CN111344292A - 用于抑制cdk7的化合物 - Google Patents
用于抑制cdk7的化合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111344292A CN111344292A CN201880071902.0A CN201880071902A CN111344292A CN 111344292 A CN111344292 A CN 111344292A CN 201880071902 A CN201880071902 A CN 201880071902A CN 111344292 A CN111344292 A CN 111344292A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cancer
- salt
- compound
- patient
- piperidine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
- C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D487/04—Ortho-condensed systems
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
- A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
- A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
- C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
- C07B2200/13—Crystalline forms, e.g. polymorphs
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
本发明提供了新的CDK7抑制剂或其药学上可接受的盐及其药物组合物。
Description
本发明涉及可用于抑制细胞周期蛋白依赖性激酶7(CDK7)的化合物、药物组合物和用于治疗与CDK7活性相关的疾病的方法。
细胞周期蛋白激酶(CDK)是激酶的主要类别,并且在癌细胞增殖和致癌基因转录失调中是重要的。CDK7与细胞周期蛋白H和MATI结合形成三聚化细胞周期蛋白活化激酶(CAK),该激酶通过使牵涉细胞周期控制的其他CDK磷酸化来执行其功能。这些复合物控制细胞周期中两个后续阶段之间的特定过渡。CDK7牵涉细胞周期的短暂控制和转录活性。CDK7通过RNA聚合酶II(RNAPII)的Rbp1亚单位的磷酸化牵涉转录起始过程。不受控制的细胞增殖和转录失调是癌症的标志。通过同时抑制活性转录和细胞周期进程选择性靶向CDK7可提供优势。因此,CDK7是治疗癌症的富有希望的靶标,特别是侵袭性和难以治疗的癌症。
在文献中已经报道了针对CDK7的小分子抑制剂(参见,例如,WO 2015/154022、WO2016/142855、WO 2016/160617、WO 2016/193939和WO 2017/044858)。仍然需要提供可用于治疗细胞增殖性疾病例如癌症的CDK7抑制剂。另外,需要提供与其他CDK相比对CDK7具有选择性的CDK7抑制剂。
本发明提供了作为CDK7选择性抑制剂的新型化合物。这样的新化合物可以解决强效、有效治疗癌症的需求,尤其是具有转录失调的癌症。本发明还可以解决对强效、有效治疗尿路上皮癌、子宫癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝胆管癌、胰腺癌、宫颈癌、前列腺癌、血癌、肉瘤、皮肤癌和/或神经胶质瘤的需求。
本发明提供了下式的化合物:
或其药学上可接受的盐。尤其优选苯磺酸盐。还优选半乙二磺酸盐水合物盐。
本发明还提供了用于治疗癌症的方法,特别是用于治疗具有转录失调的癌症的方法。优选地,所述癌为尿路上皮癌、子宫癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝胆管癌、胰腺癌、宫颈癌、前列腺癌、血癌、肉瘤、皮肤癌或神经胶质瘤。更优选地,所述癌为结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌或胃癌。最优选地,所述癌为乳腺癌。
本发明还提供了治疗患者的尿路上皮癌、子宫癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝胆管癌、尿路上皮癌、子宫癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝胆管癌、胰腺癌、宫颈癌、前列腺癌、血癌、肉瘤、皮肤癌或神经胶质瘤的方法,包括测试来自患者的生物样品中ARID1A、KMT2C、KMT2D和/或RB1基因内的功能突变的至少一种缺失的存在,并且如果样品测试对ARID1A、KMT2C、KMT2D和/或RB1基因的任一种中的功能突变的至少一种缺失呈阳性,则给患者施用治疗有效量的本发明的化合物或盐,特别是4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯或其药学上可接受的盐。优选地,所述盐为苯磺酸盐或半乙二磺酸盐水合物盐。更优选地,所述癌为结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌或胃癌。最优选地,所述癌为乳腺癌。优选地,所述生物样品为肿瘤样品,且通过基因组/DNA测序分析样品。优选地,该样品得自给患者首次施用所述化合物或其盐之前的患者,优选4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯或其药学上可接受的盐。优选地,所述盐为苯磺酸盐或半乙二磺酸盐水合物盐。优选地,所述基因为ARID1A基因。优选地,所述基因为KMT2C基因。优选地,所述基因为KMT2D基因。优选地,所述基因为RB1基因。
本发明还提供了治疗患者的尿路上皮癌、子宫癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝胆管癌、胰腺癌、宫颈癌、前列腺癌、血癌、肉瘤、皮肤癌或神经胶质瘤的方法,包括给患者施用治疗有效量的本发明化合物或盐,特别是4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯或其药学上可接受的盐,条件是来自该患者的生物样品包含ARID1A、KMT2C、KMT2D和/或RB1基因中的功能突变的至少一种缺失。优选地,所述盐为苯磺酸盐或半乙二磺酸盐水合物盐。更优选地,所述癌为结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌或胃癌。最优选地,所述癌为乳腺癌。优选地,所述生物样品为肿瘤样品,且通过基因组/DNA测序分析样品。优选地,该样品得自给患者首次施用所述化合物或其盐之前的患者,优选4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯或其药学上可接受的盐。优选地,所述盐为苯磺酸盐或半乙二磺酸盐水合物盐。优选地,所述基因为ARID1A基因。优选地,所述基因为KMT2C基因。优选地,所述基因为KMT2D基因。优选地,所述基因为RB1基因。
本发明还提供了治疗患者的尿路上皮癌、子宫癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝胆管癌、胰腺癌、宫颈癌、前列腺癌、血癌、肉瘤、皮肤癌或神经胶质瘤的方法,包括给患者施用治疗有效量的本发明化合物或盐,特别是4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯或其药学上可接受的盐,条件是如果来自该患者的生物样品对ARID1A、KMT2C、KMT2D和/或RB1基因中的功能突变的至少一种缺失呈阳性,则选择该患者用于治疗。优选地,所述盐为苯磺酸盐或半乙二磺酸盐水合物盐。更优选地,所述癌选自结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌或胃癌。最优选地,所述癌为乳腺癌。优选地,所述生物样品为肿瘤样品,且通过基因组/DNA测序分析样品。优选地,该样品得自给患者首次施用所述化合物或其盐之前的患者,优选4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯或其药学上可接受的盐。优选地,所述盐为苯磺酸盐或半乙二磺酸盐水合物盐。优选地,所述基因为ARID1A基因。优选地,所述基因为KMT2C基因。优选地,所述基因为KMT2D基因。优选地,所述基因为RB1基因。
本发明还提供了药物组合物,其包含本发明的化合物或其药学上可接受的盐与一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂。在另一个实施方案中,该组合物还包含一种或多种另外的治疗剂。在另一个实施方案中,本发明提供了用于治疗癌症的药物组合物,其包含本发明的化合物或其药学上可接受的盐与一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在另一个实施方案中,本发明提供了用于治疗具有转录失调的癌症的药物组合物,其包含本发明的化合物或其药学上可接受的盐与一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在所述实施方案中,所述癌为尿路上皮癌、子宫癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝胆管癌、胰腺癌、宫颈癌、前列腺癌、血癌、肉瘤、皮肤癌或神经胶质瘤。
在一个优选的实施方案中,所述癌为结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌或胃癌。在一个更优选的实施方案中,所述癌为乳腺癌。
本发明还提供了本发明的化合物或其药学上可接受的盐,用于治疗癌症,还包含进行体外测定,该测定使用来自患者的生物样品,测定ARID1A、KMT2C、KMT2D和RB1基因中的至少一种失活突变的存在,并且如果存在任一基因中的至少一种失活突变,则给患者施用治疗有效量的所述化合物或其盐。在所述实施方案中,所述癌为用于治疗中的尿路上皮癌、子宫癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝胆管癌、胰腺癌、宫颈癌、前列腺癌、血癌、肉瘤、皮肤癌或神经胶质瘤。优选地,所述生物样品为肿瘤样品,且通过基因组/DNA测序分析样品。优选地,将所述化合物或其盐(the compound of salt thereof)以约1mg-2g的剂量施用于患者。优选地,所述样品得自给患者首次施用所述化合物或其盐之前的患者。优选地,选择在ARID1A基因中具有失活突变的患者。优选地,选择在KMT2C基因中具有失活突变的患者。优选地,选择在KMT2D基因中具有失活突变的患者。优选地,选择在RB1基因中具有失活突变的患者。
本发明还提供了本发明的化合物或其药学上可接受的盐,其用于疗法,特别是用于治疗具有转录失调的癌症。在另一个实施方案中,本发明提供了本发明的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗具有转录失调的癌症的药物中的用途。在所述实施方案中,所述癌为尿路上皮癌、子宫癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝胆管癌、胰腺癌、宫颈癌、前列腺癌、血癌、肉瘤、皮肤癌或神经胶质瘤。在优选的实施方案中,所述癌选自结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌或胃癌。在更优选的实施方案中,所述癌为乳腺癌。
在另一个实施方案中,本发明提供了本发明的化合物或其药学上可接受的盐,其用于疗法,特别是用于治疗癌症。在另一个实施方案中,本发明提供了本发明的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗癌症的药物中的用途。在所述实施方案中,所述癌为尿路上皮癌、子宫癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝胆管癌、胰腺癌、宫颈癌、前列腺癌、血癌、肉瘤、皮肤癌或神经胶质瘤。在一个优选的实施方案中,所述癌为结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌或胃癌。在一个更优选的实施方案中,所述癌为乳腺癌。本发明还提供了用于治疗尿路上皮癌、子宫癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝胆管癌、胰腺癌、宫颈癌、前列腺癌、血癌、肉瘤、皮肤癌或神经胶质瘤的药物的制备,还包含使用来自患者的生物样品进行体外测定,确定ARID1A、KMT2C、KMT2D和RB1基因中存在至少一种失活突变,并且如果存在任意基因中的至少一种失活突变,则给患者施用治疗有效量的所述化合物或其盐。优选地,所述生物样品为肿瘤样品,并且通过基因组/DNA测序测定样品。优选地,将所述化合物或其盐以约1mg-2g的剂量施用于患者。优选地,所述样品得自给患者首次施用所述化合物或其盐之前的患者。优选地,选择具有ARID1A基因中的至少一种失活突变的患者。优选地,选择具有KMT2C基因中的至少一种失活突变的患者。优选地,选择具有KMT2D基因中的至少一种失活突变的患者。优选地,选择具有RB1基因中的至少一种失活突变的患者。
本发明提供了晶体盐形式的本发明的化合物4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯。本发明还提供了晶体4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯半乙二磺酸盐水合物。本发明还提供了晶体盐形式的4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯半乙二磺酸盐水合物,其特征在于使用CuKa射线的具有在2θ±0.2°中出现在18.5°的特征峰与一个或多个选自21.5°、16.7°和15.2°的峰的X-射线粉末衍射图。本发明还提供了晶体4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯苯磺酸盐。本发明还提供了晶体形式的4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯苯磺酸盐,其特征在于使用CuKa射线的具有在2θ±0.2°中出现在21.5°的特征峰与一个或多个选自12.4°、17.3°和15.8°的峰的X-射线粉末衍射图。本发明还提供了晶体4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯盐酸盐。本发明还提供了晶体形式的4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯盐酸盐,其特征在于使用CuKa射线的具有在2θ±0.2°中出现在18.9°的特征峰与一个或多个选自5.5°、15.5°和9.7°的峰的X-射线粉末衍射图。
本发明还涵盖用于合成本发明化合物的中间体和方法。
如本文所用,术语“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)是指压缩(straining)、减缓、停止或逆转现有症状、病症或障碍的进展或严重程度。
如本文所用,术语“癌症”和“癌性”是指或描述患者的生理状况,其典型地以细胞增殖失控为特征。该定义包括良性和恶性癌。所谓“早期癌”或“早期肿瘤”是指非晚期或转移性或被分类为0、I或II期癌症的癌。癌症的实例包括、但不限于尿路上皮癌、子宫癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝胆管癌、胰腺癌、宫颈癌、前列腺癌、血癌、肉瘤、皮肤癌或神经胶质瘤。
本发明的化合物可以反应形成药学上可接受的盐。药学上可接受的盐及其常用制备方法为本领域众所周知的(参见,例如P.Stahl等人Handbook of PharmaceuticalSalts:Properties,Selection and Use,第2修订版(Wiley-VCH,2011);S.M.Berge等人,“Pharmaceutical Salts,”Journal of Pharmaceutical Sciences,第66卷,1977年1月1日)。
本领域技术人员可以理解,如(I)中所示的本发明的化合物或其药学上可接受的盐由包含一个如下*表示的手性中心的核组成:
尽管本发明关注所有单个对映体,以及所述化合物的对映体的混合物,包括外消旋体,但本发明的优选化合物由以下(II)表示:
或其药学上可接受的盐。
本领域技术人员还将理解,所有手性中心的Cahn-Ingold-Prelog(R)或(S)命名将根据特定化合物的取代模式的不同而变化。单一对映体可以从手性试剂开始或通过立体选择性或立体有择的合成技术来制备。或者,可以通过标准手性色谱或结晶技术在合成本发明的化合物中的任何便利点从混合物中分离出单个对映体。本发明化合物的单一对映体是本发明的优选实施方案。
优选将本发明的化合物配制成通过多种途径施用的药物组合物。这样的药物组合物及其制备方法在本领域中是众所周知的(参见,例如,Remington:The Science andPractice of Pharmacy(A.Gennaro等人,eds.编辑,第21版,Mack Publishing Co.,2005))。更特别优选地为药物组合物,其包含下式的化合物
或其药学上可接受的盐和一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂。
本发明的优选实施方案为:
或其药学上可接受的盐。
本发明的一个特别优选的实施方案涉及化合物4-{[5-甲基-3-(丙-2-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基]氨基}哌啶-1-甲酸(3S)-1-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基酯:
或其药学上可接受的盐。尤其优选半乙二磺酸盐水合物盐或苯磺酸盐形式。
本发明的另一个特别优选的实施方案涉及化合物4-{[5-甲基-3-(丙-2-基)吡唑并[1,5-A]嘧啶-7-基]氨基}哌啶-1-甲酸(3S)-1-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基酯:
本发明的另一个特别优选的实施方案涉及化合物4-{[5-甲基-3-(丙-2-基)吡唑并[1,5-A]嘧啶-7-基]氨基}哌啶-1-甲酸(3R)-1-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基酯(如下(III)所示):
或其药学上可接受的盐。尤其优选半乙二磺酸盐水合物盐或苯磺酸盐形式。
本发明的另一个特别优选的实施方案涉及化合物4-{[5-甲基-3-(丙-2-基)吡唑并[1,5-A]嘧啶-7-基]氨基}哌啶-1-甲酸(3R)-1-[(2E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基酯:
本发明的化合物在宽剂量范围内通常是有效的。例如,每天的剂量在约1mg-约2g的范围内。在某些情况下,低于上述范围下限的剂量水平可能是足够的,而在另外的情况下,在保持有利的利益/风险特性的同时,仍可以采用更大的剂量,且由此上述剂量范围无意以任何方式限制本发明的范围。应当理解,实际施用的化合物的量将由临床医师根据相关情况来确定,包括待治疗的病症、选择的施用途径、实际施用的一种或多种化合物、年龄、体重以及每个患者的反应和患者症状的严重程度。
本领域普通技术人员可以在本发明的化合物合成中的任何便利时,通过诸如选择性结晶技术或手性色谱这样的方法,将单个异构体和对映异构体分离或拆分。(参见,例如J.Jacques等人,″Enantiomers,Racemates,and Resolutions″,John Wiley and Sons,Inc.,1981,和E.L.Eliel和S.H.Wilen,”Stereochemistry of Organic Compounds”,Wiley-Interscience,1994)。
另外,本文所述的某些中间体可包含一个或多个保护基。根据具体的反应条件和要进行的具体转化的不同,可变保护基团在每次出现时可以相同或不同。保护和脱保护条件是技术人员众所周知的,并在文献中有描述(参见,例如“Greene’s Protective Groupsin Organic Synthesis”,第4版,Peter G.M.Wuts和Theodora W.Greene,John Wiley andSons,Inc.2007)。
将某些缩写定义如下:“1H NMR”是指1H-核磁共振;“eq”是指等效物;“THF”是指四氢呋喃;“DCM”是指二氯甲烷;“MeCN”或“ACN”是指乙腈;“DMSO”是指二甲亚砜;“MTBE”是指甲基叔丁基醚;“TEA”是指三甲胺;“HATU”是指I-[双(二甲基氨基)亚甲基]-I8-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸盐;“MeOH”是指甲醇;“TLC”是指薄层色谱法;“UV”是指紫外线;“LC柱”是指液相色谱柱;“DMEA”是指二甲基甲胺;“EtOAc”是指乙酸乙酯;“DMF”是指二甲基甲酰胺;“SCX”是指强阳离子交换;“ca.”指约或近似;“RBF”是指圆底烧瓶;“ATP”是指三磷酸腺苷;“DTT”是指二硫苏糖醇;“HEPES”是指(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸);“EDTA”是指乙二胺四乙酸;“ATCC”是指美国模式培养物保藏中心;“RT”是指室温;“PBS”是指磷酸缓冲盐水;“BSA”是指牛血清白蛋白;“FBS是指胎牛血清;“RNAase”是指核糖核酸酶;“cDNA”是指互补DNA;“GST”是指谷胱甘肽S-转移酶;“His”是指组氨酸;“GSH”是指谷胱甘肽;且“HBSS”是指Hank平衡盐溶液。
本发明的化合物或其药学上可接受的盐可以通过本领域已知的各种方法以及任选的制备例和实施例制备。所述的每种途径的具体合成步骤可以以不同的方式合并,或者与来自不同方案的步骤结合,以制备本发明的化合物或其药学上可接受的盐。可以通过本领域公知的常规方法回收以下方案中每个步骤的产物,包括萃取、蒸发、沉淀、色谱、过滤、研磨和结晶。试剂和原料对于本领域普通技术人员而言易于得到。
下列制备例和实施例进一步示例本发明,并代表本发明化合物的典型的合成。
制备例和实施例
制备例1
3-异丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-5,7-二醇的合成
在23℃将乙醇钠(979g,14.4摩尔,3.0eq)和丙二酸二乙酯(998g,6.23摩尔,3.0eq)加入到4-异丙基-1H-吡唑-3-胺(600g,4.79摩尔)在乙醇4.2L)中的溶液中,将该混合物加热至80℃(内部温度)15小时。将该混合物冷却至25℃,加入1M HCl水溶液(2.0L)(最终pH=2.0),过滤,用水(2.0L)洗涤固体,干燥,得到3-异丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-5,7-二醇(600g,65%),为白色固体。ES/MS m/z 194(M+H)。
制备例2
5,7-二氯-3-异丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶的合成
在50℃将POCl3(2.00L,25.8摩尔,10eq)和N,N-二甲基苯胺(162mL,2.58摩尔,1.0eq)加入到3-异丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-5,7-二醇(500g,2.58摩尔)在MeCN(1.25L)中的混悬液中,将该混合物加热至100℃36小时。冷却至23℃,以滴加方式倾1∶1冰/磷酸盐缓冲液(1M,pH=8,10L),搅拌15小时。过滤,用水(5.0L)洗涤固体,干燥,得到5,7-二氯-3-异丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶(375g,63%),为棕色固体。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)230/232(M+H)。1H NMR(d6-DMSO)δ1.32(d,6H),3.19(dq,1H),7.58(s,1H),8.31(s,1H)。
5,7-二氯-3-异丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶的可选合成
将乙醇钠-21%的乙醇溶液-(17.9mL,47.9mmol)加入到4-异丙基-1H-吡唑-5-胺(5g,39.9mmol)和丙二酸二乙酯(6.74mL,43.9mmol)在乙醇(150mL)中的溶液中,在RT搅拌。5分钟后,在90℃加热,搅拌。18小时后,冷却至RT,减压浓缩。用水溶解残余物,将1N盐酸加入至pH=3。过滤白色沉淀,在50℃减压干燥18小时。将得到的固体3-异丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-5,7-二醇(4.92g,25.5mmol,0.638)混悬于磷酰氯(48mL),加入N,N-二甲基苯胺(2.3mL)。在110℃回流该混合物。2小时后,冷却至RT,减压浓缩。将残余物倾倒在冰/水溶液上,用DCM萃取(2次)。合并有机层,用盐水洗涤,用硫酸镁干燥。过滤,减压浓缩,得到残余物。通过快速色谱法纯化(硅胶),用乙基己烷:乙酸酯洗脱,得到5,7-二氯-3-异丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶(4.45g,19.3mmol),为棕色固体。MS(m/z):230,232(M+1)。1H NMR(400.21MHz,DMSO):8.31(s,1H),7.58(s,1H),3.19(m,1H),1.32(d,J=7.0Hz,6H)。
制备例3
4-[(5-氯-3-异丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸叔丁酯的合成
在23℃将N,N-二异丙基乙胺(189mL,140g,1080mmol,2eq)和4-氨基哌啶-1-甲酸叔丁酯(114g,570mmol,1.05eq)加入到5,7-二氯-3-异丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶(130g,542mmol)在2-丙醇(1.0L)中的混悬液中,将该混合物搅拌18小时,过滤,用MTBE(200mL)洗涤固体,干燥,得到4-[(5-氯-3-异丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(182g,85%收率),为黄色固体。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)394/396(M+H)。1H NMR(d6-DMSO)δ1.28(d,6H),1.42(s,9H),1.61(m,2H),1.83(m,2H),2.87(m,1H),3.10(dq,1H),3.32(m,1H),3.85(m,1H),3.98(m,2H),6.34(s,1H),8.01(s,1H),8.07(d,1H)。
制备例4
4-[叔丁氧羰基-(5-氯-3-异丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸叔丁酯的合成
在23℃将N,N-二异丙基乙胺(69.1mL,51.2g,396mmol,1eq)、4-二甲基氨基吡啶4.84g,39.6mmol,0.1eq)和二碳酸二叔丁酯(200mL,190g,871mmol,2.2eq)加入到4-[(5-氯-3-异丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(156g,396mmol)在THF(936mL)中的溶液中,将该混合物在50℃(内部温度)加热21小时。冷却至23℃,真空浓缩,得到4-[叔丁氧羰基-(5-氯-3-异丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(195g,99%),为橙色固体。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)438/440(M+H-56)。1H NMR(d6-DMSO)δ1.20(s,9H),1.31(d,6H),1.35(s,9H),1.46(m,2H),1.88(m,2H),2.75(m,1H),3.19(dq,1H),3.32(m,1H),3.95(m,1H),4.18(m,2H),7.20(s,1H),8.19(s,1H)。
4-[叔丁氧羰基-(5-氯-3-异丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸叔丁酯的可选合成
将4-氨基哌啶-1-甲酸叔丁酯(2.8g,14mmol)加入到5,7-二氯-3-异丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶(3.1g,13mmol)在乙醇(32mL)中的溶液中。在80℃加热。18小时后,冷却至RT,减压浓缩。通过快速色谱法纯化(硅胶),用乙酸乙酯:DCM洗脱。得到4-[叔丁氧羰基-(5-氯-3-异丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸叔丁酯,为白色固体。质谱(m/e):394,396(M+1)。将叔丁氧羰基叔丁基碳酸酯(1.14g,5.22mmol)加入到4-[(5-氯-3-异丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(940mg,2.386mmol)和4-二甲基氨基吡啶(290mg,2.33mmol)在THF(7mL)中的溶液中。在60℃加热该混合物。30分钟后,冷却至RT,减压浓缩。通过快速色谱法纯化(硅胶),用DCM洗脱,得到4-[叔丁氧羰基-(5-氯-3-异丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.1g),为浅黄色油状物。质谱(m/z):438(M-t-Bu)。1H NMR(400.13MHz,d6-DMSO):8.19(s,1H),7.20(s,1H),5.76(s,1H),4.17(m,1H),3.95(m,2H),3.19(m,1H),1.87(m,2H),1.47(m,2H),1.35(s,9H),1-31(d,6H),1.19(s,9H)。
制备例5
4-[叔丁氧羧基-(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸叔丁酯的合成
在90℃(内部温度)将[1,1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(II)DCM加合物(15.7g,19.3mmol,0.05eq)、磷酸三钾(245g,1160mmol,3eq)和2,4,6-三甲基-1,3,5,2,4,6-三氧杂硼杂环己烷(trioxatriborinane)(50质量%的THF溶液,75.3mL,67.6g,270mmol,0.7eq)加入到4-[叔丁氧羰基-(5-氯-3-异丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(190g,385mmol)在1,4-二噁烷(1.5L)中的溶液中。5天后,冷却至23℃,通过硅藻土垫过滤,用THF(3x250mL)洗涤固体。在23℃用Thiol树脂(40-63μm;载量=1.46mmol/g;320g,467mmol)处理合并的滤液,加热至65℃18小时。冷却至23℃,过滤,用DCM(2x250mL)洗涤树脂。真空浓缩合并的滤液,将残余物溶于MTBE(1mL),用水(200mL)洗涤,干燥(MgSO4),真空浓缩,得到4-[叔丁氧羰基-(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(182g,100%),为棕色固体。ES/MS m/z474(M+H)。
制备例6
3-异丙基-5-甲基-N-(4-哌啶基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺二盐酸盐的合成
在23℃将盐酸的2-丙醇溶液(5.50mol/L,349mL,1920mmol,5eq)加入到4-[叔丁氧羰基-(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(182g,384mmol)在2-丙醇(1.4L)中的混悬液中,将该混合物加热至70℃(内部温度)3小时。冷却至23℃,过滤,用MTBE(2x200mL)洗涤固体,干燥,得到3-异丙基-5-甲基-N-(4-哌啶基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺二盐酸盐(95g,71%收率),为黄色固体。合并母液,用MTBE(2L)稀释,用MTBE(2x50mL)洗涤固体,干燥,又得到物质(8.42g,15%收率)。ES/MS m/z 274(M+H)。1HNMR(d6-DMSO)δ1.28(d,6H),2.04(m,4H),2.61(s,3H),3.00(m,2H),3.40(m,3H),4.16(m,2H),6.68(s,1H),8.30(s,1H),8.80(m,1H),9.21(m,1H),9.86(m,1H)。
3-异丙基-5-甲基-N-(4-哌啶基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺二盐酸盐的可选合成
将7-氯-3-异丙基-5-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶(2.1kg,10.0mol)和二异丙基乙胺(4.18L,2.4eq)溶于异丙醇(16.8L,8mL/g)。向反应混合物中加入4-氨基哌啶-1-甲酸叔丁酯(2.6kg,1.3eq.),加热至75-80℃16小时。将反应混合物冷却至5-10℃,加入4M盐酸的异丙醇溶液(17.5L,7.0eq),加热至40-45℃4小时。冷却至25-30℃,过滤该混合物,得到标题化合物(2.25kg,72.7%收率)。将物质不经进一步纯化用于下一步。1H NMR(500MHz,D2O)δ8.16(s,1H),6.45(s,1H),4.29-4.26(m,1H),3.63(d,J=15.0Hz,2H),3.26-3.12(m,3H),2.64(s,3H),2.40(d,J=15.0Hz,2H),2.08(dd,J=10.0,25.0Hz,2H),1.31(d,J=5.0Hz,6H)。
作为游离碱的3-异丙基-5-甲基-N-(4-哌啶基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺的可选合成
将1,4-二噁烷(15mL)加入到4-[叔丁氧羰基-(5-氯-3-异丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(689mg,1.39mmol)、2,4,6-三甲基-1,3,5,2,4,6-三氧杂硼杂环已烷(350mg,2.79mmol)和磷酸三钾(1.2g,5.5mmol)的混合物中。使N2通过该溶液起泡5分钟。加入[1,1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(II)DCM加合物(60mg,0.072mmol)。在110℃加热、1.5小时后,再加入[1,1-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(II)(60mg,0.072mmol),在100℃加热。18小时后,冷却至RT,通过过滤器垫过滤该混合物,用乙酸乙酯冲洗,减压浓缩。通过快速色谱法纯化(硅胶),用乙酸乙酯和DCM洗脱,得到4-[叔丁氧羰基-(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(537mg,1.077mmol),为橘黄色油状物。质谱(m/z):474(M+1)。
将三氟乙酸(2.5mL,33mmol)滴加到4-[叔丁氧羰基-(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(537mg,1.077mmol)在DCM(12mL)中的溶液中。在RT搅拌。2小时后,减压浓缩该混合物。通过SCX-2柱纯化残余物,用10%DCM:MeOH、然后用MeOH(2N NH3)洗脱。减压浓缩碱性级分,得到3-异丙基-5-甲基-N-(4-哌啶基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺(345mg,1.199mmol),为呈褐色的固体。质谱(m/z):274(M+1)。1H NMR(400.13MHz,DMSO):7.82(s,1H),7.23(d,1H),6.08(s,1H),3.58(m,1H),3.12(m,1H),2.97(m,2H),2.58(m,2H),2.39(s,3H),2.10(m,2H),1.28(d,6H)。
制备例7
4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-叔丁氧羰基吡咯烷-3-基]酯的合成
在23℃将光气(20质量%的甲苯溶液,348mL,485g,981mmol,2.4eq)加入到(3S)-3-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(76.5g,409mmol)在THF(765mL)中的溶液中,持续1小时,该溶液置于3颈RBF中,所述3颈RBF连接至包含32%NH4OH水溶液的洗涤器捕集瓶(scrubbertrap bottle)。使N2通过该混合物起泡30分钟,真空浓缩。将残余物溶于DCM(757mL),冷却至0℃(内部温度),加入(7分钟内缓慢添加)预先用三乙胺(228mL,166g.,1639mmol,6eq)处理的3-异丙基-5-甲基-N-(4-哌啶基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺二盐酸盐(94.6g,273.2mmol)在DCM(756.8mL)中的混悬液。添加后除去冷却浴,30分钟后用35%HCl水溶液(20mL)和1M HCl水溶液(300mL)(最终pH=7)使反应停止。分离有机层,用水(300mL)和饱和NaCl水溶液(300mL)洗涤,干燥(MgSO4),真空浓缩。将残余物(约180g)溶于DCM(1.5L),在23℃加入Thiol树脂(40-63μm;载量=1.46mmol/g;10g,14.6mmol,140eq,基于Pd含量),然后将该混合物加热至40℃2小时。过滤,用DCM(2x10mL)冲洗树脂,真空浓缩合并的滤液,得到4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-叔丁氧羰基吡咯烷-3-基]酯(129g,97%),为黄色固体。ES/MS m/z487(M+H)。1H NMR(d6-DMSO)δ1.28(d,6H),1.40(s,9H),1.65(m,2H),1.88(m,2H),1.96(m,1H),2.07(m,1H),2.46(s,3H),2.90(m,2H),3.31(m,5H),3.89(m,1H),4.02(m,2H),5.10(m,1H),6.32(s,1H),8.01(s,1H)。
4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-叔丁氧羰基吡咯烷-3-基]酯的可选合成
在15-30℃将(3S)-3-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(438g,1.3eq.)溶于ACN(4.4L,10.0mL/g)。加入三乙胺(595mL,4.5eq.),然后在15-30℃加入氯甲酸4-硝基苯酯(490g,1.4eq.)。加热至35-40℃,将混合物搅拌4小时。冷却至15-25℃,加入3-异丙基-5-甲基-N-(哌啶-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺(500g,1.8mol)。在15-30℃搅拌5小时。减压浓缩。加入2-甲基四氢呋喃(4.4L,10.0mL/g),搅拌,过滤。依次用2M NaOH(1.1L,2.5mL/g,4次)和饱和NaCl水溶液(4.4L,10.0mL/g)洗涤。用Na2SO4干燥,过滤,减压浓缩。加入异丙醇(2.2L,5mL/g),得到标题化合物溶液(660g,75.4%收率)。
制备例8
4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-吡咯烷-3-基]酯的合成
在23℃将盐酸的2-丙醇溶液(5.50mol/L,217mL,1190mmol,5eq)加入到4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-叔丁氧羰基吡咯烷-3-基]酯(116g,239mmol)在2-丙醇(755mL)中的混悬液中,将该混合物加热至70℃90分钟。冷却至23℃,真空浓缩。将残余物混悬于DCM(1.5L),加入1M NaOH水溶液(400mL)和50%NaOH水溶液(100mL)。搅拌15分钟。分离有机相,干燥(MgSO4),真空浓缩。将残余物(约131g)混悬于MTBE/己烷(2∶1,900mL),将该混合物搅拌18小时。过滤,用己烷(2x100mL)洗涤过滤的固体,干燥,得到4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-吡咯烷-3-基]酯(82.7g,90%收率),为黄色固体。ES/MS m/z 387(M+H)。1H NMR(d6-DMSO)δ1.28(d,6H),1.60(m,3H),1.88(m,3H),2.40(s,3H),2.75(m,2H),2.91(m,4H),3.13(dq,1H),3.78(m,1H),4.02(m,2H),5.10(m,1H),6.14(s,1H),7.41(d,1H),7.87(s,1H)。
4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-吡咯烷-3-基]酯的可选合成
在20-30℃将5.5M盐酸的异丙醇溶液(8.4L,5.0mL/g)加入到包含(S)-4-((3-异丙基-5-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基)哌啶-1-甲酸1-(叔丁氧羰基)吡咯烷-3-基酯(819g)的异丙醇溶液中。将反应混合物加热至50-60℃5小时。冷却至30-35℃,加入MTBE(8.2L,10mL/g),搅拌1小时。过滤,在0-5℃加入湿饼状物至氢氧化钠水溶液(3.0当量)中,搅拌30分钟。加入2-甲基四氢呋喃(8.2L,10.0mL/g),搅拌。萃取有机相,用饱和NaCl水溶液洗涤。用硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩至1-2个体积。加入MTBE(2.46L,3mL/g),搅拌3小时。过滤,得到标题化合物(550g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.82(s,1H),6.12(d,J=8.1Hz,1H),5.78(s,1H),5.27-5.13(m,1H),4.26-4.01(m,2H),3.74-3.59(m,1H),3.36-3.23(m,1H),3.14-2.98(m,5H),2.90(ddd,J=11.1,8.4,5.4Hz,1H),2.52(s,3H),2.18-2.00(m,3H),1.87(dd,J=12.6,6.4Hz,1H),1.76(s,1H),1.66-1.52(m,2H),1.34(d,J=6.9Hz,6H)。
4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-吡咯烷-3-基]酯的可选合成
将光气(1.14mL,20质量%的甲苯溶液,3.20mmol)加入到冷(0℃)(3S)-3-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(500mg,2.67mmol)和TEA(0.37mL,2.6mmol)在THF(13mL)中的溶液中。除去冷浴,将该混合物在RT搅拌。30分钟后,减压浓缩该混合物,将残余物溶于DCM(11mL)。将该溶液加入到3-异丙基-5-甲基-N-(4-哌啶基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺(C,365mg,100质量%,0.365g)和TEA(0.3mL)在DCM(11mL)中的溶液中。将该混合物在RT搅拌。10分钟后,加入饱和NaHCO3水溶液,再用DCM萃取。合并有机层,用饱和NaCl水溶液洗涤,用硫酸镁干燥,减压浓缩,得到残余物。通过快速色谱法纯化(硅胶),用DCM:MeOH洗脱,得到4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-叔丁氧羰基吡咯烷-3-基]酯(671mg),为浅黄色油状物。质谱(m/z):487(M+1)。
将三氟乙酸(2mL,26.45mmol)滴加到4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-叔丁氧羰基吡咯烷-3-基]酯(671mg,1.269mmol)在DCM(12mL)中的溶液中。在RT搅拌。18小时后,减压浓缩该混合物。将残余物溶于DCM,用10%K2CO3水溶液洗涤有机相。用硫酸镁干燥有机相,过滤,减压浓缩,得到4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-吡咯烷-3-基]酯(274mg,0.6593mmol),为白色泡沫体。质谱(m/z):387(M+1)。1H NMR(400.13MHz,d6-DMSO):7.87(s,1H),7.42(d,J=9.0Hz,1H),6.13(s,1H),5.00(ddd,J=9.0,5.2,2.5Hz,1H),4.02(m,2H),3.77(m,1H),3.13(m,1H),2.89(m,4H),2.72(m,2H),2.40(s,3H),1.87(dd,J=6.8,14.1Hz,2H),1.63(m,3H),1.28(d,J=6.8Hz,6H)。
制备例9
4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3R)-吡咯烷-3-基]酯的合成
将光气(1.14mL,20质量%的甲苯溶液,3.20mmol)加入到冷(0℃)(3R)-3-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(500mg,2.67mmol)和TEA(0.37mL,2.6mmol)在THF(13mL)中的溶液中,除去冷浴,在RT搅拌该混合物。
30分钟后,减压浓缩该混合物,将残余物溶于DCM(11mL)。将该溶液加入到3-异丙基-5-甲基-N-(4-哌啶基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺(365mg,100质量%,0.365g)和TEA(0.3mL)在DCM(11mL)中的溶液中。在RT搅拌该混合物。10分钟后,加入饱和NaHCO3水溶液,再用DCM萃取。合并有机层,用饱和NaCl水溶液洗涤,用硫酸镁干燥,过滤,减压浓缩,得到残余物。通过快速色谱法纯化(硅胶),用己烷:乙酸乙酯洗脱,得到4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3R)-1-叔丁氧羰基吡咯烷-3-基]酯(350mg),为浅黄色油状物。质谱(m/z):487(M+1)。
将三氟乙酸(0.8mL,0.72mmol)滴加到4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3R)-1-叔丁氧羰基吡咯烷-3-基]酯(350mg,0.72mmol)在DCM(7mL)中的溶液中。在RT搅拌。45分钟后,减压浓缩该混合物。通过SCX-2柱纯化残余物,用10%DCM:MeOH、然后用MeOH(2N NH3)洗脱。减压浓缩碱性级分,得到4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3R)-吡咯烷-3-基]酯(246mg),为呈褐色的固体。质谱(m/z):387(M+1)。
制备例10
3-异丙基-5-甲基-4H-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-酮的合成
将4-异丙基-1H-吡唑-5-胺(2.2kg,17.6mol)和乙酰乙酸乙酯(2.86kg,1.25eq.)溶于乙酸(17.6L,8.0mL/g)。将该混合物加热至110-115℃,然后冷却至35-40℃。加入庚烷和MTBE(44L,20mL/g.,5/1之比)。过滤,用庚烷(4.4L,2mL/g.)冲洗固体,得到标题化合物(2.28kg,85.5%收率)。1H NMR(500MHz,DMSO)δ11.81(s,1H),7.77(s,1H),5.50(s,1H),3.08-3.05(m,1H),2.31(s,3H),1.22(d,J=5.0Hz,6H)。
制备例11
7-氯-3-异丙基-5-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶的合成
将3-异丙基-5-甲基-4H-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-酮(2.1kg,11.0mol)和N,N-二甲基苯胺(0.86kg,0.65eq.)溶于ACN(8.4L,4mL/g)。将该反应体系加热至50-55℃,滴加POCl3(4.2kg,2.5eq.)。调整温度至60-65℃,搅拌混合物9小时。将混合物冷却至25-30℃,倾入2M磷酸钾缓冲液(pH=8.0,42L,20mL/g)。加入MTBE(23.9L,11.4mL/g),萃取有机相。依次用20%柠檬酸溶液(4.2L,2.0mL/g)洗涤有机相2次,10%NaHCO3水溶液(10.5L,5.0mL/g)和饱和NaCl水溶液(10.5L,5.0mL/g)洗涤。用Na2SO4干燥有机相,过滤,减压浓缩,得到标题化合物(1.8kg,78%收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.02(s,1H),6.75(s,1H),3.27-3.25(m,1H),2.58(s,3H),1.42(d,J=8.0Hz,6H)。
制备例12
3-异丙基-5-甲基-N-(4-哌啶基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺
在10-15℃将3-异丙基-5-甲基-N-(4-哌啶基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺二盐酸盐(2.2kg,6.4mol)加入到1M氢氧化钠水溶液(19.2L,3.0eq.)中。将该反应混合物搅拌15-20分钟,然后加入2-甲基四氢呋喃(4.70L,10.0当量),搅拌20-25分钟。分离有机相,用2-甲基四氢呋喃(6.6L,3.0mL/g,3次)洗涤水相。合并有机溶液,用饱和NaCl水溶液(11L,5.0mL/g)洗涤。用Na2SO4干燥有机相,过滤,减压浓缩。加入MTBE(6.6L,3.0mL/g),在25-30℃搅拌40分钟。过滤,得到标题化合物(1.5kg,85.7%收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.81(s,1H),6.10(d,J=8.0Hz 1H),5.75(s,1H),3.59-3.54(m,1H),3.32-3.28(m,1H),3.22-3.19(m,2H),2.77-2.73(m,2H),2.51(s,3H),2.11(d,J=8.0Hz,2H),1.56-1.50(m,3H),1.34(d,J=8.0Hz,6H)。
实施例1
4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯的合成
[*注意,如实施例1所示,手性中心改变了取向,并且S对映异构体的形式与上述实施例在结构(II)中的显示方式不同。]在23℃将(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酸盐酸盐(15.0g,90.3mmol,1.2eq)、N,N-二异丙基乙胺(31.3mL,23.4g,181mmol,2.4eq)和HATU(42.9g,113mmol,1.5eq)加入到4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-吡咯烷-3-基]酯(29.1g,75.3mmol)在THF(146mL)中的混悬液中,将该混合物搅拌90分钟。用磷酸盐缓冲液(0.5M,pH=9,150mL)稀释,用DCM(2x375mL)萃取,干燥(MgSO4),真空浓缩。通过色谱法纯化得到的残余物(约95g)(溶于65mL DCM的残余物载量;330g SiO2;洗脱液:MTBE/7N NH3的MeOH 0%-10%溶液;TLC:MTBE/7N NH3的MeOH 5∶1溶液)。将该物质(约40g)溶于DCM(400mL),用1M K2HPO4水溶液(1M,80mL)洗涤,干燥(MgSO4),真空浓缩。通过色谱法纯化残余物(约38g)(吸附在SiO2(50g)上的残余物载量;330g SiO2;洗脱液:MTBE/7N NH3的MeOH 0%-10%溶液),得到4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯(28.1g,75%),为白色固体。ES/MS m/z 498(M+H)。1H NMR(CD3OD)δ1.33(d,6H),1.64(m,2H),2.10(m,2H),2.18(m,1H),2.26(m,1H),2.29(s,6H),2.50(s,3H),3.11(m,2H),3.18(dd,2H),3.29(dq,1H),3.70(m,3H),3.87(m,2H),4.14(m,2H),5.31(m,1H),6.12(s,1H),6.47(m,1H),6.86(m,1H),7.88(s,1H)。[α]D 20=+49.9°(C=2.0,MeOH)。对映体过量(ee)=97%.Rt(保留时间)=2.79分钟(UV);LC柱:AS(4.6x150mm,5μm);MeOH+0.2%DMEA;流速:1.0mL/min。
4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯的可选合成
加入N,N-二异丙基乙胺(0.36mL,2.1mmol,)至4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-吡咯烷-3-基]酯(170mg,0.4091mmol)、(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酸;盐酸盐(135mg,0.81512mmol)和HATU(317mg,0.8181mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中的溶液中。在RT搅拌。5分钟后,减压浓缩该混合物。通过SCX-2柱纯化残余物,用10%DCM:MeOH、然后用MeOH(2N NH3)洗脱。减压浓缩碱性级分,通过ISCOTM反相Claricep C-系列纯化残余物,用NH4CO3 pH 9/CAN洗脱,得到4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯(129mg,0.255mmol),为白色固体。质谱(m/z):498(M+1)。1H NMR(400.13MHz,MeOD):7.88(s,1H),6.85(m,1H),6.47(m,1H),6.12(s,1H),3.91-3.52(m,5H),3.13(m,1H),3.03(m,2H),2.94(m,1H),2.39(s,3H),2.15(s,6H),2.06(m,1H),1.88(d,J=11.5Hz,2H),1.66(m,2H),1.28(d,J=6.8Hz,6H)。
4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯的可选合成
在15-30℃将4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-吡咯烷-3-基]酯(550g,1.4mol)溶于THF(5.5L,10.0mL/g)。在15-30℃加入(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酸盐酸盐(278g,1.2eq.)和TEA(1.17L,6.0eq.),搅拌40分钟。在15-30℃加入50%丙基膦酸酐的EtOAc溶液(1.68L,1.2当量),搅拌12小时。过滤,将滤液与乙酸异丙酯进行减压溶剂交换。加入2M NaOH水溶液(2.75L,5mL/g),在25-30℃搅拌20分钟。萃取有机相,用饱和NaCl水溶液(2.75L,5mL/g)洗涤。用Na2SO4干燥,过滤,减压浓缩。在15-30℃加入庚烷(3.85L,7mL/g)和THF(16.5L,3mL/g)。搅拌1小时,过滤,得到标题化合物(440g,63.2%收率)。1H NMR(500MHz,CD3OD)δ7.86(s,1H),6.83(d,J=10.7Hz,1H),6.43(dd,J=34.3,14.9Hz,1H),6.08(s,1H),5.26(d,J=24.2Hz,1H),4.85(s,2H),4.22-4.01(m,2H),3.90-3.76(m,2H),3.61-3.47(m,1H),3.36-3.21(m,2H),3.17-3.11(m,2H),3.12-2.98(m,2R),2.47(s,3H),2.28-2.21(m,7H),2.16-2.00(m,3H),1.68-1.48(m,2H),1.30(d,J=6.2Hz,6H)。
实施例2
4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯盐酸盐的合成
[*注意,如实施例2所示,手性中心改变了取向,并且S对映异构体的形式与上述实施例在结构(II)中的显示方式不同。]在23℃加入HCl(1M的EtOAc溶液(0.589mL,0.590g,0.589mmol,1.07eq)至4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯(0.283g,0.549mmol)在丙酮(5.5mL)中的溶液中,将该混合物搅拌5小时。真空浓缩,得到4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯盐酸盐(0.244g,81%),为白色固体。ES/MS m/z 498(M+H)。
1H NMR(CD3OD)δ1.34(d,6H),1.66(m,2H),2.11(m,2H),2.20(m,1H),2.30(m,1H),2.54(s,3H),2.90(s,6H),3.12(m,2H),3.28(dq,1H),3.74(m,4H),3.95(dd,2H),4.16(m,2H),4.63(m,1H),5.32(m,1H),6.22(s,1H),6.78(m,2H),7.94(s,1H)。
实施例3
4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3R)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯的合成
[*注意,如实施例3所示,手性中心改变了取向,并且R对映异构体的形式与上述实施例在结构(III)中的显示方式不同。]加入N,N-二异丙基乙胺(0.4mL,2.0mmol,)至4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3R)-吡咯烷-3-基]酯(170mg,0.43mmol)、(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酸;盐酸盐(150mg,0.90mmol)和HATU(343mg,0.87mmol)在DMF(4mL)中的溶液中。在RT搅拌。5分钟,减压浓缩该混合物。通过SCX-2柱纯化残余物,用10%DCM:MeOH、然后用MeOH(2N NH3)洗脱。减压浓缩碱性级分,通过ISCO反相Claricep C-系列纯化残余物,用NH4CO3 pH9/ACN洗脱,得到4-[(3-异丙基-5-甲基--吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3R)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯(188mg),为白色固体。质谱(m/z):498(M+1)。
1H NMR(400.21MHz,DMSO):7.86(s,1H),7.41(m,1H),6.63(m,1H),6.37(m,1H),6.13(s,1H),5.16(m,1H),4.09-3.92(m,2H),3.78(m,2H),3.56(m,2H),3.13(m,1H),3.03(m,2H),2.93(m,1H),2.39(s,3H),2.14(s,6H),2.06(m,1H)1.88(m,2H),1.60(m,2H),1.28(d,J=6.8Hz,6H)。
实施例4
晶体4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯半乙二磺酸盐水合物的合成
[*注意,如实施例4所示,手性中心改变了取向,并且S对映异构体的形式与上述实施例在结构(II)中的显示方式不同。]将2.0g的4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯置于8mL丙酮中,同时在室温下磁搅拌。在单独的小瓶中,将505mg 1,2-乙二磺酸水合物溶于6mL丙酮。将酸溶液加入游离碱溶液中,在RT混合。搅拌样品,使其充分混合,必要时添加额外的溶剂以稀释浆状物。将该混悬液在50℃搅拌过夜。搅拌过夜后,将剩余的白色固体稠浆冷却至20℃。通过在滤纸上进行真空过滤来分离固体,将置于滤纸上的所得的白色固体饼状物干燥(2.1g,88%收率)。
在配备有CuKa源和Vantec检测器的在35kV和50mA下操作的Bruker D4 Endeavor X-射线粉末衍射仪上得到晶体固体的XRD图案。在2θ中以4-40°的范围、在2θ中以0.008°的步长和0.5秒/步的扫描速率扫描样品,其中使用0.6mm的散度,5.28固定的防散射和9.5mm的检测器狭缝。将干粉填充在石英样品品架上,并使用载玻片得到光滑的表面。在室温和相对湿度下采集晶体形式的衍射图。在晶体学领域中众所周知,对于任何给定的晶体形式,由于例如晶体形态和习性这样的因素所导致的优选取向,衍射峰的相对强度可能会变化。在存在优选取向的影响的情况下,峰强度会改变,但多晶型物的特征峰位置不会改变。参见,例如,1995年美国药典(United States Pharmacopeia)#23,国家处方集(National Formulary)#18,第1843-1844页。此外,在晶体学领域还众所周知,对于任何给定的晶体形式,角峰位可能会略有变化。例如,由于分析样品的温度或湿度、样品位移或内标的存在或不存在,峰位可能会发生移动。在当前情况下,在2θ中±0.2的峰位变异性会考虑这些可能的变化,而不会妨碍对所指示晶体形式的明确鉴定。可以基于区别峰(以°2θ为单位)的任何独特组合(典型地为更突出的峰)来证实晶型。基于在8.853和26.774度2-θ处的NIST 675标准峰,调整在室温和相对湿度下采集的晶体形式的衍射图。
制备的晶体半乙二磺酸盐水合物的样品的特征在于,使用CuKa射线的XRD图案。其具有如下表所述的衍射峰(2-θ值),特别是在18.5°具有的峰与一个或多个选自21.5°、16.7°和15.2°的峰;其中衍射角公差为0.2度。
晶体半乙二磺酸盐水合物的X-射线粉末衍射峰
实施例5
晶体4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯苯磺酸盐的合成
[*注意,如本文实施例5所示,手性中心改变了取向,并且S对映异构体的形式与上述实施例在结构(II)中的显示方式不同。]将1998mg的4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯放入15mL丙酮,同时在RT下以1000rpm搅拌。加入650mg苯磺酸(溶于5mL丙酮)。将样品在RT以1000rpm搅拌1小时,并且在一段时间后溶液浑浊,且形成白色固体稠浆。通过在滤纸上真空过滤分离出白色固体。将样品在真空烘箱中于70℃干燥1小时(2.23g,85%收率)。
晶体4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯苯磺酸盐的合成
在15-30℃将4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯(440g,1.1mol)溶于EtOAc(1.4L)和丙酮(357mL)。加热至50-55℃。将苯磺酸一水合物(156g,0.89eq.)溶于EtOAc(709mL)和丙酮(166mL),在50-55℃以5-10mL/分钟加入到反应混合物中。搅拌1小时。冷却至15-30℃,搅拌12小时。过滤,在氮气气氛中干燥湿饼状物,得到标题化合物(525g 72.9%收率)。1H NMR(500MHz,CD3OD)δ7.89(s,1H),7.85-7.79(m,2H),7.43-7.39(m,3H),6.82-6.66(m,2H),6.15(s,1H),5.27(d,J=21.5Hz,1H),4.11(d,J=32.9Hz,2H),3.94-3.79(m,4H),3.33-3.18(m,2H),3.10-2.97(m,2H),2.84(s,6H),2.49(s,3H),2.25-1.94(m,5H),1.68-1.51(m,2H),1.31(d,J=6.8Hz,6H)。
基本上如实施例4中所述得到晶体固体的XRD图案。所制备的晶体苯磺酸盐样品的特征在于使用CuKa射线的XRD图案,其具有如下表中所述的衍射峰(2-θ值),且特别是在21.5°处具有峰与一个或多个峰选自12.4°、17.3°和15.8°的峰;其中衍射角公差为0.2度。
晶体苯磺酸盐的X-射线粉末衍射峰
实施例6
晶体4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯盐酸盐的合成
[*注意,如本文实施例6所示,手性中心改变了取向,并且S对映异构体的形式与上述实施例在结构(II)中的显示方式不同。]将557mg的4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯放入4mL丙酮,同时在RT下以1000rpm搅拌。加入1200μL HCl(1M乙酸乙酯溶液,1.07eq.)。将样品以1000rpm搅拌过夜,得到白色固体稠浆。通过在滤纸上真空过滤分离出白色固体。在空气气氛中将所得白色固体饼状物在滤器上干燥10分钟(385mg,64%收率)。
基本上如实施例4中所述得到晶体固体的XRD图案。所制备的晶体盐酸盐水合物样品的特征在于使用CuKa射线的X射线衍射图,其具有如下表中所述的衍射峰(2-θ值),且特别是具有在18.9°处的峰与一个或多个选自5.5°、15.5°和9.7°的峰;其中衍射角公差为0.2度。
晶体盐酸盐的X-射线粉末衍射峰
生物学测定
下列测定法证明本发明的化合物为CDK7活性的抑制剂。测定结果还表明,本发明的化合物抑制癌细胞中的CDK7信号传导。另外,本发明的化合物抑制癌的异种移植肿瘤模型中癌细胞系的增殖和肿瘤的生长。
“IC50”是指针对该活性剂可能产生的最大抑制反应的50%的活性剂浓度,或者是指产生与受体特异性结合的配体50%置换的活性剂浓度;通过计算相对于板载(on-plate)“MIN”和“MAX”控件的抑制百分比且然后使用十点剂量响应数据拟合四参数逻辑方程,使用荧光单位确定相对IC50值。
CDK7和CDK9激酶活性测定
本测定的目的在于测量本发明化合物抑制CDK7/细胞周期蛋白H/Mat1复合物激酶活性的能力。为了证明本发明中包括的化合物是否对CDK7、CDK7和CDK9表现出任何亲和力,在不将酶与化合物预温育或预温育3小时的情况下进行生化测定。功能测定提供了关于本发明化合物是否表现出抑制CDK7和CDK9激酶活性的能力的支持。在以下测定中使用的所有配体、溶剂和试剂可容易地从商业来源获得或可由本领域技术人员便利地合成。如下确定对CDK7和CDK9的IC50测定。
用于抑制CDK7/细胞周期蛋白H/MAT1的生物化学测定
在ATP//[33P]ATP和肽底物存在下,使用纯化的人重组酶,使用放射性标记滤器结合(FB)测定法测定抑制剂的IC50活性。选择的ATP浓度等于或接近ATP的酶Km。
反应在96孔聚苯乙烯板上以每孔25μL的最终体积进行。将在20%DMSO中的5μL测试化合物、10μL底物溶液(ATP/33PATP和CDK7/9肽)和10μL酶溶液混合。制备底物溶液,得到终浓度为100μMATP/[33P]ATP(NEN 10μCi/μL,3000Ci/mmol)和250μM CDK7/9肽((YSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSKKKK)(SEQ ID NO:1)),其用4mM MgCl2、0.01%TRITONTM X-100、2mM DTT和20mM HEPES的激酶缓冲液稀释。制备该酶溶液,使其在激酶缓冲液中稀释的终浓度为1nM CDK7/细胞周期蛋白H/Mat1酶Proqinase 0366-0360-4批号002)]。将测试化合物在20%DMSO中按1∶3顺序稀释,以20μM的起始浓度创建10点曲线。单独使用不含测试化合物的20%DMSO缓冲液作为高对照(在没有任何抑制剂存在下具有完全活性),在没有酶活性的情况下(低对照)使用500mM EDTA来测定背景水平。将5μL化合物与10μL酶溶液混合后,将板在22℃下温育0或180分钟。此后,通过添加底物溶液来引发反应,并在22℃下温育50分钟。通过加入80μL10%的冷正磷酸(orthophosphoric acid)溶液以终止反应。将滤板(不透明的,非无菌的滤板)用10μL10%的正磷酸溶液预洗涤至每个孔中。将100μL该混合物转移至磷酸纤维素滤膜,并在室温下温育45分钟。将滤板在滤板处理器上用200μL0.5%正磷酸洗涤3次。通过向每个孔中添加80μL MICROSCINTTM来确定33Pi的掺入(“cpm”计数)并在1小时后在计数器上读取。数据通过工具进行处理。使用4参数非线性逻辑方程(四参数逻辑浓度-响应曲线)分析数据:Y=bot+[(top-bot)/1+(x/IC50)斜率]其中Y=%抑制,X=得到y%抑制的浓度,下限=通过曲线获得的y最小值,上限=通过曲线获得的y最大值,斜率=曲线在IC50处的陡度。%Inh=[(中位数最大值-x/中位数最大值-中位数最小值)]·100
IC50:使给定反应(配体结合,酶反应)降低50%的化合物浓度。
实施例1和3中所述的化合物展示出在未进行预温育的情况下在CDK7中的IC50分别为0.0173μM和0.0487μM。在将CDK7酶与实施例1和3一起预温育3小时后,它们显示出IC50分别为0.00237μM和0.00506μM。这些数据表明实施例1和3均抑制CDK7。
用于抑制CDK9/细胞周期蛋白T1激酶活性的测定:
在ATP和肽底物存在下,使用纯化的人重组酶,应用放射性标记滤膜结合(FB)测定法测定抑制剂的IC50活性。选择的ATP浓度等于或接近ATP的酶Km。反应在96孔聚苯乙烯板上进行,最终体积为每孔25μL。将在20%DMSO中的5μL测试化合物、10μL底物溶液(ATP//[33P]ATP和CDK7/9肽)和10μL酶溶液混合。制备底物溶液以使其最终浓度为100μM ATP/[33P]ATP(NEN 10uCi/μL,3000Ci/mmol)和200μM CDK7/9肽((YSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSKKKK)(SEQ IDNO:1)),其用4mM MgCl2、0.0025%TRITONTM X-100、1.58mM DTT和15.80mM的激酶缓冲液稀释。制备该酶溶液,使其最终浓度为在激酶缓冲液中稀释的7.5nM CDK9/细胞周期蛋白T1酶[Proqinase 0371-0345-1(批号004)]。将测试化合物在20%DMSO中按1∶3顺序稀释,以20μM的起始浓度创建10点曲线。单独使用不含测试化合物的20%DMSO缓冲液作为高对照(在没有任何抑制剂存在下具有完全活性),在没有酶活性的情况下(低对照)使用500mM EDTA来测定背景水平。将5μL化合物与10μL酶溶液混合后,将板在22℃下温育0或180分钟。此后,通过添加10μL底物溶液来引发反应,并在22℃下温育60分钟。加入80μL10%的冷正磷酸溶液以终止反应。每孔用10μL10%的正磷酸溶液预洗涤滤板(不透明,非无菌滤板)。将100μL的混合物转移至磷酸纤维素滤膜,并在室温下温育45分钟。将滤板在滤板处理器上用200μL0.5%正磷酸洗涤3次。将80μL MICROSCINTTM添加到每个孔中,并在1小时后在闪烁计数器上读取。数据通过工具进行处理。使用4参数非线性逻辑方程(四参数逻辑浓度-响应曲线)分析数据:Y=bot+[(top-bot)/1+(x/IC50)斜率]其中Y=%抑制,X=得到y%抑制的浓度,下限=通过曲线获得的y最小值,上限=通过曲线获得的y最大值,斜率=曲线在IC50处的陡度。%Inh=[(中位数最大值-x/中位数最大值-中位数最小值)]·100IC50:使给定反应(配体结合,酶反应)降低50%的化合物浓度。相对IC50:得到化合物最大响应的一半的浓度。
实施例1和3中所述的化合物展示出对CDK9的IC50分别为5.93μM和2.45μM(3小时预温育)。这些数据表明实施例1和3均无法强效地抑制CDK9活性。
来自以上测定的数据一起表明实施例1和3的化合物相对于CDK9选择性地抑制CDK7。
CDK7和CDK9细胞机制测定
这些测定的目的在于测定化合物在体外抑制癌细胞中CDK7和CDK9信号转导的能力。
基于磷酸羧基末端结构域(Rbp2)(Ser2)p-CTD(S2)细胞的敏锐度测定
将HCT116细胞(ATCC CCL-247)在补充10%FBS、1%NaPyr和1%青霉素/链霉素的McCoy′s 5A培养基改进的培养基中培养,并在96-孔平底平板中以每孔5,000个细胞的密度在100μL体积中铺板(然后至70%汇合率)。然后将细胞在细胞温育箱(5%CO2,95%相对湿度(RH)和37℃)中温育过夜,并使其附着在板上。第二天早上,对细胞给予化合物。首先将化合物抑制剂以60μM溶于含有0.6%DMSO的培养基。随后在60μM-0.003μM的范围内制备化合物系列稀释液(1∶3)。通过向附着有100μL培养基的包含细胞的测定板上添加来自顺序稀释板的50μL给予细胞,产生最终DMSO浓度为0.2%与最终化合物浓度剂量范围为20μM-0.001μM。对于最大点,使用包含0.2%DMSO的培养基,对于最小点,使用包含0.2%DMSO的生长培养基中以终浓度0.83μM稀释的参比化合物。用化合物给药后,将细胞板在37℃和5%CO2下温育4小时。谨慎地除去生长培养基,并通过在RT下添加100μL 4%低聚甲醛来固定细胞30分钟。将细胞用PBS洗涤1次,并与100μL冷MeOH在RT下温育15分钟,以进行细胞渗透。再次用PBS(100μL/每个)将细胞洗涤2次,并在RT下用100μL/孔的1%BSA/PBS封闭30分钟。每孔加入1%BSA/PBS的50μL1∶1000一抗(抗-磷酸CTD Ser2 Abcam,目录号ab5095-100)稀释液,将板密封并在4℃温育过夜。
第二天,将细胞用PBS(100μL/孔)洗涤3次,并与50μL/孔的二抗(1∶2000稀释,山羊抗-家兔IgM ALEXA FLUORTM 488)在PBS中在RT下温育1小时。用PBS(100μL/孔)洗涤3X后,每孔加入在PBS中的100μL 50μg/mL RNAase和1∶1000碘化丙锭(Invitrogene)稀释液。将板密封并在RT下在工作台上温育1小时(避光保存)。将板在Acumen上使用FL2(平均强度)和FL3(总强度)进行分析。用ACUMEN EXPLORERTM[TTP LABTECH LTD制造的激光扫描荧光微量培养板细胞计数器]扫描荧光板,以测量丝氨酸2(pCTD)处的抗磷酸羧基末端结构域。图像分析基于用于识别阳性细胞的细胞荧光信号。通过在阈值以上500-530处的平均强度来鉴定pCTD(S2)阳性细胞。来自碘化丙锭/DNA的575-640处的总强度用于鉴定单个细胞。测定输出值为%pCTD阳性细胞。
使用GeneDATATM通过拟合至每个输出值的四参数的逻辑曲线来确定IC50。实施例1和3中所述的化合物对phosphoCTD(S2)的相对IC50分别>20μM和3.52μM。这些数据表明实施例1和3无法强效地抑制细胞中的CDK9。
基于磷酸羧基末端结构域(Rbp2)(Ser5)p-CTD(S5)细胞的敏锐度测定
将HCT116细胞(ATCC CCL-247)在补充10%FBS、1%NaPyr和1%青霉素/链霉素的McCoy′s 5A培养基改进的培养基中培养,并在96-孔平底平板中以每孔5,000个细胞的密度在100μL体积中铺板(然后至70%汇合率)。然后将细胞在细胞温育箱(5%CO2,95%相对湿度(RH)和37℃)中温育过夜,并使其附着在板上。第二天早上,对细胞给予化合物。将化合物抑制剂以60μM溶于含有0.6%DMSO的培养基。随后在60μM-0.003μM的范围内制备化合物系列稀释液(1∶3)。通过向附着有100μL培养基的包含细胞的测定板上添加来自顺序稀释板的50μL给予细胞,产生最终DMSO浓度为0.2%与最终化合物浓度剂量范围为20μM-0.001μM。对于最大点,使用包含0.2%DMSO的培养基,对于最小点,使用包含0.2%DMSO的生长培养基中以终浓度0.83μM稀释的参比化合物。用化合物给药后,将细胞板在37℃和5%CO2下温育4小时。谨慎地除去生长培养基,并通过在RT下添加100μL4%低聚甲醛来固定细胞30分钟。将细胞用PBS洗涤1次,并与100μL冷MeOH在RT下温育15分钟,以进行细胞渗透。再次用PBS(100μL/每个)将细胞洗涤2次,并在RT下用100μL/孔的1%BSA/PBS封闭30分钟。每孔加入1%BSA/PBS的50μL 1∶1000一抗(抗-磷酸CTD Ser5 Bethyl Laboratories目录号A300-655A)稀释液,将板密封并在4℃温育过夜。
第二天,将细胞用PBS(100μL/孔)洗涤3次,并与50μL/孔的二抗(1∶2000稀释,山羊抗-家兔IgM ALEXA FLUORTM 488)在PBS中在RT下温育1小时。用PBS(100μL/孔)洗涤3X后,每孔加入在PBS中的100μL 50μg/mL RNAase和1∶1000碘化丙锭(Invitrogene)稀释液。将板密封并在RT下在工作台上温育1小时(避光保存)。将板在Acumen上使用FL2(平均强度)和FL3(总强度)进行分析。用ACUMEN EXPLORERTM[TTP LABTECH LTD制造的激光扫描荧光微量培养板细胞计数器]扫描荧光板,以测量丝氨酸5(pCTD)处的抗磷酸羧基末端结构域。图像分析基于用于识别阳性细胞的细胞荧光信号。通过在阈值以上500-530处的平均强度来鉴定pCTD(S5)阳性细胞。来自碘化丙锭/DNA的575-640处的总强度用于鉴定单个细胞。测定输出值为%pCTD阳性细胞。使用Gene DATATM通过对每个输出值的四参数逻辑曲线拟合来确定IC50。
实施例1和3中所述的化合物展示出对pCTD Ser5的相对IC50分别为0.148μM和0.198μM。这些数据表明实施例1和3均抑制CDK7细胞活性。
基于cMyc细胞的敏锐度测定
将HCT116细胞(ATCC CCL-247)在补充10%FBS、1%NaPyr和1%青霉素/链霉素的McCoy′s 5A培养基改进的培养基中培养,并在96-孔平底平板中以每孔5,000个细胞的密度在100μL体积中铺板(然后至70%汇合率)。然后将细胞在细胞箱(5%CO2,95%相对湿度(RH)和37℃)中温育过夜,并使其附着在板上。第二天早上,对细胞给予化合物。将化合物抑制剂以60μM溶于含有0.6%DMSO的培养基。随后在60μM-0.003μM的范围内制备化合物系列稀释液(1∶3)。通过向附着有100μL培养基的包含细胞的测定板上添加来自顺序稀释板的50μL给予细胞,产生最终DMSO浓度为0.2%与最终化合物浓度剂量范围为20μM-0.001μM。对于最大点,使用包含0.2%DMSO的培养基,对于最小点,使用包含0.2%DMSO的生长培养基中以终浓度0.83μM稀释的参比化合物。用化合物给药后,将细胞板在37℃和5%CO2下温育4小时。谨慎地除去生长培养基,并通过在RT下添加100μL 4%低聚甲醛来固定细胞30分钟。将细胞用PBS洗涤1次,并与100μL冷MeOH在RT下温育15分钟,以进行细胞渗透。再次用PBS(100μL/每个)将细胞洗涤2次,并在RT下用100μL/孔的1%BSA/PBS封闭30分钟。每孔加入1%BSA/PBS的50μL 1∶1000一抗(抗c-Myc抗体[Y69]Abcam目录号ab32072)稀释液,将板密封并在4℃温育过夜。第二天,将细胞用PBS(100μL/孔)洗涤3次,并与50μL/孔的二抗(1∶2000稀释,山羊抗-家兔IgM ALEXA FLUORTM488)在PBS中在RT下温育1小时。用PBS(100μL/孔)洗涤3X后,每孔加入在PBS中的100μL 50μg/mL RNAase和1∶1000碘化丙锭(Invitrogene)稀释液。将板密封并在RT下在工作台上温育1小时(避光保存)。将板在Acumen上使用FL2(平均强度)和FL3(总强度)进行分析。用ACUMEN EXPLORERTM[TTP LABTECH LTD制造的激光扫描荧光微量培养板细胞计数器]扫描荧光板,以测量丝氨酸5(pCTD)处的抗磷酸羧基末端结构域。图像分析基于用于识别阳性细胞的细胞荧光信号。通过在阈值以上500-530处的平均强度来鉴定pCTD(S5)阳性细胞。来自碘化丙锭/DNA的575-640处的总强度用于鉴定单个细胞。测定输出值为%pCTD阳性细胞。使用GeneDATATM通过对每个输出值的四参数逻辑的曲线拟合来确定IC50。
实施例1和3中所述的化合物展示出对cMyc的相对IC50为0.0828μM和0.0573μM。这些数据表明实施例1和3均抑制HCT116细胞中cMyc的转录。
选择性剖析实验:Proqinase WT Profiler
通过在320种野生型蛋白激酶测定中以单份测量四个浓度下的残留活性值来确定化合物的激酶抑制特性。分别以20μM、2μM、0.2μM和0.02μM以单份对化合物进行测试。所有反应混合物(包括高和低对照)中的DMSO终浓度为1%。
蛋白激酶测定
放射性测量的蛋白激酶测定(Activity Assay,ProQinase)用于测定320种蛋白激酶的激酶活性。所有激酶测定均在96-孔FLASHPLATESTM中50μL反应体积中进行。按照以下顺序分四个步骤将反应混合物移液:
1.10μL非放射性ATP溶液(在H2O中)
2.25μL测定缓冲液/[γ-33P]-ATP混合物
3.5μL在10%DMSO中的测试样品
4.10μL酶/底物混合物
所有蛋白激酶的测定均包含70mM HEPES-NaOH pH 7.5、3mM MgCl2、3mM MnCl2、3μM原钒酸Na、1.2mM DTT、ATP(可变量,相当于相应激酶的表观ATP-Km,参见表1)、[γ-33P]-ATP(每孔约8x1005cpm)、蛋白激酶(可变量;参见表1)和底物(可变量;参见表1)。所有PKC测定(除外PKC-mu和PKC-nu测定)还包含1mM CaCl2、4mM EDTA、5μg/mL磷脂酰丝氨酸和1μg/mL1,2-二油基甘油。CAMK1D、CAMK2A、CAMK2B、CAMK2D、CAMK2G、CAMK4、CAMKK1、CAMKK2、DAPK2、EEF2K、MYLK、MYLK2和MYLK3测定还包含1μg/mL钙调蛋白和0.5mM CaCl2。PRKG1和PRKG2测定还包含1μM cGMP。DNA-PK测定还包含2.5μg/mL DNA。
将蛋白激酶反应混合物在30℃下温育60分钟。用50μL 2%(v/v)H3PO4终止反应,抽吸板并用200μL 0.9%(w/v)NaCl洗涤两次。用微孔板闪烁计数器测定33Pi的掺入(“cpm”的计数)。所有蛋白激酶测定均使用BeckmanCoulter2000/SL机器人系统进行。ProQinase提供的所有蛋白激酶在Sf9昆虫细胞或大肠杆菌(E.coli)中均作为重组GST融合蛋白或全长或酶促活性片段形式的His标记的蛋白表达。所有激酶均由人cDNA产生,并通过GSH亲和色谱或固定化金属纯化。在纯化过程中,从许多激酶中去除亲和标记。通过SDS-PAGE/考马斯染色检查蛋白激酶的纯度,通过质谱检查身份。根据供应商的说明对来自外部供应商(CAR=Carna Biosciences Inc.;INV=Life Technologies(InvitrogenCorporationTM);MIL=Merck-Millipore(Millipore CorporationTM),参见表1)的激酶进行表达、纯化和质量控制。用于测定的酶和底物的浓度如表1中所示。
原始数据评价
对于每种激酶,将三个孔的cpm中位值定义为“低对照”(n=3)。该值反映了不存在蛋白激酶但底物存在下放射性与板的非特异性结合。另外,对于每种激酶,将其他三个孔的cpm中位值作为“高对照”,即在任何抑制剂不存在下的全部活性(n=3)。将每种酶的高与低对照之差视为100%活性。作为数据评价的组成部分,从高对照值及其相应的“化合物值”中减去每种激酶的低对照值。每个化合物孔的残留活性(以%计)通过使用以下公式计算:Res.活性(%)=100X[(化合物的信号-低对照)/(高对照-低对照)]。非标准IC50使用结合XLFit加载项的定制excel电子表格进行计算。由于数据点数量少,(4)XL-Fit使用四参数方程式计算非标准IC50,其中三个参数被锁定为固定值。
方程为:
Y=B+((A-B))/〖1+(x/C)〗^D
A:最小活性值,也称作底部。固定为0
B:最大活性值,也称作顶部。固定为100
C:曲线的拐点
D:Hill斜率。固定为1
Y:因变量(即你所测量的信号)
X:自变量(即你所控制的变量,例如剂量、浓度等)
计算非标准IC50的方式为C参数分配随机值,并且反复重复。然后,该算法测量残差平方和的差,并将寻找残差变化会聚的依次连续迭代。一旦满足会聚极限(convergencelimit),则将解决方案视为最佳解决方案,且拟合过程结束。
基本按上述方法测试CDK12和CDK13(ProQinase),但分别使用半对数稀释液以10个浓度(2x105M-6x1010M)进行测试。对于10个点,使用WORKFLOWTM V3.1.1计算出每个浓度的残留活性和化合物IC50值。用于IC50测定的拟合模型为″S形响应(可变斜率)″,其中参数“顶部”固定为100%,“底部”固定为0%。使用的拟合方法是最小二乘拟合。
数据如下表1中所示。
表1
激酶 | 激酶 | 激酶浓度 | ATP浓度 | 底物 | 底物 | IC<sub>50</sub> |
名称 | 家族 | nM | μM | 名称 | μg/50μL | μM |
CDK7/CycH/MAT1 | CMGC | 3.3 | 3 | RBER-CHKtide | 2 | 0.0928 |
CDK9/CycT1 | CMGC | 2.2 | 1 | RBER-CHKtide | 2 | 6.32 |
CDK1/CycB1 | CMGC | 7 | 1 | RBER-CHKtide | 2 | 20.000 |
CDK2/CycE1 | CMGC | 1.5 | 1 | RBER-CHKtide | 1 | 20.000 |
CDK4/CycD1 | CMGC | 3.3 | 3 | RBER-CHKtide | 2 | 2.830 |
CDK6/CycD1 | CMGC | 3.2 | 3 | RBER-CHKtide | 2 | 8.079 |
CDK8/CycC | CMGC | 8.3 | 1 | RBER-IRStide | 1 | 10.922 |
CDK16/CycY | CMGC | 3.2 | 0.3 | GSK3(14-27) | 2 | 9.073 |
CDK19/CycC | CMGC | 30.9 | 3 | RBER-IRStide | 2 | 7.414 |
CDK12/CycK | CMGC | 14.7 | 0.3 | RBER-IRStide | 2 | 14.780 |
CDK13/CycK | CMGC | 29.2 | 0.3 | RBER-CDC25tide | 1 | 20.000 |
这些数据表明,实施例1的化合物对来自有代表性的激酶组的CDK7具有很高的选择性。
细胞增殖试验
表2中的数据显示,实施例1的化合物抑制特定肿瘤细胞系的增殖和活力。将细胞系以每孔5000个细胞的密度在100μL/孔的生长培养基中铺板到白色96-孔细胞培养板中。有关细胞系和培养基的信息参见表2。将板在37℃和5%CO2下温育。第二天,通过在DMSO中将化合物1∶3稀释10点来制备测试化合物的系列稀释液。DMSO板为1000X终浓度。除CDK7抑制剂外,还包括单独的DMSO栏作为最大的生长对照,且还包括10μM星状孢子素最终栏作为最大的生长抑制对照。然后通过将来自1000X DMSO板中的每孔2μL加到OMEM(LifeTechnologies,Carlsbad,CA,目录号31985-070)中的每孔198μL中来制备10X稀释板。通过从10X OMEM板向包含100μL/孔1X终浓度生长培养基的细胞板中添加11μL/孔,用指示的化合物处理细胞。将板在37℃和5%CO2下放回温育箱中。加入化合物后7天,将板从温育箱中取出并使其平衡至RT。在室温下将CELL TITER试剂解冻,然后将一小瓶测定缓冲液与一小瓶底物混合并轻轻涡旋混合来制备。然后将CELL TITER试剂以每孔100μL的量添加到细胞板上,并在室温下以2的速度设置放在Titer Plate Shaker上15分钟。在振荡器上温育15分钟后,使用Wallac VICTOR2TM读取发光,每孔1秒。使用Graphpad Prism 6软件,应用非线性回归和S形剂量响应曲线来计算半数最大抑制浓度(IC50)。
表2
这些数据表明,实施例I的化合物以剂量依赖的方式抑制来自多种组织包括结肠、乳腺、肺、卵巢和胃的癌细胞系的体外生长。
异种移植肿瘤模型
本测定的目的在于测定响应于实施例1的化合物的肿瘤体积的减少。为了评价测试化合物的体内功效,使用了多种异种移植肿瘤模型。简言之,将1∶1混合物(总体积为0.2mL)中的5-10×106个肿瘤细胞皮下注射到大多数异种移植肿瘤模型的雌性无胸腺裸鼠(Envigo,Harlan实验室)中。替代小鼠品系用于建立MDAMB468(NOD SCIDGamma,Jackson实验室)、CT26和EMT6(BALB/c,Envigo,Harlan Laboratories)异种移植物。在使肿瘤达到期望的~300-500mm3大小后,将动物随机分为6-8组进行功效研究。通过口服管饲法(PO)以指定的剂量和方案施用测试化合物。随着时间的推移监测肿瘤的生长和体重,以评价功效和毒性迹象。
将测试化合物配制成在1%的羟乙基纤维素、0.25%的聚山梨酯80、0.05%的消泡剂(在纯净水(HEC)中)中的5%N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中,并且以表4中所示的剂量通过口服管饲法(最终体积0.2mL)施用。每周配制一次测试化合物,并保存在4℃下。根据上述使用的方案,将媒介物以0.2mL/剂量的体积施用于对照组。通过口服管饲法对小鼠给药,并在终止时采集肿瘤样品并储存在-80℃。
每两周记录并分析一次肿瘤大小和体重。给药后2小时和终止时使用DBS(干血斑)卡采集血液。在研究结束时采集肿瘤,将其切成3个部分,然后速冻以进行暴露和蛋白质分析,或放入中进行RNA分析。将组织样品冷冻并保存在-80℃。
实施例1的化合物在人癌异种移植模型中显示出显著的抗肿瘤活性(表3)。
表3:如所示,在不同剂量水平下测试的横跨各种异种移植瘤模型的实施例1体内单一活性剂功效(ΔT/C)概述。
模型 | 组织学 | 突变 | 实施例1剂量(mg/kg) | 方案 | Avg.ΔT/C |
A2780 | 卵巢 | ARID1A | 20 | QDx35 | -41 |
COLO205 | 卵巢 | 20 | QDx28 | -4 | |
CT26 | 结直肠 | 20 | QDx24 | 52 | |
EMT6 | 乳腺 | 20 | QDx28 | 17 | |
H441 | 肺 | 20 | QDx35 | 0 | |
H460 | 肺 | ARID1A | 20 | QDx35 | 16 |
HCC1806 | 乳腺 | KMT2C | 20 | QDx28 | -87 |
HCT116 | 结直肠 | KMT2C | 25 | QDx21 | -17 |
MDAMB468 | 乳腺 | ARID1A,RB1 | 20 | QDx28 | -91 |
MIAPACA2 | 胰腺 | ARID1A | 20 | QDx35 | 10 |
MKN45 | 胃 | KMT2C | 20 | QDx35 | 57 |
MDAMB231 | 乳腺 | 20 | QDx35 | -25 |
当治疗组中的终点肿瘤体积等于或大于基线肿瘤体积时,计算ΔT/C%。公式为100*(T-T0)/(C-C0)。在此,T和C分别是治疗组或对照组中的平均终点肿瘤体积。T0和C0是这些组中的平均基线肿瘤体积。*:显著性(p<0.05)。
生物标志物研究
本研究的目的在于评价本发明化合物的潜在预测性生物标志物。
剖析癌症细胞系,以评价测试化合物的体外抗增殖活性。可从COSMIC数据库(cancer.sanger.ac.uk)和cBioportal(http://www.cbioportal.org/)获得跨癌细胞系的ARID1A、KMT2C、KMT2D和/或RB1基因的突变、拷贝数和基因表达信息。将细胞在生长培养基中培养,并且以5000个细胞/孔接种到96-孔板中的100μL/孔生长培养基中,然后在37℃、5%CO2下温育过夜。使用供应商推荐的培养基和本领域众所周知的条件培养细胞,例如使用在有或没有HEPES和L-谷氨酰胺(Thermo SH30255.01)和1mM丙酮酸钠和10%FBS(Gibco目录号10082)的RPMI 1640。通过在DMSO中制备10mM的测试样品工作溶液并在DMSO中进行1∶3稀释10个点来制备1000X中间稀释板。通过将来自1000X中间稀释板的2μL加入198μL+10%FBS中并充分混合来制备10X定量板。然后通过将来自10X定量板的11μL加入100μL/孔的细胞板中以达到1X的终浓度来处理细胞板。星状孢子素在最终浓度为5μM时用作最大的生长抑制对照。将细胞板在37℃、5%CO2下温育7天。处理后7天,从-20℃取出Cell (Promega目录号G7571)测定缓冲液和底物,并使其平衡至室温。将测定缓冲液添加到底物中,轻轻旋转以混合。将CELL试剂(100μL/孔)添加到细胞板中,并在RT下温育15分钟。15分钟后,使用读板仪读取发光。用Excel分析数据,并在GraphPad Prism中绘图。使用GraphPad Prism,应用Mann-Whitney非参数t检验计算统计分析和p值。
表4中显示了增殖数据的概述。将测试化合物的抗增殖作用分类为不敏感(IC50≥1μM)、细胞生长抑制(IC50<1μM和抑制百分比<70%)或细胞毒性(IC50<1μM和抑制百分比≥70%)。与小组中的其余细胞系相比,在ARID1A、KMT2C、KMT2D或RB1基因中携带失活或功能丧失(LOF)突变的细胞系表现出对实施例1显著更高的细胞毒性反应(表5)。相反,非LOF细胞系表现出对实施例1的更高的(%)细胞生长抑制反应。
此外,许多携带这些突变的异种移植肿瘤模型用于评价实施例1作为单一疗法的功效(表3)。
表3中显示了功效研究和抗肿瘤活性(ΔT/C)的概述。实施例1在多种肿瘤模型中显示出强大的功效,其中在包含ARID1A、KMT2C或RB1基因中的突变的肿瘤模型中注意到显著消退。综上所述,这些发现表明,ARID1A、KMT2C、KMT2D或RB1基因中的失活突变为使用实施例1横跨多种癌症类型治疗提供了潜在的患者选择策略。
培养基信息:
A.RPMI 1640(Gibco 11835,Gibco 22400-089或Hyclone目录号SH30027)+10%FBS(Gibco目录号10082)
B.具有L-谷氨酰胺(Thermo目录号SH30022)+NaPyr+NEAA+HEPES+10%FBS(Gibco目录号10082)的DMEM
C.具有HEPES&L-谷氨酰胺(Gibco 22400)+1mM丙酮酸钠+10%FBS(Gibco目录号10082)的RPMI 1640
D.F-12K培养基(目录号30-2004)+10%FBS(Gibco目录号10082)
E.EMEM(CellGro目录号17-305-CV)+L-谷氨酰胺+丙酮酸钠+碳酸氢钠+10%FBS(Gibco目录号10082)
F.EMEM(CellGro目录号17-305-CV)+L-谷氨酰胺+丙酮酸钠+碳酸氢钠+NEAA+10%FBS(Gibco目录号10082)
G.DMEM(Gibco 11995)+1mM丙酮酸钠+10%FBS(Gibco目录号10082)
H.DMEM高糖(Hyclone目录号SH30022)+10%HI FBS(Gibco目录号10082)+1X NEAA(Hyclone SH30328)
I.ATCC改进的RPMI 1640(Gibco A1049101)+1mM丙酮酸钠+10%FBS(Gibco目录号10082)
J.McCoy′s 5A+10%FBS(Gibco目录号10082)
K.DMEM(Gibco11965)+10%FBS
L.具有Earle盐(Gibco 11095-080)+1%NEAA+1%NaPyr+10%FBS(Gibco目录号10082)的MEM Eagle
M.具有L-谷氨酰胺和HEPES+10%热灭活的FBS的RPMI-1640
N.具有L-谷氨酰胺(Thermo目录号SH30022)+丙酮酸钠+10%FBS(Gibco目录号10082)的DMEM
O.MEM(Gibco11095)+丙酮酸钠+NEAA+10%FBS(Gibco目录号10082)
P.具有HEPES&L-谷氨酰胺(Thermo SH30255.01或Gibco11835)+1mM丙酮酸钠+10%FBS(Gibco目录号10082)的RPMI 1640
Q.DMEM:F12w/2.5mM L-谷氨酰胺,15mM HEPES+0.5mM丙酮酸钠+10%FBS
R.49%RPMI 1640+49%Ham′s F12+2%h.i.FBS
S.45%RPMI 1640+45%Ham′s F12+10%h.i.FBS
T.DMEM(Gibco 11965)+1mM丙酮酸钠+5%FBS(Gibco目录号10082)
U.Leibovitz's L15(Gibco目录号11415-064)+10%FBS(Gibco目录号10082),NoCO2
V.具有高Glu&L-gln+10%热灭活的FBS+NaPyr+NEAA+HEPES的DMEM
W.DMEM:F12(1∶1)+ITS+10nM氢化可的松+10nM β-雌二醇+4.5mM L-谷氨酰胺+5%FBS(Gibco目录号10082)
X.具有L-谷氨酰胺和HEPES+10%FBS的RPMI-1640
Y.具有HEPES&L-谷氨酰胺(Gibco 22400)+1mM丙酮酸钠+NEAA+20%FBS(Gibco目录号10082)的RPMI 1640
Z.DMEM+2mM谷氨酰胺+1mM丙酮酸钠(NaP)+20IU/l牛胰岛素+10%FBS(Gibco目录号10082)
AA.Williams′ E培养基(Gibco目录号12551)+10%FBS
BB.MEM+10%FBS+NaPyr+NEAA+HEPES+1.5g/L NaHCO3
CC.McCoy′s 5A(Gibco 16600)+15%FBS(Gibco目录号10082)
DD.1∶1MEM(11095):F12(CellGro 10-080-CV)+10%FBS(Gibco目录号10082)
EE.具有谷氨酰胺和HEPES(Hyclone目录号SH30255)+10%FBS(Gibco目录号16000)+1X NaPyr的RPMI-1640
FF.Iscove改进Dulbecco′培养基w/L-谷氨酰胺、25mMHEPES[GIBCO12440-053]+20%FBS
GG.具有HEPES&L-谷氨酰胺(无酚红+1mM丙酮酸钠+10%
FBS(Gibco目录号10082)的RPMI 1640
HH.1∶1Hams F12:DMEM+L-谷氨酰胺+5%FBS(Gibco目录号10082)
II.RPMI-1640(Hyclone目录号SH30027)+10%热灭活的FBS(Gibco目录号10082)
JJ.包含终浓度为1.5g/L的碳酸氢钠的MCDB 105培养基和包含终浓度为2.2g/L的碳酸氢钠+15%FBS的培养基199的1∶1混合物
表5:实施例1通过携带LOF突变的癌细胞系的抗增殖作用的分布(%)。
Claims (55)
6.根据权利要求2的化合物或盐,其为4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯苯磺酸盐。
7.根据权利要求2的化合物或盐,其为4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯半乙二磺酸盐水合物。
8.根据权利要求4的化合物或盐,其为4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3R)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯苯磺酸盐。
9.根据权利要求4的化合物或盐,其为4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3R)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯半乙二磺酸盐水合物。
10.根据权利要求2或权利要求6的化合物或盐,其为晶体4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯苯磺酸盐。
11.根据权利要求10的化合物或盐,其为晶体4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯苯磺酸盐,其特征在于使用CuKa射线的具有在2θ±0.2°中出现在21.5°的特征峰与一个或多个选自12.4°、17.3°和15.8°的峰的X-射线粉末衍射图。
12.根据权利要求2或权利要求7的化合物或盐,其为晶体4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯半乙二磺酸盐水合物。
13.根据权利要求12的化合物或盐,其为4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯半乙二磺酸盐水合物,其特征在于使用CuKa射线的具有在2θ±0.2°中出现在18.5°的特征峰与一个或多个选自21.5°、16.7°和15.2°的峰的X-射线粉末衍射图。
14.根据权利要求4或权利要求8的化合物或盐,其为晶体4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3R)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯苯磺酸盐。
15.根据权利要求4或权利要求9的化合物或盐,其为晶体4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3R)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯半乙二磺酸盐水合物。
16.药物组合物,其包含权利要求1-15任一项的化合物或其药学上可接受的盐与一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
17.根据权利要求16的药物组合物,其包含一种或多种另外的治疗剂。
18.治疗尿路上皮癌、子宫癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝胆管癌或神经胶质瘤的方法,包括对有此需要的患者施用治疗有效量的权利要求1-15任一项的化合物或其药学上可接受的盐。
19.根据权利要求18的方法,其中所述癌为结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌或胃癌。
20.根据权利要求18或权利要求19的方法,其中所述癌为乳腺癌。
21.治疗患者的尿路上皮癌、子宫癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝胆管癌、尿路上皮癌、子宫癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝胆管癌、胰腺癌、宫颈癌、前列腺癌、血癌、肉瘤、皮肤癌或神经胶质瘤的方法,包含测试来自所述患者的生物样品中ARID1A,KMT2C、KMT2D或RB1基因中的至少一种功能缺失突变存在,并且如果样品测试所述功能缺失突变为阳性,则对该患者施用治疗有效量的权利要求1-15任一项的化合物或其药学上可接受的盐。
22.治疗患者的尿路上皮癌、子宫癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝胆管癌、尿路上皮癌、子宫癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝胆管癌、胰腺癌、宫颈癌、前列腺癌、血癌、肉瘤、皮肤癌或神经胶质瘤的方法,包括对该患者施用治疗有效量的权利要求1-15任一项的化合物或其药学上可接受的盐,条件是来自该患者的生物样品包含ARID1A、KMT2C、KMT2D或RB1基因中的功能突变的至少一种。
23.治疗患者的尿路上皮癌、子宫癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝胆管癌、胰腺癌、宫颈癌、前列腺癌、血癌、肉瘤、皮肤癌或神经胶质瘤的方法,包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求1-15任一项的化合物或其药学上可接受的盐,条件是如果来自患者的生物样品测试ARID1A、KMT2C、KMT2D或RB1基因中至少一种功能缺失突变为阳性,则选择该患者进行治疗。
24.根据权利要求18-23任一项的方法,其中所述化合物或盐为4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3S)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯或其药学上可接受的盐。
25.根据权利要求18-23任一项的方法,其中所述化合物或盐为4-[(3-异丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基]哌啶-1-甲酸[(3R)-1-[(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰基]吡咯烷-3-基]酯或其药学上可接受的盐。
26.根据权利要求18-25任一项的方法,其中所述盐为苯磺酸盐。
27.根据权利要求18-25任一项的方法,其中所述盐为半乙二磺酸盐水合物盐。
28.根据权利要求21-27任一项的方法,其中所述生物样品为肿瘤样品,且通过基因组/DNA测序来测定该样品。
29.根据权利要求21-28任一项的方法,其中所述样品得自将所述化合物或盐首次施用于患者之前的患者。
30.根据权利要求21-29任一项的方法,其中所述基因为ARID1A基因。
31.根据权利要求21-29任一项的方法,其中所述基因为KMT2C基因。
32.根据权利要求21-29任一项的方法,其中所述基因为KMT2D基因。
33.根据权利要求21-29任一项的方法,其中所述基因为RB1基因。
34.根据权利要求1-15任一项的化合物或其盐,其用于疗法。
35.根据权利要求1-15任一项的化合物或其盐,用于治疗尿路上皮癌、子宫癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝胆管癌、胰腺癌、宫颈癌、前列腺癌、血癌、肉瘤、皮肤癌或神经胶质瘤。
36.用于根据权利要求35的化合物或盐,其中所述癌为结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌或胃癌。
37.用于根据权利要求35或36的化合物或盐,其中所述癌为乳腺癌。
38.用于根据权利要求34-37任一项的化合物或其盐,还包含使用来自患者的生物样品进行体外测定,确定ARID1A、KMT2C、KMT2D和RB1基因中至少一种失活突变的存在,并且如果基因的任一种中存在至少一种失活突变,则向该患者施用治疗有效量的所述化合物或其盐。
39.用于根据权利要求38的化合物或其盐,其中所述生物样品为肿瘤样品,且通过基因组/DNA测序来测定该样品。
40.用于根据权利要求38或39的化合物或其盐,其中所述样品得自对患者首次施用所述化合物或其盐之前的患者。
41.用于根据权利要求34-40任一项的化合物或其盐,其中根据ARID1A基因中具有至少一种失活突变来选择要治疗的患者。
42.用于根据权利要求34-40任一项的化合物或其盐,其中根据KMT2C基因中具有至少一种失活突变来选择要治疗的患者。
43.用于根据权利要求34-40任一项的化合物或其盐,其中根据KMT2D基因中具有至少一种失活突变来选择要治疗的患者。
44.用于根据权利要求34-40任一项的化合物或其盐,其中根据RB1基因中具有至少一种失活突变来选择要治疗的患者。
45.用于根据权利要求34-44任一项的化合物或其盐,其中以约1mg-2g的剂量将所述化合物或其盐施用于所述患者。
46.根据权利要求1-15任一项的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗尿路上皮癌、子宫癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝胆管癌、胰腺癌、宫颈癌、前列腺癌、血癌、肉瘤、皮肤癌或神经胶质瘤的药物中的用途。
47.根据权利要求46的用途,其中所述癌选自结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌或胃癌。
48.根据权利要求46和47任一项的用途,还包含使用来自患者的生物样品进行体外测定,确定ARID1A、KMT2C、KMT2D和RB1基因中至少一种失活突变的存在,并且如果基因的任一种中存在至少一种失活突变,则向该患者施用治疗有效量的所述化合物或其盐。
49.根据权利要求48的用途,其中所述生物样品为肿瘤样品,且所述样品通过基因组/DNA测序测定。
50.根据权利要求46-49任一项的用途,其中所述样品得自将所述化合物或其盐首次施用于患者之前的患者。
51.根据权利要求46-50任一项的用途,其中选择具有ARID1A基因中的至少一种失活突变的患者。
52.根据权利要求46-50任一项的用途,其中选择具有KMT2C基因中的至少一种失活突变的患者。
53.根据权利要求46-50任一项的用途,其中选择具有KMT2D基因中的至少一种失活突变的患者。
54.根据权利要求46-50任一项的用途,其中选择具有RB1基因中的至少一种失活突变的患者。
55.根据权利要求46-50任一项的用途,其中将所述化合物或其盐以约1mg-2g的剂量施用于患者。
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP17382778 | 2017-11-16 | ||
EP17382778.3 | 2017-11-16 | ||
EP18382034.9 | 2018-01-23 | ||
EP18382034 | 2018-01-23 | ||
EP18382546 | 2018-07-20 | ||
EP18382546.2 | 2018-07-20 | ||
PCT/US2018/060025 WO2019099298A1 (en) | 2017-11-16 | 2018-11-09 | Compounds useful for inhibiting cdk7 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111344292A true CN111344292A (zh) | 2020-06-26 |
CN111344292B CN111344292B (zh) | 2022-06-03 |
Family
ID=64477309
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201880071902.0A Active CN111344292B (zh) | 2017-11-16 | 2018-11-09 | 用于抑制cdk7的化合物 |
Country Status (31)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US10472370B2 (zh) |
EP (1) | EP3710446B1 (zh) |
JP (1) | JP6633254B2 (zh) |
KR (1) | KR102450727B1 (zh) |
CN (1) | CN111344292B (zh) |
AU (1) | AU2018369508B2 (zh) |
BR (1) | BR112020008253A2 (zh) |
CA (1) | CA3080910C (zh) |
CL (1) | CL2020001218A1 (zh) |
CR (1) | CR20200184A (zh) |
DK (1) | DK3710446T3 (zh) |
DO (1) | DOP2020000102A (zh) |
EC (1) | ECSP20025899A (zh) |
ES (1) | ES2925219T3 (zh) |
HR (1) | HRP20221152T1 (zh) |
HU (1) | HUE060078T2 (zh) |
IL (1) | IL274540B (zh) |
JO (1) | JOP20200122B1 (zh) |
LT (1) | LT3710446T (zh) |
MD (1) | MD3710446T2 (zh) |
MX (1) | MX2020004932A (zh) |
MY (1) | MY197700A (zh) |
NZ (1) | NZ763551A (zh) |
PE (1) | PE20210392A1 (zh) |
PL (1) | PL3710446T3 (zh) |
RS (1) | RS63530B1 (zh) |
SA (1) | SA520411990B1 (zh) |
SG (1) | SG11202003677UA (zh) |
SI (1) | SI3710446T1 (zh) |
TW (1) | TWI703149B (zh) |
WO (1) | WO2019099298A1 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022033552A1 (zh) * | 2020-08-12 | 2022-02-17 | 隆泰申医药科技(南京) 有限公司 | Cdk激酶抑制剂、其制备方法、药物组合物和应用 |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3129371B1 (en) * | 2014-04-05 | 2020-07-29 | Syros Pharmaceuticals, Inc. | Inhibitors of cyclin-dependent kinase 7 (cdk7) |
TWI703149B (zh) * | 2017-11-16 | 2020-09-01 | 美商美國禮來大藥廠 | 用於抑制cdk7之化合物 |
CN114901284A (zh) * | 2019-10-29 | 2022-08-12 | 希洛斯医药品股份有限公司 | 用细胞周期蛋白依赖性激酶7(cdk7)抑制剂治疗生物标志物鉴定的患者的癌症的方法 |
AU2020404326A1 (en) | 2019-12-20 | 2022-08-11 | Evopoint Biosciences Co., Ltd. | Heterocyclic compound, and pharmaceutical composition thereof, preparation method therefor, intermediate thereof and application thereof |
USD1004119S1 (en) | 2021-08-31 | 2023-11-07 | MerchSource, LLC | Percussion massager |
USD1004118S1 (en) | 2021-08-31 | 2023-11-07 | MerchSource, LLC | Percussion massager |
USD987844S1 (en) | 2021-08-31 | 2023-05-30 | MerchSource, LLC | Percussion massager |
USD1004117S1 (en) | 2021-08-31 | 2023-11-07 | MerchSource, LLC | Percussion massager |
USD994898S1 (en) | 2021-11-17 | 2023-08-08 | MerchSource, LLC | Percussion massager |
USD995812S1 (en) | 2021-11-22 | 2023-08-15 | MerchSource, LLC | Percussion massager |
USD1009292S1 (en) | 2021-12-22 | 2023-12-26 | MerchSource, LLC | Percussion massager |
USD1018881S1 (en) | 2021-12-22 | 2024-03-19 | MerchSource, LLC | Percussion massager |
USD1004122S1 (en) | 2021-12-31 | 2023-11-07 | MerchSource, LLC | Pivoting percussion massager |
USD1004121S1 (en) | 2021-12-31 | 2023-11-07 | MerchSource, LLC | Pivoting percussion massager |
CN114452391B (zh) * | 2022-01-28 | 2023-08-25 | 深圳市泰尔康生物医药科技有限公司 | Cdk16作为靶标在制备用于治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用 |
WO2024125532A1 (zh) * | 2022-12-12 | 2024-06-20 | 杭州德睿智药科技有限公司 | 作为CDKs抑制剂的新型并杂环类新化合物及其应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1701073A (zh) * | 2002-09-04 | 2005-11-23 | 先灵公司 | 作为细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂的吡唑并[1,5-a]嘧啶 |
WO2015154022A1 (en) * | 2014-04-05 | 2015-10-08 | Syros Pharmaceuticals, Inc. | Inhibitors of cyclin-dependent kinase 7 (cdk7) |
WO2016142855A2 (en) * | 2015-03-09 | 2016-09-15 | Aurigene Discovery Technologies Limited | Pyrazolo[1,5-a][1,3,5]triazine and pyrazolo[1,5-a]pyrimidine derivatives as cdk inhibitors |
WO2016160617A2 (en) * | 2015-03-27 | 2016-10-06 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Inhibitors of cyclin-dependent kinases |
CN106103445A (zh) * | 2014-02-21 | 2016-11-09 | 癌症研究技术有限公司 | 作为cdk抑制剂的吡唑并[1,5‑a]嘧啶‑5,7‑二胺化合物和它们的治疗用途 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
LT3302448T (lt) | 2015-06-04 | 2024-02-12 | Aurigene Oncology Limited | Pakeisti heterociklilo dariniai kaip cdk inhibitoriai |
CA2996978A1 (en) | 2015-09-09 | 2017-03-16 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Inhibitors of cyclin-dependent kinases |
TWI703149B (zh) * | 2017-11-16 | 2020-09-01 | 美商美國禮來大藥廠 | 用於抑制cdk7之化合物 |
-
2018
- 2018-10-31 TW TW107138486A patent/TWI703149B/zh not_active IP Right Cessation
- 2018-11-09 LT LTEPPCT/US2018/060025T patent/LT3710446T/lt unknown
- 2018-11-09 US US16/185,801 patent/US10472370B2/en active Active
- 2018-11-09 SI SI201830727T patent/SI3710446T1/sl unknown
- 2018-11-09 MX MX2020004932A patent/MX2020004932A/es unknown
- 2018-11-09 ES ES18808599T patent/ES2925219T3/es active Active
- 2018-11-09 CN CN201880071902.0A patent/CN111344292B/zh active Active
- 2018-11-09 CA CA3080910A patent/CA3080910C/en active Active
- 2018-11-09 HR HRP20221152TT patent/HRP20221152T1/hr unknown
- 2018-11-09 AU AU2018369508A patent/AU2018369508B2/en active Active
- 2018-11-09 SG SG11202003677UA patent/SG11202003677UA/en unknown
- 2018-11-09 HU HUE18808599A patent/HUE060078T2/hu unknown
- 2018-11-09 DK DK18808599.7T patent/DK3710446T3/da active
- 2018-11-09 RS RS20220824A patent/RS63530B1/sr unknown
- 2018-11-09 EP EP18808599.7A patent/EP3710446B1/en active Active
- 2018-11-09 PL PL18808599.7T patent/PL3710446T3/pl unknown
- 2018-11-09 CR CR20200184A patent/CR20200184A/es unknown
- 2018-11-09 KR KR1020207013683A patent/KR102450727B1/ko active IP Right Grant
- 2018-11-09 WO PCT/US2018/060025 patent/WO2019099298A1/en unknown
- 2018-11-09 MY MYPI2020002310A patent/MY197700A/en unknown
- 2018-11-09 JP JP2019527416A patent/JP6633254B2/ja active Active
- 2018-11-09 MD MDE20200963T patent/MD3710446T2/ro unknown
- 2018-11-09 PE PE2020001000A patent/PE20210392A1/es unknown
- 2018-11-09 NZ NZ763551A patent/NZ763551A/en unknown
- 2018-11-09 BR BR112020008253-8A patent/BR112020008253A2/pt unknown
- 2018-11-09 JO JOP/2020/0122A patent/JOP20200122B1/ar active
-
2019
- 2019-09-26 US US16/583,661 patent/US10787460B2/en active Active
-
2020
- 2020-05-07 CL CL2020001218A patent/CL2020001218A1/es unknown
- 2020-05-08 IL IL274540A patent/IL274540B/en unknown
- 2020-05-15 EC ECSENADI202025899A patent/ECSP20025899A/es unknown
- 2020-05-16 SA SA520411990A patent/SA520411990B1/ar unknown
- 2020-06-01 DO DO2020000102A patent/DOP2020000102A/es unknown
- 2020-09-22 US US17/028,334 patent/US20210032257A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1701073A (zh) * | 2002-09-04 | 2005-11-23 | 先灵公司 | 作为细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂的吡唑并[1,5-a]嘧啶 |
CN106103445A (zh) * | 2014-02-21 | 2016-11-09 | 癌症研究技术有限公司 | 作为cdk抑制剂的吡唑并[1,5‑a]嘧啶‑5,7‑二胺化合物和它们的治疗用途 |
WO2015154022A1 (en) * | 2014-04-05 | 2015-10-08 | Syros Pharmaceuticals, Inc. | Inhibitors of cyclin-dependent kinase 7 (cdk7) |
WO2016142855A2 (en) * | 2015-03-09 | 2016-09-15 | Aurigene Discovery Technologies Limited | Pyrazolo[1,5-a][1,3,5]triazine and pyrazolo[1,5-a]pyrimidine derivatives as cdk inhibitors |
WO2016160617A2 (en) * | 2015-03-27 | 2016-10-06 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Inhibitors of cyclin-dependent kinases |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022033552A1 (zh) * | 2020-08-12 | 2022-02-17 | 隆泰申医药科技(南京) 有限公司 | Cdk激酶抑制剂、其制备方法、药物组合物和应用 |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111344292B (zh) | 用于抑制cdk7的化合物 | |
JP6871275B2 (ja) | 新規アンモニウム誘導体、それを調製するためのプロセス及びそれを含有する医薬組成物 | |
TWI714631B (zh) | 咪唑並[4,5-c]喹啉-2-酮化合物及它們在治療癌症中之用途 | |
KR20200119824A (ko) | 축합 고리 화합물 | |
EP1876178B1 (en) | Cyanopyridine derivative and use thereof as medicine | |
EP3613737B1 (en) | Novel inhibitor of cyclin-dependent kinase cdk9 | |
Liu et al. | Design, synthesis and structure-activity relationships of novel 4-phenoxyquinoline derivatives containing 1, 2, 4-triazolone moiety as c-Met kinase inhibitors | |
CA2961607A1 (en) | Mk2 inhibitors and uses thereof | |
TWI693218B (zh) | 極光a激酶抑制劑 | |
EP3812386A1 (en) | Crystal form of compound for inhibiting the activity of cdk4/6 and use thereof | |
TW201731837A (zh) | 雙嗒 化合物及它們在治療癌症中之用途 | |
TW201730188A (zh) | 1,3,4-噻二唑化合物及其在治療癌症中之用途 | |
CN115667257B (zh) | 用于抑制cdk7的化合物 | |
EA039950B1 (ru) | Соединения, пригодные для ингибирования cdk7 | |
CN113563341B (zh) | 作为Trk抑制剂的取代的吡唑并[1,5-a]嘧啶化合物 | |
EP4086252A1 (en) | Heterocyclic sulfoximine compound and intermediate thereof, preparation method therefor, and application thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |