KR20190039090A

KR20190039090A - 보체 억제제 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20190039090A
Application number: KR1020197002195A
Authority: KR
Inventors: 크리스토프 슈미트; 후베르트 슈레첸마이어; 마르쿠스 안리커; 브리타 회흐스만
Original assignee: 우니베르시테트 울름
Priority date: 2016-06-28
Filing date: 2017-06-28
Publication date: 2019-04-10
Also published as: CA3029106A1; IL263949A; ES2925466T3; MX2019000059A; US20190202878A1; DK3474883T3; JP7068203B2; CN109689084A; EP3474883A1; WO2018002131A1; EP3474883B1; AU2017289214B2; KR102566634B1; AU2017289214A1; PL3474883T3; JP2019523238A

Abstract

본 발명은 (i) 고전적 및 대체 보체 활성화 경로의 컨버타제에 대한 컨버타제 붕괴 촉진 도메인인 제1 보체 제어 단백질 반복부 (CCP)-포함 도메인, (ii) 숙주 세포 인식 도메인, 및 (iii) 보조인자 활성을 갖는 제2 CCP-포함 도메인을 포함하는 다중-도메인 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상기 다중-도메인 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 상기 폴리뉴클레오티드 및/또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한, 및 부적절한 보체 활성화 및/또는 증상으로서 부적절한 보체 활성화를 보이는 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한, 다중-도메인 폴리펩티드, 폴리펩티드, 및 벡터에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 다중-도메인 폴리펩티드, 폴리펩티드, 및 벡터와 관련된 방법 및 용도에 관한 것이다.

Description

보체 억제제 및 그의 용도

면역계는 두 분야: 계통 발생적으로 더 오래된 선천 면역 및 적응 면역 반응으로 나뉠 수 있다. 전형적으로는 적응, 또는 후천성 면역계에 의한 면역 반응이 선천 면역 반응보다 더 특이적이다. 적응 면역계의 다른 특징은 면역 기억의 발생, 및 항원 노출과 최대 면역 반응 사이의 전형적으로 관찰되는 지연이다.

선천 면역계는 심지어 원시 유기체에서도 고도로 보존된다. 상기 분야의 세포 이펙터는 주로 호중구, 단핵구 및 대식세포를 포함하는 반면, 가용성 선천 면역 이펙터는 급성기 단백질 또는 포어 형성 펩티드와 같은 다른 이펙터에 더하여 보체계로 주로 이루어진다 (Parkin & Cohen (2001) The Lancet 357: 1777-89). 보체계는 혈청 중 열불안정 성분으로 이루어져 있으며, 이는 박테리아에 대한 항체 반응을 "보완한다"고 파울 에를리히(Paul Ehrlich)에 의해 기술되었다. 보체계의 다른 기능은 포식 세포에 의한 흡수를 통한 미생물 침입자, 면역 복합체, 파편, 아폽토시스성 및 괴사성 세포의 효과적인 제거를 지원하는 상기 미생물 침입자, 면역 복합체, 파편, 아폽토시스성 및 괴사성 세포의 옵소닌화이다 (Ricklin et al. (2010) Nature Immunology 11: 785-797). 보체계는 3개의 활성화 경로: 고전적 (CP), 렉틴 (LP) 및 대체 경로 (AP)로 조직화된다.

CP의 활성화는 전형적으로, 패턴 인식 분자 (PRM)로서 작용하는 보체 성분 C1q를 통해 항체에 의존하는 방식으로 달성된다. 연속되는 단백질분해 활성화 이벤트 후, CP C3-컨버타제 (C4bC2a)는 3개의 보체 활성화 경로 모두에 중심이 되는 보체 성분 C3을 C3a, 아나필라톡신 및 C3b (옵소닌)로 절단한다. 상기 절단에 기인하여, 입체형태적 변화가 일어나고, 이전의 내부 티오에스테르 결합이 C3b의 단백질 표면에 도달하게 된다. 이러한 활성을 갖는 티오에스테르 결합은 단기간 노출되고 나면, 세포 표면 상에 국재화된 히드록실 기 및 아미노 기에 공유적으로 결합할 수 있거나, 또는 물에 의해 용해 ("켄칭")될 수 있다. 그 결과, C3-컨버타제가 하향 조절되지 않을 경우, 다수의 C3b 분자와 함께 세포의 옵소닌화가 발생할 수 있다. 대량의 C3b 분자 생산은 C5 컨버타제에 의한 C5 활성화를 촉진시킨다. C5-컨버타제는 C5를 C5a (가장 강력한 아나필라톡신) 및 C5b로 절단하고, 이는 보체 인자 C6-9를 동원하여, 세포 막 중의 홀을 어셈블리하여 용해 및 사멸하는 막 공격 복합체 (MAC)를 형성한다.

렉틴 경로 (LP)는 CP와 유사하게 조직화된다. 활성화는 병원체 연관 분자 패턴 (PAMP) 또는 위험 연관 분자 패턴 (DAMP) 인식을 통해 이루어진다. LP 내에서, PAMP 및 DAMP는 C1q (CP의 패턴 인식 분자)와 상동성인 여러 패턴 인식 분자: 만노스 결합 렉틴 (MBL) 및 다양한 유형의 콜렉틴 및 피콜린에 의해 검출될 수 있다. PAMP 또는 DAMP에 이어서, 결합 MBL에서는 입체형태적 변화가 일어난 후, 이어서, MBL 회합 세린 프로테아제 (MASP)와 회합하게 된다. MBL은 구조상 상동성이고, C1q에 기능한다. CP와 유사하게, MASP2는 단백질분해적으로 C2를 C2a 및 C2b로, 및 C4를 C4a 및 C4b로 활성화시킨다. 활성화된 성분은, CP와 동일하고, C3을 C3a 및 C3b로 절단하는, LP의 C3 컨버타제 C4bC2a를 구성할 수 있다. CP와 유사하게, C3 컨버타제의 엄격한 조절이 없을 경우, 더 많은 C3b 분자가 생산되고, 이는 C5 컨버타제를 통해 C5를 활성화시키게 된다. C5의 단백질분해 활성화는, C5b가 MAC 형성을 개시하는 말단 및 용해 보체 경로의 출발점이다.

대체 경로는 낮은 수준으로 자기 활성화 프로세스를 통해 활성화된다. 이러한 프로세스는 C3의 "틱-오버(tick-over)" 활성화로 불린다. C3 분자는 내재적으로 대사가능한 입체형태를 가질 수 있다. 항상, 소량의 C3 분자가 자발적인 입체형태적 변화 (활성화)를 겪게 되고, 이는 이전의 내부 티오에스테르 도메인을 노출시킨다. 티오에스테르에 의해 켄칭될 수 있거나, 또는 세포 표면 상의 뉴클레오필에 (자기인지 또는 외부인지에 대한) 분별없이 부착될 수 있다. 상기 "자기 활성화된" C3은 C3(H₂O)으로 명명되고, 이는 C3b 분자와 구조적으로 유사하다. C3b 또는 C3(H₂O)는 C3 중에 은닉된 새로운 단백질 표면을 노출시킨다. 이들 새 표면은 AP의 또 다른 보체 인자인 인자 B에 결합한다. 인자 B가 C3b 또는 C3(H₂O)에 결합되면, 프로테아제 인자 D에 의해 Ba 및 Bb로 절단될 수 있다. Bb는 C3(H₂O) (또는 C3b)에 결합된 상태 그대로 유지되고, AP의 C3 컨버타제인 C3bBb를 구성한다. CP 및 LP C3 컨버타제와 유사하게, C3bBb는 C3을 절단함으로써 C3b 및 C3a 분자를 생산할 수 있다. AP의 양성 조절인자인 단백질 프로페르딘(Properdin)은 AP C3 컨버타제의 단백질-단백질 상호작용을 안정화시킴으로써 중요한 역할을 한다. 대체, 고전적 또는 렉틴 경로에 의해 조절되는 임의의 C3b는 조절되지 않을 경우, AP의 더 많은 C3 컨버타제를 구성할 수 있고, 추가로, 양성 피드백 루프에서 생산되는 C3b 분자의 개수를 증폭시킬 수 있다. 이러한 단계는 AP의 "증폭 루프"로 명명된다. 따라서, 3가지 활성화 경로는 C3 활성화 수준으로 모여지며, 조절되지 않을 경우, MAC 형성으로 축적된다.

고전적 및 렉틴 경로는 병원체 또는 내인성 위험 분자의 감지를 통해 특이적으로 활성화될 때까지 불활성이다. 그에 반해, AP는 항상 낮은 수준으로 활성을 갖고, C3b (또는 초기에 C3(H₂O)) 분자를 분별없이 생산한다. 보체계 내에서 10개 초과의 상이한 조절 단백질이 공지되어 있다. 일부 조절인자는 바로 CP 및 LP를 개시시키는 수준에서 억제시키지만, 가장 엄격하게 제어되는 캐스케이드 부분은, 활성화 신호의 증폭제로서 작용하는 컨버타제, 및 C3-, 및 염증성 C5-컨버타제를 형성하는 플랫폼을 구성하는 C3b이다. 용해 MAC를 특이적으로 제어하는 일부 조절인자도 또한 존재한다.

조절 단백질은 C3-컨버타제를 탈안정화시키고, 컨버타제의 보다 빠른 붕괴를 유도하는 붕괴 촉진제로 나누어질 수 있다. 추가 군은 C3b 또는/및 C4b를 분해하는 단백질, 예컨대, 인자 H 및 인자 I를 포함하고; 가용성 프로테아제 인자 I에 의한 비특이적인 분해를 방지하기 위해, C3b 또는 C4b를 불활성화시키기 위해서는 표적에 결합하고, 인자 I를 동원하는 보조인자 단백질 (예컨대, FH 또는 CR1)이 반드시 존재하여야 한다. 추가의 조절인자 군은 MAC의 형성을 억제시킨다.

다수의 질환, 특히, 유전병은 보체의 기능이상, 특히, 보체의 과다활성화와 연관이 있다. 따라서, 보체계의 인공 조절인자를 제공하기 위한 노력으로, 보체 단백질 C5에 특이적으로 결합하고, 말단 활성화를 억제시키는 모노클로날 항체인 에쿨리주맙이 개발되었다 (Hillmen et al. (2006), NEJM355(12):1233). 유사 개발 라인으로, C5 억제성 단백질 rEV576 (코베르신)이 개발되었다 (Romay-Penabad et al., (2014), Lupus 23(12):1324). 추가로, 링커를 통해 보체 인자 H의 보체 제어 단백질 반복부 (CCP) 1-4 및 19-20을 연결하는, "미니-FH"로 불리는 단백질을 수득하였지만 (WO 2013/142362 A1); 후자의 것은 오직 대체 경로만을 억제시킨다.

따라서, 관련 기술분야에서는 선행 기술의 단점을 피하는 개선된 보체 억제제가 요구되고 있다. 상기 문제는 본원에 개시된 수단 및 방법에 의해 해결된다.

따라서, 본 발명은

(i) 고전적 및 대체 보체 활성화 경로의 컨버타제에 대한 컨버타제 붕괴 촉진 도메인인 제1 보체 제어 단백질 반복부 (CCP)-포함 도메인,

(ii) 숙주 세포 인식 도메인, 및

(iii) 제2 CCP-포함 도메인

을 포함하는 다중-도메인 폴리펩티드에 관한 것이다.

또한, 본 발명은

(i) 보체 수용체 1형 (CR1)의 보체 제어 단백질 반복부 (CCP) 1 내지 3과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/거나, 붕괴 촉진 인자 (DAF)의 CCP 1 내지 4와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 CCP-포함 도메인,

(ii) 보체 인자 H의 CCP 6 내지 8과, 또는 CCP 19 내지 20과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 숙주 세포 인식 도메인, 및

(iii) CR1의 CCP 8 내지 10과, 및/또는 CCP 15 내지 17과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 CCP-포함 도메인

을 포함하는 다중-도메인 폴리펩티드에 관한 것이다.

하기에서 사용되는 바, "갖다," "포함하다(comprise)" 또는 "포함하다(include)"라는 용어 또는 그의 임의의 임의적 문법상의 파생어가 비배타적인 방식으로 사용된다. 따라서, 상기 용어는 이들 용어에 의해 도입되는 특징 이외의 추가 특징은 이러한 문맥에 기술된 엔티티에 존재하지 않는 상황, 및 하나 이상의 추가 특징이 존재하는 상황, 둘 모두를 지칭할 수 있다. 예로서, "A가 B를 갖다, "A가 B를 포함하다(comprise)," 및 "A가 B를 포함하다(include)"라는 표현은, B 이외의 다른 요소는 A에 존재하지 않는 상황 (즉, A는 단독으로 및 배타적으로 B로만 이루어지는 상황), 및 B 이외에도, 예컨대, 요소 C, 요소 C 및 D, 또는 보다 추가의 요소와 같은, 하나 이상의 추가 요소가 엔티티 A에 존재하는 상황, 이 둘 모두를 지칭할 수 있다.

추가로, 하기에서 사용되는 바, "바람직하게는", "보다 바람직하게는", "가장 바람직하게는", "특히", "보다 특히", "구체적으로", "보다 구체적으로"라는 용어 또는 유사 용어는 추가의 가능성을 한정하지 않으면서, 임의적 특징과 함께 사용될 수 있다. 따라서, 이들 용어에 의해 도입되는 특징은 임의적인 특징이며, 어느 방식으로든 특허청구범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 통상의 기술자가 알고 있는 바와 같이, 본 발명은 대안적 특징을 이용하여 수행될 수 있다. 유사하게, "본 발명의 한 실시양태에서" 또는 유사 표현에 의해 도입되는 특징은 본 발명의 추가의 실시양태에 관한 어떤 한정도 없이, 본 발명의 범주에 관한 어떤 한정도 없이, 및 그러한 방식으로 도입된 상기 특징을 본 발명의 다른 임의적 또는 비-임의적 특징과 함께 조합할 수 있는 가능성에 관한 어떤 한정도 없이, 임의적 특징인 것으로 의도된다. 또한, 달리 명시되지 않는 한, "약"이라는 용어는 관련 분야에서 일반적으로 용인되는 기술적 정확성을 갖는 명시된 값에 관한 것이고, 바람직하게는 명시된 값 ± 20%, 보다 바람직하게는 ± 10%, 가장 바람직하게는 ± 5%에 관한 것이다.

관련 기술분야에서는 "CCP," "짧은 보체 유사 반복부," "짧은 컨센서스 반복부" 또는 "SCR"로도 지칭되는, "보체 제어 단백질 반복부"라는 용어는 이론적으로 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예컨대, 문헌 [Schmidt et al. (2008), Clin Exp Immunol.151(1):14-24)]에서 검토되었다. CCP는, 2개의 이황화 결합을 형성하는 4개의 보존되는 시스테인 잔기 및 보존되는 트립토판과, 나머지 아미노산은 상당부 서열 변이를 보이는 것을 포함하는, 대략 60 내지 70개의 아미노산을 포함하는 펩티드 서열이다. 보체 단백질 C3b 및/또는 C4b에의 결합 이외에도, CCP는 본원 하기에서 언급되는 바와 같이, 붕괴 촉진 활성 및 인자 I 보조인자 활성을 비롯한 추가 활성을 매개하는 것으로 밝혀졌다.

본원에서 사용되는 바, "제1 CCP-포함 도메인"이라는 용어는 고전적 및 대체 보체 활성화 경로의 컨버타제에 대한 컨버타제 붕괴 촉진 도메인인, 본원에서 언급된 바와 같은 다중-도메인 폴리펩티드의 도메인에 관한 것이다. 따라서, 바람직하게는 제1 CCP-포함 도메인은 대체 보체 활성화 경로 및 고전적 보체 활성화 경로, 둘 모두의 C3 컨버타제에 대하여 붕괴 촉진 활성을 갖는 적어도 하나의 CCP를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "붕괴 촉진 활성"이라는 용어는 대체 보체 활성화 경로의 C3 컨버타제, 즉, C3bBb의, 및/또는 고전적 보체 활성화 경로의 C3 컨버타제, 즉, C4bC2a의 붕괴, 바람직하게는 불활성화를 매개하는 CCP 또는 CCP-포함 도메인의 특성에 관한 것이다. 바람직하게는 CCP의 붕괴 촉진 활성은 본원 실시예에서 언급되는 바와 같이, 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 측정된다. 바람직하게는 제1 CCP-포함 도메인은 상기 언급된 활성을 갖거나, 또는 그에 기여하는 2 내지 10개, 바람직하게는 2 내지 5개, 보다 바람직하게는 3 내지 4개의 CCP로 구성된다. 바람직하게는 제1 CCP-포함 도메인은 본원 하기에서 언급되는 바와 같이, 보체 수용체 1형 (CR1)의, 바람직하게는 인간 CR1의 CCP 1 내지 3을 포함하고/거나; 본원 하기에서 언급되는 바와 같이, 붕괴 촉진 인자 (DAF), 바람직하게는 인간 DAF의 CCP 1 내지 4를 포함한다. 바람직하게는 제1 CCP-포함 도메인은 자연적으로 발생된 서열에서와 같이, 보체 수용체 1형 (CR1)의 CCP 1 내지 3을 포함하고/거나; 자연적으로 발생된 서열에서와 같이, 붕괴 촉진 인자 (DAF)의 CCP 1 내지 4를 포함한다.

바람직하게는 제1 CCP-포함 도메인은 서열식별번호(SEQ ID NO) 1에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호 1과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95% 동일하고, 고전적 및 대체 보체 활성화 경로의 컨버타제에 대한 컨버타제 붕괴 촉진 도메인의 활성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 그로 이루어진다. 보다 바람직하게는 제1 CCP-포함 도메인은 서열식별번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 그로 이루어진다. 또한, 바람직하게는 제1 CCP-포함 도메인은 바람직하게는 서열식별번호 2에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호 2와 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95% 동일하고, 고전적 및 대체 보체 활성화 경로의 컨버타제에 대한 컨버타제 붕괴 촉진 도메인의 활성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 보다 바람직하게는 제1 CCP-포함 도메인은 서열식별번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 그로 이루어진다.

바람직하게는 제1 CCP-포함 도메인은 보체 인자 C3b 및/또는 C4b에 대한 결합 활성을 갖는 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 보다 바람직하게는 적어도 3개의 CCP를 포함한다. 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 보체 인자 C3b 및/또는 C4b에 대한 결합 활성을 갖는 하나 이상 CCP는 상기 언급된 바와 같은 붕괴 촉진 활성을 갖는 CCP 또는 CCP들과 상이한 CCP일 수 있고; 바람직하게는 보체 인자 C3b 및/또는 C4b에 대한 결합 활성을 갖는 CCP(들)는 상기 언급된 바와 같은 붕괴 촉진 활성을 갖는 CCP(들)이다. "보체 인자 C3b 및/또는 C4b에 대한 결합 활성"이라는 용어는 통상의 기술자에 의해 이해된다. 바람직하게는 상기 용어는 측정가능한 친화도로 보체 단백질 C3b 및 C4b 중 적어도 하나에 결합하는, 제1 CCP-포함 도메인 및/또는 그의 CCP 중 적어도 하나의 특성에 관한 것이다. 바람직하게는 CCP 또는 CCP-포함 도메인의 C3b 또는 C4b에의 결합 친화도는 본원 실시예에서 언급되는 바와 같이 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 측정된다.

"보체 수용체 1형" 또는 "CR1"이라는 용어는 이론상, C3b/C4b 수용체 또는 분화 클러스터 35 단백질 (CD35)로도 또한 공지된, 보체 활성화 조절인자 (RCA) 패밀리 단백질의 구성원에 관한 것으로 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 바람직하게는 CR1은 포유동물 CR1이고, 보다 바람직하게는 CR1은 인간 CR1이다. 가장 바람직하게는 CR1은 진뱅크 수탁 번호(Genbank Acc. No.) P17927.3 GI:290457678로 지정된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 인간 CR1이다.

"붕괴 촉진 인자" 또는 "DAF"라는 용어 또한 이론상, 분화 클러스터 55 단백질 (CD55)로도 또한 공지된, 보체계의 세포 표면-결합 조절인자에 관한 것으로 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 바람직하게는 DAF는 포유동물 DAF, 보다 바람직하게는 인간 DAF이다. 가장 바람직하게는 DAF는 진뱅크 수탁 번호 P08174.4 GI:60416353로 지정된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 인간 DAF이다.

본원에서 사용되는 바, "제2 CCP-포함 도메인"이라는 용어는 적어도 하나의 CCP를 포함하는 다중-도메인 폴리펩티드의 도메인에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 제2 CCP-포함 도메인은 상기 제1 CCP-포함 도메인과 바로 인접해 있지 않고, 즉, 상기 제2 CCP-포함 도메인은 인접한 연속 펩티드 결합에 의해 상기 제1 CCP-포함 도메인에 연결되어 있지 않거나, 또는 바람직하게는 상기 제1 및 제2 CCP-포함 도메인은 C3b에도, C4b에도 결합 활성을 갖지 않는 도메인에 의해 분리되어 있다. 따라서, 바람직하게는 다중-도메인 폴리펩티드가 융합 폴리펩티드인 경우, 제1 및 제2 CCP-포함 도메인은 바람직하게는 적어도 숙주 세포 인식 도메인에 의해 분리되어 있다. 바람직하게는 제2 CCP-포함 도메인은 바람직하게는 하기 기술되는 바와 같은 활성을 갖거나, 또는 그에 기여하는 2 내지 10개, 바람직하게는 2 내지 5개, 보다 바람직하게는 3 내지 4개의 CCP로 구성된다. 바람직하게는 제2 CCP-포함 도메인은 본원 상기에서 언급된 바와 같이, CR1의, 바람직하게는 인간 CR1의 CCP 8 내지 10, 및/또는 15 내지 17을 포함한다. 보다 바람직하게는 제2 CCP-포함 도메인은 CR1의, 바람직하게는 인간 CR1의 CCP 15 내지 17을 포함한다. 보다 더 바람직하게는 제2 CCP-포함 도메인은 서열식별번호 3에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호 3과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95% 동일하고, 본원 하기에서 기술되는 바와 같은 인자 I 보조인자 활성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 그로 이루어진다. 가장 바람직하게는 제2 CCP-포함 도메인은 바람직하게는 서열식별번호 3에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다.

바람직하게는 제2 CCP-포함 도메인은 보체 인자 C3b 및/또는 C4b에 대한 결합 활성을 갖고, 바람직하게는 인자 I 보조인자 활성을 추가로 갖는, 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 보다 바람직하게는 적어도 3개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 CCP를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "인자 I 보조인자 활성"이라는 용어는 C3b 및/또는 C4b에 결합하고, 인자 I에 의한 상기 C3b 및/또는 C4b의 단백질분해성 분해를 매개하는 화합물, 바람직하게는 CCP 또는 CCP-포함 도메인의 특성에 관한 것이다. 바람직하게는 인자 I 보조인자 활성은 본원 실시예에 명시된 바와 같이 측정된다.

본원에서 사용되는 바, "숙주 세포 인식 도메인"이라는 용어는 숙주 세포 표면 마커, 바람직하게는 시알산 및/또는 글리코사미노글리칸을 포함하는 폴리음이온 탄수화물에의 결합 활성을 갖고/거나, 보체 인자 C3b 분해 생성물에의, 바람직하게는 iC3b 및/또는 C3dg 또는 C3d에의 결합 활성을 갖는, 다중-도메인 폴리펩티드의 도메인에 관한 것이다. 바람직하게는 숙주 세포 인식 도메인은 숙주 세포 표면 마커, 바람직하게는 시알산 및/또는 글리코사미노글리칸을 포함하는 폴리음이온 탄수화물에의 결합 활성을 갖고/거나, 보체 인자 C3b 분해 생성물에의, 바람직하게는 iC3b 및/또는 C3dg 또는 C3d에의 결합 활성을 갖는, 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개의 CCP를 포함한다. 바람직하게는 숙주 세포 인식 도메인은 본원 상기에서 언급된 바와 같이, 보체 인자 H, 바람직하게는 인간 보체 인자 H의 CCP 6 내지 8 및/또는 19 내지 20을 포함한다. 보다 바람직하게는 숙주 세포 인식 도메인은 서열식별번호 4에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호 4와 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95% 동일하고, 바람직하게는 숙주 세포 표면 마커, 바람직하게는 시알산 및/또는 글리코사미노글리칸을 포함하는 폴리음이온 탄수화물에의 결합 활성을 갖고/거나, 보체 인자 C3b 분해 생성물에의, 바람직하게는 iC3b 및/또는 C3dg에의 결합 활성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 그로 이루어진다. 보다 바람직하게는 숙주 세포 인식 도메인은 서열식별번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 그로 이루어진다. 바람직하게는 CCP의, 또는 숙주 세포 인식 도메인의 숙주 세포 표면 마커에의 결합 활성 및 보체 인자 C3b 분해 생성물에의 결합 활성은 본원 실시예에서 언급되는 바와 같이 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 측정된다.

본 명세서에서 사용되는 바, "다중-도메인 폴리펩티드"라는 용어는 본원 하기에서 언급되는 바와 같은 적어도 폴리펩티드 도메인을 포함하는 임의의 화학 분자에 관한 것이다. 도메인 사이의 화학적 연결이 반드시 펩티드 결합일 필요는 없다는 것을 이해하여야 한다. 도메인 사이의 화학 결합은 에스테르 결합, 이황화 결합, 또는 통상의 기술자에게 공지된 임의의 다른 적합한 공유 화학 결합이라는 것이 본 발명에 의해서 이 또한 구상된다. 도메인이 단지 무시할 수 있는 정도로 다른 도메인으로부터 해리되는 정도로 낮은 해리 상수를 갖는 비공유 결합 또한 구상된다. 바람직하게는 상기 비공유 결합에 대한 해리 상수는 10^- ⁵ mol/l 미만 (Strep-Tag:Strep-Tactin 결합인 경우와 같이), 10^- ⁶ mol/l 미만 (Strep-TagII:Strep-Tactin 결합인 경우와 같이), 10^- ⁸ mol/l 미만, 10^- ¹⁰ mol/l 미만, 또는 10^-12 mol/l 미만 (스트렙트아비딘:비오틴 결합인 경우와 같이)이다. 해리 상수를 측정하는 방법은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 예컨대, 분광 적정 방법, 표면 플라스몬 공명 측정, 평형 투석 등을 포함한다. 추가로, 다중-도메인 폴리펩티드의 도메인 사이의 결합이 간접 결합인 것, 예컨대, 도메인이 비오틴에 대하여 친화성을 갖는 태그를 포함하고, 비오틴 모이어티를 포함하는 추가의 분자 또는 입자에 결합되는 것 또한 구상된다. 바람직하게는 도메인 사이의 화학적 연결은 펩티드 결합이고, 즉, 바람직하게는 다중-도메인 폴리펩티드는 본 발명의 도메인을 포함하거나, 또는 그로 이루어진 융합 폴리펩티드이다. 바람직하게는 다중-도메인 폴리펩티드 중 적어도 2개의 도메인은 링커 펩티드에 의해 연결된다. 적합한 링커 펩티드는 이론상 관련 기술분야에 공지되어 있다. 바람직한 링커 펩티드는 글리신 및/또는 프롤린 잔기를 포함하거나, 또는 바람직하게는, 그로 이루어진다. 보다 바람직하게는 링커 펩티드는 폴리-글리신 링커 펩티드이다. 가장 바람직하게는 링커 펩티드, 특히, 본원 다른 곳에서 언급된 바와 같은, 제1 CCP-포함 도메인 및 숙주 세포 인식 도메인을 연결하는 링커 펩티드는 14 또는 15개의 글리신 잔기을 포함하고, 바람직하게는, 그로 이루어진 링커이다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 본원에 기술된 바와 같은 성분으로 이루어진다.

바람직하게는 폴리펩티드, 특히, 다중-도메인 폴리펩티드, 및/또는 도메인, 특히, CCP-포함 도메인에 대한 언급은 본원에 기술된 구체적인 폴리펩티드 및 도메인의 변이체를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "폴리펩티드 변이체" 및 "도메인 변이체"라는 용어는 적어도 본원에서 언급된 바와 같은 도메인 또는 도메인들을 포함하지만, 명시된 상기 폴리펩티드 또는 도메인과는 구조가 다른 임의의 화학 분자에 관한 것이다. 바람직하게는 폴리펩티드 변이체 또는 도메인 변이체는 본원에서 언급된 바와 같은 폴리펩티드 또는 도메인에 포함된 25 내지 500개의, 보다 바람직하게는 30 내지 300개의, 가장 바람직하게는 35 내지 150개의 연속된 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함한다. 추가로, 본 발명에 따라 언급된 바와 같은 폴리펩티드 변이체 또는 도메인 변이체는 적어도 하나의 아미노산 치환, 결실, 및/또는 부가로 인해 상이한 아미노산 서열을 가져야 하며, 여기서, 변이체의 아미노산 서열은 여전히, 바람직하게는 특정 폴리펩티드 또는 도메인의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다는 것을 이해하여야 한다. 두 아미노산 서열 사이의 동일성 정도는 관련 기술분야에 널리 공지된 알고리즘에 의해 측정될 수 있다. 바람직하게는 동일성 정도는 비교창에 걸쳐 최적으로 정렬된 두 서열을 비교함으로써 측정되어야 하며, 여기서, 비교창 내의 아미노산 서열의 단편은 최적의 정렬을 위하여, 그의 비교 대상이 되는 서열과 비교하였을 때, 부가 또는 결실 (예컨대, 갭 또는 오버행)을 포함할 수 있다. 백분율(%)은 바람직하게는 전장의 펩티드 상의, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 잔기가 존재하는 위치의 개수를 측정하여 매칭되는 위치의 개수를 얻고, 매칭되는 위치의 개수를 비교창 내 위치의 총 개수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율(%)을 얻음으로써 계산된다. 비교를 위한 최적의 서열 정렬은 스미쓰(Smith) 및 워터만(Waterman) (1981)의 국부 상동성 알고리즘에 의해, 니들만(Needleman) 및 운치(Wunsch) (1970)의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 피어슨(Pearson) 및 립만(Lipman) (1988)의 유사성 검색 방법에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터에 의한 실행 (제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group: 미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package) 내의 GAP, BESTFIT, BLAST, PASTA, 및 TFASTA), 또는 시각적 검사에 수행될 수 있다. 비교를 위해 두 서열을 확인한다는 것을 고려해 볼 때, 그의 최적의 정렬, 및 따라서, 동일성 정도를 측정하는 데에는 바람직하게는 GAP 및 BESTFIT가 사용된다. 바람직하게는 갭 가중치에 대해 5.00 및 갭 가중 길이에 대해 0.30인 디폴트 값이 사용된다. 상기 언급된 폴리펩티드 변이체 또는 도메인 변이체는 대립유전자 변이체 또는 임의의 다른 종 특이적인 호몰로그, 파라로그, 또는 오솔로그로부터 유도될 수 있다. 추가로, 본원에서 언급된 폴리펩티드 변이체는 특정 폴리펩티드의 단편 또는 상기 언급된 유형의 변이체를 포함하는데, 이는 상기 단편 및/또는 변이체가 상기 언급된 바와 같은 도메인을 포함하는 한, 그러하다. 상기 단편은 예컨대, 폴리펩티드의 분해 생성물 또는 스플라이스 변이체일 수 있거나, 또는 그로부터 유도된 것일 수 있다. 비천연 아미노산을 포함함으로써, 및/또는 펩티도미메틱스가 되도록 만듦으로써, 번역 후 변형, 예컨대, 인산화, 글리코실화, 유비퀴티닐화, 수모화, 또는 미리스틸화에 기인하여 상이한 변이체도 추가로 포함된다.

본원에서 사용되는 바, "X와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 도메인"이라는 용어는 X와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 갖는, 상기 언급된 바와 같은 X의 변이체를 포함하는 도메인에 관한 것이다. 바람직하게는 X와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 도메인은 보다 바람직하게는 본원에서 언급된 바와 같이, X의 활성을 갖는 X의 변이체이다.

따라서, 바람직하게는 본 발명의 다중-도메인 폴리펩티드 및 그의 변이체는 보체 활성화의 억제제의 활성을 갖고, 즉, 바람직하게는 시험관내 및/또는 생체내에서 보체 반응을 억제시키는 활성을 갖는다. 바람직하게는 다중-도메인 폴리펩티드 및 그의 변이체는 적어도 2개, 보다 바람직하게는 3개의 보체계 활성화 경로 모두를 억제시키는 활성을 갖는다. 보다 바람직하게는 다중-도메인 폴리펩티드 및 그의 변이체는 적어도 대체 보체 활성화 경로 및 고전적 보체 활성화 경로를 억제시키는 활성을 갖고, 바람직하게는 적어도 대체 보체 활성화 경로, 고전적 보체 활성화 경로, 및 렉틴 보체 활성화 경로를 억제시키는 활성을 갖는다.

바람직하게는 다중-도메인 폴리펩티드는 인접 폴리펩티드 서열로서 그의 도메인 중 적어도 2개를 포함하고, 바람직하게는 그의 도메인 3개 모두를 포함하고, 즉, 다중-도메인 폴리펩티드는 바람직하게는 상기 3개의 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 바람직하게는 이론상, 3개의 도메인은 통상의 기술자에 의해 적절한 것으로 간주되는 임의 순서로 상기 융합 폴리펩티드에 포함될 수 있다. 보다 바람직하게는 다중-도메인 폴리펩티드는 상기 도메인을 N-말단, 제1 CCP-포함 도메인, 숙주 세포 인식 도메인, 제2 CCP-포함 도메인, C-말단 순서로 포함한다. 보다 더 바람직하게는 다중-도메인 폴리펩티드는 서열식별번호 5 또는 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 그로 이루어지거나, 또는 본원 상기에서 언급된 바와 같은 그의 변이체이고, 여기서, 바람직하게는 상기 변이체는 상기에서 언급된 바와 같은 보체 활성화의 억제제의 활성을 여전히 갖는다.

이롭게도, 본 발명의 근간이 된 연구에서 본원에 기술된 화합물이 보체 억제 활성을 갖고, 이는 특히, 공지된 3개의 보체 활성화 경로 모두를 억제시키는 데 적합하다는 것이 밝혀졌다. 놀랍게도, 본 발명의 화합물의 인자 C3b에 대한 해리 상수는 20 nM 내지 40 nM 범위인 것으로 나타났다. 추가로, 화합물은 대략 75 nM 내지 150 nM 농도에서 대체 경로를 통해 유도된 용혈, 및 100 nM 미만 농도에서 고전적 경로를 통해 유도된 용혈을 방해한 것으로 나타났다.

상기 내려진 정의는 하기에 준용된다. 추가로 하기에서 내려지는 추가 정의 및 설명 또한 본 명세서에 기술된 모든 실시양태에 준용된다.

본 발명은 추가로 본 발명의 다중-도메인 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

본 발명에 따라 사용되는 바, "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 본원 상기에서 언급된 바와 같은 도메인을 포함하는 다중-도메인 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 상기 언급된 도메인을 포함하는 다중-도메인 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 따라 널리 공지된 기술을 사용하여 관련 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 합성함으로써 수득되었다.

따라서, 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열식별번호 5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는, 서열식별번호 7 또는 13에 제시된 핵산 서열을 포함하고/거나, 서열식별번호 6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는, 서열식별번호 8 또는 14에 제시된 핵산 서열을 포함한다. 서열식별번호 5 또는 6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 또한 축중성 유전자 코드에 기인하여 다른 폴리뉴클레오티드에 의해서도 코딩될 수 있다는 것도 이해하여야 한다.

추가로, 본 발명에 따라 사용되는 바, "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 상기 언급된 특정 폴리뉴클레오티드의 변이체도 추가로 포함한다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 바람직하게는, 서열이 적어도 하나의 뉴클레오티드 치환, 부가 및/또는 결실에 의해 서열식별번호 7, 8, 13, 또는 14에 제시된 상기 언급된 특정 핵산 서열로부터 유도될 수 있고, 그에 의해서도 변이체 핵산 서열은 상기 언급된 바와 같은 활성을 포함하는 폴리펩티드를 여전히 코딩하여야 하는 것을 특징으로 하는 핵산 서열을 포함한다. 변이체는 서열식별번호 7, 8, 13, 또는 14에 제시된 핵산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 추가로, 서열식별번호 5 또는 6에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또한 포함된다. 동일성(%) 값은 바람직하게는 전체 아미노산 또는 핵산 서열 영역에 걸쳐 계산된다. 상이한 서열을 비교하는 데 다양한 알고리즘에 기반한 프로그램 시리즈가 통상의 기술자에게 이용가능하다. 이와 관련하여, 니들만 및 운치, 또는 스미쓰 및 워터만의 알고리즘이 특히 신뢰가능한 결과를 제공한다. 서열 정렬을 수행하기 위해, 프로그램 PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) 또는 프로그램 Gap 및 BestFit (Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970)) 및 스미쓰 및 워터만 (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981))) (이는 GCG 소프트웨어 패킷의 일부이다 (제네틱스 컴퓨터 그룹: 미국 53711 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 (1991)))가 사용되어야 한다. 퍼센트(%)로 상기 언급된 서열 동일성 값은 바람직하게는 하기의 설정 환경을 이용하여 전체 서열 영역에 걸쳐 프로그램 GAP를 이용하여 측정되어야 한다: 갭 가중치: 50, 길이 가중치: 3, 평균 매치: 10.000 및 평균 미스매치: 0.000 (달리 언급되지 않는 한, 이는 항상 서열 정렬을 위한 표준 설정 환경으로서 사용되어야 한다). 변이체는 또한 바람직하게는 엄격한 혼성화 조건하에서 상기 언급된 특정 핵산 서열에 혼성화할 수 있는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 엄격한 조건은 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]에서 살펴볼 수 있다. 엄격한 혼성화 조건에 대한 바람직한 예는 대략 45℃에서의 6' 염화나트륨/시트르산나트륨 (= SSC) 중에서의 혼성화 조건, 이어서, 50 내지 65℃에서 0.2' SSC, 0.1% SDS 중에서의 1회 이상의 세척 단계이다. 통상의 기술자는 상기 혼성화 조건은 핵산 유형에 따라, 및 예를 들어, 유기 용매가 존재할 때, 완충제의 온도 및 농도와 관련하여 다르다는 것을 알고 있다. 예를 들어, "표준 혼성화 조건"하에서, 온도는 핵산 유형에 따라 0.1 내지 5' 농도의 SSC를 포함하는 수성 완충제 (pH 7.2) 중에서 42℃ 내지 58℃로 다르다. 상기 언급된 완충제 중 예를 들어, 50% 포름아미드와 같은 유기 용매가 존재할 경우, 표준 조건하에서의 온도는 대략 42℃이다. DNA:DNA 하이브리드에 대한 혼성화 조건은 바람직하게는 예를 들어, 0.1' SSC 및 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 30℃ 내지 45℃이다. DNA:RNA 하이브리드에 대한 혼성화 조건은 바람직하게는 예를 들어, 0.1' SSC 및 30℃ 내지 55℃, 바람직하게는 45℃ 내지 55℃이다. 상기 언급된 혼성화 온도는 예를 들어, 포름아미드의 부재하에서의, 길이가 대략 100 bp (= 염기쌍)이고, G + C 함량이 50%인 핵산에 대하여 결정된 것이다. 통상의 기술자는 교재, 예컨대, 상기 언급된 교재, 또는 하기 교재: 문헌 [Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989]; [Hames and Higgins (Ed.) 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford]; [Brown (Ed.) 1991, "Essential Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford]를 참조함으로써, 요구되는 혼성화 조건을 결정하는 방법을 알 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드 변이체는 PCR 기반 기술, 예컨대, 혼합된 올리고뉴클레오티드 프라이머 기반의 DNA 증폭, 즉, 본 발명의 폴리펩티드의 보존되는 도메인에 대한 축중성 프라이머를 사용함으로써 수득될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 보존되는 도메인은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 다른 CCP의 서열과 서열 비교함으로써 확인될 수 있다. 주형으로서, 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간으로부터의 DNA 또는 cDNA가 사용될 수 있다.

상기 언급된 핵산 서열 중 임의의 것의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드로서 포함된다. 상기 단편은 상기 언급된 도메인을 포함하고, 상기 언급된 바와 같은 활성을 여전히 갖는 폴리펩티드를 코딩하여야 한다. 따라서, 폴리펩티드는 상기 생물학적 활성을 부여하는, 본 발명의 도메인을 포함할 수 있거나, 또는 그로 이루어질 수 있다. 본원에서 의미하는 바, 단편은 바람직하게는 상기 언급된 핵산 서열 중 적어도 50, 적어도 100, 적어도 250 또는 적어도 500개의 연속된 뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 상기 언급된 아미노산 서열 중 적어도 20, 적어도 30, 적어도 50, 적어도 80, 적어도 100 또는 적어도 150개의 연속된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 코딩한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기 언급된 핵산 서열로 이루어지거나, 또는 상기 언급된 핵산 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 추가의 핵산 서열도 함유할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 융합 단백질의 한 파트너가 상기 언급된 핵산 서열에 의해 코딩되는 다중-도메인 폴리펩티드인 것인 융합 단백질을 코딩할 수 있다. 상기 융합 단백질은 추가 부분으로서 발현을 모니터링하기 위한 다른 폴리펩티드 (예컨대, 녹색, 황색, 청색 또는 적색 형광 단백질, 알칼리성 포스파타제 등), 또는 검출가능한 마커로서, 또는 정제 목적을 위한 보조 조치로서 작용할 수 있는, 소위 "태그"라 불리는 것을 포함할 수 있다. 다른 목적의 태그도 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 이는 FLAG-태그, 6-히스티딘-태그, MYC-태그 등을 포함한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 단리된 폴리뉴클레오티드로서(그의 천연 환경으로부터 단리된 것으로서), 또는 유전적으로 변형된 형태로 제공되어야 한다. 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 cDNA를 비롯한 DNA이거나, 또는 RNA이다. 상기 용어는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드도 포함한다. 추가로, 자연적으로 발행된 변형된 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 글리코실화된 또는 메틸화된 폴리뉴클레오티드, 또는 인공 변형 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 비오티닐화된 폴리뉴클레오티드를 비롯한, 화학적으로 변형된 폴리뉴클레오티드 또한 포함된다.

따라서, 바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 a) 서열식별번호 7, 8, 13, 또는 14와 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드이고/거나, b) 서열식별번호 5 또는 6과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고/거나, c) 엄격한 조건 엄격한 조건하에서 서열식별번호 7, 8, 13, 또는 14와 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드이다. 보다 바람직하게는 폴리뉴클레오티드는 a) 서열식별번호 7, 8, 13, 또는 14의 핵산 서열을 포함하고, 바람직하게는 그로 이루어진 폴리뉴클레오티드이고/거나, b) 서열식별번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 그로 이루어진 폴리펩티드를 코딩한다. 바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기 언급된 바와 같은 활성을 갖는 다중-도메인 폴리펩티드를 코딩한다.

본 발명은 추가로 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

"벡터"라는 용어는 바람직하게는 파지, 플라스미드, 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터 뿐만 아니라, 인공 염색체, 예컨대, 박테리아 또는 효모 인공 염색체를 포함한다. 추가로, 상기 용어는 또한 표적화 구축물의 게놈 DNA 내로의 무작위적 또는 부위 지정 통합을 허용하는 표적화 구축물에 관한 것이다. 상기 표적 구축물은 바람직하게는 하기 상세하게 기술되는 바와 같은 상동성 또는 이종성 재조합에 충분한 길이의 DNA를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 바람직하게는 숙주에서의 증식 및/또는 선별을 위한 선별가능한 마커를 추가로 포함한다. 벡터는 관련 기술분야에 널리 공지된 다양한 기술에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 벡터는 예컨대, 인산칼슘 침전물 또는 염화루비듐 침전물과 같은 침전물로, 또는 하전된 지질과의 복합체로, 또는 예컨대, 풀러렌과 같은 탄소계 클러스터로 도입될 수 있다. 대안적으로, 플라스미드 벡터는 열 충격, 또는 전기천공 기술에 의해 도입될 수 있다. 벡터가 바이러스인 경우, 이는 숙주 세포에 적용되기 이전에, 시험관내에서 적절한 패키징 세포주를 사용하여 패키징될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 복제 가능 또는 복제 결함인 것일 수 있다. 후자의 경우, 바이러스 증식은 일반적으로 오직 보완 숙주/세포에서만 일어나게 될 것이다.

보다 바람직하게는 본 발명의 벡터에서, 폴리뉴클레오티드는 원핵 및/또는 진핵 세포, 또는 그의 단리된 분획에서 발현될 수 있도록 허용하는 발현 제어 서열에 작동적으로 연결되어 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 발현은 폴리뉴클레오티드의 바람직하게는 번역가능한 mRNA로의 전사를 포함한다. 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포에서의 발현이 확실하게 이루어지도록 보장하는 조절 요소는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이는 바람직하게는 전사 개시가 확실하게 이루어지도록 보장하는 조절 서열, 및 임의적으로, 전사 종결, 및 전사체의 안정화가 확실하게 이루어지도록 보장하는 폴리-A 신호를 포함한다. 추가 조절 요소로는 전사 뿐만 아니라, 번역 인핸서를 포함한다. 원핵 숙주 세포에서의 발현을 허용하는, 가능한 조절 요소로는 예컨대, E. 콜라이(E. coli)에서의 lac, trp 또는 tac 프로모터를 포함하고, 진핵 숙주 세포에서의 발현을 허용하는 조절 요소의 예로는 효모에서의 AOX1 또는 GAL1 프로모터, 또는 포유동물 및 다른 동물 세포에서의 CMV-, SV40-, RSV-프로모터 (라우스 육종 바이러스), CMV-인핸서, SV40-인핸서 또는 글로빈 인트론이 있다. 추가로, 유도가능한 발현 제어 서열이 본 발명에 포함되는 발현 벡터에 사용될 수 있다. 상기 유도가능한 벡터는 tet 또는 lac 오퍼레이터 서열, 또는 열 충격 또는 다른 환경 인자에 의해 유도가능한 서열을 포함할 수 있다. 적합한 발현 제어 서열은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 전사 개시를 담당하는 요소 이외에도, 상기 조절 요소는 또한 폴리뉴클레오티드 하류에 전사 종결 신호, 예컨대, SV40-폴리-A 부위 또는 tk-폴리-A 부위를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 예컨대, 오카야마-베르그(Okayama-Berg) cDNA 발현 벡터 pcDV1 (파마시아(Pharmacia)), pBluescript (스트라테이진(Stratagene)), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (인비트로진(InVitrogene)) 또는 pSPORT1 (GIBCO BRL)과 같은 적합한 발현 벡터가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 바람직하게는 상기 벡터는 발현 벡터, 및 유전자 전달 또는 표적화 벡터이다. 바이러스 예컨대, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 또는 소 유두종 바이러스로부터 유래된 발현 벡터가 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 표적화된 세포 집단 내로 전달하는 데 사용될 수 있다. 재조합 바이러스 벡터를 구축하는 데 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법이 사용될 수 있으며; 예를 들어, 문헌 [Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.] 및 [Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)]에 기재된 기술을 참조한다.

바람직하게는 벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 숙주 세포에서의 발현을 매개하는 벡터이다. 통상의 기술자는 벡터의 증식을 위해 및/또는 벡터에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 위해 벡터 및 숙주 세포의 조합을 선택하는 방법을 알고 있다.

추가로, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 바, "숙주 세포"는 본 발명의 벡터를 증식시킬 수 있고/거나, 본 발명의 벡터 또는 폴리뉴클레오티드 상에 코딩된 다중-도메인 폴리펩티드를 제조할 수 있는 능력을 갖는 박테리아, 고세균, 또는 진핵 세포에 관한 것이다. 바람직하게는 숙주 세포는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 종으로부터의 박테리아 세포, 인시류, 마우스, 래트, 또는 인간 세포이고; 보다 바람직하게는 세포는 효모 세포, 바람직하게는 피치아(Pichia) 속의 것, 보다 바람직하게는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 세포이다. 바람직하게는 숙주 세포는 시험관내에서 배양된 세포이다. 추가로 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포는 생체내 세포, 바람직하게는 망막 색소 상피 세포, 맥락막 맥관구조 내의 내피 세포, 및/또는 망막 또는 맥락막 내의 또 다른 세포이다.

본 발명은 또한 의약으로 사용하기 위한, 본 발명에 따른 다중-도메인 폴리펩티드, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는 본 발명에 따른 벡터에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 또한 부적절한 보체 활성화 및/또는 증상으로서 부적절한 보체 활성화를 보이는 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한, 본 발명에 따른 다중-도메인 폴리펩티드, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는 본 발명에 따른 벡터에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 바, "부적절한 보체 활성화"라는 용어는 주어진 상황하에서의 타이밍 및/또는 진폭이 정상적인 보체 활성화 수준을 초과하는 보체 활성화에 관한 것이다. 따라서, 바람직하게는 부적절한 보체 활성화는 주어진 상황하에서 건강한 참조 대상, 바람직하게는 겉보기상 건강한 대상체의 보체 활성화 정도를 초과하는, 바람직하게는 유의적으로 초과하는 보체 활성화이다. 바람직하게는 부적절한 보체 활성화는 환자에서 질환의 증상을 유발하는 보체 활성화이다. 부적절한 보체 활성화의 증상은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 용혈, 황반 변성, 일시적 종창, 예컨대, 유전성 혈관부종에서의 것 등을 포함한다. 바람직하게는 부적절한 보체 활성화는 샘플 중 보체 인자 C3 및/또는 C4 활성을 측정함으로써 측정된다.

통상의 기술자에게 공지되어 있는 바와 같이, 다양한 질환이 부적절한 보체 활성화와 연관되어 있고/거나, 그에 의해 유발된다. 따라서, 바람직하게는 본 발명은 또한 증상으로서 부적절한 보체 활성화를 보이는 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한, 본 발명에 따른 다중-도메인 폴리펩티드, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는 본 발명에 따른 벡터에 관한 것이다. 바람직하게는 상기의, 증상으로서 부적절한 보체 활성화를 보이는 질환은 허혈 재관류 손상, 항체 매개 이식편 거부반응, 이식 후 혈전성 미세혈관병증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 급성 및 지연 용혈성 수혈 반응, 한랭 응집소증, 류마티스성 관절염, 아쿠아포린-4-항체-양성 시신경척수염, CD59-결핍증, C3-사구체병증, 비정형 용혈성 요독 증후군, 발작성 야간 헤모글로빈뇨증, 및 연령 관련 황반 변성으로 이루어진 목록으로부터 선택된다.

본원에서 사용되는 바, "치료하는"이라는 용어는 본원에서 언급된 질환 또는 장애, 또는 그와 함께 동반되는 증상을 바람직하게는 유의적인 정도로 호전시키는 것을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, 상기 치료하는이라는 것은 또한 본원에서 언급된 질환 또는 장애와 관련하여 건강의 완전한 회복도 포함한다. 본 발명에 따라 사용되는 바, 치료하는이라는 것은 치료하고자 하는 모든 대상체에서 효과적일 수는 없다는 것을 이해하여야 한다. 그러나, 상기 용어는 바람직하게는 본원에서 언급된 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체 중 통계학상 유의적인 일부가 성공적으로 치료될 수 있어야 한다는 것을 요구한다. 일부가 통계학상 유의적인지 여부는 지체 없이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 널리 공지된 다양한 통계적 평가 도구, 예컨대, 신뢰 구간 측정, p 값 측정, 스튜던츠 t 검정(Student's t-test), 만-위트니(Mann-Whitney) 검정 등을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직한 신뢰 구간은 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이다. p 값은 바람직하게는 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 또는 0.0001이다. 바람직하게는 치료는 주어진 코호트 또는 집단의 대상체 중 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%에 대하여 효과적이어야 한다.

본원에서 사용되는 바, "예방하는"이라는 용어는 대상체에서 특정 기간 동안 본원에서 언급된 질환 또는 장애와 관련하여 건강 상태를 유지시키는 것을 지칭한다. 상기 기간은 투여되는 약물 화합물의 양 및 본 명세서 다른 곳에서도 논의된 대상체의 개별 인자에 의존한다는 것을 이해할 것이다. 예방이 본 발명에 따른 화합물로 치료받은 모든 대상체에서 효과적일 수는 없다는 것 또한 이해하여야 한다. 그러나, 상기 용어는 바람직하게는 코호트 또는 집단의 대상체 중 통계학상 유의적인 일부가 본원에서 언급된 질환 또는 장애, 또는 그의 동반 증상을 앓지 않도록 효과적으로 예방되어야 하는 것을 요구한다. 바람직하게는 대상체로 이루어진 코호트 또는 집단은 이와 관련하여, 보통은, 즉, 본 발명에 따른 예방적 조치가 없는 경우에는 본원에서 언급된 질환 또는 장애가 발생하게 되는 코호트 또는 집단인 것으로 구상된다. 일부가 통계학상 유의적인지 여부는 지체 없이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 본 명세서 다른 곳에서도 논의된, 널리 공지된 다양한 통계적 평가 도구를 사용하여 결정될 수 있다.

본 발명은 또한 부적절한 보체 활성화 및/또는 증상으로서 부적절한 보체 활성화를 보이는 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한, 보체 단백질 C5 억제 폴리펩티드, 바람직하게는 에쿨리주맙과 함께 조합되는, 본 발명에 따른 다중-도메인 폴리펩티드, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는 본 발명에 따른 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 부적절한 보체 활성화 및/또는 증상으로서 부적절한 보체 활성화를 보이는 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한, 본 발명에 따른 다중-도메인 폴리펩티드, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는 본 발명에 따른 벡터와 함께 조합되는, 보체 단백질 C5 억제 폴리펩티드, 바람직하게는 에쿨리주맙, 또는 rEV576 (코베르신)에 관한 것이다.

"보체 단백질 C5"라는 용어는 보체 경로 활성화 이후, 절단되어 보체 단백질 C5a 및 C5b로 수득되는 단백질에 관한 것으로 통상의 기술자에 의해 이해된다. 상응하여, "보체 단백질 C5 억제 폴리펩티드"는 보체 단백질 C5를 특이적으로 인식하고, 그를 억제시키는 폴리펩티드, 바람직하게는 항체, 보다 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 바람직하게는 보체 단백질 C5 억제 폴리펩티드는 C5에 특이적으로 결합하고, 말단 활성화를 억제시키는 항체이고; 보다 바람직하게는 보체 단백질 C5 억제 폴리펩티드는 에쿨리주맙 (CAS NO: 219685-50-4)이다. 또한, 바람직하게는 보체 단백질 C5 억제 폴리펩티드는 rEV576 (코베르신)이다.

본 발명은 추가로 (i) 본 발명에 따른 다중-도메인 폴리펩티드 및 (ii) 보체 단백질 C5 억제 폴리펩티드, 바람직하게는 에쿨리주맙, 또는 rEV576 (코베르신)을 포함하는, 동시, 별개 또는 순차적 사용을 위한 조합 제제에 관한 것이다.

본 출원에서 언급되는 바, "조합 제제"라는 용어는 하나의 제제로 본 발명의 제약상 활성인 화합물을 포함하는 제제에 관한 것이다. 바람직하게는 조합 제제가 용기에 포함되고, 즉, 바람직하게는 상기 용기는 본 발명의 제약상 활성인 화합물 모두를 포함한다. 바람직하게는 상기 용기는 별개의 제제로서, 즉, 바람직하게는 다중-도메인 폴리펩티드인 한 제제 및 보체 단백질 C5 억제 폴리펩티드인 한 제제로서, 본 발명의 제약상 활성인 화합물을 포함한다. 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, "제제"라는 용어는 바람직하게는 제약상 허용되는, 본 발명의 적어도 하나의 제약상 활성인 화합물을 포함하거나, 또는 그로 이루어진 화합물의 혼합물에 관한 것이다. 바람직하게는 조합 제제는 예컨대, 정제와 같은 단일의 고체 제약 형태로 보체 단백질 C5 억제 폴리펩티드 및 다중-도메인 폴리펩티드를 포함하고, 여기서, 보다 바람직하게는 본 발명의 한 화합물은 즉시 또는 고속 방출형 제제에 포함되고, 본 발명의 제2 화합물은 서방성 또는 지연 방출형 제제에 포함되고; 보다 바람직하게는 본 발명의 화합물은 2개의 별개의, 바람직하게는 액체 제제에 포함되고; 상기 별개의 액체 제제는 바람직하게는 대상체 신체의 다른 부분에의 바람직하게는 주사를 위한 것이다.

바람직하게는 조합 제제는 별개 투여용 또는 조합 투여용인 것이다. 본원에서 사용되는 바, "별개 투여"란, 본 발명의 제약상 활성인 화합물 중 적어도 2개가 상기한 경로를 통해, 및/또는 대상체 신체의 다른 부분에 투여되는 투여에 관한 것이다. 예컨대, 한 화합물은 장관 투여 (예컨대, 경구적으로)에 의해 투여될 수 있는 반면, 제2 화합물은 비경구적 투여 (예컨대, 정맥내로)에 의해 투여된다. 바람직하게는 별개 투여용 조합 제제는 별개 투여를 위해 적어도 2개의 물리적으로 분리된 제제를 포함하고, 여기서, 각 제제는 적어도 하나의 제약상 활성인 화합물을 함유하고; 예컨대, 조합 제제의 제약상 활성인 화합물이 그의 화학성 또는 생리적 특성에 기인하여 상이한 경로에 의해, 예컨대, 비경구적으로 및 경구적으로 투여되어야 하는 경우에 상기 대안이 바람직하다. 반대로, "조합 투여"란, 본 발명의 제약상 활성인 화합물이 동일한 경로를 통해, 예컨대, 경구적으로, 또는 바람직하게는 정맥내로 투여되는 투여에 관한 것이다.

또한, 바람직하게는 조합 제제는 동시 투여용 또는 순차적 투여용인 것이다. 본원에서 사용되는 바, "동시 투여"란, 본 발명의 제약상 활성인 화합물이 같은 시간에 투여되는 투여, 즉, 바람직하게는 제약상 활성인 화합물의 투여가 15분 미만인 시간 간격 내에서, 보다 바람직하게는 5분 미만인 시간 간격 내에서 시작되는 것인 투여에 관한 것이다. 가장 바람직하게는 제약상 활성인 화합물의 투여는 예컨대, 제약상 활성인 화합물을 포함하는 정제를 연하시킴으로써, 또는 제약상 활성인 화합물 중 하나를 포함하는 정제는 연하시키고, 동시에 제2 화합물은 주사함으로써, 또는 신체 상이한 부분에 한 제약상 활성인 화합물을 포함하는 용액을 정맥내 주사로 적용시키고, 제2 화합물을 주사함으로써 같은 시간에 시작된다. 반대로, 본원에서 사용되는 바, "순차적 투여란, 대상체 내에서 제약상 활성인 화합물의 혈장 농도가 본 발명의 시너지 효과를 발휘할 수 있도록 하기는 하지만, 바람직하게는 본원 상기에 언급된 바와 같은 동시 투여는 아닌 것인 투여에 관한 것이다. 바람직하게는 순차적 투여는 제약상 활성인 화합물, 바람직하게는 모든 제약상 활성인 화합물의 투여가 1 또는 2일의 시간 간격 내에서, 보다 바람직하게는 12시간의 시간 간격 내에서, 보다 더 바람직하게는 4시간의 시간 간격 내에서, 보다 더 바람직하게는 1시간의 시간 간격 내에서, 가장 바람직하게는 5분의 시간 간격 내에서 시작되는 것인 투여이다.

바람직하게는 조합 제제는 제약상 화합성인 조합 제제이다. 본원에서 사용되는 바, "제약상 화합성인 제제" 및 "제약 조성물"이라는 용어는 본 발명의 화합물 및 임의적으로, 하나 이상 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 제약상 허용되는 염으로서 제제화될 수 있다. 바람직한 허용되는 염은 아세테이트, 메틸에스테르, HCl, 술페이트, 클로라이드 등이다. 제약 조성물은 바람직하게는 국소적으로, 또는 보다 바람직하게는 전신 투여된다. 약물 투여에 통상 사용되는 적합한 투여 경로는 경구적, 정맥내, 피하, 또는 비경구적 투여 뿐만 아니라, 흡입이다. 그러나, 화합물의 성질 및 작용 모드에 의존하여 제약 조성물은 다른 경로에 의해서도 투여될 수 있다. 또한, 화합물은 본원 다른 곳에서 언급된 바와 같이 공동 제약 조성물로, 또는 부품들의 키트의 형태로 제공될 수 있는 분리된 제약 조성물로서 다른 약물과 함께 조합하여 투여될 수 있다. 바람직하게는 조합 제제는 화합물 중 하나 이상의 것과 관련하여 연장 방출 제제이다.

화합물은 바람직하게는 통상의 방법에 따라 표준 제약 담체와 함께 약물을 조합함으로써 제조되는 통상의 투여 형태로 투여된다. 상기 방법은 원하는 제제에 적절하게 성분을 혼합하고, 과립화시키고, 압착하거나, 또는 용해시키는 것을 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 담체 또는 희석제의 형태 및 특징은 그와 함께 조합되는 활성 성분의 양, 투여 경로 및 널리 공지된 다른 변수에 의해 지배된다는 것을 이해할 것이다.

담체(들)는 그가 제제의 다른 성분과 화합성이어야 하고, 그의 수용자에게 유해하지 않아야 한다는 점에서 허용가능한 것이어야 한다. 사용되는 제약 담체는 예를 들어, 고체, 겔, 또는 액체일 수 있다. 고체 담체의 예로는 락토스, 테라 알바, 수크로스, 탈크, 젤라틴, 아가, 펙틴, 아카시아, 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 등이 있다. 예시적인 액체 담체로는 포스페이트 완충처리된 염수 용액, 시럽, 오일, 예컨대, 땅콩 오일 및 올리브 오일, 물, 에멀젼, 다양한 유형의 습윤화제, 멸균 용액 등이 있다. 유사하게, 담체 또는 희석제는 관련 기술분야에 널리 공지된 시간 지연 물질, 예컨대, 글리세릴 모노-스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 단독으로 또는 왁스와 함께 포함할 수 있다. 상기 적합한 담체는 상기 언급된 것, 및 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 것들을 포함하고, 예컨대, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania]을 참조할 수 있다.

희석제(들)는 화합물 또는 화합물들의 생물학적 활성에 영향을 주지 않도록 선택된다. 상기 희석제의 예로는 증류수, 생리 염수, 링거액(Ringer's solution), 덱스트로스 용액, 및 행크스 용액(Hank's solution)이 있다. 추가로, 제약 조성물 또는 제제는 다른 담체, 애주번트, 또는 비독성, 비치료, 비면역원성 안정제, 활성 산소 스캐빈저 또한 포함할 수 있다.

치료학상 유효 용량이란, 본 명세서에서 언급된 질환 또는 병태를 동반하는 증상을 예방하거나, 호전시키거나, 또는 치료하는, 본 발명의 제약 조성물에서 사용되는 화합물의 양을 지칭한다. 예컨대, ED50 (집단 중 50%에서 치료학상 효과적인 용량), 및 LD50 (집단 중 50%에게 치명적인 용량)과 같은, 상기 화합물의 치료 효능 및 독성은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 제약 방법에 의해 측정될 수 있다. 치료 효과와 독성 효과 사이의 용량 비가 치료 지수이며, 이는 LD50/ED50 비로서 표시될 수 있다.

투여량 요법은 담당의 및 다른 임상 인자; 바람직하게는 상기 기술된 방법들 중 어느 한 방법에 따라 결정될 것이다. 의학 분야에 널리 공지된 바와 같이, 어느 한 환자를 위한 투여량은 환자의 크기, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 횟수 및 경로, 일반적인 건강 상태 및 공동으로 투여되는 다른 약물을 비롯한, 다수의 인자에 의존한다. 진행 상태는 주기적인 사정에 의해 모니터링될 수 있다. 전형적인 용량은 예를 들어, 1 내지 1,500 mg 범위일 수 있지만; 이러한 예시적 범위 미만 또는 그 초과의 용량도 특히 상기 언급된 인자를 고려하여 구상된다. 일반적으로, 제약 조성물의 주기적 투여와 같은 요법은 그 범위가 1일당 100 ㎍ 내지 100 mg 단위여야 한다. 요법이 연속 주입일 경우, 그 범위 또한 각각 1분당 체중 1 kg당 100 ㎍ 내지 100 mg이어야 한다. 바람직하게는 각 약물의 연장 방출 제제는 주 1회 내지 2개월마다 1회, 또는 심지어는 보다 긴 간격으로 주사된다. 진행 상태는 주기적인 사정에 의해 모니터링될 수 있다. 본 발명의 화합물의 바람직한 용량 및 농도는 본원 다른 곳에도 언급되어 있다.

예로서, 다중-도메인 폴리펩티드의 혈장 농도는 바람직하게는 25 nM 미만, 보다 바람직하게는 50 nM 미만이다. 또한 바람직하게는 다중-도메인 폴리펩티드의 혈장 농도는 20 nM 내지 20 μM, 보다 바람직하게는 50 nM 내지 5 μM 범위이다. 보체 단백질 C5 억제 폴리펩티드, 특히, 에쿨리주맙의 유효 농도는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 본 발명의 다중-도메인 폴리펩티드의 시너지 효과에 기인하여, 조합 치료에서의 보체 단백질 C5 억제 폴리펩티드에 대한 유효 농도는 더 낮은 저농도일 수 있다.

본원에서 언급된 제약 조성물 및 제제는 본 명세서에서 언급된 질환 또는 병태를 치료하기 위해 또는 호전시키기 위해 또는 예방하기 위해, 예컨대, 연장 방출 제제인 경우, 바람직하게는 적어도 1회 투여된다. 그러나, 상기 제약 조성물은 1회 초과로, 예를 들어, 1일 1회 내지 4회, 최대 비제한된 일수로 투여될 수 있다. 또한, 제거 시간이 짧은 일부 화합물은 장시간의 치료 기간 동안 전신에 유효 용량을 제공하기 위해 혈류 중에 주입물로서 적용될 수 있다.

특정 제약 조성물은 제약 분야에 널리 공지된 방식으로 제조되고, 이는 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 혼합된, 또는 다르게는 그와 함께 회합된, 본원 상기에서 언급된 적어도 하나의 활성 화합물을 포함한다. 상기 특정 제약 조성물 제조를 위해, 활성 화합물(들)은 일반적으로 담체 또는 희석제와 함께 혼합되거나, 또는 캡슐, 샤셋, 카세, 페이퍼 또는 다른 적합한 용기 또는 비히클에 내장되거나, 또는 캡슐화될 것이다. 생성된 제제는 투여 모드에 맞게, 즉, 정제, 캡슐제, 좌제, 액제, 현탁제 등의 형태로 채택될 것이다. 고려되는 수용자에 의존한 용량 조정을 기대하기 위해서는 투여량 권고사항이 처방자 또는 사용자 설명서에 명시되어야 한다.

본 발명은 또한 (i) 다중-도메인 폴리펩티드, (ii) 보체 단백질 C5 억제 폴리펩티드, 및 (iii) 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 의약; 및 상기 언급된 바와 같이 치료 및/또는 예방에서 사용하기 위한 상기 의약에 관한 것이다.

"의약"이라는 용어는 통상의 기술자에 의해 이해된다. 이해되는 바와 같이, 바람직하게는, 본원 상기에서 "조합 제제"라는 용어에 대하여 내려진 정의가 본 발명의 의약이라는 용어에 준용된다.

추가로, 본 발명은 대상체에게 유효 용량의, 본 발명에 따른 다중-도메인 폴리펩티드, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는 본 발명에 따른 벡터를 투여하여

상기 대상체에서 부적절한 보체 활성화 및/또는 증상으로서 부적절한 보체 활성화를 보이는 질환을 치료 및/또는 예방하는 단계를 포함하는, 대상체에서 부적절한 보체 활성화 및/또는 증상으로서 부적절한 보체 활성화를 보이는 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 치료 및/또는 예방하는 방법은 바람직하게는 생체내 방법이다. 또한, 이는 상기에 명백하게 언급된 단계 이외의 다른 단계도 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가 단계는 예컨대, 부적절한 보체 활성화 및/또는 증상으로서 부적절한 보체 활성화를 보이는 질환을 진단하는 단계, 또는 추가 화합물, 예컨대, 보체 단백질 C5 억제 폴리펩티드를 투여하는 단계에 관한 것일 수 있다. 또한, 상기 단계 중 하나 이상의 단계는 자동 장치에 의해 수행될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "대상체"라는 용어는 보체계가 있는 동물, 바람직하게는 포유동물에 관한 것이다. 보다 바람직하게는 대상체는 소, 돼지, 양, 말, 고양이, 개, 마우스, 또는 래트, 가장 바람직하게는 인간이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 다중-도메인 폴리펩티드, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는 본 발명에 따른 벡터를 보체 인자를 포함하는 반응 혼합물에 적용하여

상기 반응 혼합물에서 보체 활성화를 예방하거나 또는 보체 활성화 정도를 감소시키는 단계를 포함하는, 보체 활성화를 예방하거나 또는 보체 활성화 정도를 감소시키는 시험관내 방법에 관한 것이다.

본 발명의 보체 활성화를 예방하거나 또는 보체 활성화 정도를 감소시키는 시험관내 방법은 상기에 명백하게 언급된 단계 이외의 다른 단계도 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가 단계는 예컨대, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 숙주 세포 내로 도입시키는 단계, 또는 상기 반응 혼합물에서 보체 활성화 정도를 측정하는 단계에 관한 것일 수 있다. 또한, 상기 단계 중 하나 이상의 단계는 자동 장치에 의해 수행될 수 있다.

추가로, 본 발명은 보체 활성화 및/또는 증상으로서 부적절한 보체 활성화를 보이는 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한, 본 발명에 따른 다중-도메인 폴리펩티드, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는 본 발명에 따른 벡터의 용도; 및 부적절한 보체 활성화 및/또는 증상으로서 부적절한 보체 활성화를 보이는 질환 치료용 및/또는 예방용 의약 제조를 위한, 본 발명에 따른 다중-도메인 폴리펩티드, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는 본 발명에 따른 벡터의 용도에 관한 것이다.

상기 내용에 비추어, 하기 실시양태가 바람직하다:

1. (i) 고전적 및 대체 보체 활성화 경로의 컨버타제에 대한 컨버타제 붕괴 촉진 도메인인 제1 보체 제어 단백질 반복부 (CCP),

(ii) 숙주 세포 인식 도메인, 및

(iii) 제2 CCP-포함 도메인

을 포함하는 다중-도메인 폴리펩티드.

2. (i) 보체 수용체 1형 (CR1)의 보체 제어 단백질 반복부 (CCP) 1 내지 3과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/거나, 붕괴 촉진 인자 (DAF)의 CCP 1 내지 4와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 CCP 도메인,

을 포함하는 다중-도메인 폴리펩티드.

3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 CCP-포함 도메인이 다중의 CCP를 포함하는 것인 다중-도메인 폴리펩티드.

4. 실시양태 1 내지 3 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 CCP-포함 도메인이 2 내지 10개, 바람직하게는 2 내지 5개, 보다 바람직하게는 3 내지 4개의 CCP로 구성되는 것인 다중-도메인 폴리펩티드.

5. 실시양태 1 내지 4 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 제1 CCP-포함 도메인이 보체 수용체 1형 (CR1)의, 바람직하게는 인간 CR1의 CCP 1 내지 3을 포함하고/거나; 붕괴 촉진 인자 (DAF), 바람직하게는 인간 DAF의 CCP 1 내지 4를 포함하는 것인 다중-도메인 폴리펩티드.

6. 실시양태 1 내지 5 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 제1 CCP-포함 도메인이 서열식별번호 1에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호 1과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 그로 이루어진 것인 다중-도메인 폴리펩티드.

7. 실시양태 1 내지 6 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 제1 CCP-포함 도메인이 서열식별번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 그로 이루어진 것인 다중-도메인 폴리펩티드.

8. 실시양태 1 내지 7 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 제1 CCP-포함 도메인이 서열식별번호 2에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호 2와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 그로 이루어진 것인 다중-도메인 폴리펩티드.

9. 실시양태 1 내지 8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 제1 CCP-포함 도메인이 서열식별번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 그로 이루어진 것인 다중-도메인 폴리펩티드.

10. 실시양태 1 내지 9 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 제2 CCP-포함 도메인이 CR1의, 바람직하게는 인간 CR1의 CCP 8 내지 10, 및/또는 15 내지 17을 포함하는 것인 다중-도메인 폴리펩티드.

11. 실시양태 1 내지 10 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 제2 CCP-포함 도메인이 CR1의, 바람직하게는 인간 CR1의 CCP 15 내지 17을 포함하는 것인 다중-도메인 폴리펩티드.

12. 실시양태 1 내지 11 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 제2 CCP-포함 도메인이 서열식별번호 3에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호 3과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 그로 이루어진 것인 다중-도메인 폴리펩티드.

13. 실시양태 1 내지 12 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 제2 CCP-포함 도메인이 서열식별번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 그로 이루어진 것인 다중-도메인 폴리펩티드.

14. 실시양태 1 내지 13 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 숙주 세포 인식 도메인이 보체 인자 H, 바람직하게는 인간 보체 인자 H의 CCP 6 내지 8 및/또는 19 내지 20을 포함하는 것인 다중-도메인 폴리펩티드.

15. 실시양태 1 내지 14 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 숙주 세포 인식 도메인이 서열식별번호 4에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호 4와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 그로 이루어진 것인 다중-도메인 폴리펩티드.

16. 실시양태 1 내지 15 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 숙주 세포 인식 도메인이 서열식별번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 그로 이루어진 것인 다중-도메인 폴리펩티드.

17. 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 다중-도메인 폴리펩티드가 상기 도메인 중 적어도 2개를 포함하고, 바람직하게는 인접 폴리펩티드 서열로서 상기 도메인 3개 모두를 포함하는 것인 다중-도메인 폴리펩티드.

18. 실시양태 1 내지 17 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 다중-도메인 폴리펩티드가 상기 도메인을 N-말단, 제1 CCP-포함 도메인, 숙주 세포 인식 도메인, 제2 CCP-포함 도메인, C-말단인 순서로 포함하는 것인 다중-도메인 폴리펩티드.

19. 실시양태 1 내지 18 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 도메인 중 적어도 2개가 링커 펩티드, 바람직하게는 폴리-글리신 링커 펩티드에 의해 연결된 것인 다중-도메인 폴리펩티드.

20. 실시양태 1 내지 19 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 제1 CCP-포함 도메인 및 상기 숙주 세포 인식 도메인이 14 또는 15개의 글리신 잔기를 포함하는, 바람직하게는 그로 이루어진 링커에 의해 연결된 것인 다중-도메인 폴리펩티드.

21. 실시양태 1 내지 20 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 다중-도메인 폴리펩티드가 서열식별번호 5 또는 6에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호 5 또는 6과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 그로 이루어진 것인 다중-도메인 폴리펩티드.

22. 실시양태 1 내지 21 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 다중-도메인 폴리펩티드가 서열식별번호 5 또는 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 그로 이루어진 것인 다중-도메인 폴리펩티드.

23. 실시양태 1 내지 22 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 제1 CCP-포함 도메인이 보체 인자 C3b 및 C4b에 대하여 결합 활성을 갖는, 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 보다 바람직하게는 적어도 3개의 CCP를 포함하는 것인 다중-도메인 폴리펩티드.

24. 실시양태 1 내지 23 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 제2 CCP-포함 도메인이 보체 인자 C3b 및/또는 C4b에 대하여 결합 활성을 갖고, 바람직하게는 인자 I 보조인자 활성을 추가로 갖는, 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 보다 바람직하게는 적어도 3개의 CCP를 포함하는 것인 다중-도메인 폴리펩티드.

25. 실시양태 1 내지 24 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 숙주 세포 인식 도메인이 보체 인자 C3b 분해 생성물에의, 바람직하게는 iC3b 및/또는 C3dg 및/또는 C3d에의 결합 활성을 갖고/거나; 숙주 세포 표면 마커, 바람직하게는 시알산 및/또는 글리코사미노글리칸을 포함하는 폴리음이온 탄수화물에의 결합 활성을 갖는, 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개의 CCP를 포함하는 것인 다중-도메인 폴리펩티드.

26. 실시양태 1 내지 25 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 다중-도메인 폴리펩티드가 보체 반응을 억제시키는 활성을 갖는 것인 다중-도메인 폴리펩티드.

27. 실시양태 1 내지 26 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 다중-도메인 폴리펩티드가 적어도 2개, 바람직하게는 보다 바람직하게는 3개 모두의 보체계 활성화 경로를 억제시키는 활성을 갖는 것인 다중-도메인 폴리펩티드.

28. 실시양태 1 내지 27 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 다중-도메인 폴리펩티드가 적어도 대체 경로 및 고전적 보체 활성화 경로를 억제시키는 활성을 갖고, 바람직하게는 적어도 대체 보체 활성화 경로, 고전적 보체 활성화 경로, 및 렉틴 보체 활성화 경로를 억제시키는 활성을 갖는 것인 다중-도메인 폴리펩티드.

29. 실시양태 1 내지 28 중 어느 한 실시양태의 다중-도메인 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.

30. 실시양태 29에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가

a) 서열식별번호 7, 8, 13, 또는 14와 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드이고/거나,

b) 서열식별번호 5 또는 6과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고/거나,

c) 엄격한 조건 엄격한 조건하에서 서열식별번호 7, 8, 13, 또는 14에 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드인 것인 폴리뉴클레오티드.

31. 실시양태 29 또는 30에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가

a) 서열식별번호 7, 8, 13, 또는 14의 핵산 서열을 포함하고, 바람직하게는 그로 이루어진 폴리뉴클레오티드이고/거나,

b) 서열식별번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 그로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 것인 폴리뉴클레오티드.

32. 실시양태 29 내지 31 중 어느 한 실시양태의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.

33. 실시양태 29 내지 31 중 어느 한 실시양태의 폴리뉴클레오티드, 및/또는 실시양태 32의 벡터를 포함하는 숙주 세포.

34. 실시양태 1 내지 28 중 어느 한 실시양태에 있어서, 실시양태 29 내지 31 중 어느 한 실시양태에 있어서, 또는 실시양태 33에 있어서, 의약으로 사용하기 위한, 다중-도메인 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터.

35. 실시양태 1 내지 28 중 어느 한 실시양태에 있어서, 실시양태 29 내지 31 중 어느 한 실시양태에 있어서, 또는 실시양태 33에 있어서, 부적절한 보체 활성화 및/또는 증상으로서 부적절한 보체 활성화를 보이는 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한, 다중-도메인 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터.

36. 실시양태 1 내지 28 중 어느 한 실시양태에 있어서, 실시양태 29 내지 31 중 어느 한 실시양태에 있어서, 또는 실시양태 33에 있어서, 허혈 재관류 손상, 항체 매개 이식편 거부반응, 이식 후 혈전성 미세혈관병증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 급성 및 지연 용혈성 수혈 반응, 한랭 응집소증, 류마티스성 관절염, 아쿠아포린-4-항체-양성 시신경척수염, CD59-결핍증, C3-사구체병증, 비정형 또는 정형 용혈성 요독 증후군, 발작성 야간 헤모글로빈뇨증, 및/또는 연령 관련 황반 변성을 치료 및/또는 예방하기 위한, 다중-도메인 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터.

37. 실시양태 1 내지 28 중 어느 한 실시양태에 있어서, 실시양태 29 내지 31 중 어느 한 실시양태에 있어서, 또는 실시양태 33에 있어서, 보체 단백질 C5 억제 폴리펩티드, 바람직하게는 에쿨리주맙 또는 rEV576 (코베르신)과 함께 조합하여, 부적절한 보체 활성화 및/또는 증상으로서 부적절한 보체 활성화를 보이는 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한, 다중-도메인 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터.

38. 실시양태 1 내지 28 중 어느 한 실시양태에 따른 다중-도메인 폴리펩티드, 실시양태 29 내지 31 중 어느 한 실시양태에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는 실시양태 33에 따른 벡터와 함께 조합하여, 부적절한 보체 활성화 및/또는 증상으로서 부적절한 보체 활성화를 보이는 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한, 보체 단백질 C5 억제 폴리펩티드, 바람직하게는 에쿨리주맙.

39. (i) 실시양태 1 내지 28 중 어느 한 실시양태에 따른 다중-도메인 폴리펩티드, 및 (ii) 보체 단백질 C5 억제 폴리펩티드, 바람직하게는 에쿨리주맙 또는 rEV576 (코베르신)을 포함하는, 동시, 별개 또는 순차적 사용을 위한 조합 제제.

40. 대상체에게 유효 용량의, 실시양태 1 내지 28 중 어느 한 실시양태에 따른 다중-도메인 폴리펩티드, 실시양태 29 내지 31 중 어느 한 실시양태에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는 실시양태 33에 따른 벡터를 투여하여

상기 대상체에서 부적절한 보체 활성화 및/또는 증상으로서 부적절한 보체 활성화를 보이는 질환을 치료 및/또는 예방하는 단계를 포함하는, 대상체에서 부적절한 보체 활성화 및/또는 증상으로서 부적절한 보체 활성화를 보이는 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법.

41. 실시양태 1 내지 28 중 어느 한 실시양태에 따른 다중-도메인 폴리펩티드를 보체 인자를 포함하는 반응 혼합물에 적용하여

상기 반응 혼합물에서 보체 활성화를 예방하거나 또는 보체 활성화 정도를 감소시키는 단계를 포함하는, 보체 활성화를 예방하거나 또는 보체 활성화 정도를 감소시키는 시험관내 방법.

42. 부적절한 보체 활성화 및/또는 증상으로서 부적절한 보체 활성화를 보이는 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한, 실시양태 1 내지 28 중 어느 한 실시양태에 따른 다중-도메인 폴리펩티드, 실시양태 29 내지 31 중 어느 한 실시양태에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는 실시양태 33에 따른 벡터의 용도.

43. 부적절한 보체 활성화 및/또는 증상으로서 부적절한 보체 활성화를 보이는 질환 치료용 및/또는 예방용 의약 제조를 위한, 실시양태 1 내지 28 중 어느 한 실시양태에 따른 다중-도메인 폴리펩티드, 실시양태 29 내지 31 중 어느 한 실시양태에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는 실시양태 33에 따른 벡터의 용도.

본 명세서에서 인용된 모든 참고문헌은 그의 전체 개시내용 전문 및 본 명세서에서 구체적으로 언급된 개시내용과 관련하여 본원에서 참조로 포함된다.

<도면 설명>

도 1: 사용된 구축물을 나타내는 개략도.

도 2: CR1- (A) 및 DAF- (B) 유래 구축물에 의한, 대체 경로 매개 용혈의 억제. x축: 억제제 (구축물)의 농도, y축: 용혈률(%).

도 3: 5% 혈청 중에서의 CR1 (A) 및 DAF (B) 유래 구축물에 의한, 고전적 경로 매개 용혈의 억제. (C) (B)와 같지만, 단, 75% 혈청 중에서의 것인 억제. x축: 억제제 (구축물)의 농도, y축: 용혈률(%).

도 4: CR1 (A) 및 DAF (B) 유래 구축물에 의한, PNH-RBC의 대체 경로 매개 용혈의 억제. x축: 억제제 (구축물)의 농도, y축: 용혈률(%).

도 5: 억제제의 조합에 의한, 고전적 경로 매개 용혈의 억제. x축: 억제제 (구축물): a NHS; b NHS + 에쿨리주맙 (1.2 μM); c FB 고갈된 혈청; d NHS + 미니FH (=FH(1-4)FH(19-20), 2.5 μM); e NHS + 미니FH (2.5 μM) + 에쿨리주맙 (1.2 μM); f NHS + 삼중 I. (=DAF(1-4)FH(19-20)CR1(15-17), 0.17 μM); g NHS + 삼중-I. (0.17 μM) + 에쿨리주맙 (1.2 μM); h NHS + CR1(1-3) (7.3 μM); i NHS + CR1(1-3) (7.3 μM) + 에쿨리주맙 (1.2 μM) y축: PNH III RBC의 용해율(%).

실시예 1: 구축물

사용된 명명법: 본 실시예에서 사용된 CR1은 인간 CR1이었고; FH는 인간 보체 인자 H에 관한 것이고, DAF는 인간 붕괴 촉진 인자에 관한 것이다. 단백질 명칭의 약어 다음의 숫자는 사용된 단백질 내의 CCP의 번호, 예컨대, FH(19-20)은 인자 H의 CCP 19 내지 20에 관한 것이다.

하기 구축물이 사용되었다 (도 1): DAF(1-4)와 FH(19-20) 사이에 올리고-gly 링커를 포함하는 "DAF(1-4)FH(19-20) 긴 링커" (서열식별번호 11, 서열식별번호 16에 의해 코딩됨) (도 1A); 및 DAF(1-4) 및 FH(19-20)이 직접 연결되어 있는, 즉, 링커 없이 연결되어 있는, "DAF(1-4)FH(19-20) 짧은 링커" (서열식별번호 12, 서열식별번호 15에 의해 코딩됨). 구축물 CR1(1-3)FH(19-20) 긴 링커 (서열식별번호 9, 서열식별번호 18에 의해 코딩됨) 및 짧은 링커 (서열식별번호 10, 서열식별번호 17에 의해 코딩됨) (도 1B)를 유사한 방식으로 구축하였다. 추가로, DAF(1-4) (가용성 DAF, "sDAF", 서열식별번호 2), CR1(1-3) (서열식별번호 1), CR1(15-17) (서열식별번호 3) 또한 사용하였다.

피치아 파스토리스 발현을 위해 코돈 최적화시키기 위하여 (진아트(Geneart)로부터) 다중-도메인 단백질 "CR1(1-3)FH(19-20)CR1(15-17)" 및 "DAF(1-4)FH(19-20)CR1(15-17)"에 대한 코딩 DNA를 주문하고, 합성하고, 피치아 파스토리스 발현 벡터 pPICZαB로 서브클로닝하였다. CR1(1-3)FH(19-20)CR1(15-17)은 서열식별번호 13에 의해 코딩되었지만; 그러나, 동일한 아미노산 서열 (서열식별번호 5)을 갖는 폴리펩티드는 또한 서열식별번호 7을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다. 또한, DAF(1-4)FH(19-20)CR1(15-17)은 서열식별번호 14에 의해 코딩되었지만; 그러나, 동일한 아미노산 서열 (서열식별번호 6)을 갖는 폴리펩티드는 또한 서열식별번호 8을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다. 모든 다른 구축물에 대한 발현 카세트는 동일한 벡터 배경에서 제조되었다.

각 단백질이 P. 파스토리스(P. pastoris)에서 과잉 생산되었고, 이를 종래 방법에 의해 정제하였다.

실시예 2: 보체 단백질 C3b에 대한 친화도

표면 플라스몬 공명 (SPR) 기반 검정법 (Schmidt et al. (2013), Journal of Immunology 190: 5712-5721)을 사용하여 중요한 보체 단백질 C3b에 대한 조작된 보체 억제제의 친화도를 측정하였다. 1940 반응 단위 (μRU)의 C3b를 칩에 커플링시켰다. 샘플을 농도 시리즈로 25 ㎕/min로 전개시켰고, 여기서, 재현가능성을 프로빙하기 위해 최고 농도 및 최저 농도를 이중으로 검정하였다. 다른 단백질에 대한 KD 값을 추정하기 위해, 검정된 농도에 대한 (안정 상태 동안의) 반응 플롯을 1:1 안정 상태 친화도 모델에 피팅하였다. CR1(15-17), DAF(1-4) 및 FH(19-20)에 대하여 측정된 KD 값은 각각 K_D = 0.95 μM, K_D = 11.5 μM 및 K_D = 4.67 μM이었고, 문헌과 잘 일치하였다. 결과는 하기 표 1에 제시되어 있다.

<표 1>

실시예 3: 붕괴 촉진 활성 검정법

붕괴 촉진 활성 (DAA)을 측정하기 위해, 확립된 SPR-기반 검정법 (Schmidt et al. (2013), ibd.) 또한 사용하였다. 3653 μRU의 C3b를 칩 표면에 커플링시켰다. 칩 표면 상에 정제된 단백질 인자 B 및 인자 D의 믹스 (콤테크(CompTech: 미국))를 유동시킴으로써, 인자 B는 C3b에 결합하고, 이로써, 인자 D가 인자 B를 절단하고, 활성화시킬 수 있게 한다. 그 결과로 칩 상에서 AP 컨버타제 C3bBb가 형성된다. 이분자 C3 컨버타제는 본질적으로는 느린 속도로 붕괴시키지만, DAA를 갖는 조절인자에의 노출시, 붕괴는 현저하게 촉진된다. 이러한 셋업을 이용하여 상이한 융합 단백질이 얼마나 효율적으로 C3bBb를 붕괴시킬 수 있는지에 대해 시험하였다. CR1(15-17)은 DAA는 보이지 않지만, 오직 보조인자 활성을 보이는 바, 이에 대조군으로서 진행시켰다.

실시예 4: 보조인자 검정법

CR1(15-17)을 함유하는 구축물이 보조인자 활성 (CA)을 갖는지 여부를 확인하기 위해, 4개의 피분석물: CR1(15-17), CR1(1-3)FH(19-20)CR1(15-17), DAF(1-4)FH(19-20)CR1(15-17) 및 DAF(1-4)FH(19-20)-SL (이는 음성 대조군으로서 포함되었다)을 이용하여 CA 검정법을 수행하였다. C3b 단독이 음성 대조군으로서 사용되었다.

C3b는 2개의 쇄: α- 및 β-쇄로 이루어져 있다. 보조인자의 존재하에서, 인자 I는 C3b의 α'-쇄 내의 특정 펩티드 결합을 절단시킴으로써 단백질분해에 의해 C3b를 iC3b (또는 C3dg)로 불활성화시킨다. 이러한 활성/프로세스는 SDS-PAGE 분석에 의해 쉽게 모니터링될 수 있다: 113 kDa의 큰 α'-쇄는 2회 절단되고, 이로써, 3개의 밴드가 생성된다: C3α'-68, -46 및-43 밴드. β-쇄는 비커팅 상태 그대로 유지된다. 예상대로, 음성 대조군은 α'-쇄를 절단시키지 않았지만, CR1(15-17)을 함유하는 모든 단편은 CA를 보였다.

실시예 5: 토끼 적혈구의 대체 경로 (AP)-특이적 보호 검정법

AP 활성화 경로를 특이적으로 억제시킬 수 있는 조작된 보체 조절제의 능력을 측정하기 위해, 토끼 적혈구 (RBC)의 용혈 검정법을 수행하였다. 이를 위해, 토끼 RBC를 억제제 및 하기 두 시약과 혼합된 25% 인간 혈청 중에서 인큐베이션시켰다: 칼슘 이온을 특이적으로 킬레이트화시키고, 이로써, 고전적 경로 (CP)의 임의의 활성을 차단시키기 위해, EGTA를 첨가하였다. AP 컨버타제는 충분한 양의 Mg 이온의 존재에 의존하기 때문에, 마그네슘 이온을 첨가하여 AP의 활성을 촉진시켰다. 토끼 적혈구는 인간 혈청에서의 AP의 공지된 활성인자이고, 이는 AP 활성을 프로빙하는 우수한 모델 시스템이다. 토끼 RBC 상의 초기의 C3(H2O) 및 C3b 침착은 AP 증폭 루프를 통해 빠르게 증식되고, 이는 대량의 C3b 침착 및 MAC 형성 및 세포 용해를 유도한다. 인간 RBC와 달리, 토끼 적혈구에는 인간 혈청에 존재하는 보체계를 조절할 수 있는 조절인자 단백질이 없다. 그 결과, 토끼 RBC는 용해되고, (분광광도법에 의해) 헤모글로빈 방출을 측정함으로써 용해 수준을 측정할 수 있다. 보체 조절 단백질에 스파이킹함으로써, (DAA 및 CA에 의해) AP를 억제시키고, 이로써, C3b 침착을 방지하고, 그 결과로, MAC 형성 및 용해 또한 방지한다. 결과는 도 2, 및 하기 표 2에 제시되어 있다.

<표 2>

실시예 4: 감작된 양 적혈구의 고전적 경로 (CP)-특이적 보호 검정법

보체계의 CP를 억제시킬 수 있는 조작된 보체 조절제의 능력을 측정하기 위해, 양 RBC를 이용하여 용혈 검정법을 수행하였다. 양 RBC는 그의 표면 상의 시알산 모이어티가 인간 FH를 동원하고, AP에 의한 용해로부터 그를 보호하기 때문에, 인간 혈청 중에서 쉽게 용해되지 않는다. 이러한 상황을 이용하며, 양 RBC를 이용하여 보체 활성화의 CP를 프로빙할 수 있다. 양 적혈구를 5% 인간 혈청에 노출시키기 전에, 그의 표면에 대한 항체로 감작시킨다. 마그네슘 및 칼슘 이온을 첨가함으로써 CP의 효율적 기능이 확실히 발휘되도록 하고, 이로써, 적혈구 표면 상의 항체가 C1 복합체에 의해 감지될 때, 활성화된다. 활성화 결과, C3-컨버타제가 형성되고, 점점 더 많은 C3b 분자가 침착되고, 결국에는 MAC가 형성되고, 세포 용해가 일어나게 된다. 양 RBC는 그의 표면 상에 음으로 하전된 시알산 분자를 갖고 있는 바, 이는 FH(19-20)에 의해 부분적으로 표적화될 수 있다는 것을 의미한다. 조작된 조절 단백질을 상기 검정법에서 시험하여 CP 활성화 경로를 억제시킬 수 있는 그의 능력을 프로빙하였다. 결과는 도 3 및 하기 표 3에 제시되어 있다.

<표 3>

실시예 5: 발작성 야간 헤모글로빈뇨증 (PNH) 적혈구의 AP 매개 용해의 임상적으로 관련된 생체외 모델

본 검정법을 위해 에쿨리주맙 치료를 받고 있는 PNH 환자로부터의 PNH 적혈구를 사용하였다. 본 검정법을 위해 ABO 매칭된 혈청을 사용하였다. 건강한 사람으로부터의 ABO 매칭된 RBC를 대조군으로서 사용하였다. 2회의 독립 실험을 수행하였고, 여기서, 데이터 점은 이중으로 검정하였다. 405 nm의 흡광도에서의 헤모글로빈 방출을 측정함으로써 PNH 적혈구의 용해를 측정하였다. 검정되는 조건하에서 오직/주로 PNH RBC가 용해되도록 제어하기 위해, 혈청 부재하의 PBS 중 대조군 샘플에서 (용해 비발생), 및 조작된 억제제가 첨가되지 않은, 혈청을 함유하는 샘플에 대하여, 건강한 세포 (PNH I형 세포), PNH II형 및 III형 세포의 비율을 (FACS 분석에 의해) 측정하였고, 임의로 PNH 세포 용해에 대한 값을 100%로 설정하였다. 혈청 인큐베이션 동안 PNH II 및 III 세포 비율이 감소하였다면, 이는 실제로 취약하게 PNH II 및 III 세포가 용해되었고, 헤모글로빈 방출에 기여하였다는 것을 나타내는 것이다 (그리고, 건강한 PNH I형 세포는 그러하지 않았다). 이는 실제로 발생하였으며, 405 nm의 흡광도 측정이 실제로 PNH III 세포 용해와 상관관계가 있다는 것을 입증한다. 결과는 도 4 및 하기 표 4에 제시되어 있다.

<표 4>

실시예 6:

PNH 적혈구를 PNH 적혈구 상에 존재하는 혈액군 항원에 대한 동종항체로 감작시켰을 때, 감작된 PNH 적혈구는 동종항체의 존재에 의존한 CP 활성을 통해 보체에 의존하는 방식으로 빠르게 용해되었다. 심지어 에쿨리주맙의 존재도 동종항체를 이용한 상기 챌린징 조건하에서 용혈을 방지하지 못했다. 이러한 CP 검정법에서는 본 실험을 위해 (양 적혈구 대신) 인간 세포를 갖는 보체 감수성인 PNH 적혈구를 사용하였다. 건강한 적혈구 또한 사용될 수 있고, 실험 판독값도 사용될 수 있다 (즉, 보체 활성 검출은 수득하기가 더 어려울 수 있다). 도 5에 제시된 결과를 수득하였다. 예상 밖으로, (본 검정법에서 C5 농도보다 5배 높은) 1.2 μM의 에쿨리주맙은 강력한 CP 활성화 후에 용해를 억제시키지 않고; 예상대로, (AP를 억제시키는 효율적인 농도보다 10배 높은 2.5 μM의) 미니FH는 CP 매개 용해를 억제시키지 않고; 0.17 μM의, 도 5에서 "삼중 I"로 지칭되는 DAF(1-4)FH19-20CR1(15-17)는 용혈 일부를 억제시키고; 7.3 μM의 CR1(1-3)은 용혈 일부를 억제시키고; 따라서, DAF(1-4)FH19-20CR1(15-17)이 CR1(1-3) (활성에서 40배 차이) 또는 에쿨리주맙 단독인 것보다 훨씬 더 효과적이다.

SEQUENCE LISTING <110> Universit? Ulm <120> Complement Inhibitors and Uses thereof <130> UU14017PC <150> EP16176739.7 <151> 2016-06-28 <160> 18 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 193 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Cys Asn Ala Pro Glu Trp Leu Pro Phe Ala Arg Pro Thr Gln Leu 1 5 10 15 Thr Asp Glu Phe Glu Phe Pro Ile Gly Thr Tyr Leu Asn Tyr Glu Cys 20 25 30 Arg Pro Gly Tyr Ser Gly Arg Pro Phe Ser Ile Ile Cys Leu Lys Asn 35 40 45 Ser Val Trp Thr Gly Ala Lys Asp Arg Cys Arg Arg Lys Ser Cys Arg 50 55 60 Asn Pro Pro Asp Pro Val Asn Gly Met Val His Val Ile Lys Gly Ile 65 70 75 80 Gln Phe Gly Ser Gln Ile Lys Tyr Ser Cys Thr Lys Gly Tyr Arg Leu 85 90 95 Ile Gly Ser Ser Ser Ala Thr Cys Ile Ile Ser Gly Asp Thr Val Ile 100 105 110 Trp Asp Gln Glu Thr Pro Ile Cys Asp Arg Ile Pro Cys Gly Leu Pro 115 120 125 Pro Thr Ile Thr Asn Gly Asp Phe Ile Ser Thr Asn Arg Glu Asn Phe 130 135 140 His Tyr Gly Ser Val Val Thr Tyr Arg Cys Asn Pro Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160 Arg Lys Val Phe Glu Leu Val Gly Glu Pro Ser Ile Tyr Cys 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tggtagaaag gttttcgagt tggttggtga gccatccatc tactgtactt 540 ccaacgatga ccaggttggt atttggtctg gtccagctcc acagtgtatt attggtggtg 600 gaggaggtgg tggaggtgga ggcggtggtg gtggaaaatg tggtccacct cctcctattg 660 acaacggtga cattacttcc ttcccattgt ccgtttacgc tccagcttct tccgttgagt 720 accagtgtca aaacctgtac cagttggagg gtaacaagag aatcacctgt agaaacggtc 780 aatggtccga accaccaaag tgcttgcacc catgtgttat ctccagagaa atcatggaaa 840 actacaacat tgccctgaga tggaccgcca agcaaaagtt gtactccaga actggtgagt 900 ccgttgagtt cgtctgtaag agaggttaca gattgtcctc cagatcccac actttgagaa 960 ctacttgttg ggacggaaag ttggagtacc ctacttgtgc ctaatagtct agaatatta 1019

Claims

(i) 고전적 및 대체 보체 활성화 경로의 컨버타제에 대한 컨버타제 붕괴 촉진 도메인인 제1 보체 제어 단백질 반복부 (CCP) 도메인,
(ii) 숙주 세포 인식 도메인, 및
(iii) 제2 CCP-포함 도메인
을 포함하는 다중-도메인 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 상기 제1 CCP-포함 도메인이 보체 수용체 1형 (CR1)의, 바람직하게는 인간 CR1의 CCP 1 내지 3을 포함하고/거나; 붕괴 촉진 인자 (DAF), 바람직하게는 인간 DAF의 CCP 1 내지 4를 포함하는 것인 다중-도메인 폴리펩티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 CCP-포함 도메인이 서열식별번호 1에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호 1과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 그로 이루어진 것인 다중-도메인 폴리펩티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 CCP-포함 도메인이 서열식별번호 2에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호 2와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 그로 이루어진 것인 다중-도메인 폴리펩티드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 CCP-포함 도메인이 CR1의, 바람직하게는 인간 CR1의 CCP 8 내지 10, 및/또는 15 내지 17을 포함하는 것인 다중-도메인 폴리펩티드.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 CCP-포함 도메인이 서열식별번호 3에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호 3과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 그로 이루어진 것인 다중-도메인 폴리펩티드.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포 인식 도메인이 보체 인자 H, 바람직하게는 인간 보체 인자 H의 CCP 6 내지 8, 및/또는 19 내지 20을 포함하는 것인 다중-도메인 폴리펩티드.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포 인식 도메인이 서열식별번호 4에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호 4와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 그로 이루어진 것인 다중-도메인 폴리펩티드.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중-도메인 폴리펩티드가 상기 도메인을 N-말단, 제1 CCP-포함 도메인, 숙주 세포 인식 도메인, 제2 CCP-포함 도메인, C-말단 순서로 포함하는 것인 다중-도메인 폴리펩티드.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중-도메인 폴리펩티드가 서열식별번호 5 또는 6에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호 5 또는 6과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 그로 이루어진 것인 다중-도메인 폴리펩티드.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 CCP-포함 도메인이 보체 인자 C3b 및 C4b에 대하여 결합 활성을 갖는, 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 보다 바람직하게는 적어도 3개의 CCP를 포함하는 것인 다중-도메인 폴리펩티드.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 CCP-포함 도메인이 보체 인자 C3b 및/또는 C4b에 대하여 결합 활성을 갖고, 바람직하게는 인자 I 보조인자 활성을 추가로 갖는, 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 보다 바람직하게는 적어도 3개의 CCP를 포함하는 것인 다중-도메인 폴리펩티드.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포 인식 도메인이 보체 인자 C3b 분해 생성물에의, 바람직하게는 iC3b 및/또는 C3dg에의 결합 활성을 갖고/거나; 숙주 세포 표면 마커, 바람직하게는 시알산 및/또는 글리코사미노글리칸을 포함하는 폴리음이온 탄수화물에의 결합 활성을 갖는, 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개의 CCP를 포함하는 것인 다중-도메인 폴리펩티드.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중-도메인 폴리펩티드가 적어도 2개, 바람직하게는 보다 바람직하게는 3개 모두의 보체계 활성화 경로를 억제시키는 활성을 갖는 것인 다중-도메인 폴리펩티드.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 다중-도메인 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제15항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제15항의 폴리뉴클레오티드 및/또는 제16항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로 사용하기 위한, 다중-도메인 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 부적절한 보체 활성화 및/또는 증상으로서 부적절한 보체 활성화를 보이는 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한, 다중-도메인 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 보체 단백질 C5 억제 폴리펩티드, 바람직하게는 에쿨리주맙과 함께 조합하여, 부적절한 보체 활성화 및/또는 증상으로서 부적절한 보체 활성화를 보이는 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한, 다중-도메인 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 다중-도메인 폴리펩티드, 제15항에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는 제16항에 따른 벡터와 함께 조합하여, 부적절한 보체 활성화 및/또는 증상으로서 부적절한 보체 활성화를 보이는 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한, 보체 단백질 C5 억제 폴리펩티드, 바람직하게는 에쿨리주맙.
(i) 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 다중-도메인 폴리펩티드, 및 (ii) 보체 단백질 C5 억제 폴리펩티드, 바람직하게는 에쿨리주맙을 포함하는, 동시, 별개 또는 순차적 사용을 위한 조합 제제.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 다중-도메인 폴리펩티드를 보체 인자를 포함하는 반응 혼합물에 적용하여
상기 반응 혼합물에서 보체 활성화를 예방하거나 또는 보체 활성화 정도를 감소시키는 단계
를 포함하는, 보체 활성화를 예방하거나 또는 보체 활성화 정도를 감소시키는 시험관내 방법.
부적절한 보체 활성화 및/또는 증상으로서 부적절한 보체 활성화를 보이는 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 다중-도메인 폴리펩티드, 제15항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 제16항에 따른 벡터의 용도.