CN113365648A - 补体抑制因子及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多模件多肽,其包含(i)Fc受体结合模件;(ii)第一补体调节蛋白重复序列(CCP)模件;和(iii)第二CCP模件,其结合至至少一个宿主细胞表面标志物、结合至补体因子C3b、结合至补体因子C4b、结合至补体因子C3b的降解产物和/或结合至补体因子C4b的降解产物;其中所述第二CCP模件是所述Fc受体结合模件和所述第一CCP模件的C末端。本发明还涉及编码所述多模件多肽的多核苷酸,并且涉及所述多模件多肽,其用于医疗,特别是用于治疗和/或预防不适当的补体激活和/或以不适当的补体激活作为症状的疾病。而且,本发明涉及一种用于预防或降低补体激活程度的体外方法,该方法包括将多模件多肽应用于包含补体因子的反应混合物、组织和/或器官,从而预防或降低在所述反应混合物、组织和/或器官中补体激活的程度。
Description
本发明涉及多模件多肽,其包含(i)Fc受体结合模件;(ii)第一补体调节蛋白重复序列(CCP)模件;和(iii)第二CCP模件,其结合至至少一个宿主细胞表面标志物、结合至补体因子C3b、结合至补体因子C4b、结合至补体因子C3b的降解产物和/或结合至补体因子C4b的降解产物;其中所述第二CCP模件是所述Fc受体结合模件和所述第一CCP模件的C末端。本发明还涉及编码所述多模件多肽的多核苷酸,并且涉及所述多模件多肽用于医疗,特别是用于治疗和/或预防不适当的补体激活和/或以不适当的补体激活作为症状的疾病。而且,本发明涉及一种用于预防或降低补体激活程度的体外方法,该方法包括将多模件多肽应用于包含补体因子的反应混合物、组织和/或器官,从而预防或降低在所述反应混合物、组织和/或器官中补体激活的程度。
免疫系统可分为两个分支:系统发育较早的先天免疫和适应性免疫应答。适应性或获得性免疫系统产生的免疫应答通常比先天免疫应答更具特异性。适应性免疫系统的其他特征是免疫记忆的发展以及通常观察到的抗原暴露和最大免疫应答之间的延迟。
即使在原始生物中,先天免疫系统也是高度保守的。该分支的细胞效应子主要包括中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞,而可溶性先天免疫效应子主要由补体系统和其他效应子如急性期蛋白或成孔肽组成(Parkin和Cohen(2001)The Lancet 357:1777-89)。补体系统由血清中不耐热的成分组成,Paul Ehrlich描述了该成分可“补足”针对细菌的抗体反应。补体系统的其他功能是对入侵的微生物、免疫复合物、碎片、凋亡和坏死细胞的调理作用,以支持通过吞噬细胞的摄取来进行有效清除(Ricklin等人(2010)Nature Immunology11:785-797)。补体系统分为三种激活途径:经典途径(CP)、凝集素途径(LP)和旁路途径(AP)。
CP的激活通常通过补体成分C1q以抗体依赖性方式实现,所述补体成分充当模式识别分子(PRM)。在一系列蛋白水解激活事件后,CP C3转化酶(C4bC2a)将补体成分C3切割为C3a、过敏毒素和C3b(调理素),所述补体成分C3是所有三个补体激活途径的中心。由于这种切割,发生构象变化,并且先前的内部硫酯键伸出C3b的蛋白质表面。这种活性的且一经暴露就生命短暂的硫酯键可以共价结合到位于细胞表面的分子的羟基基团和氨基基团上,或者可以被水裂解(“淬灭”)。因此,如果没有下调C3转化酶,则可能发生通过许多C3b分子产生的细胞调理作用。大量C3b分子的产生促进了C5转化酶对C5的激活。C5转化酶将C5裂解为C5a(最有效的过敏毒素)和C5b,后者募集补体因子C6-9形成膜攻击复合物(MAC),该复合物在细胞膜上组装孔以裂解并杀伤细胞。
凝集素途径(LP)的组织方式与CP相似。通过识别病原体相关分子模式(PAMP)或危险相关分子模式(DAMP)进行激活。在LP中,可以通过与C1q(CP的模式识别分子)同源的几种模式识别分子:甘露糖结合凝集素(MBL)以及各种类型的胶原凝集素和纤维胶凝蛋白检测PAMP或DAMP。在PAMP或DAMP之后,结合的MBL发生构象变化,然后与MBL相关的丝氨酸蛋白酶(MASP)结合。MBL在结构和功能上与C1q同源。与CP类似,MASP2通过蛋白水解将C2激活为C2a和C2b,并将C4激活为C4a和C4b。激活的成分可以构建LP的C3转化酶C4bC2a,这与CP相同,并将C3切割为C3a和C3b。与CP类似,在没有严格调节C3转化酶的情况下,更多的C3b分子的产生通过C5转化酶促进了C5的激活。C5的蛋白水解激活是C5b引发MAC形成的终末和裂解补体途径的起点。
旁路途径通过低水平的自我激活过程被激活。此过程称为C3的“缓慢”激活。C3分子具有固有的亚稳态构象。在任何时候,一小部分的C3分子发生自发的构象变化(激活),从而暴露出先前的内部硫酯模件。硫酯可以用水淬灭,也可以不加区别地(对于自身的或外来的)附着于细胞表面的亲核试剂上。这种“自动激活”的C3称为C3(H2O),其结构类似于C3b分子。C3b或C3(H2O)暴露了隐藏在C3中的新蛋白质表面。这些新表面结合了作为AP的另一个补体因子的因子B。当因子B与C3b或C3(H2O)结合时,它可以被蛋白酶D裂解为Ba和Bb。Bb仍与C3(H2O)(或C3b)结合,并构成AP的C3转化酶C3bBb。与CP和LP C3转化酶类似,C3bBb可通过裂解C3产生C3b和C3a分子。蛋白质备解素是AP的正调节蛋白,它通过稳定AP C3转化酶的蛋白质-蛋白质相互作用而起重要作用。如果不加以调节,则由旁路途径、经典途径或凝集素途径产生的任何C3b都能构建更多的AP的C3转化酶,并且还增加正反馈回路中产生的C3b分子的数量。此步骤称为AP的“放大回路”。因此,激活的三个途径在C3激活的水平上收敛,并且如果不加以调节,则在MAC的形成中累积。
经典途径和凝集素途径是失活的,直到它们通过感应到病原体或内源性危险分子而被特异性激活。相反,AP始终处于低水平激活,并且不加选择地生成C3b(或最初的C3(H2O))分子。补体系统内有多于十种不同的调节蛋白是已知的。一些调节蛋白就在启动CP和LP的水平上进行抑制,但是级联中受最严格控制的部分是转化酶(充当激活信号的放大器),而C3b则建立平台以形成C3转化酶和炎性C5转化酶。也有一些调节蛋白专门控制裂解性MAC。
调节蛋白可分为促衰变因子,其使C3转化酶不稳定并导致转化酶更快降解。另一组涉及降解C3b或/和C4b的蛋白质,如因子H和因子I;为了防止可溶性蛋白酶因子I的非特异性降解,C3b或C4b的失活需要存在与靶标结合并募集因子I的辅因子蛋白(例如FH或CR1)。另一组调节蛋白抑制MAC的形成。
许多疾病,特别是遗传性疾病,与补体功能异常,特别是补体过度激活有关。因此,为提供补体系统的人工调节蛋白,开发了特异性结合补体蛋白C5并抑制末端活化的单克隆抗体依库珠单抗(Hillmen等人(2006),NEJM355(12):1233)。在类似的开发路线中,开发了C5抑制蛋白rEV576(coversin)(Romay-Penabad等人(2014),Lupus 23(12):1324)。此外,获得了通过接头连接补体因子H的补体调节蛋白重复序列(CCP结构域)1至4和19至20的称为“mini-FH”的蛋白(WO 2013/142362 A1)。在几种体外和离体测定中,miniFH在针对补体旁路途径的调节活性方面均具有增强了十倍的补体调节活性,并优于FH。
尽管如此,在本领域中仍然需要改进的补体抑制因子以避免现有技术的缺点。该问题通过本文公开的装置和方法来解决。
因此,本发明涉及多模件多肽,其包含(i)Fc受体结合模件;(ii)第一补体调节蛋白重复序列(CCP)模件;和(iii)第二CCP模件,其结合至至少一个宿主细胞表面标志物、结合至补体因子C3b、结合至补体因子C4b、结合至补体因子C3b的降解产物和/或结合至补体因子C4b的降解产物;其中所述第二CCP模件是所述Fc受体结合模件和所述第一CCP模件的C末端。
如在下文中所使用的,术语“具有”、“包含”或“包括”都以非排他的方式使用。因此,这些术语均可指除由这些术语引入的特征之外,在本文中所描述的实体中没有其他特征的情况,和其中存在一个或多于一个其他特征的情况。例如,“A具有B”、“A包含B”和“A包括B”的表述都可以指这样的情况,其中除了B之外,在A中不存在其他元素(即其中A仅并且排他地由B组成的情况),和其中除了B之外,实体A中存在一个或多于一个其他元素,例如元素C、元素C和元素D或甚至其他元素的情况。
此外,如在下文中所使用的,术语“优选”、“更优选”、“最优选”、“特别地”、“更特别地”、“具体地”、“更具体地”或类似术语与可选特征结合使用,而不限制进一步的可能性。因此,由这些术语引入的特征是可选特征,并且不旨在以任何方式限制权利要求的范围。本发明所属领域的技术人员将认识到,本发明可以通过使用可选特征进行。类似地,通过“在本发明的实施方案中”引入的特征或类似表述旨在是可选特征,而不对本发明的其他实施方案进行任何限制,不对本发明的范围进行任何限制,并且不对任何以这种方式将引入的特征与本发明的其他可选或非可选特征相结合的可能性进行限制。
如果没有另外的说明,如本文所用,术语“标准条件”涉及IUPAC标准环境温度和压力(SATP)条件,即优选25℃的温度和100kPa的绝对压力。还优选,标准条件包括pH为7。此外,如果没有另外的说明,术语“约”涉及相关领域中普遍接受的技术精度所表明的值,优选地涉及所表明的值±20%,更优选±10%,最优选±5%。此外,术语“基本上”表示不存在对所指示的结果或使用有影响的偏差,即,潜在的偏差不会使所指示的结果偏差超过±20%,更优选±10%,最优选±5%。因此,“基本组成为”或“基本由……组成”是指包括指定的组分,但不包括除了以下之外的其他组分:作为杂质存在的材料、由于用于提供组分的工艺而存在的不可避免的材料以及为达到本发明的技术目的以外的目的而添加的组分。例如,使用短语“基本上组成为”或“基本由……组成”定义的组合物涵盖任何已知的可接受的添加剂、赋形剂、稀释剂、载剂等。优选地,基本组成为一组组分的组合物包含小于5重量%,更优选小于3重量%,甚至更优选小于1重量%,最优选小于0.1重量%的非特定组分。在核酸序列的上下文中,术语“基本相同”表示具有至少80%,优选至少90%,更优选至少98%,最优选至少99%的%同一性值。可以理解,术语基本相同包括100%同一性。术语“基本互补”比照前述内容适用。
如本文所用,术语“Fc受体”是指在细胞表面或内体中对抗体,优选对IgG的Fc部分具有亲和力的受体;因此,优选地,Fc受体是新生儿Fc受体(FcRn)(或Fc-γ受体),更优选地,Fc受体选自CD64、CD32、CD16a和CD16b。优选地,Fc受体是哺乳动物Fc受体,更优选地是人Fc受体。因此,如本文所用,术语“Fc受体结合模件”涉及对如上文所述的Fc受体具有亲和力的多模件多肽的模件,优选多肽结构域。优选地,Fc受体结合模件和至少一种Fc受体的解离常数KD为至多10-6M,更优选至多10-7M,甚至更优选至多10-8M。优选地,Fc受体是如本文中所述的FcRn,并且在pH 6时FcRn/Fc受体结合模件复合物的解离常数小于10-6M,优选小于10-7M。还优选地,Fc受体是如本文上文所述的FcRn,并且在pH 7时FcRn/Fc受体结合模件复合物的解离常数为至少10-6M,优选至少10-5M。因此,优选地,Fc受体是如本文上文所述的FcRn,并且在pH 6时FcRn/Fc受体结合模件复合物的解离常数小于10-6M,优选小于10-7M,并且在pH 7时为至少10-6M,优选为至少10-5M。还优选地,与pH 6相比,在pH 7时FcRn/Fc受体结合模件复合物的解离常数是至少5倍,更优选至少10倍,更优选至少20倍。优选地,Fc受体结合模件是免疫球蛋白(Ig)的Fc模件,更优选是IgG的Fc模件,还更优选是IgG1的Fc模件。在一个优选的实施方案中,Fc受体结合模件包含与所述Fc受体结合模件的第二分子形成二硫键的至多一个半胱氨酸残基,在更优选的实施方案中,Fc受体结合模件不包含形成二硫键的半胱氨酸残基。因此,在优选的实施方案中,多模件多肽形成非共价同二聚体。最优选地,Fc受体结合模件包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:3或与其具有至少70%同一性的序列的肽,优选包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:12的肽。在一个优选的实施方案中,Fc受体结合模件包含白蛋白,优选人白蛋白(Genbank登录号为AAA98797.1)或小鼠白蛋白(Genbank登录号为AAH49971.1)的Fc-受体结合子序列。
原则上,术语“补体调节蛋白重复序列结构域”在本领域是已知的,其在本文中也称为“补体调节蛋白重复序列”、“CCP结构域”或“CCP”,并且在本领域中也称为“短补体样重复序列”、“短共有重复序列”或“SCR”。CCP结构域例如是Schmidt等人(2008),Clin ExpImmunol.151(1):14-24中综述的。CCP结构域是包含约60个至70个氨基酸的肽序列,其中包括一个保守的色氨酸和四个保守的半胱氨酸残基,形成两个二硫键,其余氨基酸的序列差异很大。除了与补体蛋白C3b和/或C4b结合之外,发现CCP结构域介导其他活性,包括下文所述的促衰变活性和因子I辅因子活性。
如本文所用,术语“第一CCP模件”涉及多模件多肽的模件,其包含至少一个CCP结构域并且是(i)针对补体激活的经典途径和/或旁路途径的转化酶的转化酶促衰变模件;和/或是(ii)针对补体因子C3b和/或C4b的结合模件,优选还具有因子I辅助因子活性。因此,优选地,第一CCP模件包含对补体激活的旁路途径和/或经典途径的C3转化酶具有促衰变活性的至少一个CCP结构域。本文所用的术语“促衰变活性”涉及CCP结构域或CCP模件介导补体激活的旁路途径的C3转化酶,即C3bBb,和/或补体激活的经典途径的C3转化酶,即C4bC2a的衰变,优选失活的性质。优选地,CCP结构域或CCP模件的促衰变活性是由表面等离子体共振(SPR)确定的。优选地,第一CCP模件包含具有或有助于前述活性的两个至十个,更优选两个至五个,还更优选三个至四个CCP结构域。优选地,所述第一CCP模件包含因子H的CCP结构域1至4,优选人因子H的CCP结构域1至4;包含1型补体受体(CR1)的CCP结构域1至3,优选人CR1的CCP结构域1至3,如下文所述;包含促衰变因子(DAF)的CCP结构域1至4,优选人DAF的CCP结构域1至4,如下文所述,和/或包含C4结合蛋白(C4BP)的CCP结构域1至3,优选人C4BP的CCP结构域1至3。优选地,包含第一CCP的模件包括1型补体受体(CR1)的CCP结构域1至3,如天然存在的序列中;和/或包含促衰变因子(DAF)的CCP结构域1至4,如在天然存在的序列中。优选地,第一CCP模件包含人因子H的CCP结构域1至4。更优选地,第一CCP模件包含、优选组成为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少70%,优选至少80%,更优选至少90%,最优选至少95%同一性的氨基酸序列,并且具有作为补体激活的经典途径和/或旁路途径的转化酶的转化酶促衰变模件的活性。更优选地,第一CCP模件包含、优选组成为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
还优选地,第一CCP模件包含对补体因子C3b和/或C4b具有结合活性的至少一个,优选地至少两个,更优选地至少三个CCP结构域,优选地还具有因子I辅助因子活性。如本领域技术人员将理解的,对补体因子C3b和/或C4b具有结合活性的一个或多于一个CCP结构域可以是不同于如上所述的具有促衰变活性的CCP结构域的CCP结构域。优选地,具有对补体因子C3b和/或C4b的结合活性的至少一个,更优选至少两个,还更优选至少三个CCP结构域也是具有促衰变活性的CCP结构域。更优选地,对补体因子C3b和/或C4b具有结合活性的CCP是如上所述的具有促衰变活性的CCP。术语“对补体因子C3b和/或C4b具有结合活性”是技术人员理解的。优选地,该术语涉及第一CCP模件和/或其至少一个CCP结构域以可测量的亲和力结合补体蛋白C3b和C4b中的至少一个的性质,可测量的亲和力更优选KD为至多5 x 10- 5M,更优选至多1 x 10-5M,甚至更优选至多10-6M。优选地,CCP或CCP模件与C3b或C4b的结合亲和力通过表面等离子体共振(SPR)测定。优选地,至少一种对补体因子C3b和/或C4b具有结合活性的CCP选自H因子的CCP结构域1至4、CR1,优选人CR1的CCP结构域8至10和15至17、和C4BP,优选人C4BP的CCP结构域1至3。因此,优选地,第一CCP模件包含或还包含CR1,优选人CR1的CCP结构域8至10和/或15至17,如本文其他地方所述。更优选地,包含第一CCP的模件包含或还包含CR1,优选人CR1的CCP结构域15至17。
原则上,术语“1型补体受体”或“CR1”是技术人员已知的涉及蛋白的补体激活(RCA)家族的调节蛋白的成员,也称为C3b/C4b受体或分化群35蛋白(CD35)。优选地,CR1是哺乳动物CR1,更优选地,CR1是人CR1。最优选地,CR1是具有如Genbank登录号P17927.3 GI:290457678中所示的氨基酸序列的人CR1。
原则上,术语“促衰变因子”或“DAF”也是本领域技术人员已知的,涉及补体系统的细胞表面结合调节蛋白,其也称为分化群55蛋白(CD55)。优选地,DAF是哺乳动物DAF,更优选地是人DAF。最优选地,DAF是具有如Genbank登录号P08174.4 GI:60416353中所示的氨基酸序列的人DAF。
术语“因子H”在技术人员中还被公认为是通过因子I使C3b失活的辅助因子,并且在替代补体途径中还用于增加C3bBb复合物(C3转化酶)和C3bBb3b复合物(C5转化酶)的解离速率。优选地,因子H是哺乳动物因子H,更优选地是人因子H。最优选地,因子H是具有Genbank登录号NP_000177.2中所示的氨基酸序列的人因子H。
术语“C4BP”也是本领域技术人员已知的补体激活的经典途径的控制分子,其作为辅助因子结合到C3b/C4b用于通过血清蛋白酶因子I使补体蛋白C4b蛋白水解失活。C4BP还增加了经典补体途径中C4b2a复合物(C3转化酶)和C4b2a3b复合物(C5转化酶)解离的速率。优选地,C4BP是哺乳动物C4BP,更优选地是人C4BP。最优选地,C4BP是具有如Genbank登录号NP_000706.1中所示的氨基酸序列的人C4BP。
如本文所用,术语“第二CCP模件”涉及多模件多肽的模件,该模件具有与至少一种宿主细胞表面标志物、与补体因子C3b、与补体因子C4b、与补体因子C3b的降解产物和/或与补体因子C4b的降解产物结合的活性。优选地,第二CCP模件具有与包含唾液酸和/或糖胺聚糖的聚阴离子碳水化合物结合的活性,和/或与补体因子C3b或C4b和/或其降解产物结合的活性,优选与iC3b、C3dg、C3d、iC4b、C4dg和/或C4d结合的活性。优选地,第二CCP模件具有与至少一种宿主细胞表面标志物结合的活性。更优选地,第二CCP模件具有与至少一种宿主细胞表面标志物和至少C3b结合的活性。优选地,第二CCP模件不具有可检测的转化酶促衰变活性和/或不具有可检测的因子I辅助因子活性。因此,更优选地,第二CCP模件仅对至少一种上述分子具有结合活性,并且最优选地,其不具有补体调节活性。优选地,第二CCP模件包含至少一个,优选至少两个CCP结构域,其具有与宿主细胞表面标志物,优选包含唾液酸和/或糖胺聚糖的聚阴离子碳水化合物结合的活性和/或具有与补体因子C3b降解产物,优选iC3b、C3dg、C3d、iC4b、C4dg和/或C4d结合的活性。优选地,第二CCP模件包含上文所述的补体因子H,优选人补体因子H的CCP结构域6至8和/或19至20、或C4BP的α链的任何CCP结构域1至8。更优选地,第二CCP模件包含如上所述的补体因子H,优选人补体因子H的CCP结构域6至8和/或19至20。甚至更优选地,第二CCP模件包含、优选组成为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少70%,优选至少80%,更优选至少90%,最优选至少95%同一性的氨基酸序列,优选具有与宿主细胞表面标志物,优选包含唾液酸和/或糖胺聚糖的聚阴离子碳水化合物结合的活性,和/或具有与补体因子C3b降解产物,优选与iC3b和/或C3dg结合的活性。更优选地,第二CCP模件包含、优选组成为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。优选地,通过表面等离子体共振(SPR)来确定与宿主细胞表面标志物结合的活性和与CCP或宿主细胞识别模件的补体因子C3b降解产物结合的活性。
如本说明书中所使用的,术语“多模件多肽”是指至少包含如下文所述的多肽模件的任何化学分子。应当理解的是,模件之间的化学键不必一定是肽键。本发明还设想模件之间的化学键是酯键、二硫键或技术人员已知的任何其他合适的共价化学键。还设想了非共价键,其具有如此低的离解常数以致于模件与其他模件的解离程度仅可忽略不计。优选地,所述非共价键的解离常数小于10-5M(如Strep-Tag:Strep-Tactin结合的情况)、小于10-6M(如Strep-TagII:Strep-Tactin结合的情况)、小于10-8M、小于10-10M或小于10-12M(如链霉亲和素:生物素结合的情况)。确定解离常数的方法是本领域技术人员众所周知的,包括例如光谱滴定法、表面等离子体共振测量、平衡透析等。此外,还可以设想,多模件多肽的模件之间的结合是间接的,例如所述模件包含对生物素具有亲和力的标签,并与包含生物素部分的另一分子或颗粒结合。优选地,模件之间的化学键是肽键,即,优选地,多模件多肽是包含或组成为本发明的模件的融合多肽。在一个优选的实施方案中,多肽组成为本文所述的组分。
优选地,提及多肽,特别是多模件多肽,和/或模件,特别是CCP模件,包括本文所述的特定多肽和模件的变体。如本文所用,术语“多肽变体”和“模件变体”是指任何化学分子,其至少包含如本文所指定的一个或多于一个模件,但结构与所述多肽或模件不同。优选地,多肽变体或模件变体包含具有对应于包含在本文所述多肽或模件中的25个至500个氨基酸序列,更优选30个至300个氨基酸序列,最优选35个至150个连续氨基酸序列的氨基酸序列的肽。此外,应理解,根据本发明的多肽变体或模件变体应具有由于至少一个氨基酸取代、缺失和/或添加而不同的氨基酸序列,其中变体的氨基酸序列仍优选与特定的多肽或模件的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%或99%同一性。两个氨基酸序列之间的同一性程度可以通过本领域众所周知的算法来确定。优选地,同一性程度是通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列来确定的,其中比较窗口中氨基酸序列的片段与进行比较以获得最佳对齐的序列相比可以包括添加或缺失(例如,空位或突出端)。通过优选在肽的全长上确定两个序列中相同氨基酸残基出现的位置数,以产生匹配位置数,用匹配位置数除以比较窗口中位置的总数,并将结果乘以100即得到序列同一性百分比。通过Smith和Waterman(1981)的局部同源性算法、Needleman和Wunsch(1970)的同源性比对算法、Pearson和Lipman(1988)的相似性搜索的方法、通过这些算法(GAP、BESTFIT、BLAST、PASTA和TFASTA在Wisconsin Genetics Software Package,GeneticsComputer Group(GCG),575 Science Dr.,Madison,WI)的计算机化实现或通过目视检查,可以进行比较序列的最佳比对。假定已经确定用于比较的两个序列,则优选采用GAP和BESTFIT来确定它们的最佳比对,从而确定同一性程度。优选地,对于空位权重使用默认值5.00,对于空位权重长度使用默认值0.30。以上提及的多肽变体或模件变体可以衍生自等位基因变体或任何其他物种特异性同源物、旁系同源物或直系同源物。此外,本文所指的多肽变体包括特定多肽的片段或上述类型的变体,只要这些片段和/或变体包含上述模件。这样的片段可以来自或衍生自例如多肽的降解产物或剪接变体。还包括由于翻译后修饰,例如磷酸化、糖基化、泛素化、SUMO化或肉豆蔻基化而不同的变体,通过包括非天然氨基酸,和/或通过是拟肽。
优选地,多模件多肽的至少两个模件通过“接头”肽连接。合适的接头肽原则上是本领域已知的。优选的接头肽包含或优选组成为甘氨酸、丙氨酸和/或脯氨酸残基。更优选地,接头肽是聚甘氨酸接头肽。最优选地,接头肽,特别是如本文其他地方所述的连接第一CCP模件和第二CCP模件的接头肽,是包含、优选组成为14个或15个甘氨酸残基的接头。其他优选的接头是组成为5个或8个甘氨酸残基的接头。优选地,还设想通过将N末端模件的最后一个氨基酸和/或C末端模件的第一个氨基酸交换为G残基来连接两个模件。
如本文所用,术语“包含与X具有至少70%同一性的氨基酸序列的模件”涉及包含上述模件的变体的模件,所述变体具有与所述模件具有至少70%同一性的氨基酸序列。优选地,包含与X具有至少70%同一性的氨基酸序列的模件是具有X的活性,更优选具有如本文所述的活性的X的变体。
因此,优选地,本发明的多模件多肽及其变体具有作为补体激活抑制因子的活性,即具有抑制补体反应的活性,优选在体外和/或体内。优选地,多模件多肽及其变体具有抑制补体系统的至少两个,更优选所有三个激活途径的活性。更优选地,多模件多肽及其变体具有至少抑制补体激活的旁路途径和经典途径的活性,优选地具有至少抑制补体激活的旁路途径、经典途径和凝集素途径的活性。
优选地,多模件多肽包含其至少两个模件,优选地包含其所有三个模件作为连续的多肽序列,即,多模件多肽优选地是包含所述三个模件的融合多肽。优选地,原则上,只要第二CCP模件在所述Fc受体结合模件和所述第一CCP模件的C末端,就可以以本领域技术人员认为合适的任何顺序将三个模件包含在这种融合多肽中。优选地,多模件多肽包含的所述模件以N末端至C末端的顺序为Fc受体结合模件、第一CCP模件和第二CCP模件。应当理解,多模件多肽可优选包含除本文所指的结构域和结构元件以外的其他结构域和结构元件。更优选地,多模件多肽组成为本文提及的元件。然而,优选地,具有与至少一种宿主细胞表面标志物、与补体因子C3b、与补体因子C4b、与补体因子C3b的降解产物和/或与补体因子C4b的降解产物结合的活性的一个或多于一个CCP结构域在其他CCP结构域和Fc受体结合模件的C末端,更优选地,具有与至少一种宿主细胞表面标志物、与补体因子C3b、与补体因子C4b、与补体因子C3b的降解产物和/或与补体因子C4b的降解产物结合的活性的CCP结构域是多模件多肽的C末端元件。甚至更优选地,多模件多肽包含、优选组成为SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列,或者是如上文所述的其变体,其中,优选地,所述变体仍具有如上所述的补体激活抑制因子的活性。最优选地,多模件多肽包含、优选组成为SEQ IDNO:8或SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
有利地,在本发明基础的工作中发现,重要的是构建包含Fc受体结合模件和细胞结合CCP结构域的多模件多肽,使得结合细胞的CCP结构域位于或接近所得分子的C末端。出人意料的是,这样的位置没有明显影响多模件多肽的血浆半衰期,但是对有效浓度/剂量有明显影响。
以上所述的定义适用于下述的进一步修正。在下文中进一步描述的附加定义和说明也适用于本说明书中所描述的所有实施方案的必要修正。
本发明还涉及编码本发明的多模件多肽的多核苷酸。
根据本发明使用的术语“多核苷酸”涉及包含核酸序列的多核苷酸,该核酸序列编码包含如上文所指定的模件的多模件多肽。根据本发明,通过使用众所周知的技术合成编码相关模件的多核苷酸,已经获得了编码包含上述模件的多模件多肽的多核苷酸。
因此,多核苷酸优选包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11所示的核酸序列,其编码具有如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的多肽。应当理解,由于简并遗传密码,具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的多肽也可以被其他多核苷酸编码。
此外,根据本发明使用的术语“多核苷酸”还包括上述特定多核苷酸的变体。多核苷酸变体优选包含核酸序列,其特征在于该序列可以通过至少一个核苷酸取代、添加和/或缺失而从SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11所示的上述特定核酸序列衍生而来,其中变体核酸序列仍应编码包含上述活性的多肽。变体包括以下多核苷酸:所述多核苷酸包含与SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:11所示的至少一个核酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的核酸序列。此外,还包括以下多核苷酸:所述多核苷酸包含编码与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的氨基酸序列的核酸序列。优选地在整个氨基酸或核酸序列区域上计算百分比同一性值。基于各种算法的一系列程序可供熟练技术人员用来比较不同的序列。在这种情况下,Needleman和Wunsch算法或Smith和Waterman算法给出了特别可靠的结果。为了进行序列比对,使用PileUp程序(J.Mol.Evolution.,25,351-360,1987,Higgins等人,CABIOS,5 1989:151-153)或空位和最佳拟合程序(Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48;443-453(1970))和Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2;482-489(1981))),其是GCG软件包(GeneticsComputer Group,575 Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711(1991))的一部分。上面列出的以百分比(%)表示的序列同一性值优选在整个序列区域中使用GAP程序通过以下设置确定:空位权重:50,长度权重:3,平均匹配:10.000和平均不匹配:0.000,除非另有说明,否则这应始终用作序列比对的标准设置。变体还涵盖包含核酸序列的多核苷酸,所述核酸序列优选在严格的杂交条件下能够与上述特定核酸序列杂交。这些严格条件是本领域技术人员已知的,并且可以在Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中找到。严格杂交条件的一个优选实例是在约45℃的6′氯化钠/柠檬酸钠(=SSC)中杂交的条件,然后在50℃至65℃的0.2′SSC,0.1%SDS中进行一个或多于一个洗涤步骤。技术人员知道,这些杂交条件根据核酸的类型以及例如当存在有机溶剂时在缓冲液的温度和浓度方面有所不同。例如,在“标准杂交条件”下,在浓度为0.1至5′SSC(pH 7.2)的水性缓冲液中,温度根据核酸类型在42℃至58℃变化。如果上述缓冲液中存在有机溶剂,例如50%甲酰胺,则标准条件下的温度约为42℃。DNA:DNA杂合体的杂交条件优选为例如0.1′SSC和20℃至45℃,优选为30℃至45℃。DNA:RNA杂合体的杂交条件优选为例如0.1′SC和30℃至55℃,优选为45℃至55℃。例如在不存在甲酰胺的情况下,对于长度大约为100bp(=碱基对)且G+C含量为50%的核酸,确定上述杂交温度。技术人员知道如何通过参考教科书诸如上述教科书或以下教科书来确定所需的杂交条件:Sambrook等人,″Molecular Cloning”,Cold Spring Harbor Laboratory,1989;Hames和Higgins(Ed.)1985,″Nucleic Acids Hybridization:A Practical Approach”,IRL Press at OxfordUniversity Press,Oxford;Brown(Ed.)1991,″Essential Molecular Biology:APractical Approach”,IRL Press at Oxford University Press,Oxford。或者,多核苷酸变体可通过基于PCR的技术获得,例如基于混合的基于寡核苷酸引物的DNA扩增,即使用针对本发明多肽的保守模件的简并引物。本发明的多肽的保守模件可以通过将本发明的多核苷酸的核酸序列或多肽的氨基酸序列与其他CCP结构域的序列比较来确定。作为模板,可以使用来自动物,优选哺乳动物,更优选人的DNA或cDNA。
包含任何上述核酸序列的片段的多核苷酸也包括在本发明的多核苷酸中。该片段应编码包含上述指定模件的多肽,并且优选仍具有上述指定的活性。因此,多肽可包含或组成为赋予所述生物活性的本发明模件。本文所述的片段优选包含上述核酸序列的至少50个、至少100个、至少250个或至少500个连续的核苷酸或编码包含上述氨基酸序列的至少20个、至少30个、至少50个、至少80个、至少100个或至少150个连续氨基酸的氨基酸序列。
本发明的多核苷酸由上述核酸序列组成或包含上述核酸序列。因此,它们也可以包含其他核酸序列。具体地,本发明的多核苷酸可以编码融合蛋白,其中融合蛋白的一个配偶体(partner)是由上述核酸序列编码的多模件多肽。这样的融合蛋白可以包含作为附加部分的用于监测表达的其他多肽(例如,绿色、黄色、蓝色或红色荧光蛋白,碱性磷酸酶等)或所谓的“标签”,其可以用作可检测的标记或用于纯化目的的辅助手段。用于不同目的的标签是本领域众所周知的,并且包括FLAG标签、6-组氨酸标签、MYC标签等。
本发明的多核苷酸应优选以分离的多核苷酸(即从其天然环境分离)或遗传修饰的形式提供。多核苷酸优选是DNA,包括cDNA,或者是RNA。该术语涵盖单链和双链多核苷酸。此外,还包括化学修饰的多核苷酸,包括天然存在的修饰的多核苷酸,例如糖基化或甲基化的多核苷酸或人工修饰的多核苷酸,例如生物素化的多核苷酸。
因此,优选地,本发明的多核苷酸a)是与SEQ ID NO:9具有至少70%序列同一性的多核苷酸,b)编码与SEQ ID NO:8具有至少70%序列同一性的多肽,和/或c)是能够在严格条件下与SEQ ID NO:9杂交的多核苷酸。更优选地,多核苷酸a)是包含、优选组成为核酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的多核苷酸,和/或b)编码包含、优选组成为氨基酸序列SEQID NO:8或SEQ ID NO:10的多肽。优选地,本发明的多核苷酸编码具有如上所述活性的多模件多肽。
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的载体。
术语“载体”优选地涵盖噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体以及人工染色体,例如细菌或酵母人工染色体。此外,该术语还涉及靶向构建体,其允许将靶向构建体随机或定点整合到基因组DNA中。这样的靶构建体优选地包含具有足够长度的DNA以用于同源或异源重组,如下文详细描述的。包含本发明的多核苷酸的载体优选还包含用于在宿主中繁殖和/或选择的选择性标记物。可以通过本领域众所周知的各种技术将载体掺入宿主细胞。例如,可以将质粒载体引入沉淀物中,例如磷酸钙沉淀物或氯化铷沉淀物中,或引入具有带电荷脂质的复合物中,或引入碳基簇中,例如富勒烯中。或者,可以通过热激或电穿孔技术引入质粒载体。如果载体是病毒,则可以在应用于宿主细胞之前使用适当的包装细胞系对其进行体外包装。逆转录病毒载体可以是具有复制能力的或是复制缺陷的。在后一种情况下,病毒繁殖通常只会在互补的宿主/细胞中发生。
更优选地,在本发明的载体中,多核苷酸可操作地连接至表达控制序列,从而允许在原核和/或真核细胞或其分离的级分中表达。所述多核苷酸的表达包括多核苷酸的转录,优选转录成可翻译的mRNA。确保在真核细胞、优选哺乳动物细胞中表达的调节元件是本领域众所周知的。它们优选包含确保转录起始的调节序列,以及任选地确保转录终止和转录物稳定的聚-A信号。其他调节元件可以包括转录增强子和翻译增强子。可能在原核宿主细胞中表达的调控元件包括,例如,大肠杆菌中的lac、trp或tac启动子,而允许在真核宿主细胞中表达的调控元件的实例是酵母中的AOX1或GAL1启动子或哺乳动物和其他动物细胞中的CMV-启动子、SV40-启动子、RSV-启动子(劳氏肉瘤病毒)、CMV增强子、SV40增强子或球蛋白内含子。此外,可诱导表达控制序列可用于本发明涵盖的表达载体中。这样的可诱导载体可包含tet或lac操纵子序列或可被热激或其他环境因素诱导的序列。合适的表达控制序列是本领域众所周知的。除了负责转录起始的元件之外,此类调控元件还可在多核苷酸下游包含转录终止信号,例如SV40-聚-A位点或tk-聚-A位点。在这方面,合适的表达载体是本领域已知的,例如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pBluescript(Stratagene)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(InVitrogene)或pSPORT1(GIBCO BRL)。优选地,所述载体是表达载体和基因转移或靶向载体。衍生自病毒例如逆转录病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒的表达载体可用于将本发明的多核苷酸或载体递送至靶细胞群中。本领域技术人员众所周知的方法可用于构建重组病毒载体;参见,例如,Sambrook,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory(1989)N.Y.和Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,GreenPublishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1994)中描述的技术。
优选地,载体是在宿主细胞中介导本发明的多核苷酸表达的载体。技术人员知道如何选择载体和宿主细胞的组合以用于载体的繁殖和/或用于表达由载体编码的蛋白质。
此外,本发明涉及包含本发明的多核苷酸或载体的宿主细胞。
如本文所用,“宿主细胞”涉及细菌、古细菌或真核细胞,其具有繁殖本发明的载体和/或产生在该载体上编码的多模件多肽或本发明的多核苷酸的能力。优选地,宿主细胞是来自大肠杆菌菌种的细菌细胞、鳞翅目昆虫、小鼠、大鼠或人细胞;优选地,宿主细胞是大肠杆菌。更优选地,该细胞是酵母细胞,优选地为毕赤酵母属的酵母细胞,更优选地为巴斯德毕赤酵母细胞(Pichia pastoris cell)。优选地,宿主细胞是体外培养的细胞。在另一个优选的实施方案中,宿主细胞是体内细胞,优选为视网膜色素上皮细胞、脉络膜脉管系统内的内皮细胞和/或视网膜或脉络膜内的另一种细胞。
本发明还涉及根据本发明的多模件多肽、根据本发明的多核苷酸、根据本发明的载体和/或根据本发明的宿主细胞,其用于医疗。此外,本发明还涉及根据本发明的多模件多肽、根据本发明的多核苷酸、根据本发明的载体和/或根据本发明的宿主细胞,其用于治疗和/或预防不适当的补体激活和/或以不适当的补体激活作为症状的疾病。
如本文所用,术语“不适当的补体激活”涉及在给定情况下在时间和/或幅度上超过补体激活的正常水平的补体激活。因此,优选地,不适当的补体激活是在给定情况下,补体激活超过、优选显著超过健康参照、优选明显健康对象的补体激活程度。优选地,不适当的补体激活是引起患者疾病症状的补体激活。不适当的补体激活的症状在本领域中是已知的,包括溶血、黄斑变性、偶发性肿胀,例如遗传性血管性水肿等。优选地,通过确定样品中的补体因子C3和/或C4活性来确定不适当的补体激活。
如本领域技术人员所知,各种疾病与不适当的补体激活有关和/或由不适当的补体激活引起。因此,优选地,本发明还涉及根据本发明的多模件多肽、根据本发明的多核苷酸或根据本发明的载体,其用于治疗和/或预防以不适当的补体激活作为症状的疾病。在一个优选的实施方案中,以不适的补体激活作为症状的疾病选自Ricklin等人(2017),MolImmunol.89:10-21中公开的疾病。优选地,所述以不适当的补体激活作为症状的疾病选自缺血再灌注损伤、抗体介导的移植物排斥、移植后血栓性微血管病、自身免疫性溶血性贫血、急性和迟发性溶血性输血反应、冷凝集素疾病、类风湿性关节炎、水通道蛋白-4-抗体-阳性视神经脊髓炎、CD59缺乏症、C3肾小球病、非典型溶血性尿毒综合征、阵发性夜间血红蛋白尿和年龄相关性黄斑变性。
如本文所用,术语“治疗”是指减轻本文所提及的疾病或病症或伴随其的症状,优选地在很大程度上减轻。如本文所使用的所述治疗还包括关于本文所提及的疾病或病症的整体健康恢复。应当理解,根据本发明使用的治疗可能并非在所有待治疗的对象中都是有效的。然而,该术语应优选地要求能够成功治疗统计学显著比例的患有本文所提及疾病或病症的对象。本领域技术人员可以无需费力地使用各种众所周知的统计评估工具来确定比例是否在统计上有意义,统计评估工具例如,置信区间的确定、p值确定、学生t检验、Mann-Whitney检验等。优选的置信区间为至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%。p值优选为0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。优选地,该治疗对于给定同生群或群体的至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的对象有效。
如本文所用,术语“预防”是指在对象中对于本文所提及的疾病或病症保持一定时间段的健康。应理解的是,所述时间段取决于所施用的药物化合物的量以及本说明书中其他地方讨论的对象的个体因素。还应理解,预防可能不在用本发明化合物治疗的所有对象中是有效的。但是,该术语优选地要求有效地预防同生群或群体的统计学显著部分的患有本文所述的疾病或病症或其伴随症状的对象。优选地,在这种情况下,设想了对象的同生群或群体,其通常,即,如果没有根据本发明的预防措施,将发展出本文所指的疾病或病症。本领域技术人员可以使用本说明书中其他地方讨论的各种众所周知的统计评估工具来确定一部分是否在统计上是有意义的。
本发明还涉及根据本发明的多模件多肽、根据本发明的多核苷酸或根据本发明的载体,其与补体蛋白C5抑制多肽,优选依库珠单抗联合,用于治疗和/或预防不适当的补体激活和/或以不适当的补体激活作为症状的疾病。
本发明还涉及与补体蛋白C5抑制多肽,优选依库珠单抗或rEV576(coversin)与根据本发明的多模件多肽、根据本发明的多核苷酸、根据本发明的载体和/或根据本发明的宿主细胞组合,用于治疗和/或预防不适当的补体激活和/或以不适的补体激活作为症状的疾病。
术语“补体蛋白C5”被技术人员理解为与在补体途径激活后被裂解以产生补体蛋白C5a和C5b的蛋白有关。相应地,“补体蛋白C5抑制多肽”是特异性识别和抑制补体蛋白C5的多肽,优选为抗体,更优选为单克隆抗体。优选地,补体蛋白C5抑制多肽是与C5特异性结合并抑制末端激活的抗体。更优选地,补体蛋白C5抑制多肽是依库珠单抗(CAS号:219685-50-4)。还优选地,补体蛋白C5抑制多肽是rEV576(coversin)。
本发明还涉及用于同时、单独或顺序使用的组合制剂,其包含(i)根据本发明的多模件多肽和(ii)补体蛋白C5抑制多肽,优选依库珠单抗或rEV576(coversin)。
本申请中所指的术语“组合制剂”涉及在一种制剂中包含本发明的药物活性化合物的制剂。优选地,组合制剂包含在容器中,即,优选地,所述容器包含本发明的所有药物活性化合物。优选地,所述容器包含作为单独制剂的本发明的药物活性化合物,即,优选地,多模件多肽的一种制剂和补体蛋白C5抑制多肽的一种制剂。如本领域技术人员将理解的,术语“制剂”涉及优选地药学上可接受的化合物的混合物,其包含或组成为本发明的至少一种药物活性化合物。优选地,所述组合制剂包含单一固体药物形式的补体蛋白C5抑制多肽和多模件多肽,所述单一固体药物形式例如片剂,其中,更优选地,本发明的一种化合物包含在即释或速释制剂中,而本发明的第二化合物包含在缓释或迟释制剂中;更优选地,本发明的化合物包含在两个单独的,优选为液体的制剂中;所述单独的液体制剂优选用于注射,优选注射到对象身体的不同部位。
优选地,组合制剂用于单独或组合施用。如本文所用,“单独施用”涉及其中本发明的至少两种药物活性化合物通过不同途径和/或对象的不同部位施用的施用。例如一种化合物可以通过肠内施用(例如口服)来施用,而第二种化合物通过肠胃外施用(例如静脉内施用)来施用。优选地,用于单独施用的组合制剂包括至少两种用于单独施用的物理上分开的制剂,其中每种制剂包含至少一种药物活性化合物;所述替代方案是优选的,例如在组合制剂的药物活性化合物由于其化学或生理特性必须通过不同途径例如肠胃外和口服施用的情况下。相反,“组合施用”涉及其中通过相同的途径例如口服或优选静脉内来施用本发明的药物活性化合物的施用。
还优选地,组合制剂用于同时或顺序施用。如本文所用,“同时施用”涉及其中同时施用本发明的药物活性化合物的施用,即,优选地,药物活性化合物的施用在少于15分钟的时间间隔内,更优选地,在小于5分钟的时间间隔内开始。最优选地,药物活性化合物的施用同时开始,例如通过吞咽包含药物活性化合物的片剂,或吞咽包含药物活性化合物之一的片剂并同时注射第二化合物,或通过静脉注射包含一种药物活性化合物的溶液并向身体的不同部分以不同的方式注射第二化合物。相反,如本文所用,“顺序施用”涉及引起对象中药物活性化合物的血浆浓度能够实现本发明的协同作用的施用,但是优选地,其不是如上文所述的同时施用。优选地,顺序施用是这样的施用,其中药物活性化合物,优选所有药物活性化合物的施用在1天或2天的时间间隔内,更优选在12小时的时间间隔内,还更优选在4小时的时间间隔内,甚至更优选在1小时的时间间隔内,最优选在5分钟的时间间隔内开始。
优选地,所述组合制剂是药学上相容的组合制剂。如本文所用,术语“药学上相容的制剂”和“药物组合物”涉及包含本发明的化合物和任选地一种或多于一种药学上可接受的载剂的组合物。本发明的化合物可以配制成药学上可接受的盐。优选的可接受的盐是乙酸盐、甲酯盐、HCl盐、硫酸盐、氯盐等。药物组合物优选局部施用,或更优选全身施用。通常用于药物施用的合适的施用途径是口服、静脉内、皮下或肠胃外施用以及吸入。然而,取决于化合物的性质和作用方式,药物组合物也可以通过其他途径施用。此外,所述化合物可以与其他药物组合以普通药物组合物的形式或如本文其他地方所指定的分离的药物组合物的形式施用,其中所述分离的药物组合物可以以试剂盒套装的形式提供。优选地,组合制剂是关于一种或多于一种化合物的缓释制剂。
化合物优选以常规剂型施用,所述常规剂型是根据常规方法通过将药物与标准药物载剂结合而制备的。这些程序可以包括将成分混合、制粒、压缩或溶解,以适合于所需的制剂。应当理解的是,药学上可接受的载剂或稀释剂的形式和特性由与其结合的活性成分的量、施用途径和其他众所周知的变量所决定。
在与制剂的其它成分相容并且对对象无害的意义上,每种载剂都是可接受的。所使用的药物载剂可以是例如固体、凝胶或液体。固体载剂的实例是乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸等。示例性液体载剂是磷酸盐缓冲盐溶液、糖浆、油,例如花生油和橄榄油、水、乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。类似地,载剂或稀释剂可包括本领域众所周知的延时材料,例如单独的或与蜡一起的甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。所述合适的载剂包括上面提到的那些和本领域公知的其他载剂,参见,例如,Remington′s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania。
选择不影响一种或多于一种化合物的生物活性的稀释剂。这样的稀释剂的实例是蒸馏水、生理盐水、林格溶液、右旋糖溶液和汉克溶液。另外,药物组合物或制剂还可包含其他载剂、佐剂、或无毒、无治疗、无免疫原性的稳定剂、活性氧清除剂等。
治疗有效剂量是指用于本发明的药物组合物中化合物预防、改善或治疗本说明书中提及的疾病或病状伴随的症状的量。这类化合物的治疗功效和毒性可以在细胞培养或实验动物中通过标准药学方法来确定,例如ED50(在50%的群体中治疗有效的剂量)和LD50(对50%的群体致命的剂量)。治疗效果和毒性作用之间的剂量比是治疗指数,并且可以表示为LD50/ED50的比。
剂量方案将由主治医生和其他临床因素决定;优选根据上述方法中的任何一种。如医药领域众所周知的,用于任何一名患者的剂量取决于许多因素,包括患者的体型、体表面积、年龄、所要施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、总体健康状况以及同时施用的其他药物。可以通过定期评估来监控进度。典型的剂量可以例如为1mg至1500mg;然而,可以设想低于1mg或高于1500mg的剂量,特别是考虑到上述因素。通常,作为药物组合物的常规施用方案应为每天100μg至100mg单位。如果方案是连续输注,则每分钟每公斤体重也应分别为100μg至100mg单位。优选地,每1周一次至每2个月一次或甚至更长的间隔注射每种药物的缓释制剂。可以通过定期评估来监控进度。本发明化合物的优选剂量和浓度在本文其他地方规定。
举例来说,多模件多肽的血浆浓度优选不小于25nM,更优选不小于50nM。还优选地,多模件多肽的血浆浓度为20nM至20μM,更优选为50nM至5μM。补体蛋白C5抑制多肽,特别是依库珠单抗的有效浓度是本领域已知的。由于本发明的多模件多肽的协同作用,组合治疗中补体蛋白C5抑制多肽的有效浓度可能较低。
本文所指的药物组合物和制剂优选至少施用一次,例如在缓释制剂的情况下,为了治疗或改善或预防本说明书中所述的疾病或病状。但是,所述药物组合物可以施用多次,例如每天一次至四次,直至不限天数。同样,一些清除时间短的化合物也可以通过输液方式使用,以在较长的治疗时间内向全身提供有效剂量。
具体的药物组合物是以药学领域众所周知的方式制备的,并且包含至少一种本文上面提到的活性化合物,其与药学上可接受的载剂或稀释剂混合或另外与药学上可接受的载剂或稀释剂关联。为了制备那些特定的药物组合物,通常将一种或多于一种活性化合物与载剂或稀释剂混合,或封闭或封装在胶囊、小袋、扁囊剂、纸或其他合适的容器或载剂中。所得制剂应适于施用方式,即片剂、胶囊剂、栓剂、溶液剂、混悬剂等形式的施用方式。剂量建议应在开药者或使用者说明中指出,以便根据所考虑的接受者预期进行剂量调整。
本发明还涉及一种药物,其包含(i)多模件多肽、(ii)补体蛋白C5抑制多肽、和(iii)至少一种药学上可接受的载剂;并且涉及所述药物,其用于上述治疗和/或预防。
术语“药物”是技术人员所理解的。应当理解的是,本文以上给出的术语“组合制剂”的定义优选地应用于经必要修正后的本发明的术语药物。
此外,本发明涉及一种用于在对象中治疗和/或预防不适当的补体激活和/或以不适当的补体激活作为症状的疾病的方法,该方法包括施用有效剂量的本发明的多模件多肽、根据本发明的多核苷酸、根据本发明的载体和/或根据本发明的宿主细胞,从而在对象中治疗和/或预防不适当的补体激活和/或以不适当的补体激活作为症状的疾病。
本发明的治疗和/或预防方法优选为体内方法。此外,除了上述明确提及的之外,还可以包括多个其他步骤。例如,其他步骤可以涉及例如诊断不适当的补体激活和/或以不适当的补体激活作为症状的疾病,或施用另外的化合物,例如补体蛋白C5抑制多肽。此外,所述步骤中的一个或多于一个可以由自动化设备执行。
如本文所用,术语“对象”涉及具有补体系统的动物,优选涉及哺乳动物。更优选地,对象是牛、猪、羊、马、猫、狗、小鼠或大鼠,最优选地是人。
此外,本发明涉及用于预防或减少补体激活程度的体外方法,其包括将根据本发明的多模件多肽、根据本发明的多核苷酸、根据本发明的载体和/或根据本发明的宿主细胞应用于包含补体因子的反应混合物、组织和/或器官,从而防止或降低所述反应混合物、组织和/或器官中补体激活的程度。
本发明的用于预防或降低补体激活程度的体外方法可以包括除上面明确提到的那些步骤之外的步骤。例如,其他步骤可以涉及例如将本发明的多核苷酸或载体引入宿主细胞,或确定所述反应混合物、组织或器官中补体激活的程度。此外,所述步骤中的一个或多于一个可以由自动化设备执行。优选地,在体外对反应混合物进行该方法。
此外,本发明涉及根据本发明的多模件多肽、根据本发明的多核苷酸、根据本发明的载体和/或根据本发明的宿主细胞在治疗和/或预防不适当的补体激活和/或以不适当的补体激活作为症状的疾病中的用途;以及涉及根据本发明的多模件多肽、根据本发明的多核苷酸、根据本发明的载体和/或根据本发明的宿主细胞在制备用于治疗和/或预防不适当的补体激活和/或以不适当的补体激活作为症状的疾病的药物中的用途。
鉴于上文,优选的是以下实施方案:
1.一种多模件多肽,其包含
(i)Fc受体结合模件;
(ii)第一补体调节蛋白重复序列(CCP)模件;和
(iii)第二CCP模件,其结合到至少一个宿主细胞表面标志物,结合至补体因子C3b,结合至补体因子C4b,结合至补体因子C3b的降解产物和/或结合至补体因子C4b的降解产物;
其中所述第二CCP模件是所述Fc受体结合模件和所述第一CCP模件的C末端。
2.实施方案1的多模件多肽,其中所述多模件多肽包含的所述模件以N末端至C末端的顺序为Fc受体结合模件、第一CCP模件和第二CCP模件。
3.实施方案1或2的多模件多肽,其中所述第一CCP模件和/第二CCP模件包含多个CCP结构域。
4.实施方案1至3中任一项的多模件多肽,其中所述第一和/或第二CCP模件由2个至10个,优选2个至5个,更优选3个至4个CCP结构域构成。
5.实施方案1至4中任一项的多模件多肽,其中所述第一CCP模件包含因子H的CCP结构域1至4,优选人因子H的CCP结构域1至4;包含1型补体受体(CR1)的CCP结构域1至3,优选人CR1的CCP结构域1至3;包含促衰变因子(DAF)的CCP结构域1至4,优选人DAF的CCP结构域1至4,和/或包含C4结合蛋白(C4BP)的CCP结构域1至3,优选人C4BP的CCP结构域1至3。
6.实施方案1至5中任一项的多模件多肽,其中所述第一CCP模件(i)是针对补体激活的经典途径和/或旁路途径的转化酶的转化酶促衰变模件,和/或(ii)是针对补体因子C3b和/或C4b的结合模件,所述第一CCP模件优选还具有因子I辅助因子活性。
7.实施方案1至6中任一项的多模件多肽,其中所述第一CCP模件包含、优选组成为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与其具有至少70%同一性的氨基酸序列。
8.实施方案1至7中任一项的多模件多肽,其中所述第一CCP模件包含、优选组成为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
9.实施方案1至8中任一项的多模件多肽,其中所述第二CCP模件结合至包括唾液酸、糖胺聚糖和/或补体因子C3b或其降解产物的聚阴离子碳水化合物。
10.实施方案1至9中任一项的多模件多肽,其中所述第二CCP模件包含因子H的CCP结构域19至20,优选人因子H的CCP结构域19至20。
11.实施方案1至10中任一项的多模件多肽,其中所述第二CCP模件包含、优选组成为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与其具有至少70%同一性的氨基酸序列。
12.实施方案1至11中任一项的多模件多肽,其中所述第二CCP模件包含、优选组成为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
13.实施方案1至12中任一项的多模件多肽,其中所述Fc受体结合模件是免疫球蛋白(Ig)的Fc模件。
14.实施方案1至13中任一项的多模件多肽,其中所述Fc受体结合模件是IgG,优选IgG1的Fc模件。
15.实施方案1至14中任一项的多模件多肽,其中所述Fc受体结合模件包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:3或与其具有至少70%同一性的序列的肽,优选包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:3的肽。
16.实施方案1至15中任一项的多模件多肽,其中所述多模件多肽包含至少两个所述模件作为连续多肽序列,优选包含所有三个所述模件作为连续多肽序列。
17.实施方案1至16中任一项的多模件多肽,其中所述第一CCP模件和/或所述第二CCP模件包含因子H的CCP结构域1至4,优选人因子H的CCP结构域1至4。
18.实施方案1至17中任一项的多模件多肽,其中包含所述第一CCP模件和所述第二CCP模件一起作为mini-FH,所述mini-FH包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7之一的氨基酸序列或与至少一个所述序列具有至少70%同一性的序列,优选包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7之一的氨基酸序列。
19.实施方案1至18中任一项的多模件多肽,其中所述模件中的至少两个通过接头肽,优选聚-AG或聚-G接头肽连接。
20.实施方案1至19中任一项的多模件多肽,其中所述第一CCP模件和所述第二CCP模件通过接头连接,所述接头包含、优选组成为1个至15个,优选1个、5个、8个、14个或15个甘氨酸残基。
21.实施方案1至20中任一项的多模件多肽,其中所述多模件多肽包含、优选组成为SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或与其具有至少70%同一性的氨基酸序列。
22.实施方案1至21中任一项的多模件多肽,其中所述多模件多肽包含、优选组成为SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
23.实施方案1至22中任一项的多模件多肽,其中所述第一CCP模件包含对补体因子C3b和/或C4b具有结合活性、具有因子I辅助因子活性的至少一个,优选至少两个,更优选至少三个CCP。
24.实施方案23的多模件多肽,其中对补体因子C3b和/或C4b具有结合活性的CCP具有因子I辅助因子活性。
25.实施方案1至24中任一项的多模件多肽,其中所述多模件多肽具有抑制补体反应的活性。
26.实施方案1至25中任一项的多模件多肽,其中所述多模件多肽具有抑制补体系统的至少一个、优选两个、更优选所有三个激活途径的活性。
27.实施方案1至26中任一项的多模件多肽,其中所述多模件多肽具有至少抑制补体激活的旁路途径和经典途径的活性,优选地具有至少抑制补体激活的旁路途径、经典途径和凝集素途径的活性。
28.一种多核苷酸,其编码实施方案1至27中任一项的多模件多肽。
29.实施方案28的多核苷酸,其中所述多核苷酸
a)是与SEQ ID NO:9具有至少70%序列同一性的多核苷酸,
b)编码与SEQ ID NO:8具有至少70%序列同一性的多肽,和/或
c)是能够在严格条件下与SEQ ID NO:9杂交的多核苷酸。
30.实施方案28或29的多核苷酸,其中所述多核苷酸
a)是包含、优选组成为SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的核酸序列的多核苷酸,和/或
b)编码包含、优选组成为SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的氨基酸序列的多肽。
31.一种载体,其包含实施方案28至30中任一项的多核苷酸。
32.一种宿主细胞,其包含实施方案28至30中任一项的多核苷酸和/或实施方案31的载体。
33.根据实施方案1至27中任一项的多模件多肽,根据实施方案28至30中任一项的多核苷酸,根据实施方案31的载体和/或根据实施方案32的宿主细胞,其用于医疗。
34.实施方案1至27中任一项的多模件多肽,实施方案28至30中任一项的多核苷酸,实施方案31的载体和/或实施方案32的宿主细胞,其用于治疗和/或预防不适当的补体激活和/或以不适当的补体激活作为症状的疾病。
35.实施方案1至27中任一项的多模件多肽、实施方案28至30中任一项的多核苷酸、实施方案31的载体或实施方案32的宿主细胞,其用于治疗和/或预防缺血再灌注损伤、抗体介导的移植物排斥、移植后血栓性微血管病、自身免疫性溶血性贫血、急性和迟发性溶血性输血反应、冷凝集素疾病、类风湿性关节炎、水通道蛋白-4-抗体-阳性视神经脊髓炎、CD59缺乏症、C3肾小球病、非典型或典型溶血性尿毒症综合征、阵发性夜间血红蛋白尿和年龄相关性黄斑变性。
36.实施方案1至27中任一项的多模件多肽、实施方案28至30中任一项的多核苷酸、实施方案31的载体或实施方案32的宿主细胞,其与补体蛋白C5抑制多肽,优选依库珠单抗或rEV576(coversin)组合,用于治疗和/或预防不适当的补体激活和/或以不适当的补体激活作为症状的疾病。
37.一种补体蛋白C5抑制多肽,优选依库珠单抗,其与实施方案1至27中任一项的多模件多肽、实施方案28至30中任一项的多核苷酸、实施方案31的载体或实施方案32的宿主细胞组合,用于治疗和/或预防不适当的补体激活和/或以不适当的补体激活作为症状的疾病。
38.用于同时、单独或顺序使用的组合制剂,其包含(i)实施方案1至27中任一项的多模件多肽、实施方案28至30中任一项的多核苷酸、实施方案31的载体或实施方案32的宿主细胞和(ii)补体蛋白C5抑制多肽,优选依库珠单抗或rEV576(coversin)。
39.一种用于治疗和/或预防对象中不适当的补体激活和/或以不适当的补体激活作为症状的疾病的方法,其包括施用有效剂量的实施方案1至27中任一项的多模件多肽、实施方案28至30中任一项的多核苷酸、实施方案31的载体和/或实施方案32的宿主细胞,从而治疗和/或预防所述对象中不适当的补体激活和/或以不适当的补体激活作为症状的疾病。
40.一种用于预防或减少补体激活程度的体外方法,其包括将实施方案1至28中任一项的多模件多肽应用于包含补体因子的反应混合物、组织和/或器官,从而预防或减少所述反应混合物、组织和/或器官中补体激活的程度。
41.实施方案1至27中任一项的多模件多肽、实施方案28至30中任一项的多核苷酸、实施方案31的载体和/或实施方案32的宿主细胞用于治疗和/或预防不适当的补体激活和/或以不适当的补体激活作为症状的疾病中的用途。
42.实施方案1至27中任一项的多模件多肽、实施方案28至30中任一项的多核苷酸、实施方案31的载体和/或实施方案32的宿主细胞在制备用于治疗和/或预防不适当的补体激活和/或以不适当的补体激活作为症状的疾病的药物中的用途。
43.实施方案1至27中任一项的多模件多肽,其中所述Fc受体结合模件包含与所述Fc受体结合模件的第二分子形成二硫桥的至多一个半胱氨酸残基,优选不包含形成二硫桥的半胱氨酸残基。
44.实施方案1至27或43中任一项的多模件多肽,其中所述多模件多肽形成非共价同二聚体。
在本说明书中引用的所有参考文献都参考其全部公开内容,并且在本说明书中具体提及的公开内容以引用方式并入本文中。
附图说明
图1:天然的、工程改造的和融合了Fc的构建体。(A)天然补体调节因子H(FH)和先前工程改造的FH变体miniFH结构域表示的示意图。基于编码的包括信号序列的FH序列(UniProt登录号:P08603)的氨基酸编号。每个椭圆形代表一个CCP结构域(标有结构域号)。用一个字母代码表示天然的N末端残基和C末端残基;非天然接头序列被加框。在上图突出显示CCP结构域的关键功能属性。(B)IgG分子和三个miniFH Fc融合分子的结构域结构示意图。注意,仅描绘并用箭头突出显示了多肽链间二硫键(S-S-桥)。链间二硫桥存在于miniFH-Fc和Fc-miniFH的IgG重链和轻链的恒定结构域之间,IgG的重链和重链之间。内部二硫键,即多肽链内二硫键未示出或突出显示。(C)miniFH和miniFH的三种不同Fc融合变体的SDS-PAGE凝胶分析。在还原和非还原条件下,将2μg每种蛋白质上样到Novex NuPAGE 4-12%Bis-Tris SDS-PAGE凝胶上,并通过考马斯染色法显色。
图2:测定miniFH和三种Fc融合变体在小鼠中的血浆半衰期。miniFH或三种miniFHFc融合变体的平均血浆循环水平。通过ELISA测量在由注射后指定时间收集的血液制备的血浆中蛋白质的血浆水平(0.1mg)。平均值±SD;miniFH n=3,Fc-miniFH-短n=5,所有其他n=4。
图3:miniFH和miniFH的Fc融合变体的C3b结合活性。miniFH(A)、miniFH-Fc(C)、Fc-miniFH(E)和Fc-miniFH-短(G)的C3b结合的表面等离子体共振(SPR)传感器图(在指定的浓度范围内测定;通过胺沉积4030RU的C3b)。(B)示出了miniFH(B)、miniFH-Fc(D)、Fc-miniFH(F)和Fc-miniFH-短(H)与C3b结合的拟合亲和力(1∶1稳态亲和力拟合)的各个浓度响应图。亲和平衡常数示于图中。
图4:保护兔红细胞免于补体旁路途径介导的裂解的影响。将兔红细胞在血清(来自健康供体)中孵育30分钟,该血清已与所示的补体抑制因子之一混合。在测定中最终血清浓度为25%。通过血红蛋白的释放来测量兔红细胞的裂解,并根据在水中观察到的裂解归一化(显示了3次独立测定的平均值和标准差)。
图5:融合了Fc的促衰变因子(DAF或CD55)构建体。IgG分子和两个DAF Fc融合分子的结构域结构示意图。
图6:Fc-DAF和DAF-Fc融合变体的Bb结合活性。Fc-DAF(A)、DAF-Fc(B)的Bb结合的SPR传感图。
图7:Fc-DAF和DAF-Fc融合变体的C3b结合活性。测定了Fc-DAF(A)、DAF-Fc(B)的C3b结合;(C)Fc-DAF和DAF-Fc(单次注射,浓度各为1.0μM)的C3b结合的SPR传感图。
图8:保护兔红细胞免于补体旁路途径介导的裂解的影响。将兔红细胞在血清(来自健康供体池)中孵育30分钟,该血清已与所示的补体抑制因子之一混合。在测定中最终血清浓度为25%。通过血红蛋白释放来测量兔红细胞裂解,并根据水中观察到的裂解进行归一化。
以下实施例仅用于说明本发明。无论如何,它们不应被理解为限制本发明的范围。
实施例1:重组蛋白和FH
天然存在的(全长)血浆蛋白因子H(FH)是从血浆中纯化的,并且是从商业来源CompTech(美国泰勒)购买的。重组蛋白miniFH,以及miniFH(SEQ ID NO:4)、miniFH-Fc(SEQID NO:13)、Fc-miniFH(SEQ ID NO:10)和Fc-miniFH-短(SEQ ID NO:8)的三种不同Fc融合体的生产和纯化过程如先前所述(Schmidt等人(2013),J.Immunol.190(11):5712-5721)。为了构建用于不同Fc:miniFH融合蛋白的DNA构建体,将密码子优化的(针对宿主巴斯德毕赤酵母)编码miniFH的DNA和密码子优化的(针对宿主巴斯德毕赤酵母)编码Fc部分的DNA克隆到pPICZαB毕赤酵母表达载体(Invitrogen)中。密码子优化的DNA获自GeneArt。利用特定引入的限制性酶切位点(PstI、XmaI和XbaI)消化编码Fc部分和miniFH的DNA,并以产生所需方向的方式连接到pPICZαB巴斯德毕赤酵母表达载体中(构建体概述见图1)。根据制造商的说明将表达盒转化到巴斯德毕赤酵母菌株KM71H或GS115(Invitrogen)中,并按照描述的程序(变化很小)使用发酵罐在巴斯德毕赤酵母中表达(Schmidt等人(2011),ProteinExpr.Purif.;76(2):254-263)。通过连续的阳离子交换和/或阴离子交换层析步骤,然后进行尺寸排阻层析,纯化蛋白质。预期所有重组构建体的天然氨基酸序列将以非天然序列EAEAAG(SEQ ID NO:14)、EAAG(SEQ ID NO:15)或AG(SEQ ID NO:15)开头,其中EA序列是酵母分泌信号肽加工的残余物(Cereghino等人(2000),FEMS Microbiol.Rev.24(1):45-66),AG是克隆的人工氨基酸。
实施例3:旁路途径兔红细胞溶血试验
如之前所发表的那样(Schmidt等人(2016),Immunobiology.221(4):503-511)进行测定,伴随很小的变化。简而言之,将PBS中的20μl补体抑制因子与10μl含Mg-EGTA(最终测定浓度为5mM)的NHS(CompTech)混合。加入悬浮的10μl兔红细胞(rRBC),并将混合物在37℃下孵育30分钟。为了终止反应,添加了120μl冰冷的PBS/EDTA(5mM)。通过测量100μl上清液的A405定量rRBC裂解。
实施例4:通过表面等离子体共振(SPR)监测补体Fc融合变体与C3b的结合
表面等离子体共振实验是在Reichert SR7500DC SPR仪器上,在含有0.005%吐温20的PBS中,以25μl/min的流速在25℃下进行的。将C3b的4030响应单元(RU)固定在羧甲基葡聚糖(CMD)500传感器芯片(Xantec)上,并测定与胺偶联的C3b的结合。以指定的浓度注入分析物。为了探测结合,注入一系列浓度的miniFH或miniFH Fc融合物(以25μl/min的速度持续2.5min),然后进行300s缓冲液流动和包括注入1M NaCl持续30s的再生步骤。每个系列的最高浓度注射两次以评估可重复性。在适当的情况下,通过将稳态下的响应对摩尔浓度作图,然后使用1∶1稳态亲和力模型将亲和力用TRACEDRAWER软件拟合,来提取亲和常数。始终显示减去了参考的传感图。
实施例5:小鼠血浆半衰期的测定
向BALB/c小鼠静脉内注射0.1mg分析物蛋白在无菌PBS中的溶液。必要时,在施用之前,应先从内毒素中清除所研究的蛋白质分析物,因此剂量不超过5EU内毒素/kg体重。通常,在注射蛋白质分析物后1h、2h、4h、8h、24h、30h、48h、54h和72h从尾巴中取出血液,并与相同体积的含5mM EDTA的PBS混合以终止凝血反应。通过将EDTA-血液混合物在2000g至3000g下旋转3分钟来制备血浆。将血浆在液氮中骤冷并保存在-80℃,然后再用于三明治ELISA中,以测定每个时间点小鼠血浆中分析物蛋白的水平。
为了测定小鼠血浆中的miniFH或miniFH的Fc融合形式之一,将微量滴定板(MaxiSorp;Nunc)涂上2μg/ml捕获抗体(抗人补体因子H(克隆:C18/3),储备液:1mg/ml),在PBS中以50μl/孔室温放置2h,或在4℃放置过夜。用200μl/孔PBST(PBS+0.05%吐温)洗涤两次后,在室温下以200μl/孔的1%BSA的PBS溶液(=BSA-PBS)封闭孔1h。然后,将孔暴露于鼠血浆样品或相应分析物的标准曲线样品的稀释液中,相应分析物的标准曲线样品是通过将设定浓度的分析物与未经处理的小鼠血浆混合而制备的。将样品在室温下在孔中孵育30分钟,然后用PBST(200μl)洗涤3次。然后以1∶1000的PBS-BSA(含1%BSA的PBS)溶液添加50μl山羊抗人H因子多克隆抗体(未缀合,储备液:1.0mg/ml,cat#A237,CompTech),在室温下孵育30min。然后用PBST(200μl)清洗孔3次。然后加入50μl的PBS-BSA中1∶1000溶液稀释的驴抗山羊IgG HRP(santa cruz biotechnology),在室温下孵育30分钟。用PBST(200μl)洗涤3次后,通过添加50μl新鲜制备的10ml pH4.3的0.1M柠檬酸缓冲液、5mgABTS(Roche)和10μl的30%H2O2的混合物使板显影。在405nm处读取吸光度。
实施例6:生产不同的Fc融合版miniFH
为了增加miniFH的血浆半衰期,将miniFH的多肽与IgG抗体的Fc部分融合。实现了将miniFH连接到Fc部分的三种不同方式(图1B)。首先,将miniFH的C末端与Fc部分的N末端融合,即miniFH-Fc。在第二构建体中,miniFH的N末端与Fc部分的C末端融合,即Fc-miniFH。并且在第三构建体中,miniFH的N末端也融合到Fc部分的C末端,但是这次Fc部分组成为较短的N末端序列,因此缺少IgG的重链的二硫键二聚结构域,即Fc-miniFH-短。然而,由于两个相同的CH3结构域之间的亲和力非常高的、非共价的相互作用,该构建体在生理条件下(例如可以通过尺寸排阻色谱法建立)保持稳定的二聚体。这与已公布的报告一致(Ridgway等人(1996),Protein Eng.9(7):617-621;McAuley等人(2008),ProteinSci.Publ.Protein Soc.17(1):95-106)。miniFH的所有三个Fc融合变体均可在宿主毕赤酵母中成功重组产生并纯化至高纯度(图1C)。
实施例6:miniFH与Fc部分的N末端或C末端融合导致了血浆半衰期的类似延长
为了评估Fc融合体如何影响血浆半衰期,将约0.1mg的miniFH或miniFH的三种Fc融合变体之一静脉内注射到小鼠中,通过在几个时间点收集血浆样品并分析这些样品中存在的蛋白质量来确定血浆半衰期。图2显示miniFH的β相血浆半衰期约为2.5h,而miniFH的任何Fc融合变体的β相血浆半衰期(T(1/2))均显著增加约20小时(miniFH-Fc T(1/2)=23.1h;Fc-miniFH T(1/2)=21.1h;Fc-miniFH-短(T(1/2)=16.5h)。可以确定在miniFH的三种不同Fc融合形式之间,血浆半衰期没有实质性差异。
实施例7:miniFH与Fc部分C末端的融合导致了更高的针对补体激活产物C3b的亲和力
由于任何Fc融合变体都引入二聚化作用,从而对miniFH的结合配偶体具有亲合力,因此预计所有Fc融合变体均比miniFH自身更好地结合到miniFH的主要靶标(即C3b)上。由于miniFH与其靶C3b预期具有更高亲和力的驱动因素是通过二聚作用引入亲和力,因此无法预期一种Fc融合策略会比另一种Fc融合策略产生更好的亲和力。但是,图3显示,在表面等离子体共振(SPR)实验中,两个Fc-miniFH融合变体(Fc-miniFH和Fc-miniFH-短)相比于具有不同Fc取向的变体更好地结合到C3b。因此,Fc-miniFH和Fc-miniFH-短与主要补体靶标C3b的结合是miniFH-Fc与主要补体靶标C3b的结合的三倍。对于用作参考物质的miniFH,已确定了与先前测量的相同的亲和力,从而交叉验证了SPR分析方法(Harder等人2016,J.Immunol.Baltim.Md 1950196(2):866-876)。
实施例8:miniFH与Fc部分C末端的融合还导致了人血清中更高的补体的调节活性,从而增强了细胞保护作用
然后研究了对主要补体靶标C3b的更高亲和力是否还产生增强的补体调节活性。在溶血测定中对此进行了研究,其中当人血清与兔红细胞混合时,兔红细胞通过补体的旁路途径被裂解。MiniFH-Fc、Fc-miniFH和Fc-miniFH-短与miniFH一起在此分析中进行了测试。图4显示,与miniFH-Fc相比,Fc-miniFH和Fc-miniFH-短对C3b的较高亲和力确实产生较高的补体调节活性。而且,由于由二聚作用引起的亲合力,miniFH-Fc对C3b的亲和力比miniFH略高(约两倍)。但是,与miniFH相比,这种轻微的增加并不会增加对补体旁路途径活性的更高调节力。miniFH和miniFH-Fc调节补体级联反应的活性非常相似。相反,与miniFH(或miniFH-Fc)相比,Fc-miniFH方向的Fc融合产生高约四倍的补体调节活性。因此,miniFH的N末端与Fc部分C末端的非典型融合不仅使对主要补体靶C3b的亲和力更高,而且使在人血清中的整体补体调节活性也明显提高。
实施例9:为了测试Fc-DAF和DAF-Fc融合变体的Bb结合活性(图5),每个变体在0.5μM的相同浓度用SPR进行了两次分析,以证明可重复性。通过标准胺偶联将2600RU的Bb沉积到羧甲基葡聚糖传感器芯片上。运行缓冲液为补充有1mM MgCl2和0.005%吐温20的PBS。图6仅显示减去参考的传感器图。类似地,为了测试Fc-DAF和DAF-Fc融合变体的C3b结合活性,用SPR以0.1μM的相同的浓度对每种变体进行了两次测定,以证明可重复性。通过标准胺偶联将5610RU的C3b沉积在羧甲基葡聚糖传感器芯片上。运行缓冲液为补充有1mM MgCl2和0.005%吐温20的PBS。图7仅显示减去参考的传感器图。此外,如图8所示,测试了兔红细胞免于补体旁路途径介导的裂解的保护作用。
虽然两个融合形式与Bb的结合几乎没有差异(图6),但Fc-DAF基本上与C3b结合,而DAF-Fc无法与C3b结合(图7),尽管两种蛋白在同一试验中以相同浓度进行测定。为了进一步研究与分离成分结合的这种差异是否还在血清中产生整体补体级联反应的总体调节差异,采用标准补体激活测定法,其中兔红细胞被人血清补体依赖裂解,而添加补体抑制因子可防止这种裂解的发生。该测定法证明了在结合测定法(图7)中发现的Fc-DAF和DAF-Fc之间的功能差异在细胞保护测定法(图8)中也体现为血清中总体补体调节活性的实质差异。虽然Fc-DAF在2μM时防止兔红细胞的裂解,但2μM的DAF-Fc导致几乎完全裂解。如可以从实施例9推导出的,将Fc模件N末端融合至补体激活的调节剂产生比Fc模件C末端融合更高的调节活性。
引用的非标准文献:
-Cereghino等人(2000),FEMS Microbiol.Rev.24(1):45-66。
-Harder等人(2016),J.Immunol.Baltim.Md 1950.196(2):866-876。
-Hillmen等人(2006),NEJM355(12):1233
-McAuley等人(2008),Protein Sci.Publ.Protein Soc.17(1):95-106。
-Parkin和Cohen(2001)The Lancet 357:1777-89。
-Ricklin等人(2010)Nature Immunology 11:785-797
-Ricklin等人(2017),Mol Immunol.89:10-21
-Ridgway等人(1996),Protein Eng.9(7):617-621。
-Romay-Penabad等人(2014),Lupus 23(12):1324
-Schmidt等人(2008),Clin Exp Immunol.151(1):14-24
-Schmidt等人(2011),Protein Expr.Purif.76(2):254-263。
-Schmidt等人(2013),J.Immunol.190(11):5712-5721。
-Schmidt等人(2016).Immunobiology.221(4):503-511。
-WO 2013/142362 A1
Claims (17)
1.一种多模件多肽,其包含
(i)Fc受体结合模件;
(ii)第一补体调节蛋白重复序列(CCP)模件;和
(iii)第二CCP模件,其结合到至少一个宿主细胞表面标志物、结合至补体因子C3b、结合至补体因子C4b、结合至补体因子C3b的降解产物和/或结合至补体因子C4b的降解产物;
其中所述第二CCP模件是所述Fc受体结合模件和所述第一CCP模件的C末端。
2.根据权利要求1所述的多模件多肽,其中所述第一CCP模件(i)是针对补体激活的经典途径和/或旁路途径的转化酶的转化酶促衰变模件,和/或(ii)是针对补体因子C3b和/或C4b的结合模件,所述第一CCP模件优选还具有因子I辅助因子活性。
3.根据权利要求1或2所述的多模件多肽,其中所述第一CCP模件包含因子H的CCP结构域1至4,优选人因子H的CCP结构域1至4;包含1型补体受体(CR1)的CCP结构域1至3,优选人CR1的CCP结构域1至3;包含促衰变因子(DAF)的CCP结构域1至4,优选人DAF的CCP结构域1至4,和/或包含C4结合蛋白(C4BP)的CCP结构域1至3,优选人C4BP的CCP结构域1至3。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多模件多肽,其中所述第一CCP模件包含、优选组成为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与其具有至少70%同一性的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的多模件多肽,其中所述第二CCP模件结合至包括唾液酸、糖胺聚糖和/或补体因子C3b或其降解产物的聚阴离子碳水化合物。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的多模件多肽,其中所述第二CCP模件包含因子H的CCP结构域19至20,优选人因子H的CCP结构域19至20。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的多模件多肽,其中所述第二CCP模件包含、优选组成为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与其具有至少70%同一性的氨基酸序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的多模件多肽,其中所述Fc受体结合模件是IgG的Fc模件,优选IgG1的Fc模件。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的多模件多肽,其中所述Fc受体结合模件包含与所述Fc受体结合模件的第二分子形成二硫桥的至多一个半胱氨酸残基,优选不包含形成二硫桥的半胱氨酸残基。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的多模件多肽,其中所述多模件多肽形成非共价同二聚体。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的多模件多肽,其中所述Fc受体结合模件包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:3或与其具有至少70%同一性的序列的肽,优选包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:3的肽。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的多模件多肽,其中包含所述第一CCP模件和所述第二CCP模件一起作为mini-FH,所述mini-FH包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:7之一的氨基酸序列或与至少一个所述序列具有至少70%同一性的序列,优选包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7之一的氨基酸序列。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的多模件多肽,其中所述多模件多肽包含、优选组成为SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或与其具有至少70%同一性的氨基酸序列。
14.一种多核苷酸,其编码根据权利要求1至13中任一项所述的多模件多肽。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的多模件多肽和/或根据权利要求14所述的多核苷酸,其用于医疗,优选用于治疗和/或预防不适当的补体激活和/或以不适当的补体激活作为症状的疾病。
16.根据权利要求15之用途的所述多模件多肽和/或多核苷酸,其中所述以不适当的补体激活作为症状的疾病是缺血再灌注损伤、抗体介导的移植物排斥、移植后血栓性微血管病、自身免疫性溶血性贫血、急性和迟发性溶血性输血反应、冷凝集素疾病、类风湿性关节炎、水通道蛋白-4-抗体-阳性视神经脊髓炎、CD59缺乏症、C3肾小球病、非典型或典型溶血性尿毒综合征、阵发性夜间血红蛋白尿和/或年龄相关性黄斑变性。
17.一种用于预防或减少补体激活程度的体外方法,其包括将根据权利要求1至13中任一项所述的多模件多肽应用于包含补体因子的反应混合物、组织和/或器官,从而预防或减少所述反应混合物、组织和/或器官中补体激活的程度。
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