CN113262303B

CN113262303B - 硝酸盐还原酶抑制剂在制备药物中的用途

Info

Publication number: CN113262303B
Application number: CN202010524433.2A
Authority: CN
Inventors: 周宏伟; 徐开宇; 高徐璇; 尹恝; 何彦; 陈慕璇
Original assignee: Southern Medical University Zhujiang Hospital
Current assignee: Southern Medical University Zhujiang Hospital
Priority date: 2020-06-10
Filing date: 2020-06-10
Publication date: 2022-02-01
Anticipated expiration: 2040-06-10
Also published as: CN113262303A

Abstract

本申请涉及硝酸盐还原酶抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗受试者中与胃肠道缺血再灌注相关的远端损伤。本申请还涉及硝酸盐还原酶抑制剂用于筛选药物的用途，其中所述药物用于预防、缓解和/或治疗受试者中与胃肠道缺血再灌注相关的远端损伤。本申请还涉及包含所述硝酸盐还原酶抑制剂的药物组合物以及预防、缓解和/或治疗受试者中与胃肠道缺血再灌注相关的远端损伤的方法。

Description

硝酸盐还原酶抑制剂在制备药物中的用途

技术领域

本申请涉及生物医药领域，具体的涉及硝酸盐还原酶抑制剂在制备药物中的用途。

背景技术

脑卒中是当今世界上最为广泛的疾病之一，其发病率逐年增加，脑卒中患者生活质量下降，严重时导致死亡。在世界范围内，从1990年到2010年缺血性卒中年发病率和死亡率分别增加了37％和21％。

目前，脑卒中患者的治疗重点是静脉溶栓或血管内治疗，例如静脉注射重组组织型纤溶酶原激活剂(r-tPA)，该方法仍被认为是最重要的治疗方法。此外，根据每位患者的疾病具体状况，还会有抗血小板治疗，抗凝血剂，神经保护剂以及其他的对症治疗，包括治疗和预防高血糖，高血压和急性中风并发症。然而鉴于中风发病日趋严重的形式，新的治疗方式、靶点及药物亟需进一步地开发。

发明内容

本申请提供了硝酸盐还原酶抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗受试者中与胃肠道缺血再灌注相关的远端损伤。

在某些实施方式中，所述硝酸盐还原酶抑制剂抑制硝酸盐还原酶的活性。

在某些实施方式中，所述硝酸盐还原酶抑制剂包括钨酸盐和/或氯酸盐。

在某些实施方式中，所述硝酸盐还原酶抑制剂包括钨酸钠和/或氯酸钠。

在某些实施方式中，所述药物被配制为使得所述硝酸盐还原酶抑制剂在胃肠道局部发挥效力。

在某些实施方式中，所述药物被配制为使得在施用后约1小时或之后，所述硝酸盐还原酶抑制剂仍然以预防、缓解和/或治疗所述胃肠道缺血再灌注相关的远端损伤的有效量存在于胃肠道局部。

在某些实施方式中，所述药物被配制为使得在施用后约24小时或之后，所述药物中至多50％的所述硝酸盐还原酶抑制剂被所述受试者吸收而进入血液循环系统。

在某些实施方式中，所述药物中所述硝酸盐还原酶抑制剂的浓度为约0.0001％(w/w)至约90％(w/w)。

在某些实施方式中，所述受试者曾经、正在或有风险患有与所述胃肠道缺血再灌注相关的疾病和/或病症。

在某些实施方式中，所述与胃肠道缺血再灌注相关的疾病或病症包括脑卒中、创伤、休克、败血症、急性胰腺炎和/或炎症性肠病。

在某些实施方式中，所述与胃肠道缺血再灌注相关的疾病包括缺血性脑卒中。

在某些实施方式中，所述受试者曾经、正在或有风险经受所述胃肠道缺血再灌注。

在某些实施方式中，所述胃肠道缺血再灌注相关的远端损伤包括脑梗塞。

在某些实施方式中，所述药物被配置为适于经口施用。

在某些实施方式中，所述硝酸盐还原酶抑制剂基本上不被消化液分解和/或灭活。

本申请还提供了硝酸盐还原酶抑制剂用于筛选药物的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗受试者中与胃肠道缺血再灌注相关的远端损伤。

在某些实施方式中，所述药物抑制所述硝酸盐还原酶的活性。

本申请还提供了一种药物组合物，其包含本申请所述的硝酸盐还原酶抑制剂和任选地药学上可接受的载体。

本申请还提供了一种预防、缓解和/或治疗受试者中与胃肠道缺血再灌注相关的远端损伤的方法，所述方法包括向所述受试者施用本申请所述的硝酸盐还原酶抑制剂。

在某些实施方式中，所述施用包括经胃肠道施用。

在某些实施方式中，所述硝酸盐还原酶抑制剂在胃肠道局部发挥效力。

在某些实施方式中，在施用后约1小时或之后，所述硝酸盐还原酶抑制剂仍然以预防、缓解和/或治疗所述与胃肠道缺血再灌注相关的远端损伤的有效量存在于胃肠道局部。

在某些实施方式中，在施用后约24小时或之后，至多50％的所述硝酸盐还原酶抑制剂被所述受试者吸收而进入血液循环系统。

在某些实施方式中，所述硝酸盐还原酶抑制剂的给药剂量为约0.01mg/kg-200mg/kg体重。

本申请还提供了一种预防受试者中与胃肠道缺血再灌注相关的远端损伤的方法，所述方法包括：

a)监测所述受试者的胃肠道状况；

b)当所述监测显示所述受试者有风险经受胃肠道缺血再灌注，或者经受胃肠道缺血再灌注之时或之后，向所述受试者施用硝酸盐还原酶抑制剂。

在某些实施方式中，所述施用包括经胃肠道施用。

本申请还提供了硝酸盐还原酶抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗受试者中的脑梗塞。

在某些实施方式中，所述硝酸盐还原酶抑制剂抑制硝酸盐还原酶活性。

在某些实施方式中，所述药物被配置为适于经口施用。

在某些实施方式中，所述药物用于预防、缓解和/或治疗受试者中的脑梗塞。

在某些实施方式中，所述药物抑制硝酸盐还原酶活性。

本申请还提供了一种预防、缓解和/或治疗受试者中的脑梗塞的方法，所述方法包括向所述受试者施用本申请中所述的硝酸盐还原酶抑制剂。

在某些实施方式中，所述施用包括经胃肠道施用。

在某些实施方式中，述硝酸盐还原酶抑制剂在胃肠道局部发挥效力。

本申请还提供了一种预防受试者中的脑梗塞的方法，所述方法包括：

(a)监测所述受试者的胃肠道状况；

(b)当所述监测显示所述受试者经受胃肠道缺血再灌注之时或之后，向所述受试者施用硝酸盐还原酶抑制剂。

在某些实施方式中，所述施用包括经胃肠道施用。

本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。

附图说明

本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：

图1显示的是本申请中通过激光散斑成像系统(瑞沃德RFLSI Pro)观察的小鼠盲肠血流变化情况。

图2显示的是本申请中通过激光散斑成像系统(瑞沃德RFLSI Pro)观察的小鼠盲肠血流ROI proportion的统计结果。

图3显示的是本申请中利用PCoA分析表示的缺血性脑卒中引起的胃肠道缺血再灌注后肠道菌群失调的情况。

图4显示的是本申请中利用LEfSe分析表示的小鼠缺血性脑卒中引起的胃肠道缺血再灌注后肠道菌群的构成变化情况。

图5显示的是本申请中小鼠缺血性脑卒中引起的胃肠道缺血再灌注后肠道肠杆菌科的丰度变化情况。

图6显示的是本申请中钨酸钠(W)干预对小鼠缺血性脑卒中引起的胃肠道缺血再灌注后肠道菌群失调的影响。

图7显示的是本申请中钨酸钠(W)干预对小鼠缺血性脑卒中引起的胃肠道缺血再灌注后肠道(盲肠、结肠)肠杆菌科的丰度变化的影响。

图8显示的是钨酸钠(W)干预对于由缺血性脑卒中引起的胃肠道缺血再灌注后肠组织中肠屏障相关因子及促炎性细胞因子表达水平的影响。

图9显示的是本申请中钨酸钠(W)干预对于小鼠胃肠道缺血再灌注后脑损伤的影响。

图10显示的是本申请中尼氏(Nissl)染色示出的钨酸钠(W)干预对于小鼠脑部神经元死亡的影响。

图11显示的是本申请中钨酸钠(W)干预对于血清中肠屏障标记物与炎症因子含量的影响。

图12显示的是本申请中利用LEfSe分析表示的脑卒中患者肠道菌群的丰度变化情况。

图13显示的是本申请中不同发病进程脑卒中患者肠杆菌科丰度变化情况。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。

在本申请中，术语“硝酸盐还原酶”通常指一类能够将硝酸盐(NO₃ ^-)还原成亚硝酸盐(NO₂ ^-)的酶。硝酸盐还原酶可存在于真核生物或原核生物中，通常其活性位点可以包含钼辅因子。硝酸盐还原酶活性位点的钼辅因子可以是以钼蝶呤作为基本结构，在某些原核硝酸盐还原酶中，其活性位点的钼辅因子可以是二-钼蝶呤鸟苷二核苷酸(bis-molybdopterin guanine dinucleotide，MGD)的形式。在真核生物中，硝酸盐还原酶是亚硫酸氧化酶家族的部分成员，能够将电子从NADH或NADPH转移到硝酸盐。在原核生物中，硝酸盐还原酶属于DMSO还原酶家族，通常可以分为三类：位于细胞质的同化硝酸盐还原酶(Nas)，主要利用硝酸盐作为生长的氮源；膜结合的呼吸硝酸盐还原酶(Nar)，主要通过将硝酸盐作为末端电子受体来产生代谢能，本质上也是异化硝酸盐还原酶；位于细胞周质的异化硝酸盐还原酶(Nap)，主要是消散过量的还原力而实现氧化还原平衡。然而取决于亚硝酸盐的代谢命运，某种硝酸盐还原酶在某种具体的不同的条件下也可能具有不同的功能。(Conrado Moreno-Vivián，etc.,J Bacteriol.1999，181(21):6573–6584)。

在本申请中，术语“缺血”通常是指组织或器官供血量不足，进而导致缺氧及养分的情形。缺血一般情况下可以由血管问题所导致，例如血管栓塞，血管压迫；也可能因血管收缩、血栓形成或栓塞导致的局部贫血所导致，也可能由意外创伤、手术介入导致，也可能由其他器官或组织的疾病所导致，例如其他器官或组织的缺血性疾病，例如本申请中由缺血性脑卒中导致的胃肠道缺血。

在本申请中，术语“缺血再灌注”通常指在缺血或缺氧(缺氧或低氧)后血液供应返回组织的过程。换句话说，缺血再灌注通常指发生缺血的组织或器官在缺血诱因被消除/抵消/代偿/减缓后重新恢复血流的过程。在某些实施方式中，缺血组织的再灌注通常可以伴有如下任意情况的发生：再灌注部位微血管系统损伤，例如由于毛细血管和小动脉的渗透性增加，从而导致组织中的流体过滤及扩散增加；活化的内皮细胞在再灌注后产生更多的活性氧物质或者自由基导致随后的炎症反应；新返回血液将白血细胞由运送到再灌注区域，白细胞响应组织损伤从而释放炎症因子例如白细胞介素以及自由基，白细胞还可能与小毛细血管的内皮结合，阻塞它们从而导致新的缺血；另一方面，恢复的血流在组织内重新引入氧气，氧气在此特定情况下可能会破坏细胞的蛋白质，核酸和质膜结构，由此产生的反应性物质可能间接作用于氧化还原信号传导以开启细胞凋亡，细胞膜的损伤也可能进一步导致导致更多的自由基释放。所述的自由基可以包含氮氧自由基，例如一氧化氮或其衍生物。缺血再灌注通常会导致再灌注损伤，例如脑梗塞、急性心肌梗死、心肺复苏术后脑无再流现象、应激性溃疡、胰腺炎、烧伤、离体器官的移植、肠缺血、坏死性小肠结肠炎、间歇性跛行、急性肾小管坏死、休克后肝功能衰竭及多系统器官功能衰竭等。当所述再灌注损伤发生的部位与已经缺血再灌注的组织或器官不同时，通常可以称作远端再灌注损伤。

在本申请中，术语“远端损伤”通常指累及与已经缺血再灌注的局部器官或组织不同的器官或组织的病理生理过程。这一过程通常可能由局部缺血再灌注器官或组织部位生成的细胞产物经由循环系统暴露于其他器官所致。在某些实施方式中，所述远端损伤可以包括引起所述缺血再灌注的疾病、病征或医学介入，例如，脑卒中、创伤、休克、败血症、急性胰腺炎、炎症性肠病或脑外伤手术。在某些实施方式中，所述缺血再灌注可以包括胃肠道缺血再灌注。在某些实施方式中，所述远端损伤可以包括胃肠道缺血再灌注相关的缺血性脑卒中的损伤。例如，由缺血性脑卒中引起的胃肠道缺血再灌注相关的缺血性脑卒中的损伤。

在本申请中，术语“胃肠道缺血再灌注相关的远端损伤”通常是指与发生缺血再灌注的胃肠道部位不同的器官或组织的病理生理过程。这种病理生理过程与胃肠道缺血再灌注有关，例如可以表现为与胃肠道缺血再灌注同时、在其之前或之后发生的与胃肠道部位不同的器官或组织的病理生理过程。例如，当对胃肠道缺血再灌注或者胃肠道缺血再灌注相关效应或表征进行干预时，所述器官或组织的病理生理过程表现出相应变化，例如其症状减轻或缓解。例如在本申请中基于胃肠道缺血再灌注施用硝酸盐还原酶抑制剂后减轻了缺血性脑卒中的症状。

在本申请中，术语“硝酸盐还原酶活性”通常是指硝酸盐还原酶代谢硝酸盐的能力。

在本申请中，术语“抑制剂”通常指能够完全或部分地预防或降低一种或多种特定蛋白质的生理功能的化合物/物质或组合物。所述降低一种或多种特定蛋白质的生理功能可以包含蛋白质本身活性的降低或者本身存在量的降低。在某些实施方式中，所述抑制剂可以作为不同的晶体、无定形物质、药学上可接受的盐、水合物和溶剂化物而存在。

在本申请中，“钨酸盐”通常是指阴离子含钨酸根或聚钨酸根的盐。铵根离子、碱金属、碱土金属及其他重金属阳离子都能形成钨酸盐。例如，钨酸钠、钨酸钙、钨酸钴、钨酸镉、钨酸镁、钨酸亚铁、钨酸铵和钨酸锌等。

在本申请中，术语“施用”通常指通过任意引入或递送途径将所述抑制剂引入受试者的身体中。可以采用本领域技术人员已知的用于使细胞、器官或组织与所述抑制剂接触的任何方法。包括而不限于动脉内、鼻内、腹内、静脉内、肌内、皮下透皮或口服。每日剂量可以划分成一个、两个或更多个合适形式的剂量以在某个时间段期间的一个、两个或更多个时间施用。

在本申请中，术语“有效量”或“有效剂量”通常指足以实现或至少部分实现所需效果的量。药物或治疗剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”通常是当单独使用或与另一种治疗剂组合使用时促进疾病消退(这通过疾病症状严重程度的降低、疾病无症状期的频度和持续时间的增加、或者由于罹患疾病而引起的损害或残疾的预防来证明)的任何药物量。药物的“预防有效量”或“预防有效剂量”通常是指当单独或与另一种治疗剂组合给有疾病发展或疾病复发的风险的受试者施用时抑制疾病的发展或复发的药物量。可以使用本领域技术人员已知的多种方法对治疗剂或预防剂促进疾病消退或抑制疾病发展或复发的能力进行评估，比如在处于临床试验期间的人类受试者中、在动物模型系统中预测对人类的功效、或者通过在体外测定中测定药剂的活性。

在本申请中，术语“脑卒中”通常指一种急性脑血管疾病，也称作“中风”、“脑血管意外(cerebralvascular accident，CVA)”。脑卒中可以是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入脑而引起脑组织损伤的一组疾病，包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中。

在本申请中，术语“缺血性脑卒中”通常指由于脑的特定区域或广泛的脑组织区域供血量不足，导致所述区域的神经组织功能障碍的一组疾病。脑供血不足可以由多种疾病或异常引起，例如可以是镰状细胞性贫血、血管压迫、室性心动过速、动脉斑块积聚、血栓、严重低血压以及先天性心脏缺陷等。其中，镰状血细胞比正常血细胞更容易凝结，阻碍血液流向脑部；血管压迫通过阻断携带氧气进入大脑的动脉，可能导致脑缺血，血管压迫的原因例如肿瘤；室性心动过速可能导致心脏完全停跳导致血液流动停止，而心率失常也可能导致血凝块的形成，导致脑缺血；由于动脉斑块积聚导致的动脉阻塞也可能导致脑缺血，在少量斑块积聚的情况下也会导致通道变窄倾向于形成血栓，从而导致脑缺血；凝血功能异常，大血块也可以通过阻止血流引起脑缺血；心脏病发作也可能引起脑缺血，心脏病发作可能会使血流缓慢，血液可能开始凝结而阻止血液流向脑部；心脏病发作和低血压之间存在相关性，药物的不当使用和对药物的反应也可能导致过低的血压，过低的血压通常代表组织的氧合不足。在本申请中，缺血性脑卒中还可以是通过手术阻塞小鼠大脑中动脉血流实现。所述神经组织功能障碍可以包括神经元死亡。由于不同区域的神经组织功能障碍其主要症状可以包括：气/味/听或视觉改变、吞咽/瞳孔对光反应障碍、身体运动障碍、失语、呼吸和心率改变、其他组织或器官的缺血、意识丧失等。

在本申请中，术语“消化液”通常是指消化系统分泌的对食物起消化作用的液体。消化液主要由有机物、离子和水组成。消化液的主要功能可以包括：稀释食物，使之与血浆的渗透压相等，以利于吸收；改变消化腔内的pH，使之适应于消化酶活性的需要；水解复杂的食物成分，使之便于吸收；通过分泌粘液、抗体和大量液体，保护消化道粘膜，防止物理性和化学性的损伤。消化液可以包括如下几种：唾液、胃液、胰液、胆汁、小肠液等。

在本申请中，术语“预防”通常是指对健康受试者预防性地施用组合，以预防某种疾病或病症的发生。其也可以包含对处于待治疗变应性疾病前期的患者预防性地施用组合。“预防”不需要100％消除疾病或病症发生的可能性，换句话说，“预防”通常指在所述施用组合的存在下疾病或病症发生的可能性或发生程度降低了。

在本申请中，术语“缓解”指减少、缩减或迟滞某种病状、疾病、病症或表型。所述病状、疾病、病症或表型可以包括包括受试者主观感知例如疼痛、晕眩或其他生理性障碍，或者医学上可以检测的指征，例如通过医学检验手段检测到的病灶情况。

在本申请中，术语“治疗”通常指用于改变所处理的个体或细胞在临床病理过程中的自然过程的临床干预。可以包括改善病状态、消除病灶或改善的预后。

在本申请中，术语“经胃肠道施用”通常指允许在胃肠道部位处或附近区域特异性释放治疗剂。通过局部而不是全身释放治疗剂，药物的生物利用度可以在胃肠道部位增加和/或在体循环中减少，更低的全身药物水平可带来降低的毒性和降低的免疫原性(例如在生物制剂的情况下)，一方面导致改善的总体安全性以及较少的不良副作用，一方面提高在胃肠道部位的剂量，实现更高效、更加具有靶向的的效果。在一些情况下，局部施用治疗剂还提供了新的作用模式，例如不同局部位置的联合施用。

在本申请中，术语“在胃肠道局部发挥效力”通常是指所施用的治疗剂能够在胃肠道局部保持有效剂量并能够改变胃肠道局部的病症或表型。在胃肠道局部发挥效力不排除在胃肠道局部之外的器官或组织中观察到所述治疗剂。通常所述治疗剂可以具有在胃肠道部位的稳定性和/或胃肠道部位的组织穿透能力(渗透到胃肠道组织中的能力)，可以在胃肠道组织中实质分布。所述稳定性可以包括给药之前和/或之后的稳定性，例如在输送装置内的稳定性，给药后制剂和/或药物在胃肠道环境中的稳定性，包括疾病状态胃肠道环境，例如温度稳定性、pH稳定性、氧化稳定性。所述胃肠道局部可以包括受试者胃肠道一个或多个部位的部分或子部分。

在本申请中，术语“受试者”通常指人类或非人类动物，包括但不限于猫、狗、马、猪、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴。

在本申请中，术语“药物组合物”通常指指一种混合物，其包含至少一种待对受试者施用以治疗影响该个体的具体疾病或病症的活性成分。其允许所述活性成分处于有效的形式并且不含有对该组合物将要给予的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。这种组合物可以是无菌的，也可以包含药学上可接受的载体。

在本申请中，术语“药学上可接受的载体”通常指药学上可接受的涉及携带或转运化学试剂的物质、组合物或媒介物。例如缓冲液、表面活性剂、稳定剂、防腐剂、用于增强生物利用度的吸收促进剂、液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂、包囊材料和/或其他常规的增溶剂或分散剂。

在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。

在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。

一方面，本申请还提供了硝酸盐还原酶抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗受试者中的脑梗塞。

例如，所述脑梗塞可以包含大动脉的动脉粥样硬化性闭塞、脑栓塞(栓塞性梗死)、小的深部穿支动脉的非栓塞性梗塞(腔隙性脑梗)、和由远端动脉狭窄及脑血流下降导致的分水岭区域缺血(血流动力学卒中)。

例如，所述脑梗塞的相关病症可以包括脑神经细胞死亡、脑功能损伤、气/味/听或视觉改变、吞咽/瞳孔对光反应障碍、身体运动障碍、失语、呼吸和心率改变、其他组织或器官的神经调节紊乱、意识丧失等。

例如，所述脑梗塞的相关病症可以包括NIHSS中的任意指标。其中，所述NIHSS为美国国立卫生研究院卒中量表(National Institute of Health stroke scale)，所述NIHSS的评分方法可以参见Williams LS,Yilmaz EY,Lopez-Yunez AM.RetrospectiveAssessment of Initial Stroke Severity with The NIH Stroke Scale.Stroke.2000；31:858–862)。

例如，所述脑梗塞的相关病症在小鼠MCAO模型中可以表现为TTC染色中缺血性脑卒中区域为不着色(灰白色)，组织冰冻切片尼氏(Nissl)染色中缺血性脑卒中区域尼氏小体消失，或者小鼠改良神经缺损评分升高。

例如，所述硝酸盐还原酶抑制剂抑制硝酸盐还原酶活性。

例如，所述硝酸盐还原酶抑制剂包括钨酸盐和/或氯酸盐。

例如，所述硝酸盐还原酶抑制剂包括钨酸钠和/或氯酸钠。

例如，所述硝酸盐还原酶抑制剂为钨酸钠(Na₂WO₄)。

例如，所述药物被配制为使得所述硝酸盐还原酶抑制剂在胃肠道局部发挥效力。

例如，所述药物被配置为适于经口施用。

例如，所述硝酸盐还原酶抑制剂基本上不被消化液分解和/或灭活。

本申请还提供了硝酸盐还原酶抑制剂用于筛选药物的用途，其中所述药物用于预防、缓解和/或治疗受试者中的脑梗塞。

例如，所述药物抑制硝酸盐还原酶活性。

本申请还提供了一种预防、缓解和/或治疗受试者中的脑梗塞的方法，所述方法包括向所述受试者施用本申请所述的硝酸盐还原酶抑制剂。

例如，所述施用包括经胃肠道施用。

例如，所述硝酸盐还原酶抑制剂在胃肠道局部发挥效力。

(a)监测所述受试者的胃肠道状况；

例如，所述施用包括经胃肠道施用。

另一方面，本申请提供一种硝酸盐还原酶抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗受试者中与胃肠道缺血再灌注加剧相关的远端损伤。

在本申请中，所述药物被配制为使得所述硝酸盐还原酶抑制剂在胃肠道局部发挥效力。

在本申请中，所述胃肠道局部可以包含胃、小肠、大肠部位。所述胃可以包含胃贲门部、胃底、胃体、胃幽门部。所述小肠可以包含十二指肠、空肠、回肠。所述大肠可以包含盲肠、结肠、直肠。

在本申请中，所述在胃肠道局部发挥效力可以包含所述硝酸盐还原酶抑制剂抑制所述胃肠道细菌硝酸盐还原酶的活性或者降低所述胃肠道细菌硝酸盐还原酶的的表达。

例如，所述在胃肠道局部发挥效力可以包含所述硝酸盐还原酶抑制剂能够改善胃肠道菌群失调。

例如，所述在胃肠道局部发挥效力可以包含所述硝酸盐还原酶抑制剂能够降低胃肠道肠杆菌科的丰度。

在本申请中，所述在胃肠道局部发挥效力可以包含肠组织中Nox1、Duox2基因表达水平下降。所述肠组织可以包含结肠组织。

在本申请中，所述在胃肠道局部发挥效力可以包含肠组织中肠屏障相关基因表达水平的变化。

例如，肠屏障相关基因可以包括Ocln、Cldn2。其中，Ocln为Occludin、Cldn2为Claudin-2。

例如，所述在胃肠道局部发挥效力可以包含肠组织中Ocln表达升高。

例如，所述在胃肠道局部发挥效力可以包含肠组织中Cldn2表达下降。

在本申请中，所述在胃肠道局部发挥效力可以包含使得肠组织中促炎性细胞因子基因表达量下降，所述促炎性细胞因子基因选自下组的任意一种：Tnf、Ifng、Il6、Cxcl2和Kc；其中，Tnf为肿瘤坏死因子，Ifng为干扰素γ，Il6为白细胞介素6，Kc和Cxcl2为趋化因子成员。

例如，所述肠组织可以包含空肠、回肠、盲肠或结肠。

例如，所述药物被配制为使得在施用后约1小时或之后，所述硝酸盐还原酶抑制剂仍然以预防、缓解和/或治疗所述与胃肠道缺血再灌注相关的远端损伤的有效量存在于胃肠道局部。

例如，所述药物被配制为使得在施用后约24小时或之后，所述药物中至多50％的所述硝酸盐还原酶抑制剂被所述受试者吸收而进入血液循环系统。

在本申请中，所述药物中所述硝酸盐还原酶抑制剂的浓度为约0.0001％(w/w)至约90％(w/w)。

例如，所述硝酸盐还原酶抑制剂的浓度为约0.0005％(w/w)至约90％(w/w)，约0.001％(w/w)至约85％(w/w)，约0.0015％(w/w)至约80％(w/w)，约0.002％(w/w)至约75％(w/w)，约0.0025％(w/w)至约70％(w/w)，约0.003％(w/w)至约65％(w/w)，约0.0035％(w/w)至约60％(w/w)，约0.004％(w/w)至约55％(w/w)，约0.0045％(w/w)至约50％(w/w)，约0.005％(w/w)至约45％(w/w)，约0.0055％(w/w)至约40％(w/w)，约0.006％(w/w)至约35％(w/w)，约0.0065％(w/w)至约30％(w/w)，约0.007％(w/w)至约25％(w/w)，约0.0075％(w/w)至约20％(w/w)，约0.01％(w/w)至约80％(w/w)，约0.1％(w/w)至约70％(w/w)，约0.5％(w/w)至约60％(w/w)，约1％(w/w)至约50％(w/w)，约5％(w/w)至约90％(w/w)，约10％(w/w)至约80％(w/w)，约20％(w/w)至约70％(w/w)，约10％(w/w)至约50％(w/w)，约20％(w/w)至约50％(w/w)，约20％(w/w)至约40％(w/w)。约30％(w/w)至约50％(w/w)，约10％(w/w)至约20％(w/w)。

在本申请中，所述受试者曾经、正在或有风险患有与所述胃肠道缺血再灌注相关的疾病或病症。

在本申请中，所述与胃肠道缺血再灌注相关的疾病和/或病症可以包含天然事件、创伤或者减少/阻止胃肠道血流量的一种或多种外科手术或其他治疗性干预。其中，所述天然事件可以包含动脉梗死、静脉阻塞或者破坏或降低血液流向内脏器官的全身性低血压，所述全身性低血压可以包括因失血所致的出血性休克、因心肌梗死或心力衰竭所致的心源性休克、神经源性休克、肾源性休克或过敏反应。

例如，所述与胃肠道缺血再灌注相关的疾病和/或病症可以包括脑卒中、创伤、休克、败血症和/或急性胰腺炎。

例如，所述与胃肠道缺血再灌注相关的疾病和/或病症可以包含脑卒中。所述脑卒中可以包含由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入脑或入脑血流量减少而引起脑组织损伤的一组疾病。

例如，所述疾病可以包含缺血性脑卒中。所述缺血性脑卒中可以包含大动脉的动脉粥样硬化性闭塞、脑栓塞(栓塞性梗死)、小的深部穿支动脉的非栓塞性梗塞(腔隙性脑梗)、和由远端动脉狭窄及脑血流下降导致的分水岭区域缺血(血流动力学卒中)。

在本申请中，所述受试者曾经患有与所述胃肠道缺血再灌注相关的上述疾病。所述曾经可以包含向所述受试者施用所述药物前所述受试者患有与所述胃肠道缺血再灌注相关的上述疾病或病症。

在本申请中，所述受试者正在患有与所述胃肠道缺血再灌注相关的上述疾病或病症。所述正在可以包含向所述受试者施用所述药物时所述受试者患有与所述胃肠道缺血再灌注相关的上述疾病或病症。

在本申请中，所述受试者有风险患有与所述胃肠道缺血再灌注相关的上述疾病或病症。所述有风险可以包含向所述受试者施用所述药物后所述患者可能患有与所述胃肠道缺血再灌注相关的上述疾病或病症。

在本申请中，所述受试者曾经、正在或有风险经受所述胃肠道缺血再灌注。

例如，所述受试者曾经经受所述胃肠道缺血再灌注。所述曾经可以包含向所述受试者施用所述药物前所述受试者经受了所述胃肠道缺血再灌注。

例如，所述受试者正在经受所述胃肠道缺血再灌注。所述正在可以包含向所述受试者施用所述药物时所述受试者正在经受所述胃肠道缺血再灌注。

例如，所述受试者有风险经受所述胃肠道缺血再灌注。所述有风险可以包含向所述受试者施用所述药物后所述受试者经受了所述胃肠道缺血再灌注。

例如，所述与胃肠道缺血再灌注相关的远端损伤包括脑梗塞。

在本申请中，所述药物被配置为适于经口施用。例如口服。

例如，口服的剂型可以包括胶囊、片剂、丸剂、粒剂或糖浆。

例如，口服剂量可以按照按范围从约0.01至200mg/kg体重、从约0.01至180mg/kg、从约0.01至160mg/kg、从约0.01至140mg/kg、从约0.01至120mg/kg、从约0.01至100mg/kg、从约0.1至200mg/kg、从约0.1至150mg/kg、从约0.1至100mg/kg、从约0.1至80mg/kg、从约1至60mg/kg、从约0.1至40mg/kg、从约0.1至20mg/kg、25-200mg/kg、约50-200mg/kg、约100-200mg/kg、约25-50mg/kg、约25-100mg/kg、约50-100mg/kg、约50-200mg/kg。

的剂量施用。

例如，所述口服方式可以包括每日1或多次、每日、每隔1日、每周、每两周、每月或每两月服用。

在本申请中，所述硝酸盐还原酶抑制剂基本上不被消化液分解和/或灭活。所述消化液可以包含唾液、胃液、小肠液、胰腺液、胆汁。

例如，唾液，其pH为6.6～7.1，主要成分包括唾液淀粉酶、溶菌酶和少量的无机物(如含钠、钾、钙的无机盐)等，所述硝酸盐还原酶抑制剂基本上不被所述唾液分解和/或灭活。

例如，胃液，其pH为0.9～1.5，主要成分包括胃蛋白酶、胃酸(即盐酸)、黏液以及钠盐、钾盐等无机物，所述硝酸盐还原酶抑制剂基本上不被所述胃液分解和/或灭活。

例如，胰液，其pH为7.8～8.4，主要成分包括碳酸氢钠、胰淀粉酶、胰脂肪酶、胰蛋白酶原和糜蛋白酶原等，所述硝酸盐还原酶抑制剂基本上不被所述胰液分解和/或灭活。

例如，胆汁，其pH约为6.8～7.4，主要成分是胆盐和胆色素，所述硝酸盐还原酶抑制剂基本上不被所述胆汁分解和/或灭活。

例如，小肠液，其pH约为7.6，包含淀粉酶、麦芽糖酶、蔗糖酶、乳糖酶、肽酶、脂肪酶等多种消化酶，所述硝酸盐还原酶抑制剂基本上不被所述小肠液分解和/或灭活。

例如，所述硝酸盐还原酶抑制剂基本上不被所述唾液、胃液、胰液、胆汁、小肠液分解和/或灭活。

例如，所述硝酸盐还原酶抑制剂在ph为6.6～7.1、0.9～1.5、7.8～8.4、6.8～7.4、7.6时基本上不被分解和/或灭活。

所述硝酸盐还原酶抑制剂基本上不被消化液分解和/或灭活可以包括所述硝酸盐还原酶通路抑制在所述消化液中或与所述消化液接触后能够基本保持抑制所述硝酸盐还原酶的性能。

另一方面，本申请还提供了硝酸盐还原酶用于筛选药物的用途，其中所述药物用于预防、缓解和/或治疗受试者中与胃肠道缺血再灌注相关的远端损伤。

本申请还提供了硝酸盐还原酶抑制剂用于筛选药物的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗受试者中神经系统相关疾病或病症。

在本申请中，所述筛选药物可以包含对可能作为药物使用的物质进行生物活性、药理作用及药用价值的评估过程。所述筛选药物可以包含生化水平和细胞水平的筛选。所述选药物还可以包含高通量筛选和虚拟药物筛选。

在某些实施方式中，所述药物抑制所述硝酸盐还原酶的表达和/或活性。

另一方面，本申请还提供了一种药物组合物，所述药物组合物可以包含本申请所述的硝酸盐还原酶抑制剂和任选地药学上可接受的载体。

例如，所述药物组合物可以包括保健制品。

所述保健品通常是指具有一般食品的共性，能调节人体的机能，适用于特定人群食用，但不以治疗疾病为目的一类制品，也称作膳食补充剂。包括茶、酒、蜂制品、饮品、汤品、鲜汁、药膳等。

例如，所述药物组合物可以包括生物制品。

所述生物制品通常是指应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备的，用于人类疾病预防、治疗和诊断的制品。包括菌苗、疫苗、毒素、类毒素、血液制品、免疫球蛋白、抗原、变态反应原、细胞因子、激素、酶、发酵产品、单克隆抗体、DNA重组产品等。

所述硝酸盐还原酶抑制剂可以包含钨酸盐和/或氯酸盐。所述钨酸盐可以包括钨酸钠、钨酸钙、钨酸镁、钨酸亚铁、钨酸铵和/或钨酸锌等；所述氯酸盐可以包括氯酸钾、氯酸钠、氯酸镁等。所述药学上可接受的载体可以包含药学上可接受的涉及携带或转运化学试剂的物质、组合物或媒介物，例如缓冲液、表面活性剂、稳定剂、防腐剂、用于增强生物利用度的吸收促进剂、液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂、包囊材料和/或其他常规的增溶剂或分散剂。

在本申请中，所述药物组合物可以包含以下组分中的任何一种或其任何组合：阿拉伯胶，藻酸盐，海藻酸，乙酸铝，苯甲醇，对羟基苯甲酸丁酯，丁基化羟基甲苯，抗氧化剂，柠檬酸，碳酸钙，小烛树蜡，交联羧甲基纤维素钠，糖果糖，胶体二氧化硅，纤维素，巴西棕榈蜡，玉米淀粉，羧甲基纤维素钙，硬脂酸钙，EDTA二钠钙，共聚维酮，氢化蓖麻油，磷酸氢钙脱水，氯化十六烷基吡啶，半胱氨酸HC1，交联聚维酮，磷酸氢钙，磷酸氢二钠，聚二甲基硅氧烷，赤藓红钠，乙基纤维素，明胶，单油酸甘油酯，甘油，甘氨酸，单硬脂酸甘油酯，山丁酸甘油酯，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羟丙甲纤维素，HPMC邻苯二甲酸盐，氧化铁，氧化铁黄，乳糖(含水或无水或一水合物或喷雾干燥)，硬脂酸镁，微晶纤维素，甘露醇，甲基纤维素，碳酸镁，矿物油，甲基丙烯酸共聚物，氧化镁，对羟基苯甲酸甲酯，PEG，聚山梨醇酯80，丙二醇，聚环氧乙烷，对羟基苯甲酸丙酯，泊洛沙姆407或188，碳酸氢钾，山梨酸钾，淀粉，磷酸，聚氧乙烯40硬脂酸酯，羟基乙酸淀粉钠，预胶化淀粉，交联羧甲基纤维素钠，十二烷基硫酸钠，二氧化硅，苯甲酸钠，硬脂酸，用于药用糖果的糖浆，造粒剂，山梨酸，碳酸钠，糖精钠，海藻酸钠，硅胶，山梨糖醇单油酸酯，硬脂酰富马酸钠，氯化钠，偏亚硫酸氢钠，脱水柠檬酸钠，羧甲基纤维素钠，琥珀酸，丙酸钠，二氧化钛，滑石粉，甘油三乙酸酯，柠檬酸三乙酯。

在本申请中，所述药物组合物可以是固体形式，例如，胶囊，片剂，丸剂，粒剂，小药囊或锭剂；或者可以是液体形式，例如溶液，悬浮液，乳液或糖浆。

另一方面，本申请还提供了一种预防、缓解和/或治疗受试者中与胃肠道缺血再灌注相关的远端损伤的方法，所述方法包括向所述受试者施用本申请所述的硝酸盐还原酶抑制剂。

本申请还提供了一种预防、缓解和/或治疗受试者中神经系统相关疾病或病症，所述方法包括向所述受试者施用本申请所述的硝酸盐还原酶抑制剂。

例如，所述施用包括经胃肠道施用。所述经胃肠道施用包括在胃肠道部位处或附近区域特异性释放所述硝酸盐还原酶抑制剂。

例如，通过机械装置将所述硝酸盐还原酶抑制剂递送至胃肠道。

例如，通过内窥镜、喷雾导管将所述硝酸盐还原酶抑制剂递送至胃肠道。

例如，通过口服缓释剂、崩解剂使得所述硝酸盐还原酶抑制剂在胃肠道释放。

例如，所述缓释剂、崩解剂能够依赖胃肠道pH启动释放或崩解。

例如，通过肠溶衣胶囊、脂质体微胶囊使得所述硝酸盐还原酶抑制剂在胃肠道释放。

例如，通过灌胃将所述硝酸盐还原酶抑制剂递送至胃肠道。

例如，经胃肠道施用的时间为脑卒中后约1-7天，1-6天，约1-5天，约1-4天，约1-3天，约1-2天，约1-24小时，约1-12小时，约3-12小时，约6-12小时，约1-3小时，约1-6小时，约3-6小时，约3-12小时，约6-12小时。

例如，所述硝酸盐还原酶抑制剂在胃肠道局部发挥效力。

例如，在施用后约1小时或之后，所述硝酸盐还原酶抑制剂仍然以预防、缓解和/或治疗所述胃肠道缺血再灌注相关的远端损伤的有效量存在于胃肠道局部。

例如，在施用后约24小时或之后，至多50％的所述硝酸盐还原酶抑制剂被所述受试者吸收而进入血液循环系统。

例如，所述硝酸盐还原酶抑制剂的给药剂量为从约0.01至200mg/kg体重、从约0.01至180mg/kg、从约0.01至160mg/kg、从约0.01至140mg/kg、从约0.01至120mg/kg、从约0.01至100mg/kg、从约0.1至200mg/kg、从约0.1至150mg/kg、从约0.1至100mg/kg、从约0.1至80mg/kg、从约1至60mg/kg、从约0.1至40mg/kg、从约0.1至20mg/kg、25-200mg/kg、约50-200mg/kg、约100-200mg/kg、约25-50mg/kg、约25-100mg/kg、约50-100mg/kg、约50-200mg/kg。

另一方面，本申请还提供了一种预防受试者中与胃肠道缺血再灌注相关的远端损伤的方法，所述方法包括：(1)监测所述受试者的胃肠道状况；(2)当所述监测显示所述受试者经受胃肠道缺血再灌注之时或之后，向所述受试者施用硝酸盐还原酶抑制剂。

例如，所述方法还包括在步骤(1)前监测导致胃肠道缺血再灌注的疾病或病症。

例如，所述检测所述受试者的胃肠道状况包括临床查体，临床检验和/或临床检查，评估受试者的胃肠道状况。

例如，在监测到患者曾经、正在或有风险经受导致胃肠道缺血再灌注的疾病或病症时，对其进行临床查体，检验与检查，评估受试者的胃肠道状况。

例如，所述临床查体可以包括观察患者食欲、有无吞咽困难、有无腹痛、恶心、呕吐、呕血、便血、大便性状、排便时有无包含腹痛腹胀、排便习惯是否改变等症状，以及腹部查体。

例如，临床检验包括三大常规等。

例如，临床检查可以包括腹部X线、超声、CT、内镜、ERCP、与PTC等。

例如，监测所述受试者的胃肠道状况可以包含观察胃肠部位血流变化。

例如，所述施用包括经胃肠道施用。

例如，通过灌胃将所述硝酸盐还原酶抑制剂递送至胃肠道。

在本申请中，所述与胃肠道缺血再灌注相关的远端损伤可以包括与胃肠道不同的任何器官或组织的病理或生理过程。

例如，所述与胃肠道不同的任何器官或组织的病理或生理过程可以是与胃肠道缺血再灌注同时发生的。

例如，所述同时发生可以是所述与胃肠道不同的任何器官或组织的病理或生理过程与胃肠道缺血再灌注的发生时间相差在10分钟内，例如5分钟内，例如3分钟内，例如1分钟内。

例如，所述与胃肠道不同的任何器官或组织的病理或生理过程可以是在胃肠道缺血再灌注之前发生的。

例如，所述与胃肠道不同的任何器官或组织的病理或生理过程可以是在胃肠道缺血再灌注之前24小时内发生的。例如22小时内，例如20小时内，例如18小时内，例如16小时内，例如14小时内，例如12小时内，例如10小时内，例如8小时内，例如，6小时内，例如5小时内，例如4.5小时内，例如4小时内，例如3.5小时内，例如3小时内，例如2.5小时内，例如2小时内，例如1.5小时内，例如1小时内，例如，0.5小时内。

例如，所述与胃肠道不同的任何器官或组织的病理或生理过程可以是在胃肠道缺血再灌注之后发生的。

例如，所述与胃肠道不同的任何器官或组织的病理或生理过程可以是在胃肠道缺血再灌注之后30天内发生的。例如28天内，例如26天内，例如24天内，例如22天内，例如20天内，例如18天内，例如16天内，例如14天内，例如12天内，例如10天内，例如8天内，例如1天内例如6天内，例如5天内，例如4天内，例如3天内，例如2天内，例如1天内，例如12小时内，例如9小时内，例如6小时内，例如3小时内，例如1小时内，例如0.5小时内。

例如，所述与胃肠道不同的任何器官或组织的病理或生理过程可以表现为当对胃肠道缺血再灌注或者胃肠道缺血再灌注相关效应或表征进行干预时，所述器官或组织的病理生理过程得到缓解或减轻。

例如，所述肠道缺血再灌注相关效应或表征可以包括肠道菌群失调、肠杆菌科细菌丰度变化、肠屏障变化、胃肠组织促炎因子变化。

例如，所述肠道缺血再灌注相关效应或表征可以包括肠道菌群失调、肠道菌群构成变化。

例如，所述肠道缺血再灌注相关效应或表征可以包括肠道肠杆菌科丰度升高。

例如，所述肠道缺血再灌注相关效应或表征可以包括肠屏障损伤、胃肠组织炎症因子表达变化。

在本申请中，所述胃所述与胃肠道不同的任何器官或组织的病理或生理过程可以包括胃肠道缺血组织的再灌注导致的全身性或局部远端反应，所述反应可以包括广泛微血管功能障碍和组织屏障功能改变以及炎症反应。

在本申请中，所述与胃肠道不同的任何器官或组织的病理或生理过程可以累及肺。

例如，所述与胃肠道不同的任何器官或组织的病理或生理过程可以包含肺水肿、肺内血栓形成过程、肺栓塞和/或肺组织的炎症。

在本申请中，所述与胃肠道不同的任何器官或组织的病理或生理过程可以累及肾。

例如，所述与胃肠道不同的任何器官或组织的病理或生理过程可以包含肾衰竭、水肿形成、血栓形成、血栓栓塞和/或肾组织的炎症。

在本申请中，所述与胃肠道不同的任何器官或组织的病理或生理过程可以累及中枢神经系统。

例如，所述与胃肠道不同的任何器官或组织的病理或生理过程可以包括血脑屏障破坏、沉默型脑缺血、脑卒中、脑水肿、颅内压升高、神经元组织的炎症、神经细胞死亡、脑损伤和/或神经系统功能障碍。

例如，所述与胃肠道不同的任何器官或组织的病理或生理过程可以包含缺血性脑卒中及相关病症。

例如，所述缺血性脑卒中及相关病症可以包括在小鼠MCAO模型中表现为TTC染色中缺血性脑卒中区域为不着色(灰白色)，组织冰冻切片尼氏(Nissl)染色中缺血性脑卒中区域紫色尼氏小体消失，或者小鼠改良神经缺损评分升高(与对照组有显著差异P值<0.05)。

例如，所述与胃肠道不同的任何器官或组织的病理或生理过程可以包含炎症。

例如，所述与胃肠道不同的任何器官或组织的病理或生理过程可以包含全身性炎症。所述炎症可以累及肺、胃肠系统、心血管系统、其他四肢和/或中枢神经系统。

例如，所述与胃肠道不同的任何器官或组织的病理或生理过程可以包含全身炎症反应综合征(重症炎性反应综合征)和/或多器官功能障碍综合征(MODS)。

例如，所述与胃肠道不同的任何器官或组织的病理或生理过程可以包括引起所述胃肠道缺血再灌注的疾病、病症或医学介入，例如，脑卒中、创伤、休克、败血症、急性胰腺炎、炎症性肠病或脑外伤手术。

例如，所述创伤包括由外力因素引起人体组织或器官的破坏，例如，交通伤、坠落伤、机械伤、锐器伤、跌伤、火器伤。

例如，所述休克通常是指机体遭受强烈的致病因素侵袭后，有效循环血量锐减，机体失去代偿，组织缺血缺氧，神经-体液因子失调的一种临床症候群。其主要特点可以包括重要脏器组织中的微循环灌流不足、代谢紊乱、全身各系统的机能障碍。例如，低血容量性休克、血管扩张性休克、心源性休克。所述低血容量性休克可以包括失血性休克、烧伤性休克、创伤性休克；所述血管扩张性休克可以包括感染性休克、过敏性休克、神经源性休克。

在本申请中，所述硝酸盐还原酶可以包括真核硝酸盐还原酶和/或原核硝酸盐还原酶。

例如，所述硝酸盐还原酶可以包括原核硝酸盐还原酶。

例如，所述原核硝酸盐还原酶可以包括同化硝酸盐还原酶(Nas)、呼吸硝酸盐还原酶(Nar)、异化硝酸盐还原酶(Nap)。

在本申请中，所述硝酸盐还原酶抑制剂抑制硝酸盐还原酶的表达和/或活性。

例如，所述硝酸盐还原酶抑制剂可以包括能够与钼蝶呤结合或者能够阻抑钼蝶呤功能的化合物。

例如，所述硝酸盐还原酶抑制剂可以包括能够与所述硝酸盐还原酶结合而抑制其活性或功能的化合物。

例如，所述硝酸盐还原酶抑制剂抑制原核硝酸盐还原酶的表达和/或活性。

例如，所述硝酸盐还原酶抑制剂抑制胃肠道细菌的硝酸盐还原酶的表达和/或活性。

例如，所述硝酸盐还原酶抑制剂抑制肠杆菌科细菌硝酸盐还原酶的表达和/或活性。

例如，所述硝酸盐还原酶抑制剂能够使得胃肠道肠杆菌科丰度下降。

例如，所述硝酸盐还原酶抑制剂可以包括钨酸盐和/或氯酸盐。

例如，所述钨酸盐可以包括钨酸钠、钨酸钙、钨酸镁、钨酸亚铁、钨酸铵和/或钨酸锌等。

例如，所述氯酸盐可以包括氯酸钾、氯酸钠、氯酸镁等。

例如，所述硝酸盐还原酶抑制剂可以包括钨酸钠和/或氯酸钠。

例如，所述硝酸盐还原酶抑制剂可以为钨酸钠(Na₂WO₄)。

不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的硝酸盐还原酶抑制剂在制备药物中的用途、硝酸盐还原酶用于筛选药物的用途、包含硝酸盐还原酶抑制剂的药物组合物等，而不用于限制本申请发明的范围。

实施例

材料和试剂

8-10周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠，体重为22-24g，由广东省医学实验动物中心提供，具有实验动物质量合格证明。粪便样品基因组DNA提取试剂盒(MinkaGene Stool DNAKit)为Minka Gene产品；引物由Thermo Fisher公司合成；TaqMan逆转录试剂、SYBR Green为Takara Bio公司产品；ViiA 7实时PCR系统为Applied Biosystems公司产品；硝酸盐/亚硝酸盐检测试剂盒为Sigma公司产品；TTC粉剂为Sigma公司产品；D-Lac、LBP、LPS血清ELISA试剂盒为基因美公司产品；其他材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

统计学分析

非微生物信息学数据数据分析采用R分析软件。正态分布数据以均数±标准差表示，非正态分布数据以中位数(四分位数间距)形式展示，非参数检验采用Kruskal-Wallis秩和检验或Mann-Whitney U检验，参数检验采用非成对Student’s test或ONE-WAY ANOVA进行分析。分类变量以比例表示。使用Shapiro-Wilk测试检查数据的正常性。对于微生物群分析，使用在QIIME 1.9.1中实施的Adonis测试。P<0.05(双尾)被认为具有显著差异。

实施例1.实验小鼠分组

选取SPF级8周龄雄性C57BL/6野生型小鼠为实验对象，并对其进行如下随机分组：SHAM组，进行假手术处理；MCAO组，进行MCAO造模处理；W组(Post-W组)，在小鼠进行MCAO造模后，对其进行钨酸钠(W)干预(0.8％w/v水溶液，灌胃，200μl，1次)；Pre-W组，在小鼠进行MCAO造模前，对其进行钨酸钠(W)干预(0.2％w/v，饮水每天约为3～5μl，7天)。空白对照组：不做处理。

实施例2.小鼠大脑中动脉梗死模型(MCAO)建立

小鼠称重，以0.2ml/10g的三溴乙醇进行麻醉，剪开颈部约1cm的正中切口，小心剥离组织，暴露右侧颈动脉三角区。小心分离出右侧颈总动脉、颈外动脉(颈外动脉需要尽量往上剥离，直到入颅前分叉处)和颈内动脉；结扎颈总动脉近心端(活结)，用电凝器尖端凝断颈外动脉小分支，结扎颈外动脉的近心端(活结)和远心端(死结)。剪开颈外动脉，将线栓(根据小鼠体重选择适当型号)往颈内动脉方向插入，略微感到阻力时停止插入(大约当线栓标记(离头端1cm)在颈总动脉分叉处)，固定线栓，随后缝合皮肤。插入线栓后1小时拔栓，此时作为卒中后计时起点(即卒中后0点)。术中采用恒温毯保持小鼠核心体温在37+0.5℃，持续到小鼠麻醉效应过后苏醒，此操作是为了防止因低温脑保护作用影响小鼠脑缺血模型的建立。手术过程中因失血过多或造模时间超过15分钟的小鼠将舍弃，不纳入后期实验分析研究中。

实施例3.小鼠盲肠血流观察

对SHAM组以及MCAO组的小鼠盲肠部位血管进行血流观察，以MCAO组的小鼠造模操作前、插线栓后、拔线栓后、以及拔线栓后1小时为时间点，SHAM组小鼠进行假手术操作，并在响应时间点进行血流观察。具体操作步骤如下：

(1)操作前需对小鼠进行麻醉，腹部进行消毒，沿腹正中线逐层切开皮肤，肌层，暴露盲肠；

(2)使用激光散斑成像系统(瑞沃德RFLSI Pro)观察小鼠盲肠血流，首先观察小鼠盲肠全景成像，拍照后采用激光散斑成像系统(瑞沃德RFLSI Pro)软件记录盲肠血流动态图像，记录时间为10min，每帧间隔为1s；

(3)分析采用兴趣区域(Region of Interest，ROI)的血流变化，兴趣区域为盲肠六条血管分支，记录完毕后提取兴趣区域的数值作为血流值。

(4)检测过程中不同时间点的相对区域血流值为相应时刻的兴趣区内平均血流值除以最初时间点的血流值。

在整个手术过程中控制小鼠核心体温在37+0.5℃。

观察结果如图1和图2所示，在MCAO组小鼠移除线栓以及在此之后的1小时的时间点，与SHAM组小鼠相比，在MCAO组小鼠的盲肠血流减少，表明在MCAO小鼠脑卒中期间小鼠肠中发生缺血现象。

实施例4.肠道内容物总DNA(肠道菌群总DNA)提取

脑卒中后3小时、6小时、12小时、24小时、3天、7天对SHAM组、空白对照组以及MCAO组的小鼠，采用粪便样品基因组DNA提取试剂盒(MinkaGene Stool DNA Kit)进行样本中细菌总DNA的提取。提取流程严格按照该试剂盒的说明书进行。细菌总DNA的提取产物放置于-80℃冰箱冻存，留待后续进行PCR操作扩增目标基因。样品采集部位包括空肠、回肠、盲肠、结肠。

实施例5.PCR扩增细菌16S rRNA V4区基因特征标签序列

将实施例4获得的细菌总DNA样品，采用具有16s rRNA V4可变区域带barcode的通用引物进行下一步的PCR扩增流程。PCR循环参数设定如下表1所示：

表1 PCR循环步骤

PCR体系建立过程均在无菌条件下完成，操作台为生物安全柜。PCR反应体系为25μl。PCR反应体系如下：

表2 PCR反应体系：

反应物	体积
		上游引物F	0.4ul
下游引物R	0.4ul
		ROX2(Vazyme，南京，中国)	0.4ul
SYBR Green(Vazyme，南京，中国)	10ul
		细菌DNA	2ul
PCR水	6.8ul

以16s rRNA V4区域带Barcode的通用引物进行PCR扩增，通用引物分别是V4F：GTGYCAGCMGCCGCGGTAA；V4R：GGACTACNVGGGTWTCTAAT。(如SEQ ID NO.15-16所示)。

扩增结束后，PCR产物存放于-20℃冰箱中保存等待混样与测序。

实施例6测序及菌群数据分析

成功扩增目标条带的的PCR产物，按照浓度100ug/L定量混样，于本实验室采用Illumina Iseq100(PE 150)测序技术进行菌群基因测序。利用BIPES技术测序对测序前所有的原始序列进行预处理(参见Zhou HW,Li DF,Tam NF,et al.BIPES,a cost-effectivehigh-throughput method for assessing microbial diversity.ISME J,2011,5:741-749)。

测序结果综合采用Mothur、QIIME、BIPES等生物信息学工具，处理序列，质控，去除嵌合体，拼接获得目标标签序列，最终分拣到每个样品。进一步地，经Usearch或者UPARSE聚类，进行OTU种属分类(参见He Y,Caporaso JG,Jiang XT,et al.Stability ofoperational taxonomic units:an important but neglected property for analyzingmicrobial diversity[J].Microbiome,2015,3:20)。最终的结果再进一步获得相应的alpha和beta多样性参数，并作PCoA，PCA等多元统计分析。最后结合运用LEfSe等工具，寻找不同组别之间的菌群结构差异。

OTU(Operational Taxonomic Units，分类操作单元)：在生物学信息分析中，测序得到的每一条序列代表一个菌。对序列进行归类操作(cluster)，将序列按照彼此相似性(指定相似度96％、97％或者98％)归类为许多小组(每一个小组即为一个OTU)，OTU划分后进行生物信息统计分析，进一步得知一个样品测序结果中的菌种、菌属等数目信息，分析过程中所使用的肠杆菌科最大OTU序列如SEQ ID NO：17所示。

利用PyNAST算法(PyNAST algorithms)对每个OTU的序列进行校准序列排齐处理，每个OTU的代表性序列通过序列的频率来确定。之后去除嵌合体，将OTU的代表序列插入到FastTree软件进行处理，进而生成含有所有OTU代谢序列的系统发育进化树，在此基础上进行菌群分析。

主成分分析(Principal component analysis,PCA)已被广泛运用于不同肠道菌群群落结构的比较。主成分分析PCA是根据样本之间的相关性程度，采用降维方法，把多数指标转化为几个综合性的指标来进行分析。本专利中，采用的是与主成分分析PCA相似的主坐标分析方法(principal coordinate analysis，PCoA)，对各样本间进行进行非加权(unweighted)和加权(weighted)分析组间β-多样性的结果。PCoA分析方法是从样本间的聚类矩阵出发，通过三维坐标轴的旋转，根据聚类距离在新的坐标系中标定样本。

PCoA分析表明脑卒中造模后小鼠肠道微生物β-多样性呈现出显著变化。Unweighted UniFrac结果如图3所示，与空白对照组相比MCAO造模后小鼠肠道菌群(回肠部位内容物)与对照组相比均出现显著失调。在MCAO造模后不同时间点，小鼠肠道内容物菌群结构呈现出先紊乱后恢复的变化趋势。具体表现为，随着时间的推移，自3小时开始MCAO组小鼠的样本与对照组样本的距离逐渐增大，在造模后1天时距离最远，之后组间距离逐渐缩小。以上结果表明，进行脑卒中造模的小鼠在不同时间点其肠道中微生物结构发生显著变化，并表现为先紊乱后恢复的变化趋势。

采用LEfSe(linear discriminate analysis size effect)分析，找出对照组和实验组之间具有显著性差异的细菌类群。在本次分析中，将LDA(线性判别分析)临界值设置为4.1。LEfSe分析，即LDA Effect Size分析，是一种针对高维生物的标记进行探索的分析方法。它可识别不同生物条件间的基因组学的特点，辨别两个或多个不同生态组之间的差异，实现分组之间的比较。除此之外，还可进行分组的内部的亚组比较，找到组间在丰度上有显著差异的物种。该分析方法首先在多组样本中检测不同分组间丰度差异显著的物种(采用非参数因子Kruskal-Wallis秩和检验)；然后进行组间的差异分析(采用非参数因子成组分析的Wilcoxon秩和检验)；最后用线性判别分析(LDA)方法，对数据进行降维以帮助评估组间差异显著的物种在组间差异中的影响力(即LDA score)。最后，采用条图展示出LEfSe分析结果。条图中的高度表示细菌差异程度的大小。

LEfSe分析结果如图4显示，脑卒中后24小时相对于Sham组而言MCAO组中的细菌如Enterobacteriaceae(肠杆菌科)高度富集，是MCAO组相对于Sham组的显著差异菌种。

肠杆菌科16S rRNA V4测序分析结果如图5所示，自脑卒中后3小时起，肠杆菌科丰度显著高于SHAM组，其持续升高，至脑卒中后12小时至1天时间点达到最高水平，随后逐渐下降，于脑卒中后第7天仍显著高于SHAM组。MCAO组的小鼠相对SHAM组小鼠肠杆菌科的相对丰度显著增加。

实施例7.钨酸钠(W)干预对于肠道缺血再灌注后肠道菌群失调的影响

(1)按照实施例1中的描述准备如下四组小鼠：SHAM组，进行假手术处理；MCAO组，进行MCAO造模处理；W组，小鼠进行MCAO造模，脑卒中后1小时(即移除线栓后1小时)对其进行钨酸钠(W)干预(0.8％w/v水溶液，灌胃，200μl，1次)；Pre-W组，在小鼠进行MCAO造模前，对其进行钨酸钠(W)干预(0.2％w/v，饮水每天约为3～5μl，7天)，钨酸钠(W)干预7天结束后进行MCAO造模。MCAO造模按照实施例2所述的方式进行。

(2)在脑卒中后24小时，按照实施例4-6的方法进行菌群测序及数据分析，结果如图6所示，无论是造模前钨酸钠(W)干预还是造模后钨酸钠(W)干预都相对于MCAO组显著改善了肠道菌群失调的情况。

实施例8.钨酸钠(W)干预对于肠道缺血再灌注后肠杆菌科丰度的影响

(1)按照实施例1中的描述准备如下四组小鼠：SHAM组，进行假手术处理；MCAO组，进行MCAO造模处理；W组，小鼠进行MCAO造模，脑卒中后1小时(即移除线栓后1小时)对其进行钨酸钠(W)干预(0.8％w/v水溶液，灌胃，200μl，1次)；Pre-W组，在小鼠进行MCAO造模前，对其进行钨酸钠(W)干预(0.2％w/v，饮水每天约为3～5μl，7天)，钨酸钠(W)干预7天结束后进行MCAO造模。MCAO造模按照实施例2所述的方式进行；

(2)在脑卒中后24小时，按照实施例4-6的方法进行菌群测序及数据分析，结果如图7所示，无论是造模前钨酸钠(W)干预还是造模后钨酸钠(W)干预都相对于MCAO组显著降低了肠杆菌科的相对丰度。

实施例9.钨酸盐(W)干预对于肠组织中肠屏障因子和促炎性细胞因子(proinflammatory cytokine)表达量的影响

在脑卒中后的24小时快速采取小鼠结肠组织并冷冻储存在-80℃用于测定Ocln、Cldn2、Ifng、Cxcl2、Kc、和Il6的表达水平。其中，Ocln、Cldn2为肠屏障相关基因，Ocln为Occludin、Cldn2为Claudin-2；Ifng为干扰素γ、Il6为白细胞介素6、Kc和Cxcl2趋化因子。脑卒中后24小时进行取样检测。Ocln、Cldn2、Ifng、Cxcl2、Kc、和Il6的引物序列如如SEQ IDNO：3-14所示。

具体步骤如下：

(1)使用Minibeadbeater(Biospec Products，Bartlesville)均匀化结肠组织；

(2)Trizol试剂法(Invitrogen)提取RNA：每50-100mg均质组织样本中加入1mlTRIZOL进行匀浆。之后加入0.2ml氯仿，覆盖后剧烈摇动15秒，在15-30℃下放置2-3分钟，然后离心12,000g，15分钟，2-8℃。将上层水相转移，加入0.5ml异丙醇，放置10分钟，15-30℃，然后离心12,000g，10分钟，2-8℃。加入1ml 75％乙醇洗涤RNA沉淀5分钟。之后溶解RNA，并测定浓度；

(3)使用TaqMan逆转录试剂(Takara Bio)分别从各RNA样品中获取cDNA；

(4)以20μl体积中加入2μl cDNA为模板(浓度为50-100ng/ul)，以250nM为最终浓度加入如SEQ ID NO：3-14所示的上游引物和下游引物，进行SYBR Green(Takara Bio)实时PCR，反应体系如下：

表3 SYBR Green实时PCR体系：

反应物	体积
		上游引物F	0.4ul
下游引物R	0.4ul
		ROX Reference Dye II	0.4ul
SYBR Green	10ul
		cDNA	2ul
PCR水	6.8ul

(5)用ViiA 7实时PCR系统(Applied Biosystems)提取数据，并使用比较Ct方法进行数据分析。以各自Gapdh表达水平作为内参，序列如SEQ ID NO.1-2所示。

结果如图8所示，造模前钨酸盐(W)干预或者造模后钨酸盐(W)干预使Ocln基因表达水平显著升高，同时Cldn2基因表达水平显著降低，表明其改善了肠屏障损伤；同时显著降低了Ifng、Cxcl2、Kc、和Il6的表达水平，表明其有效抑制了结肠组织的炎症反应。

实施例10.钨酸钠(W)干预对于肠道缺血再灌注后缺血性脑卒中脑损伤的影响

(2)使用PBS配制TTC粉剂，TTC染色液浓度为2％，避光放置；

(3)小鼠麻醉(0.2ml/10g的三溴乙醇)后打开胸腔，剪开右心耳，心脏灌注冰冻PBS约2min；

(4)断头取脑，脑组织放置在脑槽中，随后将脑槽放置在-80℃冰箱7-8分钟后取出，行厚1.5mm的冠状切片；

(5)将切好的脑组织放置在TTC染色液中，避光染色10min。正常脑组织为深红色，缺血性脑卒中区不着色(灰白色)。将染色后的切片加入甲醛固定后，取出拍照；

(6)采用ImagePlus Soft图像软件进行脑损伤体积分析。分析结果时排除脑水肿因素，通过水肿修正梗死体积的公式进行计算：脑损伤区域＝直接损伤体积-(躯体同侧半球-躯体对侧半球)，最终得到脑损伤体积占全大脑半球比例值。

结果如图9所示，无论是造模前钨酸钠(W)干预还是造模后钨酸钠(W)干预，小鼠脑缺血性脑卒中的损伤程度都显著缓解，相比于未干预的MCAO组。这说明通过抑制肠杆菌科丰度，可以改善小鼠缺血性脑卒中后脑损伤。

实施例11.脑组织冰冻切片尼氏(Nissl)染色

(1)取脑：脑卒中后24小时，评估mNSS后，处死各组小鼠(SHAM组，MCAO组，Post-W组)，取脑；

(2)固定：麻醉小鼠后打开胸腔充分暴露心脏，剪开右心耳，使用冰冻生理盐水进行心脏灌注10min，然后冰冻4％多聚甲醛(Paraformaldehyde，PFA)灌注10min。随后将组织固定于PFA 24h，30％PFA蔗糖48小时。充分脱水后脑组织完全沉底，取出脑组织；

(3)包埋：切取脑组织置于冰冻切片包埋模具中，常规OCT包埋，液氮冷冻，置于-80℃冰箱冻存；

(4)切片：将冰冻切片机温度调至-20℃。温度达到后取出标本，脑组织取前囟后2.0mm至4.0mm的范围(包含整个的丘脑组织)，连续切成厚度5μm的冠状面切片。用细毛笔展平切片，将切片置于载玻片上，置于-20℃冰箱中保存；

(5)尼氏染色：脑切片浸入尼氏染液5分钟，蒸馏水洗涤2次。95％乙醇约5秒。95％乙醇脱水2分钟。浸入新鲜二甲苯透明5分钟，中性树胶封片。片子晾干后置于显微镜下观察并采集图片分析。正常存活的神经元细胞胞膜完整呈蓝紫色，可见胞核深染。

结果如图10所示，钨酸钠(W)干预减少了小鼠海马区域神经元的丢失。

实施例12.钨酸钠(W)干预对于血清中肠屏障标记物与炎症因子含量的影响

小鼠评估mNSS后进行采血。采血方式包括眼眶取血和后腔静脉取血。小鼠血清标本进行检测前储存于-80℃。小鼠血清肠屏障标记物如D-Lac、MDA按照ELISA试剂盒(基因美，Elisa Lab)说明书的步骤进行操作，炎症因子如IL-6、TNF-α含量严格按照ELISA试剂盒(基因美，Elisa Lab)说明书的步骤进行操作，制作标准曲线，按照标准曲线算出各表达量。

结果如图11所示，造模前钨酸钠(W)干预或者造模后钨酸钠(W)干预都显著降低了小鼠血清中D-Lac、MDA的含量，表明其改善了肠屏障损伤；同时造模后钨酸钠(W)干预显著降低了小鼠血清中TNF-α的含量，造模前钨酸钠(W)干预或者造模后钨酸钠(W)干预都显著降低了小鼠血清中IL-6的含量，表明其有效抑制了炎症水平。

实施例13.脑卒中患者肠道菌群构成分析

(1)研究队列为于2016年5月至2016年9月在南方医科大学南方燕岭医院神经内科住院的急性脑卒中患者28例。本研究招募了新诊断为缺血性卒中的患者。缺血性卒中被定义为与影像学证实的急性梗塞相关的临床综合征，其与磁共振成像或磁共振血管造影的结果一致。根据缺血性脑卒中诊断指标，入院时的所有患者确诊为缺血性卒中。入组标准：①诊断符合中国急性缺血性脑卒中诊治指南(2014版)诊断标准；②年龄大于18岁；③发病48小时内入院；④未行静脉溶栓和(或)血管内治疗；⑤1个月之内无抗生素使用史；⑥1个月之内无益生元和(或)益生菌使用史；⑦患者本人或授权委托人签署知情同意书并配合留取标本。排除标准：①合并肿瘤性疾病；②合并炎症性肠病、消化道大出血或肝硬化；③合并需要使用抗生素的感染；④签署同意书后拒绝提供研究所需粪便样本；⑤正在参与其他干预性研究。同时在本课题组的数据库中根据年龄和性别匹配28例无心脑血管疾病病史的健康体检者作为对照组(healthy control,HC)，对照组与疾病组排除标准相同。

南方医科大学伦理委员会批准了本研究的所有内容，并从所有受试者或其法定监护人处获得了数据收集的知情同意书。患者粪便样本在采集后，迅速放置在冰盒中转送至实验室，采用高压无菌的EP管进行分装，分装操作台为消毒后的通风橱，分装后做好标记，并在收集后2小时内在冻存于-80℃冰箱中。确定入组样本后，进行后期操作分析。

(3)采用深圳易瑞生物技术有限公司的粪便样本总DNA磁珠法提取试剂盒提取粪便中的细菌总DNA。提取流程严格按照试剂盒的说明书进行。细菌总DNA的提取产物放置于-20℃冰箱冻存，留待后期进行PCR操作扩增目标基因。

(4)按照实施例5-6的方法进行PCR。所有PCR产物混合并进行Illumina的双端测序。使用BIPES对原始序列进行预处理。使用QIIME(1.9.1)工作流程脚本来构建BIOM文件。使用Usearch算法选择操作分类单元(OTU)。根据序列频率，确定每个OTU的代表性序列与生物分类分配。PyNAST算法用于比对代表性序列，FastTree用于基于代表性序列确定系统发育关系。其余分析流程同上，LEfSe分析结果如图12显示，相对于健康对照组组而言脑卒中患者中Enterobacteriaceae(肠杆菌科)高度富集，是脑卒中患者组相对于健康对照组的显著差异菌种。

实施例14.脑卒中患者发病后不同时期肠杆菌科丰度检测

(1)实施例14所述脑卒中患者组中，在患者入组后多次采集粪便样本并根据发病时间到标本采集时间的间隔分为四组，T1：卒中发病后1天至4天，T2：卒中发病后5天至7天，T3：卒中发病后8天至30天，T4：卒中发病后31天至120天。按照实施例14中步骤收集粪便样本，获取肠道菌群基因组。

(2)按照实施例13的方法进行菌群测序及数据分析，结果如图13所示，T1-T3组的肠杆菌科相对丰度对明显高于健康对照组与T4期患者。脑卒中后肠杆菌科相对丰度体现出先升高后降低的变化趋势。

实施例15.硝酸盐还原酶抑制剂在胃肠道局部发挥效力

在小鼠干预前(0h)，及干预后不同时间点(1h，3h，6h，12h，24h)，收集小鼠血浆、肠道内容物样本。

样本预处理：每个粪便样品称取约10mg，分别装进1.5mL管中，加入25μL的水，用氧化锆珠匀浆3min。然后，加入185μL的乙腈：甲醇(8:2)提取代谢物，高速离心(18000g,20min)，将上清液转移至96孔板中。每个孔中加入20μL新鲜配制的衍生化试剂，将板密封，置于30℃进行约60min的衍生化。然后，加入350μL冰浴的50％甲醇溶液稀释样品，将板置于-20℃下20min，接着在4℃下离心(4000g,30min)，吸取135μL上清液，转移至新的96孔板，每个孔中加入15μL的内标。在左边孔中加入衍生化的标准品原液的梯度稀释液，最后将板密封，用于LC-MS分析。

在每个血清样品中移取25μL转移至96孔板中。每个孔中加入100μL含内标的冰冷甲醇，剧烈振荡5min。将96孔板在4000g下离心30min，再重新放置于移液工作站中。转移30μL上清于新的96孔板中，加入20μL新鲜配制的衍生化试剂，将板密封，置于30℃进行约60min的衍生化。然后，加入350μL冰浴的50％甲醇溶液稀释样品，将板置于-20℃下20min，接着在4℃下离心(4000g,30min)，吸取135μL上清液，转移至新的96孔板，每个孔中加入15μL的内标。在左边孔中加入衍生化的标准品原液的梯度稀释液，最后将板密封，用于LC-MS分析。

利用超高效液相色谱-串联质谱联用仪(UPLC-MS/MS)(ACQUITY UPLC-Xevo TQS,Waters Corp.,Milford,MA,USA)进行药物浓度检测。使用QuanMET软件(v2.0,Metabo-Profile,Shanghai,China)对UPLC-MS/MS生成的原始数据文件进行处理，对每一个代谢物进行峰的集成、校准和定量。

结果显示，施用后约1小时或之后，钨酸钠仍然以预防、缓解和/或治疗所述胃肠道缺血再灌注引起的远端损伤的有效量存在于胃肠道局部；在施用后约24小时或之后，至多50％的钨酸钠、多粘菌素类抗生素、肠杆菌科噬菌体被所述受试者吸收而进入血液循环系统。

前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。

序列表

<110> 南方医科大学珠江医院

<120> 硝酸盐还原酶抑制剂在制备药物中的用途

<130> 0133-PA-003

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> gapdh引物序列1

<400> 1

tgtagaccat gtagttgagg tca 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> gapdh引物序列2

<400> 2

aggtcggtgt gaacggattt g 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Ocln引物序列1

<400> 3

acggaccctg accactatga 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Ocln引物序列2

<400> 4

tcagcagcag ccatgtactc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Cldn2引物序列1

<400> 5

tggttcctga cagcatgaaa 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Cldn2引物序列2

<400> 6

ctttgggctg ttgagcagat 20

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Ifng引物序列1

<400> 7

gctctgagac aatgaacgct acac 24

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Ifng引物序列2

<400> 8

ttcttccaca tctatgccac ttgag 25

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Cxcl2引物序列1

<400> 9

tccaggtcag ttagccttgc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Cxcl2引物序列2

<400> 10

cggtcaaaaa gtttgccttg 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Il6引物序列1

<400> 11

cggaggcttg gttacacatg tt 22

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Il6引物序列2

<400> 12

ctggctttgt ctttcttgtt atc 23

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Kc引物序列1

<400> 13

tgcacccaaa ccgaagtcat 20

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Kc引物序列2

<400> 14

ttgtcagaag ccagcgttca c 21

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 16S rRNA通用上游引物

<220>

<221> n

<222> (4)..(4)

<223> n=c或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> n 是 a, c, g或t

<220>

<221> n

<222> (9)..(9)

<223> n=a或c

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n是 a, c, g或 t

<400> 15

gtgncagcng ccgcggtaa 19

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 16S rRNA 通用下游引物

<220>

<221> n

<222> (8)..(8)

<223> n=a,，t，c或g

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(9)

<223> n是 a, c, g或 t

<220>

<221> n

<222> (9)..(9)

<223> n=a,，c或g

<220>

<221> n

<222> (14)..(14)

<223> n=a,或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> n是 a, c, g或t

<400> 16

ggactacnng ggtntctaat 20

<210> 17

<211> 1400

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肠杆菌科最大OTU序列

<400> 17

agagtttgat cctggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgaac 60

ggtaacagaa agcagcttgc tgctttgctg acgagtggcg gacgggtgag taatgtctgg 120

gaaactgcct gatggagggg gataactact ggaaacggta gctaataccg cataacgtcg 180

caagaccaaa gagggggacc ttcgggcctc ttgccatcgg atgtgcccag atgggattag 240

ctagtaggtg gggtaacggc tcacctaggc gacgatccct agctggtctg agaggatgac 300

cagccacact ggaactgaga cacggtccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat 360

tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcca tgccgcgtgt atgaagaagg ccttcgggtt 420

gtaaagtact ttcagcgggg aggaagggag taaagttaat acctttgctc attgacgtta 480

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Claims

1.钨酸钠在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗受试者的缺血性脑卒中。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物被配制为使得所述钨酸钠在胃肠道局部发挥效力。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物被配制为使得在施用后1小时或之后，所述钨酸钠仍然以预防、缓解和/或治疗所述缺血性脑卒中的有效量存在于胃肠道局部。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物被配制为使得在施用后24小时或之后，所述药物中至多50％的所述钨酸钠被所述受试者吸收而进入血液循环系统。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物中所述钨酸钠的浓度为0.0001％(w/w)至90％(w/w)。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的用途，其中所述受试者曾经、正在或有风险经受所述缺血性脑卒中。

7.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物被配置为适于经口施用。

8.根据权利要求1所述的用途，其中所述钨酸钠不被消化液分解和/或灭活。