ES2925219T3 - Compuestos útiles para inhibir CDK7 - Google Patents

Abstract

RESUMEN La presente invención proporciona nuevos inhibidores de CDK7 y composiciones farmacéuticas de los mismos: (I), o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Compuestos útiles para inhibir CDK7

La presente invención se refiere a compuestos útiles para inhibir la quinasa dependiente de ciclina 7 (CDK7), composiciones farmacéuticas y su uso en procedimientos para tratar enfermedades relacionadas con la actividad de la CDK7.

Las quinasas dependientes de ciclina (CDKs) son una clase principal de quinasas y son importantes en la proliferación de las células cancerosas y en la transcripción oncogénica desregulada. La CDK7 se une a la ciclina H y a la MATI para formar una quinasa activadora de ciclinas (CAK) trimérica que realiza su función fosforilando otras CDK implicadas en el control del ciclo celular. Estos complejos controlan transiciones específicas entre dos fases posteriores del ciclo celular. La CDK7 está implicada tanto en el control temporal del ciclo celular como en la actividad transcripcional. La CDK7 está implicada en el proceso de iniciación transcripcional mediante la fosforilación de la subunidad Rbp1 de la ARN polimerasa II (RNAPII). La proliferación celular descontrolada y la l transcripción desregulada son una característica del cáncer. El direccionamiento a CDK7 de forma selectiva puede ofrecer una ventaja al inhibir simultáneamente la transcripción activa y la progresión del ciclo celular. Por lo tanto, CDK7 es una diana prometedora para el tratamiento del cáncer, en particular de los cánceres agresivos y difíciles de tratar.

En la literatura se han notificado inhibidores de moléculas pequeñas contra la CDK7 (véase, por ejemplo ,WO 2015/154022, WO 2016/142855, WO 2016/160617, WO 2016/193939 y WO 2017/044858). Sigue siendo necesario proporcionar inhibidores de la CDK7 que puedan utilizarse en el tratamiento de trastornos proliferativos de las células, como el cáncer. Además, es necesario proporcionar inhibidores de CDK7 que sean selectivos para CDK7 en comparación con otras CDKs.

La presente invención proporciona novedosos compuestos que son inhibidores selectivos de CDK7. Estos nuevos compuestos podrían respondera la necesidad de un tratamiento potente y eficaz del cáncer, especialmente del cáncer con transcripción desregulada. La presente invención también podría abordar la necesidad de un tratamiento potente y eficaz del cáncer urotelial, el cáncer de útero, el cáncer colorrectal, el cáncer de mama, el cáncer de pulmón, el cáncer de ovario, el cáncer gástrico, el cáncer hepatobiliar, el cáncer de páncreas, los cánceres de cuello uterino, el cáncer de próstata, los cánceres hematológicos, los sarcomas, los cánceres de piel y/o los gliomas.

La presente invención proporciona un compuesto de fórmula I: en la que

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Se prefiere especialmente una sal de besilato. También se prefiere la sal de hidrato de hemi-edisilato.

La presente invención también proporciona los compuestos de la invención para su uso en un procedimiento para el tratamiento del cáncer, en particular para el tratamiento del cáncer con transcripción desregulada. Preferentemente, el cánceres un cáncer urotelial, un cáncer de útero, un cáncer colorrectal, un cáncer de mama, un cáncer de pulmón, un cáncer de ovario, un cáncer gástrico, un cáncer hepatobiliar, un cáncer de páncreas, un cáncer de cuello de útero, un cáncer de próstata, un cáncer hematológico, sarcomas, un cáncer de piel o gliomas. Más preferentemente, el cáncer es colorrectal, de mama, de pulmón, de ovarios o gástrico. Lo más preferible es que el cáncer sea cáncer de mama.

La presente invención también proporciona los compuestos de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento de cáncer urotelial, cáncer uterino, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer gástrico, cáncer hepatobiliar, cáncer urotelial, cáncer uterino, cáncer colorrectal cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer gástrico, cáncer hepatobiliar, cáncer de páncreas, cánceres de cuello uterino, cáncer de próstata, cánceres hematológicos, sarcomas, cánceres de piel o gliomas en un paciente, comprendiendo la comprobación de la presencia de al menos una mutación de pérdida de función en los genes AR D IA , KMT2C, KMT2^d y/o RB1 en una muestra biológica del paciente y administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o sal de la presente invención, en particular [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo al paciente si la muestra da positivo en al menos una mutación de pérdida de función en cualquiera de los genes ARID1A, KMT2C, KMT2D y/o RB1 . Preferentemente, la sal es una sal de besilato o una sal de hidrato de hemi-edisilato. Más preferentemente, el cáncer es colorrectal, de mama, de pulmón, de ovarios o gástrico. Lo más preferible es que el cáncer sea cáncer de mama. Preferentemente, la muestra biológica es una muestra tumoral y la muestra se ensaya mediante secuenciación genómica/ADN. Preferentemente, la muestra se obtiene del paciente antes de una primera administración del compuesto o sal del mismo, preferentemente [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, al paciente. Preferentemente, la sal es una sal de besilato o una sal de hidrato de hemi-edisilato. Preferentemente, el gen es el gen ARID1A . Preferentemente, el gen es el gen KMT2C . Preferentemente, el gen es el gen KMT2D . Preferentemente, el gen es el gen RB1 .

La presente invención también proporciona los compuestos de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento de cáncer urotelial, cáncer uterino, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer gástrico, cáncer hepatobiliar, cáncer de páncreas, cánceres de cuello uterino, cáncer de próstata, cánceres hematológicos, sarcomas, cánceres de piel o gliomas en un paciente, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o sal de la presente invención, en particular [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo al paciente, siempre que una muestra biológica del paciente contenga al menos una mutación de pérdida de función en los genes ARID1A, KMT2C, KMT2D y/o RB1 . Preferentemente, la sal es una sal de besilato o una sal de hidrato de hemi-edisilato. Más preferentemente, el cáncer es colorrectal, de mama, de pulmón, de ovarios o gástrico. Lo más preferible es que el cáncer sea cáncer de mama. Preferentemente, la muestra biológica es una muestra tumoral y la muestra se ensaya mediante secuenciación genómica/ADN. Preferentemente, la muestra se obtiene del paciente antes de una primera administración del compuesto o sal del mismo, preferentemente [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, al paciente. Preferentemente, la sal es una sal de besilato o una sal de hidrato de hemi-edisilato. Preferentemente, el gen es el gen ARID1A . Preferentemente, el gen es el gen KMT2C . Preferentemente, el gen es el gen KMT2D . Preferentemente, el gen es el gen RB1 .

La presente invención también proporciona los compuestos de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento de cáncer urotelial, cáncer uterino, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer gástrico, cáncer hepatobiliar, cáncer de páncreas, cánceres de cuello uterino, cánceres de próstata, cánceres hematológicos, sarcomas, cánceres de piel o gliomas en un paciente, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o sal de la presente invención, en particular [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo a un paciente, siempre que éste sea seleccionado para el tratamiento si una muestra biológica del paciente ha dado positivo en al menos una mutación de pérdida de función en los genes ARID1A, KMT2C, KMT2D y/o RB1 . Preferentemente, la sal es una sal de besilato o una sal de hidrato de hemi-edisilato. Más preferentemente, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario o cáncer gástrico. Lo más preferible es que el cáncer sea cáncer de mama. Preferentemente, la muestra biológica es una muestra tumoral y la muestra se ensaya mediante secuenciación genómica/ADN. Preferentemente, la muestra se obtiene del paciente antes de una primera administración del compuesto o sal del mismo, preferentemente [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, al paciente. Preferentemente, la sal es una sal de besilato o una sal de hidrato de hemi-edisilato. Preferentemente, el gen es el gen ARID1A . Preferentemente, el gen es el gen KMT2C . Preferentemente, el gen es el gen KMT2D . Preferentemente, el gen es el gen RB1 .

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica, que comprende un compuesto de la invenciónI, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en combinación con uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables. En otra realización, la composición comprende además uno o más agentes terapéuticos diferentes. En una realización adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer que comprende un compuesto de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en combinación con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables. En aún una realización adicional, lapresente invención proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer con transcripción desregulada que comprende un compuesto de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables. En dichas realizaciones, el cáncer es un cáncer urotelial, un cáncer de útero, un cáncer colorrectal, un cáncer de mama, un cáncer de pulmón, un cáncer de ovario, un cáncer gástrico, un cáncer hepatobiliar, un cáncer de páncreas, un cáncer de cuello de útero, un cáncer de próstata, un cáncer hematológico, sarcomas, un cáncer de piel o gliomas.

En una realización preferida, el cáncer es cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario o cáncer gástrico. En una realización más preferida, el cáncer es cáncer de mama.

Además, la presente invención proporciona un compuesto de la invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un procedimiento para el tratamiento del cáncer que también comprende realizar un ensayo in vitro utilizando una muestra biológica del paciente, determinando la presencia de al menos una mutación inactivadora en los genes ARID1A, KMT2C, KMT2D y R B I, y administrando una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto o sal del mismo al paciente si está presente al menos una mutación inactivadora en cualquiera de los genes. En dicha realización, el cáncer es para el tratamiento de cáncer urotelial, cáncer de útero, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer gástrico, cáncer hepatobiliar, cáncer de páncreas, cáncer de cuello de útero, cáncer de próstata, cánceres hematológicos, sarcomas, cánceres de piel o gliomas. Preferentemente, la muestra biológica es una muestra tumoral y la muestra se ensaya mediante secuenciación genómica/ADN. Preferentemente, el compuesto o la sal del mismo se administra al paciente en una dosis de aproximadamente 1 mg a 2 g. Preferentemente, la muestra se obtiene del paciente antes de la primera administración del compuesto o la sal del mismo al paciente. Preferentemente, se selecciona un paciente que tenga una mutación inactivadora en el gen ARID1A. Preferentemente, se selecciona un paciente que tenga una mutación inactivadora en el gen KMT2C . Preferentemente, se selecciona un paciente que tenga una mutación inactivadora en el gen KMT2D . Preferentemente, se selecciona un paciente que tenga una mutación inactivadora en el gen RB1 .

Además, la presente invención proporciona un compuesto de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en terapia, en particular para el tratamiento del cáncer con transcripción desregulada En realización adicional, la presente invención proporciona el uso de un compuesto de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer con transcripción desregulada. En dichas realizaciones, el cáncer es un cáncer urotelial, un cáncer de útero, un cáncer colorrectal, un cáncer de mama, un cáncer de pulmón, un cáncer de ovario, un cáncer gástrico, un cáncer hepatobiliar, un cáncer de páncreas, un cáncer de cuello de útero, un cáncer de próstata, un cáncer hematológico, sarcomas, un cáncer de piel o gliomas. En una realización preferida, el cáncer se selecciona de cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario o cáncer gástrico. En una realización más preferida, el cáncer es cáncer de mama.

En aún una realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en terapia, en particular para el tratamiento del cáncer. En una realización adicional, la presente invención proporciona el uso de un compuesto de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. En dichas realizaciones, el cáncer es un cáncer urotelial, un cáncer de útero, un cáncer colorrectal, un cáncer de mama, un cáncer de pulmón, un cáncer de ovario, un cáncer gástrico, un cáncer hepatobiliar, un cáncer de páncreas, un cáncer de cuello de útero, un cáncer de próstata, un cáncer hematológico, sarcomas, un cáncer de piel o gliomas. En una realización preferida, el cáncer es cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovarios o cáncer gástrico. En una realización más preferida, el cáncer es cáncer de mama. Además, la presente invención proporciona la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer urotelial, un cáncer uterino, un cáncer colorrectal, un cáncer de mama, un cáncer de pulmón, un cáncer de ovario, un cáncer gástrico, un cáncer hepatobiliar, un cáncer de páncreas, un cáncer de cuello de útero, un cáncer de próstata, un cáncer hematológico, sarcomas, un cáncer de piel o gliomas, comprendiendo también la realización de un ensayo in vitro utilizando una muestra biológica del paciente, determinando la presencia de al menos una mutación inactivadora en los genes ARID1A, KMT2C, KMT2D y RB1 , y administrando una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto o sal del mismo al paciente si está presente al menos una mutación inactivadora en cualquiera de los genes. Preferentemente, la muestra biológica es una muestra tumoral y la muestra se ensaya mediante secuenciación genómica/ADN. Preferentemente, el compuesto o la sal del mismo se administra al paciente en una dosis de aproximadamente 1 mg a 2 g. Preferentemente, la muestra se obtiene del paciente antes de la primera administración del compuesto o la sal del mismo al paciente. Preferentemente, se selecciona un paciente que tenga al menos una mutación inactivadora en el gen ARID1A . Preferentemente, se selecciona un paciente que tenga al menos una mutación inactivadora en el gen KMT2C . Preferentemente, se selecciona un paciente que tenga al menos una mutación inactivadora en el gen KMT2D . Preferentemente, se selecciona un paciente que tenga al menos una mutación inactivadora en el gen RB1 .

La presente invención proporciona un compuesto de la invención [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato en forma de sal cristalina. La presente invención también proporciona hidrato de hemi-edisilato de [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato cristalino. La presente invención también proporciona hidrato de hemi-edisilato de [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato en una forma cristalina caracterizada por un patrón de difracción de rayos X en polvo que tiene picos característicos utilizando radiación CuKa, en 20 ± 02°, que se producen a 18,5° en combinación con uno o más picos seleccionados del grupo que consiste en 21,5°, 16,7° y 15,2°. La presente invención también proporciona [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato besilato cristalino. La presente invención también proporciona [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato besilato en una forma cristalina caracterizada por un patrón de difracción de rayos X en polvo que tiene picos característicos utilizando radiación CuKa, en 20 ± 02°, que se producen a 21,5° en combinación con uno o más picos seleccionados del grupo que consiste en 12,4°, 17,3° y 15,8°. La presente invención también proporciona clorhidrato cristalino de [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato. La presente invención también proporciona clorhidrato de [(3S)-1 -[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato en una forma cristalina caracterizada por un patrón de difracción de rayos X en polvo que tiene picos característicos utilizando radiación CuKa, en 20 ± 02°, que se producen a 18,9° en combinación con uno o más picos seleccionados del grupo que consiste en 5,5°, 15,5° y 9,7°.

La presente invención también abarca productos intermedios y procesos útiles para la síntesis de un compuesto de la presente invención.

El término "tratar" (o "trato" o "tratamiento") tal como se usa en el presente documento se refiere a restringir, ralentizar, detener o revertir la progresión o gravedad de un síntoma, afección o trastorno existente.

Tal y como se utilizan aquí, los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la condición fisiológica en los pacientes que se caracteriza típicamente por una proliferación celular no regulada. En esta definición se incluyen los cánceres benignos y malignos. Por "cáncer en fase inicial" o "tumor en fase inicial" se entiende un cáncer que no es avanzado ni metastásico o que está clasificado como cáncer en fase 0, I o II. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, el cáncer urotelial, el cáncer de útero, el cáncer colorrectal, el cáncer de mama, el cáncer de pulmón, el cáncer de ovario, el cáncer gástrico, el cáncer hepatobiliar, el cáncer de páncreas, los cánceres de cuello de útero, el cáncer de próstata, los cánceres hematológicos, los sarcomas, los cánceres de piel o los gliomas.

Un compuesto de la presente invención puede reaccionar para formar sales farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables y la metodología habitual para prepararlas son bien conocidas en la técnica. (véase, por ejemplo, P. Stahl, et al. Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, 2nd Revised Edition (Wiley-vCH, 2011) S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts", Journal o f Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, Núm. 1, enero de 1977).

El artesano experto apreciará que un compuesto de la invención, como se muestra en (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, está comprendido de un núcleo que contiene un centro quiral, como se representa por * a continuación

Aunque la presente invención contempla todos los enantiómeros individuales, así como las mezclas de los enantiómeros de dichos compuestos, incluyendo los racematos, el compuesto preferido de la invención está representado por (II) a continuación:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Los expertos en la técnica también apreciarán que las denominaciones de Cahn-Ingold-Prelog (R) o (S) para todos los centros quirales variarán dependiendo de los patrones de sustitución del compuesto concreto. Los enantiómeros o diastereómeros individuales pueden prepararse comenzando con reactivos quirales o mediante técnicas sintéticas estereoselectivas o estereoespecíficas. Como alternativa, los enantiómeros o diastereómeros individuales pueden aislarse de las mezclas mediante técnicas cromatográficas o de cristalización quirales convencionales en cualquier punto conveniente de la síntesis de los compuestos de la invención. Los enantiómeros individuales de los compuestos de la invención son una realización preferida de la invención.

Un compuesto de la presente invención se formula preferentemente como composiciones farmacéuticas administradas por una variedad derutas. Dichas composiciones farmacéuticas y los procesos para prepararlas son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro, et al., eds., 21st ed., Mack Publishing Co., 2005)). o Más particularmente preferida, es una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula,

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes

Una realización preferida de la presente invención es

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Una realización especialmente preferida de la presente invención se refiere al compuesto, (3S)-1-[(2E)-4-(Dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il 4-{[5-metil-3-(propan-2-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il]amino}piperidin-1-carboxilato:

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo. Se prefiere especialmente la sal de hidrato de hemi-edisilato o la sal de besilato.

Otra realización especialmente preferida de la presente invención se refiere al compuesto, (3S)-1-[(2E)-4-(Dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il 4-{[5-metil-3-(propan-2-il)pirazolo[1,5-A]pirimidin-7-il]amino}piperidin-1-carboxilato

Otra realización especialmente preferida de la presente invención se refiere al compuesto, (3R)-1-[(2E)-4-(Dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il 4-{[5-metil-3-(propan-2-il)pirazolo[1,5-A]pirimidin-7-il]amino}piperidin-1-carboxilato (como se muestra en (111) a continuación):

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo. Se prefiere especialmente la sal de hidrato de hemi-edisilato o la sal de besilato.

Otra realización especialmente preferida de la presente invención se refiere al compuesto, (3R)-1-[(2E)-4-(Dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il 4-{[5-metil-3-(propan-2-il)pirazolo[1,5-A]pirimidin-7-il]amino}piperidin-1-carboxilato

Los compuestos de la presente invención son generalmente eficaces en un amplio intervalo de dosificación. Por ejemplo, las dosificaciones por día caen dentro del intervalo de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 2 g. En algunos casos, los niveles de dosificación por debajo del límite inferior del intervalo mencionado anteriormente pueden ser más que adecuados, mientras que en otros casos se pueden emplear dosificaciones aún mayores mientras se mantiene un perfil beneficio/riesgo favorable y, por lo tanto, el intervalo de dosificación anterior no pretende limitar el alcance de la invención de ninguna manera. Se entenderá que la cantidad del compuesto realmente administrada será determinada por un médico, a la luz de las circunstancias pertinentes, incluyendo la afección que se va a tratar, la vía de administración elegida, el compuesto o compuestos reales administrados, la edad, el peso y la respuesta del paciente individual, y la gravedad de los síntomas del paciente.

Los isómeros y enantiómeros individuales pueden ser separados o resueltos por un experto en la materia en cualquier punto conveniente de la síntesis de los compuestos de la invención, mediante procedimientos como las técnicas de cristalización selectiva o la cromatografía quiral (véase, por ejemplo, J. Jacques, et al., "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981 y E.L. Eliel and S.H. Wilen," Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994.

Además, ciertos productos intermedios descritos en el presente documento pueden contener uno o más grupos protectores. El grupo protector variable puede ser el mismo o diferente cada vez que aparece, dependiendo de las condiciones particulares de reacción y de las transformaciones particulares a realizar. Las condiciones de protección y desprotección son bien conocidas por el artesano experto y se describen en la bibliografía (véase, por ejemplo, "Greene's Protective Groups in Organic Synthesis", cuarta edición, por Peter G.M. Wuts y Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007).

Otras abreviaturas se definen como sigue: "1H RMN" se refiere a resonancia magnética nuclear 1H; "eq" se refiere a equivalente; "THF" se refiere a tetrahidrofurano; "DCM" se refiere a diclorometano; "MeCN" o "ACN" se refiere a acetonitrilo; "DMSO" se refiere a dimetilsulfóxido; "MTBE" se refiere al metil tert-butil éter; "TEA" se refiere a la trimetilamina; "HATU" se refiere al I-[Bis(dimetilamino)metileno]-I 8-1,2,3-triazolo[4, 5-b]piridinio 3-oxidhexafluorofosfato; "MeOH" se refiere al metanol; "TLC" se refiere a la cromatografía en capa fina; "UV" se refiere al ultravioleta; "Columna LC" se refiere a la columna de cromatografía líquida; "DMEA" se refiere a la dimetilmetilamina; "EtOAc" se refiere al acetato de etilo; "DMF" se refiere a la dimetilformamida; "SCX" se refiere al intercambio catiónico fuerte; "ca." se refiere a aproximadamente; "RBF" se refiere a matraz de fondo redondo; "ATP" se refiere a trifosfato de adenosina; "DTT" se refiere a ditiotreitol; "HEPES" se refiere a (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico); "EDTA" se refiere a ácido etilendiaminotetraacético; "ATCC" se refiere a American Type Culture Collection; "TA" se refiere a temperatura ambiente; "PBS" se refiere a la solución salina tamponada con fosfato; "BSA" se refiere a la albúmina de suero bovino; "FBS" se refiere al suero bovino fetal; "ARNasa" se refiere a la ribonucleasa; "ADNc" se refiere al ADN complementario; "GST" se refiere a la glutatión S-transferasa; "His" se refiere a la histidina; "GSH" se refiere al glutatión; y "HBSS" se refiere a la solución salina equilibrada de Hank.

Los compuestos de la presente invención, o las sales de los mismos, pueden prepararse mediante una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica, así como las Preparaciones y Ejemplos a continuación. Las etapas sintéticas específicas de cada una de las vías descritas pueden combinarse de diferentes maneras, o junto con etapas de diferentes esquemas, para preparar compuestos de la invención, o sales de los mismos. Los productos de cada etapa de los esquemas que se presentan a continuación pueden recuperarse mediante métodos convencionales bien conocidos en la técnica, como la extracción, la evaporación, la precipitación, la cromatografía, la filtración, la trituración y la cristalización. Los reactivos y los materiales de partida están fácilmente disponibles para los expertos en la técnica.

Las siguientes preparaciones y ejemplos ilustran aún más la invención y representan la síntesis típica de los compuestos de la presente invención.

Preparaciones y ejemplos

Preparación 1

Síntesis de 3-isopropilpirazolo[1,5-a]pirimidin-5,7-diol.

Se añade etoxido de sodio (979 g, 14,4 moles, 3,0 eq) y malonato de dietilo (998 g, 6,23 moles, 3,0 eq) a 23 °C a una solución de 4-isopropil-1H-pirazol-3-amina (600 g, 4,79 moles) en etanol (4,2 L) y se calienta la mezcla a 80 °C (temperatura interna) durante 15 horas. Enfriar la mezcla a 25 °C, añadir HCl ac. 1M (2,0 L) (pH final = 2,0), filtrar, lavar el sólido con agua (2,0 L) y secar para obtener 3-isopropilpirazolo[1,5-a]pirimidin-5,7-diol (600 g, 65 %) como sólido blanco. ES/MS m/z 194 (M+H).

Preparación 2

Síntesis de 5,7-dicloro-3-isopropil-pirazolo[1,5-d]pirimidina

Añadir POCh (2,00 L, 25,8 moles, 10 eq) y N,N-dimetilanilina (162 ml, 2,58 moles, 1,0 eq) a una suspensión de 3-isopropilpirazolo[1,5-a]pirimidin-5,7-diol (500 g, 2,58 moles) en MeCN (1,25 L) a 50 °C y calentar la mezcla a 100 °C durante 36 horas. Enfriar a 23 °C, verter gota a gota en hielo/ tampón fosfato 1:1 (1 M, pH = 8, 10 L) y agitar durante 15 horas. Se filtra, se lava el sólido con agua (5,0 L) y se seca para obtener 5,7-dicloro-3-isopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidina (375 g, 63 %) como sólido marrón. ES/MS (m/z)(³⁵Cl/³⁷Cl) 230/232 [M+1]+ ¹H RMN (d⁶-DMSO) 81,32 (d, 6H), 3,19 (dq, 1H), 7,58 (s, 1H), 8,31 (s, 1H).

Síntesis alternativa de 5,7-dicloro-3-isopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidina.

Se añade etoxido de sodio -21 % en etanol-(17,9 ml, 47,9 mmol) a una solución de 4-isopropil-1H-pirazol-5-amina (5 g, 39,9 mmol) y malonato de dietilo (6,74 ml, 43,9 mmol) en etanol (150 ml) y se agita a TA. Tras 5 minutos, calentar a 90 °C y remover. Después de 18 horas, enfriar a temperatura ambiente y concentrar bajo presión reducida. Disolver el residuo con agua y añadir ácido clorhídrico 1 N hasta alcanzar un pH=3. Filtrar el precipitado blanco y secar a presión reducida a 50 °C durante 18 horas. Suspender el sólido resultante, 3-isopropilpirazolo[1,5-a]pirimidin-5,7-diol (4,92 g, 25,5 mmol, 0,638) en oxicloruro de fósforo (48 ml) y añadir N,N-dimetilanilina (2,3 ml). Someter a reflujo la mezcla a 110 °C. Después de 2 horas, enfriar a TA y concentrar a presión reducida. Verter el residuo en una solución de hielo/agua y extraer con DCM (dos veces). Combinar las capas orgánicas y lavar con salmuera, secar sobre sulfato de magnesio. La reacción se enfría y se concentra a presión reducida para dar un residuo amarillo. Se purifica el residuo por cromatografía instantánea (gel de sílice), eluyendo con hexano de etilo: acetato para proporcionar 5,7-dicloro-3-isopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidina (4,45 g, 19,3 mmol) como sólido marrón. MS (m/z): 230.232 (M+1). ¹H-RMN (400,21 MHz, DMSO) 8: 8,31 (s, 1 H), 7,58 (s, 1 H), 3,19 (m, 1 H), 1,32 (d, J= 7,0 Hz, 6H).

Preparación 3

Síntesis de 4-[(5-cloro-3-isopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato de tert-butilo.

Añada N,N-diisopropiletilamina (189 ml, 140 g, 1080 mmol, 2 eq) y 4-aminopiperidin-1-carboxilato de tert-butilo (114 g, 570 mmol, 1,05 eq) a una suspensión de 5,7-dicloro-3-isopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidina (130 g, 542 mmol) en 2-propanol (1,0 L) a 23 °Cy se agita la mezcla durante 18 horas. Se filtra, se lava el sólido con MTBE (200 ml) y se seca para obtener 4-[(5-cloro-3-isopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato de tert-butilo (182 g, 85 % de rendimiento) como sólido amarillo. ES/MS (m/z) (35Cl/37Cl) 394/396 (M+H) 1H RMN (d6-DMSO) 5 1,28 (d, 6H), 1,42 (s, 9H), 1,61 (m, 2H), 1,83 (m, 2H), 2,87 (m, 1H), 3,10 (dq, 1H), 3,32 (m, 1H), 3,85 (m, 1H), 3,98 (m, 2H), 6,34 (s, 1H), 8,01 (s, 1H), 8,07 (d, 1H).

Preparación 4

Síntesis de 4-[tert-butoxicarbonil-(5-cloro-3-isopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato de tert-butilo.

Añada N,N- diisopropiletilamina (69,1 ml, 51,2 g, 396 mmol, 1 eq), 4-dimetilaminopiridina (4,84 g, 39,6 mmol, 0,1 eq) y dicarbonato de di-tert-butilo (200 ml, 190 g, 871 mmol, 22 eq) a una solución de 4-[(5-cloro-3-isopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato de tert-butilo (156 g, 396 mmol) en THF (936 ml) a 23 °C, y caliente la mezcla a 50 °C (temperatura interna) durante 21 horas. Se enfría a 23 °C y se concentra al vacío para obtener 4-[tertbutoxicarbonil-(5-cloro-3-isopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato de tert-butilo (195 g, 99 %) como sólido naranja. ES/MS m/z (35Cl/37Cl) 438/440 (M+H-56). 1H RMN (d6-DMSO) 5 1,20 (s, 9H), 1,31 (d, 6H), 1,35 (s, 9H), 1,46 (m,2H), 1,88 (m, 2H), 2,75 (m, 1H), 3,19 (dq, 1H), 3,32 (m, 1H), 3,95 (m, 1H), 4,18 (m, 2H), 7,20 (s, 1H), 8,19 (s, 1H).

Síntesis alternativa de 4-[tert-butoxicarbonil-(5-cloro-3-isopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato.de tert-butilo

Se añade 4-aminopiperidin-1-carboxilato de tert-butilo (2,8 g, 14 mmol) a una solución de 5,7-dicloro-3-isopropilpirazolo[1,5-a]pirimidina (3,1 g, 13 mmol) en etanol (32 ml). Calentara 80 °C. Tras 18 horas, enfriar a TA y concentrar a presión reducida. Se purifica el residuo mediante cromatografía instantánea (gel de sílice), eluyendo con acetato de etilo:DCM para proporcionar 4-[tert-butoxicarbonil-(5-cloro-3-isopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato de tert-butilo como sólido blanco. Espectro de masas (m/e): 394,396(M+1) Añada carbonato de tertbutoxicarbonilo tert-butilo (1,14 g, 5,22 mmol) a una solución de 4-[(5-cloro-3-isopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato de tert-butilo (940 mg, 2,386 mmol) y 4-dimetilaminopiridina (290 mg, 2,33 mmol) en THF (7 ml). Calentar la mezcla a 60 °C. Tras 30 minutos, enfriar a TA y concentrar a presión reducida. Se purifica el residuo mediante cromatografía instantánea (gel de sílice), eluyendo con DCM para proporcionar 4-[tert-butoxicarbonil-(5-cloro-3-isopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato de yert-butilo (1,1 g) como un aceite amarillento. Espectro de masas (m/z): 438(M-t-Bu). 1H RMN (400,13 MHz, d6-DMSO): 8,19 (s, 1H), 7,20 (s, 1H), 5,76 (s, 1H),4,17(m, 1H), 3,95 (m, 2H), 3,19 (m, 1H), 1,87 (m, 2H), 1,47 (m, 2H), 1,35 (s, 9H), 1-31 (d, 6H), 1,19 (s,9H).

Preparación 5

Síntesis de 4-[tert-butoxicarbonN-(3-isopropN-5-metN-pirazolo[1,5-a]pirimidm-7-N)ammo]piperidm-1-carboxilato de tert-butilo.

Se añade el aducto de [1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]dicloropaladio (II) DCM (15,7 g, 19,3 mmol, 0,05 eq), fosfato potásico tribásico (245 g, 1160 mmol, 3 eq), y 2,4,6-trimetil-1,3,5,2,4,6-trioxatriborinano (50 % en masa en THF, 75,3 ml, 67,6 g, 270 mmol, 0,7 eq) a una solución de 4-[tert-butoxicarbonil-(5-cloro-3-isopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato de tert-butilo (190 g, 385 mmol) en 1,4-dioxano (1,5 ^l) a 90 °C (temperatura interna). Después de 5 días, enfriar a 23 °C, filtrar a través de una almohadilla de tierra de diatomeas y enjuagar el sólido con THF (3 x 250 ml). Tratar los filtrados combinados a 23 °C con resina SiliaMetS® Thiol (40-63 ^m; carga = 1,46 mmol/g; 320 g, 467 mmol), y calentar a 65 °C durante 18 horas. Enfriar a 23 °C, filtrar y lavarla resina con DCM (2 x 250 ml). Se concentran los filtrados combinados en vacío, se disuelve el residuo en MTBE (1 ml), se lava con agua (200 ml), se seca (MgSO4) y se concentra en vacío para obtener 4-[tert-butoxicarbonil-(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato de tert-butilo (182 g, 100 %) como sólido marrón. E^s /MS m/z 474 (M+H).

Preparación 6

Síntesis de dihidrocloruro de 3-isopropil-5-metil-N-(4-piperidil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-amina

Añada ácido clorhídrico en 2-propanol (5,50 mol/L, 349 ml, 1920 mmol, 5 eq) a una suspensión de 4-[tertbutoxicarbonil-(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato de tert-butilo (182 g, 384 mmol) en 2-propanol (1,4 L) a 23 °C, y calentar la mezcla a 70 °C (temperatura interna) durante 3 horas. Se enfría a 23 °C, se filtra, se lava el sólido con MTBE (2 x 200 ml) y se seca para obtener dihidrocloruro de 3-isopropil-5-metil-N-(4-piperidil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-amina (95 g, 71 % de rendimiento) como sólido amarillo. Combinar los licores madre, diluir con MTBE (2 L), filtrar, lavar el sólido con MTBE (2 x 50 ml) y secar para obtener material adicional (8,42 g, rendimiento del 15 %). ES/MS m/z 274 (M+H). 1H RMN (d6-DMSO) 51,28 (d, 6H), 2,04 (m, 4H), 2,61 (s, 3H), 3,00 (m, 2H), 3,40 (m, 3H), 4,16 (m, 2H), 6,68 (s, 1H), 8,30 (s, 1H), 8,80 (m, 1H), 9,21 (m, 1H), 9,86 (m, 1H).

Síntesis alternativa de dihidrocloruro de 3-isopropil-5-metil-N-(4-piperidil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-amina .

Disolver 7-cloro-3-isopropil-5-metilpirazolo[1,5-a]pirimidina (2,1 kg, 10,0 mol) y diisopropiletilamina (4,18 L, 2,4 eq) en isopropanol (16,8 L, 8 ml/g). Cargar el 4-aminopiperidin-1-carboxilato de tert-butilo (2,6 kg, 1,3 eq.) a la mezcla de reacción y calentar a 75-80 °C durante 16 horas. Enfriar la mezcla de reacción a 5-10 °C y añadir una solución 4 M de ácido clorhídrico en isopropanol (17,5 L, 7,0 eq). Calentar a 40-45 °C durante 4 horas. Se enfría a 25-30 °C y se filtra la mezcla para obtener el compuesto del título (2,25 kg, rendimiento del 72,7 %). El material se utilizó directamente en el siguiente paso sin purificación adicional. ¹H RMN (500 MHz,D²O) 58,16 (s, 1H), 6,45 (s, 1H), 4,29-4,26 (m,1 H), 3,63 (d, J = 15,0 Hz, 2H), 3,26 - 3,12 (m, 3H), 2,64 (s, 3H), 2,40 (d, J = 15,0 Hz, 2H), 2,08 (dd, J =10,0, 25,0 Hz, 2H), 1,31 (d, J = 5,0 Hz, 6H).

Síntesis alternativa de 3-isopropil-5-metil-N-(4-piperidil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-amina como base libre.

Se añade 1,4-dioxano (15 ml) a una mezcla de 4-[tert-butoxicarbonil-(5-cloro-3-isopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato de tert-butilo (689 mg, 1,39 m mol), 2,4,6-trimetil-1,3,5,2,4,6-trioxatriborinano (350 mg, 2,79 mmol) y fosfato potásico tribásico (1,2 g, 5,5 mmol,). Hacer burbujas de N² en la solución durante 5 minutos. Añadir [1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]dicloro paladio(II) (60 mg 0,072 mmol). Calentar a 110 °C. Tras 1,5 horas, añadir más [1,1-bis(difenilfosfino)ferroceno]dicloropaladio(II) (60 mg, 0,072 mmol) y calentara 100 °C. Después de 18 horas, enfriar a TA, filtrar la mezcla a través de una almohadilla de filtro cel, enjuagar con acetato de etilo y concentrar a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía instantánea (gel de sílice), eluyendo con acetato de etilo y DCM para proporcionar 4-[tert-butoxicarbonil-(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato (537 mg, 1,077 mmol) como un aceite anaranjado. Espectro de masas (m/z): 474 (M+1).

Añada ácido trifluoroacético (2,5 ml, 33 mmol) gota a gota a una solución de 4-[tert-butoxicarbonil-(3-isopropil-5-metilpirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato de tert-butilo (537 mg, 1,077 mmol) en DCM (12 ml). Agitara TA. Después de 2 horas, concentrar la mezcla bajo presión reducida. Purificar el residuo por elución del cartucho SCX-2 con DCM al 10 %: MeOH y luego MeOH (2 N NH³). Se concentra la fracción básica a presión reducida para proporcionar 3-isopropil-5-metil-N-(4-piperidil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-amina (345 mg, 1,199 mmol) como sólido marrón. Espectro de masas (m/z): 274 (M+1). ¹H-RMN (400,13 MHz, DMSO) 5: 7,82 (s, 1 H), 7,23 (d, 1 H), 6,08 (s, 1 H), 3,58 (m, 1 H), 3,12 (m, 1 H), 2,97 (m, 2 H), 2,58 (m, 2 H), 2,39 (s, 3 H), 2,10 (m, 2 H), 1,28 (d, 6 H).

Preparación 7

Síntesis de [(3S)-1-tert-butoxicarbonilpirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato

Se añade fosgeno (20 % en masa en tolueno, 348 ml, 485 g, 981 mmol, 2,4 eq) a una solución de (3S)-3-hidroxipirrolidin-1 -carboxilato de tert-butilo (76,5 g, 409 mmol) en THF (765 ml) colocada en un RBF de 3 cuellos conectado a una botella trampa depuradora que contiene NH4OH acuoso al 32 %, a 23 °C durante 1 hora. Se burbujea N2 a través de la mezcla durante 30 minutos y concentrar al vacío. Se disuelve el residuo en DCM (757 ml), se enfría a 0 °C (temperatura interna) y se añade (adición lenta durante 7 minutos) una suspensión de dihidrocloruro de 3-isopropil-5-metil-N-(4-piperidil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-amina (94,6 g, 273,2 mmol) en DCM (756,8 ml), previamente tratada con trietilamina (228 ml, 166 g., 1639 mmol, 6 eq). Retire el baño de enfriamiento después de la adición, e inactive la reacción después de 30 minutos con HCl acuoso al 35 % (20 ml) y HCl acuoso 1 M (300 ml) (pH final = 7). Separar la capa orgánica, lavar con agua (300 ml) y NaCl acuoso saturado (300 ml), secar (MgSO4) y concentrar al vacío. Se disuelve el residuo (unos 180 g) en DCM (1,5 L), se añade la resina SiliaMetS® Thiol (40-63 ^m; carga = 1,46 mmol/g; 10 g, 14,6 mmol, 140 eq en base al contenido de Pd) a 23 °C, y se calienta la mezcla a 40 °C durante 2 horas. Se filtró, se enjuagó la resina con DCM (2 * 10 ml) y se concentraron los filtrados combinados en vacío para obtener [(3S)-1 -tert-butoxicarbonilpirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato (129 g, 97 %) como sólido amarillo. ES/MS m/z 487 (M+H). 1H RMN (d6-DMSO) 5 1,28 (d, 6H), 1,40 (s, 9H), 1,65 (m, 2H), 1,88 (m, 2H), 1,96 (m, 1H), 2,07 (m, 1H), 2,46 (s, 3H), 2,90 (m, 2H), 3,31 (m, 5H), 3,89 (m, 1H), 4,02 (m, 2H), 5,10 (m, 1H), 6,32 (s, 1H), 8,01 (s, 1H)

Síntesis alternativa de [(3S)-1-tert-butoxicarbonilpirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato

Disolver el (3S)-3-hidroxipirrolidin-1-carboxilato de tert-butilo (438 g, 1,3 eq.) en ACN (4,4 L, 10,0 ml/g) a 15-30 °C. Añadirtrietilamina (595 ml, 4,5 eq.) seguida de cloroformato de 4-nitrofenilo (490 g, 1,4 eq.) a 15-30 °C. Calentara 35­ 40 °C y agitar la mezcla durante 4 horas. Enfriar a 15-25 °C y añadir 3-isopropil-5-metil-N-(piperidin-4-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-amina (500 g, 1,8 mol). Revolver a 30 °C durante 5 minutos. Concentrar bajo presión reducida. Añadir 2-metiltetrahidrofurano (4,4 L, 10,0 ml/g), agitar y filtrar. Lavar el filtrado secuencialmente con NaOH 2 M (1,1 L, 2,5 ml/g, 4 veces) y NaCl acuoso saturado (4,4 L, 10,0 ml/g). Secar sobre Na2SO4, filtrar y concentrar a presión reducida. Se añade alcohol isopropílico (2,2 L, 5 ml/g) para obtener una solución del compuesto del título (660 g, 75,4 % de rendimiento).

Preparación 8

Síntesis de [(3S)-pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato.

Añada ácido clorhídrico en 2-propanol (550 mol/L, 217 ml, 1190 mmol, 5 eq) a una suspensión de [(3S)-1-tertbutoxicarbonilpirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato (116 g, 239 mmol) en 2-propanol (755 ml) a 23 °C, y caliente la mezcla a 70 °C durante 90 minutos. Enfriar a 23 °C y concentrar al vacío. Suspender el residuo en Dc M (1,5 L), añadir NaOH AC. 1 M (400 ml) y 50 % ac. NaOH (100 ml). Revolver a 0 °C durante 15 minutos. Separar la fase orgánica, secar (MgSO⁴) y concentrar al vacío. Suspender el residuo (unos 131 g) en MTBE / hexano (2:1, 900 ml), y agitar la mezcla durante 18 horas. Se filtró, se lavó el sólido filtrado con hexano (2 * 100 ml) y se secó para obtener [(3S)-pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato (82,7 g, 90 % de rendimiento) como sólido amarillo. ES/MS m/z 387 (M+H). ¹H RMN (d⁶-DMSO) 51,28 (d, 6H), 1,60 (m, 3H), 1,88 (m, 3H), 2,40 (s, 3H), 2,75 (m, 2H), 2,91 (m, 4H), 3,13 (dq, 1H), 3,78 (m, 1H), 4,02 (m, 2H), 5,10 (m, 1H), 6,14 (s, 1H), 7,41 (d, 1H), 7,87 (s, 1H).

Síntesis alternativa de [(3S)-pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato.

Añadir ácido clorhídrico 5,5 M en alcohol isopropílico (8,4 L, 5,0 ml/g) a la solución de alcohol isopropílico que contiene (S)-1-(tert-butoxicarbonil)pirrolidin-3-il 4-((3-isopropil-5-metilpirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino)piperidin-1-carboxilato (819 g) a 20-30 °C. Calentar la mezcla de reacción a 50-60 °C durante 5 horas. Enfriar a 30-35 °C, añadir MTBE (8,2 L, 10 ml/g) y agitar durante 1 hora. Filtrar, añadir la torta húmeda al hidróxido de sodio acuoso (3,0 equiv) a 0-5 °C y agitar durante 30 minutos. Añadir 2-metiltetrahidrofurano (8,2 L, 10,0 ml/g) y agitar. Extraer la fase orgánica y lavar con NaCl acuoso saturado. Secar sobre sulfato de sodio, filtrar y concentrar a presión reducida hasta 1-2 volúmenes. Añadir MTBE (2,46 l, 3 ml/g) y agitar durante 3 horas. La filtración proporciona el compuesto del título. (550 g). ¹H RMN (400 MHz, CDCl^s) 57,82 (s, 1H), 6,12 (d, J =8,1 Hz, 1H), 5,78 (s, 1H), 5 ,27-5,13 (m, 1H), 4,26-4,01 (m, 2H), 3,74- 3,59 (m, 1H), 3 ,36-3,23 (m, 1H), 3 ,14-2,98 (m, 5H), 2,90 (ddd, J =11,1, 8,4, 5,4 Hz, 1H), 2,52 (s, 3H), 2,18 -2,00 (m, 3H), 1,87 (dd, J = 12,6, 6,4 Hz, 1H), 1,76 (s, 1H), 1,66 - 1,52 (m, 2H), 1,34 (d, J = 6,9 Hz, 6H).

Síntesis alternativa de [(3S)-pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato.

Se añade fosgeno (1,14 ml, 20 % en masa en tolueno, 3,20 mmol) a una solución fría (0 °C) de (3S)-3-hidroxipirrolidin-1-carboxilato de tert-butilo (500 mg, 2,67 mmol) y TEA (0,37 ml, 2,6 mmol) en THF (13 ml). Eliminar el baño de enfriamiento y agitar durante 30 minutos a TA. Tras 30 minutos, concentrar la mezcla a presión reducida y disolver el residuo en DCM (11 ml). Añada esta solución a una solución de 3-isopropil-5-metil-N-(4-piperidil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-amina (C, 365 mg, 100 % en masa, 0,365 g) y TEA (0,3 ml) en DCM (11 ml). Agitar la mezcla a TA. Tras 10 minutos, añadir una solución acuosa saturada de NaHCO3 y extraer con más DCM. Combinar las capas orgánicas y lavar con NaCl acuoso saturado, secar sobre sulfato de magnesio, filtrar y concentrar a presión reducida para dar un residuo. Purificar el residuo por cromatografía instantánea (gel de sílice), eluyendo con DCM: MeOH para proporcionar [(3S)-1 -tert-butoxicarbonilpirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato (671 mg) como un aceite amarillento. Espectro de masas (m/z): 487 (M+1).

Añada gota a gota ácido trifluoroacético (2 ml, 26,45 mmol) a una solución de [(3S)-1 -tert-butoxicarbonilpirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato (671 mg, 1,269 mmol) en DCM (12 ml). Agitar a Ta . Tras 18 horas, concentrarla mezcla a presión reducida. Disolver el residuo en DCM y lavar la fase orgánica con una solución acuosa de K2CO3 al 10%. Se seca la fase orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtra y se concentra a presión reducida para proporcionar [(3S)-pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato (274 mg, 0,6593 mmol) como espuma blanca. Espectro de masas (m/z): 387 (M+1).

1H RMN (400,13 MHz, d6-DMSO): 7,87 (s, 1H), 7,42 (d, J= 9,0 Hz, 1H), 6,13 (s, 1H), 5,00 (ddd, J= 9,0, 5,2, 2,5 Hz, 1H), 4,02 (m, 2H), 3,77 (m, 1 H), 3,13 (m, 1 H), 2,89 (m, 4 H), 2,72 (m, 2H), 2,40 (s, 3 H), 1,87 (dd, J= 6 ,8 , 14,1 Hz, 2 H), 1,63 (m, 3 H), 1,28 (d, J= 6,8 Hz, 6 H).

Preparación 9

Síntesis de [(3R)-pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato

Se añade foseno (1,14 ml, 20 % en masa en tolueno, 3,20 mmol) a una solución fría (0 °C) de (3R)-3-hidroxipirrolidin-1-carboxilato de tert-butilo (500 mg, 2,67 mmol) y TEA (0,37 ml, 2,6 mmol) en t Hf (13 ml). Eliminar el baño de enfriamiento y agitar durante 30 minutos a TA.

Tras 30 minutos, concentrar la mezcla a presión reducida y disolver el residuo en DCM (11 ml). Añada esta solución a una solución de 3-isopropil-5-metil-N-(4-piperidil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-amina (365 mg, 100 % en masa, 0,365 g) y TEA (0,3 ml) en DCM (11 ml). Agitar la mezcla a TA. Tras 10 minutos, añadir una solución acuosa saturada de NaHCO3 y extraer con más DCM. Combinar las capas orgánicas y lavar con NaCl acuoso saturado, secar sobre sulfato de magnesio, filtrar y concentrar a presión reducida para dar un residuo. Se purificó el residuo mediante cromatografía instantánea (gel de sílice), eluyendo con hexano: acetato de etilo para proporcionar [(3R)-1-tert-butoxicarbonilpirrolidin-3- il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato (350 mg) como un aceite amarillento. Espectro de masas (m/z): 487 (M+1).

Añada gota a gota ácido trifluoroacético (0,8 ml, 0,72 mmol) a una solución de [(3R)-1 -tert-butoxicarbonilpirrolidin-3-il] 4- [(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato (350 mg, 0,72 mmol) en DCM (7 ml). Agitar a TA. Tras 45 minutos, concentrar la mezcla a presión reducida. Purificar el residuo por elución del cartucho SCX-2 con DCM al 10 %: MeOH y luego MeOH (2 N Nh3). Se concentra la fracción básica a presión reducida para proporcionar [(3R)-pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato (246 mg) como un sólido marrón. Espectro de masas (m/z): 387 (M+1).

Preparación 10

Síntesis de 3-isopropil-5-metil-4H-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-ona

Disuelva la 4-isopropil-1H-pirazol-5-amina (2,2 kg, 17,6 mol) y el acetoacetato de etilo (2,86 kg, 1,25 eq.) en ácido acético (17,6 L, 8,0 ml/g.). Calentar la mezcla hasta 110-115 °C y luego enfriarla hasta 35-40 °C. Añadir heptano y MTBE (44 L, 20 ml/g., relación 5/1). Se filtra y se enjuaga el sólido con heptano (4,4 L, 2 ml/g.) para dar el compuesto del título (2,28 kg, 85,5 % de rendimiento). 1H RMN (d6-DMSO) 511,81 (s, 1H), 7,77 (sa, 1H), 5,50 (m, 1H), 3,08 (m, 1H), 2,31 (m, 1H), 1,22 (sa, 1H).

Preparación 11

Síntesis de 7-doro-3-isopropil-5-metilpirazolo[1,5-a]pirimidina

Disuelva la 3-isopropil-5-metil-4H-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-ona (2,1 kg, 11,0 mol) y la N,N-dimetilanilina (0,86 kg, 0,65 eq.) en ACN (8,4 L, 4 ml/g.). Calentar la reacción a 50-55 °C y añadir POCl3 (4,2 kg, 2,5 eq.) gota a gota. Ajustar la temperatura a 60-65 °C y agitar la mezcla durante 9 horas. Enfriar la mezcla a 25-30 °C y verterla en tampón de fosfato de potasio 2M (pH=8,0, 42 L, 20 ml/g). Añadir MTBE (23,9 L, 11,4 ml/g) y extraer la fase orgánica. Lavar la fase orgánica secuencialmente con una solución de ácido cítrico al 20 % (4,2 L, 2,0 ml/g) dos veces, una solución acuosa de NaHCOs al 10 % (10,5 L, 5,0 ml/g) y NaCl acuoso saturado (10,5 L, 5,0 ml/g). Se seca la fase orgánica sobre Na2SO4, se filtra y se concentra a presión reducida para proporcionar el compuesto del título (1,8 kg, 78 % de rendimiento).. 1H RMN (400 MHz, CDCls) 58,02 (s, 1H), 6,75 (s, 1H), 3,27-3,25 (m, 1H), 2,58 (s, 3H), 1,42 (d, J= 8,0 Hz, 6H).

Preparación 12

3-isopropil-5-metil-N-(4-piperidil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-amina

Se añade dihidrocloruro de 3-isopropil-5-metil-N-(4-piperidil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-amina (2,2 kg, 6,4 mol) a una solución acuosa 1 M de hidróxido de sodio (19,2 L, 3,0 equiv.) a 10-15 °C. Se agita la mezcla de reacción durante 15­ 20 minutos y luego se añade 2-metiltetrahidrofurano (4,70 L, 10,0 equiv.) y se agita durante 20-25 minutos. Separar la fase orgánica y lavar la fase acuosa con 2-metiltetrahidrofurano (6,6 L, 3,0 ml/g, 3 veces). Combinar las soluciones orgánicas y lavar con NaCl acuoso saturado (11 L, 5,0 ml/g). Se seca la fase orgánica sobre Na2SO4, , se filtra y se concentra a presión reducida. Se añade MTBE (6,6 L, 3,0 ml/g) y se agita durante 40 minutos a 25-30 °C. Por filtración se obtiene el compuesto del título (1,5 kg, 85,7 % de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, CDCh) 57,81 (s, 1H), 6,10 (d, J= 8,0 Hz 1H), 5,75 (s, 1H), 3,59-3,54 (m, 1 H), 3,32-3,28 (m, 1 H), 3,22-3,19 (m, 2 H), 2,77-2,73 (m, 2 H), 2,51 (s, 3H), 2,11 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 1,56-1,50 (m, 3 H), 1,34 (d, J =8,0 Hz, 6H).

Ejemplo 1

Síntesis de [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1 -carboxilato.

[♦Obsérvese que, como se muestra aquí en el ejemplo 1, el centro quiral ha cambiado de orientación y la forma del enantiómero S se representa de forma diferente a como se muestra arriba de los ejemplos en la estructura (II)] Añada clorhidrato de ácido (E)-4-(dimetilamino)but-2-enoico (15,0 g, 90,3 mmol, 1,2 eq), N,N-diisopropiletilamina (31,3 ml, 23,4 g, 181 mmol, 2,4 eq) y HATU (42,9 g, 113 mmol, 1,5 eq) a una suspensión de [(3S)-pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato (29,1 g, 75,3 mmol) en Th F (146 ml) a 23 °C, y se agita la mezcla durante 90 minutos. Diluir con tampón fosfato (0,5 M, pH = 9, 150 ml), extraer con DCM (2 * 375 ml), secar (MgSO⁴) y concentrar al vacío. Purificar el residuo resultante (aprox. 95 g) por cromatografía (cargar el residuo disuelto en 65 ml de DCM; 330 g de SiO² ; eluyente: MTBE / 7N NH³ en MeOH 0 % a 10 %; TLC: MTBE / 7N NH³ en MeOH 5:1). Disolver el material (unos 40 g) en DCM (400 ml), lavar con 1 M aq. K² HPO⁴ (1 M, 80 ml), secar (MgSO⁴) y concentrar al vacío. Purificar el residuo (aprox. 38 g) por cromatografía (cargar el residuo absorbido en SiO² (50 g); 330 g de SiO² ; eluyente: MTBE / 7N NH³ en MeOH 0 % a 10 %) para obtener [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato (28,1 g, 75 %) como sólido blanco. ES/MSm/z498 (M+H). ¹H RMN (CD³OD) 51,33 (d, 6H), 1,64 (m, 2H), 2,10 (m, 2H), 2,18 (m, 1H), 2,26 (m, 1H), 2,29 (s, 6H), 2,50 (s, 3H), 3,11 (m, 2H), 3,18 (dd, 2H), 3,29 (dq, 1H), 3,70 (m, 3H), 3,87 (m, 2H), 4,14 (m, 2H), 5,31 (m, 1H), 6,12 (s, 1H), 6,47 (m, 1H), 6,86 (m, 1H), 7,88 (s, 1H). [a]^{o 20} = 49,9° (C = 2,0, MeOH). Exceso enantiomérico (ee) = 97 %. Rt (tiempo de retención) = 2,79 minutos (uV); Columna LC: c HiRALPAK® AS (4,6 * 150 mm, 5 ^m); MeOH 0,2 % DMEA; Caudal: 1,0 ml/min.

Síntesis alternativa de [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato.

Se añade N,N-diisopropiletilamina (0,36 ml, 2,1 mmol,) a una solución de [(3S)-pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metilpirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato (170 mg, 0,4091 mmol), ácido (E)-4-(dimetilamino)but-2-enoico;clorhidrato (135 mg, 0,81512 mmol) y HATU (317 mg, 0,8181 mmol) en N,N-dimetilformamida (4 ml). Agitar a TA. Tras 5 minutos, concentrar la mezcla a presión reducida. Purificar el residuo mediante cartucho ^s C^x -2 eluyendo con DCM al 10 %: MeOH y luego MeOH (2N NH3). Se concentra la fracción básica a presión reducida y se purifica el residuo a través de la fase inversa ISCO™ de la serie Claricep C eluyendo con NH4CO3 pH 9/ACN para proporcionar [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato (129 mg, 0,255 mmol) como sólido blanco. Espectro de masas (m/z): 498 (M+1). 1H RMN (400,13 MHz, MeOD) 7,88 (s, 1H), 6,85 (m, 1 H), 6,47 (m, 1 H), 6,12 (s, 1 H), 3,91-3,52 (m, 5 H), 3,13 (m, 1 H), 3,03 (m, 2 H), 2,94 (m, 1 H), 2,39 (s, 3 H), 2,15 (s, 6 H), 2,06 (m, 1 H), 1,88 (d, J= 11,5 Hz, 2 H), 1,66 (m, 2 H), 1,28 (d, J= 6,8 Hz, 6 H).

Síntesis alternativa de [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato.

Se disuelve [(3S)-pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato (550 g, 1,4 mol) en T^h F (5,5 L, 10,0 ml/g) a 15-30 °C. Se añade clorhidrato de ácido (E)-4-(dimetilamino)but-2-enoico (278 g, 1,2 eq.) y TEA (1,17 L, 6,0 eq.) a 15-30 °C y se agita durante 40 minutos. Añadir anhídrido propilfosfónico al 50 % en EtOAc (1,68 L, 1,2 equiv) a 15-30 °C y agitar durante 12 horas. Filtrar e intercambiar el filtrado con acetato de isopropilo a presión reducida. Añadir NaOH acuoso 2 M (2,75 L, 5 ml/g) y agitar durante 20 minutos a 25-30 °C. Extraer la fase orgánica y lavar con NaCl acuoso saturado (2,75 L, 5 ml/g). Secar sobre Na²SO⁴, filtrar y concentrara presión reducida. Añadir heptano (3,85 L, 7 ml/g) y THF (16,5 L, 3 ml/g) a 15-30 °C. Se agita durante 1 hora y se filtra para obtener el compuesto del título (440 g, rendimiento del 63,2 %). 421 (M+1), ¹H RMN (500 MHz, CD³OD) 57,86 (s, 1H), 6,83 (d, J = 10,7 Hz, 1H), 6,43 (dd, J= 34,3, 14,9 Hz, 1H), 6,08 (s, 1H), 5,26 (d, J= 24,2 Hz, 1H), 4,85 (s, 2H), 4,22-4,01 (m, 2H), 3,90-3,76 (m, 2H), 3,61 -3,47 (m, 1H), 3,36-3,21 (m, 2H), 3,17-3,11 (m, 2H), 3,12-2,98 (m, 2H), 2,47 (s, 3H), 2,28 - 2,21 (m, 7H), 2,16 - 2,00 (m, 3H), 1,68 - 1,48 (m, 2H), 1,30 (d, J= 6,2 Hz, 6H).

Ejemplo 2

Síntesis del clorhidrato de [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metilpirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1 -carboxilato.

[♦Obsérvese que como se muestra aquí en el Ejemplo 2, el centro quiral ha cambiado de orientación y la forma del enantiómero S se representa de forma diferente a como se muestra arriba de los Ejemplos en la estructura (II)] Añada HCl (1 M en EtOAc (0,589 ml, 0,590 g, 0,589 mmol, 1,07 eq) a una solución de [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato (0,283 g, 0,549 mmol) en acetona (5,5 ml) a 23 °C, y se agita la mezcla durante 5 horas. Se concentra al vacío para obtener clorhidrato de [(3S)-1 -[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato (0,244 g, 81 %) como sólido blanco. ES/M^s m/z498 (M+H).

¹H RMN (CD³OD) 5 1,34 (d, 6H), 1,66 (m, 2H), 2,11 (m, 2H), 2,20 (m, 1H), 2,30 (m, 1H), 2,54 (s, 3H), 2,90 (s, 6H), 3,12 (m, 2H), 3,28 (dq, 1H), 3,74 (m, 4H), 3,95 (dd, 2H), 4,16 (m, 2H), 4,63 (m, 1H), 5,32 (m, 1H), 6,22 (s, 1H), 6,78 (m, 2H), 7,94 (s, 1H).

Ejemplo 3

Síntesis de [(3R)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1 -carboxilato.

[♦Obsérvese que, como se muestra aquí en el ejemplo 3, el centro quiral ha cambiado de orientación y la forma del enantiómero R se representa de forma diferente a como se muestra arriba de los ejemplos en la estructura (111)] Añada N,N-diisopropiletilamina (0,4 ml, 2,0 mmol,) a una solución de [(3R)-pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato (170 mg, 0,43 mmol), ácido (E)-4-(dimetilamino)but-2-enoico;clorhidrato (150 mg, 0,90 mmol) y HATU (343 mg, 0,87 mmol) en DMF (4 ml). Agitar a TA. Tras 5 minutos, concentrar la mezcla a presión reducida. Purificar el residuo mediante cartucho ^s C^x -2 eluyendo con DCM al 10 %: MeOH y luego MeOH (2 N NH3). Se concentra la fracción básica a presión reducida y se purifica el residuo a través de la fase inversa Claricep serie C de la ISCO, eluyendo con NH4CO3 pH 9/ACN para proporcionar [(3R)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato (188 mg) como sólido blanco. Espectro de masas (m/z): 498 (M+1).

0088H-NMR (400,21 MHz, DMSO) 5: 7,86 (s, 1 H), 7,41 (m, 1 H), 6,63 (m, 1 H), 6,37 (m, 1 H), 6,13 (s, 1 H), 5,16 (m, 1 H), 4,09-3,92 (m, 2 H), 3,78 (m, 2 H), 3,56 (m, 2 H), 3,13 (m, 1 H), 3,03 (m, 2 H), 2,93 (m, 1 H), 2,39 (s, 3 H), 2,14 (s, 6 H), 2,06 (m, 1 H) 1,88 (m, 2 H), 1,60 (m, 2 H), 1,28 (d, J= 6,8 Hz, 6 H).

Ejemplo 4

Síntesis de hidrato de hemi-edisilato de [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1 -carboxilato cristalino

[♦Obsérvese que, como se muestra aquí en el ejemplo 4, el centro quiral ha cambiado de orientación y la forma del enantiómero S se representa de forma diferente a como se muestra arriba de los ejemplos en la estructura (II)] Coloque 2,0 g de [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato en 8 ml de acetona mientras se agita magnéticamente a temperatura ambiente. En otro vial, disolver 505 mg de hidrato de ácido 1,2-etanodisulfónico en 6 ml de acetona. Añadir la solución ácida a la solución de base libre y mezclar a temperatura ambiente. Agitar la muestra para que la mezcla sea completa, añadiendo más disolvente para diluir la pasta si es necesario. Agitar la suspensión durante la noche a 50 °C. Después de agitar durante la noche, enfriar la suspensión espesa restante de sólido blanco a 20 °C. Aislar los sólidos por filtración al vacío sobre papel de filtro y secar la torta resultante de sólido blanco en su lugar sobre el filtro (2,1 g, 88 % de rendimiento).

Obtener los patrones de DRX del sólido cristalino en un difractómetro de rayos X Bruker D4 Endeavor, equipado con una fuente de CuKa A = 1,54060 Á) y un detector Vantec, operando a 35 kV y 50 mA. Escanee la muestra entre 4 y 40° en 20, con un tamaño de paso de 0,008° en 20 y una velocidad de escaneo de 0,5 segundos/paso, y con divergencia de 0,6 mm, antidispersión fija de 5,28 y rendijas de detector de 9,5 mm. Colocar el polvo seco en un portamuestras de cuarzo y obtener una superficie lisa con un portaobjetos de vidrio. Recoge los patrones de difracción de la forma de los cristales a temperatura y humedad relativa ambiente. Es bien sabido en el arte de la cristalografía que, para cualquier forma de cristal dada, las intensidades relativas de los picos de difracción pueden variar debido a la orientación preferida resultante de factores como la morfología y el hábito del cristal. Cuando los efectos de la orientación preferida están presentes, las intensidades de los picos se alteran, pero las posiciones de los picos característicos del polimorfo no se modifican. Véase, por ejemplo , The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, páginas 1843-1844, 1995. Además, también es bien conocido en el arte de la cristalografía que, para cualquier forma de cristal, las posiciones de los picos angulares pueden variar ligeramente. Por ejemplo, las posiciones de los picos pueden cambiar debido a una variación en la temperatura o la humedad a la que se analiza una muestra, al desplazamiento de la muestra o a la presencia o ausencia de un estándar interno. En el presente caso, una variabilidad de la posición del pico de ± 0,2 en 20 tendrá en cuenta estas posibles variaciones sin obstaculizar la identificación inequívoca de la forma cristalina indicada. La confirmación de una forma cristalina puede hacerse sobre la base de cualquier combinación única de picos distintivos (en unidades de ° 20), normalmente los picos más prominentes. Ajustar los patrones de difracción de la forma del cristal, recogidos a temperatura ambiente y humedad relativa, basándose en los picos estándar del NIST 675 a 8,853 y 26,774 grados 2-theta.

Una muestra preparada del hidrato de hemi-edisilato cristalino se caracteriza por un patrón de DRX usando radiación CuKa como teniendo picos de difracción (valores 2-theta) como se describe en la tabla siguiente, y en particular teniendo un pico a 18,5° en combinación con uno o más picos seleccionados del grupo que consiste en 21,5°, 16,7°, y 15,2°; con una tolerancia para los ángulos de difracción de 0,2 grados.

Picos de difracción de rayos X en polvo del hidrato de hemi-edisilato cristalino

>0093

Ejemplo 5

Síntesis de [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1 -carboxilato besilato cristalino

[♦Obsérvese que, como se muestra aquí en el ejemplo 5, el centro quiral ha cambiado de orientación y la forma del enantiómero S se representa de forma diferente a como se muestra en los ejemplos anteriores en la estructura (II)] Poner 1998 mg de [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato en 15 ml de acetona mientras se agita a 1000 rpm a TA. Añadir 650 mg de ácido bencenosulfónico (disuelto en 5 ml de acetona). Se agita la muestra a 1000 rpm a TA durante una hora, y al cabo de un tiempo, la solución se enturbia, y resulta una pasta espesa de sólido blanco. Aislar el sólido blanco por filtración al vacío en papel de filtro. Secar la muestra en la estufa de vacío durante 1 hora a 70 °C (2,23 g, 85 % de rendimiento).

Síntesis de [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato besilato cristalino

Se disuelve [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato (440 g, 1,1 mol) en EtOAc (1,4 L) y acetona (357 ml) a 15-30 °C. Calentar hasta 50-55 °C. Disolver el ácido bencenosulfónico monohidratado (156 g, 0,89 eq.) en EtOAc (709 ml) y acetona (166 ml) y añadir a la mezcla de reacción a 5-10 ml/minutos a 50-55 °C. Agitar durante 1 hora. La mezcla se calienta hasta 30 °C y se agita durante 12 horas. Se filtra y se seca la torta húmeda bajo nitrógeno para obtener el compuesto del título (525 g de rendimiento del 72,9 %). 1H NMR (500 MHz, CD³OD) 57,89 (s, 1H), 7,85 - 7,79 (m, 2H), 7,43 - 7,39 (m, 3H), 6,82 - 6,66 (m, 2H), 6,15 (s, 1H), 5,27 (d, J = 21,5 Hz, 1H), 4,11 (d, J = 32,9 Hz, 2H), 3,94- 3,79 (m, 4H), 3 ,33-3,18 (m, 2H), 3,10-2,97 (m, 2H), 2,84 (s, 6H), 2,49 (s, 3H), 2,25 - 1,94 (m, 5H), 1,68 - 1,51 (m, 2H), 1,31 (d, J = 6,8 Hz, 6H). Obtener los patrones de DRX del sólido cristalino esencialmente como se describe en el Ejemplo 4. Una muestra preparada del besilato cristalino se caracteriza por un patrón de DRX utilizando la radiación CuKa por tener picos de difracción (valores 2-theta) como se describe en la tabla siguiente, y en particular por tener un pico a 21,5° en combinación con uno o más picos seleccionados del grupo que consiste en 12,4°, 17,3° y 15,8°; con una tolerancia para los ángulos de difracción de 0,2 grados.

Picos de difracción de rayos X en polvo del besilato cristalino

Ejemplo 6

Síntesis del clorhidrato cristalino de [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato

[♦Obsérvese que, como se muestra aquí en el ejemplo 6 , el centro quiral ha cambiado de orientación y la forma del enantiómero S se representa de forma diferente a como se muestra arriba de los ejemplos en la estructura (II)] Poner 557 mg de [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato en 4 ml de acetona mientras se agita a 1000 rpm a TA. Añadir 1200 ^L de HCl (1M en acetato de etilo, 1,07 eq.). Agitar la muestra a 1000 rpm durante la noche para obtener una pasta espesa de sólido blanco. Aislar el sólido blanco por filtración al vacío en papel de filtro. Secar la torta de sólido blanco resultante en el lugar del filtro bajo corriente de aire durante 10 minutos (385 mg, 64 % de rendimiento).

Obtener los patrones de DRX del sólido cristalino esencialmente como se describe en el Ejemplo 4. Una muestra preparada del hidrato de hidrocloruro cristalino se caracteriza por un patrón de DRX utilizando radiación CuKa como teniendo picos de difracción (valores 2-theta) como se describe en la tabla siguiente, y en particular teniendo un pico a 18,9° en combinación con uno o más picos seleccionados del grupo que consiste en 5,5°, 15,5°, y 9,7°; con una tolerancia para los ángulos de difracción de 0,2 grados.

Picos de difracción de rayos X del clorhidrato cristalino

Ensayos biológicos

Los siguientes ensayos demuestran que un compuesto de la invención es un inhibidor de la actividad de CDK7. Los resultados de los ensayos también muestran que un compuesto de la invención inhibe la señalización de CDK7 en las células cancerosas. Además, un compuesto de la invención inhibe la proliferación en líneas celulares de cáncer y el crecimiento tumoral en el modelo tumoral de xenoinjerto de cáncer.

El "IC⁵⁰" se refiere a la concentración de un agente que produce el 50 % de la respuesta inhibitoria máxima posible para ese agente o, alternativamente, a la concentración de un agente que produce el 50 % de desplazamiento de la unión específica del ligando al receptor; los valores relativos del IC⁵⁰ se determinan utilizando la unidad de fluorescencia calculando el porcentaje de inhibición con respecto a los controles "MÍN" y "MÁX" en placa y luego ajustando los datos de respuesta a la dosis de diez puntos a una ecuación logística de cuatro parámetros.

Ensayos de actividad de las quinasas CDK7 y CDK9

El propósito de este ensayo es medir la capacidad de un compuesto de la invención para inhibir la actividad quinasa del complejo CDK7/CyclinH/Mat1. Para demostrar si los compuestos incluidos en la presente invención presentan alguna afinidad por ^c DK7, CDK7 y CDK9, los ensayos bioquímicos se realizan sin preincubación de la enzima con el compuesto o con 3 horas de preincubación. Los ensayos funcionales proporcionan apoyo sobre si los compuestos de la presente invención exhiben la capacidad de inhibir las actividades de las quinasas CDK7 y CDK9. Todos los ligandos, disolventes y reactivos empleados en los siguientes ensayos pueden obtenerse fácilmente de fuentes comerciales o pueden ser sintetizados fácilmente por un experto en la materia. La determinación del IC⁵⁰ para la CDK7 y la CDK9 se determina como sigue.

Ensayo bioquímico para la inhibición de CDK7/CyclinH/MAT1

La actividad IC⁵⁰ del inhibidor se determina mediante ensayos de unión a filtros de radiomarcadores (FB) utilizando la enzima recombinante humana purificada en presencia de ATP//[³³P]ATP y sustrato peptídico. Las concentraciones de ATP elegidas están en o cerca de la Km de la enzima para el ATP.

Las reacciones se llevan a cabo en placas de poliestireno de 96 pocillos en un volumen final de 25 j l por pocillo. se mezclan 5 j l de compuesto de ensayo en DMSO al 20 %, 10 j l de solución de sustrato (ATP/³³PATP y marea CDK7/9) y 10 j l de solución enzimática. La solución de sustrato se prepara para obtener una concentración final de 100 jM de ATP/[33P]ATP (NEN 10jC i/jL , 3000 Ci/mmol) y 250 jM de péptido CDK7/9 ((YSPTSPSYSPTSPSYPSKKK) (SEQ ID NO: 1)) diluido en tampón de quinasa de 4 mM MgCh, 0,01 % TRITON™ X-100, 2 mM DTT y 20 mM HEPES. La solución enzimática se prepara para una concentración final de la enzima InM CDK7/CyclinH/Mat1 [Proqinase 0366­ 0360-4 Lot 002)] diluida en tampón de quinasa. Los compuestos de prueba se diluyen en serie 1:3 en DMSO al 20 % para crear una curva de 10 puntos a una concentración inicial de 20 jM . el tampón DMSO al 20 % solo sin el compuesto de prueba se emplea como control alto (actividad completa en ausencia de cualquier inhibidor), 500 mM EDTA se utiliza para determinar el nivel de fondo en ausencia de actividad enzimática (control bajo). Después de mezclar 5 jL de compuestos con 10 jL de solución enzimática se incuba la placa durante 0 o 180 minutos a 22 °C. Transcurrido ese tiempo se inicia la reacción añadiendo 10 jL de solución de sustrato y se incuba durante 50 minutos a 22 °C. La reacción se termina con la adición de 80 jL de solución ortofosfórica fría al 10 %. Las placas filtrantes (placas filtrantes opacas, no estériles) se lavan previamente con 10 j l de solución ortofosfórica al 10 % en cada pocillo. se transfieren 100 j l de la mezcla aun filtro de fosfocelulosa y se incuba a temperatura ambiente durante 45 minutos. Las placas de filtro se lavan con 200 j l de ácido ortofosfórico al 0,5 % 3 veces en un procesador de placas de filtro. La incorporación de 33Pi (recuento de "cpm") se determina añadiendo 80 j l de MICROSCINT™ a cada pocillo y se lee en un contador después de una hora. Los datos se procesan mediante la herramienta GENEDATA SCREENER®. Los datos se analizan mediante una ecuación logística no lineal de 4 parámetros (curva logística de concentración-respuesta de cuatro parámetros): Y = bot [(top-bot)/1+(x/ IC⁵⁰)pendiente] donde Y = % de inhibición, X = concentración que produce y % de inhibición, Bottom = valor mínimo de y alcanzado por la curva, Top = valor máximo de y alcanzado por la curva y Pendiente = inclinación de la curva en IC⁵⁰. %Inh = [(mediana Máx- x/ mediana Máx - mediana Mín)] -100 IC⁵⁰: concentración del compuesto que reduce una respuesta determinada (unión del ligando, respuesta de la enzima) en un 50 %.

Los compuestos descritos en los Ejemplos 1 y 3 muestran una IC⁵⁰ de 0,0173 jM y 0,0487 jM en CDK7 sin preincubación, respectivamente. Después de 3 horas de preincubación de la enzima CDK7 con los Ejemplos 1 y 3, muestran una IC⁵⁰ de 0,00237 jM y 0,00506 jM , respectivamente. Estos datos muestran que tanto los Ejemplos 1 y 3 inhiben la CDK7.

Ensayo de inhibición de la actividad quinasa CDK9/CyclinTl:

La actividad IC⁵⁰ del inhibidor se determina mediante ensayos de unión a filtros de radiomarcación (FB) utilizando la enzima recombinante humana purificada en presencia de ATP y sustrato peptídico. Las concentraciones de ATP elegidas están en o cerca de la Km de la enzima para el ATP. Las reacciones se realizan en placas de poliestireno de 96 pocillos en un volumen final de 25 j l por pocillo. se mezclan 5 j l de compuesto de prueba en DMSO al 20 %, 10 j l de solución de sustrato (ATP//[³³P]ATP y marea CDK7/9) y 10 j l de solución enzimática. La solución de sustrato se prepara para obtener una concentración final de 100 jM de ATP/[³³P]ATP (NEN 10uCi/jL, 3000 Ci/mmol) y 200 jM de péptido CDK7/9 ((YSPTSPSYSPTSPSYPSKKK) (SEQ ID NO: 1)) diluido en tampón de quinasa de 4 mM MgCh, 0,0025 % TRITON™ X-100, 1,58 mM DTT y 15,80 mM HEPES. La solución enzimática se prepara para una concentración final de 7,5 nM de enzima CDK9/ciclinaT1 [Proqinase 0371-0345-1 (Lote 004)] diluida en tampón de quinasa. Los compuestos de prueba se diluyen en serie 1:3 en DMSO al 20 % para crear una curva de 10 puntos a una concentración inicial de 20 jM . el tampón DMSO al 20 % solo sin el compuesto de prueba se emplea como control alto (actividad completa en ausencia de cualquier inhibidor), 500 mM EDTA se utiliza para determinar el nivel de fondo en ausencia de actividad enzimática (control bajo). Después de mezclar 5 jL de compuestos con 10 jL de solución enzimática, la placa se incuba durante 0 o 180 minutos a 22 °C. Transcurrido ese tiempo se inicia la reacción añadiendo 10 jL de solución de sustrato y se incuba durante 60 minutos a 22 °C. La reacción se termina con la adición de 80 jL de solución ortofosfórica fría al 10 %. Las placas de filtro (placas de filtro opacas y no estériles) se lavan previamente con 10 j l de solución ortofosfórica al 10 % por pocillo. se transfieren 100 j l de la mezcla a un filtro de fosfocelulosa y se incuba a temperatura ambiente durante 45 minutos. Las placas de filtro se lavan con 200 j l de ácido ortofosfórico al 0,5 % 3 veces en un procesador de placas de filtro. se añaden 80 j l de MICROSCINT™ a cada pocillo y se lee en un contador de centelleo después de una hora. Los datos se procesan mediante una herramienta ^g Eⁿ EDATA-SCREENER®. Los datos se analizan mediante una ecuación logística no lineal de 4 parámetros (curva logística de concentración-respuesta de cuatro parámetros): Y = bot [(top-bot)/1+(x/ IC⁵⁰)pendiente] donde Y = % de inhibición, X = concentración que produce y % de inhibición, Bottom = valor mínimo de y alcanzado por la curva, Top = valor máximo de y alcanzado por la curva y Pendiente = inclinación de la curva en IC⁵⁰. %Inh = [(mediana Máx- x/ mediana Máx - mediana Mín)] - 100 IC⁵⁰: concentración del compuesto que reduce una respuesta determinada (unión del ligando, respuesta de la enzima) en un 50 %. IC⁵⁰ relativo: concentración que da la mitad de la respuesta máxima del compuesto.

Los compuestos descritos en los Ejemplos 1 y 3 muestran una IC⁵⁰ de 5,93 jM y 2,45 jM para CDK9 (3 horas de preincubación), respectivamente. Estos datos muestran que los Ejemplos 1 y 3 no inhiben de forma potente la actividad de la CDK9.

En conjunto, los datos de los ensayos anteriores demuestran que los compuestos de los Ejemplos 1 y 3 inhiben selectivamente la CDK7 sobre la CDK9.

Ensayos de Mecanismos Celulares CDK7 y CDK9

El propósito de estos ensayos es medir la capacidad de los compuestos para inhibir la señalización de CDK7 y CDK9 en las células cancerosas in vitro.

Ensayo en Acumen basado en células del dominio terminal fosfo-carboxilo (Rbp2) (Ser2) p-CTD (S2)

Las células HCT116 (ATCC CCL-247) se cultivan en un medio McCoy's 5A Modificado complementado con 10 % de FBS, 1 % de NaPyr y 1 % de Pen/Strep y se colocan en placas de fondo plano de 96 pocillos (antes de que alcancen el 70 % de confluencia) a una densidad de 5.000 células por pocillo en un volumen de 100 pl. A continuación, las células se incuban durante la noche en un incubador de cultivos celulares (5 % de CO² , 95 % de humedad relativa (HR) y 37 °C) y se deja que se adhieran a la placa. A la mañana siguiente, las células se dosifican con compuestos. Los compuestos inhibidores se solubilizan primero a 60 pM en un medio de cultivo que contiene 0,6 % de DMSO. Posteriormente se preparan diluciones seriadas de compuestos (1:3) en un intervalo de 60 pM a 0,003 pM. Las células se dosifican con la adición de 50 pl de la placa de dilución en serie a la placa de ensayo que contiene células unidas con 100 pl de medio, produciendo una concentración final de DMSO del 0,2 % con un intervalo de dosis de concentración final del compuesto entre 20 y 0,001 pM. Para el punto máximo se utiliza un medio que contiene un 0,2 % de DMSO y para el punto mínimo se utiliza un compuesto de referencia diluido a una concentración final de 0,83 pM en el medio de crecimiento que contiene un 0,2 % de DMSO. Tras la dosificación de los compuestos, las placas de células se incuban a 37 °C y 5 % de CO² durante 4 horas. El medio de cultivo se retira cuidadosamente y las células se fijan añadiendo 100 pl de paraformaldehído al 4 % durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavan una vez con PBS y se incuban con 100 pl de MeOH frío durante 15 minutos a TA para la permeabilización celular. Las células se lavan dos veces con PBS (100 pl/cada una) y se bloquean con 100 pl/pocillo de BSA/PBS al 1 % durante 30 minutos a TA. se añaden 50 pl de anticuerpo primario 1:1000 (Anti-phospho CTD Ser2 Abcam, cat# ab5095-100) diluido en BSA/PBS al 1 % por pocillo, se sellan las placas y se incuban durante la noche a 4 °C.

Al día siguiente, las células se lavan tres veces con PBS (100 pl/pocillo) y se incuban con 50 pl/pocillo de anticuerpo secundario (dilución 1:2000, IgM anti-conejo de cabra A lEx A Fl UOR™ 488) en PBS durante 1 hora a TA. Después de lavar 3 veces con PBS (100 pl/pocillo), se añaden 100 pl de ARNasa de 50 pg/ml y una dilución de yoduro de propidio 1:1000 en PBS por pocillo. Las placas se sellan y se incuban 1 hora a TA en el banco (preservadas de la luz). Las placas se analizan en Acumen en FL2 (intensidad media), y FL3 (intensidad total). Las placas de fluorescencia se escanean con el ACUMEN EXPLORER™ [Citómetro de fluorescencia de barrido láser fabricado por TTP LABTECH LTD] para medir el dominio anti-fosfo-carboxilo terminal en Serina 2 (pCTD). El análisis de las imágenes se basa en las señales fluorescentes celulares para identificar las células positivas. Las células positivas a la pCTD (S2) se identifican por la intensidad media a 500-530 por encima del umbral. La intensidad total a 575-640 del yoduro de propidio/ADN se utiliza para identificar células individuales. El resultado del ensayo es el porcentaje de células positivas a la pCTD.

El IC⁵⁰ se determina mediante el ajuste de la curva a una logística de cuatro parámetros para cada salida utilizando GENE DATA™. Los compuestos descritos en los Ejemplos 1 y 3 muestran una IC⁵⁰ relativa >20 pM y 3,52 pM para la fosfoCTD (S2), respectivamente. Estos datos muestran que tanto los Ejemplos 1 y 3 no inhiben potentemente la CDK9 en las células.

Ensayo en Acumen basado en células del dominio terminal fosfo-carboxilo (Rbp2) (Ser2) p-CTD (S2)

Las células HCT116 (ATCC CCL-247) se cultivan en un medio McCoy's 5A Modificado complementado con 10 % de FBS, 1 % de NaPyr y 1 % de Pen/Strep y se colocan en placas de fondo plano de 96 pocillos (antes de que alcancen el 70 % de confluencia) a una densidad de 5.000 células por pocillo en un volumen de 100 pl. Las células se incuban durante la noche en un incubador de cultivos celulares (5 % de CO² , 95 % de humedad relativa (HR) y 37 °C) y se deja que se adhieran a la placa. A la mañana siguiente, las células se dosifican con compuestos. Los compuestos inhibidores se solubilizan a 60 pM en un medio de cultivo que contiene 0,6 % de DMSO. Posteriormente se preparan diluciones seriadas de compuestos (1:3) en un intervalo de 60 pM a 0,003 pM. Las células se dosifican con la adición de 50 pl de la placa de dilución en serie a la placa de ensayo que contiene células adheridas con 100 pl de medio produciendo una concentración final de DMS^o del 0,2 % con un intervalo de dosis de concentración final del compuesto entre 20 y 0,001 pM. Para el punto máximo se utiliza un medio que contiene un 0,2 % de DMSO y para el punto mínimo se utiliza un compuesto de referencia diluido a una concentración final de 0,83 pM en el medio de crecimiento que contiene un 0,2 % de DMSO. Tras la dosificación de los compuestos, las placas de células se incuban a 37 °C y 5 % de CO² durante 4 horas. Se retira cuidadosamente el medio de cultivo y se fijan las células añadiendo 100 pl de paraformaldehído al 4 % durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavan una vez con PBS y se incuban con 100 pl de MeOH frío durante 15 minutos a TA para la permeabilización celular. De nuevo se lavan las células dos veces con PBS (100 pl/cada una) y se bloquean con 100 pl/pocillo de BSA/PBS al 1 % durante 30 minutos a TA. se añaden 50 pl de anticuerpo primario 1:1000 (Anti-phosphoCTD Ser5 Bethyl Laboratories cat# A300-655A) diluido en 1 % BSA/p Bs por pocillo, se sellan las placas y se incuban durante la noche a 4 °C.

Al día siguiente, las células se lavan tres veces con PBS (100 |jl/pocillo) y se incuban con 50 jl/pocillo de anticuerpo secundario (dilución 1:2000, IgM anti-conejo de cabra ALEXA FLUOR™ 488) en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar 3 veces con PBS (100jL/pocillo), se añaden 100 jL de ARNasa de 50 jg/m l (Sigma) y una dilución de yoduro de propidio 1:1000 en PBS por pocillo. Las placas se sellan y se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente en el banco (protegidas de la luz). Las placas se analizan en Acumen en FL2 (intensidad media), y ^f L3 (intensidad total). Las placas de fluorescencia se escanean con el ACUMEN EXPLORER™ [Citómetro de fluorescencia de barrido láser fabricado por TTP LABTECH LTD] para medir el dominio anti-fosfo-carboxilo terminal en Serina 5 (pCTD). El análisis de la imagen se basa en las señales fluorescentes celulares para identificar las células positivas. Las células positivas a la pCTD (S5) se identifican por la intensidad media a 500-530 por encima del umbral. La intensidad total a 575-640 del yoduro de propidio/ADN se utiliza para identificar células individuales. El resultado del ensayo es el porcentaje de células positivas a la pCTD. El IC⁵⁰ se determina mediante el ajuste de la curva a una logística de cuatro parámetros para cada salida utilizando GENE DATA™.

Los compuestos descritos en los Ejemplos 1 y 3 muestran una IC⁵⁰ relativo de 0,148 jM y 0,198 jM para pCTD Ser5, respectivamente. Estos datos muestran que tanto los Ejemplos 1 y 3 inhiben la actividad celular de CDK7.

Ensayo en Acumen basado en células cMyc

Las células HCT116 (ATCC CCL-247) se cultivan en un medio McCoy's 5A Modificado complementado con 10 % de FBS, 1 % de NaPyr y 1 % de Pen/Strep y se colocan en placas de fondo plano de 96 pocillos (antes de que alcancen el 70 % de confluencia) a una densidad de 5.000 células por pocillo en un volumen de 100 jl. A continuación, las células se incuban durante la noche en un incubador de cultivos celulares (5 % de CO² , 95 % de humedad relativa (HR) y 37 °C) y se deja que se adhieran a la placa. A la mañana siguiente, las células se dosifican con compuestos. Los compuestos inhibidores se solubilizan a 60 jM en un medio de cultivo que contiene 0,6 % de DMSO. Posteriormente se preparan diluciones seriadas de compuestos (1:3) en un intervalo de 60 jM a 0,003 jM . Las células se dosifican con la adición de 50 j l de la placa de dilución en serie a la placa de ensayo que contiene células adheridas con 100 j l de medio produciendo una concentración final de DMSO del 0,2 % con un intervalo de dosis de concentración final del compuesto entre 20 jM y 0,001 jM . Para el punto máximo se utiliza un medio que contiene un 0,2 % de DMSO y para el punto mínimo se utiliza un compuesto de referencia diluido a una concentración final de 0,83jM en el medio de crecimiento que contiene un 0,2 % de DMSO. Tras la dosificación de los compuestos, las placas de células se incuban a 37 °C y 5 % de CO² durante 4 horas. Se retira cuidadosamente el medio de cultivo y se fijan las células añadiendo 100 j l de paraformaldehído al 4 % durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavan una vez con PBS y se incuban con 100 j l de MeOH frío durante 15 minutos a temperatura ambiente para la permeabilización celular. De nuevo se lavan las células dos veces con PBS (100 jl/cada una) y se bloquean con 100 jl/pocillo de BSA/PBS al 1 % durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se añaden 50 j l de anticuerpo primario 1:1000 (anticuerpo anti-c-Myc [Y69] Abcam cat# ab32072) diluido en BSA/PBS al 1 % por pocillo, se sellan las placas y se incuban durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, las células se lavan tres veces con PBS (100 jl/pocillo) y se incuban con 50 jl/pocillo de anticuerpo secundario (dilución 1:2000, IgM de cabra anti-conejo ALEXA FLUOR™ 488) en PBS durante 1 hora a TA. Después de lavar 3 veces con PBS (100jL/pocillo), se añaden 100jL de 50 jg/m l de ARNasa y una dilución de 1:1000 de yoduro de propidio (Invitrogene) en ^p B^s por pocillo. Las placas se sellan y se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente en el banco (protegidas de la luz). Las placas se analizan en Acumen en FL2 (intensidad media), y FL3 (intensidad total). Las placas de fluorescencia se escanean con el ACUMEN EXPLORER™ [Citómetro de microplacas de fluorescencia de barrido láser fabricado por TTP LABTECH LTD] para medir el dominio anti-fosfo-carboxilo terminal en Serina 5 (pCTD). El análisis de las imágenes se basa en las señales fluorescentes celulares para identificar las células positivas. Las células positivas a pCTD (S5) se identifican por la intensidad media a 500-530 por encima del umbral. La intensidad total a 575-640 del yoduro de propidio/ADN se utiliza para identificar células individuales. El resultado del ensayo es el porcentaje de células positivas a la pCTD. La IC⁵⁰ se determina mediante el ajuste de la curva a una logística de cuatro parámetros para cada salida utilizando GENE DATA™.

Los compuestos descritos en los Ejemplos 1 y 3 muestran una IC⁵⁰ relativa de 0,0828 jM y 0,0573 jM para cMyc. Estos datos muestran que tanto los Ejemplos 1 y 3 inhiben la transcripción de cMyc en las células HCT116.

Experimento de perfil de selectividad: Perfilador Proqinase WT

El perfil de inhibición de la quinasa del compuesto se determina midiendo los valores de actividad residual a cuatro concentraciones en ensayos de proteína quinasa de tipo salvaje 320. Los compuestos se ensayan a 20 jM , 2 jM , 0,2 jM y 0,02 jM en monoensayo. La concentración final de DMSO en todos los cócteles de reacción (incluidos los controles altos y bajos) es del 1 %.

Ensayo de proteínas quinasas

Se utiliza un ensayo radiométrico de proteínas quinasas (33PANQINASE® Activity Assay, ProQinase) para medir la actividad quinasa de las 320 proteínas quinasas. Todos los ensayos de quinasa se realizan en FLASHpLATES™ de 96 pocillos en un volumen de reacción de 50 jl. El cóctel de reacción se pipetea en 4 pasos en el siguiente orden:

1.-10 jL de solución de ATP no radiactivo (en H²O)

2. 25 pL de tampón de ensayo/mezcla de [^y-33P]-ATP

3. 5 pL de muestra de ensayo en DMSO al 10 %

4. 10 pL de mezcla de enzima/sustrato

El ensayo para todas las proteínas quinasas contiene 70 mM de HEPES-NaOH pH 7,5, 3 mM de MgCl² , 3 mM de MnCl² , 3 pM de Na-ortovanadato, 12 mM DTT, ATP (cantidades variables, correspondientes al ATP-Km aparente de la quinasa respectiva, véase la Tabla 1), [^y-33P]-ATP (aproximadamente 8 x 1005 cpm por pocillo), proteína quinasa (cantidades variables; véase la Tabla 1) y sustrato (cantidades variables; véase la Tabla 1). Todos los ensayos de PKC (excepto el ensayo de PKC-mu y el de PKC-nu) contienen además 1 mM de CaCl² , 4 mM de EDTA, 5 pg/ml de fosfatidilserina y 1 pg/ml de 1,2-dioleilglicerol. Los ensayos CAMK1D, CAMK2A, CAMK2B, CAMK2D, CAMK2G, CAMK4, CAMKK1, CAMKK2, DAPK2,EEF2K, MYLK, MYLK2 y MYLK3 contienen además 1 pg/ml de Calmodulina y 0,5 mM de CaCl². Los ensayos PRKG1 y PRKG2 contienen además 1 pM de GMPc. El ensayo DNA-PK contenía además 2,5 pg/ml de ADN.

Los cócteles de reacción de proteína quinasa se incuban a 30 °C durante 60 minutos. La reacción se detiene con 50 pl de H³PO⁴ al 2 % (v/v), se aspiran las placas y se lavan dos veces con 200 pl de NaCl al 0,9 % (p/v). La incorporación de 33Pi (recuento de "cpm") se determina con un contador de centelleo de microplacas. Todos los ensayos de proteína quinasa se realizan con un sistema robótico BIOMEK® 2000/SL de BeckmanCoulter. Todas las proteínas quinasas proporcionadas por ProQinase se expresan en células de insecto Sf9 o en E.coli como proteínas recombinantes de fusión GST o proteínas marcadas con His, ya sea como longitud completa o como fragmentos enzimáticamente activos. Todas las quinasas se producen a partir de ADNc humano y se purifican mediante cromatografía de afinidad con GSH o metal inmovilizado. Las etiquetas de afinidad se eliminan de varias quinasas durante la purificación. La pureza de las proteínas quinasas se examina mediante tinción SDS-PAGE/Coomassie, y la identidad se comprueba mediante espectroscopia de masas. Las quinasas de proveedores externos (CAR = Carna Biosciences Inc.; INV = Life Technologies (Invitrogen Corporation™); MIL = Merck-Millipore (Millipore Corporation™), véase la Tabla 1) se expresan, se purifican y se controla su calidad en virtud de las lecturas de los proveedores. Las concentraciones de enzimas y sustratos para los ensayos se muestran en la Tabla 1.

Evaluación de los datos sin procesar

Para cada quinasa, el valor mediano de las cpm de tres pocillos se define como "control bajo" (n=3). Este valor refleja la unión inespecífica de la radiactividad a la placa en ausencia de una proteína quinasa pero en presencia del sustrato. Además, para cada quinasa se toma el valor mediano de las cpm de otros tres pocillos como "control alto", es decir, la actividad completa en ausencia de cualquier inhibidor (n=3). La diferencia entre el control alto y el control bajo de cada enzima se toma como una actividad del 100 %. Como parte de la evaluación de los datos, el control bajo de cada quinasa se resta del valor de control alto, así como de sus correspondientes "valores compuestos". La actividad residual (en %) de cada pocillo de compuesto se calcula mediante la siguiente fórmula: . Actividad Res. (%) = 100 X [(señal del compuesto - control bajo) / (control alto - control bajo)]. Las IC⁵⁰ no estándar se calculan utilizando una hoja de cálculo Excel personalizada junto con el complemento XLFit. Debido al bajo número de puntos de datos, (4) XL-Fit calcula una IC⁵⁰ no estándar utilizando una ecuación de cuatro parámetros en la que tres parámetros están bloqueados en valores fijos.

La ecuación es

A: Valor mínimo de actividad , También conocido como Inferior. Fijado a 0

B: Valor máximo de actividad, también conocido como Superior. Fijado al 100

C: Punto de inflexión de la curva

D: Pendiente de la colina. Fijado en 1

Y La variable dependiente (es decir, lo que se mide como señal)

X La variable independiente (es decir, lo que se controla, como la dosis, la concentración, etc.)

La forma de calcular la IC⁵⁰ no estándar es asignar valores aleatorios al parámetro C y repetirlo de forma iterativa. El algoritmo mide entonces las diferencias en la suma de los residuos al cuadrado y buscará sucesivas iteraciones consecutivas en las que el cambio en los residuos sea convergente. Una vez alcanzado el límite de convergencia, la solución se considera óptima y el proceso de ajuste finaliza.

Las CDK12 y CDK13 (ProQinase) se ensayan esencialmente como en el caso anterior pero por separado a 10 concentraciones (2 x10⁵ M a 6 x10¹⁰ M) utilizando diluciones semilogarítmicas. Para los 10 puntos, se calculan los análisis de las actividades residuales para cada concentración y los valores IC⁵⁰ del compuesto utilizando QUATTRO® WORKFLOW™ V3.1.1. El modelo de ajuste para las determinaciones de la IC⁵⁰ fue "Respuesta sigmoidal (pendiente variable)" con los parámetros "superior" fijado en el 100 % e "inferior" en el 0 %. El procedimiento de ajuste utilizado fue el de mínimos cuadrados. Los datos se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1

Estos datos muestran que el compuesto del Ejemplo 1 es muy selectivo para CDK7 de un panel representativo de quinasas.

Ensayo de proliferación celular

Los datos de la Tabla 2 muestran que el compuesto del Ejemplo 1 inhibe la proliferación y viabilidad de las líneas de células tumorales especificadas. Las líneas celulares se colocan a una densidad de 5000 células por pocillo en 100 pl de medio de cultivo por pocillo en una placa blanca de cultivo celular de 96 pocillos. Véase la Tabla 2 para información sobre la línea celular y el medio de cultivo. Las placas se incuban a 37 °C y 5 % de CO². Al día siguiente, se prepara una dilución en serie del compuesto de prueba diluyendo el compuesto 1:3 en DMSO durante 10 puntos. La placa de DMSO es 1000X la concentración final. Además del inhibidor de CDK7, se incluye una columna de sólo DMSO como control de crecimiento máximo y una columna final de estaurosporina 10 pM como control de inhibición de crecimiento máximo. A continuación, se prepara una placa de dilución 10X añadiendo 2 pl por pocillo de la placa de DMSO 1000X a 198 pl por pocillo de ^o M^e M (Life Technologies, Carlsbad, CA, cat#31985-070). Las células se tratan con el compuesto indicado añadiendo 11 pl por pocillo de la placa de OMEM 10X a la placa de células que contiene 100 pl por pocillo de medio de crecimiento para una concentración final de 1X. Las placas se colocan de nuevo en la incubadora a 37 °C y 5 % de CO². Siete días después de la adición del compuesto, las placas se sacan de la incubadora y se dejan equilibrar a TA. El reactivo CELL TITER GLO® se descongela a temperatura ambiente y se prepara mezclando un vial de tampón de ensayo con un vial de sustrato y se agita suavemente para mezclarlo. A continuación, se añade el reactivo CELL TITER GLO® a la placa celular, 100pL por pocillo, y se coloca en un agitador de placas de titulación a velocidad 2 durante 15 minutos a temperatura ambiente. Tras 15 minutos de incubación en el agitador, se lee la luminiscencia, 1 segundo por pocillo, utilizando un Wallac VICTOR2™. Para calcular la mitad de la concentración máxima inhibitoria (IC⁵⁰) se utiliza la regresión no lineal y las curvas sigmoidales dosis-respuesta con el software Graphpad Prism 6.

Tabla 2

Estos datos muestran que el compuesto del Ejemplo I inhibe el crecimiento in vitro de líneas celulares de cáncer de una variedad de histologías, incluyendo colon, mama, pulmón, ovario y estómago, de una manera dependiente de la dosis.

Modelo de tumor de xenoinjerto

El propósito de este ensayo es medir la reducción del volumen del tumor en respuesta al compuesto del Ejemplo 1. Para evaluar la eficacia in vivo de un compuesto de prueba, se utilizan múltiples modelos tumorales de xenoinjerto. Brevemente, se inyectan 5-10 *106 células tumorales en una mezcla de MATRIGEL® 1:1 (0,2 ml de volumen total) por vía subcutánea en las hembras de ratones lampiños atímicos (Envigo, laboratorios Harlan) para la mayoría de los modelos de xenoinjertos tumorales. Se utilizan cepas alternativas de ratones para establecer xenoinjertos MDAMB468 (NOD SCID Gamma, Jackson labs), CT26 y EMT6 (BALB/c, Envigo, Harlan Laboratories). Tras permitir que los tumores alcancen el tamaño deseado de ~300-500 mm3, los animales se distribuyen aleatoriamente en grupos de 6­ 8 para los estudios de eficacia. El compuesto de prueba se administra por vía oral (PO) a las dosis y regímenes indicados. El crecimiento del tumor y el peso corporal se controlan a lo largo del tiempo para evaluar la eficacia y los signos de toxicidad.

El compuesto de prueba se formula en N-metil-2-pirrolidona (NMP) al 5 % en hidroxietilcelulosa al 1 %, polisorbato 80 al 0,25 %, antiespumante al 0,05 % en agua purificada (HEC) y se administra por sonda oral (volumen final de 0,2 ml) a las dosis indicadas en la Tabla 4. Se formula un compuesto de prueba semanalmente y se almacena a 4 °C. Los vehículos se administran a los grupos de control según los esquemas utilizados anteriormente utilizando un volumen de 0,2 ml por dosis. Los ratones se dosifican por vía oral y las muestras tumorales se recogen al finalizar y se almacenan a -80 °C.

El tamaño del tumor y el peso corporal se registran y analizan quincenalmente. La sangre se recoge utilizando una tarjeta DBS (mancha de sangre seca) 2 horas después de la dosis y al finalizar. Los tumores se recogen al finalizar el estudio, se cortan en 3 secciones y se congelan para la exposición y el análisis de proteínas, o se colocan en RNAlater® para el análisis del ARN. Las muestras de tejido se congelan y se almacenan a -80 °C.

El compuesto del Ejemplo 1 demuestra una actividad antitumoral significativa en modelos de xenoinjerto de cáncer humano (Tabla 3).

Tabla 3: Resumen de la eficacia in vivo del agente único del Ejemplo 1 (AT/C) en una variedad de modelos tumorales de xenoinjertos probados a diferentes niveles de dosis según se indica.

El Delta T/C % se calcula cuando el volumen tumoral del punto final en un grupo tratado es igual o superior al volumen tumoral de referencia. La fórmula es 100*(T-T0)/(C-C0). Aquí, T y C son los volúmenes tumorales medios del punto final en el grupo tratado o de control, respectivamente. T0 y C0 son los volúmenes tumorales medios de referencia en esos grupos. *: Significativo (p<0,05)

Estudio de biomarcadores

El propósito de este estudio es evaluar potenciales biomarcadores predictivos para los compuestos de la presente invención.

Las líneas celulares de cáncer se perfilan para evaluar la actividad antiproliferativa de un compuesto de prueba in vitro. La información sobre la mutación, el número de copias y la expresión génica de los genes ARID1A, KMT2C, KMT2D y/o RB1 en las líneas celulares de cáncer se obtiene de la base de datos COSMIC (cancer.sanger.ac.uk) y de cBioportal (http://www.cbioportal.org/). Las células se cultivan en un medio de crecimiento y se colocan en una placa de 96 pocillos en un medio de crecimiento de 100 pl/pocillo a 5000 células/pocillo y se incuban a 37 °C, 5 % de CO² durante la noche. Las células se cultivan utilizando los medios recomendados por el proveedor y en condiciones bien conocidas en la técnica, por ejemplo con RPMI 1640 con o sin HEPES y L-Glutamina (Thermo s H30255,01) y Piruvato de Sodio ImM, y 10 % de FBS (Gibco cat#10082). La placa de dilución intermedia 1000X se prepara haciendo una solución de trabajo 10 mM de una muestra de ensayo en DMSO y realizando diluciones 1:3 en DMSO durante 10 puntos. La placa de dosificación 10X se prepara añadiendo 2 pl de la placa de dilución intermedia 1000X a 198 pl de OPTIMEM® 10 % FBS y mezclando bien. A continuación, se trata la placa celular añadiendo 11 pl de la placa de dosificación 10X en la placa celular de 100 pl/pocillo para obtener una concentración final 1X. La estaurosporina se utiliza como control de inhibición máxima del crecimiento a una concentración final de 5 pM. La placa celular se incuba durante 7 días a 37 °C, 5 % de CO². Siete días después del tratamiento, el tampón de ensayo Cell Titer-Glo® (Promega cat# G7571) y el sustrato se retiran de -20 °C y se dejan equilibrar a TA. Se añade el tampón de ensayo al sustrato y se agita suavemente para mezclarlo. El reactivo CELL TITER-GLO® (100 pl/pocillo) se añade a la placa celular y se incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos. Tras 15 minutos, se lee la luminiscencia con un lector de placas. Los datos se analizan en Excel y se grafican en GraphPad Prism. El análisis estadístico y el valor p se calculan mediante las pruebas t no paramétricas de Mann-Whitney utilizando GraphPad Prism.

En la Tabla 4 se muestra un resumen de los datos de proliferación. Los efectos antiproliferativos de un compuesto de prueba se clasifican como insensibles (IC⁵⁰ > 1 pM), citostáticos (IC⁵⁰ < 1 pM y % de inhibición <70 %) o citotóxicos (IC⁵⁰ <1 pM y % de inhibición >70 %). Las líneas celulares portadoras de mutaciones inactivadoras o de pérdida de función (LOF) en los genes ARID1A, KMT2C, KMT2D o RB1 demostraron una respuesta citotóxica significativamente mayor al Ejemplo 1 en comparación con el resto de las líneas celulares del panel (Tabla 5). Por el contrario, las líneas celulares no LOF demostraron un mayor (%) de respuesta citostática en respuesta al Ejemplo 1.

Además, se utilizaron varios modelos de tumores de xenoinjerto que portaban estas mutaciones para evaluar la eficacia del Ejemplo 1 como monoterapia (Tabla 3).

En la Tabla 3 se muestra un resumen de los estudios de eficacia y actividad antitumoral (AT/C). El ejemplo 1 demostró una sólida eficacia en diversos modelos tumorales, observándose regresiones significativas en los modelos tumorales que albergaban mutaciones en los genes ARID1A, KMT2C o RB1 . En conjunto, estos resultados muestran que la inactivación de las mutaciones en el gen ARID1A, KMT2C, KMT2D o RB1 presenta una estrategia potencial de selección de pacientes para el tratamiento con el Ejemplo 1 en múltiples tipos de cáncer.

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Información de los medios :

A. RPMI 1640 (Gibco 11835, Gibco 22400-089, o Hyclone Cat # SH30027 ) 10 % FBS (Gibco cat#10082) B. DMEM con L-Glutamina (Thermo cat#SH30022) NaPyr NEAA HEPES 10% FBS (Gibco cat#10082) C. RPMI 1640 con HEPES y L-Glutamina (Gibco 22400) 1mM de piruvato de Na 10 % de FBS (Gibco cat#10082)

D. Medio F-12K (Cat#30-2004)+ 10 % FBS (Gibco cat#10082)

E. EMEM (CellGro cat#17-305-CV) L-Glutamina Na Piruvato Na Bicarbonato 10 % FBS (Gibco cat#10082)

F. EMEM (CellGro cat#17-305-CV) L-Glutamina Na Piruvato Na Bicarbonato NEAA+ 10 % FBS (Gibco cat#10082)

G. DMEM (Gibco 11995) 1mM de piruvato de Na 10 % de FBS (Gibco cat#10082)

H. DMEM con alto contenido de glucosa (Hyclone Cat # SH30022) 10 % HIFBS (Gibco Cat # 10082) IX NEAA (Hyclone SH30328)

I. RPMI 1640 modificado por ATCC (Gibco A1049101) 1mM de piruvato de Na 10 % de FBS (Gibco cat#10082)

J. McCoy's 5A 10 % FBS (Gibco cat#10082)

K. DMEM (Gibco 11965) 10 % FBS

L. MEM Eagle con sales de Earle (Gibco 11095-080) 1 % NEAA 1 % NaPyr 10 % FBS (Gibco cat#10082) M. RPMI-1640 con L-glutamina y HEPES 10 % de FBS inactivado por calor

N. DMEM con L-Glutamina (Thermo cat#SH30022) Piruvato de Na 10 % FBS (Gibco cat#10082) O. MEM (Gibco 11095) Piruvato de Na NEAA 10 % FBS (Gibco cat#10082)

P. RPMI 1640 con HEPES y L-Glutamina (Thermo SH30255.01 o Gibco 11835) 1mM de piruvato sódico 10 %FBS(Gibco cat#10082)

Q. DMEM:F12 con 2,5 mM de L-glutamina, 15 mM de HEPES 0,5 mM de NaPyruv 10 % de FBS R. 49 % RPMI 1640 49 % F12 de Ham 2 % h.i. FBS

S. 45 % RPMI 1640 45 % Ham's F12 10 % h.i. FBS

T. DMEM (Gibco 11965) 1mM Na Pyruvate 5 % FBS (Gibco cat#10082)

U. L15 de Leibovitz (Gibco cat#11415-064) 10 % FBS (Gibco cat#10082), sinCO2

V. DMEM con alto contenido de Glu y L-gln 10 % de FBS inactivado por calor NaPyr NEAA HEPES W. DMEM:F12 (1:1) ITS 10nM Hidrocortisona 10nM beta-Estradiol 4,5mM L-glut 5 % FBS (Gibco cat#10082)

X. RPMI-1640 con L-glutamina y HEPES 10 % FBS

Y. RPMI 1640 con HEPES y L-Glutamina (Gibco 22400) 1mM de Na Piruvato NEAA 20 % FBS(Gibco cat#10082)

Z. DMEM 2mM de glutamina 1mM de piruvato sódico (NaP) 20 IU/l de insulina bovina 10 % de FBS (Gibco cat#10082)

AA Medio E de Williams (Gibco Cat# 12551)+ 10%FBS

BB. MEM 10 % FBS NaPyr NEAA HEPES 1,5g/L NaHCOa

CC. McCoy's 5A (Gibco 16600) 15 % FBS (Gibco cat#10082)

DD. 1-1-11095 F12 (CellGro 10-080-CV) 10 % FBS (Gibco cat#10082)

Claims (24)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de fórmula (I)

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 de fórmula (II)

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 2, de fórmula (II)

4. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 de fórmula (111)

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

5. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 4, de fórmula (III):

6. El compuesto o la sal de acuerdo con la reivindicación 2 que es una sal de hidrato de hidrocloruro, besilato o hemiedisilato.

7. El compuesto o la sal de acuerdo con la reivindicación 4 que es una sal de hidrato de besilato o de hemi-edisilato.

8. El compuesto o la sal de acuerdo con la reivindicación 2 que está en forma de sal cristalina.

9. El compuesto o la sal de acuerdo con la reivindicación 8, que es besilato de [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato cristalino, caracterizado por un patrón de difracción de rayos X en polvo que tiene picos característicos utilizando radiación CuKa, en 20 ± 02°, que se producen a 21,5° en combinación con uno o más picos seleccionados del grupo que consiste en 12,4°, 17,3° y 15,8°.

10. El compuesto o la sal de acuerdo con la reivindicación 8, que es hidrato de hemidiilato de [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirrolidin-3-il] 4-[(3-isopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-carboxilato, caracterizado por un patrón de difracción de rayos X en polvo que tiene picos característicos utilizando radiación CuKa, en 20 ± 02°, que se producen a 18,5° en combinación con uno o más picos seleccionados del grupo que consiste en 21,5°, 16,7° y 15,2°.

11. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.

12. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11 que comprende uno o más agentes terapéuticos.

13. Un compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para su uso en terapia.

14. Un compuesto o sal del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para su uso en un procedimiento de tratamiento de cáncer urotelial, cáncer de útero, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer gástrico, cáncer hepatobiliar, cáncer de páncreas, cánceres de cuello de útero, cáncer de próstata, cánceres hematológicos, sarcomas, cánceres de piel o gliomas.

15. El compuesto o sal para uso de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el cáncer es cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario o cáncer gástrico.

16. El compuesto o sal para uso de acuerdo con la reivindicación 14 o 15, en el que el cáncer es cáncer de mama.

17. El compuesto o sal del mismo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, comprendiendo el procedimiento también realizar un ensayo in vitro utilizando una muestra biológica del paciente, determinando la presencia de al menos una mutación inactivadora en los genes ARID1A, KMT2C, KMT2D y RB1 , y administrando una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto o sal del mismo al paciente si está presente al menos una mutación inactivadora en cualquiera de los genes.

18. El compuesto o sal del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que la muestra biológica es una muestra tumoral y la muestra se ensaya mediante secuenciación genómica/ADN.

19. El compuesto o la sal del mismo para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 17 o 18, en el que la muestra se obtiene del paciente antes de la primera administración del compuesto o la sal del mismo al paciente.

20. El compuesto o la sal del mismo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, en el que un paciente se selecciona para el tratamiento por tener al menos una mutación inactivadora en el gen ARID1A .

21. El compuesto o la sal del mismo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, en el que un paciente se selecciona para el tratamiento por tener al menos una mutación inactivadora en el gen KMT2C .

22. El compuesto o sal del mismo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, en el que un paciente se selecciona para el tratamiento por tener al menos una mutación inactivadora en el gen KMT2D .

23. El compuesto o la sal del mismo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, en el que un paciente se selecciona para el tratamiento por tener al menos una mutación inactivadora en el gen RB1 .

24. El compuesto o la sal del mismo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 23, en el que el compuesto o la sal del mismo se administra al paciente a una dosis de aproximadamente 1 mg a 2 g.