ES2925466T3 - Inhibidores del complemento y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un polipéptido multidominio que comprende (i) un primer dominio que comprende la repetición de la proteína de control del complemento (CCP) que es un dominio acelerador de la descomposición de la convertasa para las convertasas de las vías clásica y alternativa de activación del complemento, (ii) una célula huésped dominio de reconocimiento, y (iii) un segundo dominio que comprende CCP con actividad de cofactor. La presente invención se refiere además a un polinucleótido que codifica dicho polipéptido multidominio, a un vector que comprende dicho polinucleótido ya una célula huésped que comprende dicho polinucleótido y/o dicho vector. Además, la presente invención se refiere al polipéptido multidominio, el polipéptido y el vector para uso en medicina y para tratar y/o prevenir la activación inapropiada del complemento y/o una enfermedad que tiene una activación inapropiada del complemento como síntoma. Además, la presente invención se refiere a métodos y usos relacionados con el polipéptido multidominio, el polipéptido y el vector. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidores del complemento y usos de los mismos

La presente divulgación se refiere a un polipéptido multidominio que comprende (i) un primer dominio que comprende una repetición de proteína de control del complemento (CCP) que es un dominio de aceleración de la disociación de convertasa para convertasas de las vías clásicas y alternativas de activación del complemento, (ii) un dominio de reconocimiento de células hospedadoras, y (iii) un segundo dominio que comprende una CCP con actividad de cofactor. La presente divulgación se refiere además a un polinucleótido que codifica dicho polipéptido multidominio, a un vector que comprende dicho polinucleótido y a una célula hospedadora que comprende dicho polinucleótido y/o dicho vector. Además, la presente divulgación se refiere al polipéptido multidominio, al polipéptido y al vector para su uso en medicina y para tratar y/o prevenir la activación inapropiada del complemento y/o una enfermedad que tiene activación inapropiada del complemento como un síntoma. Además, la presente divulgación se refiere a métodos y usos relacionados con el polipéptido multidominio, el polipéptido y el vector.

El sistema inmunitario se puede dividir en dos ramas: la inmunidad innata filogenéticamente más antigua y las respuestas inmunitarias adaptativas. Una respuesta inmunitaria por el sistema inmunitario adaptativo, o adquirido, es normalmente más específica que una respuesta inmunitaria innata. Otras características del sistema inmunitario adaptativo son el desarrollo de una memoria inmunológica y el retraso normalmente observado entre la exposición de un antígeno y la máxima respuesta inmunitaria.

El sistema inmunitario innato está altamente conservado, incluso en organismos primitivos. Los efectores celulares de esta rama comprenden principalmente neutrófilos, monocitos y macrófagos, mientras que los efectos inmunitarios innatos solubles consisten principalmente en el sistema del complemento, además de otros efectores, como proteínas de fase aguda o péptidos formadores de poros (Parkin & Cohen (2001) The Lancet 357: 1777-89). El sistema del complemento consiste en componentes lábiles al calor en suero, que se describieron por Paul Ehrlich para "complementar" la respuesta de anticuerpos contra bacterias. Otras funciones del sistema del complemento son la opsonización de intrusos microbianos, complejos inmunitarios, residuos, células apoptósicas y necróticas para soportar su depuración eficaz mediante la captación por células fagocíticas (Ricklin et al. (2010) Nature Immunology 11: 785-797). El sistema del complemento está organizado en tres vías de activación: la vía clásica (CP), de las lectinas (LP) y la alternativa (AP).

La activación de la CP normalmente se logra en un modo dependiente de anticuerpo por el componente del complemento C1q, que actúa de molécula de reconocimiento de patrones (PRM). Después de una serie de acontecimientos de activación proteolítica, la convertasa C3 de CP (C4bC2a) escinde el componente del complemento C3, que es fundamental para las tres vías de activación del complemento, dando C3a, una anafilotoxina y C3b (opsonina). Debido a esta escisión, ocurre un cambio conformacional y un enlace tioéster previamente interno llega a la superficie de la proteína de C3b. Este enlace tioéster activo, y una vez se expone de corta vida, puede unirse covalentemente a grupos hidroxilo y amino de moléculas localizadas sobre superficies celulares, o se puede lisar ("extinguir") por agua. Como consecuencia, puede ocurrir la opsonización de células con muchas moléculas C3b si la convertasa C3 no está regulada por disminución. La producción de enormes cantidades de moléculas C3b facilita la activación de C5 por convertasas C5. La convertasa C5 escinde C5 en C5a (la anafilotoxina más potente) y C5b, que recluta los factores del complemento C6-9 formando el complejo de ataque a membrana (MAC) que ensambla orificios en membranas celulares para la lisis y la destrucción.

La vía de las lectinas (LP) está organizada similarmente a la CP. La activación ocurre mediante el reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) o patrones moleculares asociados al peligro (DAMP). Dentro de la LP, PAMP o DAMP pueden ser detectados por varias moléculas de reconocimiento de patrones que son homólogas a C1q (la molécula de reconocimiento de patrones de la CP): lectina que se une a manosa (MBL) y diversos tipos de colectinas y ficolinas. Posterior a PAMP o DAMP, la unión a MBL sufre cambios conformacionales y entonces se asocia con serina proteasas asociadas a MBL (MASP). La MBL es homóloga en estructura y función a C1q. En analogía con la CP, MASP2 activa proteolíticamente C2 en C2a y C2b, y C4 en C4a y C4b. Los componentes activados pueden formar la convertasa C3 C4bC2a de LP, que es idéntica a la CP y escinde C3 en C3a y C3b. En analogía con CP, en ausencia de una estricta regulación de la convertasa C3, la producción de más moléculas C3b fomenta la activación de C5 a través de las convertasas C5. La activación proteolítica de C5 es el punto de partida de la vía final y lítica del complemento donde C5b inicia la formación de MAC.

La vía alternativa se activa a través de un proceso de autoactivación a bajo nivel. Este proceso se denomina activación "marcapasos" de C3. Las moléculas de C3 tienen una conformación intrínsecamente metaestable. En todo momento, una pequeña proporción de las moléculas de C3 experimentan cambios conformacionales espontáneos (activación) que exponen el dominio tioéster previamente interno. El tioéster se puede inactivar por agua o unir indistintamente (para propios o extraños) a nucleófilos sobre una superficie celular. Dicha "autoactivada" C3 se denomina C3(H2O) y es estructuralmente similar a las moléculas de C3b. C3b o C3(H2O) exponen nuevas superficies de proteína que están escondidas en C3. Estas nuevas superficies se unen al factor B, otro factor del complemento de AP. Cuando el factor B se une a C3b o C3(H2O), se puede escindir por el factor de proteasa D en Ba y Bb. Bb sigue unido a C3(H2O) (o C3b) y constituye la convertasa C3 de la AP, C3bBb. En analogía con las convertasas C3 de CP y LP, C3bBb puede producir moléculas de C3b y C3a escindiendo C3. La proteína Properdin, un regulador positivo de la AP, desempeña una función importante estabilizando las interacciones proteína-proteína de la convertasa C3 de AP. Si no se regula, cualquier C3b generada por la vía alternativa, clásica o de las lectinas es capaz de formar más convertasas C3 de la AP y amplificar más el número de moléculas de C3b producidas en el bucle de retroalimentación positiva. Esta etapa se denomina "bucle de amplificación" de la AP. Por lo tanto, las tres vías de activación convergen al nivel de activación de C3 y, si no se regulan, se acumulan en la formación de MAC.

Las vías clásica y de las lectinas son inactivas hasta que son activadas específicamente a través de la detección de patógenos o moléculas de peligro endógeno. Por el contrario, la AP es activa todo el tiempo a un bajo nivel y produce indistintamente moléculas de C3b (o inicialmente C3(H2O)). Se conocen más de diez proteínas reguladoras diferentes dentro del sistema del complemento. Algunos reguladores inhiben precisamente al nivel de iniciación de CP y LP; sin embargo, las partes de la cascada que están más fuertemente controladas son las convertasas, que actúan de amplificadores de la señal de activación, y C3b, que construye la plataforma para formar las convertasas C3, y las convertasas C5 inflamatorias. También hay algunos reguladores que controlan específicamente el MAC lítico.

Las proteínas reguladoras se pueden dividir en aceleradores de la disociación que desestabilizan la convertasa C3 y conducen a una disociación más rápida de la convertasa. Un grupo adicional implica a proteínas que degradan C3b o/y C4b, como el factor H y el factor I; para prevenir la degradación no específica por el factor de proteasa soluble I, la inactivación de C3b o C4b necesita la presencia de proteínas de cofactor que se unen a la diana y reclutan al factor I (por ejemplo, FH o CR1). Un grupo adicional de reguladores inhibe la formación de MAC.

Muchas enfermedades, en particular enfermedades hereditarias, están asociadas con una insuficiencia del complemento, en particular una hiperactivación del complemento. Por lo tanto, en un esfuerzo por proporcionar un regulador artificial del sistema del complemento, se desarrolló un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a la proteína del complemento C5 y que inhibe la activación final, eculizumab (Hillmen et al. (2006), NEJM355(12):1233). En una línea de desarrollo similar, se desarrolló la proteína inhibidora C5 rEV576 (coversin) (Romay-Penabad et al (2014), Lupus 23(12):1324). Además, se obtuvo una proteína denominada "mini-FH", que conecta las repeticiones de la proteína de control del complemento (las CCP ) 1-4 y 19-20 del factor H del complemento a través de un conector (documento de patente WO 2013/142362 A1); sin embargo, la última solo inhibe la vía alternativa.

El documento de patente WO 2005/069726 A2 propuso una proteína reguladora del complemento híbrida que comprende una primera unidad funcional de una primera proteína reguladora del complemento, que tiene propiedades reguladoras del complemento, una primera secuencia espaciadora y al menos una segunda unidad funcional seleccionada del grupo que consiste en polipéptidos que proporcionan una unidad funcional de una segunda proteína reguladora del complemento, polipéptidos derivados de una inmunoglobulina y polipéptidos que potencian la unión de la proteína a una célula de animal.

El documento de patente WO 2010/034015 A2 desveló un método de modulación de la actividad del complemento alternativo en un individuo, que comprende administrar al individuo una composición seleccionada del grupo que consiste en (a) anexina A2 o un fragmento biológicamente activo de la misma; (b) una proteína de fusión que comprende un anticuerpo anti-anexina A2 o un fragmento de unión al antígeno del mismo fusionado con un inhibidor del complemento seleccionado del grupo que consiste en DAF, factor H, MCP, CD59, CRI y proteína Crry de ratón o un fragmento biológicamente activo de la misma; y (c) un fragmento biológicamente activo del factor H que carece del dominio regulador del complemento en SCR 1 a 4 del factor H de longitud completa.

Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de inhibidores del complemento mejorados que eviten los inconvenientes del estado de la técnica. Este problema se resuelve por los medios y métodos desvelados en el presente documento.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un polipéptido multidominio según la reivindicación 1; la presente divulgación se refiere a un polipéptido multidominio que comprende

(i) un primer dominio que comprende una repetición de proteína de control del complemento (CCP) que es un dominio de aceleración de la disociación de convertasa para convertasas de las vías clásicas y alternativas de activación del complemento,

(ii) un dominio de reconocimiento de células hospedadoras, y

(iii) un segundo dominio que comprende CCP.

Por tanto, la presente divulgación se refiere a un polipéptido multidominio que comprende

(i) un primer dominio que comprende una repetición de proteína de control del complemento (CCP) que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al menos el 70 % a CCP 1 a 3 de un receptor del complemento de tipo 1 (CR1) y/o que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al menos el 70 % a CCP 1 a 4 de un factor de aceleración de la disociación (DAF),

(ii) un dominio de reconocimiento de células hospedadoras que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al menos el 70 % a CCP 6 a 8 o a CCP 19 a 20 de un factor H del complemento, y

(iii) un segundo dominio que comprende CCP, que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al menos el 70 % a CCP 8 a 10 y/o a CCP 15 a 17 de un CR1.

Como se usa a continuación, los términos "tener", "comprender" o "incluir", o cualquier variación gramatical aleatoria de los mismos, se usan de una forma no excluyente. Por lo tanto, estos términos se pueden referir tanto a una situación en la que, además de la característica introducida por estos términos, no están presentes características adicionales en la entidad descrita en este contexto, como a una situación en la que están presentes una o más características adicionales. Como un ejemplo, las expresiones "A tiene B", "A comprende a B" y "A incluye B" se pueden referir tanto a una situación en la que, además de B, no está presente otro elemento en A (es decir, una situación en la que A consiste únicamente y exclusivamente en B) como a una situación en la que, además de B, están presentes uno o más elementos adicionales en la entidad A, tales como el elemento C, los elementos C y D, o incluso elementos adicionales.

Además, como se usa a continuación, los términos "preferentemente", "más preferentemente", "lo más preferentemente", "particularmente", "más particularmente", "específicamente", "más específicamente" o términos similares se usan junto con características opcionales, sin restringir posibilidades adicionales. Por lo tanto, las características introducidas por estos términos son características opcionales y no pretenden restringir el alcance de las reivindicaciones de ningún modo. La invención se puede realizar, como reconocerá el experto, usando características alternativas. Similarmente, las características introducidas por "en una realización de la invención" o expresiones similares pretenden ser características opcionales, sin restricción referente a realizaciones adicionales de la invención, sin restricciones referentes al alcance de la invención y sin restricción referente a la posibilidad de combinar las características introducidas de esa forma con otras características opcionales o no opcionales de la invención. Además, si no se indica de otro modo, el término "aproximadamente" se refiere al valor indicado con la precisión técnica comúnmente aceptada en el campo relevante, se refiere preferentemente al valor indicado ± 20 %, más preferentemente ± 10 %, lo más preferentemente ± 5 %.

El término "repetición de proteína de control del complemento", que también se denomina "CCP", "repetición corta de tipo complemento", "repetición consenso corta" o "SCR", en la técnica, se conoce, en principio, en la técnica y se revisó, por ejemplo en Schmidt et al. (2008), Clin Exp Immunol. 151 (1 ):14-24). Las CCP son secuencias de péptidos que comprenden aprox. 60 a 70 aminoácidos que incluyen cuatro restos de cisteína conservados que forman dos enlaces disulfuro y un triptófano conservado, con variación de secuencias considerable de los aminoácidos residuales. Además de la unión a las proteínas del complemento C3b y/o C4b, también se encontró que las CCP median en actividades adicionales, que incluyen la actividad de aceleración de la disociación y la actividad de cofactor del factor I como se especifica en el presente documento a continuación.

El término "primer dominio que comprende CCP", como se usa en el presente documento, se refiere a un dominio de polipéptido multidominio como se especifica en el presente documento que es un dominio de aceleración de la disociación de convertasa para convertasas de las vías clásicas y alternativas de activación del complemento. Por lo tanto, preferentemente, el primer dominio que comprende CCP comprende al menos una CCP que tiene actividad de aceleración de la disociación en convertasas C3 de la vía de activación del complemento tanto alternativa como clásica. El término "actividad de aceleración de la disociación", como se usa en el presente documento, se refiere a la propiedad de una CCP o dominio que comprende CCP para mediar en la disociación, preferentemente inactivación, de la convertasa C3 de la vía alternativa de activación del complemento, es decir, C3bBb, y/o de la convertasa C3 de la vía clásica de activación del complemento, es decir, C4bC2a. Preferentemente, la actividad de aceleración de la disociación de una CCP se determina por resonancia de plasmones superficiales (SPR) como se especifica en el presente documento en los ejemplos. Preferentemente, el primer dominio que comprende CCP comprende de desde dos hasta diez, preferentemente de desde dos hasta cinco, más preferentemente de desde tres hasta cuatro CCP que tienen o que contribuyen a la actividad mencionada. Preferentemente, el primer dominio que comprende CCP comprende las CCP 1 a 3 de un receptor del complemento de tipo 1 (CR1), preferentemente de CR1 humano, como se especifica en el presente documento a continuación; y/o comprende las CCP 1 a 4 de un factor de aceleración de la disociación (DAF), preferentemente DAF humano, como se especifica en el presente documento a continuación. Preferentemente, el primer dominio que comprende CCP comprende las CCP 1 a 3 de un receptor del complemento de tipo 1 (CR1), como en la secuencia que existe de forma natural; y/o comprende las CCP 1 a 4 de un factor de aceleración de la disociación (DAF), como en la secuencia que existe de forma natural.

Preferentemente, el primer dominio que comprende CCP comprende, preferentemente consiste en, una secuencia de aminoácidos como se muestra en ^s E^q ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 70 %, preferentemente al menos el 80 %, más preferentemente al menos el 90 %, lo más preferentemente al menos el 95 % a SEQ ID NO: 1 y que tiene la actividad de ser un dominio de aceleración de la disociación de convertasa para convertasas de las vías clásicas y alternativas de activación del complemento. Más preferentemente, el primer dominio que comprende CCP comprende, preferentemente consiste en, una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 1. También preferentemente, el primer dominio que comprende CCP comprende, preferentemente consiste en, una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 70 %, preferentemente al menos el 80 %, más preferentemente al menos el 90 %, lo más preferentemente al menos el 95 % a SEQ ID NO: 2 y que tiene la actividad de ser un dominio de aceleración de la disociación de convertasa para convertasas de las vías clásicas y alternativas de activación del complemento. Más preferentemente, el primer dominio que comprende CCP comprende, preferentemente consiste en, una secuencia de aminoácidos como se muestra en ^s E^q ID NO: 2.

Preferentemente, el primer dominio que comprende CCP comprende al menos una, preferentemente al menos dos, más preferentemente al menos tres CCP que tienen actividad de unión por los factores del complemento C3b y/o C4b. Como se entenderá por el experto, una o más las CCP que tienen actividad de unión para los factores del complemento C3b y/o C4b pueden ser CCP diferentes de las CCP o las CCP que tienen actividad de aceleración de la disociación como se especifica anteriormente; preferentemente, la(s) CCP(s) que tiene(n) actividad de unión por los factores del complemento C3b y/o C4b son la(s) CCP(s) que tiene(n) actividad de aceleración de la disociación como se especifica anteriormente. El término "actividad de unión por los factores del complemento C3b y/o C4b" es entendido por el experto. Preferentemente, el término se refiere a la propiedad del primer dominio que comprende CCP y/o de al menos una de sus CCP para unirse a al menos una de las proteínas del complemento C3b y C4b con afinidad medible. Preferentemente, la afinidad de unión de una CCP o un dominio que comprende CCP a C3b o C4b se determina por resonancia de plasmones superficiales (SPR) como se especifica en el presente documento en los ejemplos.

El término "receptor del complemento de tipo 1" o "CR1" es, en principio, conocido por el experto en referencia con un miembro de los reguladores de la familia de proteínas de activación del complemento (RCA) que también se conoce como receptor de C3b/C4b o la proteína del grupo de diferenciación 35 (CD35). Preferentemente, CR1 es un CR1 de mamífero, más preferentemente, CR1 es CR1 humano. Lo más preferentemente, CR1 es CR1 humano que tiene una secuencia de aminoácidos como se especifica en N.° de acceso de Genbank P17927.3 GI:290457678.

El término "factor de aceleración de la disociación" o "DAF" también es conocida, en principio, por el experto en referencia con un regulador unido a la superficie celular del sistema del complemento que también se conoce como la proteína del grupo de diferenciación 35 (CD55). Preferentemente, DAF es un DAF de mamífero, más preferentemente DAF humano. Lo más preferentemente, DAF es DAF humano que tiene una secuencia de aminoácidos como se especifica en N.° de acceso de Genbank P08174.4 GI:60416353.

El término "segundo dominio que comprende CCP", como se usa en el presente documento, se refiere a un dominio de polipéptido multidominio que comprende al menos una CCP. Preferentemente, dicho segundo dominio que comprende CCP no es directamente contiguo a dicho primer dominio que comprende CCP, es decir, dicho segundo dominio que comprende CCP no está conectado con dicho primer dominio que comprende CCP por una serie contigua de enlaces peptídicos o, preferentemente, dicho primer y segundo dominio que comprende las CCP están separados por un dominio que no tiene actividad de unión ni por C3b ni por C4b. Por lo tanto, preferentemente, en caso de que el polipéptido multidominio sea un polipéptido de fusión, el primer y segundo dominio que comprende las CCP están separados preferentemente por al menos un dominio de reconocimiento de células hospedadoras. Preferentemente, el segundo dominio que comprende CCP comprende de desde dos hasta diez, preferentemente de desde dos hasta cinco, más preferentemente de desde tres hasta cuatro CCP, preferentemente que tiene o que contribuye a la actividad como se describe a continuación. Preferentemente, el segundo dominio que comprende CCP comprende las CCP 8 a 10 y/o 15 a 17 de un CR1, preferentemente de CR1 humano como se especifica en el presente documento anteriormente. Más preferentemente, el segundo dominio que comprende CCP comprende las CCP 15 a 17 de CR1, preferentemente de CR1 humano. Incluso más preferentemente, el segundo dominio que comprende CCP comprende, preferentemente consiste en, una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 70 %, preferentemente al menos el 80 %, más preferentemente al menos el 90 %, lo más preferentemente al menos el 95 % a SEQ ID NO: 3, preferentemente que tiene actividad de cofactor del factor I como se describe en el presente documento a continuación. Lo más preferentemente, el segundo dominio que comprende CCP comprende, preferentemente consiste en, una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 3.

Preferentemente, el segundo dominio que comprende CCP comprende al menos una, preferentemente al menos dos, más preferentemente al menos tres, lo más preferentemente de desde tres hasta cuatro CCP que tienen actividad de unión por los factores C3b y/o C4b del complemento, preferentemente más que tienen actividad de cofactor del factor I. El término "actividad de cofactor del factor I", como se usa en el presente documento, se refiere a la propiedad de un compuesto, preferentemente una CCP o un dominio que comprende CCP, de unión a C3b y/o C4b y que media en la degradación proteolítica de dicha C3b y/o C4b por el factor I. Preferentemente, la actividad de cofactor del factor I se determina como se indica en el presente documento en los ejemplos.

El término "dominio de reconocimiento de células hospedadoras", como se usa en el presente documento, se refiere a un dominio del polipéptido multidominio que tiene la actividad de unión a los marcadores superficiales de células hospedadoras, preferentemente hidratos de carbono polianiónicos que comprenden ácidos siálicos y/o glicosaminoglicanos, y/o que tiene actividad de unión por los productos de degradación del factor del complemento C3b, preferentemente por iC3b y/o C3dg o C3d. Preferentemente, el dominio de reconocimiento de células hospedadoras comprende al menos una, preferentemente al menos dos CCP que tienen actividad de unión por marcadores superficiales de células hospedadoras, preferentemente hidratos de carbono polianiónicos que comprenden ácidos siálicos y/o glicosaminoglicanos y/o que tienen actividad de unión por productos de degradación del factor del complemento C3b, preferentemente por iC3b y/o C3dg o C3d. Preferentemente, el dominio de reconocimiento de células hospedadoras comprende las CCP 6 a 8 y/o 19 a 20 de un factor H del complemento, preferentemente un factor H del complemento humano como se especifica en el presente documento anteriormente. Más preferentemente, el dominio de reconocimiento de células hospedadoras comprende, preferentemente consiste en, una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 70 %, preferentemente al menos el 80 %, más preferentemente al menos el 90 %, lo más preferentemente al menos el 95 % a SEQ ID NO: 4, que tiene preferentemente actividad de unión por marcadores superficiales de células hospedadoras, preferentemente hidratos de carbono polianiónicos que comprenden ácidos siálicos y/o glicosaminoglicanos y/o que tienen actividad de unión por los productos de degradación del factor del complemento C3b, preferentemente por iC3b y/o C3dg. Más preferentemente, el dominio de reconocimiento de células hospedadoras comprende, preferentemente consiste en, una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 4. Preferentemente, la actividad de unión por marcadores superficiales de células hospedadoras y actividad de unión por los productos de degradación del factor del complemento C3b de una CCP o de un dominio de reconocimiento de células hospedadoras se determina por resonancia de plasmones superficiales (SPR) como se especifica en el presente documento en los ejemplos.

Como se usa en esta memoria descriptiva, el término "polipéptido multidominio" se refiere a cualquier molécula química que comprende al menos los dominios de polipéptido que se especifican en el presente documento a continuación. Se debe entender que el enlace químico entre los dominios no necesita ser necesariamente un enlace peptídico. También se prevé por la presente invención que el enlace químico entre los dominios sea un enlace éster, un enlace disulfuro, o cualquier otro enlace químico covalente adecuado conocido por el experto. También se prevén enlaces no covalentes con una constante de disociación tan baja que un dominio solo se disociará hasta un grado despreciable de los otros dominios. Preferentemente, la constante de disociación para dicho enlace no covalente es inferior a 10­ 5 mol/l (como es el caso con la unión Strep-Tag : Strep-Tactin), inferior a 10-6 mol/l (como es el caso en la unión Strep-TagII : Strep-Tactin), inferior a 10-8 mol/l, inferior a 10-10 mol/l, o inferior a 10-12 mol/l (como es el caso para la unión estreptavidina : biotina). Los métodos de determinación de las constantes de disociación se conocen bien por el experto e incluyen, por ejemplo, métodos de valoración espectroscópica, mediciones de resonancia de plasmones superficiales, diálisis en equilibrio y similares. Además, también se prevé que la unión entre los dominios del polipéptido multidominio sea indirecta, por ejemplo, que los dominios comprendan una marca con afinidad por biotina y se unan a una molécula o partícula adicional que comprende restos de biotina. Preferentemente, el enlace químico entre los dominios es un enlace peptídico, es decir, preferentemente, el polipéptido multidominio es un polipéptido de fusión que comprende o que consiste en los dominios de la presente invención. Preferentemente, al menos dos dominios del polipéptido multidominio están conectados por un conector péptido. Los péptidos conectores adecuados son, en principio, conocidos en la técnica. Los péptidos conectores preferidos comprenden o, preferentemente, consisten en glicina y/o restos de prolina. Más preferentemente, un conector péptido es un péptido conector de poliglicina. Lo más preferentemente, un péptido conector, en particular un péptido conector que se une a un primer dominio que comprende CCP y un dominio de reconocimiento de células hospedadoras como se especifica en cualquier parte en el presente documento, es un conector que comprende, preferentemente que consiste en, 14 o 15 restos de glicina. En una realización preferida, el polipéptido consiste en los componentes que se describen en el presente documento.

Preferentemente, referencia a polipéptidos, en particular polipéptidos multidominio, y/o dominios, en particular dominios que comprenden CCP, incluye variantes de los polipéptidos y dominios específicos descritos en el presente documento. Como se usa en el presente documento, los términos "variante de polipéptido" y "variante de dominio" se refieren a cualquier molécula química que comprende al menos el dominio o dominios que se especifican en el presente documento, pero que se diferencian en la estructura de dicho polipéptido o dominio indicado. Preferentemente, una variante de polipéptido o una variante de dominio comprende un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia de aminoácidos de desde 25 hasta 500, más preferentemente de desde 30 hasta 300, lo más preferentemente de desde 35 hasta 150 aminoácidos consecutivos comprendidos en un polipéptido o dominio como se especifica en el presente documento. Además, se debe entender que una variante de polipéptido o variante de dominio como se denomina según la presente invención debe tener una secuencia de aminoácidos que se diferencia debido a al menos una sustitución, deleción y/o adición de aminoácidos, en donde la secuencia de aminoácidos de la variante es todavía, preferentemente, idéntica al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % a la secuencia de aminoácidos del polipéptido o dominio específico. El grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar por algoritmos bien conocidos en la técnica. Preferentemente, el grado de identidad se va a determinar comparando dos secuencias óptimamente alineadas a lo largo de una ventana de comparación, donde el fragmento de secuencia de aminoácidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (por ejemplo, huecos o extremos protuberantes) en comparación con la secuencia con la que se compara para un alineamiento óptimo. El porcentaje se calcula determinando, preferentemente a lo largo de la longitud completa del péptido, el número de posiciones en las que aparece el resto de aminoácido idéntico en ambas secuencias para dar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia. El alineamiento óptimo de secuencias para la comparación se puede realizar por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981), por el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y Wunsch (1970), por el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988), por implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, PASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), o por inspección visual. Dado que se han identificado dos secuencias por comparación, se emplean preferentemente GAP y BESTFIT para determinar su alineamiento óptimo y, por lo tanto, el grado de identidad. Preferentemente, se usan valores por defecto de 5,00 para el peso por hueco y 0,30 para la longitud del peso por hueco. Las variantes de polipéptido o variantes de dominio referidas anteriormente pueden derivar de variantes alélicas o cualquier otro homólogo, parálogo u ortólogo específico de especie. Además, las variantes de polipéptido referidas en el presente documento incluyen fragmentos de los polipéptidos específicos o los tipos anteriormente mencionados de variantes, en tanto que estos fragmentos y/o variantes comprendan los dominios a los que se refirió anteriormente. Dichos fragmentos pueden ser o derivar de, por ejemplo, productos de degradación o variantes de corte y empalme de los polipéptidos. Se incluyen además variantes que se diferencian debido a modificaciones postraduccionales, tales como fosforilación, glucosilación, ubiquitinilación, sumoilación o mirisilación, incluyendo aminoácidos no naturales, y/o por ser peptidomiméticos.

Como se usa en el presente documento, el término "dominio que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al menos el 70 % a X" se refiere a un dominio que comprende una variante de X como se especifica anteriormente que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica al menos el 70 % a X. Preferentemente, el dominio que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al menos el 70 % a X es una variante de X que tiene la actividad de X, más preferentemente como se especifica en el presente documento.

Por lo tanto, preferentemente, el polipéptido multidominio de la presente invención y las variantes del mismo tienen la actividad de ser un inhibidor de activación del complemento, es decir, tienen la actividad de inhibir la reacción del complemento, preferentemente in vitro y/o in vivo. Preferentemente, el polipéptido multidominio y sus variantes tienen la actividad de inhibir al menos dos, más preferentemente las tres vías de activación del sistema del complemento. Más preferentemente, el polipéptido multidominio y las variantes del mismo tienen la actividad de inhibir al menos la vía alternativa y la vía clásica de activación del complemento, preferentemente tienen la actividad de inhibir al menos la vía alternativa, la vía clásica y la vía de las lectinas de activación del complemento.

Preferentemente, el polipéptido multidominio comprende al menos dos de sus dominios, preferentemente comprende los tres de sus dominios como secuencia de polipéptidos contigua, es decir, el polipéptido multidominio es preferentemente un polipéptido de fusión que comprende dichos tres dominios. Preferentemente, en principio, los tres dominios pueden estar comprendidos en dicho polipéptido de fusión en cualquier orden considerado apropiado por el experto. Más preferentemente, el polipéptido multidominio comprende dichos dominios en el orden extremo N, primer dominio que comprende CCP, dominio de reconocimiento de células hospedadoras, segundo dominio que comprende CCP, extremo C. Incluso más preferentemente, el polipéptido multidominio comprende, preferentemente consiste en una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 5 o 6 o es una variante de la misma como se especifica en el presente documento anteriormente, en donde, preferentemente, dicha variante todavía tiene la actividad de ser un inhibidor de la activación del complemento como se especifica anteriormente.

Ventajosamente, se descubrió en el trabajo que subyace a la presente invención que los compuestos descritos en el presente documento tienen actividad inhibidora del complemento y son particularmente aptos para inhibir las tres vías de activación del complemento conocidas. Sorprendentemente, se descubrió que la constante de disociación de los compuestos de la presente invención para C3b estaba en el intervalo de 20 nM a 40 nM. Además, se descubrió que los compuestos prevenían la hemólisis inducida por la vía alternativa a una concentración de aproximadamente 75 nM a 150 nM y la hemólisis inducida por la vía clásica a una concentración inferior a 100 nM.

Las definiciones dadas anteriormente se aplican cambiando lo que haya que cambiar a lo siguiente. Las definiciones y explicaciones adicionales dadas más adelante también se aplican a todas las realizaciones descritas en esta memoria descriptiva cambiando lo que haya que cambiar.

La presente invención se refiere además a un polinucleótido según la reivindicación 10.

El término "polinucleótido", como se usa según la presente invención, se refiere a un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido multidominio que comprende los dominios que se han especificado en el presente documento anteriormente. Un polinucleótido que codifica un polipéptido multidominio que comprende los dominios mencionados anteriormente ha sido obtenido según la presente invención sintetizando un polinucleótido que codifica los dominios relevantes usando técnicas bien conocidas.

Por lo tanto, el polinucleótido, preferentemente, comprende la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 7 o 13, que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 5, y/o comprende la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 8 o 14, que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 6. Se debe entender que un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 5 o 6 también puede ser codificada debido al código genético degenerado por otros polinucleótidos.

Además, el término "polinucleótido", como se usa según la presente invención, engloba además variantes de los polinucleótidos específicos mencionados anteriormente. Las variantes de polinucleótidos comprenden preferentemente una secuencia de ácido nucleico caracterizada por que la secuencia puede derivar de las secuencias de ácido nucleico específicas mencionadas anteriormente mostradas en SEQ ID NO: 7, 8, 13 o 14 por al menos una sustitución, adición y/o deleción de nucleótido por la cual la secuencia de ácido nucleico de variante debe todavía codificar un polipéptido que comprende las actividades que se especifican anteriormente. Las variantes incluyen polinucleótidos que comprenden secuencias de ácido nucleico que son idénticas al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % a las secuencias del ácido nucleico mostradas en SEQ ID NO: 7, 8, 13 o 14. Además, también se engloban polinucleótidos que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias de aminoácidos que son idénticas al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % a las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 5 o 6. Los valores de porcentaje de identidad se calculan preferentemente a lo largo de toda la región de la secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico. Está disponible para el experto una serie de programas basados en una variedad de algoritmos para comparar diferentes secuencias. En este contexto, los algoritmos de Needleman y Wunsch o Smith y Waterman dan resultados particularmente fiables. Para llevar a cabo los alineamientos de secuencias, se van a usar el programa PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351 -360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 51989: 151 -153) o los programas Gap y BestFit (Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970)) y Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981))), que son parte del paquete informático de GCG (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)). Los valores de identidad de secuencia citados anteriormente en porcentaje (%) se van a determinar preferentemente usando el programa GAP a lo largo de la región de secuencia entera con los siguientes parámetros: Peso por hueco: 50, peso por longitud: 3, compatibilidad promedio 10,000 e incompatibilidad promedio: 0,000, que, a menos que se especifique de otro modo, siempre se deben usar como parámetros habituales para los alineamientos de secuencias. Las variantes también engloban polinucleótidos que comprenden una secuencia de ácido nucleico que es capaz de hibridarse con las secuencias del ácido nucleico específicas mencionadas anteriormente, preferentemente, en condiciones de hibridación rigurosas. Estas condiciones rigurosas son conocidas por el experto y se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1 -6.3.6. Un ejemplo preferido de condiciones de hibridación rigurosas son condiciones de hibridación en 6' cloruro sódico/citrato de sodio (= SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido de una o más etapas de lavado en 0,2' SSC, 0,1 % de SDS a 50 a 65 °C. El experto conoce que estas condiciones de hibridación se diferencian dependiendo del tipo de ácido nucleico y, por ejemplo, cuando están presentes disolventes orgánicos, con respecto a la temperatura y la concentración del tampón. Por ejemplo, en "condiciones de hibridación normales", la temperatura se diferencia dependiendo del tipo de ácido nucleico entre 42 °C y 58 °C en tampón acuoso con una concentración de 0,1 a 5 ' SSC (pH 7,2). Si está presente disolvente orgánico en el tampón mencionado anteriormente, por ejemplo 50 % de formamida, la temperatura en condiciones normales es aproximadamente 42 °C. Las condiciones de hibridación para los híbridos de ADN:ADN son preferentemente, por ejemplo, 0,1 ' SSC y 20 °C a 45 °C, preferentemente entre 30 °C y 45 °C. Las condiciones de hibridación para los híbridos de ADN:ARN son preferentemente, por ejemplo, 0,1 ' SSC y 30 °C a 55 °C, preferentemente entre 45 °C y 55 °C. Las temperaturas de hibridación mencionadas anteriormente se determinan, por ejemplo, para un ácido nucleico con aproximadamente 100 pb (= pares de bases) de longitud y un contenido G C del 50 % en ausencia de formamida. El experto conoce cómo determinar las condiciones de hibridación requeridas con referencia a libros de texto, tales como el libro de texto mencionado anteriormente, o los siguientes libros de texto: Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Hames y Higgins (Ed.) 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Ed.) 1991, "Essential Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford. Alternativamente, las variantes de polinucleótidos son obtenibles por técnicas basadas en PCR, tales como amplificación de ADN basada en cebadores de oligonucleótidos mixtos, es decir, usando cebadores degenerados contra dominios conservados de los polipéptidos de la presente invención. Los dominios conservados del polipéptido de la presente invención se pueden identificar por una comparación de secuencias de la secuencia de ácido nucleico del polinucleótido o la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la presente invención con secuencias de otras CCP. Como molde, se puede usar ADN o ADNc de animales, preferentemente mamíferos, más preferentemente seres humanos.

Un polinucleótido que comprende un fragmento de cualquiera de las secuencias del ácido nucleico mencionadas anteriormente también está englobado como un polinucleótido de la presente invención. El fragmento debe codificar un polipéptido que comprende los dominios especificados anteriormente y que, preferentemente, todavía tiene la actividad que se especifica anteriormente. Por consiguiente, el polipéptido puede comprender o consistir en los dominios de la presente invención que confieren dichas actividades biológicas. Un fragmento como se entiende en el presente documento comprende preferentemente al menos 50, al menos 100, al menos 250 o al menos 500 nucleótidos consecutivos de la secuencia de ácido nucleico mencionada anteriormente o codifica una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 20, al menos 30, al menos 50, al menos 80, al menos 100 o al menos 150 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente.

Los polinucleótidos de la presente invención o consisten en las secuencias del ácido nucleico mencionadas anteriormente o comprenden las secuencias del ácido nucleico mencionadas anteriormente. Por lo tanto, también pueden contener secuencias del ácido nucleico adicionales. Específicamente, los polinucleótidos de la presente invención pueden codificar proteínas de fusión en donde un componente de la proteína de fusión es un polipéptido multidominio que está codificado por una secuencia de ácido nucleico citada anteriormente. Dichas proteínas de fusión pueden comprender como parte adicional otros polipéptidos para monitorizar la expresión (por ejemplo, proteínas fluorescentes verdes, amarillas, azules o rojas, fosfatasa alcalina y similares) o las denominadas "marcas" que pueden servir de marcador detectable o de medida auxiliar para fines de purificación. Las marcas para los diferentes fines son bien conocidas en la técnica y comprenden marcas FLAG, marcas de 6-histidina, marcas de MYC y similares.

El polinucleótido de la presente invención se debe proporcionar preferentemente o como un polinucleótido aislado (es decir, aislado de contexto natural) o en forma genéticamente modificada. El polinucleótido es preferentemente ADN, que incluye ADNc, o es ARN. El término engloba polinucleótidos monocatenarios, así como bicatenarios. Además, también están comprendidos polinucleótidos químicamente modificados que incluyen polinucleótidos modificados que existen de forma natural, tales como polinucleótidos glicosilados o metilados o modificados artificiales, tales como polinucleótidos biotinilados.

Por lo tanto, preferentemente, el polinucleótido de la presente invención a) es un polinucleótido que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 7, 8, 13 o 14, b) codifica un polipéptido que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 5 o 6, y/o c) es un polinucleótido capaz de hibridarse en condiciones rigurosas condiciones rigurosas con SEQ ID NO: 7, 8, 13 o 14. Más preferentemente, el polinucleótido a) es un polinucleótido que comprende, preferentemente que consiste en, la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7, 8, 13 o 14, y/o b) codifica un polipéptido que comprende, preferentemente que consiste en, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o 6. Preferentemente, el polinucleótido de la presente invención codifica un polipéptido multidominio que tiene una actividad como se especifica anteriormente.

La presente invención se refiere además a un vector según la reivindicación 11.

El término "vector" engloba preferentemente vectores de fago, plásmido, virales o retrovíricos, así como cromosomas artificiales, tales como cromosomas artificiales bacterianos o de levadura. Además, el término también se refiere a construcciones de selección que permiten la integración aleatoria o dirigida al sitio de la construcción de selección en ADN genómico. Dichas construcciones diana comprenden preferentemente ADN de longitud suficiente para la recombinación homóloga o heteróloga como se describe en detalle a continuación. El vector que engloba los polinucleótidos de la presente invención comprende preferentemente además marcadores de selección para la propagación y/o selección en un hospedador. El vector se puede incorporar en una célula hospedadora por diversas técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, un vector plasmídico se puede introducir en un precipitado, tal como un precipitado de fosfato de calcio o precipitado de cloruro de rubidio, o en un complejo con un lípido cargado o en grupos basados en carbono, tales como fullerenos. Alternativamente, un vector plasmídico se puede introducir por choque térmico o técnicas de electroporación. Si el vector es un virus, se puede encapsidar in vitro usando una estirpe celular de encapsidación apropiada antes de la aplicación a células hospedadoras. Los vectores retrovíricos pueden ser competentes en la replicación o defectuosos en la replicación. En el último caso, la propagación vírica ocurrirá, en general, solo en hospedador/células complementarios.

Más preferentemente, en el vector de la invención el polinucleótido está operativamente unido a secuencias de control de la expresión que permiten la expresión en células procariotas y/o eucariotas o fracciones aisladas de las mismas. La expresión de dicho polinucleótido comprende la transcripción del polinucleótido, preferentemente en un ARNm traducible. Se conocen bien en la técnica los elementos reguladores que aseguran la expresión en células eucariotas, preferentemente células de mamífero. Comprenden preferentemente secuencias reguladoras que aseguran el inicio de la transcripción y, opcionalmente, señales de poli-A que aseguran la terminación de la transcripción y la estabilización del transcrito. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores transcripcionales, así como traduccionales. Los posibles elementos reguladores que permiten la expresión en células hospedadoras procariotas comprenden, por ejemplo, el promotor lac, trp o tac en E. coli, y ejemplos de elementos reguladores que permiten la expresión en células hospedadoras eucariotas son el promotor AOX1 o GAL1 en levadura o el promotor del CMV, SV40, RSV (virus del sarcoma de Rous), potenciador del CMV, potenciador del SV40 o un intrón de globina en células de mamífero y otras células de animales. Además, se pueden usar secuencias de control de la expresión inducibles en un vector de expresión englobadas por la presente invención. Dichos vectores inducibles pueden comprender secuencias del operador tet o lac o secuencias inducibles por choque térmico u otros factores ambientales. Se conocen bien en la técnica secuencias de control de la expresión adecuadas. Además de los elementos que son responsables del inicio de la transcripción, dichos elementos reguladores también pueden comprender señales de terminación de la transcripción, tales como el sitio de SV40-poli-A o el sitio tk-poli-A, en la dirección del polinucleótido. En este contexto, se conocen en la técnica vectores de expresión adecuados, tales como el vector de expresión de ADNc de Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pBluescript (Stratagene), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (InVitrogene) o pSPORT1 (GIBCO BRL). Preferentemente, dicho vector es un vector de expresión y un vector de transferencia o direccionamiento de genes. Se pueden usar vectores de expresión derivados de virus, tales como retrovirus, virus de la variolovacuna, virus adeno-asociado, virus del herpes o virus del papiloma bovino, para la administración de los polinucleótidos o vector de la invención en una población de células seleccionada. Los métodos que se conocen bien por los expertos en la técnica se pueden usar para construir vectores víricos recombinantes; véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994).

Preferentemente, el vector es un vector que media en la expresión del polinucleótido de la presente invención en una célula hospedadora. El experto conoce cómo seleccionar combinaciones de vectores y células hospedadoras para la propagación de un vector y/o para la expresión de una proteína codificada por el vector.

Además, la presente invención se refiere a una célula hospedadora según la reivindicación 12.

Una "célula hospedadora", como se usa en el presente documento, se refiere a una célula bacteriana, de arquea o eucariota con la capacidad de propagar el vector de la presente invención y/o de producir un polipéptido multidominio codificado en el vector o el polinucleótido de la invención. Preferentemente, la célula hospedadora es una célula bacteriana de la especie Escherichia coli, un lepidóptero, una célula de ratón, rata o humana; más preferentemente, la célula es una célula de levadura, preferentemente del género Pichia, más preferentemente una célula de Pichia pastoris. Preferentemente, la célula hospedadora es una célula cultivada in vitro. En una realización preferida adicional, la célula hospedadora es una célula in vivo, preferentemente una célula epitelial pigmentaria de la retina, una célula endotelial dentro de la vasculatura coroidea y/u otra célula dentro de la retina o la coroides.

La presente invención también se refiere a un polipéptido multidominio según la presente invención, un polinucleótido según la presente invención, o un vector según la presente invención para su uso en medicina según la reivindicación 13. Además, la presente invención también se refiere a un polipéptido multidominio según la presente invención, un polinucleótido según la presente invención, o un vector según la presente invención para tratar y/o prevenir la activación inapropiada del complemento y/o una enfermedad que tiene activación inapropiada del complemento como un síntoma según la reivindicación 13.

Como se usa en el presente documento, el término "activación inapropiada del complemento" se refiere a una activación del complemento que excede, en tiempo y/o amplitud, el nivel de activación normal del complemento en las circunstancias dadas. Por lo tanto, preferentemente, la activación inapropiada del complemento es la activación del complemento que excede, preferentemente que excede significativamente, el grado de activación del complemento de una referencia sana, preferentemente un sujeto aparentemente sano, en las circunstancias dadas. Preferentemente, la activación inapropiada del complemento es la activación del complemento que causa síntomas de enfermedad en un paciente. Los síntomas de activación inapropiada del complemento se conocen en la técnica e incluyen hemólisis, degeneración macular, inflamaciones episódicas, por ejemplo en angioedema hereditario, y similares. Preferentemente, la activación inapropiada del complemento se determina determinando la actividad del factor del complemento C3 y/o C4 en una muestra.

Como se conoce por el experto, una variedad de enfermedades está asociada y/o es causada por la activación inapropiada del complemento. Por lo tanto, preferentemente, la presente invención también se refiere a un polipéptido multidominio según la presente invención, un polinucleótido según la presente invención, o un vector según la presente invención para tratar y/o prevenir una enfermedad que tiene la activación inapropiada del complemento como un síntoma. Preferentemente, dicha enfermedad que tiene la activación inapropiada del complemento como un síntoma se selecciona de la lista que consiste en lesión por isquemia-reperfusión, rechazo del injerto mediado por anticuerpos, microangiopatía trombótica postrasplante, anemia hemolítica autoinmune, reacción transfusional hemolítica aguda y retardada, enfermedad de las aglutininas frías, artritis reumatoide, neuromielitis óptica por anticuerpos anti-acuaporina-4 positiva, deficiencia de CD59, glomerulopatía C3, síndrome hemolítico urémico atípico, hemoglobinuria paroxística nocturna y degeneración macular senil.

El término "tratar", como se usa en el presente documento, se refiere a mejorar las enfermedades o trastornos a las que se hace referencia en el presente documento o los síntomas que los acompañan, preferentemente hasta un grado significativo. Dicho tratar como se usa en el presente documento también incluye una restauración completa de la salud con respecto a las enfermedades o trastornos a los que se hace referencia en el presente documento. Se debe entender que tratar como se usa según la presente invención puede no ser eficaz en todos los sujetos que se van a tratar. Sin embargo, el término debe requerir preferentemente que una porción estadísticamente significativa de los sujetos que padecen una enfermedad o trastorno al que se hace referencia en el presente documento pueda ser tratada satisfactoriamente. Si una porción es estadísticamente significativa, se puede determinar sin más por el experto en la técnica usando diversas herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, la determinación de intervalos de confianza, determinación de valores de p, prueba de la t de Student, prueba de Mann-Whitney etc. Los intervalos de confianza preferidos son al menos del 90 %, al menos del 95 %, al menos del 97 %, al menos del 98 % o al menos del 99 %. Los valores de p son, preferentemente, 0,1, 0,05, 0,01,0,005 o 0,0001. Preferentemente, el tratamiento debe ser eficaz para al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, o al menos el 90 % de los sujetos de la cohorte o población dada.

El término "prevenir", como se usa en el presente documento, se refiere a retener la salud con respecto a las enfermedades o trastornos a los que se hace referencia en el presente documento durante un cierto periodo de tiempo en un sujeto. Se entenderá que dicho periodo de tiempo depende de la cantidad del compuesto de fármaco que se ha administrado y factores individuales del sujeto tratado en cualquier parte en esta memoria descriptiva. También se debe entender que la prevención puede no ser eficaz en todos los sujetos tratados con el compuesto según la presente invención. Sin embargo, el término requiere preferentemente que se prevenga eficazmente que una porción estadísticamente significativa de los sujetos de una cohorte o población padezca una enfermedad o trastorno al que se hace referencia en el presente documento o sus síntomas concomitantes. Preferentemente, en este contexto se prevé una cohorte o población de sujetos que normalmente, es decir, sin medida preventiva según la presente invención, desarrollaría una enfermedad o trastorno al que se hace referencia en el presente documento. Si una porción es estadísticamente significativa, puede ser determinada sin más por el experto en la técnica usando diversas herramientas de evaluación estadística bien conocidas tratadas en cualquier parte en esta memoria descriptiva.

La presente invención también se refiere a un polipéptido multidominio según la presente invención, un polinucleótido según la presente invención, o un vector según la presente invención para su uso en el tratamiento y/o la prevención de activación inapropiada del complemento y/o una enfermedad que tiene activación inapropiada del complemento como un síntoma en combinación con un polipéptido que inhibe la proteína del complemento C5, en donde el polipéptido que inhibe la proteína del complemento C5 es un anticuerpo, preferentemente un anticuerpo monoclonal, más preferentemente eculizumab, o es coversin, según la reivindicación 14.

La presente divulgación se refiere además a un polipéptido que inhibe la proteína del complemento C5, preferentemente eculizumab, o rEV576 (coversin), para tratar y/o prevenir la activación inapropiada del complemento y/o una enfermedad que tiene activación inapropiada del complemento como un síntoma en combinación con un polipéptido multidominio según la presente invención, un polinucleótido según la presente invención, o un vector según la presente invención.

El experto entiende que el término "proteína del complemento C5" se refiere a la proteína que se escinde dando las proteínas del complemento C5a y C5b después de la activación de la vía del complemento. Correspondientemente, un "polipéptido que inhibe la proteína del complemento C5" es un polipéptido, preferentemente un anticuerpo, más preferentemente un anticuerpo monoclonal, que reconoce específicamente y que inhibe la proteína del complemento C5. Preferentemente, el polipéptido que inhibe la proteína del complemento C5 es un anticuerpo que se une específicamente a C5 y que inhibe la activación final; más preferentemente, el polipéptido que inhibe la proteína del complemento C5 es eculizumab (CAS NO: 219685-50-4). También preferentemente, el polipéptido que inhibe la proteína del complemento C5 es rEV576 (coversin).

La presente divulgación se refiere además a una preparación combinada para el uso simultáneo, separado o secuencial que comprende (i) un polipéptido multidominio según la presente divulgación y (ii) un polipéptido que inhibe la proteína del complemento C5, preferentemente eculizumab, o rEV576 (coversin).

El término "preparación combinada", como se hace referencia en la presente solicitud, se refiere a una preparación que comprende los compuestos farmacéuticamente activos de la presente divulgación en una preparación. Preferentemente, la preparación combinada está comprendida en un envase, es decir, preferentemente, dicho envase comprende todos los compuestos farmacéuticamente activos. Preferentemente, dicho envase comprende los compuestos farmacéuticamente activos como formulaciones separadas, es decir, preferentemente, una formulación del polipéptido multidominio y una formulación del polipéptido que inhibe la proteína del complemento C5. Como se entenderá por el experto, el término "formulación" se refiere a una mezcla de compuestos, preferentemente farmacéuticamente aceptables, que comprende o que consiste en al menos un compuesto farmacéuticamente activo. Preferentemente, la preparación combinada comprende un polipéptido que inhibe la proteína del complemento C5 y un polipéptido multidominio en una única forma farmacéutica sólida, por ejemplo un comprimido, en donde, más preferentemente, un compuesto está comprendido en una formulación de liberación inmediata o rápida, y el segundo compuesto está comprendido en una formulación de liberación lenta o retardada; más preferentemente, los compuestos están comprendidos en dos formulaciones separadas, preferentemente líquidas; dichas formulaciones líquidas separadas son preferentemente para inyección, preferentemente en diferentes partes del cuerpo de un sujeto.

Preferentemente, la preparación combinada es para administración separada o para combinada. "Administración separada", como se usa en el presente documento, se refiere a una administración en donde al menos dos de los compuestos farmacéuticamente activos se administran por diferentes vías y/o en diferentes partes del cuerpo de un sujeto. Por ejemplo, un compuesto se puede administrar por administración enteral (por ejemplo, por vía oral), mientras que un segundo compuesto se administra por administración parenteral (por ejemplo, por vía intravenosa). Preferentemente, la preparación combinada para administración separada comprende al menos dos preparaciones físicamente separadas para administración separada, en donde cada una preparación contiene al menos un compuesto farmacéuticamente activo; dicha alternativa se prefiere, por ejemplo, en casos en los que los compuestos farmacéuticamente activos de la preparación combinada se tengan que administrar por vías diferentes, por ejemplo por vía parenteral y por vía oral, debido a sus propiedades químicas o fisiológicas. En cambio, "administración combinada" se refiere a una administración en donde los compuestos farmacéuticamente activos se administran por la misma vía, por ejemplo por vía oral o, preferentemente, por vía intravenosa.

También preferentemente, la preparación combinada es para administración simultánea o secuencial. "Administración simultánea", como se usa en el presente documento, se refiere a una administración en donde los compuestos farmacéuticamente activos se administran al mismo tiempo, es decir, preferentemente, la administración de los compuestos farmacéuticamente activos empieza en un intervalo de tiempo inferior a 15 minutos, más preferentemente, en un intervalo de tiempo inferior a 5 minutos. Lo más preferentemente, la administración de los compuestos farmacéuticamente activos empieza al mismo tiempo, por ejemplo, tragando un comprimido que comprende los compuestos farmacéuticamente activos, o tragando un comprimido que comprende uno de los compuestos farmacéuticamente activos e inyección simultánea del segundo compuesto, o poniendo una inyección intravenosa de una disolución que comprende un compuesto farmacéuticamente activo e inyectando el segundo compuesto en una parte del cuerpo diferente. En cambio, "administración secuencial", como se usa en el presente documento, se refiere a una administración que causa concentraciones plasmáticas de los compuestos farmacéuticamente activos en un sujeto que permite el efecto sinérgico de la presente divulgación, pero que, preferentemente, no es una administración simultánea como se especifica en el presente documento anteriormente. Preferentemente, la administración secuencia! es una administración en donde la administración de los compuestos farmacéuticamente activos, preferentemente todos los compuestos farmacéuticamente activos, empieza en un intervalo de tiempo de 1 o 2 días, más preferentemente en un intervalo de tiempo de 12 horas, todavía más preferentemente en un intervalo de tiempo de 4 horas, incluso más preferentemente en un intervalo de tiempo de una hora, lo más preferentemente en un intervalo de tiempo de 5 minutos.

Preferentemente, la preparación combinada es una preparación combinada farmacéuticamente compatible. Los términos "preparación farmacéuticamente compatible" y "composición farmacéutica", como se usan en el presente documento, se refieren a composiciones que comprenden los compuestos y opcionalmente uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Los compuestos se pueden formular como sales farmacéuticamente aceptables. Las sales aceptables preferidas son acetato, éster metílico, HCl, sulfato, cloruro y similares. Las composiciones farmacéuticas se administran, preferentemente, por vía tópica o, más preferentemente, por vía sistémica. Las vías de administración convencionalmente adecuadas usadas para la administración de fármacos son administración oral, intravenosa, subcutánea o parenteral, así como inhalación. Sin embargo, dependiendo de la naturaleza y el modo de acción de un compuesto, las composiciones farmacéuticas también se pueden administrar por otras vías. Además, los compuestos se pueden administrar en combinación con otros fármacos, ya sea en una composición farmacéutica común, o como composiciones farmacéuticas separadas, como se especifica en cualquier parte en el presente documento, en donde dichas composiciones farmacéuticas separadas se pueden proporcionar en forma de un kit de partes. Preferentemente, la preparación combinada es una preparación de liberación prolongada con respecto a uno o más de los compuestos.

Los compuestos se administran preferentemente en formas farmacéuticas convencionales preparadas combinando los fármacos con vehículos farmacéuticos habituales según procedimientos convencionales. Estos procedimientos pueden implicar la mezcla, la granulación y la compresión o la disolución de los componentes según convenga para la preparación deseada. Se apreciará que la forma y el carácter del vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable viene impuesto por la cantidad de principio activo con la que se va a combinar, la vía de administración y otras variables bien conocidas.

El (Los) vehículo(s) debe(n) ser aceptable(s) en el sentido de ser compatibles con los otros componentes de la formulación y no ser perjudiciales para el receptor de la misma. El vehículo farmacéutico empleado puede ser, por ejemplo, un sólido, un gel o un líquido. A modo de ejemplo de vehículos sólidos son lactosa, terra alba, sacarosa, talco, gelatina, agar, pectina, goma arábiga, estearato de magnesio, ácido esteárico y similares. Los vehículos líquidos a modo de ejemplo son solución salina tamponada con fosfato, jarabe, aceite, tal como aceite de cacahuete y aceite de oliva, agua, emulsiones, diversos tipos de agentes humectantes, disoluciones estériles y similares. Similarmente, el vehículo o diluyente puede incluir material de retardo del tiempo bien conocido en la técnica, tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, solo o con una cera. Dichos vehículos adecuados comprenden los mencionadas anteriormente y otros bien conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsilvania.

El (Los) diluyente(s) se selecciona(n) de manera que no afecten la actividad biológica del compuesto o compuestos. Los ejemplos de dichos diluyentes son agua destilada, solución salina fisiológica, disolución de Ringers, disolución de dextrosa y disolución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica también puede incluir otros vehículos, adyuvantes o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos, secuestrantes de oxígeno reactivo y similares.

Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a una cantidad de los compuestos que se van a usar en una composición farmacéutica que previene, mejora o trata los síntomas que acompañan a una enfermedad o afección a la que se hace referencia en esta memoria descriptiva. La eficacia terapéutica y la toxicidad de dichos compuestos se pueden determinar por procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población) y la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población). La relación de dosis entre efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico, y se puede expresar como la relación, DL50/DE50.

La pauta posológica será determinada por el médico adjunto y otros factores clínicos; preferentemente según uno cualquiera de los métodos descritos anteriormente. Como se conoce bien en las ciencias médicas, la dosis para cualquier paciente depende de muchos factores, que incluyen el tamaño del paciente, el área superficial del cuerpo, la edad, el compuesto particular a administrar, el sexo, el momento y la vía de administración, la salud general y otros fármacos que se administran simultáneamente. El progreso se puede monitorizar por evaluación periódica. Una dosis típica puede estar, por ejemplo, en el intervalo de desde 1 hasta 1500 mg; sin embargo, se prevén dosis por debajo de o por encima de este intervalo a modo de ejemplo, especialmente considerando los factores anteriormente mencionados. En general, el régimen como administración regular de la composición farmacéutica debe estar en el intervalo de unidades de 100 pg a 100 mg por día. Si el régimen es una infusión continua, debe también estar en el intervalo de unidades de 100 pg a 100 mg por kilogramo de peso corporal por minuto, respectivamente. Preferentemente, las preparaciones de liberación prolongada de cada fármaco se inyectan de una vez por 1 semana a una vez cada 2 meses o incluso en intervalos más largos. El progreso se puede monitorizar por evaluación periódica. Las dosis y las concentraciones preferidas de los compuestos se especifican en cualquier parte en el presente documento.

Por medio de ejemplo, una concentración plasmática del polipéptido multidominio no es preferentemente inferior a 25 nM, más preferentemente no es inferior a 50 nM. También preferentemente, una concentración plasmática del polipéptido multidominio está en el intervalo de desde 20 nM hasta 20 pM, más preferentemente de desde 50 nM hasta 5 pM. Se conocen en la técnica las concentraciones eficaces de un polipéptido que inhibe la proteína del complemento C5, en particular eculizumab. Debido al efecto sinérgico de los polipéptidos multidominio de la presente divulgación, las concentraciones eficaces para un polipéptido que inhibe la proteína del complemento C5 en tratamiento combinado pueden ser más bajas.

Las composiciones y las formulaciones farmacéuticas referidas en el presente documento se administran preferentemente al menos una vez, por ejemplo en caso de formulaciones de liberación prolongada, para tratar o mejorar o prevenir una enfermedad o afección citada en esta memoria descriptiva. Sin embargo, dichas composiciones farmacéuticas se pueden administrar más de una vez, por ejemplo desde una hasta cuatro veces al día hasta un número no limitado de días. También se pueden aplicar algunos compuestos con un corto tiempo de eliminación como infusión en la corriente sanguínea para proporcionar una dosis eficaz en todo el cuerpo durante un largo tiempo de tratamiento.

Las composiciones farmacéuticas específicas se preparan de un modo bien conocido en el técnica farmacéutica y comprenden al menos un compuesto activo al que se ha hecho referencia en el presente documento anteriormente en mezcla o de otro modo asociado con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Para la preparación de composiciones farmacéuticas específicas, el (los) compuesto(s) activo(s) se mezclará(n) normalmente con un vehículo o diluyente, o se encerrará(n) o encapsulará(n) en una cápsula, sobre, sello, papel u otros envases o vehículos adecuados. Las formulaciones resultantes deben adoptar el modo de administración, es decir, las formas de comprimidos, cápsulas, supositorios, disoluciones, suspensiones o similares. Las recomendaciones de dosis se deben indicar en las instrucciones de los médicos prescriptores o de usuario para prever ajustes de dosis dependiendo del receptor considerado.

La presente divulgación también se refiere a un medicamento que comprende (i) un polipéptido multidominio, (ii) un polipéptido que inhibe la proteína del complemento C5, y (iii) al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable; y dicho medicamento para su uso en el tratamiento y/o la prevención como se especifica anteriormente.

El término "medicamento" es entendido por el experto. Como se entenderá, las definiciones dadas anteriormente en el presente documento para el término "preparación combinada" se aplican preferentemente al término medicamento, cambiando lo que haya que cambiar.

Además, la presente divulgación se refiere a un método de tratamiento y/o prevención de la activación inapropiada del complemento y/o una enfermedad que tiene activación inapropiada del complemento como síntoma en un sujeto que comprende

administrar una dosis eficaz de un polipéptido multidominio según la presente divulgación, un polinucleótido según la presente divulgación o un vector según la presente divulgación a dicho sujeto,

tratándose y/o previniéndose así la activación inapropiada del complemento y/o una enfermedad que tiene activación inapropiada del complemento como un síntoma en dicho sujeto.

El método de tratamiento y/o prevención es preferentemente un método in vivo. Además, puede comprender etapas, además de las explícitamente mencionadas anteriormente. Por ejemplo, las etapas adicionales se pueden relacionar, por ejemplo, con el diagnóstico de la activación inapropiada del complemento y/o una enfermedad que tiene activación inapropiada del complemento como un síntoma, o la administración de compuestos adicionales, por ejemplo un polipéptido que inhibe la proteína del complemento C5. Además, se puede realizar una o más de dichas etapas por equipo automatizado.

El término "sujeto", como se usa en el presente documento, se refiere a un animal que tiene un sistema del complemento, preferentemente a un mamífero. Más preferentemente, el sujeto es ganado vacuno, un cerdo, ovejas, caballo, gato, perro, ratón o rata, lo más preferentemente un humano.

Además, la presente divulgación se refiere a un método in vitro de prevención o reducción del grado de activación del complemento que comprende

aplicar un polipéptido multidominio según la presente divulgación, un polinucleótido según la presente divulgación, o un vector según la presente divulgación, a una mezcla de reacción que comprende factores del complemento,

previniéndose o reduciéndose así el grado de activación del complemento en dicha mezcla de reacción.

El método in vitro de prevención o reducción del grado de activación del complemento puede comprender etapas, además de las mencionadas explícitamente anteriormente. Por ejemplo, las etapas adicionales se pueden relacionar, por ejemplo, con la introducción del polinucleótido o el vector de la presente divulgación en una célula hospedadora, o la determinación del grado de activación del complemento en dicha mezcla de reacción. Además, una o más de dichas etapas puede ser realizada por equipo automatizado.

Además, la presente divulgación se refiere a un uso de un polipéptido multidominio según la presente divulgación, un polinucleótido según la presente divulgación, o un vector según la presente divulgación, para tratar y/o prevenir la activación inapropiada del complemento y/o una enfermedad que tiene activación inapropiada del complemento como un síntoma; y a un uso de un polipéptido multidominio según la presente divulgación, un polinucleótido según la presente divulgación, o un vector según la presente divulgación, para la fabricación de un medicamento para tratar y/o prevenir la activación inapropiada del complemento y/o una enfermedad que tiene activación inapropiada del complemento como un síntoma.

Leyendas de las figuras

Fig. 1: Representación esquemática de las construcciones usadas.

Fig. 2: Inhibición de la hemólisis mediada por la vía alternativa por construcciones derivadas de CR1 (A) y DAF (B). Eje x: concentración de inhibidor (construcción), eje y: hemólisis en %.

Fig. 3: Inhibición de la hemólisis mediada por la vía clásica por construcciones derivadas de CR1 (A) y DAF (B) en 5 % de suero. (C) como en (B), pero en 75 % de suero. Eje x: concentración de inhibidor (construcción), eje y: hemólisis en %.

Fig. 4: Inhibición de la hemólisis mediada por la vía alternativa de PNH-RBC por construcciones derivadas de CR1 (A) y DAF (B). Eje x: concentración de inhibidor (construcción), eje y: hemólisis en %.

Fig. 5: Inhibición de la hemólisis mediada por la vía clásica por combinaciones de inhibidores. Eje x: inhibidor (construcción): a NHS; b NHS eculizumab (1,2 gM); c suero reducido en FB; d NHS miniFH (=FH(1-4)FH(19-20), 2,5 gM); e NHS mini FH (2,5 gM) eculizumab (1,2 gM); f NHS triple I. (=DAF(1-4)FH(19-20)CR1(15-17), 0,17 gM); g NHS triple-I. (0,17 gM) eculizumab (1,2 gM); h NHS CR1(1-3) (7,3 gM); i NHS CR1(1-3) (7,3 gM) eculizumab (1,2 gM), eje y: lisis de RBC III de pNH en %.

Ejemplo 1: Construcciones

Nomenclatura usada: El CR1 usado en los ejemplos fue CR1 humano; FH se refiere a factor H del complemento humano y DAF se refiere a factor de aceleración de la disociación humano. Los números que siguen a las abreviaturas de los nombres de proteínas se refieren a los números de las CCP dentro de la proteína usada, por ejemplo FH(19-20) se refiere a las CCP 19 y 20 del factor H.

Se usaron las siguientes construcciones (Fig. 1): "DAF(1 -4)FH(19-20) conector largo" (SEQ ID NO: 11, codificado por SEQ ID NO: 16), que comprende un conector de oligo-gly entre DAF(1-4) y FH(19-20) (Fig. 1 A); y "DAF(1-4)FH(19-20) conector corto" (SEQ ID NO: 12, codificado por SEQ ID NO: 15), en la que dA f (1-4) y FH(19-20) están conectados directamente, es decir, sin conector. Las construcciones CR1 (1 -3)FH(19-20) conector largo (SEQ ID NO:9, codificado por SEQ ID NO: 18) y conector corto (SEQ ID NO: 10, codificada por ^s E^q ID NO: 17) (Fig. 1B) se construyeron análogamente. Además, también se usaron DAF(1-4) (DAF soluble, "sDAF", SEQ ID NO: 2), CR1(1-3) (SEQ ID NO: 1), CR1(15-17) (SEQ ID NO: 3).

Los ADN codificantes para las proteínas multidominio "CR1 (1-3)FH(19-20)CR1 (15-17)" y "DAF(1-4)FH(19-20)CR1 (15­ 17)" se pidieron (de Geneart) para estar optimizadas en los codones para la expresión de Pichia pastoris, se sintetizaron y se subclonaron en el vector de expresión de Pichia pastoris pPICZaB. CR1(1-3)FH(19-20)CR1(15-17) se codificó por SEQ ID NO: 13; sin embargo, un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 5) también se puede codificar por un polinucleótido que comprende SEQ ID NO: 7. Por tanto, DAF(1-4)FH(19-20)CR1 (15-17) fue codificado por SEQ ID NO: 14; sin embargo, un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) también se puede codificar por un polinucleótido que comprende SEQ ID NO: 8. Los casetes de expresión para todas las otras construcciones se prepararon en el mismo fondo de vector.

Las proteínas respectivas se produjeron en exceso en P. pastoris y se purificaron por métodos convencionales.

Ejemplo 2: Afinidad por la proteína del complemento C3b

Se usó un ensayo basado en resonancia de plasmones superficiales (SPR) (Schmidt et al. (2013), Journal of Immunology 190: 5712-5721) para determinar la afinidad de los inhibidores del complemento manipulados para la proteína del complemento C3b clave. Se acoplaron 1940 unidades de respuesta (gRU) de C3b al chip. Las muestras se realizaron a 25 gl/min en una serie de concentración con la mayor y la menor concentraciones que se ensayaron por duplicado para la reproducibilidad de sondas. Para conseguir una estimación del valor de KD para otras proteínas, se ajustó el gráfico de respuesta (durante el estado estacionario) contra la concentración ensayada con un modelo 1:1 de afinidad en estado estacionario. Los valores de KD medidos para CR1(15-17), DAF(1-4) y FH(19-20) fueron K^d = 0,95 gM, K^d = 11,5 gM y K^d = 4,67 gM, respectivamente, y estuvieron en buena concordancia con la bibliografía. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1

Ejemplo 3: Ensayo de actividad de aceleración de la disociación

Para medir la actividad de aceleración de la disociación (DAA), también se empleó un ensayo basado en SPR establecido (Schmidt et al. (2013), arriba). Se acoplaron 3653 pUR de C3b a la superficie del chip. Haciendo circular una mezcla de las proteínas purificadas factor B y factor D (CompTech, EE. UU.) sobre la superficie del chip, el factor B se une a C3b, por lo que se permite que el factor D se escinda y active el factor B. Esto da como resultado la formación de la convertasa de AP C3bBb sobre el chip. La convertasa C3 bimolecular se disocia intrínsecamente a una baja tasa, pero tras la exposición a un regulador con DAA, la disociación se acelera espectacularmente. Esta configuración se empleó para probar cómo de eficientemente pueden disociarse las diferentes proteínas de fusión C3bBb. CR1(15-17) se realizó como control, ya que no presenta DAA, sino solo actividad de cofactor.

Ejemplo 4: Ensayo de cofactor

Para verificar que las construcciones que contienen CR1(15-17) tienen actividad de cofactor (CA), se realizó un ensayo de CA con los cuatro analitos: CR1 (15-17), CR1 (1 -3)FH(19-20)CR1 (15-17), DAF(1 -4)FH(19-20)CR1 (15-17) y DAF(1 -4)FH(19-20)-SL, que se incluyó como control negativo. C3b solo se usó como control negativo.

C3b consiste en dos cadenas: la cadena a y la cadena p. En presencia de un cofactor, el factor I inactiva C3b proteolíticamente dando iC3b (o C3dg) por escisión de ciertos enlaces peptídicos dentro de la cadena a' de C3b. Esta actividad/proceso puede ser fácilmente monitorizado por análisis de SDS-PAGE: La cadena a' grande de 113 kDa se escinde dos veces dando tres bandas: las bandas C3a'-68, -46 y-43. La cadena p permanece sin cortar. Como era de esperar, los controles negativos no produjeron la escisión de la cadena a', pero todos los fragmentos que contienen CR1 (15-17) presentaron CA.

Ejemplo 5: Ensayo de protección específico de la vía alternativa (AP) de eritrocitos de conejo

Para determinar la capacidad de que reguladores del complemento manipulados inhiban específicamente la vía de activación de AP, se realizó un ensayo de hemólisis de eritrocitos (RBC) de conejo. Para este fin, se incubaron RBC de conejo en 25 % de suero humano que se había mezclado con inhibidores y los dos siguientes reactivos: para quelar específicamente iones de calcio y así bloquear cualquier actividad de la vía clásica (CP), se añadió EGTA. Se añadieron iones magnesio para promover la actividad de AP, puesto que las convertasas de AP dependen de la presencia de cantidades suficientes de iones Mg. Los eritrocitos de conejo son activadores conocidos de la AP en suero humano y son un buen sistema de molde para sondar la actividad de AP. La deposición inicial de C3(H2Ü) y C3b sobre los RBC de conejo se propaga rápidamente por el bucle de amplificación de AP que conduce a la deposición de enormes cantidades de C3b y la formación de MAC y la lisis celular. A diferencia de los RBC humanos, los eritrocitos de conejo carecen de proteínas reguladoras que pueden regular el sistema del complemento presente en el suero humano. Como consecuencia, los RBC de conejo son lisados y el nivel de lisis se puede determinar midiendo la liberación de hemoglobina (espectrofotométricamente). Añadiendo las proteínas reguladoras del complemento se logra la inhibición de AP (por DAA y CA), que previene la deposición de C3b y en consecuencia también la formación y la lisis de MAC. Los resultados se muestran en la Fig. 2. y en la Tabla 2.

Tabla 2

Ejemplo 4: Ensayo de protección específico de la vía clásica (CP) de eritrocitos de oveja sensibilizados

Para determinar la capacidad de que los reguladores del complemento manipulados inhiban el CP del sistema del complemento, se realizó un ensayo de hemólisis con RBC de oveja. Los RBC de oveja no son lisados fácilmente en suero humano debido a que los restos de ácido siálico sobre su superficie reclutan FH humano y los protegen de la lisis por el AP. Esta situación es explotada y los RBC de oveja se pueden usar para sondar el CP de activación del complemento. Se sensibilizan eritrocitos de oveja con un anticuerpo contra su superficie antes de ser expuestos a 5 % de suero humano. La adición de iones magnesio y calcio garantiza la eficiente funcionalidad de CP, que se activa cuando los anticuerpos sobre la superficie de los eritrocitos son detectados por el complejo C1. La activación conduce a la formación de convertasas C3, la deposición de cade vez más moléculas de C3b y al final la formación de MAC y la lisis de células. Puesto que los RBC de oveja tienen moléculas de ácido siálico negativamente cargadas sobre su superficie, esto significa que pueden ser parcialmente seleccionadas por FH(19-20). Se probaron las proteínas reguladoras manipuladas en este ensayo para sondar su capacidad para inhibir la vía de activación de CP. Los resultados se muestran en la Fig. 3 y la Tabla 3.

Tabla 3

Ejemplo 5: Modelo ex ^vivo clínicamente relevante de lisis mediada por AP de eritrocitos de hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH)

Se usaron para este ensayo eritrocitos de PNH de un paciente con PNH con tratamiento con eculizumab. Se usó suero compatible con ABO para el ensayo. Se usaron RBC compatibles con ABO de una persona sana como control. Se realizaron dos experimentos independientes, siendo los puntos de datos ensayados por duplicado. Se determinó la lisis de eritrocitos de PNH midiendo la liberación de hemoglobina a una absorbancia de 405 nm. Para controlar que solo/principalmente se lisaran los RBC de PNH en las condiciones ensayadas, se midieron las proporciones de células sanas (células de PNH de tipo I), células de tipo II y tipo III de PNH (por análisis de FACS) en una muestra de control en PBS en ausencia de suero (no ocurre la lisis) y para una muestra que contenía suero sin la adición de un inhibidor manipulado, que estableció arbitrariamente el valor del 100 % para la lisis de células de PNH. Si la proporción de células II y III de PNH disminuye durante la incubación del suero, es indicativo de que efectivamente se han lisado las células II y III de PNH vulnerables y se contribuyó a la liberación de hemoglobina (y no las células de tipo I de PNH sanas). Esto ocurrió efectivamente, lo que demuestra que la medición de la absorbancia a 405 nm se correlaciona efectivamente con la lisis de células III de PNH. Los resultados se muestran en la Fig. 4 y la Tabla 4.

Tabla 4

Ejemplo 6:

Cuando los eritrocitos de PNH se sensibilizaron con aloanticuerpos contra antígenos de grupo sanguíneo presentes en los eritrocitos de PNH, los eritrocitos de PNH sensibilizados se lisaron rápidamente en un modo dependiente del complemento a través de la actividad de CP, que dependió de la presencia de los aloanticuerpos. Incluso la presencia de eculizumab no previno la hemólisis en esta condición exigente con aloanticuerpo. Los eritrocitos de PNH se usaron en este ensayo de CP para tener una célula humana (en lugar de eritrocitos de oveja) para el experimento que son sensibles al complemento. También se podrían haber usado eritrocitos sanos, pero la lectura experimental (es decir,

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido multidominio que comprende

(i) un primer dominio de repetición de proteína de control del complemento (CCP) que es un dominio de aceleración de la disociación de convertasa para convertasas de las vías clásicas y alternativas de activación del complemento,

(ii) un dominio de reconocimiento de células hospedadoras, y

(iii) un segundo dominio que comprende CCP,

en donde dicho dominio de reconocimiento de células hospedadoras comprende las CCP 6 a 8 y/o 19 a 20 de un factor H del complemento.

2. El polipéptido multidominio de la reivindicación 1, en donde dicho primer dominio que comprende CCP comprende las CCP 1 a 3 de un receptor del complemento de tipo 1 (CR1), preferentemente de CR1 humano; y/o comprende las CCP 1 a 4 de un factor de aceleración de la disociación (DAF), preferentemente DAF humano, preferentemente en donde dicho primer dominio que comprende CCP comprende, preferentemente consiste en, una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 70 % a SEQ ID NO: 1 o comprende, preferentemente consiste en, una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 70 % a SEQ ID NO: 2.

3. El polipéptido multidominio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde dicho segundo dominio que comprende CCP comprende las CCP 8 a 10 y/o 15 a 17 de CR1, preferentemente de CR1 humano, preferentemente en donde dicho segundo dominio que comprende CCP comprende, preferentemente consiste en, una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 70 % a SEQ ID NO: 3.

4. El polipéptido multidominio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho dominio de reconocimiento de células hospedadoras comprende las CCP 6 a 8 y/o 19 a 20 de un factor H del complemento humano, preferentemente en donde dicho dominio de reconocimiento de células hospedadoras comprende, preferentemente consiste en, una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 70 % a SEQ ID NO: 4.

5. El polipéptido multidominio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho polipéptido multidominio comprende dichos dominios en el orden extremo N, primer dominio que comprende CCP, dominio de reconocimiento de células hospedadoras, segundo dominio que comprende CCP, extremo C.

6. El polipéptido multidominio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho polipéptido multidominio comprende, preferentemente consiste en, una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 5 o 6 o una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 70 % a SEQ ID NO: 5 o 6.

7. El polipéptido multidominio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho primer dominio que comprende CCP comprende al menos una, preferentemente al menos dos, más preferentemente al menos tres CCP que tienen actividad de unión por los factores del complemento C3b y C4b; y/o en donde dicho segundo dominio que comprende CCP comprende al menos una, preferentemente al menos dos, más preferentemente al menos tres CCP que tienen actividad de unión por los factores del complemento C3b y/o C4b, preferentemente que tiene además actividad de cofactor del factor I.

8. El polipéptido multidominio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho dominio de reconocimiento de células hospedadoras comprende al menos una, preferentemente al menos dos CCP, que tienen actividad de unión a los productos de degradación del factor del complemento C3b, preferentemente a iC3b y/o C3dg; y/o que tiene actividad de unión a marcadores superficiales de células hospedadoras, preferentemente hidratos de carbono polianiónicos que comprenden ácidos siálicos y/o glicosaminoglicanos.

9. El polipéptido multidominio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho polipéptido multidominio tiene la actividad para inhibir al menos dos, preferentemente, más preferentemente las tres vías de activación del sistema del complemento.

10. Un polinucleótido que codifica un polipéptido multidominio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 10.

12. Una célula hospedadora que comprende el polinucleótido de la reivindicación 10 y/o el vector de la reivindicación 11.

13. Un polipéptido multidominio según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, un polinucleótido según la reivindicación 10, o un vector según la reivindicación 11 para su uso en medicina o para tratar y/o prevenir la activación inapropiada del complemento y/o una enfermedad que tiene activación inapropiada del complemento como un síntoma.

14. Un polipéptido multidominio según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, un polinucleótido según la reivindicación 10, o un vector según la reivindicación 11 para su uso en el tratamiento y/o la prevención de una activación inapropiada del complemento y/o una enfermedad que tiene activación inapropiada del complemento como un síntoma en combinación con un polipéptido que inhibe la proteína del complemento C5, en donde el polipéptido que inhibe la proteína del complemento C5 es un anticuerpo, preferentemente un anticuerpo monoclonal, más preferentemente eculizumab, o es coversin.