ES2924983T3 - Métodos para la detección de fármacos inmunosupresores - Google Patents

Abstract

Se describen métodos y reactivos para mejorar la biodisponibilidad de un fármaco hidrofóbico y, en algunas realizaciones, para determinar un fármaco hidrofóbico, en una muestra que se sospecha que contiene un fármaco hidrofóbico. Se forma una combinación en un medio donde la combinación comprende la muestra, un agente hemolítico donde se lleva a cabo una determinación del fármaco hidrofóbico y un agente de biodisponibilidad para el fármaco hidrofóbico. El agente de biodisponibilidad comprende un detergente iónico que comprende una cadena de al menos 10 átomos de carbono o un detergente no iónico que comprende una cadena de al menos 15 unidades repetidas de óxido de etileno o unidades de óxido de propileno o una combinación de unidades de óxido de etileno y unidades de óxido de propileno. La concentración del agente de biodisponibilidad en el medio es suficiente para potenciar la biodisponibilidad del fármaco hidrofóbico. El medio se incuba en condiciones para potenciar la biodisponibilidad del fármaco hidrófobo, y en una determinación del fármaco hidrófobo en condiciones para hemolizar las células de la muestra. Para la determinación del fármaco hidrófobo, se añaden al medio reactivos para determinar la presencia y/o cantidad del fármaco hidrófobo en la muestra. Los reactivos comprenden al menos un anticuerpo para el fármaco hidrofóbico. Se examina el medio para detectar la presencia de un complejo que comprende el fármaco hidrofóbico y el anticuerpo para el fármaco hidrofóbico. La presencia y/o la cantidad del complejo indica la presencia y/o la cantidad del fármaco hidrofóbico en la muestra. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para la detección de fármacos inmunosupresores

Antecedentes

La divulgación se relaciona con compuestos, métodos y kits para la determinación de fármacos hidrofóbicos, tales como, por ejemplo, fármacos inmunosupresores, en muestras, tales como muestras de pacientes, que se conoce o se sospecha que contienen uno o más de tales fármacos hidrofóbicos.

El cuerpo depende de un complejo sistema de respuesta inmunitaria para distinguir lo propio de lo extraño. A veces, el sistema inmunitario del cuerpo se debe controlar con el fin de incrementar una respuesta deficiente o suprimir una respuesta excesiva. Por ejemplo, cuando se trasplantan órganos, tales como riñón, corazón, corazón-pulmón, médula ósea e hígado en humanos, el cuerpo a menudo rechazará el tejido trasplantado por un proceso referido como rechazo del aloinjerto.

En el tratamiento del rechazo del aloinjerto, el sistema inmunitario se suprime frecuentemente de una manera controlada con la terapia farmacológica. Los fármacos inmunosupresores se administran cuidadosamente a los receptores de trasplantes con el fin de ayudar a prevenir el rechazo del aloinjerto de tejido extraño. Los dos fármacos inmunosupresores que se administran comúnmente para prevenir el rechazo de los órganos en pacientes trasplantados son la ciclosporina (CSA, por sus siglas en inglés) y el FK-506 (FK, por sus siglas en inglés, o Tacrolimus). Otro fármaco que encuentra uso como un inmunosupresor en los Estados Unidos y en otros países es el Sirolimus, también conocido como rapamicina. También se dice que los derivados del Sirolimus son útiles como inmunosupresores. Dichos derivados incluyen, por ejemplo, el Everolimus y similares.

Los efectos secundarios asociados con algunos fármacos inmunosupresores se pueden controlar en parte por el control cuidadoso del nivel del fármaco presente en un paciente. Se requiere un monitoreo terapéutico de las concentraciones de fármacos inmunosupresores y fármacos relacionados en la sangre para optimizar los regímenes de dosificación y garantizar la máxima inmunosupresión con una toxicidad mínima. Aunque los medicamentos inmunosupresores son agentes inmunosupresores altamente efectivos, su uso se debe manejar cuidadosamente porque el rango de dosis efectivo a menudo es estrecho y una dosis excesiva puede resultar en efectos secundarios serios. Por otro lado, una dosis demasiado pequeña de un inmunosupresor puede llevar al rechazo del tejido. Debido a que la distribución y el metabolismo de un fármaco inmunosupresor pueden variar notablemente entre pacientes y debido al amplio rango y severidad de las reacciones adversas, es esencial un monitoreo exacto del nivel del fármaco.

La mayoría de los análisis de sangre total para fármacos inmunosupresores requieren un paso manual para extraer el fármaco de los constituyentes de la sangre usando disolventes orgánicos. Como resultado, las moléculas del fármaco se extraen en una solución relativamente limpia en la cual se remueven las proteínas plasmáticas y las partículas de lipoproteínas, así como la mayoría de otras moléculas. Por lo tanto, la unión del anticuerpo de ensayo al fármaco ocurre en ausencia de la mayoría de las sustancias endógenas en estos ensayos. Sin embargo, en un ensayo homogéneo donde no hay extracción manual o separación del fármaco de los componentes de la sangre, un anticuerpo para el fármaco inmunosupresor tiene que detectar el fármaco en presencia de la mayoría o de todos los componentes de la sangre, lo que podría interferir con la unión del anticuerpo al fármaco inmunosupresor y/o su análogo.

Los presentes inventores han reconocido que los fármacos hidrofóbicos, tales como los fármacos inmunosupresores, son absorbidos por las partículas de lipoproteínas ricas en colesterol, tales como lipoproteínas de baja densidad (LDL, por sus siglas en inglés) y lipoproteínas de alta densidad (HDL, por sus siglas en inglés), etc. El fármaco se absorbe de modo tal que una porción o todo del fármaco se vuelve inaccesible para el anticuerpo de detección en un ensayo para el fármaco, resultando en una disminución en la cantidad del fármaco detectable en el ensayo. Debido a que la hiperlipidemia es común en pacientes trasplantados, un ensayo para la determinación de un fármaco inmunosupresor necesita ser robusta a la interferencia de lipoproteínas.

Hay, por lo tanto, una necesidad continua de desarrollar métodos de diagnóstico rápidos y exactos para la medición de los niveles de los fármacos inmunosupresores o derivados de los mismos en pacientes. Los métodos deben estar completamente automatizados y ser exactos incluso cuando se llevan a cabo en muestras de sangre total sin extracción usando un ensayo homogéneo donde un anticuerpo empleado en el ensayo tiene que detectar el fármaco en presencia de la mayoría, sino de todos los constituyentes de la sangre.

Breve descripción de la invención

Una realización es un método para la potenciación de la biodisponibilidad de un fármaco hidrofóbico en una muestra que se sospecha que contiene un fármaco hidrofóbico. Se proporciona un medio que comprende una combinación de la muestra y de un agente de biodisponibilidad para el fármaco hidrofóbico, en donde el agente de biodisponibilidad comprende un detergente iónico que comprende una cadena de al menos 10 átomos de carbono, o un detergente no iónico que comprende una cadena de al menos 15 unidades repetidas de óxido de etileno, o unidades de óxido de propileno, o una combinación de unidades de óxido de etileno y de unidades de óxido de propileno. La concentración del agente de biodisponibilidad en el medio es suficiente para potenciar la biodisponibilidad del fármaco hidrofóbico. El medio se incuba bajo condiciones para la potenciación de la biodisponibilidad del fármaco hidrofóbico.

Otra realización es un método para la determinación de un fármaco hidrofóbico en una muestra que se sospecha que contiene un fármaco hidrofóbico. Se forma una combinación en un medio donde la combinación comprende la muestra, un agente hemolítico, y un agente de biodisponibilidad para el fármaco hidrofóbico. El agente de biodisponibilidad comprende un detergente iónico que comprende una cadena de al menos 10 átomos de carbono, o un detergente no iónico que comprende una cadena de al menos 15 unidades repetidas de óxido de etileno, o unidades de óxido de propileno, o una combinación de unidades de óxido de etileno y de unidades de óxido de propileno. La concentración del agente de biodisponibilidad en el medio es suficiente para potenciar la biodisponibilidad del fármaco hidrofóbico. El medio se incuba bajo condiciones para la hemólisis de las células de la muestra y para la potenciación de la biodisponibilidad del fármaco hidrofóbico. Se adicionan reactivos al medio para la determinación de la presencia y/o la cantidad del fármaco hidrofóbico en la muestra, en donde los reactivos comprenden al menos un anticuerpo para el fármaco hidrofóbico. Se examina el medio para la presencia de un complejo que comprende el fármaco hidrofóbico y el anticuerpo para el fármaco hidrofóbico. La presencia y/o la cantidad del complejo indica la presencia y/o la cantidad del fármaco hidrofóbico en la muestra.

Otra realización es un método para la determinación de un fármaco inmunosupresor en una muestra que se sospecha que contiene un fármaco inmunosupresor. Se forma una combinación en un medio, en donde la combinación comprende la muestra, un agente hemolítico, y un agente de biodisponibilidad para el fármaco hidrofóbico, como se describe anteriormente. El medio se incuba bajo condiciones para la hemólisis de las células de la muestra y para la potenciación de la biodisponibilidad del fármaco hidrofóbico. Las partículas magnéticas que comprenden el fármaco inmunosupresor o un análogo del mismo y un anticuerpo para el fármaco inmunosupresor que comprende una enzima se combinan en el medio, que posteriormente se examina para la presencia de un complejo que comprende el fármaco inmunosupresor y el anticuerpo para el fármaco inmunosupresor. La presencia y/o la cantidad del complejo indica la presencia y/o la cantidad del fármaco inmunosupresor en la muestra.

Otra realización es un método para la determinación de un fármaco inmunosupresor en una muestra que se sospecha que contiene un fármaco inmunosupresor. Se forma una combinación en un medio, en donde la combinación comprende la muestra, un agente hemolítico, y un agente de biodisponibilidad para el fármaco hidrofóbico, como se describe anteriormente. El medio se incuba bajo condiciones para la hemólisis de las células de la muestra y para la potenciación de la biodisponibilidad del fármaco hidrofóbico. Al medio se le adiciona (i) un fotosensibilizador asociado a una primera partícula y que es capaz de la generación de un oxígeno singulete, y (ii) una composición quimioluminiscente activable por el oxígeno singulete y asociada a una segunda partícula. La primera partícula o la segunda partícula, o ambas, comprenden un anticuerpo para el fármaco inmunosupresor. La combinación se somete a condiciones para la unión del anticuerpo al fármaco inmunosupresor, si está presente. El fotosensibilizador se irradia con luz y la cantidad de luminiscencia generada por la composición quimioluminiscente se detecta. La cantidad de luminiscencia se relaciona con la cantidad del fármaco inmunosupresor en la muestra.

Alternativamente, en la realización anterior, una de la primera partícula o la segunda partícula comprende el anticuerpo, y la otra partícula comprende un análogo del fármaco para el fármaco inmunosupresor. La combinación se somete a condiciones para la competencia de las partículas recubiertas del análogo del fármaco y del fármaco inmunosupresor, si está presente, con el anticuerpo para el fármaco. Alternativamente, en la realización anterior, la primera partícula o la segunda partícula comprende estreptavidina, que se combina con un análogo biotinilado del fármaco inmunosupresor en el medio. La combinación se somete a condiciones para la competencia del análogo del fármaco biotinilado y del fármaco inmunosupresor por el anticuerpo del fármaco. En cualquiera de las realizaciones alternativas anteriores, el fotosensibilizador se irradia con luz y se detecta la cantidad de luminiscencia generada por la composición quimioluminiscente. La cantidad de luminiscencia se relaciona con la cantidad del fármaco inmunosupresor en la muestra.

Descripción detallada de realizaciones específicas

Discusión general

Los métodos actuales se enfocan en la mitigación de la interferencia causada por los constituyentes sanguíneos endógenos, especialmente por las lipoproteínas y, en particular, por los triglicéridos y el colesterol. Los presentes métodos tienen aplicación en ensayos homogéneos completamente automatizados en los cuales, previo al ensayo, no hay extracción ni separación del fármaco hidrofóbico de otros constituyentes de la muestra, tales como, por ejemplo, de los constituyentes sanguíneos, que pueden incluir las lipoproteínas. En un ensayo de “extracción no manual”, una muestra, tal como una muestra de sangre total, se combina con un agente hemolizante en un medio y, seguido de un período de incubación para permitir la hemólisis, se adicionan reactivos para llevar a cabo un ensayo para el fármaco hidrofóbico el medio, y el ensayo se lleva a cabo. Se ha encontrado que la biodisponibilidad de un fármaco hidrofóbico en un ensayo para el fármaco se puede potenciar incubando una muestra que se sospecha que contiene el fármaco hidrofóbico con un agente de biodisponibilidad que potencia la disponibilidad del fármaco hidrofóbico para la unión subsecuente a un anticuerpo para el fármaco durante un ensayo para detectar la presencia y/o la cantidad del fármaco en donde están presentes otros constituyentes de la muestra.

El término “fármaco hidrofóbico”, como se usa en la presente, se refiere a un fármaco, usualmente un fármaco terapéutico, donde el fármaco exhibe una característica de absorción por una lipoproteína hasta el punto de que la absorción interfiere con la cuantificación del fármaco en un ensayo para el fármaco. La interferencia con la cuantificación del fármaco significa que la capacidad de realizar una determinación cuantitativa exacta del fármaco en un ensayo se reduce en al menos aproximadamente 10%, en al menos aproximadamente 15%, en al menos aproximadamente 20%, en al menos aproximadamente 25%, en al menos aproximadamente 30%, y así sucesivamente.

Las lipoproteínas son partículas esféricas que consisten en un núcleo lipídico no polar rodeado por una monocapa superficial de lípidos anfipáticos (fosfolípidos y colesterol no esterificado) y proteínas específicas llamadas apolipoproteínas. Se incorporan un número de fosfolípidos diferentes a la cubierta de la lipoproteína, siendo los más comunes la fosfatidilcolina, la fosfatidilserina, la fosfatidiletanolamina y la esfingomielina. Tradicionalmente, las lipoproteínas plasmáticas se clasifican y separan de acuerdo con su densidad, y se dividen en cinco categorías principales: quilomicrones, lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL, por sus siglas en inglés), lipoproteínas de densidad intermedia (IDL, por sus siglas en inglés), lipoproteínas de baja densidad (LDL), y lipoproteínas de alta densidad (HDL). Para la mitigación efectiva de la interferencia de las lipoproteínas de acuerdo con los presentes métodos, un agente de biodisponibilidad debe mitigar o reducir sustancialmente la interferencia tanto de los triglicéridos como del colesterol.

Los fármacos inmunosupresores son un ejemplo de fármacos hidrofóbicos. Los fármacos inmunosupresores son fármacos terapéuticos que se administran a los receptores de trasplantes con el fin de ayudar a prevenir el rechazo del aloinjerto de tejido no propio. Los fármacos inmunosupresores se pueden clasificar en cuatro grupos: glucocorticoides, citostáticos, anticuerpos, fármacos que actúan sobre las inmunofilinas, y otros fármacos, tales como interferones, proteínas de unión a INF (por sus siglas en inglés) de opiáceos, micofenolato, FTY720 y similares. Una clase particular de fármacos inmunosupresores comprende aquellos fármacos que actúan sobre las inmunofilinas. Las inmunofilinas son un ejemplo de proteínas de unión específicas de alta afinidad que tienen una importancia fisiológica. Actualmente se conocen dos familias distintas de inmunofilinas: ciclofilinas y macrofilinas, la última de las cuales se une específicamente, por ejemplo, a Tacrolimus o a Sirolimus. Los fármacos inmunosupresores que actúan sobre la inmunofilina incluyen, por ejemplo, ciclosporina (que incluye ciclosporina A, ciclosporina B, ciclosporina C, ciclosporina D, ciclosporina E, ciclosporina F, ciclosporina G, ciclosporina H, ciclosporina I), Tacrolimus (FK506, PROGRAF®), Sirolimus (rapamicina, RAPAMUNE®), Everolimus (RAD, CERTICAN®) y así sucesivamente.

El término “biodisponibilidad”, como se usa en la presente, se refiere a la cantidad del fármaco hidrofóbico en una muestra que está disponible para una medición, tal como, por ejemplo, disponible para unirse a un anticuerpo para el fármaco hidrofóbico, particularmente en un ensayo donde hay constituyentes en la muestra a analizar que absorben el fármaco hidrofóbico, haciendo así que el fármaco hidrofóbico no esté disponible para unirse a un anticuerpo para el fármaco hidrofóbico. Un factor principal que afecta a la biodisponibilidad de interés en los presentes métodos es la absorción de un fármaco hidrofóbico por las lipoproteínas en una muestra a analizar donde no hay separación de dichas lipoproteínas antes de un ensayo.

De acuerdo con las presentes realizaciones, “biodisponibilidad potenciada” o “potenciamiento de la biodisponibilidad” o “potenciar la biodisponibilidad” de un fármaco hidrofóbico significa que hay un potenciamiento o aumento en la cantidad del fármaco hidrofóbico disponible para la detección en una muestra que contiene cantidades aumentadas de colesterol y de triglicéridos.

En consecuencia, como se mencionó anteriormente, una realización es un método para la determinación de un fármaco hidrofóbico en una muestra que se sospecha que contiene un fármaco hidrofóbico. Se forma una combinación en un medio donde la combinación comprende la muestra, un agente hemolítico, y un agente de biodisponibilidad para el fármaco hidrofóbico. El agente de biodisponibilidad comprende un detergente iónico que comprende una cadena de al menos 10 átomos de carbono, o un detergente no iónico que comprende una cadena de al menos 15 unidades repetidas de óxido de etileno, o unidades de óxido de propileno, y en donde la concentración del agente de biodisponibilidad en el medio es suficiente para provocar que el fármaco hidrofóbico esté biodisponible. El medio se incuba bajo condiciones para la hemólisis de las células de la muestra y para provocar que el fármaco hidrofóbico esté disponible. Se adicionan reactivos al medio para la determinación de la presencia y/o la cantidad del fármaco hidrofóbico en la muestra, en donde los reactivos comprenden al menos un anticuerpo para el fármaco hidrofóbico. Se examina el medio para la presencia de un complejo que comprende el fármaco hidrofóbico y el anticuerpo para el fármaco hidrofóbico. La presencia y/o la cantidad del complejo indican la presencia y/o la cantidad del fármaco hidrofóbico en la muestra.

La frase “al menos” como se usa en la presente significa que el número de elementos especificados puede ser igual o mayor que el número mencionado. La frase “aproximadamente” como se usa en la presente significa que el número mencionado puede diferir en más o en menos de 10%; por ejemplo, “aproximadamente 5” significa un rango de 4,5 a 5,5.

La muestra a analizar es una que se sospecha que contiene uno o más analitos de fármacos hidrofóbicos. La muestra típicamente comprende uno o más compuestos que absorben un fármaco hidrofóbico, tal como una lipoproteína, particularmente el colesterol y los triglicéridos. Las muestras son preferiblemente de humanos o de animales e incluyen fluidos biológicos, tales como sangre total, suero, plasma, esputo, fluido linfático, semen, moco vaginal, heces, orina, fluido espinal, saliva, deposiciones, fluido cefalorraquídeo, lágrimas, moco, y similares; y tejidos biológicos, tales como cabello, piel, secciones o tejidos escindidos de órganos u otras partes del cuerpo; y así sucesivamente. En muchas instancias, la muestra es sangre total, plasma o suero y, en una realización particular, la muestra es sangre total.

La muestra se puede preparar en cualquier medio conveniente que no interfiera con un ensayo; se prefiere un medio acuoso. La naturaleza del medio se discute con más detalle a continuación. Se combinan en el medio un agente hemolítico y un agente de biodisponibilidad para el fármaco hidrofóbico, de acuerdo con los presentes métodos.

Agente hemolítico

Un agente hemolítico es un compuesto o una mezcla de compuestos que interrumpir la integridad de las membranas de los glóbulos rojos, liberando así el contenido intracelular de las células. En la técnica se conocen numerosos agentes hemolíticos. Los agentes hemolíticos incluyen, por ejemplo, detergentes no iónicos, detergentes aniónicos, detergentes anfóteros, soluciones acuosas de baja fuerza iónica (soluciones hipotónicas), agentes bacterianos, anticuerpos que causan una lisis dependiente del complemento, y similares. Los detergentes no iónicos que se pueden emplear como agentes hemolíticos incluyen tanto detergentes sintéticos como detergentes naturales. Los ejemplos de detergentes sintéticos incluyen TRITON™ X-100, TRITON™ N-101, TRITON™X-114, TRITON™X-405, TRITON™ SP-135, TWEEN® 20 (polioxietileno (20) monolaurato de sorbitán), TWEEN® 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitán), DOWFAX®, ZONYL®, palmitato de pentaeritritilo, ADOGEN® 464, ALKANOL® 6112 tensioactivo, alcohol alílico 1,2-butoxilato-b/oqueetoxilato HLB 6 (por sus siglas en inglés), BRIJ®, etilendiamina tetrakis(etoxilato-b/oque -propoxilato)tetrol, IGEPA^l®, MERPOL®, polietilenglicol, éter 2-[etil[(heptadecafluorooctil)sulfonil]amino]etílico, polietileno-b/oque-polietilenglicol, tetraoleato de polioxietilensorbitán, hexaoleato de polioxietilensorbitol, TERGITOL® ⁿ P-9, GAFAC® (RHODAFAC®, un éster de fosfato de alquilpolioxietilenglicol, tal como, por ejemplo, alfa-dodecil-omega-hidroxipoli(oxi-1,2-etanodiil)fosfato), EP110®, y similares. Los detergentes naturales que se pueden emplear como agentes hemolíticos incluyen, por ejemplo, saponinas, ácidos grasos neutralizados con sodio o potasio, fosfolípidos neutralizados, diacilglierol, fosfatidilserina neutralizada, fosfatidato, fosfatidiletanolamina neutralizada, fosfatidilcolina, fosfatidilinositol, fosfatidilcolina, sales biliares, colesterol no esterificado, esfingosina neutralizada, ceramida, y similares. También se pueden emplear combinaciones de uno o más detergentes sintéticos o uno o más detergentes que ocurren naturalmente, y combinaciones de detergentes sintéticos y detergentes que ocurren naturalmente.

La naturaleza y cantidad o concentración del agente hemolítico empleado depende de la naturaleza de la muestra, la naturaleza del fármaco hidrofóbico, la naturaleza del resto de los componentes reactivos, las condiciones de reacción, y similares. La cantidad del agente hemolítico es al menos suficiente para causar la lisis de los glóbulos rojos para liberar el contenido de las células. En algunas realizaciones, la cantidad del agente hemolítico es de aproximadamente 0,0001% a aproximadamente 0,5%, de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 0,4%, de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,3%, de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,2%, de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 0,3%, de aproximadamente 0,2% a aproximadamente 0,5%, de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 0,2%, y así sucesivamente (el porcentaje es en volumen).

Agente de biodisponibilidad

El agente de biodisponibilidad de acuerdo con realizaciones de los presentes métodos comprende un detergente iónico que comprende una cadena de al menos 10 átomos de carbono, o un detergente no iónico que comprende una cadena de al menos 15 unidades de óxido de etileno, o unidades repetidas de óxido de propileno , o una combinación de segmentos repetidos de óxido de de etileno y de óxido de propileno, en donde los segmentos repetidos comprenden unidades de óxido de etileno y de óxido de propileno, respectivamente. Las combinaciones que comprenden uno o más de los detergentes mencionados anteriormente con otros agentes y materiales también se incluyen dentro de la definición de un agente de biodisponibilidad. En algunas realizaciones, el agente de biodisponibilidad es un líquido.

El detergente iónico mencionado anteriormente puede ser aniónico o catiónico. En muchas realizaciones, el detergente iónico es aniónico. En algunas realizaciones, el detergente iónico comprende una cadena de al menos aproximadamente 10, o al menos aproximadamente 11, o al menos aproximadamente 12, o al menos aproximadamente 13, o al menos aproximadamente 14, o al menos aproximadamente 15, o al menos aproximadamente 16, o al menos aproximadamente 17, o al menos aproximadamente 18, o al menos aproximadamente 19, o al menos aproximadamente 20 átomos de carbono. El número de átomos de carbono en la cadena es usualmente no mayor a 50, o no mayor a 40, o no mayor a 30, y así sucesivamente. La cadena es usualmente no cíclica, es decir, no hay anillos como parte de la cadena. La cadena puede comprender unidades repetidas de metileno, tales como, por ejemplo, -CH²(CH²)nCH²-, en donde n es de aproximadamente 8 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 9 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 12 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 8 a aproximadamente 25, o de aproximadamente 8 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 9 a aproximadamente 25, o de aproximadamente 9 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 25, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 11 a aproximadamente 25, o de aproximadamente 11 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 12 a aproximadamente 25, o de aproximadamente 12 a aproximadamente 20, y así sucesivamente. En algunas realizaciones, 1 a 3, ó 1 a 2, ó 2 a 3 átomos de carbono de la cadena se pueden remplazar por un resto de oxígeno, formando así un éter.

Uno o más hidrógenos de la cadena de metileno pueden estar sustituidos con alquilo de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 4, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 2, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 5, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 4, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 3, o de aproximadamente 3 a aproximadamente 5, o de aproximadamente 3 a aproximadamente 4 átomos de carbono. Como se usa en la presente, el término “alquilo” incluye los grupos alquilo de un número designado de átomos de carbono de configuración lineal, ramificada o cíclica. Los ejemplos de “alquilo” incluyen un metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec- y ferc-butilo, pentilo, y similares. Otros sustituyentes en la cadena de metileno en lugar de uno o más hidrógenos incluyen, por ejemplo, una cetona, amina, fenilo, y similares. En muchas realizaciones, el número de sustituyentes en la cadena de metileno no es mayor a 3, o no mayor a 2, o no mayor a 1. Un término de la cadena de metileno puede ser un metilo, alquilfenol, y similares. El otro extremo de la cadena de metileno puede ser un sustituyente aniónico o catiónico dependiendo de si el detergente es aniónico o catiónico. En algunas realizaciones, el extremo puede ser un ion sulfato, ion sulfito, ion carboxilato, ion fosfato, ion fosfito, óxido de amina (secundaria o terciaria), ion amonio (primario, secundario o terciario), etc.

En algunas realizaciones, el agente de biodisponibilidad comprende una cadena de al menos 12 ó 13 ó 14 ó 15 ó 16 átomos de carbono, por ejemplo, -CH3(CH2)nCH2-, en donde n es 10, 11, 12, 13 ó 14. En algunas realizaciones, el extremo de la cadena, distinto del extremo que comprende el grupo metilo terminal, es un resto aniónico, tal como, por ejemplo, un ion sulfato, sin resto iónico interno; en algunas realizaciones, el extremo de la cadena, distinto del extremo que comprende el grupo metilo terminal, es un resto catiónico, tal como, por ejemplo, un ion amonio, sin resto iónico interno. En algunas realizaciones, el carbono alfa comprende un sustituyente, tal como, por ejemplo, un grupo cetona. En realizaciones particulares, el agente de biodisponibilidad es un sulfato de alquilo, en donde el alquilo comprende una cadena de 12 a 16 átomos de carbono. Los ejemplos de tales realizaciones del agente de biodisponibilidad incluyen los detergentes dodecilsulfato de sodio (duponol, duponal WAQE, por sus siglas en inglés), dodecilsulfato de litio, y similares. En muchas realizaciones, el agente de biodisponibilidad no es zwitteriónico.

Como se mencionó anteriormente, el agente de biodisponibilidad puede ser un detergente no iónico que comprende una cadena de al menos 15 unidades repetidas de óxido de etileno, o unidades de óxido de propileno, o una combinación de unidades de óxido de etileno y óxido de propileno. En algunas realizaciones, la cadena es lineal en lugar de ramificada. En algunas realizaciones, el detergente no iónico comprende una cadena de al menos aproximadamente 15, o al menos aproximadamente 16, o al menos aproximadamente 17, o al menos aproximadamente 18, o al menos aproximadamente 19, o al menos aproximadamente 20, o al menos aproximadamente 21, o al menos aproximadamente 22, o al menos aproximadamente 23, o al menos aproximadamente 24, o al menos aproximadamente 25, o al menos aproximadamente 26, o al menos aproximadamente 27, o al menos aproximadamente 28, o al menos aproximadamente 29 , o al menos aproximadamente 30, o al menos aproximadamente 31, o al menos aproximadamente 32, o al menos aproximadamente 33, o al menos aproximadamente 34, o al menos aproximadamente 35 unidades repetidas, como se mencionó anteriormente. El número de unidades repetidas en la cadena es usualmente no mayor a 50, o no mayor a 45, o no mayor a 40, y así sucesivamente. Cuando la cadena comprende una combinación de unidades repetidas de óxido de etileno y unidades de óxido de propileno, el cociente entre unidades de óxido de etileno y unidades de óxido de propileno es de aproximadamente 1:1, o aproximadamente 2:1, o aproximadamente 3:1, o aproximadamente 1:2, o aproximadamente 1:3, o aproximadamente 1:4, o aproximadamente 1:5, o aproximadamente 1:6, o aproximadamente 1:7, o aproximadamente 1:8, y similares. En las realizaciones anteriores, las unidades de óxido de etileno y las unidades de óxido de propileno repetidas se pueden alternar. Cada unidad de óxido de etileno repetida puede ser un segmento de unidades de óxido de etileno, donde los segmentos tienen la misma longitud o diferentes longitudes, es decir, pueden comprender el mismo número de unidades de óxido de etileno o un número diferente de unidades de óxido de etileno. Cada unidad de óxido de propileno repetida puede ser un segmento de unidades de óxido de propileno, donde los segmentos tienen la misma longitud o diferentes longitudes, es decir, pueden comprender el mismo número de unidades de óxido de propileno o un número diferente de unidades de óxido de propileno. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el detergente comprende segmentos terminales de óxido de etileno que comprenden de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 4, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 2, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 5, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 4, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 3, o de aproximadamente 3 a aproximadamente 5, o de aproximadamente 4 a aproximadamente 5 unidades de óxido de etileno, y un segmento interno de óxido de propileno que comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 25, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 25, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 25 unidades de óxido de propileno.

En algunas realizaciones, la cadena puede comprender unidades repetidas de óxido de etileno, tales como, por ejemplo, -(CH²CH²O)p-, en donde p es de aproximadamente 15 a aproximadamente 40, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 40, o de aproximadamente 25 a aproximadamente 40, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 35, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 35, o de aproximadamente 25 a aproximadamente 35, o de aproximadamente 30 a aproximadamente 35, y así sucesivamente. En algunas realizaciones, la cadena puede comprender unidades repetidas de óxido de propileno, tales como, por ejemplo, -(CH2CH(CH3)O)q-, en donde q es de aproximadamente 15 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 25 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 25, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 25, o de aproximadamente 25 a aproximadamente 35, o de aproximadamente 30 a aproximadamente 35, y así sucesivamente.

En algunas realizaciones, la cadena puede comprender una combinación de unidades de óxido de etileno y de unidades de propileno como, por ejemplo, -(CH2CH2O)s-(CH2CH(CH3)O)t-, en donde (s t) es de al menos aproximadamente 15, o al menos aproximadamente 16, o al menos aproximadamente 17, o al menos aproximadamente 18, o al menos aproximadamente 19, o al menos aproximadamente 20, o al menos aproximadamente 21, o al menos aproximadamente 22, o al menos aproximadamente 23, o al menos aproximadamente 24, o al menos aproximadamente 25 átomos de carbono, o al menos aproximadamente 26, o al menos aproximadamente 27, o al menos aproximadamente 28, o al menos aproximadamente 29, o al menos aproximadamente 30, o al menos aproximadamente 31, o al menos aproximadamente 32, o al menos aproximadamente 33, o al menos aproximadamente 34, o al menos aproximadamente 35, y usualmente no más de aproximadamente 40, no más de aproximadamente 39, no más de aproximadamente 38, no más de aproximadamente 37, no más de aproximadamente 36. En algunas realizaciones (s t) es de aproximadamente 15 a aproximadamente 40, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 40, o de aproximadamente 25 a aproximadamente 40, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 35, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 35, o de aproximadamente 25 a aproximadamente 35, o de aproximadamente 30 a aproximadamente 35, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 25 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 25, y así sucesivamente. En algunas realizaciones, siempre que (s t) sea como se ha definido anteriormente, s es de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, o de 1 a aproximadamente 10, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, o aproximadamente 2 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 25, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 15, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 25, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 15, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 25, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 15, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 25, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 25, o de aproximadamente 25 a aproximadamente 30, y t es de aproximadamente 5 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 25, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 15, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 25, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 15, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 25, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 25, o de aproximadamente 25 a aproximadamente 30.

Uno o más hidrógenos de la cadena pueden estar sustituidos con un alquilo de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 4, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 2, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 5, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 4, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 3, o de aproximadamente 3 a aproximadamente 5, o de aproximadamente 3 a aproximadamente 4 átomos de carbono, a veces referido en la presente como un alquilo inferior. Otros sustituyentes en la cadena en lugar de uno o más hidrógenos incluyen, por ejemplo, una cetona, amina, alquilfenol, y similares. En muchas realizaciones, el número de sustituyentes en la cadena es no mayor a 3, no mayor a 2, o no mayor a 1. En algunas realizaciones, un extremo de la cadena puede ser un metilo, hidroxilo, fenilo, y similares. En algunas realizaciones, el otro extremo de la cadena puede ser un metilo, hidroxilo, fenilo, y similares.

En algunas realizaciones, el agente de biodisponibilidad comprende una cadena de al menos aproximadamente 30 ó 31 ó 32 ó 33 ó 34 ó 35 unidades repetidas de óxido de etileno, por ejemplo, -(CH²CH²O)p-, en donde p es 30, 31, 32, 33, 34 ó 35. En algunas realizaciones, ambos extremos de la cadena son hidroxilos. Los ejemplos particulares de realizaciones del agente de biodisponibilidad que comprende unidades repetidas de óxido de etileno son aquellas que comprenden una cadena de 30 ó 35 unidades repetidas de óxido de etileno en las que ambos extremos de la cadena son hidroxilos. Los ejemplos específicos de realizaciones de los agentes de biodisponibilidad incluyen los detergentes TRITON™ X-405, TRITON™ SP-135, y similares.

En algunas realizaciones, el agente de biodisponibilidad comprende una cadena que comprende una combinación de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 15, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 10, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 5, de aproximadamente 3 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 3 a aproximadamente 15, o de aproximadamente 3 a aproximadamente 10, o de aproximadamente 3 a aproximadamente 5, de aproximadamente 4 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 4 a aproximadamente 15, o de aproximadamente 4 a aproximadamente 10, o de aproximadamente 4 a aproximadamente 5, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 15, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 unidades de óxido de etileno, y de aproximadamente 5 a aproximadamente 50, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 40, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 50, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 40, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 50, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 40, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 30, de aproximadamente 15 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 50, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 40, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 25, o de aproximadamente 25 a aproximadamente 50, o de aproximadamente 25 a aproximadamente 40, o de aproximadamente 25 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 30 a aproximadamente 50, o de aproximadamente 30 a aproximadamente 40, o de aproximadamente 30 a aproximadamente 35, o de aproximadamente 35 a aproximadamente 50, o de aproximadamente 35 a aproximadamente 40, o de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 unidades de óxido de propileno. En algunas realizaciones, ambos extremos de la cadena son hidroxilos.

En algunas realizaciones, la cadena puede comprender una combinación de unidades de óxido de etileno y unidades de propileno, tales como, por ejemplo, -(CH2CH2O)s-(CH2CH(CH3)O)t-(CH2CH2O)s-, en donde cada s es 1 a 3, ó 1 a 2, y en donde t es 15 a 40, ó 15 a 35, ó 15 a 30, y en donde cada extremo de la cadena es un hidroxilo. Los ejemplos particulares de realizaciones del agente de biodisponibilidad que comprende tal combinación de unidades de óxido de etileno y unidades de óxido de propileno incluyen los detergentes PLURONIC® 25R2, PLURONIC® 25R1, PLURONIC® 25R4, PLURONIC® 31R1, PLURONIC® 31R2, PLURONIC® 17R1, PLURONIC® 17R2, PLURONIC® 10R5, PLURONIC® L123, PLURONIC® L31, y similares. Otros ejemplos de realizaciones del agente de biodisponibilidad que comprende tal combinación de unidades de óxido de etileno y unidades de óxido de propileno incluyen los detergentes DOWFAX® 63N10, DOWFAX® 63N13, DOWFAX® 63N30, DOWFAX® 63N40, DOWFAX® 20A612, DOWFAX® DF101, DOWFAX® DF111, DOWFAX® DF112, y similares.

Como se mencionó anteriormente, los agentes de biodisponibilidad mitigan la interferencia tanto del colesterol como de los triglicéridos sobre la disponibilidad de un fármaco hidrofóbico para unirse a un anticuerpo en un ensayo para el fármaco hidrofóbico. El agente de biodisponibilidad puede ser una combinación de uno o más de los compuestos anteriores en combinación con otro de tales compuestos o en combinación con uno o más compuestos que pueden tener un efecto mitigador suficiente sobre la interferencia del colesterol o de la interferencia de los triglicéridos, pero no sobre ambas. Tales compuestos incluyen, por ejemplo, los detergentes saponina, GAFAC®, TWEEN® 20, TWEEN® 80, EP110™, ZWITTERGENT® (detergentes de amidosulfobetaína zwitteriónicos, tales como, por ejemplo, 3-(N,N-dimetiltetradecilamonio)propanosulfonato, TRITON™ X-100, sales biliares, ciertos detergentes p Lu RONIC® y DOWFAX®, y similares. Cabe señalar que los agentes de biodisponibilidad son efectivos para mitigar la interferencia tanto de los triglicéridos como del colesterol en ausencia de los compuestos antes mencionados.

La concentración del agente de biodisponibilidad en el medio es suficiente para alcanzar una mayor biodisponibilidad del fármaco hidrofóbico, es decir, para reducir la interferencia o la absorción por las lipoproteínas, particularmente del colesterol y de los triglicéridos, en una muestra de modo tal que se pueda realizar una cuantificación exacta del fármaco hidrofóbico en un ensayo homogéneo automatizado para el fármaco hidrofóbico. En otras palabras, la concentración del agente de biodisponibilidad en el medio es suficiente para que la cantidad de fármaco hidrofóbico en la muestra que está disponible para unirse a un miembro de unión específico para el fármaco hidrofóbico sea suficiente para una determinación exacta de la cantidad de fármaco hidrofóbico en la muestra. En consecuencia, la concentración o cantidad del agente de biodisponibilidad debe ser suficiente para mitigar o reducir la interferencia de las lipoproteínas, particularmente tanto los triglicéridos como el colesterol, alcanzando así un potenciamiento en la cantidad del fármaco hidrofóbico disponible para la detección en un ensayo.

Para el colesterol, la interferencia se reduce lo suficiente, y la biodisponibilidad del fármaco hidrofóbico se potencia, potenciando así la exactitud de su detección, cuando se aumenta la cantidad de fármaco hidrofóbico que es detectable en una muestra alta en colesterol (por ejemplo, 400 mg/dL) sobre la obtenido en ausencia del agente de biodisponibilidad en al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% , al menos aproximadamente 100%, al menos aproximadamente 105%, al menos aproximadamente 110%, al menos aproximadamente 115%, al menos aproximadamente 120%, al menos aproximadamente 125%, al menos aproximadamente 130%, al menos aproximadamente 135%, al menos aproximadamente 140%, al menos aproximadamente 145%, al menos aproximadamente 150%, al menos aproximadamente 155%, al menos aproximadamente 160%, al menos aproximadamente 165%, y así sucesivamente.

Para los triglicéridos, la interferencia se reduce lo suficiente, y la biodisponibilidad del fármaco hidrofóbico se potencia, potenciando así la exactitud de su detección, cuando se aumenta la cantidad de fármaco hidrofóbico que es detectable en una muestra alta en triglicéridos (por ejemplo, 1000 mg/dL) sobre el obtenido en ausencia del agente de biodisponibilidad en al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 100%, y así sucesivamente. Como se discute con más detalle a continuación, los parámetros anteriores para potenciar la biodisponibilidad se pueden evaluar usando un ensayo ACMIA (por sus siglas en ingles) en el analizador de química clínica DIMENSION® donde una muestra alta en colesterol contiene aproximadamente 400 mg/dL y una muestra alta en triglicéridos contiene aproximadamente 1000 mg/dL.

La cantidad o concentración del agente de biodisponibilidad empleada depende de la naturaleza de la muestra, la naturaleza del fármaco hidrofóbico, la presencia de otros compuestos detergentes y disolventes orgánicos, la naturaleza de otros componentes reactivos, las condiciones de reacción, y similares. En algunas realizaciones, la cantidad del agente de biodisponibilidad es de aproximadamente 0,0001% a aproximadamente 0,5%, de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 0,4%, de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,3%, de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,2%, de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 0,3%, de aproximadamente 0,2% a aproximadamente 0,5%, de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 0,2%, y así sucesivamente (el porcentaje es en volumen). En algunas realizaciones, la concentración máxima del agente de biodisponibilidad es menor a la concentración micelar crítica para aquellos detergentes que exhiben tal característica, tales como, por ejemplo, los detergentes TRITON™ X-405, dodecilsulfato de sodio, dodecilsulfato de litio, y similares. En algunas realizaciones, la concentración máxima del agente de biodisponibilidad es menor al rango de concentración de agregación o a la concentración de agregación límite para aquellos detergentes que exhiben tal característica, tales como, por ejemplo, los detergentes PLURONIC® 25R2, PLURONIC® 25R1, PLURONIC® 25R4, PLURONIC® 31R1, PLURONIC® 31R2, PLURONIC® 17R1, PLURONIC® 17R2, PLURONIC® 10R5, PLURONIC® L123, PLURONIC® L31, y similares.

Hemólisis y potenciamiento de la biodisponibilidad

La muestra, el agente hemolítico y el agente de biodisponibilidad se combinan en un medio que, como se mencionó anteriormente, usualmente es un medio acuoso. Todo lo anterior se puede combinar simultáneamente en el medio o uno 0 más de los reactivos anteriores se pueden adicionar secuencialmente. El medio acuoso puede ser solamente agua o puede incluir de 0,1 a aproximadamente 40 por ciento en volumen de un codisolvente, tal como, por ejemplo, un disolvente orgánico, que puede ser un alcohol, éter, éster, y similares. El medio también puede comprender uno o más preservativos conocidos en la técnica como, por ejemplo, azida de sodio, sulfato de neomicina, PROCLIN® 300, estreptomicina, y similares. El pH del medio estará usualmente en el rango de 4 a 11, más usualmente en el rango de 5 a 10, y preferiblemente en el rango de 6,5 a 9,5.

Se pueden usar varios amortiguadores para alcanzar el pH deseado y mantener el pH durante el período de incubación. Los amortiguadores ilustrativos incluyen borato, fosfato, carbonato, tris, barbital, PIPES, HEPES, MES, ACES, MOPS, BICINE (por sus siglas en inglés, respectivamente), y similares. El medio también puede comprender agentes para prevenir la formación de coágulos de sangre. Tales agentes son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, EDTA, EGTA (por sus siglas en inglés, respectivamente), citrato, heparina y similares. Se pueden emplear diversos materiales auxiliares en los métodos anteriores. Por ejemplo, además de amortiguadores y preservativos, el medio puede comprender estabilizadores para el medio y para los reactivos empleados. El medio puede comprender un agente para mitigar el efecto de las proteínas de unión en la muestra donde las proteínas de unión se unen al fármaco hidrofóbico. Tales agentes pueden ser, por ejemplo, un éster del fármaco hidrofóbico a determinar. Por ejemplo, en una determinación de Tacrolimus, se puede incluir en el medio un éster de Tacrolimus. Todos los materiales anteriores están presentes en una concentración o cantidad suficiente para alcanzar el efecto o función deseados.

El medio se incuba bajo condiciones para la hemólisis de las células de la muestra y para la potenciación de la biodisponibilidad del fármaco hidrofóbico. El período de incubación puede ser de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 60 minutos, o de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 6 minutos, o de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 5 minutos, o de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 3 minutos, o de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 2 minutos, o de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 1 minuto, o de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 30 segundos, o de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 20 segundos, o de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 10 segundos, o de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 60 minutos, o de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 6 minutos, o de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 5 minutos, o de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 3 minutos, o de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 2 minutos, o de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 1 minuto, o de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 30 segundos, o de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 20 segundos, o de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 10 segundos, o de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 60 minutos, o de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 6 minutos, o de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 5 minutos, o de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 3 minutos, o de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 2 minutos, o de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 1 minuto, o de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 30 segundos, o de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 20 segundos, o de aproximadamente 20 segundos a aproximadamente 60 minutos, o de aproximadamente 20 segundos a aproximadamente 6 minutos, o de aproximadamente 20 segundos a aproximadamente 5 minutos, o de aproximadamente 20 segundos a aproximadamente 3 minutos, o de aproximadamente 20 segundos a aproximadamente 2 minutos, o de aproximadamente 20 segundos a aproximadamente 1 minuto, o de aproximadamente 20 segundos a aproximadamente 30 segundos, o de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 60 minutos, o de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 6 minutos, o de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 5 minutos, o aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 3 minutos, o de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 2 minutos, o de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 1 minuto, o de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 30 minutos, o de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 20 minutos, o de aproximadamente de 1 minuto a aproximadamente 10 minutos, o similares.

La temperatura durante la incubación es usualmente de aproximadamente 10°C a aproximadamente 45°C, o de aproximadamente 10°C a aproximadamente 35°C, o de aproximadamente 10°C a aproximadamente 25°C, o de aproximadamente 15°C a aproximadamente 45°C, o de aproximadamente 15°C a aproximadamente 35°C, o de aproximadamente 15°C a aproximadamente 25°C, o de aproximadamente 20°C a aproximadamente 45°C, o de aproximadamente 20°C a aproximadamente de 35°C, o de aproximadamente 20°C a aproximadamente de 25°C, o similares.

Descripción general de los ensayos para un fármaco hidrofóbico

Seguido del período de incubación anterior, se adicionan al medio reactivos para la determinación de la presencia y/o la cantidad del fármaco hidrofóbico en la muestra. La naturaleza de los reactivos depende del tipo particular de ensayo a realizar. En general, el ensayo es un método para la determinación o la medición de la presencia y/o la cantidad de un analito hidrofóbico. Varios métodos de ensayo se discuten a continuación a modo de ilustración y no de limitación.

En muchas realizaciones, los reactivos comprenden al menos un anticuerpo para el fármaco hidrofóbico. La frase “anticuerpo para el fármaco hidrofóbico” significa un anticuerpo que se une específicamente al fármaco hidrofóbico y no se une en ningún grado significativo a otras sustancias que distorsionarían el análisis del fármaco hidrofóbico.

Los anticuerpos específicos para un fármaco hidrofóbico para su uso en inmunoensayos pueden ser monoclonales o policlonales. Tales anticuerpos se pueden preparar por técnicas que son bien conocidas en la técnica, tales como la inmunización de un huésped y la recolección de sueros (policlonal), o por la preparación de líneas celulares híbridas continuas y la recolección de la proteína secretada (monoclonal), o por la clonación y expresión de secuencias de nucleótidos o versiones mutagenizadas de las mismas que codifican al menos las secuencias de aminoácidos requeridas para la unión específica de anticuerpos naturales.

Los anticuerpos pueden incluir una inmunoglobulina completa o un fragmento de la misma, inmunoglobulinas que incluyen las varias clases e isotipos, como IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3, IgM (por sus siglas en inglés, respectivamente), etc. Los fragmentos de las mismas pueden incluir Fab, Fv y F(ab')², Fab' (por sus siglas en inglés, respectivamente), y similares. Además, se pueden usar agregados, polímeros y conjugados de inmunoglobulinas o sus fragmentos cuando sea apropiado siempre que se mantenga la afinidad de unión por una molécula particular.

El antisuero que contiene anticuerpos (policlonal) se obtiene por técnicas bien establecidas que involucran la inmunización de un animal, tal como un conejo, cuyo o cabra, con un inmunógeno apropiado, y la obtención de antisueros de la sangre del animal inmunizado después de un período de espera adecuado. Las revisiones del estado de la técnica son proporcionadas por Parker, Radioimmunoassay of Biologically Active Compounds, Prentice-Hall (Englewood Cliffs, N.J., EE. UU., 1976), Butler, J. Immunol. Meth. 7: 1-24 (1975); Broughton and Strong, Clin. Chem. 22: 726-732 (1976); y Playfair, et al., Br. Med. Bull. 30: 24-31 (1974).

Los anticuerpos también se pueden obtener por técnicas de hibridación de células somáticas, tales anticuerpos siendo comúnmente referidos como anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se pueden producir de acuerdo con las técnicas estándar de Kohler y Milstein, Nature 265:495-497, 1975. Las revisiones de las técnicas de anticuerpos monoclonales se encuentran en Lymphocyte Hybridomas, ed. Melchers, et al. Springer-Verlag (Nueva York 1978), Nature 266: 495 (1977), Science 208: 692 (1980), and Methods of Enzymology 73 (Part B): 3-46 (1981).

En otro enfoque para la preparación de anticuerpos, la secuencia que codifica los sitios de unión del anticuerpo se puede escindir del ADN cromosómico e insertar en un vector de clonación, que se puede expresar en bacterias para producir proteínas recombinantes que tienen los sitios de unión correspondientes del anticuerpo.

Como se discutió anteriormente, un anticuerpo seleccionado para su uso en un inmunoensayo para un fármaco hidrofóbico, por ejemplo, se debería unir específicamente y preferentemente al fármaco hidrofóbico y a sus metabolitos farmacéuticamente activos sobre otros ligandos, tales como otros metabolitos o fármacos relacionados. Por ejemplo, un anticuerpo para Tacrolimus se debería unir específicamente y preferentemente a Tacrolimus sobre, por ejemplo, rapamicina. En general, un anticuerpo debería ser capaz de distinguir entre un fármaco hidrofóbico en relación con un segundo fármaco hidrofóbico. Al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, o al menos aproximadamente 20 veces, del primer fármaco hidrofóbico se unirá al anticuerpo si el anticuerpo se combina con una muestra que contiene el fármaco hidrofóbico. Si bien la unión también depende de la concentración relativa del fármaco hidrofóbico, la unión será más alta para el primer fármaco hidrofóbico si la constante de unión del primer fármaco hidrofóbico es mayor a la constante de unión del segundo fármaco hidrofóbico, al menos aproximadamente 10 veces más alta, o al menos aproximadamente 50 veces más alta, y hasta 1000 veces o más alta.

Se incluyen otros reactivos en el medio de ensayo dependiendo de la naturaleza del ensayo a llevar a cabo. Tales ensayos usualmente involucran reacciones entre parejas de unión, tal como un analito del fármaco hidrofóbico y un anticuerpo correspondiente, o la unión entre un anticuerpo y una pareja de unión correspondiente, tal como un segundo anticuerpo que se une al primer anticuerpo. En consecuencia, la pareja de unión puede ser una proteína, que puede ser un anticuerpo o un antígeno. La pareja de unión puede ser un miembro de un par de unión específica (“miembro sbp”, por sus siglas en inglés), que es una de dos moléculas diferentes, que tiene un área en la superficie o en una cavidad, que se une específicamente y, por lo tanto, se define como complementario con una organización espacial y polar particular de la otra molécula. Los miembros del par de unión específica usualmente serán miembros de un par inmunológico, tal como un antígeno-anticuerpo, aunque otros pares de unión específica, tales como biotina-avidina, hormonas-receptores de hormonas, enzima-sustrato, duplicados de ácido nucleico, IgG-proteína A, pares de polinucleótidos, tales como ADN-ADN, ADN-ARN, y similares, no son pares inmunológicos, pero están incluidos dentro del alcance del miembro sbp.

En consecuencia, la unión específica involucra el reconocimiento específico de una de dos moléculas diferentes por la otra en comparación con un reconocimiento sustancialmente menor de otras moléculas. Por otro lado, la unión no específica involucra la unión no covalente entre moléculas que es relativamente independiente de las estructuras superficiales específicas. La unión no específica puede resultar de varios factores, que incluyen las interacciones hidrofóbicas entre las moléculas. Las parejas de unión preferidas son los anticuerpos.

Se pueden emplear muchos tipos de inmunoensayos en los presentes métodos para determinar la presencia y/o la cantidad de un analito del fármaco hidrofóbico en una muestra que se sospecha que contiene tales analitos. Los inmunoensayos pueden involucrar reactivos etiquetados o no etiquetados. Los inmunoensayos que involucran los reactivos no etiquetados usualmente comprenden la formación de complejos relativamente grandes que involucran uno o más anticuerpos. Tales ensayos incluyen, por ejemplo, métodos de inmunoprecipitina y aglutinación, y técnicas de dispersión de luz correspondientes, tales como, por ejemplo, nefelometría y turbidimetría, para la detección de complejos de anticuerpos. Los inmunoensayos etiquetados incluyen inmunoensayos enzimáticos, inmunoensayos de polarización de fluorescencia, radioinmunoensayos, ensayos de inhibición, luminiscencia inducida, ensayos de canalización de oxígeno fluorescente, y así sucesivamente.

En muchos de los ensayos discutidos en la presente, se emplea una etiqueta; la etiqueta es usualmente parte de un sistema de producción de señales (“sps”, por sus siglas en inglés). La naturaleza de la etiqueta es dependiente del formato de ensayo particular. Un sps usualmente incluye uno o más componentes, siendo al menos un componente una etiqueta detectable, que genera una señal detectable que se relaciona con la cantidad de etiqueta unida y/o no unida, es decir, la cantidad de etiqueta unida o no unida al fármaco hidrofóbico siendo detectado, o a un agente que refleja la cantidad del fármaco hidrofóbico a detectar. La etiquetar es cualquier molécula que produce o puede ser inducida para producir una señal, y puede ser, por ejemplo, un fluorescente, una radioetiqueta, una enzima, un quimioluminiscente o un fotosensibilizador. Así, la señal se detecta y/o se mide detectando actividad enzimática, luminiscencia, absorbancia de luz o radiactividad, y así sucesivamente, como sea el caso.

Las etiquetas adecuadas incluyen, a modo de ilustración y no de limitación, enzimas, tales como fosfatasa alcalina, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (“G6PDH”, por sus siglas en inglés) y peroxidasa de rábano picante; ribozima; un sustrato para una replicasa, tal como replicasa QB (por sus siglas en inglés); promotores; tintes; fluorescentes, tales como fluoresceína, isotiocianato, compuestos de rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina; complejos, tales como los preparados de CdSe y ZnS presentes en nanocristales semiconductores conocidos como puntos cuánticos; quimioluminiscentes, tales como isoluminol; sensibilizadores; coenzimas; sustratos enzimáticos; radioetiquetas, tales como 125l, 1311, 14C, 3H, 57Co y 75Se; partículas, tales como partículas de látex, partículas de carbono, partículas de metal que incluyen partículas magnéticas, por ejemplo, partículas de cromo, y similares; sol metálico; cristalito; liposomas; células, etc., que se pueden etiquetar además con un tinte, catalizador u otro grupo detectable. Las enzimas y coenzimas adecuadas se divulgan en Litman, et al., patente de EE. UU. No. 4,275,149, columnas 19-28, y Boguslaski, et al., patente de EE. UU. No. 4,318,980, columnas 10-14; los fluorescentes y quimioluminiscentes adecuados se divulgan en Litman, et al., patente de EE. UU. No. 4,275,149, columnas 30 y 31.

La etiqueta puede producir directamente una señal y, por lo tanto, no se requieren componentes adicionales para producir una señal. Numerosas moléculas orgánicas, por ejemplo, los fluorescentes, son capaces de absorber la luz ultravioleta y visible, donde la absorción de luz transfiere energía a estas moléculas y las eleva a un estado de energía excitado. Esta energía absorbida posteriormente se disipa por la emisión de luz a una segunda longitud de onda. Otras etiquetas que producen directamente una señal incluyen tintes e isótopos radiactivos.

Alternativamente, la etiqueta puede necesitar otros componentes para producir una señal, y el sistema de producción de señales incluiría entonces todos los componentes necesarios para producir una señal medible. Tales otros componentes pueden incluir sustratos, coenzimas, potenciadores, enzimas adicionales, sustancias que reaccionan con productos enzimáticos, catalizadores, activadores, cofactores, inhibidores, depuradores, iones metálicos y una sustancia de unión específica requerida para la unión de sustancias generadoras de señales. Se puede encontrar una discusión detallada de los sistemas de producción de señales adecuados en Ullman, et al., patente de EE. UU. No. 5,185,243, columnas 11-13.

La etiqueta u otros miembros sps se pueden unir a un soporte. Un derivado o análogo del fármaco hidrofóbico se puede unir a un soporte sólido de cualquier manera conocida en la técnica, siempre que la unión no interfiera sustancialmente con la capacidad de los análogos para unirse con un anticuerpo. En algunas realizaciones, el derivado o análogo del fármaco hidrofóbico se puede recubrir o unir covalentemente directamente a la fase sólida o puede tener capas de una o más moléculas portadoras, tales como poli(aminoácidos) que incluyen proteínas, tales como albúminas séricas o inmunoglobulinas, o polisacáridos (carbohidratos), tales como, por ejemplo, dextrano o derivados de dextrano. También se pueden usar grupos de enlace para acoplar covalentemente el soporte sólido y el fármaco hidrofóbico. También son posibles otros métodos de unión de los derivados de fármacos hidrofóbicos. Por ejemplo, un soporte sólido puede tener un recubrimiento de un aglutinante para una molécula pequeña, tal como, por ejemplo, avidina, un anticuerpo, etc., y se puede unir una molécula pequeña, tal como, por ejemplo, biotina, hapteno, etc., al derivado hidrofóbico del fármaco o viceversa. La unión de componentes a la superficie de un soporte puede ser directa o indirecta, covalente o no covalente, y se puede lograr por técnicas bien conocidas, comúnmente disponibles en la literatura. Ver, por ejemplo, “Immobilized Enzymes”, Ichiro Chibata, Halsted Press, Nueva York (1978) y Cautrecasas, J. Biol. Chem., 245:3059 (1970).

El soporte puede estar compuesto por un material orgánico o inorgánico, sólido o fluido, insoluble en agua, que puede ser transparente o parcialmente transparente. El soporte puede tener cualquiera de varias geometrías, tales como partículas, incluidas perlas, películas, membranas, tubos, pozos, tiras, varillas, superficies planas, tales como, por ejemplo, placas, DENDRíMe ROS, y similares. Dependiendo del tipo de ensayo, el soporte puede ser o no ser suspendible en el medio en el cual se emplea. Los ejemplos de soportes suspendibles son materiales poliméricos, tales como látex, bicapas lipídicas o liposomas, gotas de aceite, células e hidrogeles, partículas magnéticas, y similares. Otras composiciones de soporte incluyen polímeros, tales como nitrocelulosa, acetato de celulosa, policloruro de vinilo, poliacrilamida, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli-4-metilbuteno, poliestireno, polimetacrilato, politereftalato de etileno, nailon, polibutirato de vinilo, etc.; ya sea por sí mismos o en conjunto con otros materiales.

El soporte puede ser una partícula. Las partículas deben tener un diámetro promedio de al menos aproximadamente 0,02 micrómetros y no mayor de aproximadamente 100 micrómetros. En algunas realizaciones, las partículas tienen un diámetro promedio de aproximadamente 0,05 micrómetros a aproximadamente 20 micrómetros, o de aproximadamente 0,3 micrómetros a aproximadamente 10 micrómetros. La partícula puede ser orgánica o inorgánica, hinchable o no hinchable, porosa o no porosa, preferiblemente de una densidad que se aproxime a la del agua, generalmente de aproximadamente 0,7 g/mL a aproximadamente 1,5 g/mL, y compuesta de material que puede ser transparente, parcialmente transparente, u opaco. Las partículas pueden ser materiales biológicos, tales como células y microorganismos, por ejemplo, eritrocitos, leucocitos, linfocitos, hibridomas, Streptococcus, Staphylococcus aureus, E. coli, virus y similares. Las partículas también pueden ser partículas compuestas por polímeros orgánicos e inorgánicos, liposomas, partículas de látex, partículas magnéticas o no magnéticas, vesículas de fosfolípidos, quilomicrones, lipoproteínas, y similares. En algunas realizaciones, las partículas son partículas de cromo o partículas de látex.

Las partículas de polímero pueden estar formadas por polímeros de adición o de condensación. Las partículas serán fácilmente dispersables en un medio acuoso y se pueden adsorber o funcionalizar para permitir la conjugación con un análogo del fármaco hidrofóbico, ya sea directamente o indirectamente a través de un grupo de enlace. Las partículas también se pueden derivar de materiales que ocurren naturalmente, materiales que ocurren naturalmente modificados sintéticamente, y materiales sintéticos. Entre los polímeros orgánicos de particular interés están los polisacáridos, particularmente los polisacáridos reticulados, tales como agarosa, que está disponible como Sepharose, dextrano, disponible como Sephadex y Sephacryl, celulosa, almidón, y similares; polímeros de adición, tales como poliestireno, alcohol polivinílico, homopolímeros y copolímeros de derivados de acrilato y metacrilato, particularmente ésteres y amidas que tienen funcionalidades de hidroxilos libres, y similares.

La etiqueta y/u otro miembro sps se puede unir a un miembro sbp o a otra molécula. Por ejemplo, la etiqueta se puede unir covalentemente a un miembro sbp, tal como, por ejemplo, un anticuerpo; un receptor para un anticuerpo, un receptor que es capaz de unirse a una molécula pequeña conjugada con un anticuerpo o un análogo de ligando. La unión de la etiqueta al miembro sbp se puede lograr por reacciones químicas que resultan en la sustitución de un átomo de hidrógeno de la etiqueta con una unión al miembro sbp, o puede incluir un grupo de enlace entre la etiqueta y el miembro sbp. Otros miembros sps también se pueden unir covalentemente a miembros sbp. Por ejemplo, dos miembros sps, tales como un fluorescente y un silenciador, se pueden unir cada uno a un anticuerpo diferente que forma un complejo específico con el analito. La formación del complejo hace que el fluorescente y el silenciador estén en una proximidad cercana, permitiendo así que el silenciador interactúe con el fluorescente para producir una señal. Los métodos de conjugación son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Rubenstein, et al., patente de EE. UU. No. 3,817,837.

Las enzimas de particular interés como proteínas de etiqueta son las enzimas rédox, particularmente las deshidrogenasas, tales como la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, la lactato deshidrogenasa, etc., y las enzimas que involucran la producción de peróxido de hidrógeno y el uso del peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte a un tinte. Las combinaciones particulares incluyen oxidasas de sacáridos, por ejemplo, glucosa y galactosa oxidasa, u oxidasas heterocíclicas, tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea el peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte, es decir, una peroxidasa, tal como peroxidasa de rábano picante, lactoperoxidasa, o microperoxidasa. En la técnica se conocen combinaciones de enzimas adicionales. Cuando se usa una enzima única como una etiqueta, otras pueden encontrar un uso, tales como hidrolasas, transferasas y oxidorreductasas, preferiblemente hidrolasas, tales como fosfatasa alcalina y beta-galactosidasa. Alternativamente, se pueden usar luciferasas, tales como luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana.

Las coenzimas ilustrativas que encuentran un uso incluyen NAD[H], NADP[H] (por sus siglas en inglés, respectivamente), fosfato de piridoxal, FAD[H], FMN[H] (por sus siglas en inglés, respectivamente), etc., usualmente coenzimas que involucran reacciones cíclicas. Ver, por ejemplo, la patente de EE. UU. No. 4,318,980.

Con proteínas de etiqueta, tales como, por ejemplo, enzimas, el rango de peso molecular será de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 600.000, o de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 300.000 de peso molecular.

Usualmente hay al menos aproximadamente 1 análogo del fármaco hidrofóbico por aproximadamente 200.000 de peso molecular, o al menos aproximadamente 1 por aproximadamente 150.000 de peso molecular, o al menos aproximadamente 1 por aproximadamente 100.000 de peso molecular, o al menos aproximadamente 1 por aproximadamente 50.000 de peso molecular, y así sucesivamente. En el caso de las enzimas, el número de grupos análogos de fármacos hidrofóbicos es normalmente de 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 2 a aproximadamente 15, de aproximadamente 3 a aproximadamente 12, o de aproximadamente 6 a aproximadamente 10.

El término «etiquetas de no poliaminoácidos” incluye aquellas etiquetas que no son proteínas (por ejemplo, enzimas). La etiqueta de no poliaminoácido se puede detectar directamente o es detectable a través de una reacción de unión específica que produce una señal detectable. Las etiquetas de no poliaminoácidos incluyen, por ejemplo, radioisótopos, compuestos luminiscentes, soportes, por ejemplo, partículas, placas, perlas, etc., polinucleótidos, y similares. Más particularmente, la etiqueta de no poliaminoácido puede ser isotópica o no isotópica, usualmente no isotópica, y puede ser un polinucleótido que codifica un catalizador, promotor, tinte, coenzima, sustrato enzimático, grupo radiactivo, una molécula pequeña orgánica (que incluye, por ejemplo, biotina, moléculas fluorescentes, moléculas quimioluminiscentes, y similares), secuencia polinucleotídica amplificable, un soporte, tal como, por ejemplo, una partícula, tal como látex o partículas de carbono o partículas de dióxido de cromo (cromo), o similares, sol metálico, cristalito, liposoma, célula, etc., que puede o no estar etiquetada adicionalmente con un tinte, catalizador u otro grupo detectable, y similares.

Un grupo general de inmunoensayos que se pueden emplear incluye inmunoensayos que usan una concentración limitada del anticuerpo. Otro grupo de inmunoensayos involucra el uso de un exceso de uno o más de los reactivos principales, tal como, por ejemplo, un exceso de un anticuerpo para el fármaco inmunosupresor. Otro grupo de inmunoensayos son los ensayos homogéneos libres de separación en los cuales los reactivos marcados modulan la señal de la etiqueta en reacciones hidrofóbicas de unión de fármaco-anticuerpo. Otro grupo de ensayos incluye ensayos competitivos limitados con reactivos de anticuerpos etiquetados para fármacos hidrofóbicos que evitan el uso de haptenos problemáticos etiquetados. En este tipo de ensayo, el analito del fármaco hidrofóbico inmovilizado en la fase sólida está presente en una cantidad constante y limitada. La partición de una etiqueta entre el analito del fármaco hidrofóbico inmovilizado y el analito libre de fármaco hidrofóbico depende de la concentración del analito en la muestra.

Los ensayos se pueden realizar sin separación (homogéneos) o con separación (heterogéneos) de cualquiera de los componentes o productos del ensayo. Los inmunoensayos homogéneos se ejemplifican por el ensayo EMIT® (por sus siglas en inglés), (Syva Company, San José, CA) divulgado en Rubenstein, et al., patente de EE. UU. No. 3,817,837, columna 3, línea 6 a columna 6, línea 64; métodos de inmunofluorescencia, tales como los divulgados en Ullman, et al., patente de EE. UU. No. 3,996,345, columna 17, línea 59, a columna 23, línea 25; inmunoensayos de canalización enzimática (“ECIA”, por sus siglas en inglés), tales como los divulgados en Maggio et al., patente de EE. UU. No.

4,233,402, columna 6, línea 25 a columna 9, línea 63; inmunoensayo de polarización de fluorescencia (“FPIA”, por sus siglas en inglés) como se divulga, por ejemplo, en, entre otros, la patente de EE. UU. No. 5,354,693; y así sucesivamente.

Otros inmunoensayos enzimáticos son el inmunoensayo mediado por modulación enzimática (“EMMIA”, por sus siglas en inglés) discutido por Ngo y Lenhoff, FEBS Lett. (1980) 116:285-288; inmunoensayo de fluorescencia marcado con sustrato (“SLFIA”, por sus siglas en inglés) divulgado por Oellerich, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. (1984) 22:895-904; inmunoensayos combinados de donador de enzimas (“CEDIA”, por sus siglas en inglés) divulgados por Khanna, et al., Clin. Chem. Acta (1989) 185:231-240; inmunoensayos marcados con partículas homogéneas, tales como inmunoensayos de inhibición turbidimétrica potenciados por partículas (“PETINIA”, por sus siglas en inglés), inmunoensayos turbidimétricos potenciados por partículas (“PETIA”, por sus siglas en inglés), etc.; y similares.

Otros ensayos incluyen el inmunoensayo de partículas sol (“SPIA”, por sus siglas en inglés), inmunoensayo de tinte disperso (“DIA”, por sus siglas en inglés); metaloinmunoensayo (“MIA”, por sus siglas en inglés); inmunoensayos enzimáticos de membrana (“EMIA”, por sus siglas en inglés); luminoinmunoensayos (“LIA”, por sus siglas en inglés); y así sucesivamente. Otros tipos de ensayos incluyen ensayos de inmunosensores que involucran el monitoreo de los cambios en las propiedades ópticas, acústicas y eléctricas de una superficie inmovilizada con anticuerpos tras la unión de un fármaco hidrofóbico. Tales ensayos incluyen, por ejemplo, ensayos de inmunosensores ópticos, ensayos de inmunosensores acústicos, ensayos de inmunosensores de semiconductores, ensayos de inmunosensores de transductores electroquímicos, ensayos de inmunosensores potenciométricos, ensayos de electrodos amperométricos, y similares.

En algunas realizaciones de ensayos que se pueden usar en los presentes métodos, se adiciona al medio un análogo del fármaco hidrofóbico. Un análogo del fármaco hidrofóbico es un fármaco modificado que puede competir con el fármaco hidrofóbico análogo por un receptor, la modificación proporciona los medios para juntar un análogo del fármaco hidrofóbico a otra molécula. El análogo del fármaco hidrofóbico diferirá usualmente del fármaco hidrofóbico en más que el remplazo de un hidrógeno por una unión que enlaza el análogo del fármaco a un concentrador o una etiqueta, pero no necesariamente. El análogo del fármaco hidrofóbico se une al receptor de una manera similar a la unión del fármaco hidrofóbico al receptor. El análogo del fármaco hidrofóbico puede ser, por ejemplo, el fármaco hidrofóbico conjugado con otra molécula a través de un grupo de enlace, un anticuerpo dirigido contra el idiotipo de un anticuerpo al fármaco hidrofóbico, y así sucesivamente.

En una realización, el ensayo es un inmunoensayo de luminiscencia inducida, que se describe en la patente de EE. UU.

No. 5,340,716 (Ullman, et al.) titulada “Método de ensayo que usa una etiqueta quimioluminiscente fotoactivada” (“ensayo de luminiscencia inducida”). En un enfoque, el ensayo usa una partícula que incorpora un fotosensibilizador y una partícula de etiqueta que incorpora un compuesto quimioluminiscente. La partícula de etiqueta se conjuga con un miembro sbp, por ejemplo, un anticuerpo para el fármaco hidrofóbico que es capaz de unirse al analito del fármaco hidrofóbico para formar un complejo, o a un segundo miembro sbp para formar un complejo, en relación con la presencia del analito del fármaco hidrofóbico. Si el analito del fármaco hidrofóbico está presente, el fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente están en una proximidad cercana. El fotosensibilizador genera un oxígeno singulete y activa el compuesto quimioluminiscente cuando las dos etiquetas están en una proximidad cercana. El compuesto quimioluminiscente activado subsecuentemente produce luz. La cantidad de luz producida se relaciona con la cantidad del complejo formado que, a su vez, se relaciona con la cantidad de analito del fármaco hidrofóbico presente.

A modo de ilustración adicional, se emplean partículas quimioluminiscentes, que comprenden el compuesto quimioluminiscente asociado con las mismas, tal como por incorporación o unión a las mismas. Un miembro sbp que se une al analito del fármaco hidrofóbico, tal como, por ejemplo, un anticuerpo para un fármaco hidrofóbico se une a un polisacárido que recubre las partículas. Un segundo miembro sbp que se une al analito del fármaco hidrofóbico es parte de un conjugado de biotina. La estreptavidina se conjuga con un segundo conjunto de partículas que tienen un fotosensibilizador asociado a las mismas. La unión de la estreptavidina a este segundo conjunto de partículas (partículas fotosensibilizadoras) puede o no involucrar un polisacárido en las partículas. Las partículas quimioluminiscentes se mezclan con una muestra que se sospecha que contiene un analito del fármaco hidrofóbico y las partículas fotosensibilizadoras. El medio de reacción se incuba para permitir que las partículas se unan al analito del fármaco hidrofóbico en virtud de la unión de los miembros sbp al analito del fármaco hidrofóbico. Posteriormente, el medio se irradia con luz para excitar el fotosensibilizador, que es capaz en su estado excitado de activar el oxígeno a un estado de singulete. Debido a que el compuesto quimioluminiscente de uno de los conjuntos de partículas está ahora en una proximidad cercana al fotosensibilizador en virtud de la presencia del analito del fármaco hidrofóbico, éste es activado por el oxígeno singulete y emite luminiscencia. Posteriormente, se examina el medio para la presencia y/o la cantidad de luminiscencia o luz emitida, la presencia del mismo se relaciona con la presencia y/o la cantidad del analito del fármaco hidrofóbico.

Otro ejemplo particular de un ensayo que se puede emplear para la determinación de un analito del fármaco hidrofóbico se discute en la patente de EE. UU. No. 5,616,719 (Davalian, et al.), que describe inmunoensayos de canalización de oxígeno fluorescente.

En algunas realizaciones, se pueden usar inmunoensayos de analitos múltiples en los que el analito del fármaco hidrofóbico puede ser el objeto de detección junto con uno o más de otros analitos, tales como otros fármacos, y similares. Tales sistemas de múltiples analitos se describen, por ejemplo, en Loor, et al., J. Anal. Toxicol. 12: 299 (1988).

Los ensayos discutidos anteriormente normalmente se llevan a cabo en un medio acuoso amortiguado a un pH moderado, generalmente que proporciona una sensibilidad de ensayo óptima. El medio acuoso puede ser solamente agua o puede incluir de 0,1 a aproximadamente 40 por ciento en volumen de un codisolvente. El pH del medio estará usualmente en el rango de 4 a 11, más usualmente en el rango de 5 a 10, y preferiblemente en el rango de 6,5 a 9,5. El pH usualmente será un compromiso entre la unión óptima de los miembros de unión de cualquier par de unión específico, el pH óptimo para otros reactivos del ensayo, tales como los miembros del sistema de producción de señales, y así sucesivamente.

Se pueden usar varios amortiguadores para lograr el pH deseado y conservar el pH durante la determinación. Los amortiguadores ilustrativos incluyen borato, fosfato, carbonato, TRIS (por sus siglas en inglés), barbital, y similares. El amortiguador particular empleado no es crítico, pero en un ensayo individual se puede preferir uno u otro amortiguador. Se pueden emplear diversos materiales auxiliares en los métodos anteriores. Por ejemplo, además de los amortiguadores, el medio puede comprender estabilizadores para el medio y para los reactivos empleados. Frecuentemente, además de estos aditivos, se pueden incluir proteínas, tales como albúminas; disolventes orgánicos, tales como formamida; sales de amonio cuaternario; polianiones, tales como sulfato de dextrano; potenciadores de unión, por ejemplo, polialquilenglicoles; o similares.

Se pueden aplicar uno o más períodos de incubación al medio en uno o más intervalos que incluyen cualquier intervalo entre las adiciones de varios reactivos mencionados anteriormente. El medio se incuba usualmente a una temperatura y por un tiempo suficiente para que ocurra la unión de varios componentes de los reactivos. Normalmente se emplean temperaturas moderadas para llevar a cabo el método y usualmente a temperatura constante, preferiblemente a temperatura ambiente, durante el período de la medición. Las temperaturas de incubación están normalmente en el rango de aproximadamente 5°C a aproximadamente 99°C, usualmente de aproximadamente 15°C a aproximadamente 70°C, más usualmente de aproximadamente 20°C a aproximadamente 45°C. El período de tiempo para la incubación es de aproximadamente 0,2 segundos a aproximadamente 24 horas, o de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 6 horas, o de aproximadamente 2 segundos a aproximadamente 1 hora, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 15 minutos. El período de tiempo depende de la temperatura del medio y de la tasa de unión de los varios reactivos, que está determinada por la constante de la tasa de asociación, la concentración, la constante de unión y la constante de la tasa de disociación. Las temperaturas durante las mediciones están generalmente en el rango de aproximadamente 10 a aproximadamente 50°C, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 40°C.

La concentración de analito que se puede ensayar generalmente varía de aproximadamente 10-5 a aproximadamente 10­ 17 M, más usualmente de aproximadamente 10-6 a aproximadamente 10-14 M. Las consideraciones, tales como si el ensayo es cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo (en relación con la cantidad de analito del fármaco hidrofóbico presente en la muestra), la técnica de detección particular y la concentración del analito normalmente determinan las concentraciones de los diversos reactivos.

Las concentraciones de los varios reactivos en el medio del ensayo generalmente estarán determinadas por el rango de concentración de interés del analito del fármaco hidrofóbico, la naturaleza del ensayo, y similares. Sin embargo, la concentración final de cada uno de los reactivos normalmente se determina empíricamente para optimizar la sensibilidad del ensayo a lo largo del rango. Es decir, una variación en la concentración del analito del fármaco hidrofóbico que es significativa debería proporcionar una diferencia de señal medible con exactitud. Las consideraciones, tales como la naturaleza del sistema productor de señales y la naturaleza de los analitos normalmente determinan las concentraciones de los varios reactivos.

Si bien el orden de adición puede variar ampliamente, habrá ciertas preferencias dependiendo de la naturaleza del ensayo. El orden de adición más simple es adicionar todos los materiales simultáneamente y determinar el efecto que el medio de ensayo tiene sobre la señal como en un ensayo homogéneo. Alternativamente, los reactivos se pueden combinar secuencialmente. Opcionalmente, puede estar involucrada un paso de incubación subsecuente a cada adición, como se discutió anteriormente.

Paso de examinación

En el siguiente paso del método de acuerdo con la presente divulgación, se examina el medio para la presencia de un complejo que comprende el fármaco hidrofóbico y el anticuerpo para el fármaco hidrofóbico. La presencia y/o la cantidad del complejo indica la presencia y/o la cantidad del fármaco hidrofóbico en la muestra.

La frase “medición de la cantidad de un analito del fármaco hidrofóbico” se refiere a la determinación cuantitativa, semicuantitativa y cualitativa del analito del fármaco hidrofóbico. Los métodos que son cuantitativos, semicuantitativos y cualitativos, así como todos los otros métodos para la determinación del analito del fármaco hidrofóbico, se consideran métodos para la medición de la cantidad del analito del fármaco hidrofóbico. Por ejemplo, un método que simplemente detecta la presencia o ausencia del analito del fármaco hidrofóbico en una muestra que se sospecha que contiene el analito del fármaco hidrofóbico, se considera incluido dentro del alcance de la presente divulgación.

Los términos “detección” y “determinación”, así como otros sinónimos comunes para la medición, se contemplan dentro del alcance de la presente divulgación.

En muchas realizaciones, la examinación del medio involucra la detección de una señal del medio. La presencia y/o la cantidad de la señal se relaciona con la presencia y/o la cantidad del fármaco hidrofóbico en la muestra. El modo particular de detección depende de la naturaleza de los sps. Como se discutió anteriormente, existen numerosos métodos por los cuales una etiqueta de un sps puede producir una señal detectable por medios externos, deseablemente por una examinación visual, e incluyen, por ejemplo, radiación electromagnética, electroquímica, calor, detección de radiactividad, reactivos químicos, etc.

La activación de un sistema productor de señales depende de la naturaleza de los miembros del sistema productor de señales. Para aquellos miembros de un sistema de producción de señales que se activan con luz, el miembro se irradia con luz. Para los miembros de los sistemas productores de señales que se encuentran en la superficie de una partícula, la adición de una base puede resultar en la activación. A los expertos en la técnica se les sugerirán otros métodos de activación en vista de las divulgaciones de la presente. Para algunos sistemas que producen señales, no es necesario ningún agente para la activación, tales como aquellos sistemas que involucran una etiqueta que es una etiqueta radiactiva, una enzima, y así sucesivamente. Para sistemas enzimáticos, puede ser necesaria la adición de un sustrato y/o de un cofactor.

La examinación de la presencia y/o la cantidad de la señal también incluye la detección de la señal, que generalmente es simplemente un paso en el cual la señal se lee. La señal normalmente se lee usando un instrumento, cuya naturaleza depende de la naturaleza de la señal. El instrumento puede ser un espectrofotómetro, un fluorómetro, un espectrómetro de absorción, un luminómetro, un quimioluminómetro, un actinómetro, un instrumento fotográfico, y similares. La presencia y la cantidad de señal detectada se relaciona con la presencia y la cantidad del compuesto del fármaco hidrofóbico presente en una muestra. Las temperaturas durante las mediciones generalmente están en el rango de aproximadamente 10°C a aproximadamente 70°C, o de aproximadamente 20°C a aproximadamente 45°C, o de aproximadamente 20°C a aproximadamente 25°C. En un enfoque, las curvas estándar se forman usando concentraciones conocidas de los analitos que se van a explorar. Como se discutió anteriormente, también se pueden usar calibradores y otros controles.

Realizaciones específicas de ensayos

En un ensayo homogéneo, una vez combinados todos los reactivos, se determina la señal y se relaciona con la cantidad del analito en la muestra. Por ejemplo, en un ensayo EMIT para un fármaco hidrofóbico, una muestra que se sospecha que contiene el fármaco hidrofóbico se combina en un medio acuoso de simultáneamente o secuencialmente con un conjugado enzimático del fármaco hidrofóbico, es decir, un análogo del fármaco hidrofóbico y el anticuerpo capaz de reconocer el fármaco hidrofóbico. Generalmente, se adiciona un sustrato para la enzima, lo que resulta en la formación de un producto cromogénico o fluorogénico tras la reacción catalizada por la enzima. Las enzimas preferidas son glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y fosfatasa alcalina, pero se pueden emplear otras enzimas. El analito del fármaco hidrofóbico y los restos del conjugado enzimático compiten por los sitios de unión en el anticuerpo. Posteriormente, se determina la actividad enzimática en el medio, usualmente por medios espectrofotométricos, y se compara con la actividad enzimática determinada cuando se analizan calibradores o muestras de referencia en las que está presente una cantidad conocida del fármaco hidrofóbico. Típicamente, los calibradores se prueban de manera similar a la prueba de la muestra que se sospecha que contiene los analitos hidrofóbicos del fármaco. Los calibradores típicamente contienen concentraciones diferentes, pero conocidas, del analito del fármaco hidrofóbico a determinar. Preferiblemente, los rangos de concentración presentes en los calibradores abarcan el rango de concentraciones que se sospechan de analito del fármaco hidrofóbico en muestras desconocidas.

Los ensayos antes mencionados se pueden llevar a cabo usando glucosa-6-fosfato deshidrogenasa mutante como la enzima del conjugado enzimático. Esta enzima mutante se describe en las patentes de EE. UU. No. 6,090,567 y 6,033,890. Además, el ensayo se puede llevar a cabo usando anticuerpos para el fármaco hidrofóbico y usando procedimientos como los divulgados en las patentes de EE. UU. No. 5,328,828 y 5,135,863.

Los ensayos heterogéneos usualmente involucran uno o más pasos de separación y pueden ser competitivos o no competitivos. Una variedad de formatos de ensayo competitivos y no competitivos se divulgan en Davalian, et al., patente de EE. UU. No. 5,089,390, columna 14, línea 25 a columna 15, línea 9. En un tipo de ensayo competitivo, un soporte, como se discute en la presente, que tiene anticuerpos para el fármaco hidrofóbico unido al mismo, se contacta con un medio que contiene la muestra y los conjugados enzimáticos apropiados del fármaco hidrofóbico. Después de separar el soporte y el medio, la actividad enzimática del soporte o del medio se determina por técnicas convencionales y se relaciona con la presencia y/o la cantidad del fármaco hidrofóbico en la muestra.

En determinadas realizaciones, se puede emplear una segunda enzima además de la enzima del conjugado de enzima. Las enzimas del par de enzimas están relacionadas porque un producto de la primera enzima sirve como sustrato para la segunda enzima.

Otra realización de un formato de ensayo es un ensayo de captura. En este formato de ensayo, el anticuerpo para el fármaco hidrofóbico se une covalentemente a una partícula magnética. La muestra se incuba con estas partículas para permitir que el fármaco hidrofóbico de la muestra se una a los anticuerpos del fármaco hidrofóbico. Subsecuentemente, se incuba con las partículas magnéticas una enzima que tiene el fármaco hidrofóbico o un derivado del fármaco hidrofóbico unido covalentemente. Después del lavado, se mide la cantidad de enzima que se une a las partículas magnéticas y se relaciona inversamente con la presencia y/o la cantidad del fármaco hidrofóbico en la muestra.

La selección de Tacrolimus como fármaco hidrofóbico es a modo de ilustración y no de limitación, ya que la presente invención tiene una aplicación general para la detección de fármacos hidrofóbicos en general, y fármacos inmunosupresores en particular.

En una realización, la muestra de prueba o un estándar de Tacrolimus se mezcla con un conjugado de Tacrolimus, es decir, un análogo de Tacrolimus que se une a la biotina. Se permite que el Tacrolimus de la muestra de ensayo y el análogo de Tacrolimus compitan por unirse al anticuerpo por el Tacrolimus, que es capaz de unirse a Tacrolimus o al análogo de Tacrolimus. Después de enjuagar con un amortiguador de lavado apropiado, se puede adicionar al medio una molécula de detección que consiste en estreptavidina o avidina conjugada con una enzima, una molécula fluorescente o quimioluminiscente o un resto radiactivo, que posteriormente se examina para la presencia y/o la cantidad de señal. La presencia y/o la cantidad de señal se relaciona con la presencia y/o la cantidad de Tacrolimus.

En una realización, el ensayo empleado es un ensayo de luminiscencia inducida como se describe anteriormente. Los reactivos incluyen dos reactivos de perlas de látex y un anticuerpo monoclonal de ratón anti-Tacrolimus biotinilado. El primer reactivo de perlas está recubierto con Tacrolimus o un análogo de Tacrolimus y contiene un tinte quimioluminiscente. El segundo reactivo de perlas está recubierto con estreptavidina y contiene un tinte fotosensibilizador. En un primer paso, la muestra que se sospecha que contiene Tacrolimus se incuba con anticuerpo biotinilado para Tacrolimus, lo que permite que el Tacrolimus de la muestra sature una fracción del anticuerpo biotinilado que está directamente relacionado con la concentración de Tacrolimus. En un segundo paso, se adiciona el primer reactivo de perlas y lleva a la formación de inmunocomplejos de perlas/anticuerpo biotinilado con la fracción no saturada del anticuerpo biotinilado. Posteriormente, se adiciona el segundo reactivo de perlas y se une a la biotina para formar inmunocomplejos de pares de perlas. Cuando se ilumina con una luz a 680 nm, la segunda perla de reactivo convierte el oxígeno disuelto en la solución de reacción en la forma más energética de oxígeno singulete. En los pares de perlas, el oxígeno singulete se difunde en el primer reactivo de perlas desencadenando así una reacción quimioluminiscente. La señal quimioluminiscente resultante se mide a 612 nm y es una función inversa de la concentración de Tacrolimus en la muestra. La cantidad de esta señal se relaciona con la presencia y/o la cantidad de Tacrolimus en la muestra.

Un ejemplo específico de otro formato de ensayo es ACMIA (inmunoensayo mediado por columna de afinidad). Para el formato de ensayo ACMIA, se emplean como primer componente partículas de cromo, que están recubiertas con Tacrolimus o un análogo de Tacrolimus. Un segundo componente es un anticuerpo para Tacrolimus. Este anticuerpo, reticulado con una enzima reportera (por ejemplo, beta-galactosidasa), se adiciona a un recipiente de reacción en una cantidad en exceso, es decir, una cantidad mayor que la requerida para unir todo el analito que podría estar presente en una muestra. El conjugado del anticuerpo-enzima se mezcla con una muestra que se sospecha que contiene Tacrolimus para permitir que el analito de Tacrolimus se una al anticuerpo. A continuación, se adiciona el reactivo de cromo para unir cualquier exceso de conjugado del anticuerpo-enzima. Posteriormente, se aplica un imán, que extrae todo el cromo y el exceso de anticuerpo-enzima de la suspensión, y el sobrenadante se transfiere a un contenedor de reacción final. El sustrato de la enzima reportera se adiciona al contenedor de reacción final y la actividad de la enzima se mide espectrofotométricamente como un cambio en la absorbancia a lo largo del tiempo. La cantidad de esta señal se relaciona con la presencia y/o la cantidad de Tacrolimus en la muestra.

En un formato de ensayo tipo sándwich, se emplean un primer reactivo que comprende partículas de cromo recubiertas con anticuerpos anti-Tacrolimus y un segundo reactivo que comprende un segundo anticuerpo (o proteína de unión) para el primer anticuerpo conjugado con una enzima reportera. En este formato, la muestra que se sospecha que contiene Tacrolimus se incuba con las partículas de cromo para que todo el Tacrolimus, si está presente en la muestra, se una a las partículas de cromo. Las partículas de cromo se lavan, se usa un imán para separar el analito unido del sobrenadante. Posteriormente, el segundo reactivo, es decir, el anticuerpo (o la proteína de unión) conjugado con una enzima reportera, se incuba con las partículas de cromo para formar un “sándwich”. Después del lavado, se mide la cantidad de enzima que se une al cromo y se relaciona con la presencia y/o la cantidad de Tacrolimus en la muestra.

Otro formato de ensayo es EMIT® (Tecnología de inmunoensayo mediada por enzimas). En este formato de ensayo, se forma un conjugado enzimático, tal como, por ejemplo, un conjugado de G6PDH y un análogo de Tacrolimus. Se incuba un anticuerpo para Tacrolimus con el conjugado enzimático y una muestra que se sospecha que contiene Tacrolimus. El anticuerpo para Tacrolimus se une al analito de Tacrolimus en la muestra en lugar de unirse al conjugado enzimático, lo cual reduce la cantidad de inhibición de la actividad enzimática que, de otro modo, podría ocurrir en ausencia de Tacrolimus en la muestra. De este modo, las muestras con más analito de Tacrolimus producirán una mayor actividad enzimática, y las muestras sin analito de Tacrolimus tendrán la inhibición máxima y la actividad enzimática más baja. La cantidad de reducción de la inhibición de la actividad enzimática se relaciona con la cantidad de Tacrolimus en la muestra.

Los reactivos para llevar a cabo un ensayo particular pueden estar presentes en un kit útil para realizar convenientemente un ensayo para la determinación de un analito del fármaco hidrofóbico. En una realización, un kit comprende una combinación empaquetada de un anticuerpo para un analito del fármaco hidrofóbico y otros reactivos para realizar un ensayo, cuya naturaleza depende del formato de ensayo particular. Cada uno de los reactivos puede estar en contenedores separados o varios reactivos se pueden combinar en uno o más contenedores dependiendo de la reactividad cruzada y la estabilidad de los reactivos. El kit puede incluir además otros reactivos empaquetados por separado para llevar a cabo un ensayo, tales como miembros sbp adicionales, reactivos auxiliares, tal como un sustrato de enzima auxiliar, y así sucesivamente.

Las cantidades relativas de los varios reactivos en los kits se pueden variar ampliamente para proporcionar concentraciones de los reactivos que optimicen sustancialmente las reacciones que es necesario que ocurran durante el presente método, y además para optimizar sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Bajo circunstancias apropiadas, uno o más de los reactivos en el kit se pueden proporcionar como un polvo seco, usualmente liofilizado, incluidos los excipientes, que al disolverse proporcionará una solución de reactivo que tiene las concentraciones apropiadas para realizar un método o ensayo de acuerdo con la presente divulgación. El kit puede incluir además una descripción escrita de un método de acuerdo con la presente invención, como se describe anteriormente.

Ejemplos

Materiales:

El PLURONIC® 25R2 se compró de BASF Corporation (Wilmington, NC). Las otras sustancias químicas se compraron de Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO).

Las pruebas se realizaron usando el analizador DIMENSION® RxL, disponible de Dade Behring Inc., Newark, DE. El instrumento se empleó usando la tecnología de inmunoensayo ACMIA™. El método de ensayo ACMIA se divulga en las patentes de EE. UU. No. 7,186,518, 5,147,529, 5,128,103, 5,158,871, 4,661,408, 5,151,348, 5,302,532, 5,422,284, 5,447,870, 5434,051. En la realización del método ACMIA usado en la presente y discutido con más detalle a continuación, se usa la competencia entre el análogo de Tacrolimus en partículas de cromo y de Tacrolimus (TACR, por sus siglas en inglés) en muestras de pacientes para el anticuerpo para Tacrolimus conjugado con una enzima (conjugado) para determinar la cantidad de Tacrolimus en las muestras de los pacientes. El conjugado que se une al análogo de Tacrolimus en las partículas de cromo se remueve por separación magnética. Se mide la actividad enzimática del conjugado que permanece en el sobrenadante y es directamente proporcional a la cantidad de Tacrolimus en la muestra del paciente. En el formato de ensayo ACMIA empleado, la actividad enzimática observada cuando se prueba una muestra que no contiene Tacrolimus es indicativa de la cantidad de actividad enzimática que no se une al anticuerpo activo (es decir, no se puede unir a Tacrolimus en las partículas de cromo). La actividad enzimática observada cuando no hay partículas de cromo presentes es indicativa de la cantidad total de actividad enzimática en el conjugado. Estos valores se pueden usar para estimar el porcentaje de actividad enzimática unida al anticuerpo activo.

Ejemplo 1

Inmunoensayo automatizado para fármacos hidrofóbicos con interferencia de lípidos reducida usando un pretratamiento no manual

Preparación de la solución de pretratamiento que contiene PLURONIC® 25R2

Esta solución base de pretratamiento se preparó adicionando PLURONIC® 25R2 a una concentración final de 0,09% en un amortiguador que contiene 6,8 mg/mL de sal de sodio PIPES™ 1,5, 0,3 mg/mL de disodio de EDTA, 1,0 mg/mL de saponina, 5 mg/mL de un compuesto de carbamato FK-506 (o éster de Tacrolimus), 0,2% de Proclin 300, 0,024 mg/mL de sulfato de neomicina y 0,99 mg/mL de NaN3, pH 6,5. La concentración de PLURONIC® 25R2 en la mezcla de reacción final es de aproximadamente 0,021%.

Preparación de la solución de pretratamiento que contiene SDS

Esta solución base de pretratamiento se preparó adicionando dodecilsulfato de sodio (SDS, por sus siglas en inglés) a una concentración final de 0,2% en un amortiguador que contiene 6,8 mg/mL de sal de sodio PIPES 1,5, 0,3 mg/mL de disodio de EDTA, 1,0 mg/mL de saponina, 5 mg/mL de un compuesto de carbamato FK-506 (o éster de Tacrolimus), 0,2% de Proclin 300, 0,024 mg/mL de sulfato de neomicina y 0,99 mg/mL de NaN3, pH 6,5. La concentración de SDS en la mezcla de reacción final de ACMIA es de aproximadamente 0,047%.

Preparación de la solución de pretratamiento que contiene LDS

Esta solución base de pretratamiento se preparó adicionando dodecilsulfato de litio (LDS, por sus siglas en inglés) a una concentración final de 0,05% en un amortiguador que contiene 6,8 mg/mL de sal de litio PIPES 1,5, 0,3 mg/mL de dilitio de EDTA, 1,0 mg/mL de saponina, 5 mg/mL de un compuesto de carbamato FK-506 (o éster de Tacrolimus), 0,2% de Proclin 300, 0,024 mg/mL de sulfato de neomicina y 0,99 mg/mL de NaN3, pH 6,5. La concentración de LDS en la mezcla de reacción final de ACMIA es de aproximadamente 0,012%, que es menor que la CMC (por sus siglas en inglés) de LDS (0,24%).

Preparación de la solución de pretratamiento que contiene TRITON™ X405

Esta solución base de pretratamiento se preparó adicionando TRITON™ X405 a una concentración final de 0,5% en un amortiguador que contiene 6,8 mg/mL de sal de sodio PIPES 1,5, 0,3 mg/mL de disodio de EDTA, 1,0 mg/mL de saponina, 5 mg/mL de un compuesto de carbamato FK-506 (o éster de Tacrolimus), 0,2% de Proclin 300, 0,024 mg/mL de sulfato de neomicina y 0,99 mg/mL de NaN3, pH 6,5. La concentración de TRITON™ X405 en la mezcla de reacción final de ACMIA es de aproximadamente 0,117%.

Preparación de la solución de pretratamiento que contiene GAFAC®

Esta solución base de pretratamiento se preparó adicionando GAFAC® a una concentración final de 0,2% en un amortiguador que contiene 6,8 mg/mL de sal de sodio PIPES 1,5, 0,3 mg/mL de disodio de EDTA, 1,0 mg/mL de saponina, 5 mg/mL de un compuesto de carbamato FK-506 (o éster de Tacrolimus), 0,2% de Proclin 300, 0,024 mg/mL de sulfato de neomicina y 0,99 mg/mL de NaN3, pH 6,5. La concentración de GAFAC® en la mezcla de reacción final de ACMIA es de aproximadamente 0,047%.

Preparación de la solución de pretratamiento que contiene EP110®

Esta solución base de pretratamiento se preparó adicionando EP110® a una concentración final de 0,05% en un amortiguador que contiene 6,8 mg/mL de sal de sodio PIPES 1,5, 0,3 mg/mL de disodio de EDTA, 1,0 mg/mL de saponina, 5 mg/mL de un compuesto de carbamato FK-506 (o éster de Tacrolimus), 0,2% de Proclin 300, 0,024 mg/mL de sulfato de neomicina y 0,99 mg/mL de NaN3, pH 6,5. La concentración de EP110® en la mezcla de reacción final de ACMIA es de aproximadamente 0,0117%.

Preparación de la solución de pretratamiento que contiene ZWITTERGENT®

Esta solución base de pretratamiento se preparó adicionando ZWITTERGENT® a una concentración final de 0,1% en un amortiguador que contiene 6,8 mg/mL de sal de sodio PIPES 1,5, 0,3 mg/mL de disodio de EDTA, 1,0 mg/mL de saponina, 5 mg/mL de un compuesto de carbamato FK-506 (o éster de Tacrolimus), 0,2% de Proclin 300, 0,024 mg/mL de sulfato de neomicina y 0,99 mg/mL de NaN3, pH 6,5. La concentración de ZWITTERGENT® en la mezcla de reacción final de ACMIA es de aproximadamente 0,0234%.

Preparación de la solución de pretratamiento que contiene TWEEN® 20

Esta solución base de pretratamiento se preparó adicionando TWEEN® 20 a una concentración final de 0,1% en un amortiguador que contiene 6,8 mg/mL de sal de sodio PIPES 1,5, 0,3 mg/mL de disodio de EDTA, 1,0 mg/mL de saponina, 5 mg/mL de un compuesto de carbamato FK-506 (o éster de Tacrolimus), 0,2% de Proclin 300, 0,024 mg/mL de sulfato de neomicina y 0,99 mg/mL de NaN3, pH 6,5. La concentración de TWEEN® 20 en la mezcla de reacción final de ACMIA es de aproximadamente 0,0234%.

Preparación del conjugado del anticuerpo anti-Tacrolimus-p-galactosidasa

El anticuerpo monoclonal anti-Tacrolimus se conjugó con p-galactosidasa usando un agente de enlace heterobifuncional estándar, a saber, SMCC (succinimidil-frans-4-(N-maleimidilmetil)ciclohexano-1-carboxilato, por sus siglas en inglés) de acuerdo con técnicas conocidas. La solución del conjugado del anticuerpo contiene aproximadamente 7,5 mg/mL de conjugado del anticuerpo anti-Tacrolimus-p-galactosidasa, 30 mg/mL de albúmina de suero bovino libre de proteasas, 0,126 mg/mL de MgCh, 0,03 mL/mL de etilenglicol, 35,14 mg/mL de sal de sodio PIPES 1,5, 50 mg/mL de NaCl y muteína beta-gal (beta-galactosidasa inactivada), pH 6,5.

Preparación de las partículas de cromo magnético

La producción de partículas de cromo FK-Tacrolimus (fase sólida del inmunoensayo) procedió haciendo el conjugado FK-Tacrolimus-BGG (gammaglobulina bovina, por sus siglas en inglés)-dextrano, preparando una pasta con las partículas de cromo y posteriormente formando tabletas con las partículas recubiertas. Cada tableta de FK-Tacrolimus contiene aproximadamente 2 mg de la pasta de cromo de FK-Tacrolimus, 10,5 mg de albúmina de suero bovino (BSA, por sus siglas en inglés) al 30%, 30,4 mg de dihidrato de trehalosa y 3,6 mg de CARBOWAX® de 100 mm.

Ensayo de Tacrolimus

El principio y la operación del ensayo ACMIA para Tacrolimus son los siguientes: se adicionó reactivo de pretratamiento que contiene uno de los detergentes anteriores a un recipiente de reacción en el instrumento DIMENSION® RxL/HM. A continuación, se adicionan 20 mL de sangre total que contiene Tacrolimus. La muestra de sangre total se toma de una copa estándar mezclando primero la sangre con la sonda de muestra ultrasónica. La mezcla de la muestra de sangre total con la solución de pretratamiento de carbamato de Tacrolimus aseguró la lisis de la sangre total y el desplazamiento de las moléculas de Tacrolimus unidas a proteínas de sus sitios de unión por las moléculas de carbamato de Tacrolimus. Por lo tanto, las moléculas de Tacrolimus liberadas serán accesibles para el anticuerpo anti-Tacrolimus en la mezcla de reacción. A continuación, se adicionó el conjugado del anticuerpo anti-Tacrolimus-p-galactosidasa (50 mL) y se permitió reaccionar con el Tacrolimus en la muestra. Las partículas de cromo con Tacrolimus-BGG (gammaglobulina bovina)-dextrano inmovilizado se adicionaron (50 mL) y se permitió que se unieran al conjugado sin reaccionar. El conjugado del anticuerpo anti-Tacrolimus-p-galactosidasa unido a Tacrolimus no se une al cromo, sino que permanece en el sobrenadante cuando se aplica un campo magnético a la mezcla de reacción anterior para separar la solución de las partículas de cromo. El conjugado unido a Tacrolimus se detectó transfiriendo el sobrenadante del recipiente de reacción a una celda fotométrica y midiendo la tasa enzimática del conjugado en presencia de clorofenol rojo-p-D-galactopiranósido (CPRG, por sus siglas en inglés). La velocidad se midió bicromáticamente a 577 y 700 nm.

Comparación de los diferentes reactivos de pretratamiento

PLURONIC® 25R2, SDS, LDS y TRITON™ X405 se usaron para preparar soluciones de pretratamiento separadas (como se discutió en detalle anteriormente) para el ensayo ACMIA realizado en el analizador DIMENSION® para medir las concentraciones de Tacrolimus en muestras de sangre total que contienen colesterol o triglicéridos normales y elevados. Se preparó otra solución de pretratamiento sin los detergentes mencionados anteriormente como control para el ensayo (“Control”). Las soluciones de pretratamiento enriquecidas con y sin los detergentes mencionados se usaron para preparar los cartuchos de reactivos para el ensayo de Tacrolimus ACMIA en el analizador de química clínica DIMENSION®. Cuando no se usaron los detergentes mencionados anteriormente, tanto el colesterol como los triglicéridos disminuyeron la recuperación de Tacrolimus en las muestras de sangre total. En las siguientes tablas, se reporta la recuperación de Tacrolimus en ng/mL. El porcentaje de interferencia de colesterol se reporta como un número negativo (ya que representa una reducción en la cantidad de interferencia) y es la diferencia entre la recuperación del analito con colesterol normal y la recuperación del analito con colesterol alto dividida por la recuperación del analito con colesterol normal multiplicado por 100. Por ejemplo, del Control a continuación, el porcentaje de interferencia de colesterol es (10,6 - 3,9) 10,6 * 100. El porcentaje de interferencia de triglicéridos se reporta como un número negativo (ya que representa una reducción en la cantidad de interferencia) y es la diferencia entre la recuperación de analitos con triglicéridos normales y la recuperación de analitos con triglicéridos altos dividida por la recuperación de analitos con triglicéridos normales multiplicada por 100. Por ejemplo, del Control a continuación, el porcentaje de interferencia de triglicéridos es (10,0 - 6,5) 10,0 * 100.

Efectos de SDS, LDS, PLURONIC 25R2 y TRITON 405 en la interferencia de lí pidos

Efectos de otros tensioactivos en la interferencia de lípidos

Cuando los detergentes mencionados anteriormente se formularon en las soluciones de pretratamiento, los detergentes PLURONIC® 25R2, SDS, LDS y TRITON™ X405 demostraron una mitigación suficiente de la interferencia del colesterol y de los triglicéridos de acuerdo con las realizaciones de los presentes métodos.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un método para el potenciamiento de la biodisponi bilidad de un fármaco hidrofóbico en una muestra que se sospecha que contiene un fármaco hidrofóbico, el método comprende:

(a) proporcionar una combinación en un medio:

(i) la muestra, en donde la muestra es de un fluido biológico o de un tejido biológico, y en donde la muestra no ha sido tratada para remover las lipoproteínas, y

(ii) un agente de biodisponibilidad para el fármaco hidrofóbico, en donde el agente de biodisponibilidad es el detergente isooctilfeniléter de polioxietileno (40), y en donde la concentración del agente de biodisponibilidad en el medio es suficiente para potenciar la biodisponibilidad del fármaco hidrofóbico reduciendo la interferencia del colesterol y de los triglicéridos, en donde la concentración del agente de biodisponibilidad es de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,2%, y

(b) incubar el medio, en donde el período de incubación es de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 60 minutos, y la temperatura durante la incubación es de aproximadamente 10°C a aproximadamente 45°C.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1 para la determinación de un fármaco hidrofóbico en una muestra que se sospecha que contiene un fármaco hidrofóbico, en donde la combinación en el medio comprende además un agente hemolítico, y el método comprende además:

(c) adicionar al medio reactivos para la determinación de la presencia y/o la cantidad del fármaco hidrofóbico en la muestra, en donde los reactivos comprenden al menos un anticuerpo para el fármaco hidrofóbico, y

(d) examinar el medio para la presencia de un complejo que comprende el fármaco hidrofóbico y el anticuerpo para el fármaco hidrofóbico, indicando la presencia y/o la cantidad del complejo la presencia y/o la cantidad del fármaco hidrofóbico en la muestra.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el fármaco hidrofóbico es un fármaco inmunosupresor.

4. El método de conformidad con la reivindicación 2, en donde en el paso (c) se adiciona al medio un análogo del fármaco hidrofóbico.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, en donde al menos uno del anticuerpo para el fármaco hidrofóbico y el análogo del fármaco hidrofóbico comprende una etiqueta.

6. El método de conformidad con la reivindicación 2, en donde en el paso (c) se adiciona un segundo anticuerpo al medio, en donde el segundo anticuerpo se une a un complejo del fármaco hidrofóbico y al anticuerpo para el fármaco hidrofóbico.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, en donde al menos uno del anticuerpo para el fármaco hidrofóbico y el segundo anticuerpo comprende una etiqueta.