼠中，微小杆菌属(Exiguobacterium)、Paenisporosarcina、Akkermansia在FMT后0～7d定植，不动杆菌属(Acinetobacter)在FMT后7～14d定植，短状杆菌属(Brachybacterium)、F16科、梭杆菌属(Fusobacterium)在FMT后14～21d定植。

表7 IgAV初发患儿特有肠道微生物在小鼠肠道中定植时间表

注：0～7d、7～14d、14～21d表示微生物定植的时间段。

表8 IgAV复发患儿特有肠道微生物在小鼠肠道中定植时间表

注：0～7d、7～14d、14～21d表示微生物定植的时间段。

9结论

将IgAV患儿特征性肠道微生物移植到C57BL/6J(SPF级)小鼠肠道中，可以构建IgAV人源菌群小鼠，普雷沃氏菌属、Paraprevotella是主要的定植特征菌属。IgAV患儿特有肠道微生物在小鼠肠道中成功定植的时间有差异。在FMT后7～21d，不同时间点均有IgAV患儿特有肠道微生物首次定植，部分微生物在特定的时间段定植，而拟杆菌门微生物在不同时间点均有定植。本模型的建立为后续研究肠道微生物参与IgAV发生发展机制奠定了基础。

实施例2

1人类粪便标本采集

人类粪便样本来源于5名复发IgAV患儿和5名健康儿童。5例复发IgAV患儿均表现为紫癜样皮疹和肾脏受累，其中男性3例，女性2例，年龄5～11岁。

粪便标本取样流程为：使用无菌勺刮取新鲜粪便内侧样品，并置入已消毒的EP管中，量约2～3g，将收集好的样本立即放在冰上进行转运，最终保存于-80℃冰箱。

复发IgAV患儿纳入标准：(1)年龄<18岁，性别不限；(2)既往诊断IgAV(符合2010年EULAR/PRINTO/PRES制定的IgAV诊断标准)，但经治疗后临床症状已消失，至少间隔4周后再次出现新的紫癜样皮疹、新出现或再次出现胃肠道、关节、肾脏等系统受累表现。

2粪菌悬液制备

取5名复发IgAV患儿和5名健康儿童的粪便标本，等重量混合后用生理盐水稀释(1g:10mL)混匀，将混悬液通过滤网以滤去残渣，余液体离心(5000r/min，3min)后取上清液用于小鼠灌胃。

3动物分组

SPF级C57BL/6J小鼠适应性喂养7d，雌雄各按等比例随机分为2组。具体分组如下：

(1)IgAV患儿人源菌群组(rIMb组)：16只，雌雄各半；

(2)健康儿童人源菌群组(rHMb组)：16只，雌雄各半。

4粪菌移植

采用已制备好的复发IgAV患儿粪菌悬液和健康儿童粪菌悬液，按照200μL/只的剂量分别对IgAV患儿人源菌群小鼠和健康儿童人源菌群小鼠进行灌胃处理，1次/d，连续灌胃3d。

5标本收集

灌胃前、灌胃后第7d分别用无菌EP管收集小鼠粪便，收集后立即置于冰上转运，储存于-80℃冰箱。

通过心脏采血的方法留取小鼠血液样品，静置分层后离心取血清(3000r/min，15min)，ELISA法检测小鼠血清中IgA、BAFF、IL-1β、IL-6、IL-17A、IL-21、TNF-α水平。

616srDNA测序方法

与实施例1中的5相同。

7血清中IgA及细胞因子的检测

分别使用小鼠IgA、BAFF、IL-1β、IL-6、IL-17A、IL-21、TNF-αELISA检测试剂盒对小鼠血清中的IgA、BAFF、IL-1β、IL-6、IL-17A、IL-21、TNF-α进行检测。

8统计学分析

本研究所有数据均采用SPSS 24.0和R语言4.1.2进行统计分析。服从正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验(方差齐性，两组数值均服从正态分布)，对于方差不齐者或其中一组数值不服从正态分布者，两组间比较采用曼-惠特尼U检验；不服从正态分布的计量资料以中位数(下四分位数～上四分位数)[M(P25～P75)]表示，两组间比较采用曼-惠特尼U检验；计数资料采用卡方检验；P<0.05表示差异具有统计学意义。

9结果

9.1肠道微生物定植情况分析

通过绘制韦恩图分析人类特有的肠道微生物是否可在小鼠体内定植。结果提示粪菌移植7d后，IgAV患儿和健康儿童特有的肠道微生物可定植在受体小鼠的肠道中：IgAV患儿人源菌群小鼠肠道中可检出55个IgAV患儿特有的扩增子序列变异体(Ampliconsequence variants，ASV)，健康儿童人源菌群小鼠肠道中可检出35个健康儿童特有的ASV。

9.2物种组成分析

IgAV患儿人源菌群小鼠和健康儿童人源菌群小鼠粪菌移植前后肠道微生物的组成在门、科、属水平上存在差异：门水平上，经粪菌移植后的小鼠均出现肠道厚壁菌门(rIMb：39.50％→45.60％，rHMb：33.59％→34.61％)、变形菌门(rIMb：3.33％→4.61％，rHMb：2.56％→5.78％)丰度增加，拟杆菌门(rIMb：53.59％→46.99％，rHMb：60.53％→54.29％)丰度减少，IgAV患儿人源菌群小鼠肠道放线菌门丰度减少(1.30％→0.81％)，健康儿童人源菌群小鼠肠道放线菌门丰度增加(1.52％→4.61％)；科水平上，经粪菌移植后的小鼠均出现肠道S24-7(rIMb：46.65％→40.77％，rHMb：49.41％→46.04％)、毛螺菌科(rIMb：3.34％→1.81％，rHMb：4.59％→4.04％)、[Paraprevotellaceae](rIMb：1.34％→0.75％，rHMb：3.76％→2.11％)丰度减少，乳杆菌科丰度增加(rIMb：28.29％→36.99％，rHMb：20.14％→22.53％)，IgAV患儿人源菌群小鼠肠道理研菌科丰度减少(2.42％→1.88％)，健康儿童人源菌群小鼠肠道理研菌科丰度增加(2.49％→2.71％)；属水平上，经粪菌移植后的小鼠均出现肠道乳杆菌属(rIMb:27.86％→36.45％，rHMb：20.03％→22.43％)、Flexispira(rIMb:1.71％→2.89％，rHMb：0.89％→1.58％)丰度增加、[Prevotella]丰度减少(rIMb：1.29％→0.73％，rHMb：3.58％→2.08％)，IgAV患儿人源菌群小鼠肠道普氏菌属丰度增加(0.79％→0.94％),健康儿童人源菌群小鼠肠道普氏菌属丰度减少(0.96％→0.81％)(见图4)。

经粪菌移植后，IgAV患儿人源菌群小鼠和健康儿童人源菌群小鼠肠道微生物的组成在门、科、属水平上存在差异(见表9、10、11)：门水平上，IgAV患儿人源菌群小鼠组肠道厚壁菌门丰度高于健康儿童人源菌群小鼠，组间差异无统计学意义，IgAV患儿人源菌群小鼠肠道拟杆菌门、变形菌门、放线菌门丰度均低于健康儿童人源菌群小鼠，且放线菌门丰度差异有统计学意义(P<0.05)；科水平上，IgAV患儿人源菌群小鼠肠道乳杆菌科丰度高于健康儿童人源菌群小鼠，组间差异无统计学意义，IgAV患儿人源菌群小鼠肠道S24-7、螺杆菌科、毛螺菌科、理研菌科、红蝽菌科丰度低于健康儿童人源菌群小鼠，且红蝽菌科丰度差异有统计学意义(P<0.05)；属水平上，IgAV患儿人源菌群小鼠肠道乳杆菌属丰度高于健康儿童人源菌群小鼠，但组间差异无统计学意义，IgAV患儿人源菌群小鼠[Prevotella]、Allobaculum、脱硫弧菌属、Adlercreutzia丰度低于健康儿童人源菌群小鼠，且Adlercreutzia丰度差异具有统计学意义(P<0.05)。

表9两组人源菌群小鼠门水平肠道微生物丰度比较

注：a表示使用的统计方法为独立样本t检验，b表示使用的统计方法为Wilcoxon符号秩和检验，P＜0.05表示有统计学意义。

表10两组人源菌群小鼠科水平肠道微生物丰度比较

注：a表示使用的统计方法为独立样本t检验，b表示使用的统计方法为Wilcoxon符号秩和检验，P＜0.05表示有统计学意义。

表11两组人源菌群小鼠属水平肠道微生物丰度比较

注：a表示使用的统计方法为独立样本t检验，b表示使用的统计方法为Wilcoxon符号秩和检验，P＜0.05表示有统计学意义。

9.3随机森林分析

为了明确造成IgAV患儿人源菌群小鼠和健康儿童人源菌群小鼠肠道微生物组间差异的标志物种，使用随机森林分析对IgAV患儿人源菌群小鼠和健康儿童人源菌群小鼠的肠道微生物组成差异进行分析，从而寻找造成组间差异的标志肠道微生物，并按照重要性进行排列(重要值>0.001就可区别组间差异)，采用热图展示相关肠道微生物的丰度分布，然后采用箱式图展示标志肠道微生物在IgAV患儿人源菌群小鼠和健康儿童人源菌群小鼠肠道中的丰度。

结果提示，在科水平上，IgAV患儿人源菌群小鼠肠道中产碱菌科(Alcaligenaceae)、红蝽菌科(Coriobacteriaceae)丰度较健康儿童人源菌群小鼠明显减低，且差异具有统计学意义(P<0.05)，产碱菌科重要值为0.180、红蝽菌科重要值为0.146(见图5)；在属水平上，IgAV患儿人源菌群小鼠肠道中Adlercreutzia和萨特氏菌属(Sutterella)丰度较健康儿童人源菌群小鼠明显减低，且差异具有统计学意义(P<0.05)，Adlercreutzia重要值为0.129、萨特氏菌属重要值为0.073(见图6)。

9.4小鼠差异性肠道微生物在人类肠道中的丰度

为了明确用于区分IgAV患儿人源菌群小鼠和健康儿童人源菌群小鼠的特征肠道微生物在人类肠道中的丰度，选取16名复发IgAV患儿(IgAV组)和23名健康儿童(HC组)的粪菌测序结果进一步分析，两组间性别、年龄均无显著差异。在科水平对IgAV组和HC组中用于区分IgAV患儿人源菌群小鼠和健康儿童人源菌群小鼠的差异性肠道微生物的相对丰度进行比较，结果提示与健康儿童相比，科水平上IgAV患儿粪便中Burkholderiaceae丰度明显降低(P<0.05)[由于物种注释系统的不同，人类粪便标本的16srDNA测序将产碱杆菌科的成员(萨特氏菌属和副萨特氏菌属)归类到Burkholderiaceae，因此这里未显示产碱杆菌科]，红蝽菌科、韦荣球菌科(Erysipelotrichaceae)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)丰度增加，韦荣球菌科和肠杆菌科在两组间的丰度差异具有统计学意义(P<0.05)(见图7)；属水平上IgAV患儿粪便中粪芽孢菌属(Coprobacillus)丰度较健康儿童升高(P<0.05)，萨特氏菌属(Sutterella)丰度较健康儿童降低(P>0.05)，余细菌属在两组间差异无统计学意义。

9.5ROC曲线分析

为了识别和量化在小鼠和人类肠道中均存在显著差异的产碱杆菌科对IgAV的潜在诊断能力，我们根据其在人类肠道中的相对丰度绘制了ROC曲线(见图8)，结果提示Burkholderiaceae可较好的识别IgAV(特异性和敏感性分别为91.3％和62.5％，AUC为0.766)。

9.6人类粪便中Burkholderiaceae组成分析

为了进一步评估人类粪便样本中Burkholderiaceae的组成，绘制饼图展示其分布情况(见图9、图10)。结果提示萨特氏菌属和副萨特氏菌属(均属于产碱杆菌科)共占IgAV患儿和健康儿童粪便中Burkholderiaceae的99.7％、99.9％，两组间比较则发现IgAV患儿粪便中萨特氏菌属和副萨特氏菌属丰度均低于健康儿童(见图11)。

9.7小鼠血清IgA和细胞因子检测

ELISA检测结果见图12。结果表明，与健康儿童人源菌群小鼠相比，IgAV患儿人源菌群小鼠的血清IgA、BAFF、IL-17A、IL-21升高，血清TNF-α、IL-1β、IL-6降低。其中，IL-17A、IL-21组间差异具有统计学意义(P<0.05)。

根据ROC曲线(图13、图14)，IL-17A、IL-21可较好的识别IgAV患儿人源菌群小鼠，IL-17A和IL-21的最优临界点分别为25.10pg/ml和89.95pg/ml。当IL-17A≥25.10pg/ml，IL-21≥89.95pg/ml被分类为IgAV患儿人源菌群小鼠时，预测效果最好。

10结论

产碱杆菌科是造成IgAV患儿人源菌群小鼠和健康儿童人源菌群小鼠组间差异的标志肠道微生物，也是IgAV患儿和IgAV患儿人源菌群小鼠共有的IgAV特征肠道微生物。将IgAV患儿特征性肠道微生物移植到C57BL/6J(SPF级)小鼠肠道中，可以构建IgAV人源菌群小鼠，该人源菌群小鼠可出现血清IL-17A、IL-21显著升高。将Burkholderiaceae、IL-17A和IL-21三指标联合应用于IgAV人源菌群小鼠模型的判断，可提高判断的准确性，ROC曲线的AUC可达0.95以上。建立的小鼠模型为后续研究肠道微生物参与IgAV发生发展机制奠定了基础，也为IgAV治疗药物提供了筛选模型。

实施例3

1粪菌胶囊的制备

(1)收集复发IgAV患儿的粪便100g，加入200ml生理盐水，过滤后产生180ml粪菌悬液。

收集的粪便菌群结构为科水平上Burkholderiaceae丰度为1.37％，红蝽菌科、韦荣球菌科和肠杆菌科丰度为0.16％、0.28％、14.38％；属水平上粪芽孢菌属丰度为0.12‰，萨特氏菌属丰度为8.22‰。

(2)每200ml粪菌悬液与40ml 100％甘油混合均匀，400g/min离心20min，弃去上清液。

(3)沉淀在2℃-8℃条件下，10000g/min再次离心30min，弃去上清液。

(4)将最终沉淀物混合，置入抗酸2号胶囊(体积约0.37ml)并封闭。

(5)将制好的胶囊在-55℃的干冰上快速冷冻，并在-70℃下储存。

2IgAV小鼠模型的建立

模型组：将胶囊恢复至室温，按照200μl胶囊液/只的剂量对SPF级C57BL/6J小鼠进行灌胃处理，1次/d，连续灌胃3d。

对照组：按照200μl生理盐水/只的剂量对SPF级C57BL/6J小鼠进行灌胃处理，1次/d，连续灌胃3d。

模型组和对照组均在第一次灌胃后，连续饲养小鼠7天。

3模型的检测

收集模型组和对照组的小鼠粪便与血清。与对照组相比，在模型组小鼠粪便中可以检测到产碱杆菌科菌属细菌。模型组小鼠血清IL-17A>25.10pg/ml，IL-21>89.95pg/ml，均高于对照组。

实施例4

1粪菌胶囊的制备

(1)收集复发IgAV患儿的粪便80g，加入200ml生理盐水，过滤后产生180ml粪菌悬液。

(2)每200ml粪菌悬液与40ml 100％甘油混合均匀，400g/min离心20min，弃去上清液。

(3)沉淀在2℃-8℃条件下，10000g/min再次离心30min，弃去上清液。

(4)将最终沉淀物混合，置入1号明胶胶囊(体积约0.50ml)，再分别使用0号胶囊(体积约0.68ml)和00号胶囊(体积约0.93ml)重封2次。

(5)将制好的胶囊在-55℃的干冰上快速冷冻，并在-70℃下储存。

2IgAV小鼠模型的建立

将胶囊恢复至室温，按照250μl胶囊液/只的剂量对SPF级C57BL/6J小鼠进行灌胃处理，1次/d，连续灌胃3d。在第一次灌胃后，连续饲养小鼠10天。

实施例5

1粪菌胶囊的制备

(1)收集复发IgAV患儿的粪便90g，加入200ml生理盐水，过滤后产生180ml粪菌悬液。

(2)每200ml粪菌悬液与40ml100％甘油混合均匀，400g/min离心20min，弃去上清液。

(3)沉淀在2℃-8℃条件下，10000g/min再次离心30min，弃去上清液。

(4)将最终沉淀物混合，置入0号明胶胶囊(体积约0.68ml)中并封闭，再采用00号耐酸羟丙甲纤维素(HPMC)胶囊(体积约0.93ml)进行二次封闭。HPMC胶囊可以帮助保护膳食补充剂成分免受胃酸的影响，而无需在制造过程中添加耐酸特性的成本和复杂性，还可以帮助掩盖味道和气味。

(5)将制好的胶囊在-55℃的干冰上快速冷冻，并在-70℃下储存。

2IgAV小鼠模型的建立

将胶囊恢复至室温，按照230μl胶囊液/只的剂量对SPF级C57BL/6J小鼠进行灌胃处理，1次/d，连续灌胃3d。在第一次灌胃后，连续饲养小鼠9天。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims (10)

1.一种IgA血管炎人源菌群小鼠模型，包括IgA血管炎初发模型和IgA血管炎复发模型，其特征在于，所述的初发模型肠道菌群具有供体IgA血管炎症初发患者特征的肠道微生物，包括普雷沃氏菌属、Paraprevotella、双歧杆菌属中的一种以上；所述的复发模型肠道菌群具有IgA降解性肠道共生菌，包括产碱杆菌科。

2.根据权利要求1所述的IgA血管炎人源菌群小鼠模型，其特征在于，所述的初发模型肠道微生物还包括葡萄球菌属、肠杆菌科、伯克氏菌属、萨特氏菌属、柯林斯氏菌属、Catenibacterium、梭杆菌属中的一种以上；所述的复发模型肠道微生物还包括梭状芽胞杆菌属、葡萄球菌属、微小杆菌属、Paenisporosarcina、Akkermansia、不动杆菌属、短状杆菌属、F16科、梭杆菌属中的一种以上。

3.一种如权利要求1或2所述的IgA血管炎人源菌群小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

菌液制备：收集IgA血管炎初发或复发患者的粪便样本，加入生理盐水，混合均匀，得到混悬液；过滤混悬液，除去残渣后，离心，收集上清菌液备用；

粪菌移植：采用灌胃的方式将上一步制备的菌液灌入小鼠胃内，连续灌胃3-4天；

模型建立：第一次灌胃后，连续饲养小鼠7～21天，光照/黑暗循环进行昼夜明暗交替，自由摄食饮水。

4.一种如权利要求1或2所述的IgA血管炎人源菌群小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

粪菌悬液制备：收集初发或复发IgA血管炎患者的粪便80～100g，加入180～220ml生理盐水，过滤后获得粪菌悬液；粪菌悬液与甘油按体积比(4.5～5.5):1混合均匀，离心，弃去上清液；沉淀再次高速冷冻离心，弃去上清液；

粪菌胶囊制备：将沉淀物置入胶囊中，并封闭；

粪菌移植：采用灌胃的方式将上一步制备胶囊灌入小鼠胃内，连续灌胃3-4天；

模型建立：第一次灌胃后，连续饲养小鼠7～21天。

5.根据权利要求4所述的IgA血管炎人源菌群小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述的粪菌胶囊制备方法为将沉淀物置入抗酸2号胶囊并封闭；或将沉淀物置入1号明胶胶囊，再分别使用0号和00号胶囊重封2次；或将沉淀物置入0号明胶胶囊中并封闭，再采用00号耐酸羟丙甲纤维素胶囊进行二次封闭。

6.根据权利要求3或4所述的IgA血管炎人源菌群小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述的小鼠选用SPF级C57BL/6J小鼠。

7.根据权利要求3或4所述的IgA血管炎人源菌群小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述小鼠的灌胃量为200～300μL/次，灌胃频次每天至少1次。

8.一种如权利要求1～7中任一所述的IgA血管炎人源菌群小鼠模型在筛选治疗IgA血管炎药物中的应用。

9.一种如权利要求1或2所述的IgA血管炎人源菌群小鼠模型的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括普雷沃氏菌属、Paraprevotella、双歧杆菌属、梭状芽胞杆菌属和葡萄球菌属含量的检测试剂。

10.根据权利要求1或2所述的IgA血管炎人源菌群小鼠模型的检测试剂盒，所述的试剂盒包括产碱杆菌科菌属细菌丰度的检测试剂、IL-17A的检测试剂和IL-21的检测试剂。

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